KR20200124896A

KR20200124896A - 우유 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20200124896A
Application number: KR1020190048320A
Authority: KR
Inventors: 김상훈; 배인선
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-11-04
Also published as: WO2020218846A1; KR102186872B1

Abstract

본 발명은 우유 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

Description

우유 엑소좀을 포함하는 피부 미백용 조성물{SKIN WHITENING COMPOSITION COMPRISING MILK EXOSOMES}

사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)에서 생성된다. 구체적으로 멜라닌은 생체 내 존재하는 아미노산인 티로신(tyrosine)을 기질로 하여, 멜라노사이트에 존재하는 티로시나제(tyrosinase) 등의 효소에 의한 중합화 산화 반응으로 형성되는 흑갈색의 색소이다. 이렇게 형성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피세포로 이동하게 된다. 케라티노사이트로 이동한 멜라닌은 케라티노사이트가 표피에서 떨어져 나갈 때에 피부에서 함께 떨어져 나감으로써 제거될 수 있다. 그러나, 생체 내에 멜라닌을 분해하는 효소가 없기 때문에 한번 형성된 멜라닌은 생체 내에서는 분해되지 않는다. 따라서, 피부를 밝게 하기 위하여는 멜라닌의 생성을 억제하는 것이 관건이라 할 수 있다.

최근 정서적으로 흰 피부를 선호하는 동양권의 생활 수준 향상과 더불어 피부 흑화가 자외선에 의한 피부 노화로 인식되면서 미백 및 색소 침착 억제에 관한 연구의 필요성이 점차 증대되고 있다. 그에 따라 아스코르빈산(ascorbic acid), 하이드로퀴논(hydroquinone), 글루타치온(glutathione), 알부틴(arbutin) 등의 티로시나아제 저해 활성을 나타내는 물질들이 화장료나 의약품에 배합되어 사용되어 왔으나, 이들 중 대부분의 것은 효과가 불충분하거나 제형상 불안정한 면이 있어 활용도가 떨어진다. 특히 하이드로퀴논과 같은 화합물은 강한 탈색 작용을 나타내며 그 자체가 피부 감작성을 가지고 있어 피부 알레르기 등을 유발할 수 있고, 정상적인 피부의 기능을 변화시켜 백반증을 유발하는 등의 부작용을 나타내어 피부에 대한 안전성 측면에서 그 사용이 제한되고 있다.

또한, 상기와 같이 티로시나아제의 활성을 저해하는 물질이라 하더라도 이러한 물질이 각질 형성 세포인 케라티노사이트에 작용하여 멜라닌의 생합성을 촉진시키는 인자의 생성을 증가시킨다면, 결과적으로 미백 작용은 약화되거나 오히려 악효과를 거둘 수 있기 때문에 단순히 티로시나아제의 활성 저해제가 좋은 미백제라고 볼 수 없으며, 이에 많은 티로시나아제 저해제가 개발되고 있으나 거의 대부분이 우수한 미백 효과를 나타내지 않는 것으로 알려져 있다.

이에 따라, 미백 또는 색소 침착 억제 효과가 우수한 물질에 대한 연구 및 개발이 요구되고 있다.

한국등록특허 제10-1663912호

본 발명의 목적은 우유 엑소좀을 포함하는, 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 우유 엑소좀을 포함하는, 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 우유 엑소좀을 포함하는, 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, “우유 엑소좀”은 우유 유래의 지질 이중충의 소낭을 말한다. 상기 엑소좀은 우유 유래의 고유의 단백질 및 핵산 등을 포함하고 있으며 30~200 nm 크기의 생체 나노입자로, 내부에 DNA, RNA, 펩타이드 등으로 이루어진 정보가 담겨있다. 엑소좀은 내부의 물질을 체액 내 분해 효소 등으로부터 안전하게 운반하여 인접 세포 또는 원거리 세포에 정보 전달을 하여 세포 주변의 미세 환경에 영향을 미친다. 특히, 우유 유래의 우유 엑소좀은 식품으로도 접할 수 있을 뿐만 아니라 많은 양의 엑소좀이 추출되며, 긴 시간 동안 안정한 상태로 보관할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서, “미백”은 피부를 하얗게 하는 것을 의미하며 멜라닌의 과도한 합성이나, 티로시나아제 효소의 활성, L-DOPA의 과도한 산화 등으로 인한 기미, 주근깨 등의 다양한 색소 침착을 완화 또는 개선하는 것을 말한다.

구체적으로, 본 발명의 상기 우유 엑소좀은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 miR-2478을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 본 발명의 우유 엑소좀이 세포 독성이 없음을 확인하였으며(도 4), 우유 엑소좀을 처리한 경우 티로시나아제의 활성 및 발현이 억제되고, 멜라닌 생합성을 촉진하는 전사인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 의 발현 역시 억제됨을 확인하였다(도 5 내지 도 7). 특히, 피부에 색소를 침착시켜 피부를 어둡게 하는 멜라닌의 합성이 감소하는 것을 직접적으로 확인하였다(도 8). 또한, 본 발명의 우유 엑소좀 내에 마이크로 RNA인 miR-2478이 포함되어 있음을 확인하였다(도 9).

구체적으로, 상기 피부 미백용 조성물은 화장료 조성물인 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부에 직접 도포하거나 살포하는 등의 경피 투여 방법으로 사용될 수 있으며, 본 발명 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 사용량은 연령, 병변의 정도 등의 개인 차이나 제형에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 1일 1회 내지 수회 적?韜?을 피부에 도포하여 1 주일 내지 수개월 사용될 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 피부 미백용 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 우유 엑소좀을 첨가할 수 있는 식품은 소세지, 육류, 빵, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 본 발명의 우유 엑소좀 외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올일 수 있다.

상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능 식품은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.

본 발명의 우유 엑소좀을 건강기능식품(또는 건강기능 음료 첨가물)으로 사용할 경우, 상기 우유 엑소좀을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 우유 엑소좀의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 상기 우유 엑소좀은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 miR-2478을 포함하는 것일 수 있다.

상기와 같은 결과로부터 본 발명의 우유 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물이 멜라닌 합성을 억제함으로써 과다 색소 침착을 억제할 수 있으며, 멜라닌 합성 및 티로시나아제 활성 등에 기인한 피부 색소 침착 질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 본 발명의 우유 엑소좀 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 보다 구체적으로 비경구용 제형일 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있다. 더욱 구체적으로는 주사제 형태일 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 우유 엑소좀을 포함하는 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 질환의 치료방법에 관한 것이다. '피부 색소 침착 질환'은 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 피부 색소 침착 질환을 가진 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 피부 색소 침착 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 우유 엑소좀을 포함하는 조성물은 독성이 없어 생체 적합성이 우수하며, 티로시나아제 효소 활성 억제 및 멜라닌 합성 억제 효과가 우수하여 피부 미백 및 피부 색소 침착 질환 치료에 널리 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 우유 엑소좀의 크기 및 엑소좀 마커를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 전자현미경을 이용하여 우유 엑소좀의 형태 및 크기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 우유 엑소좀의 B16F10 세포 내로의 흡수를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 우유 엑소좀의 독성 여부를 세포 생존율을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 우유 엑소좀의 티로시나아제 효과 활성 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 우유 엑소좀의 티로시나아제 및 MITF 의 mRNA 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 6A: 티로시나아제의 mRNA 발현 억제, 도 6B: MITF의 mRNA 발현 억제).
도 7은 우유 엑소좀의 티로시나아제 및 MITF 의 단백질 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 우유 엑소좀의 멜라닌 합성 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 우유 엑소좀 처리에 따른 miR-2478의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 우유 엑소좀(milk exosome) 제조방법

원심분리기를 이용하여 소 유래 우유에서 엑소좀을 추출하였다. 보다 구체적으로는, 우유를 튜브에 분주하여, 2000g와 10,000g에서 각각 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수거하였다. 수거한 상층액을 0.45 μm, 0.2 μm 필터로 여과한 다음, phosphate buffered saline (PBS)를 혼합하였다. 이후, Exoquick exosome precipitation solution (System Biosciences)을 PBS와 혼합하여 넣어 준 후, 30분 동안 휴지시키고, 1500g에서 30분간 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 엑소좀 펠렛을 PBS에 용해시켜 이후 실험에 이용하였다.

실험예 1. 우유 엑소좀의 특성 확인

1-1. 우유 엑소좀의 크기 측정

우유 엑소좀의 크기를 확인하기 위해 동적 광산란 측정(dynamic light scattering, DLS)을 통해 엑소좀의 크기를 측정하였으며, 80~190nm 크기를 나타냄을 확인하였다(도 1).

1-2. CD9 단백질 발현 확인

엑소좀 마커인 CD9 발현 여부를 웨스턴블롯을 이용하여 확인하였으며, 도 1에 나타난 바와 같이 엑소좀 마커인 CD9 단백질이 엑소좀에서는 뚜렷이 관찰되었으며, 엑소좀 외에 상층액에서는 CD9 발현이 되지 않음을 확인하였다.

우유 엑소좀에서 10% SDS 폴리아크릴마이드 젤을 이용하여 단백질을 분리하였다. 상기 분리한 단백질은 니트로셀룰로오스막(GE Health care)으로 옮긴 후, 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 1시간 동안 5% 탈지분유에 반응하였다. CD9(abcam) 1차 항체를 1:1000의 비율로 희석하여 4 ℃에서 12 ~ 18시간 동안 막에 결합시켰다. 이후, HRP-tagged anti-rabbit 항체와 결합시켜 상온에서 30분 동안 반응시켰다. ECL kit(Santa Cruz Inc)를 사용하여 단백질 밴드를 관찰하였다.

1-3. 엑소좀의 형태 및 크기 확인

상기 실시예 1에서 추출한 우유 엑소좀의 형태 및 크기를 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 엑소좀이 200nm 크기 내에서 구형으로 존재하는 것을 확인하였다.

1-4. 엑소좀의 세포 내 흡수 확인

우유에서 추출한 엑소좀이 세포 내로 흡수되는지 확인하기 위하여, 엑소좀을 PKH26 염색액으로 5분동안 처리하고, 멜라닌 세포인 B16F10 세포에 염색한 엑소좀을 3시간 반응시킨 후 형광을 관찰하였다.

구체적으로, 엑소좀 펠렛을 1ml Diluent C를 첨가하고, 따로 1ml의 Diluent C는 4 μl의 PKH26 (Sigma)으로 혼합시켜 stain solution을 만들었다. 상기 stain solution을 Diluent C를 첨가한 엑소좀과 혼합하여 5분 동안 반응시켰고, 1% bovine serum albumin이 더해지면서 반응을 멈추었다. PKH26으로 표지된 엑소좀은 Exoquick exosome precipitation solution(System Biosciences)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 이후 형광 현미경(CELENA S digital imaging system, Logos Biosystems)을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 B16F10 세포 내에 염색된 엑소좀이 들어간 것을 확인하였으며, 이를 통해 우유에서 엑소좀이 추출되었으며, 추출된 엑소좀의 세포 내 흡수가 나타남을 확인하였다.

실험예 2. 우유 엑소좀의 세포 독성 확인

멜라닌 세포인 B16F10 세포를 이용하여 본 발명의 우유 엑소좀에 독성이 있는지 확인하기 위하여, B16F10 세포에 우유 엑소좀을 각각 20 μg/ml 및50 μg/ml을 24시간 동안 처리하여 세포 생존율을 측정하였다. 우유 엑소좀을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다(Mock).

B16F10 세포를 96 웰 플레이트에 5x10⁴ cells/ml이 되도록 분주하고 37℃, 5%, CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 배양된 세포에 우유 엑소좀을 처리하고, 24시간 동안 배양한 후, EZ-Cyrox 세포생존율 분석키트(Daeil Lab Service)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 세포 생존율에 대한 효과를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 우유 엑소좀을 처리한 군 모두에서 생존율 변화가 나타나지 않은 바, 본 발명의 우유 엑소좀이 독성이 없음을 확인하였다.

실험예 3. 티로시나아제(Tyrosinase, TYR) 효소 활성 억제

피부에서는 티로시나아제 효소에 의해 색소침착이 일어나며, 본 발명의 우유 엑소좀에 의해 티로시나아제의 활성이 억제되는지를 확인하였다. B16F10 세포에 우유 엑소좀을 각각 20 μg/ml 및50 μg/ml을 각각 처리하여 티로시나아제의 활성을 측정하였으며, 우유 엑소좀을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하였다(Mock).

구체적으로, B16F10세포에 우유 엑소좀을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 1% Triton X-100, 5mM EDTA, 0.1% 0.1M PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)를 혼합한 0.1M 포스페이트 완충용액으로 상기 세포를 수거한 후 얼음에서 30분간 용해시켰다. 그 후, 4℃, 16,500g 조건으로 30분간 원심분리하여 상층액을 티로시나아제 활성 측정 용액으로 사용하였다. 상기 상층액 40 μl에 80 μl의 0.1M 포스페이트 완충용액과 40 μl 티로시나아제를 첨가하였다. 기질로서 40 μl의 10mM DOPA를 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 플레이트 리더기를 이용하여 파장 475nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 우유 엑소좀을 20 μg/ml 및 50 μg/ml 농도로 처리한 경우, 대조군에 비해 티로시나아제의 활성이 현저히 감소됨을 확인하였다.

실험예 4. 티로시나아제 및 MITF의 발현 억제 확인

4-1. 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)

우유 엑소좀이 멜라닌 생합성 과정에 중요한 효소인 티로시나아제 및 전사인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통해 티로시나아제 및 MITF의 mRNA 발현을 확인하였다.

B16F10세포에서 우유 엑소좀을 처리 하고 24시간 후에 세포를 수거하였다. 상기 수거한 세포에Tri 시약(Bioline)을 반응시켜 total RNA를 분리하였다. 역전사 반응을 실시하기 위하여 1 μg RNA에 dNTP, M-MLV reverse-transcriptase (Promega) 등을 첨가한 다음 37℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. TYR과 MITF mRNA 발현을 측정하기 위해 SYBR Green PCR Master mix(Bioline)를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 특정 유전자를 증폭하기 위한 PCR 조건은 다음과 같이 시행하였다. 95℃에서 10분간 반응시킨 다음, 15초 95℃, 15초 60℃, 72℃ 15초를 한 주기로 하여 40 cycles 동안 증폭하였다. 표적 유전자 mRNA 발현량은 actin 발현량에 대한 상대적인 발현량으로 보정하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

서열번호	프라이머 종류	서열
1	TYR Forward	5'- CGA GCC TGT GCC TCC TCT AA -3'
2	TYR Reverse	5'- CCA GGA CTC ACG GTC ATC CA -3'
3	MITF Forward	5'- CAA ATG GCA AAT ACG TTA CCC G -3'
4	MITF Reverse	5'- CAA TGC TCT TGC TTC AGA CTC T -3'

그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 처리한 경우, 티로시나아제의 mRNA 발현이 억제됨을 확인하였으며, 처리된 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 티로시나아제의 mRNA 발현 억제 효과가 증가함을 확인하였다. 구체적으로, 티로시나아제 mRNA 발현이 20 μg/ml 처리한 처리군에서는 49%, 50 μg/ml을 처리한 처리군에서는 76% 감소함을 확인하였으며, 티로시나아제의 발현 억제 효과가 우수함을 확인하였다.또한, 도 6B에 나타난 바와 같이, 우유 엑소좀을 처리한 경우, 멜라닌 생합성 과정에 중요한 전사인자인 MITF의 mRNA 발현 역시 억제됨을 확인하였으며, 처리된 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 MITF의 mRNA 발현 억제 효과는 증가함을 확인하였다. 구체적으로 MITF mRNA 발현이 20 μg/ml 처리한 처리군에서는 59%, 50 μg/ml을 처리한 처리군에서는 85% 감소함을 확인하였으며, MITF의 mRNA 발현 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

4-2. 웨스턴블롯(Western blot)

우유 엑소좀이 멜라닌 생합성 과정에 중요한 전사인자인 티로시나아제 및 MITF 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 티로시나아제 및 MITF의 단백질 발현 정도를 확인하였다.

B16F10세포주를 2×10⁵ cells/well로 6 웰 플레이트에 부착시킨 다음, 우유 엑소좀을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 수거한 세포를 16,500g에서 15분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후, 단백질 농도를 BSA 키트(Bio-rad)로 정량하였다.

추출한 단백질은 10% SDS 폴리아크릴마이드 젤을 이용하여 단백질을 분리하였다. 상기 분리한 단백질은 니트로셀룰로오스막(GE Health care)으로 옮긴 후, 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 1시간 동안 5% 탈지분유에 반응하였다. TYR (abcam), MITF (abcam), Actin (Sigma)의 1차 항체를 1:1000의 비율로 희석하여 4℃에서 12 - 18시간 니트로셀룰로오스막과 반응시켰다. 이후, PBS로 세척한 다음 HRP-tagged anti-rabbit 항체를 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. ECL 키트 (Santa Cruz Inc.)를 사용하여 단백질 밴드를 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 처리한 경우, mRNA의 발현이 감소된 것과 마찬가지로, 티로시나아제 및 MITF의 단백질 발현이 모두 감소된 것을 확인하였으며, 처리된 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 티로시나아제 및 MITF의 단백질 발현 억제 효과는 증가함을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 본 발명의 우유 엑소좀이 미백 효과를 유도함을 나타내는 것이다.

실험예 5. 멜라닌 합성 억제효과 확인

직접적으로 피부색을 결정하는 멜라닌을 억제시키는 우유 엑소좀의 효능을 알아보고자 B16F10 세포에 우유 엑소좀을 처리하여 멜라닌 함량을 측정하였다.

B16F10 세포주에 우유 엑소좀을 각각 20 μg/ml, 50 μg/ml 농도로 처리한 다음, 24시간 동안 배양하고 세포를 수거하였다. 회수한 세포에 10% DMSO를 포함하는 1N NaOH를 첨가한 다음 90℃에서 1시간 반응시켜 멜라닌이 충분히 용출될 수 있도록 한 후 플레이트 리더기를 이용하여 파장 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 처리한 경우, 멜라닌 합성이 저해되는 것을 확인하였으며, 처리된 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 멜라닌 합성 억제 효과가 증가함을 확인하였다. 구체적으로, 우유 엑소좀20 μg/ml 처리한 처리군에서는 43%, 50 μg/ml을 처리한 처리군에서는 58% 감소함을 확인하였으며, 이로부터 직접적으로 멜라닌 합성을 억제하는 효과가 우수함을 확인하였다.

실험예 6. 우유 엑소좀 내의 miRNA(microRNA) 확인

피부 색소 침착에 관여하는 우유 엑소좀 내의 microRNA을 확인하였다. 소에 서 유래한 우유 엑소좀을 이용하여 microRNA 프로파일링을 조사한 결과, miR-2478이 가장 많이 존재한다는 연구 결과가 보고된 바 있음에 따라(Izumi, H., Tsuda, M., Sato, Y., Kosaka, N., Ochiya, T., Iwamoto, H., Namba, K., andTakeda, Y. (2015). Bovine milk exosomes contain microRNA and mRNA and are taken up by human macrophages. J. Dairy Sci. 98, 2920-2933.), 본 발명에서는 우유 엑소좀을 처리함에 따라 miR-2478이 증가하는지 확인하였다.

B16F10 세포에 우유 엑소좀을 20 μg/ml, 50 μg/ml 농도로 처리한 후 miR-2478의 발현을 확인하였다. 상기 miR-2478의 서열은 아래와 같다.

서열번호	miRNA	서열
5	miR-2478	5'-GUAUCCCACUUCUGACACCA-3'

6웰 플레이트 상에 B16F10 세포를 2x10⁵ cells/well 의 농도로 분주하고, 우유 엑소좀을 농도 별로 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 수거하고, 1ml의 TRI 시약(Bioline)을 이용하여 추출한 총 RNA 100ng에 miScript Reverse Transcription kit(Qiagen)을 활용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 생산물 2 μl를 miScript SYBR Green kit(Qiagen)를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 다음과 같은 PCR 조건 하에서 유전자를 증폭시켰다. 즉, Roto gene Q PCR 기기(Qiagen)을 이용하여 94°C 에서15 분, 그 후 94°C에서 15초, 55°C에서 30초 및 70°C에서 20 초의 40주기로 증폭시켰다. 유전자 발현은 SNORD61 발현으로 보정하였으며, miR-2478 검출용 miRNA 특이적 프라이머는 QIAGEN(miScript primer assay)으로 부터 구매하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 처리한 경우, miR-2478의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며, 처리된 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 miR-2478의 발현이 증가함을 확인하였다. 이를 통해 우유 엑소좀이 세포에 들어가면 세포내의 miR-2478이 우유 엑소좀 농도 의존적으로 증가하는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터 본 발명의 우유 엑소좀은 세포 독성이 없으면서도 티로시나아제 효소 활성 및 멜라닌 합성을 억제함으로써 미백 효과를 나타냄을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 우유 엑소좀은 피부 미백용으로 널리 활용될 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> SKIN WHITENING COMPOSITION COMPRISING MILK EXOSOMES <130> 19PP30076 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYR Forward primer <400> 1 cgagcctgtg cctcctctaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYR Reverse primer <400> 2 ccaggactca cggtcatcca 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF Forward primer <400> 3 caaatggcaa atacgttacc cg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF Reverse primer <400> 4 caatgctctt gcttcagact ct 22 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-2478 <400> 5 guaucccacu ucugacacca 20

Claims

우유 엑소좀을 포함하는, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 우유 엑소좀은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 miR-2478을 포함하는 것인, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 우유 엑소좀은 소 유래인 것인, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 미백용 조성물은 화장료 조성물인 것인, 피부 미백용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 미백용 조성물은 식품 조성물인 것인, 피부 미백용 조성물.
우유 엑소좀을 포함하는, 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 우유 엑소좀은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 miR-2478을 포함하는 것인, 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 우유 엑소좀은 소 유래인 것인, 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.