一种化合物及其制备方法
技术领域
本发明属于药物技术领域,具体涉及从车前草中分离得到的一种新的化合物,及其制备方法。
背景技术
车前草为车前科Plantaginaceae植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥全草,是《中国药典》(2010年版)收载的常用中药。目前,已发现的车前科有3属,约200种,分布遍及全世界。我国仅产车前属Plantago,约13种。除车前与平车前外,国内外研究较多车前草还有大车前PlantagomajorL.。车前草性味甘寒,具有利水、清热、明目、祛痰的功效。主治淋病、尿血、小便不通、黄疽、水肿、热痢、泄泻、目赤肿痛、喉痛等。《草性论》载“治尿血,能补五脏,明目,利小晒干的车前草便,通五淋”。《本草逢原》载“若虚滑精气不固者禁用”。性味和功用甘,寒,归手太阳,阳明经。利水,清热,明目,祛痰,用于小便不通,淋浊,带下,尿血,黄疸,水肿,热痢泄泻,鼻衄,目赤肿痛,喉痛,咳嗽,皮肤溃疡。
讫今为止,已从前述3种车前草中分离和鉴定出超过60种化合物,按其主要结构类型可分为环烯醚萜类、黄酮类、苯乙基苷类、酚酸类和脂肪酸类等成分。环烯醚萜类有利尿,抑菌,抗四氧化碳引起的肝中毒,利胆作用;黄酮类可作用于呼吸中枢,缓解呼吸运动而镇咳,兴奋分泌神经使气管及支气管分泌增加而祛痰;苯乙基苷类有消炎、抑菌、抑制Camp磷酸二酯酶和醛糖还原酶的活性;酚酸类具有杀菌、升白、利胆、抑制血小板聚集等功能。
现代药理学研究表明,车前草具有多种药理活性,用途广泛,可以用于治疗慢性支气管炎、急性黄疸型肝炎、痛风性关节炎、高血压、细菌性痢疾、隐匿性肾炎、青光眼和痛风等。
PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤,具有神经元的特征,因此作为神经元的模型用于研究神经元细胞的死亡方式及机制的研究。多项研究已经表明,Aβ对PC12细胞的细胞毒性作用是由于氧应激、线粒体功能异常等引致细胞凋亡。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种从车前干燥全草中分离得到的一种新化合物,该化合物可以作为制备保护神经药物中的有效成分。
本发明的上述发明目的是通过下面的技术方案得以实现的:
一种化合物,它的结构如(Ⅰ):
一种上述化合物的制备方法,包含以下操作步骤:
a、车前草粉碎,用85%乙醇热回流提取,合并提取液,浓缩至无醇味,依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物;
b、步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂,依次用20%乙醇和80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏;
c、步骤b中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离,依次用体积比为90:1、60:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分;
d、步骤c中组分4用正相硅胶进一步分离,依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;
e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离,用体积百分浓度为65%的甲醇水溶液等度洗脱,收集8-11个柱体积洗脱液,洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ);
上述步骤中所述的85%乙醇、20%乙醇和80%乙醇均是指体积百分浓度。
作为优选,所述步骤a中的车前草是车前草的干燥全草
进一步的,所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
本发明的化合物是从车前干燥全草中首次分离出来的化合物,该化合物具有如下有益效果:
应用20μmol/LAβ25-35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞株PC12凋亡模型,利用本发明的化合物(Ⅰ)进行对照试验,证明本发明的化合物(Ⅰ)能部分对抗Aβ25-35诱导的PC12凋亡,证明其在制备保护神经药物中具有有效的药用价值,可以用来开发成保护神经的药物。并且本发明的化合物或该化合物制备的药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式;
图2为化合物(Ⅰ)二维1H-1HCOSY谱;
图3为MTT代谢率检测Aβ25-35对PC12细胞的毒性作用;
图4为Aβ25-35对PC12细胞LDH释放率的影响;
图5为Aβ25-35和/或化合物(Ⅰ)对PC12细胞LDH释放率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
主要材料、试剂来源:
乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯,购自上海凌峰化学试剂有限公司,甲醇,分析纯,购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
Aβ25-35购于美国sigma公司。MTT(四唑氮蓝)购于美国Amresco公司。LDH测定试剂盒购于南京建成生物有限公司。吖啶橙(AO)购于美国sigma公司。溴化乙啶(EB)购于美国sigma公司。RNase酶购于美国sigma公司。蛋白酶K购于美国sigmaAnnexin公司。Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。D-MEM/F12培养基干粉购于美国GibcoL公司。马血清购于美国hycLon公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。多聚赖氨酸(PLL)购于美国sigma公司。化合物(Ⅰ)自制,HPLC归一化纯度大于98%。
仪器类型:低温高速离心机,美国Heraeus;二氧化碳培养箱,美国SHELL/JB;超净工作台,苏州净化设备厂;雷勃MK3酶标仪,芬兰Thermolabsystems;荧光显微镜,德国Leica;流式细胞仪EpicsXL,美国CouLter公司;电泳系统,北京六一仪器厂;雷勃MK3酶标仪,芬兰Thermolabsystems;荧光显微镜,德国Leica;流式细胞仪EpicsXL,美国CouLter公司。
实施例1:化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
(a)车前的干燥全草(8kg)粉碎,用85%乙醇热回流提取(25L×3次),合并提取液,浓缩至无醇味(6L),依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(333g)和正丁醇萃取物;(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂,依次用20%乙醇(8L)和80%(12L)乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏(152g);(c)步骤(b)中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离,依次用体积比为90:1(7个柱体积)、60:1(7个柱体积)、30:1(8个柱体积)、15:1(7个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分;(d)步骤(c)中组分4(38g)用正相硅胶进一步分离,依次用体积比为20:1(10个柱体积)、12:1(8个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;(e)步骤(d)中组分2(11g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离,用体积百分浓度为65%的甲醇水溶液等度洗脱,收集8-11个柱体积洗脱液,洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(26mg)。
结构确证:
无色粉末;HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z493.2604,结合核磁特征可得分子式为C28H38O6,不饱和度为10。核磁共振氢谱数据δH(ppm,DMSO-d6,500MHz):H-2(2.99,dd,J=18.8,3.3),H-2(2.49,dd,J=18.8,2.2),H-3(4.29,dd,J=3.3,2.2),H-4(3.69,d,J=9.4),H-6(3.37,d,J=3.2),H-7(2.14,dt,J=14.6,3.5),H-7(1.29,dd,J=14.6,11.3),H-8(1.62,m),H-9(1.90,m),H-11(1.18,m),H-11(0.94,dd,J=13.2,4.0),H-12(1.88,m),H-12(1.22,m),H-14(1.05,m),H-15(1.64,m),H-15(1.17,m),H-16(1.68,m),H-16(1.36,m),H-17(1.12,m),H-18(0.66,s),H-19(4.19,d,J=9.0),H-19(3.86,d,J=9.0),H-20(1.98,m),H-21(0.97,d,J=6.7),H-22(4.35,dt,J=13.3,3.5),H-23(2.42,brdd,J=17.0,13.3),H-23(1.92,m),H-27(1.88,s),H-28(1.94,s),6-OH(3.16,d,J=9.4);核磁共振碳谱数据δC(ppm,DMSO-d6,125Hz):208.0(C,1-C),42.8(CH2,2-C),74.3(CH,3-C),69.7(CH,4-C),60.8(C,5-C),56.9(CH,6-C),29.8(CH2,7-C),28.8(CH,8-C),36.9(CH,9-C),50.1(C,10-C),22.1(CH2,11-C),39.3(CH2,12-C),43.2(C,13-C),54.8(CH,14-C),24.2(CH2,15-C),27.3(CH2,16-C),52.3(CH,17-C),11.8(CH3,18-C),63.5(CH2,19-C),38.9(CH,20-C),13.5(CH3,21-C),78.4(CH,22-C),29.7(CH2,23-C),149.1(C,24-C),122.1(C,25-C),167.2(C,26-C),12.6(CH3,27-C),20.7(CH3,28-C);碳原子标记见图1。1H-1HCOSY谱(图2)表明化合物(Ⅰ)含有-CH2CH(OR)-部分结构[δH2.99(dd,J=18.8,3.3Hz,H-2β),2.49(dd,J=18.8,2.2Hz,H-2α),4.29(dd,J=3.3,2.2Hz,H-3)];HMBC谱中,H-3与C-1(δC208.0),H-2β与C-4(δC69.7),以及H-3与C-5(δC60.8)的相关性进一步证实了上述结构推测。这些数据表明,化合物(Ⅰ)含有另外的环状结构来满足不饱和度为10的要求。化合物(Ⅰ)中H-3与H-4之间的耦合表明两者之间有一个大约90°的二面角。化合物(Ⅰ)中C-19(δC63.5)、H-19[δH4.19(d,J=9.0Hz),3.86(d,J=9.0Hz)]以及H-3(δH4.29)的化学位移表明C-3和C-19之间存在一个氧桥。HMBC谱中C-19(δC63.5)与H-3(δH4.29)以及C-3(δC74.3)与H-19α(δH4.19)的相关性验证了上述推论。综合HMBC、1H-1HCOSY、ROESY等二维谱和相关文献,确定该化合物结构如图1所示。
本实施例的化合物主要用途是用于制备保护神经的药物。
实施例2:化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、试验方法
1、细胞培养
PC12细胞生长于含10%马血清、5%胎牛血清的D-MEM/F12培养液(37℃,体积分数为0.05的CO2,饱和湿度),常规传代。实验时培养器皿用0.005%PLL溶液(分子量为150,000-300,000)包被,增加PC12细胞对培养器皿黏附力。
2、Aβ25-35凝聚态处理
Aβ25-35溶于无菌双蒸水,终浓度为2.0mmol/L,分装,-20℃保存,临用前,37℃孵育4-7d。
3、药物对PC12细胞的处理
对数生长期的PC12细胞按一定的密度分别接种于培养板中,待其生长稳定后,将细胞分组,即对照组,Aβ25-35诱导凋亡组以及化合物(Ⅰ)干涉Aβ25-35诱导凋亡组。其中Aβ25-35诱导凋亡组,以培养液加入凝聚态的Aβ25-35储存液,配制一定浓度的工作液,分别加入细胞培养板,每孔再分别加入细胞悬液,CO2培养箱培养。每小组均设3个平行孔;其次依据20μmol/LAβ25-35,设定化合物(Ⅰ)干涉凋亡组,细胞以不同浓度化合物(Ⅰ)预处理1h,再分别予终浓度20μmol/LAβ25-35培养。
4、MTT法测定细胞存活率
取对数生长期的细胞以2-5×105/mL的初始浓度分别接种于96孔培养板中每孔160μL,待其生长稳定后,加入不同浓度的Aβ25-35,细胞对照组只加等量培养液,每组设三个平行孔。培养96小时,每孔加5mg/mL的MTT溶液(PBS配制)20μL,混匀后继续培养4h,弃上清液,每孔加DMSO0.2mL,振荡10min,以空白对照孔调零,在490nm波长下测定各孔光密度值。
5、LDH释放量的测定
接种于24孔细胞培养板的细胞,经药物处理48h后,吸出各组上清液备用,各组细胞加入0.1%NP-401mL作用10min,收集上清液备用。按照LDH测定试剂盒说明,分别检测各组上清液和0.1%NP-40的LDH活性,LDH释放率=OD上清/(OD上清+OD0.1%NP-40)×100%。
6、流式细胞分析细胞凋亡
按AnnexinVFITC试剂盒说明操作:
(1)细胞处理一定时间后,2000rpm/min离心5min,细胞数1-5×105;
(2)用PBS清洗细胞二次,2000rpm离心5min;
(3)加入500μLBindingbuffer悬浮细胞;
(4)加入2μLAnnexinV-FITC混匀后,加入5μLPropidiumIodide(PI),混匀,室温,避光反应20min;
(5)流式细胞仪(BackmancoulterEpicsXL)检测,激发波长488nm,发射光530nm.,对散点图进行分析。
7、统计分析
结果用均数±标准差表示,两两比较用t检验,P<0.05认为有统计学意义。
二、结果及结论
1、MTT测定Aβ25-35对PC12细胞活性的影响
从图3可看出,Aβ25-35处理PC12细胞4d后,MTT法检测显示20,40μmol/LAβ25-35作用组吸光值(A490)明显降低,差别有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测表示线粒体功能,结果说明Aβ25-35使PC12细胞线粒体功能降低,活细胞数减少,即Aβ25-35对PC12细胞的活性有抑制作用,并与作用浓度相关。结果见表1及图3。
表1Aβ25-35对PC12细胞生长的抑制作用
Aβ25-35(μmol/L) |
0 |
10 |
20 |
40 |
细胞存活率 |
100 |
87.04±4.3% |
73.4±3.2% |
68.6±3.08% |
2、LDH释放量测定
10、20、40μmol/LAβ25-35作用PC12细胞48h后,通过检测细胞LDH释放率显示细胞的损伤程度,结果表明Aβ25-35对PC12细胞的毒性作用,并与作用的浓度相关,20、40μmol/LAβ25-35作用组与对照组比较,差别有统计学意义(图4)。选20μmol/LAβ25-35作为损伤组,观察化合物(Ⅰ)的干预作用,作用48h,结果表明,10ng/mL化合物(Ⅰ)即能降低PC12细胞LDH释放率,但差异不显著;100ng/mL,1000ng/mL化合物(Ⅰ)组明显降低PC12细胞LDH释放率【见图5,图中标号意义:1、control(对照组);2、20μmol/LAβ25-35;3、20μmol/LAβ25-35+1.0ng/ml化合物(Ⅰ);4、20μmol/LAβ25-35+10ng/ml化合物(Ⅰ);5、20μmol/LAβ25-35+100ng/ml化合物(Ⅰ);6、20μmol/LAβ25-35+1000ng/ml化合物(Ⅰ);其中4、5、6三组与20μmol/LAβ25-35组比较p<0.05】。
3、AnnexinⅤ-PI染色的流式细胞法检测细胞凋亡
各组PC12细胞经处理后上流式细胞仪,并对散点图进行分析(MuLticycL软件处理),显示对照组、10μmol/LAβ25-35、20μmol/LAβ25-35作用48h后,PC12细胞的凋亡率分别为2.1±0.3%,9.3±0.5%和18.6±3.4%,凋亡率与Aβ25-35剂量成正相关,与对照组比较差别具有显著性意义,以100ng/mL化合物(Ⅰ)预先处理,凋亡率降低为11.2±3.7%,差别有统计学意义(表2,与对照组比较,*:P<0.05,**:P<0.01;与20μmol/LAβ25-35组比较,#:P<0.05),显示化合物(Ⅰ)抗Aβ25-35致凋亡作用。获得流式细胞术检测PC12细胞凋亡率。总结,本研究发现应用20μmol/LAβ25-35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞株PC12凋亡模型;化合物(Ⅰ)能部分对抗Aβ25-35诱导的PC12凋亡。
实施例3
片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ),以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂,制粒压片。
实施例4
口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ),以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ),以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂,制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ),以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按常规加注射用水,精滤,灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ),以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,将其溶于无菌注射用水中,搅拌使溶,用无菌抽滤漏斗过滤,再无菌精滤,分装于安瓿中,低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。