CN105503895A - 一种用于治疗急性t淋巴细胞白血病的新的二萜化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗急性T淋巴细胞白血病的新的二萜化合物，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从附子中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物作用Molt4细胞后能够诱导其显著的周期阻滞和凋亡，并使细胞周期停留于S期，从而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。化合物(Ⅰ)在治疗急性T淋巴细胞白血病方面具有潜在的应用价值，可以用来开发成治疗急性T淋巴细胞白血病的药物。

Description

一种用于治疗急性T淋巴细胞白血病的新的二萜化合物
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从附子中分离得到的一种具有治疗急性T淋巴细胞白血病作用的二萜类化合物及其制备方法。
背景技术
附子为毛茛科植物乌头aconitumcarmichaelidebx.的子根的加工品。6月下旬至8月上旬采挖，除去母根、须根及泥沙，习称“泥附子”。加工炮制为盐附子、黑附子(黑顺片)、白附片、淡附片、炮附片。属温里药。中药中“回阳救逆第一品”。主产于四川、湖北、湖南等地。附子始载于《神农本草经》，列为下品。陶弘景谓：“乌头与附子同根，附子八月采，乌头四月采，春时茎初生有脑头，如乌鸟之头，故谓之鸟头。”韩保升谓：“正者为乌头，两歧者为乌喙，细长三、四寸者为天雄，根旁如芋散生者为附子，旁连生者为侧子，五物同出而异名，苗高二尺许，叶似石龙芮及艾”。苏颂谓：“五者今并出蜀土，都是一种所产，其亩高三、四尺，茎作四棱，叶如艾，其花紫碧色作穗，其实细小如桑椹状，黑色，本只种附子一物，至成熟后乃有四物。”《本草纲目》载：“乌头有两种，出彰明者即附子之母，今人谓之川乌头是也，其产江左山南等处者，乃本经所列乌头，今人谓之草乌头是也。”
附子的化学成分主要是生物碱类物质，此外还有脂类及多糖等。附子的毒性成分是双酯型生物碱，其中主要是乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等。在二萜类生物碱中，以乌头碱的研究最全面，它的毒性和药理作用均有不少报道。乌头碱的主要毒性作用是抑制呼吸及引起心律失常，其对心脏的直接毒性作用是使心肌细胞钠离子通道开放，加速钠离子内流，促使细胞膜去极化，从而引起心律失常。二萜类醇胺为乌头碱，中乌头碱和次乌头碱相应生物碱的水解产物。它们的毒性很小，大剂量只引起窦房传导阻滞而不引起异位节律和室颤。附子的特点在于炮制，炮制的过程也即是将原来生品中所含毒性很强的双酯类生物碱水解为毒性较小的单酯类碱，如继续水解则转变为毒性更小的胺醇类碱。
发明内容
本发明的目的是提供一种从附子中分离得到的一种具有治疗急性T淋巴细胞白血病作用的二萜类化合物及其制备方法。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将附子粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
进一步地，步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。
进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
所述的药物组合物在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
制备方法：(a)附子(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(163g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ODS-C18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(43mg)。
结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z415.1418，结合核磁特征可得分子式为C20H24O8，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(2.22，m)，H-1(1.98，m)，H-3(4.86，d)，H-4(2.14，d)，H-6(4.52，t，J＝8.9)，H-7(2.17，dd，J＝14.4，8.4)，H-7(1.73，dd，J＝14.4，9.6)，H-10(2.16，m)，H-11(2.14，dd，J＝14.4，8.4)，H-11(2.25，dd，J＝14.4，6.0)，H-12(5.21，dd，J＝8.4，6.0)，H-14(6.20，br，s)，H-15(7.29，br，s)，H-16(7.26，br，s)，H-17(1.12，s)，H-19(1.28，s)，H-20(5.16，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，150MHz)：33.4(CH2，1-C)，212.3(C，2-C)，65.5(CH，3-C)，54.2(CH，4-C)，38.8(C，5-C)，84.1(CH，6-C)，41.3(CH2，7-C)，72.7(C，8-C)，55.5(C，9-C)，42.1(CH，10-C)，39.5(CH2，11-C)，70.2(CH，12-C)，128.3(C，13-C)，107.6(CH，14-C)，143.4(CH，15-C)，138.0(CH，16-C)，26.3(CH3，17-C)，177.2(C，18-C)，29.1(CH3，19-C)，105.3(CH，20-C)；碳原子标记参见图1。IR光谱显示该化合物含有羟基和内酯基团(3446cm-1和1772cm-1)。NMR谱数据表明该化合物含有一个典型的β-单取代呋喃环[δH6.20(br，s，H-14)，7.29(br，s，H-15)和7.26(br，s，H-16)；δC128.3(C-13)，107.6(C-14)，143.4(C-15)和138.0(C-16)〕，一个酯羰基[δC177.2(C-18)]，一个羰基[δC212.3(C-2)]，三个含氧次甲基[δC65.5(C-3)，84.1(C-6)和70.2(C-12)]，含氧季碳[δC72.7(C-8)]，以及两个甲基[δH1.12(3H，s，H3-17)和1.28(3H，s，H3-19)]。根据它的分子式和NMR数据，该化合物鉴定为高含氧二萜类化合物。HMBC谱中，H3-19与C-4，C-5，C-6和C-10以及H3-17与C-7，C-8和C-9的相关性表明化合物为含有5,8-二甲基双萜化合物。HMBC谱中H-6与C-18以及H-3与C-18的相关性，表明存在一个γ-内酯环。此外根据HMBC谱中，H-12与C-12，C-14和C-16的相关性，可推断呋喃环位于C-12位上。NOESY谱中，H3-19与H-4，H-6和H-10相关性表明，它们均为α构型。H-16和H3-17的相关性表明CH3-17为β构型。此外，H3-17与H-20的相关性表明H-20为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
急性T淋巴细胞白血病Molt4细胞由暨南大学血液病研究所惠赠；慢性粒细胞白血病细胞K562细胞由暨南大学由生物化学与分子生物学教研室惠赠。化合物(Ⅰ)为自制，HPLC归一化纯度大于98％，用DMSO分析纯溶解配制成5.5μg/mL溶液备用。DMEM/F12培养基粉、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、四苯基氮哇蓝试剂(MTT)购于美国Gibeo公司。新生牛血清(NewbomCalfSerum)购于中国杭州四季青公司。青霉素(Penicillin)、链霉素(Streptomycin)购于华北制药公司中国。碘化丙睫(PT)购于美国Sigma公司。PI-AnnexinV双染试剂盒购于中国北京宝赛生物技术公司。ROS高质荧光测定试剂盒购于中国碧云天生物技术研究所。Rhodamine123购于美国MolecularProbes公司。
CO2培养箱(美国ThermoForma)，超净工作台(中国苏州净化仪器厂)，压力蒸汽灭菌锅(LDZX40BI)(中国上海申安医疗器械厂)，TGL-16G型台式高速离心机(中国上海安亭科学仪器厂)，MA260S型电子分析天平(中国上海第二天平仪器厂)，自动双重纯水蒸馏器(中国上海玻璃仪器一厂)，SterivexTM，0.22μm无菌针头式过滤器(美国Millipore公司)，XDS-1B光学倒置显微镜(中国重庆光学仪器厂)，全自动酶标仪(美国BIO-RID公司)，FACSCalibur流式细胞仪(美国BDFACSAria公司)。QL-901型旋涡混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)。
二、试验方法
1、细胞培养
人急性T淋巴细胞白血病细胞Molt4细胞培养体系：DMEM/F12培养液含10％新生牛血清，置37℃、体积分数为5％CO2培养箱，每2-3天传代培养。选用对数生长期、0.2％台盼蓝拒染率>95％的细胞进行实验。
2、MTT法检测细胞增殖抑制率
3×104mLMolt4细胞接种于96孔培养板，终体积为200μL/孔，每组设5复孔，化合物(Ⅰ)设五个浓度分别为2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg//mL，20μg//mL。置37℃、5％CO2培养箱中培养48h、72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL用PBS<ph＝7.4配)20μL，继续孵育4小时，终止培养，离心，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解，酶标仪检测吸光值(测定波长570nm，参比波长690nm)，计算各组增殖抑制率。每次实验重复3次，取其均值。增殖抑制率(％)＝(1-A实验组/A对照组)×100％。
3、PI单染检测细胞周期
2×l05/mLMolt4细胞接种于12孔培养板，每孔1800μL，化合物(Ⅰ)设三个浓度分别为5μg/mL，10μg/mL15μg/mL，终体积2500μL，设3复孔。置37℃、5％CO2培养箱中培养48h后收集细胞，预冷的0.01mol/LPBS洗涤细胞2次，用体积分数为70％乙醇4℃固定过夜，离心去上清，加入PI染色液(含RNA酶)，终浓度50μg/mL，避光染色30min，300目尼龙网过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量，每个样本随机分析12000个细胞，得各组细胞生长周期比例，美国BDFACSortCellQuest软件分析处理结果。
4、AnnexinV-PI双染测定细胞凋亡比例
细胞处理及加药方法均同上，培养48h后，调整细胞浓度为5×106/mL，各组取lmL细胞，预冷0.01mol/LPBS洗涤3次，吸尽上清，加入200μL试剂盒提供的结合缓冲液，重悬细胞，分别加入10μLAnnexinV-FITC和5μL，轻轻混匀，4℃避光反应30min，再加入300μL结合缓冲液，上流式细胞仪检测。AnnexinV-FITC+、PI-的细胞群(即LR细胞群)为早期凋亡细胞。
5、统计分析
以均数士标准差表示，应用SPSS13.0统计软件处理，采用完全随机设计的单因素方差分析(one-wayANOVA)分析组间差异的显著性。
三、结果及结论
1、化合物(Ⅰ)对Molt4细胞的增殖抑制作用
化合物(Ⅰ)在不同时间点对Molt4细胞均有明显的增殖抑制作用。DMSO(0.5％)组在48h、72h的增殖抑制率分别是5.2％±0.8％、6.40％±0.9％。不同浓度化合物(Ⅰ)处理组的增殖抑制率与DMSO组相比均有统计学意义(P<0.01)。相同浓度条件下，72h的增殖抑制率较48h高。化合物(Ⅰ)对Molt4细胞48h、72h的IC50分别是19.4±0.2μg/mL、15.7±0.1μg/mL。不同浓度的化合物(Ⅰ)均显示一定的增殖抑制效果，且具有时间、剂量赖关系。结果见表1(注：*标记与Control组比较，P<0.01)。
2、化合物(Ⅰ)对Molt4细胞周期的影响
化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞48h后，空白对照组G1期细胞比例为37.5％±0.2％，S期细胞比例为50.6％±0.1％，G2期细胞比例为11.7％±0.1％，DMSO组G1期细胞比例为39.6％±0.1％，S期细胞比例为51.6％±0.2％，G2期细胞比例为8.7％±0.2％。化合物(Ⅰ)药物20μg/mL、25μg/mL处理组G1期所占细胞比例分别为4.1％±0.1％、65.8％±0.1％，S期细胞所占的比例增加分别为85.1％±0.3％、87.1％±0.25(P<0.01)，G2期细胞所占比例分别为10.7％±0.2％、7.0％±0.1％，结果显示G1期有明显差别(P<0.05)说明化合物(Ⅰ)阻滞Molt4细胞处于周期S期。结果见表2(注：*标记与Control组比较，P<0.01)。
3、化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞后的早期凋亡率
化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞48h后，AlmexinV/PI双染流式细胞仪检测早期凋亡率。空白对照组细胞早期凋亡率6.6％±0.4％，DMSO对照组的早期凋亡率7.0％士0.3％，与空白对照相比无统计学意义(p>0.05)。化合物(Ⅰ)10μg/mL组、15μg/mL组早期凋亡率分别是9.5％±0.3％、15.0％±0.5％，与空白对照相比有统计学意义(P<0.05)。结果见表3(注：*标记与Control组比较，P<0.05)。
结论，在研究中我们发现化合物(Ⅰ)作用Molt4细胞后能够诱导其显著的周期阻滞和凋亡，并使细胞周期停留于S期，从而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。化合物(Ⅰ)在治疗急性T淋巴细胞白血病方面具有潜在的应用价值。
表1化合物(Ⅰ)对Molt4细胞的增殖抑制作用(％，n＝3)
组别 48h抑制率(％) 72h抑制率(％)
DMSO 5.2±0.8 6.4±0.9
化合物(Ⅰ)2.5μg/mL 6.3±1.3 8.4±1.1
化合物(Ⅰ)5μg/mL 10.5±2.4 11.6±2.5
化合物(Ⅰ)10μg/mL 18.6±1.6* 26.9±2.7*
化合物(Ⅰ)15μg/mL 33.4±2.7* 49.4±2.2*
化合物(Ⅰ)20μg/mL 53.2±4.4* 65.4±1.6*
表2各组细胞周期百分比(％，n＝3)
表3化合物(Ⅰ)对Molt4细胞凋亡的影响(％，n＝3)
组别 细胞凋亡率
Control 6.6±0.2
DMSO 7.0±0.4
化合物(Ⅰ)10μg/mL 9.5±0.3*
化合物(Ⅰ)15μg/mL 15.0±0.3*
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将附子粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。
4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗急性T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
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