CN105348227A

CN105348227A - 一种新的异香豆素类化合物及其制备方法和医药用途

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Publication number: CN105348227A
Application number: CN201510887879.0A
Authority: CN
Inventors: 杨辉
Original assignee: XINING YIGE INTELLECTUAL PROPERTY ADVISORY SERVICES Co Ltd
Current assignee: XINING YIGE INTELLECTUAL PROPERTY ADVISORY SERVICES Co Ltd
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明公开了一种新的异香豆素类化合物及其制备方法和医药用途，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的异香豆素类化合物，可以从马齿苋的干燥地上部分中提取、分离纯化得到。体外试验证明Aβ_25-35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞株PC12凋亡模型，该化合物能对抗Aβ_25-35诱导的PC12凋亡，可以用来开发成神经保护的药物。

Description

一种新的异香豆素类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及从马齿苋的干燥地上部分中分离得到的一种异香豆素类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。

背景技术

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)又名蚂蚱菜、长命菜、马舌菜等，为马齿苋科植物全草，多以其干燥地上部分入药，生于山区潮湿肥沃的地方，盛产于四川，遍布全国。性味酸寒，具有清热解毒、凉血止血之功效。主治热痢脓血、热淋、带下、痛肿恶毒、丹毒。药理研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗动脉粥样硬化等功效。马齿苋可入药，又可食用，是我国卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一，曾被列入2008北京奥运会菜谱。

国内外研究人员对马齿苋的化学成分做了大量研究，结果表明，马齿苋中富含有机酸、黄酮、萜类、甾体类、香豆素类、花色苷类以及挥发油等多种类型的化学成分。目前，分离得到并且结构经过鉴定的香豆素类主要有6,7-二羟基香豆素(6,7-dihydroxycoumarin)、东莨菪亭(scopoletin)、佛手柑内酯(bergapten)、异茴香内酯(isopimpinellin)、lonchocarpicacid、lonchocarpenin和大叶桉亭(robustin)。

现代药理研究表明，马齿苋药理作用广泛，包括：抗菌、抗病毒作用；兴奋平滑肌的作用；肌肉松弛作用；剂量依赖性地增加心肌收缩力度、速度，且可被心得安完全阻断；降血脂、抗动脉粥样硬化作用；降血糖作用；抗肿瘤作用；抗衰老作用；增强免疫作用；抗过敏反应等。

发明内容

本发明的目的是提供一种从马齿苋的干燥地上部分中分离得到的一种异香豆素类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：

所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将马齿苋的干燥地上部分粉碎，用80～90％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用5％乙醇洗脱6个柱体积，再用75％乙醇洗脱8个柱体积，收集75％洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、8:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤(a)中，用85％乙醇热回流提取，合并提取液。

进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

所述的化合物(Ⅰ)在制备神经保护的药物中的应用。

所述的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1为化合物(Ⅰ)结构式；

图2为化合物(Ⅰ)计算ECD和实验ECD图；

图3为MTT代谢率检测Aβ_25-35对PC12细胞的毒性作用；

图4为Aβ_25-35对PC12细胞LDH释放率的影响；

图5为Aβ_25-35和/或化合物(Ⅰ)对PC12细胞LDH释放率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

主要材料、试剂来源及仪器类型：

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

(a)将马齿苋的干燥地上部分(8kg)粉碎，用85％乙醇热回流提取(30L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(375g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔树脂除杂，先用5％乙醇洗脱6个柱体积，再用75％乙醇洗脱8个柱体积，收集75％洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱浓缩物(129g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1(8个柱体积)、30:1(8个柱体积)、15:1(8个柱体积)和8:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1(8个柱体积)、8:1(10个柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(15g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(40mg)。

结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z425.1608，结合核磁特征可得分子式为C₂₂H₂₆O₇，不饱和度为10。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，500MHz)：H-1(5.01，d，J＝4.9)，H-2(4.54，d，J＝4.9)，H-3(4.68，br，s)，H-5(2.88，s)，H-7(5.78，s)，H-9(2.91，m)，H-11(2.32，m)，H-11(2.57，m)，H-14(2.63，d，J＝16.0)，H-14(2.21，d，J＝16.0)，H-15(5.78，dd，J＝17.8，11.2)，H-16(5.10，d，J＝11.2)，H-16(4.94，d，J＝17.8)，H-17(1.02，s)，H-19(1.39，s)，H-20(1.08，s)，1-OAc(2.21，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，125MHz)：71.9(CH，1-C)，74.4(CH，2-C)，64.2(CH，3-C)，46.2(C，4-C)，58.1(CH，5-C)，193.6(C，6-C)，126.2(CH，7-C)，155.3(C，8-C)，40.1(CH，9-C)，34.8(C，10-C)，37.5(CH₂，11-C)，210.1(C，12-C)，55.7(C，13-C)，42.2(CH₂，14-C)，141.1(CH，15-C)，115.8(CH₂，16-C)，17.8(CH₃，17-C)，174.9(C，18-C)，12.2(CH₃，19-C)，17.3(CH₃，20-C)，170.1(C，1-OAc)，20.8(CH₃，1-OAc)；碳原子标记参见图1。该化合物在227nm处有紫外吸收带，说明含有α,β-不饱和酮羰基基团。¹H和¹³C-NMR谱显示了三个甲基[δH1.02(s，H-17)，1.39(s，H-19)和1.08(s，H-20)；δC17.8(C-17)，12.2(C-19)和17.3(C-20)]，一个2,18-内酯结构[δH4.54(d，J＝4.9Hz，H-2)；δC74.4(C-2)和174.9(C-18)]，一个α,β-不饱和酮羰基[δH5.78(s，H-7)；δC193.6(C-6)，126.2(C-7)和155.3(C-8)]，一个酮羰基[δC210.1(C-12)]，乙烯基[δH5.78(dd，J＝17.8，11.2Hz，H-15)，4.94(d，J＝17.8Hz，H-16)和5.10(d，J＝11.2Hz，H-16)；δC141.1(C-15)和115.8(C-16)]，一个乙酰氧基[δH2.21(s，1-OAc)；δC170.1(1-OAc)和20.8(1-OAc)]。含氧碳信号δC64.2以及氢质子信号δH4.68表明C-3位连有一个羟基。HMBC谱中，质子信号δH5.01与相应酯羰基碳δC170.1的相关性表明C-1(δC71.9)位连有一个乙酰氧基。通过核磁数据可知，C-13同时连有乙烯基和叔甲基；HMBC谱中C-13与H₂-16，H₂-14和Me-17，C-15与H-16b，H₂-14和Me-17，以及C-16与Me-17的相关性验证了上述推论。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验

一、材料和仪器

Aβ_25-35购于美国sigma公司。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98％。MTT(四唑氮蓝)购于美国Amresco公司。LDH测定试剂盒购于南京建成生物有限公司。吖啶橙(AO)购于美国sigma公司。溴化乙啶(EB)购于美国sigma公司。RNase酶购于美国sigma公司。蛋白酶K购于美国sigmaAnnexin公司。Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。D-MEM/F12培养基干粉购于美国GibcoL公司。马血清购于美国hycLon公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。多聚赖氨酸(PLL)购于美国sigma公司。

低温高速离心机(美国Heraeus)，二氧化碳培养箱(美国SHELL/JB)，超净工作台(苏州净化设备厂)，雷勃MK3酶标仪(芬兰Thermolabsystems)，荧光显微镜(德国Leica)，流式细胞仪EpicsXL(美国CouLter公司)，电泳系统(北京六一仪器厂)，雷勃MK3酶标仪(芬兰Thermolabsystems)，荧光显微镜(德国Leica)，流式细胞仪EpicsXL(美国CouLter公司)，电泳系统(北京六一仪器厂)。

二、试验方法

1、细胞培养

PC12细胞生长于含10％马血清、5％胎牛血清的D-MEM/F12培养液(37℃，体积分数为0.05的CO₂，饱和湿度)，常规传代。实验时培养器皿用0.005％PLL溶液(分子量为150，000-300，000)包被，增加PC12细胞对培养器皿黏附力。

2、Aβ_25-35凝聚态处理

Aβ_25-35溶于无菌双蒸水，终浓度为2.0mmol/L，分装，-20℃保存，临用前，37℃孵育4-7d。

3、药物对PC12细胞的处理

对数生长期的PC12细胞按一定的密度分别接种于培养板中，待其生长稳定后，将细胞分组，即对照组，Aβ_25-35诱导凋亡组以及化合物(Ⅰ)干涉Aβ_25-35诱导凋亡组。其中Aβ_25-35诱导凋亡组，以培养液加入凝聚态的Aβ_25-35储存液，配制一定浓度的工作液，分别加入细胞培养板，每孔再分别加入细胞悬液，CO₂培养箱培养。每小组均设3个平行孔；其次依据20μmol/LAβ_25-35，设定化合物(Ⅰ)干涉凋亡组，细胞以不同浓度化合物(Ⅰ)预处理1h，再分别予终浓度20μmol/LAβ_25-35培养。

4、MTT法测定细胞存活率

取对数生长期的细胞以2-5×10⁵/mL的初始浓度分别接种于96孔培养板中每孔160μL，待其生长稳定后，加入不同浓度的Aβ_25-35，细胞对照组只加等量培养液，每组设三个平行孔。培养96小时，每孔加5mg/mL的MTT溶液(PBS配制)20μL，混匀后继续培养4h，弃上清液，每孔加DMSO0.2mL，振荡10min，以空白对照孔调零，在490nm波长下测定各孔光密度值。

5、LDH释放量的测定

接种于24孔细胞培养板的细胞，经药物处理48h后，吸出各组上清液备用，各组细胞加入0.1％NP-401mL作用10min，收集上清液备用。按照LDH测定试剂盒说明，分别检测各组上清液和0.1％NP-40的LDH活性，LDH释放率＝OD_上清/(OD_上清+OD_0.1％NP-40)×100％。

6、流式细胞分析细胞凋亡

按AnnexinVFITC试剂盒说明操作：

(1)细胞处理一定时间后，2000rpm/min离心5min，细胞数1－5×10⁵；

(2)用PBS清洗细胞二次，2000rpm离心5min；

(3)加入500μLBindingbuffer悬浮细胞；

(4)加入2μLAnnexinV-FITC混匀后，加入5μLPropidiumIodide(PI)，混匀，室温，避光反应20min；

(5)流式细胞仪(BackmancoulterEpicsXL)检测，激发波长488nm，发射光530nm.，对散点图进行分析。

7、统计分析

结果用均数±标准差表示，两两比较用t检验，P<0.05认为有统计学意义。

三、结果及结论

1、MTT测定Aβ_25-35对PC12细胞活性的影响

从图3可看出，Aβ_25-35处理PC12细胞4d后，MTT法检测显示20，40μmol/LAβ_25-35作用组吸光值(A490)明显降低，差别有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测表示线粒体功能，结果说明Aβ_25-35使PC12细胞线粒体功能降低，活细胞数减少，即Aβ_25-35对PC12细胞的活性有抑制作用，并与作用浓度相关。结果见表1及图3。

表1Aβ_25-35对PC12细胞生长的抑制作用

Aβ_25-35(μmol/L)	0	10	20	40
					细胞存活率	100	87.04±4.3％	73.4±3.2％	68.6±3.08％

2、LDH释放量测定

10、20、40μmol/LAβ_25-35作用PC12细胞48h后，通过检测细胞LDH释放率显示细胞的损伤程度，结果表明Aβ_25-35对PC12细胞的毒性作用，并与作用的浓度相关，20、40μmol/LAβ_25-35作用组与对照组比较，差别有统计学意义(图4)。选20μmol/LAβ_25-35作为损伤组，观察化合物(Ⅰ)的干预作用，作用48h，结果表明，10ng/mL化合物(Ⅰ)即能降低PC12细胞LDH释放率，但差异不显著；100ng/mL，1000ng/mL化合物(Ⅰ)组明显降低PC12细胞LDH释放率【图5；标号意义：1、control；2、20μmol/LAβ_25-35；3、20μmol/LAβ_25-35+1.0ng/mL化合物(Ⅰ)；4、20μmol/LAβ_25-35+10ng/mL化合物(Ⅰ)；5、20μmol/LAβ_25-35+100ng/mL化合物(Ⅰ)；6、20μmol/LAβ_25-35+1000ng/mL化合物(Ⅰ)；其中4、5、6三组与20μmol/LAβ_25-35组比较p<0.05】。

3、AnnexinⅤ-PI染色的流式细胞法检测细胞凋亡

各组PC12细胞经处理后上流式细胞仪，并对散点图进行分析(MuLticycL软件处理)，显示对照组、10μmol/LAβ_25-35、20μmol/LAβ_25-35作用48h后，PC12细胞的凋亡率分别为2.1±0.3％，9.3±0.5％和18.6±3.4％，凋亡率与Aβ_25-35剂量成正相关，与对照组比较差别具有显著性意义，以100ng/mL化合物(Ⅰ)预先处理，凋亡率降低为11.2±3.7％，差别有统计学意义(表2，与对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01；与20μmol/LAβ_25-35组比较，#：P<0.05)，显示化合物(Ⅰ)抗Aβ_25-35致凋亡作用。

表2流式细胞术检测PC12细胞凋亡率(n＝3)

组别	细胞凋亡率(％)
		对照组	2.1±0.3％
10μmol/L Aβ_25-35	9.3±0.5％*
		20μmol/L Aβ_25-35	18.6±3.4％**
20μmol/L Aβ_25-35+100ng/mL化合物(Ⅰ)	11.2±3.7％^#

总结，本研究发现应用20μmol/LAβ_25-35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞株PC12凋亡模型；化合物(Ⅰ)能部分对抗Aβ_25-35诱导的PC12凋亡。

实施例3

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：

2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将马齿苋的干燥地上部分粉碎，用80～90％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用5％乙醇洗脱6个柱体积，再用75％乙醇洗脱8个柱体积，收集75％洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、8:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用85％乙醇热回流提取，合并提取液。

4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备神经保护的药物中的应用。

7.权利要求5所述的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。