KR20150126048A - O-결합된 n-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제의 표적화 및 상처 치유 촉진용 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시의 주제는 UDP-N-아세틸글루코사민 폴리펩티드 β-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 (OGT) 를 표적화하는 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 추가로, 본 개시의 주제는 상처 치유를 촉진하기 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다.
Description
관련 출원
본 출원은 본원에서 인용 삽입되어 있는 2013 년 3 월 11 일에 제출된 미국 가특허출원 시리얼 No.61/775,937 의 우선권을 주장한다.
정부 관심
본 발명의 개시된 주제는 National Institutes of Health 에 의해 수여된 Grant RO1 AI49427 하 미국 정부로부터 지지 받고 있다. 미국 정보는 후술되는 발명(들) 에 있어 특정 권리를 갖는다.
기술분야
개시된 본 발명의 주제는 UDP-N-아세틸글루코사민 폴리펩티드 β-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 (OGT) 를 표적화하기 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개시된 주제는 추가로 상처 치료 촉진을 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
배경 기술
만성의 상처는 미국 내 650 만명의 환자에 영향을 미치는 질병률의 유의한 근원으로 연간 치료하는데 약 250 억 달러 비용이 든다 (1). 당뇨병이 있는 환자는 만성의 비치유 상처가 발달될 위험이 증가한다. 아마도, 다양한 인자들로 인해, 당뇨병 환자에게 있어, 글루코오스 수준 상승을 야기하는 기초 내분비 기능장애뿐이 아닌 신경병, 혈관병을 비롯한 만성의 상처가 발달되는 경향이 있다.
인산화와 같이 세포내 단백질 O-글리코실화는, 효소, 전사 인자, 구조 및 세포 부착 단백질을 포함하는 다수의 세포내 단백질을 조절하는 통상적인 역동적 번역후 개질이다. 세린 및 트레오닌의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 개질은 효소 UDP-N-아세틸글루코사민-폴리펩티드 β-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 (O-GlcNAc 트랜스퍼라아제, OGT) 에 의해 촉매화되는 반면; GlcNAc 는 O-GlcNAc-선택적 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 (GlcNAcase, OGA) ((2) 에서 리뷰됨) 에 의해 제거된다.
고혈당증, 즉 과량의 글루코오스가 글루코사민 통로로 공급되어 OGT 에 대해 과도한 UDP-GlcNAc 를 제공해 세포내 단백질을 개질시킨다 (3). 과량의 글루코오스는 글루코사민으로 전환되고, 이는 궁극적으로 세포내 단백질의 OGT 개질을 위한 공여자 기질인 UDP-N-아세틸글루코사민 (UDP-GlcNAc) 로 전환된다. 결과적으로, 고혈당증은 각종 단백질의 증가된 O-글리코실화와 관련있다 (3-7). 당뇨병을 비롯해 고혈당 상태에서 관찰되는 세포내 단백질의 증가된 GlcNAc 개질은 당뇨병과 연관되는 일부의 병적 이상에 기인하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, (i) 췌장 β-세포는 OGT 가 고수준이고, 세포내 O-GlcNAc 개질의 변경에 있어 민감하고, (ii) 트랜스제닉 마우스 모델에서 근육 및 지방 조직 내 OGT 의 과발현은 당뇨병을 야기한다 (8). 세포내 단백질의 증가된 GlcNAc 개질은 인간 당뇨병 조직 (9) 및 고혈당 동물 모델 (4) 을 포함해, 당뇨병이 있는 조직에서 관찰된다. 나아가, 당뇨병에 있어서 세포내 O-글리코실화에 대한 병리학적 역할에 대한 지원은 당뇨병의 유전적 연관성 및 증가된 세포내 단백질 O-글리코실화를 야기하는 돌연변이를 입증하는 연구로부터 나온다. OGA 를 인코딩하는 유전자에서 초기 종료화를 야기하는 돌연변이는 멕시코계 미국인 인구의 성인 발병형 제 2 형 당뇨병의 유전적 경향과 연관되어 있다 (10). OGA 는 세포내 단백질로부터 GlcNAc 를 제거하고, 동정된 OGA 돌연변이 결과 단백질 O-글리코실화의 수준을 증가시킨다.
상처 치유 동안, 상처 주변부의 케라티노사이트는 길게 뻗은 주변부에서 인접 세포로의 부착을 하향 조절하여 가장자리에서 상처 내부로 이동을 허용해야 한다 (11). 그룹으로부터의 이전 데이타는 증가된 O-글리코실화가 플라코글로빈을 비롯한 데스모솜 성분의 번역후 안정성을 증가시킴으로써 세포-세포 부착을 일부 안정화시킨다고 입증하였다 (12).
간략 개요
간단하게도, 본 발명의 개시는 OGT 를 표적화하고/하거나 상처 치유를 촉진하기 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 개시의 특정 구현예에서, 단리된 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이 18-30 뉴클레오티드이고, 나아가 단리된 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드는 OGT mRNA 에 하이브리드화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3 로 제시된 서열, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 로 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 중간 내지 고 엄격성의 조건 하에서 OGT mRNA 에 하이브리드화된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 (i) OGT 폴리뉴클레오티드 (이때 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 18-30 뉴클레오티드이고, OGT mRNA 에 하이브리드화하함); 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드는 제 1 의 상처 치유제 및/또는 제 1 의 항-OGT 제제이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 추가로 제 2 의 상처 치유제 및/또는 제 2 의 항-OGT 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 중간 내지 고 엄격성의 조건 하에서 OGT mRNA 에 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 겔, 알기네이트, 하이드로겔, 또는 셀룰로오스-기재 담체 (히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 및 그 혼합물로부터 선택) 이다. 그리고 일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, Pluronic®-F-127 및/또는 그 혼합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 의 코딩 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 173 의 코딩 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 173 의 인트론 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 또는 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편에 상응하는 서열을 포함하고, 이때 상기 서열은 SEQ ID NOs: 4-168 중 임의 하나로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나의 단편을 포함하고, 폴리뉴클레오티드의 서열이 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편에 상응하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 18-30 뉴클레오티드 분자에 상응하도록, 1-10 뉴클레오티드 잔기를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국부 적용 및/또는 국소적 주사를 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 상처 드레싱으로 제형화된다. 그리고, 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 콜로이드성 겔 드레싱에서 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 지효성, 예를 들어 서방성, 복효형 (extended release), 및/또는 방출 제어형으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 액체, 크림, 고약 (ointment), 에멀젼, 로션, 스프레이, 연고 (salve), 폼 (foam) 및/또는 페인트이다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 약학적 조성물의 폴리뉴클레오티드는 상처가 있는 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 상처는 예상되는 속도로 치유되지 않는다. 특정 구현예에서, 대상체의 상처는 지연되고, 치유되기 곤란하고 및/또는 만성이며, 추가 구현예에서, 상기 상처는 OGT 발현 증가로 적어도 일부 특성화된다.
일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병이 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 (i) 제 1 형 당뇨병, (ii) 제 2 형 당뇨병, (iii) 일반 혈액 글루코오스 수준보다 높음 및/또는 (iv) 인슐린-저항 수용체를 갖는다. 일반 구현예에서, 대상체는 당뇨병이 없다.
본 발명 개시된 주제의 일정 구현예에서, 세포 내 OGT 저해 방법이 제공되고, 이는 항-OGT 제제를 세포에 투여하는 것을 수반하며, 이때 항-OGT 제제는 (i) 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드 (이때 상기 폴리뉴클레오티드는 길이 18-30 뉴클레오티드이고, OGT mRNA 에 하이브리드화되는 서열을 가짐); (ii) OGT 의 발현을 저해하는 이중 가닥 RNA 분자; 및 (iii) OGT 의 발현을 저해하는 쇼트 (short) 헤어핀 RNA 분자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 인슐린-저항성 수용체를 포함하고, 특정 구현예에서, 상기 세포는 대상체 내에 존재한다.
본 발명의 개시된 주제의 특정 구현예에서, 상처가 있는 대상체의 치료 방법이 제공되고, 이는 항-OGT 제제를 대상체에 투여하는 것을 수반하며, 이때 상기 항-OGT 제제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: (i) 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드 (이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 18-30 뉴클레오티드이고, OGT mRNA 에 하이브리드화되는 서열을 가짐); (ii) OGT 의 발현을 저해하는 이중 가닥 RNA 분자; 및 (iii) OGT 의 발현을 저해하는 쇼트 헤어핀 RNA 분자.
본 발명의 개시의 방법의 일정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 중간 내지 고도의 엄격성의 조건 하에서 OGT mRNA 에 하이브라이드화된다. 본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3 로 제시된 서열을 갖고, 특정 구현예에서, 상기 18-30 뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편에 상응하고, 특정 구현예에서, 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명 개시의 방법의 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.
본 발명의 개시된 방법의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드이고, 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 올리고데옥시뉴클레오티드이다.
본 발명의 개시의 방법의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 173 의 조절 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열 (i), SEQ ID NO: 173 의 인트론 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 또는 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편에 상응하는 서열 (이때, 상기 서열은 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함함) 을 포함한다.
개시된 방법의 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나의 단편을 포함하고, 폴리뉴클레오티드의 서열이 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열에 상보적인 18-30 뉴클레오티드 분자에 해당하도록 1-10 뉴클레오티드 잔기를 추가로 포함한다.
개시된 방법의 일부 구현예에서, 단리된, 이중 가닥 RNA 분자는 SEQ ID NOS: 169-171 로부터 선택된 서열을 포함하고 약 11 내지 27 개의 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 가닥을 포함한다. 본 방법의 특정 구현예에서, 소형의 헤어핀 RNA 는 SEQ ID NO: 172 의 서열을 포함한다.
본 발명의 개시된 주제의 일부 구현예에서, 항-OGT 제제는 약학적 조성물로 제공된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하고, 이때 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어 겔, 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, Pluronic® F-127, 알기네이트, 히드로겔, 및/또는 히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 및 그 혼합물로부터 선택되는 셀룰로오스-기재 담체를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국부 적용, 국소 주사, 상처 드레싱 및/또는 콜로이드성 겔 드레싱에 의해 제형화 및/또는 투여된다. 본 개시 방법의 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 지효성, 서방성, 복효형 는 방출 제어형으로 제형화되고, 추가로 조성물은 액체, 크림, 고약, 에멀젼, 로션, 스프레이, 연고, 폼 또는 페인트 형태이다.
본 개시 방법의 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국소적으로 및/또는 국소 주사로써 투여된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물 또는 제제는 상처가 있는 대상체를 치료하기 위해 투여되고, 일부 구현예에서 상처는 지연되고, 치유하기 곤란하며, 예상되는 속도로 치유되지 않고 및/또는 만성적이다. 특정 구현예에서, 상처는 OGT 의 발현 증가로써 적어도 일부 특성화된다.
본 발명의 개시의 방법의 일부 구현예에서, (i) 대상체는 당뇨병이 있고, (ii) 대상체는 제 1 형 당뇨병이 있고, (iii) 대상체는 제 2 형 당뇨병이 있고, (iv) 대상체는 일반 혈액 글루코오스 수준보다 높고, (v) 대상체는 인슐린-저항 수용체를 갖고 및/또는 (vi) 대상체는 당뇨병이 없다.
일부 구현예에서, 개시된 방법은 제 2 의 상처 치유제 및/또는 제 2 의 항-OGT 제제를 세포 또는 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
앞서의 일반 기술과 상세히 후술되는 기술 모두 개시의 구현예를 제공하고 청구되는 바와 같이 개시의 성질 및 특성을 이해하기 위한 골격부 또는 개관을 제공하도록 의도된다는 점은 자명하다. 본 기술은 청구되는 주제의 원리 및 작동법을 설명하는 역할을 하며, 본 발명(들)의 원리가 사용되는 실시예를 제시한다. 본 발명의 기타 및 추가적인 특징 및 이점은 수반되는 도면을 고려하면서 후술되는 개시를 읽을 시 당업자에게는 용이하게도 명백해질 것이다.
도면의 설명
도 1. 고혈당증은 O-GlcN아실화를 증가시키고 인간 케라티노사이트에서 상처 치유를 지연시킨다. HaCaT 세포를 지시된 최종 농도로 글루코오스로 보충된 배지에서 배양하였다. 세포 용해물을 로딩 대조군으로서 GAPDH 및 O-GlcNAc 개질물을 인식하는 RL2 항체를 이용하는 면역블롯팅 및 SDS-PAGE 로써 분석했다 (도 1). RL2 신호를 GAPDH 로딩 대조군과 비교하여 정량하였다 (도 1B). 인간 케라티노사이트의 단층을 지시된 글루코오스 농도를 갖는 DMEM 에서 인큐베이션하였다. 세포를 피펫 팁으로 스크래칭하고, 현미경 검사를 0 h 및 16 h 에서 했다 (도 1C). 이어서, 상처 크기를 이미지 분석 소프트웨어를 이용해 측정했다. 모든 조건에 대해서 N=11 (도 1D). 오차 바는 평균 표준편차 (SEM) 를 반영한다. * 는 P-값 <0.07 을 나타내고, ** 는 통상의 글루코오스 수준 (5.5 mM) 과 비교되는 P-값 <0.0005 을 나타낸다. 25 내지 100 mM 의 P-값은 <0.01 이다.
도 2. O-GlcNAc 경로에서 RNA 간섭 (RNAi) 은 인간 케라티노사이트에서 상처 치유 속도에 영향을 미친다. 더욱이, shRNA 를 이용하는 OGT 녹다운 (knockdown) 은 상처 치유를 촉진시킨다. HaCaT 세포를, OGT, OGA, 및 GFP (대조군) 을 표적화하는 shRNA 로 안정적으로 형질도입하고 컨플루언시 (confluency) 까지 성장시켰다. 이어서, 세포 용해물을 O-GlcNAc 개질물 (RL2), OGT 단백질 및 액틴 (로딩 대조군) 에 대항하는 면역블롯팅 탐침에 의해 분석했다 (도 2A). RL2 반응성을 액틴 신호와 비교하여 정량하였다 (도 2B). 형질도입된 세포를 25 mM 글루코오스가 있는 성장 배지에서 컨플루언시까지 성장시키고 스크래칭하여 상처를 도입하였다. 0 h 및 12 h 에서 수득된 대표적인 현미경 사진을 도 2C 에 나타내는 반면, 개방성 상처 면적의 정량화는 도 2D 에 나타낸다. 스크래치 상처 검정에서, 미치료된 세포에 대해서는 N=18, shGFP 에 대해서는 N=10, shOGT 에 대해서는 N=8, 및 shOGA 에 대해서는 N=14 이다. 오차 바는 평균 표준편차 (SEM) 을 반영한다. 별표 (*) 는 p-값 < 0.05 의 결과를 나타낸다.
도 3. OGT 의 특이적 녹다운은 인간 케라티노사이트 상처 치유를 촉진시킨다. HaCaT 세포를, OGT 에 대항하는 100 nM siRNA 또는 스크램블된 대조군 siRNA 로 트랜스펙션하였다. 컨플루언트 배지의 세포 융해물을, RL2, 항-OGT, 및 항-GAPDH 반응성 (도 3A) 에 대해 면역블롯팅 탐침하고, 정량했다 (도 3B). siRNA 로의 트랜스펙션 후 60 시간 후, 컨플루언트 세포를 스크래칭하고, 0 h, 16 h, 및 26 h 에서 현미경 사진을 수득했다 (도 3C). 개방형 상처 면적을 이미지 분석 소프트웨어를 이용해 정량했다 (도 3D). 트랜스펙션되지 않은 세포에 대해서는 N=7, 대조군 siRNA 에 대해서는 N=7, 및 OGT siRNA 에 대해서는 N=6 이다. 오차 바는 표준 편차를 반영한다. 별표는 대조군과 비교되는 p 값 < 0.05 을 지시한다.
도 4. 세포-세포 부착이 OGT 트랜스펙션된 케라티노사이트에서 증가된다. 도 4A 는 디스파아제 검정 결과를 제공하고, 이때 대조군 (Con) 및 OGT (OGT) 트랜스펙션된 케라티노사이트의 컨플루언트 단층 배양 배지를 디스파아제 처리 후 플레이트에서 탈착하고 (float) 배양 배지를 앞뒤로 10 회 흔들어 전단력 하에 적용시켰다. OGT 세포로부터 더 적은 단편이 발생하였는데, 이는 대조군과 비교시 더 큰 세포-세포 부착을 시사한다. 도 4B 및 도 4C 는 대조군 및 OGT 과발현 케라티노사이트의 전자 현미경 사진을 나타내며, 이때 도 4B 는 하향식 (top-down) 사진을 제공하고, 도 4C 는 직교 사진을 제공하고, 각각은 OGT 과발현 케라티노사이트의 세포막이 대조군 케라티노사이트와 비교시 보다 긴밀하게 연합되어 있음을 보인다.
도 5. 대조군 마우스와 비교시 당뇨병이 있는 마우스의 피부에서 세포내 단백질의 증가된 O-글리코실화가 관찰된다. 도 5 는 GlcNAc-특이적 모노클로날 항체 RL2 를 이용한 면역블롯 분석을 나타내고, 이는 야생형 대조군과 비교시 당뇨병이 있는 마우스의 표피 추출물에서 증가된 GlcNAc 개질을 보인다. 별표는 대조군에서 보여지지 않는 당뇨병 피부에서 검출된 추가적인 단백질의 GlcNAc 개질을 나타낸다. 화살표는 당뇨병이 있는 피부 대 대조군에서 변경되지 않은 단백질의 GlcNAc 개질을 나타내고, 로딩 대조군으로서 역할한다 (+, 애노드; -, 캐쏘드).
도 6. 증가된 세포내 O-글리코실화는 상처 치유를 지연시킨다. 대조군 (Con) 및 OGT (OGT) 트랜스펙션된 케라티노사이트의 컨플루언트 단층 배양물을 스크래치에 의해 상처를 내고, 상처가 아무는 시간 (상처 봉합 시간) 을 확인했다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, 대조군 케라티노사이트는 16 시간까지 상처를 치유하는 반면, OGT 과발현 케라티노사이트는 t=16 시간에 상처를 아물게 하는데 실패했다.
도 7. OGT 특이적 shRNA 를 이용한 OGT 활성의 저해는 케라티노사이트 상처 치유를 촉진하고 단층 스크래치 검정에서 글루코오스에 의한 상처 치유의 용량 의존적 저해를 역전시킨다. 도 7A 에 제시한 바와 같이, 인간 HaCat 대조군 (더 짙은 색의 바) 및 OGT 특이적 shRNA 를 이용해 OGT 를 녹 다운한 HaCat 케라티노사이트 (shOGT, 더 옅은 색의 바) 의 컨플루언트 배지를 증가하는 농도의 글루코오스로 처리하고, 스크래치에 의해 상처를 내고, 치유 중인 상처의 크기를 상처 후 19 시간 후에 (그룹 당 n=12) 측정했다. 형질도입되지 않은 대조군 HaCat 케라티노사이트 및 GFP 특이적 shRNA (shGFP) 형질도입된 대조군에 대해, shOGT 형질도입된 HaCat 케라티노사이트 (그룹 당 n=12) 와 비교한 도 7A 에서와 같은 스크래치 검정 및 그 데이타는 도 7B 에 나타냄.
도 8. OGT 의 shRNA 녹다운은 케라티노사이트 세포내 단백질 O-글리코실화를 감소시키나; 그 반면에, OGA 녹다운은 단백질 O-글리코실화를 증가시킨다. GFP (대조군), OGT, 및 OGA 를 표적화하는 shRNA 로 안정적으로 트랜스펙션된 HaCaT 세포를 컨플루언시까지 성장시켰다. 이어서, 세포 융해물을 도 8A 및 도 8B 에서와 같이 (i) O-GlcNAc 개질물 (RL2), (ii) OGT 단백질, 및 (iii) GAPDH (로딩 대조군) 에 대한 항체를 이용하여 면역블롯팅으로써 분석했다. 보여지는 바와 같이, OGT 의 유전적 녹다운은 O-GlcNAc 단백질 개질을 감소시키는 반면; OGA 의 유전적 녹다운은 O-GlcNAc 단백질 개질을 증가시킨다.
도 9. OGT 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드는 상처에 국소적으로 적용시 테스트 마우스의 피부에서 OGT 단백질 수준 및 O-GlcNAC 개질을 하향조절한다. 상처낸 후 t=0 및 t=24 에서의 WT 마우스의 전층 (full thickness) 피부 상처로의 50 ul Pluronic® F-127 겔 중 10nM OGT 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드의 국소적 적용. OGT 안티센스 ODN 또는 비히클 대조군으로 치료된 마우스의 병변주변의 피부를 상처낸 후 48 시간 후에 수집했다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 피부 추출물을 SDSPAGE 로써 분리하고, O-GlcNAc 개질물 (RL2), OGT 단백질, 또는 GAPDH (로딩 대조군으로서) 에 대한 항체를 이용하여 면역블롯팅함으로써 탐침했다.
실시 구현의 상세한 설명
본 발명의 개시된 주제의 하나 이상의 구현예의 상세 사항을 본 문헌에 제시한다. 본 문헌에 기술된 구현예의 변경 및 기타 구현은 본 문헌에 제공된 정보를 연구한 후에는 당업자에게 있어서 자명할 것이다. 본 문헌에서 제공된 정보 및 특히 기술된 실시 구현예의 특정 상세사항은 주로 이해를 분명히하고자 제공된 것으로 이로부터 불필요하게 제한될 필요는 없는 것으로 이해되어야 한다. 대립시, 정의를 비롯한 본 문헌의 구체적 사항은 제어될 것이다.
각 실시예는 본 개시의 설명을 위해 제공되고 이로 한정되지 않는다. 사실상, 당업자에게 있어, 본 개시의 취지에서 벗어나지 않고 본 개시의 교시의 각종 변경 및 변형을 취할 수 있다는 점은 자명할 것이다. 예를 들어, 한 구현예의 일부로서 예시되거나 기술된 특징은 또 다른 구현예를 이용해 사용될 수 있어 추가의 다른 구현예를 만들 수 있다.
본 개시의 단일 특징 또는 한정에 대한 모든 인용은 상응하는 복수의 특징(들) 또는 한정(들) 및 그 반대도 달리 특별히 언급되거나 분명하게 그 인용이 제시된 문맥에 의해 반대되는 것을 암시하지 않는 한 포함할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 방법 또는 공정 단계의 모든 조합이 달리 특별히 언급되거나 또는 그 인용이 제시된 문맥에 의해 반대되는 것을 암시하지 않는 한 임의의 순서로 수행될 수 있다.
본 개시의 방법 및 조성물은 그의 성분들을 비롯해서 본원에서 기술된 구현들의 한계 및 필수적인 요소뿐 아니라 본원에서 기술된 임의 추가적인 또는 선택적인 성분 또는 한계점 또는 그 밖의 유용한 것을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 개시된 주제는 세포에서 UDP-N-아세틸글루코사민 폴리펩티드 β-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 (OGT) 를 저해하고/하거나 상처 치유에 유용한 화합물, 조성물 및 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시된 주제는 OGT mRNA 로 하이브리드하는 서열을 갖는 단리된 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "단리된" 이란, 단리된 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 사용시, 인간의 손에 의해, 이의 천연 환경에서 떠나 존재하고 그에 따라 천연 생성물이 아닌 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 서열"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드(들) 또는 리보뉴클레오티드(들) 및 그의 중합체(들) 을 지칭한다.
siRNA 및 shRNA 와 같은 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 기타 항-OGT 폴리뉴클레오티드의 합성은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Stein C. A. and Krieg A. M. (eds), Applied antisense Oligonucleotide Technology, 1998 (Wiley-Liss)] 을 참조한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 OGT 의 전사 및/또는 번역을 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 OGT 유전자 또는 mRNA 로부터 전사 및/또는 번역의 특이적 저해자이며, 기타 유전자 또는 mRNA 로부터 전사 및/또는 번역을 저해하지 않는다. 생성물은 OGT 유전자 또는 mRNA 에 (i) 5' 에서 코딩 서열로, 및/또는 (ii) 코딩 서열로, 및/또는 (iii) 3' 에서 코딩 서열로 결합할 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 OGT mRNA 에 안티센스이다 (예, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 서열에 상보적). 이러한 폴리뉴클레오티드는 OGT mRNA 에 하이브리드화할 수 있고, 그에 따라 전사, mRNA 프로세싱, 핵으로부터의 mRNA 이동, 번역 또는 mRNA 분해를 비롯한 OGT mRNA 신진대사의 하나 이상의 측면을 방해함으로써 OGT 의 발현을 저해할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 OGT mRNA 에 하이브리드화하여 번역의 직접적인 저해 및/또는 mRNA 의 불안정성을 야기할 수 있는 듀플렉스를 형성한다. 이러한 듀플렉스는 뉴클레아제에 의해 분해에 취약할 수 있다.
용어 "상보적"이란, 역평행의 뉴클레오티드 서열들에서 상보적인 염기 잔기들간 수소 결합 형성시 서로 결합쌍을 이룰 수 있는 역평행 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2 개의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 2 개의 상보 가닥의 핵산 서열은 각각이 5' 에서 3' 방향일 때 서로의 정반대의 보체이다. 당업계에서 또한 공지된 바와 같이, 주어진 조건 하 서로 하이브리드화하는 두 개의 서열은 반드시 100% 완전히 상보적이어야 하는 것은 아니다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 OGT mRNA 의 전부 또는 일부에 하이브리드화할 수 있다. 전형적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 OGT mRNA 의 리보솜 결합 영역 또는 코딩 영역에 하이브리드화한다. 폴리뉴클레오티드는 OGT mRNA 의 전체 또는 한 영역에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 OGT mRNA 의 전체 또는 일부의 정확한 보체일 수 있다. 그러나, 절대적 상보성은 요구되지 않으며, 생리적 조건 하 약 20℃, 30℃, 또는 40℃ 초과의 용융 온도를 갖는 듀플렉스를 형성하기에 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 특히 본 발명에서 사용되기에 적합하다.
따라서, 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 mRNA 에 상보적인 서열의 상동체이다. 폴리뉴클레오티드는 약 50℃ 내지 약 60℃ 에서 0.03M 염화나트륨 및 0.03M 나트륨 시트레이트와 같은 중간 내지 고도의 엄격성의 조건 하 OGT mRNA 에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 표현 "중간 내지 고도의 엄격성" 이란, 약 0.0165 내지 약 0.033 M 염화나트륨을 의미하고; 일부 구현예에서, "중간 내지 고도의 엄격성"이란, 약 0.0165 내지 약 0.033 M 나트륨 시트레이트를 의미하고; 일부 구현예에서, "중간 내지 고도의 엄격성"이란, 용융 온도 (Tm) 약 5 내지 약 30℃ 미만의 온도를 의미하고, 이때 50% 하이드리드화가 Tm 에서 일어난다. 일부 구현예에서, 적합한 폴리뉴클레오티드는 약 6 내지 40 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴리뉴클레오티드는 약 18 내지 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 올리고데옥시뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열, 또는 SEQ ID NO: 1 에 제시된 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 중간 내지 고도의 엄격성의 조건 하에서 OGT mRNA 에 하이브리드화된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 의 코딩 영역에 제시된 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 173 의 조절 영역에 제시된 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 173 의 인트론 영역에서 제시된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 갖는다.
본 발명의 개시된 주제는 약학적 조성물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 항-OGT 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서 이용되는 바, 항-OGT 제제는 OGT 저해제, 및 폴리뉴클레오티드, 예컨대 siRNA, shRNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 예컨대 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 바와 같은 모든 특이적 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NOs: 4-172 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 포함) 를 지칭한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 SEQ ID NOs: 4-172 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 OGT mRNA 에 하이브리드화하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 서열에 상보성인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본원에 이용되는 바, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체'는 멸균 수성 또는 비(非)수성 용액, 분산물, 현탁액 또는 에멀젼뿐 아니라 멸균 주사액 또는 분산물로의 이용 직전의 재구성화를 위한 멸균 분말을 언급한다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로오스 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일 (예, 올리브 오일) 및 주사가능 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 재료의 사용으로써, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 에멀젼화제 및 분산제와 같은 애쥬번트를 함유할 수 있다. 미생물의 작용 방지는 각종 항박테리아 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴 (흡수를 지연시킴) 과 같은 제제의 포함에 의해 야기될 수 있다. 주사가능 데포 (depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(안히드리드)와 같은 생분해성 중합체 내 약물의 마이크로캡슐 매트리스를 형성함으로써 제조된다. 활용되는 특정 중합체의 성질 및 중합체에 대한 약물의 속도에 따라, 약물 방출의 속도가 제어될 수 있다. 데포 주사가능 제형은 또한 약물을 신체 조직에 적합한 리포솜 또는 마이크로에멀젼 내 약물을 내포시켜 제조된다. 주사가능 제형물은 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과로써, 또는 멸균수 또는 기타 멸균 주사가능 매질 중에서 이용 직전에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다. 적절한 불활성 담체는 당, 예컨대 락토오스를 포함할 수 있다. 바람직하게도, 95 중량% 이상의 활성 성분 입자는 0.01 내지 10 마이크로미터 범위의 유효한 입자 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 겔, 알기네이트, 히드로겔, 알코올, 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 Pluronic® F-127 를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 셀룰로오스-기재 담체, 예를 들어 히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 및 그 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체, 크림, 고약, 에멀젼, 로션, 스프레이, 연고, 폼 또는 페인트이다.
본 발명의 개시된 주제의 조성물은 각종 바람직한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 국부 적용을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 국소 주사를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 상처 드레싱으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 콜로이드성 겔 드레싱으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 지효성으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 서방성, 복효형, 또는 방출 제어형으로 제형화된다.
용어 "상처 드레싱"은 상처로의 국부 적용을 위한 드레싱을 지칭하며, 전신 투여에 적합한 조성물은 제외된다. 예를 들어, 하나 이상의 항-OGT 폴리뉴클레오티드 (예, OGT 안티센스 폴리뉴클레오티드) 는 직물 또는 부직포 재료와 같은 상처 접촉 물질의 고체 시트 상 또는 내 분산될 수 있거나, 또는 폴리우레탄 폼과 같은 폼의 층에 또는 폴리우레탄, 히드로겔, 폴리아크릴레이트 히드로겔, 겔라틴, 카르복시메틸 셀룰로오스, 펙틴, 알기네이트 및/또는 히알루론산 히드로겔과 같은 히드로겔에, 예를 들어 겔 또는 고약에 분산될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 항-OGT 폴리뉴클레오티드는 활성 성분의 상처로의 지효성 방출을 제공하는 생분해성 시트, 예를 들어 동결 건조된 콜라겐, 동결 건조된 콜라겐/알기네이트 혼합물 (Registered Trade Mark FIBRACOL, Johnson & Johnson Medical Limited) 또는 동결 건조된 콜라겐/산화된 재생 셀룰로오스 (Registered Trade Mark PROMOGRAN, Johnson & Johnson Medical Limited) 의 시트 물질 내에서 또는 상에서 분산된다.
본원에서 사용되는 바, "상처 촉진 매트릭스"는 예를 들어 합성 또는 천연 발생 매트릭스, 예컨대 콜라겐, 무세포성 매트릭스, 가교결합된 생물학적 스캐폴드 분자, 조직 기재 생물공학적 구조 골격, 생제작된 생체인공삽입물, 및 기타 이식된 구조물, 예컨대 상처 치유 촉진에 유용한 세포 침윤 및 증식에 적합한 혈관 그라프트를 포함한다. 추가적인 적합한 생매트릭스 물질은 화학적으로 개질된 콜라겐성 조직을 포함하여 항원성 및 면역원성을 감소시킬 수 있다. 기타 적합한 예에는 상처 드레싱을 위한 콜라겐 시트, 항원이 없는 또는 항원 감소된 무세포성 매트릭스 (Wilson G J et al. (1990) Trans Am Soc Artif Intern 36:340-343) 또는 이종이식 물질에 대한 항원 반응을 감소시키도록 조작된 기타 생매트릭스를 포함한다. 상처 치유 촉진에 유용한 기타 매트릭스는 예를 들어 불용성 콜라겐 및 엘라스틴을 포함하는 가공된 소 심낭막 단백질 (Courtman D W et al. (1994) J Biomed Mater Res 28:655-666) 및 숙주 세포 이동을 위한 천연 마이크로환경을 제공하여 조직 재생을 가속화하기에 유용할 수 있는 기타 무세포성 조직 (Malone J Metal. (1984) J Vase Surg 1:181-91) 을 포함할 수 있다. 본 발명은 항-OGT 폴리펩티드를 포함하는 본원에서 기재된 하나 이상의 항-OGT 폴리펩티드를 포함하는 합성 또는 천연 매트릭스를 고려한다. OGT 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드가 바람직하다.
본 발명의 개시된 주제의 단리된 폴리뉴클레오티드 및 조성물은 세포 내 OGT 의 저해 및/또는 대상체의 상처 치료에 유용하다. 일부 구현예에서, 상처는 예상되는 속도로 치유되지 않는다. 일부 구현예에서, 상처는 지연되거나, 치유되기 곤란하거나 만성이다. 일부 구현예에서, 상처는 OGT 의 발현 증가 또는 OGT 의 활성 증가에 의해 적어도 일부 특성화된다.
본원에서 이용되는 바, 용어 "상처"는 예를 들어 지연되거나 또는 상처 및 만성 상처를 치유하기 곤란한 것을 포함해 임의의 조직의 부상을 포함한다. 상처의 예는 개방형 및 폐쇄형 상처를 포함할 수 있다. 용어 "상처"는 또한 예를 들어 다른 방식으로 개시되고 (예, 연장 지속되는 장기 요양에 의한 압박 동통, 및 트라우마에 의해 유도된 상처) 다양한 특징들을 갖는 피부 및 피하 조직으로의 부상 을 포함할 수도 있다. 상처는 상처 깊이에 따라 4 등급 중 하나로 분류될 수 있다: i) 상피에 국한된 등급 I 상처; ii) 진피 내로 확장된 등급 II 상처; iii) 피하 조직으로 확정된 등급 III 상처; 및 iv) 뼈가 노출되는 (예, 큰돌기 또는 천골과 같은 골 압박부위) 등급 IV (또는 전층 상처) 상처.
용어 "부분층 (partial thickness) 상처" 는 등급 I-III 을 망라하는 상처를 지칭한다. 부분층 상처의 예는 압박 동통, 정맥 정체성 궤양, 및 당뇨병성 궤양을 포함한다. 본 발명은 치유-지연 상처, 불완전 치유 상처 및 만성 상처를 비롯해 예상되는 속도로 치유되지 않는 유형의 모든 상처를 치료하는 것을 고려한다.
"예상되는 속도로 치유되지 않는 상처"란, 지연되거나 또는 상처 치유가 곤란한 (지연 또는 불완전 치유 상처 포함) 및 만성의 상처를 비롯한 임의의 조직에 대한 부상을 의미한다. 예상되는 속도로 치유되지 않는 상처의 예에는 궤양, 예컨대 당뇨병성 궤양, 당뇨병성 발 궤양, 맥관염성 궤양, 동맥 궤양, 정맥 궤양, 정맥 정체성 궤양, 압박성 궤양, 욕창, 전염성 궤양, 트라우마-유도 궤양, 화상 궤양, 괴저고름피부증 연관 궤양형성, 및 혼합 궤양을 포함한다. 예상되는 속도로 치유되지 않는 기타 상처에는 열개성 상처가 포함된다.
본원에 사용되는 바, 치유하기 곤란하거나 지연된 상처는 예를 들어 하기에 의해 적어도 부분적으로 특성화되는 상처를 포함할 수 있다: 1) 연장된 염증 상, 2) 서행 형성 세포외 매트릭스, 및/또는 3) 상피화 또는 봉합의 감소된 속도.
용어 "만성 상처"란 일반적으로 치유되어지지 않은 상처를 지칭한다. 3 개월 이내에 치유되지 않은 상처는 만성인 것으로 여겨진다. 만성 상처는 정맥 궤양, 정맥 정체성 궤양, 동맥 궤양, 압박성 궤양, 당뇨병성 궤양, 당뇨병성 발 궤양, 맥관염성 궤양, 욕창, 화상 궤양, 트라우마-유도 궤양, 전염성 궤양, 혼합 궤양, 및 괴저고름피부증을 포함한다. 만성 상처는 완전 또는 부분 동맥 폐색으로부터 발생한 궤양형성을 포함하는 동맥 궤양일 수 있다. 만성 상처는 정맥판막의 이상 및 관련 정맥 질환으로부터 야기된 궤양형성을 포함하는 정맥 궤양 또는 정맥 정체성 궤양일 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처의 치료 방법이 제공되며, 이때 상기 만성 상처는 하기의 압박성 궤양화의 AHCPR 단계 중 하나 이상에 의해 특성화된다: 단계 1, 단계 2, 단계 3, 및/또는 단계 4.
본원에서 이용되는 바, 만성 상처는 예를 들어 하기 중 하나 이상에 의해 적어도 부분적으로 특성화되는 상처를 지칭할 수 있다: (i) 상처 염증의 저절로 계속되는 만성 상태, (ii) 결핍되고 결함이 있는 상처 세포외 매트릭스, (iii) 세포외 매트릭스 생성을 제한하는, 열악하게 반응하는 (노화) 상처 세포, 특히 섬유모세포, 및/또는 (iv) 부분적으로 이동을 위한 스캐폴드 결핍 및 필수적인 세포외 매트릭스 통합의 부재로 인한 재상피화의 실패. 만성 상처는 또한 1) 예를 들어, 당뇨병성 궤양, 압박 궤양 (욕창), 정맥 및 동맥 궤양; 2) 발병 영역에서 매트릭스의 진행성 침착, 3) 더 길어진 회복 시간, 4) 덜한 상처 수축, 5) 더 느린 재상피화 및 6) 증가된 과립 조직의 층.
예의 만성 상처는 "압박성 궤양"을 포함할 수 있다. 예의 압박성 궤양은 AHCPR (Agency for Health Care Policy and Research, U.S. Department of Health and Human Services) 가이드라인을 바탕으로 4 단계로 분류될 수 있다. 단계 1 압박성 궤양은, 온전한 피부의 관찰가능한 압력 관련 변형으로, 신체에서 인접하거나 또는 반대편의 영역과 비교시 이의 지시자가 하기 중 하나 이상의 변화를 포함할 수 있다: 피부 온도 (온열 또는 냉열), 조직 밀도 (단단함 또는 질척이는 감촉) 및/또는 감각 (통증, 가려움). 궤양이 지속적인 발적의 소정의 영역으로서 약간 착색된 피부에서 나타나는 반면, 더 짙은 피부 톤에서 궤양은 지속적인 홍색, 청색 또는 자주색 색조로 나타날 수 있다. 단계 1 궤양형성은 온전한 피부의 비창백성 (nonblanchable) 홍반 및 피부 궤양형성의 예고 병변을 포함할 수 있다. 거무스름한 피부의 개체에서, 피부의 변색, 온기, 부종, 경화, 또는 경성이 또한 단계 1 궤양형성의 지시자일 수 있다. 단계 2 궤양형성은 상피, 진피 또는 양자 모두를 포함하는 부분층 피부 손실로써 특성화될 수 있다. 궤양은 표재상이며, 임상적으로 마모, 블리스터 또는 얕은 함몰부로서 존재한다. 단계 3 궤양형성은 기저 근막까지 그러나 이를 통과해서까지는 아닌 확장될 수 있는 피하 조직의 괴사 또는 손상을 비롯한 전층 피부 손실로써 특성화될 수 있다. 궤양은 인접 조직의 기반을 약화시키거나 또는 그렇지 않으면서 깊은 함몰부로서 임상적으로 존재한다. 단계 4 궤양형성은 대규모 파괴가 있는 전층 피부 손실, 조직 괴사 또는 근육, 뼈 또는 지지 구조 (예, 힘줄, 관절낭) 의 손상을 특징으로할 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 압박성 궤양형성의 하기 AHCPR 단계 중 하나 이상을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다: 단계 1, 단계 2, 단계 3, 및/또는 단계 4.
전형적인 만성 상처는 또한 "욕창"을 포함할 수 있다. 전형적인 욕창은 뼈의 융기부 (bony prominence) 에 장기적이고 변함없이 계속되는 압력의 결과로서 발생되어 허열을 일으킬 수 있다. 마비되어 있거나, 의식이 없거나 또는 중증의 쇄약 환자와 같이, 자기 자신이 하중을 들어 위치를 바꿀 수 없는 환자에게서 상처가 발생하는 경향이 있다. U.S. Department of Health and Human Services 에 의해 정의된 바와 같이, 주된 방지 방안에는 고위험 환자의 동정; 빈번한 평가; 및 예방 조치, 예컨대 지정한 대로의 위치전환, 적절한 압력-완화 잠자리, 습기 차단, 및 적합한 영양 상태를 포함한다. 치료 옵션에는 예를 들어 압력 완화, 외과적 및 효소 죽은조직 제거술, 습윤 상처 관리, 및 박테리아 수 제어를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 뼈 융기부에 장기적이고 변함없이 계속되는 압력 결과 허열을 일으키는 것에 인한 욕창 또는 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
만성 상처는 또한 "동맥 궤양"을 포함할 수 있다. 만성 동맥 궤양은 일반적으로 동맥경화 및 고혈압성 심혈관 질환을 수반하는 궤양형성인 것으로 이해된다. 이는 고통스럽고, 날카롭게 가장자리에 존재하고, 종종 측면 하지 및 발가락에서 발견된다. 동맥 궤양은 완전하거나 부분적인 동맥 폐색으로 인해 조직 괴사 및/또는 궤양형성이 야기될 수 있는 것을 특징으로 한다. 동맥 궤양의 징후는 예를 들어 극단부의 무맥박성; 고통스러운 궤양형성; 통상 익히 둘레에 선을 긋는 소형의 점상 궤양; 차갑거나 냉한 피부; 지연된 모세혈관 복귀 시간 (발가락 끝을 간단하게 눌러 방출시키면, 통상의 색이 발가락으로 약 3 초 이하 안에 되돌아와야 함); 위축성 발생 피부 (예, 빛나고 얇고 건성인 피부); 및 손 및 발의 털 손실을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 완전한 또는 부분적인 동맥 폐색으로 인한 동맥 궤양 또는 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
전형적인 만성 상처는 "정맥 궤양"을 포함할 수 있다. 전형적인 정맥 궤양은 하지에 발병하는 가장 통상적인 유형의 궤양이며, 이는 정맥판막의 이상을 특징으로 한다. 일반 정맥은 혈액의 역류를 막는 판막을 갖는다. 이들 판막이 무능할 때, 정맥혈의 역류가 정맥성 울혈을 야기한다. 적혈구 세포로부터 헤모글로빈은 빠져 나와 혈관밖 공간으로 누출되어, 통상 주목되는 갈색빛의 변색을 야기한다. 정맥 궤양을 둘러싸는 피부의 경피적 산소 압력이 감소되는 것이 밝혀진 바 있으며, 이는 그 영역의 통상의 혈관분포를 방해하는 힘이 존재한다는 점을 시사한다. 림프 배출 및 유동이 또한 이들 궤양에 있어 역할을 수행한다. 정맥 궤양은 내측 복사 주변에서 나타날 수 있고 통상 부종 및 경성 하지와 조합하여 발생한다; 이는 얕을 수 있고, 그리 크게 고통스럽지 않으며, 발생 부위에서 진물이 흐르면서 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 정맥판막의 이상 및 관련 혈관 질환으로 인한 정맥 궤양 또는 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 완전한 또는 부분적인 동맥 폐색으로 인한 동맥 궤양 또는 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
전형적인 만성 상처는 "정맥 정체성 궤양"을 포함할 수 있다. 정체성 궤양은 정맥부전증과 연관있는 병변으로, 이는 내측 복사에 보다 흔히 존재하고, 통상적으로 오목 부종, 정맥류종창, 반상 색소침착, 홍반, 및 비촉지성 점상출혈 및 자색반증과 함께 한다. 정체성 피부염 및 궤양은 일반적으로 고통스럽다기 보다는 다소 소양증을 일으킨다. 전형적인 정맥 정체성 궤양은 하지의 만성 수동 정맥성 울혈 결과 국소 저산소증을 야기하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이들 상처의 발병기전의 하나의 가능한 메카니즘은 두터은 혈관주의 피브린 띠를 가로지르는 산소 확산의 장애를 포함한다. 또 다른 메카니즘은 혈관주위 조직으로 누출하는 거대분자가 피부 통합성의 유지에 필요한 성장 인자를 잡는 것이다. 추가적으로, 커다란 백혈구 세포의 유동은 정맥성 울혈, 폐색 모세관, 활성화되는 것, 및 혈관 내피를 손상시키는 것으로 인해 속도가 늦춰져 궤양 형성의 성향을 야기한다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 정맥 판막의 이상 및 관련 혈관 질환으로 인한 정맥 궤양 또는 궤양 형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 하지의 만성 수동 정맥성 울혈 및/또는 그 결과의 국소 저산소증으로 인한 정맥 정체성 궤양 또는 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
전형적인 만성 상처는 "당뇨병성 궤양"을 포함할 수 있다. 당뇨병이 있는 환자는 신경계 및 혈관 합병증으로 인해 발 궤양형성을 비롯한 궤양을 형성하기 쉽다. 말초 신경병증은 발 및/또는 다리 감각을 완전히 소실시키거나 또는 달라지게 할 수 있다. 진행 신경병증과 함께 당뇨병이 있는 환자는 날카롭고 무딘 차이에 대한 모든 능력이 느슨해진다. 신경병 환자에게서 발의 임의 절단 또는 외상을 수일 또는 수주 동안 완전히 알아채지 못할 수 있다. 신경병증 환자에게 있어서, 실제로 궤양이 꽤 얼마 동안 존재해왔지만 궤양이 "막 생겼다"라고 알아채는 것이 흔하지 않은 일이 아니다. 신경병 환자에게 있어, 엄격한 글루코오스 제어가 질병의 진행을 늦추는 것으로 밝혀진 바 있다. 샤르코 발 변형은 또한 감소된 감각 결과로서 발생할 수 있다. 그들 발에서 "정상의"감각을 갖는 사람들은 너무 큰 압박이 발 주위에 가해지면 자동적으로 감지하는 능력이 있다. 일단 동정하면, 우리의 신체는 본능적으로 위치를 바꾸어 이러한 스트레스를 완화시킨다. 진행성 신경병증이 있는 환자는 지속되는 압력 손상을 감지하는 능력이 느슨해지므로, 그 결과 조직 허혈 및 괴사가 발생하여 예를 들어 발바닥 궤양형성을 야기한다. 추가적으로, 발의 뼈에서 미세골절이 간과되어 미치료되면, 기형, 만성 팽윤 및 추가적으로 뼈가 다 드러날 수 있다. 미세 혈관 질환은 당뇨병의 유의한 합병증 중 하나로, 이도 또한 궤양형성을 야기할 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 당뇨병의 신경 및 혈관 합병증 양자 모두로 인한 당뇨병성 발 궤양 및/또는 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제안된다.
전형적인 만성 상처는 "외상성 궤양"을 포함할 수 있다. 외상성 궤양의 형성은 신체의 외상 손상 결과로서 발생할 수 있다. 이들 손상은 예를 들어 동맥, 정맥 또는 림프계의 손해 (compromise); 골격의 뼈 구조물의 변화; 조직층-표피, 진피, 피하 연조직, 근육 또는 뼈의 손실; 신체 일부 또는 장기 손상 및 신체 일부 또는 장기의 손실을 포함한다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 신체의 외상성 손상과 연관되는 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
전형적인 만성 상처는 1도 화상 (즉, 피부 표면의 발적 부위); 및 2 도 화상 (수포액이 제거되어진 후 자연적으로 치유될 수 있는 수포가 있는 손상 부위); 3 도 화상 (전 피부를 통한 화상 및 통상적으로는 상처 치유를 위해 수술적 개입을 요구함); 열탕화상 (열탕 온수, 기름 또는 방열기액으로부터 야기될 수 있음); 열성 화상 (불꽃에 의해 야기될 수 있고, 통상적으로 깊게 화상입음); 화학적 화상 (산 및 알칼리로부터 발생할 수 있고, 통상적으로 깊게 화상 입음); 전기 화상 (집 주변의 저 전압 또는 직장에서의 고전압); 폭발 섬광 화상 (통상적으로 표면 손상); 및 접촉 화상 (통상적으로 깊고, 머플러 종단 배관, 고열 다리미 및 스토브에서 발생할 수 있음) 을 비롯한 "화상 궤양"을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 신체의 화상 손상과 연관된 궤양을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
전형적인 만성 상처는 "맥관염성 궤양"을 포함할 수 있다. 맥관염성 궤양은 또한 하지에서 생기며, 고통스럽고, 가장자리가 날카로운 병변이며, 이는 촉지성 자색반증 및 혈포와 연관될 수 있다. 콜라겐 질병, 패혈증 및 각종 혈액학적 장애 (예, 혈소판감소증, 이상단백혈증) 가 이러한 심각한 급성 상태의 원인일 수 있다.
전형적인 만성 상처는 괴저고름피부증을 포함할 수 있다. 괴저고름피부증은 단일 또는 다중의, 하퇴의 매우 따가운 궤양으로서 발생한다. 심홍 내지 보라색의, 기반이 약화된 경계는 화농성 중심부 결함을 둘러싼다. 생검은 전형적으로 혈관염을 드러내는데 실패한다. 환자 절반에게 있어서, 이것은 궤양성 대장염, 국한성 회장염, 또는 백혈병과 같은 전신 질환과 연관 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 괴저고름피부증 연관 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
전형적인 만성 상처는 전염성 궤양을 포함할 수 있다. 전염성 궤양은 각종 유기체로의 직접적인 접종의 뒤를 잇고, 유의한 국한성 선병증과 연계되어 있을 수 있다. 미코박테리아 전염, 탄저병, 디프테리아, 분아균증, 스포로트릭스증, 야생토끼병, 및 고양이 할큄열이 예이다. 초기 매독의 성기 궤양은 전형적으로 청결하고 단단한 베이스로 눌러도 따갑지 않다. 연성 하감 및 서혜부 육아종의 것은 우둘투둘하고, 더럽고, 보다 터무니 없는 병변인 경향이 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 전염과 연관된 궤양형성을 특징으로 하는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.
본원에서 이용되는 바, 용어 "열개성 상처"는 상처, 통상적으로 파열되거나 또는 부풀어 터진 외과적 상처를 지칭한다. 특정 구현예에서, 상처가 벌어지는 것을 특징으로 하는, 예상되는 속도로 치유되지 않는 상처를 치료하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시된 주제의 조성물은 하나 이상의 추가적인 상처 치유제, 예를 들어 U.S. Patent Nos. 8,063,023 및 8,247,384, 및 U.S. Patent Application Publication No. US 1012/0289479 (각각 본원에서 인용되어 혼입됨) 에 기재된 것, 및 예를 들어 항-코넥신제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시된 주제의 조성물은 하나 이상의 추가적인 항-OGT 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 바, 용어 "대상체"는 인간 및 동물 대상체 양자 모두를 포함한다. 따라서, 수의과적 치료 용도가 본 개시된 주제에 따라 제공된다. 이로써, 본원 개시된 주제는 인간과 같은 포유동물뿐 아니라, 시베리아 호랑이와 같은 멸종 위기의 중요한 포유동물; 인간 소비를 위한 농장에서 키우는 동물과 같은 경제적 중요성의 포유동물; 및/또는 애완동물 또는 동물원에 가둬진 동물과 같은 인간에게 사회적으로 중요한 동물 등의 포유동물의 치료를 제공한다. 이러한 동물의 예에는 이에 제한되지 않지만 하기를 포함한다: 고양이 및 개와 같은 육식 동물; 돼지 예컨대 피그, 호그 및 멧돼지; 반추류 및/또는 유제류, 예컨대 소 (cattle), 황소, 양, 기린, 사슴, 염소, 들소 및 낙타; 및 말.
일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병이 없다. 일부 구현예에서, 대상체는 제 1 형 당뇨병, 제 2 형 당뇨병을 앓고, 통상의 혈액 글루코오스 수준보다 높고 및/또는 인슐린-저항성 수용체를 갖는다.
본원에서 주목되듯이, 본 개시의 주제는 세포 내 OGT 의 저해 방법 및 상처가 있는 대상체의 치료 방법을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 내 OGT 의 저해 방법은 항-OGT 제제를 세포에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 존재한다. 일부 구현예에서 상처가 있는 대상체의 치료 방법은 항-OGT 제제를 투여하는 것을 포함한다.
본 개시된 주제의 방법의 일부 구현예에서, 항-OGT 제제는 OGT mRNA 에 하이브리드화하는 서열을 갖는 본원에 기재된 바와 같은 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드; 본원에 기재된 바와 같은 OGT 발현을 저해하는 이중 가닥 RNA 분자, 예 siRNA; 및 본원에 기재된 바와 같은 OGT 의 발현을 저해하는 쇼트 헤어핀 RNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 제 2 의 상처 치유제 및/또는 제 2 의 항-OGT 제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시된 주제의 방법에 따른 투여를 위한 조성물에 항-OGT 제제가 제공된다.
특정 예에서, 본원에서 개시된 뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 대중이 이용가능한 데이타베이스, 예컨대 GENBANK® 및 SWISSPROT 에 포함되어 있다. 서열을 포함하는 정보 및 대중이 이용가능한 데이타베이스에 포함된 뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 관련된 기타 정보가 명백하게 인용 혼입되어 있다. 달리 지시되거나 또는 명백하지 않는 한, 이러한 대중에게 이용가능한 데이타베이스에 대한 인용은 본 출원의 제출일을 기점으로 데이타베이스의 가장 최신 버젼에 대한 인용이다.
본원에서 사용된 용어는 당업자가 익히 이해한다고 여겨지는 반면에, 정의는 본 발명의 개시된 주제의 설명을 용이하도록 본원에서 제시하였다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원에서 개시된 주제가 속한 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본원에서 개시된 주제의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 대표적인 방법, 장치 및 물질을 현재 기술하였다.
오랜 특허법 관행에 따라, 용어 "하나", "한" 및 "그" 는 청구항을 비롯한 본 출원에서 사용시 "하나 이상"을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 "하나의 세포" 또는 "세포"에 대한 언급은 복수의 그러한 세포들 등을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에서 이용된 성분의 양을 표현하는 모든 수, 특성, 예컨대 반응 조건 등은 모든 경우에서 용어 "약" 에 의해 변경되어지는 것으로 이해되어져야 한다. 그에 따라, 반대로 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에서 제시된 수치 매개변수는 본 개시된 주제에 의해 수득되도록 추구되는 바람직한 특성에 따라 가변될 수 있는 근사치이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "약"은 값, 또는 질량, 중량, 시간, 부피, 농도 또는 백분율의 양을 지칭하는 경우, 이는 구체적인 양에서부터 일부 구현예에서 ±20%, 일부 구현예에서 ±10%, 일부 구현예에서 ±5%, 일부 구현예에서 ±1%, 일부 구현예에서 ±0.5% 및 일부 구현예에서 ±0.1% 의 변동치를 포함하는 것을 의미하고, 이러한 변동치는 개시된 방법을 수행하는데 적절하다.
본원에서 이용되는 바, 범위는 "약" 하나의 특정 값 및/또는 에서 "약" 또 다른 특정 값으로서 표현될 수 있다. 또한, 본원에서 개시된 값의 수가 존재하고, 각 값은 또한 그 값에 부가적으로 "약" 특정 값으로서 본원에서 개시되는 바인 점은 자명하다. 예를 들어 값 "10" 이 개시되는 경우, 그때에는 "약 10"도 또한 개시된다. 또한 2 개의 특정 단위 사이의 각 단위가 또한 개시된다는 점이 이해되어야 한다. 예를 들어, 10 및 15 가 개시되는 경우, 이때 11, 12, 13 및 14 도 또한 개시된다.
본 개시된 주제는 하기의 구체적인 그러나 비제한적인 실시예로 추가 설명된다. 하기의 실시예는 명백해질 특정한 예언적 실시예를 포함한다. 하기의 실시예는 본 발명과 연관된 개발 및 실험 과장 동안 각종 시간 때에 모은 대표적인 데이타인 데이타의 편집물을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1
당뇨병이 있는 피부에서 세포 단백질의 증가된 O-Glc-NAc 개질이 만성 당뇨병성 피부 궤양이 있는 환자에게서 관찰되는 지연된 상처 치유에 기인할 수 있는지 여부를 분석하기 위해 본 연구를 착수하였다. 본 발명자는 상승된 글루코오스에서 인간 케라티노사이트를 배양함으로써 고혈당증 모형을 만들었다. 고혈당 조건 하에서, 본 발명자는 (i) 증가된 수준의 케라티노사이트 단백질의 O-GlcNAc 개질 및 중요하게 (i) 상처 폐쇄의 지연을 관찰했다. 상처 봉합에 있어서 고혈당증으로 유도된 지연은 OGT 의 shRNA 및 siRNA 녹 다운에 의해 역행되었고, 상기 유전자는 단백질로의 GlcNAc 모이어티 부가를 담당한다. 이들 관찰은 OGT 표적화가 미치유 당뇨병성 상처를 치료하는데 유익할 수 있다는 점을 시사한다.
비(非)치유 상처는 질병률의 유의한 공급원이다. 이는 만성 피부 상처를 발달시키기 쉬운 당뇨병 환자에게 있어 특히 해당한다. 세린 및 트레오닌 잔기의 O-글리코실화는 단백질 인산화와 유사한 통상적인 조절 번역후 개질이고; 증가된 세포내 단백질 O-글리코실화는 당뇨병 및 고혈당 상태에서 발견된 바 있다. 2 개의 세포내 효소인 UDP-N-아세틸글루코사민-폴리펩티드 β-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 (OGT) 및 O-GlcNAc-선택적 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 (OGA) 는 각각 세포내 단백질 기질로부터 부가 및 제거를 중재한다. 세포내 단백질의 O-GlcNAc 개질에서의 변경은 당뇨병과 연결되고, 당뇨병 조직에서 발견되는 단백질 O-글리코실화의 증가 수준은 부분적으로 지연되는 상처 치유에 기여하는 관찰되는 기저 병태생리학의 일부를 부분적으로 설명할 수 있다. 본 발명자들은 쥣과동물 케라티노사이트에서 OGT 의 과발현에 의해 단백질 O-글리코실화를 증가시키는 것이 상승된 단백질 O-글리코실화 및 과대-부착 표현형을 도모한다는 점을 이전에 밝힌바 있다. 이러한 연구는 당뇨병이 있는 피부에서 세포성 단백질의 증가된 O-GlcNAc 개질이 만성 당뇨병 피부 궤양이 있는 환자에서 발견되는 지연된 상처 치유에 기인할 수 있는지 여부를 탐구하기 위해 착수되었다.
본 연구에서 본 발명자는, 상승된 고혈당 조건 하 배양된 인간 케라티노사이트는 증가된 수준의 O-GlcNAc 개질뿐 아니라, 시험관 내 상처 봉합 속도의 지연을 나타낸다. 본 발명자는 추가로 RNA 간섭 (RNAi) 에 의한 OGT 의 특이적 녹다운이 이러한 효과를 유의하게 반전시키고, 이로써 당뇨병 환자에게서 지연된 상처 치유의 OGT-표적화 치료적 개입 기회를 개통시킨다.
실험적 절차
재료. 세포 배양 배지를 Invitrogen, Carlsbad, CA 에서 입수했다. shRNA 플라스미드를 Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 에서 구입하고, University of North Carolina 에서 Chapel Hill Lenti-shRNA 거점 시설에서 불활성화된 렌티바이러스 입자로 팩키징하였다. 헤어핀에서 성숙한 센스 가닥의 서열은 하기였다: shOGT (TRCN0000035064; SEQ ID NO. 72): 5'-GCCCTAAGTTTGAGTCCAAAT-3', 및 shOGA (TRCN0000134040): 5'-CCAGAAACTTTCCTTGCTAAT-3'. TRC 렌트바이러스 eGFP shRNA 를 형질도입을 위한 양성 대조군으로서 이용했다 (Open Biosystems catalog #RHS4459). 마우스 모노클로날 O-GlcNAc 특이적 항체 (clone RL2) 는 Thermo Scientific (Waltham, MA) 의 것이었다. GAPDH 에 대한 토끼 모노클로날 항체는 Cell Signaling (Danvers, MA) 로부터의 것이었다. β-액틴에 대한 마우스 모노클로날 항체는 OGT-특이적 항체로부터의 것으로 Sigma (St. Louis, MO) 로부터의 것이었다. 토끼 폴리클로날 OGT 항체는 Abcam (Cambridge, MA) 로부터의 것이었다. 마우스 및 토끼 항-양 서양고추냉이 과산화효소-컨쥬게이션된 2차 항체는 GE Healthcare (Pittsburgh, PA) 로부터의 것이었다. 대조군 siRNA (센스 가닥: GCAGUUAUAAUGACUAGAU) 및 OGT siRNA (센스 가닥: GCACAAUCCUGAUAAAUUU) (3'UU 오버행) 은 Sigma-Aldrich 로부터의 것이었다.
세포 배양 및 스크래치 상처. 트랜스펙션되지 않고 shRAN 트랜스펙션된 HaCaT 세포를 통상 또는 고 글루코오스 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (5.5 mM 또는 25 mM 글루코오스, 각각) (13), 1% 소태아혈청 (FBS), 1,000 단위 페니실린/mL, 100 ㎍ 스트렙토마이신/mL 에서 배양했다. 배지를 도면의 범례에서 명시된 글루코오스 또는 저해제 양으로 보충했다. shRNA-트랜스펙션된 세포를 mL 배지 당 1 ㎍ 퓨로마이신을 이용해 선택했다. 퓨로마이신-함유 배지를 스크래칭하기 6 시간 전에 대체했다. 세포를 60 시간 (컨플루온트까지) 동안 성장시킨 후 스크래치 검정을 수행했다. 스크래치 상처 처리를, 24-웰 배양 플레이트에서 컨플루언트 세포의 단층을 가로질러 선형 스크래치를 낸 후 1 × PBS 로 1 회 세정하고 신선한 배양 배지를 첨가하여 수행했다. 스크래칭 후 즉시 10x 배율을 이용해 Nikon TE2000-U 스프닝 디스크 현미경 상에서 사진을 찍고 또 다른 사진 세트를 찍기 전에 도면 범례에 언급한 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. Tscratch 소프트웨어 팩키지를 이용해 상처를 후속해서 분석했다 (14). 동일한 초기 상처-크기를 갖는 상처만을 평가하고 비교했다.
통계적 분석. 오차 바는 평균 표준 편차 (SEM) 을 반영한다. Tscratch 소프트웨어 매뉴얼에 기재된 부등 분산을 갖는 스튜던트 T 테스트를 2측 테스트로서 수행하였다.
shRNA 로의 케라티노사이트의 안정한 형질도입. HaCaT 세포를 DMEM, 10% FBS 내지 50-60% 컨플루언시에서 배양하고, 5 시간 동안 2 의 감염 다중도 (MOI) 를 이용해 10 ㎍/mL 폴리브렌 및 shRNA (shGFP, shOGT, 또는 shOGA) 로 인큐베이션하고, 그 후 배지를 새 DMEM 으로 변경하였다. 익일, 1 ㎍/mL 퓨로마이신을 함유하는 배지를 세포에 부가해 성공적으로 형질도입된 세포에 대해 선택했다. 6-8 회 퓨로마이신 선택 하 세포 배양 계대를 수행한 후 이들을 실험에 사용했다.
면역블롯 신호의 정량화. 샘플을 이전에 기술된 바와 같은 SDS-PAGE 로써 동등하게 로딩하고 분리했다. 면역블롯팅을 확립한 프로토콜에 따라 수행하고 증강된 화학발광 (ECL) 반응 (Amersham Biosciences) 으로써 전개하였다. 면역블롯으로부터의 단백질 밴드를 GeneSnap 소프트웨어 (SynGENE, Frederick, MD) 를 이용해 정량하였다. RL2 염색을 위해, 3 가지의 가장 두드러진 밴드를 GeneSnap 소프트웨어를 이용해 분석했다.
케라티노사이트의 siRNA 트랜스펙션. OGT 에 대항하는 siRNA (3'-GCACAAUCCUGAUAAAUUU-5') 및 스크램블된 대조군 siRNA (3'-GCAGUUAUAAUGACUAGAU-5') 를 3'-UU 오버핸드로 합성하고, 수 중 20 mM (작업 스톡) 으로 희석하고, 40% 컨플루언트 케라티노사이트를 갖는 24-웰 플레이트 내 각 웰을 프로토콜에 따라 Oligofectamine (Invitrogen) 를 이용해 트랜스펙션하였다. 간략히도, 3 mL 올리고펙타민 (Invitrogen) 을 12 mL Opti-MEM I (Invitrogen) 에 희석하고, 8 분 동안 인큐베이션하였다. 그 동안에, 3 mL siRNA 를, 50 mL Opti-MEM I 와 혼합하고, 이를 올리고펙타민 희석물에 첨가하고 20 분간 복합물을 형성하도록 정치시켰다. 이어서, 32 mL Opti-MEM 를 혼합물에 첨가하고, 세포에 부가했다 (500 mL 고 글루코오스 DMEM 중). 48 시간 후, 배지를 고 글루코오스 DMEM 으로 변경하고 60 시간 째에 세포를 스크래치 검정에 이용했다. 도면 범례에 기재된 시간 지점에서 사진을 찍었다.
결과
고혈당 조건은 인간 케라티노사이트에서 상승된 O-GlcNAc 를 도모한다. 당뇨병이 있는 피부에서 증가된 수준의 O-GlcNAc 개질이 고수준의 조직 내 글루코오스와 연결될 수 있는지에 대해 조사하기 위해, 이들 조건을 48 시간 동안 성장 배지에서 보충된 글루코오스를 상이한 양으로 48 시간 동안 인간 케라티노사이트 (HaCaT) 를 성장시킴으로써 세포 배지에서 모방하였다 (도 1). 세포 융해물의 면역블롯은 증가된 수준의 글루코오스가 실제로 O-GlcNAc 특이적 항체 RL2 에 의해 검출된 바와 같이 케라티노사이트 분해물에서 더 많은 O-GlcNAc 개질을 도모하였음을 보인다 (도 1A 및 1B). O-GlcN아실화에서의 상기 용량-의존적 증가는 증가된 글루코오스 농도 및 O-GlcNAc 개질 (케라티노사이트에서) 간의 연결을 강조한다.
인간 케라티노사이트는 고혈당 조건 하에서 지연된 상처 치유를 보인다. 즉, 본 발명자들은 고혈당 조건이 인간 케라티노사이트에 대한 상처 봉합 속도에 영향을 미치는지 여부에 관해 테스트하기를 원하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 상처 치유를 위한 시험관 내 모델로서 "스크래치 검정"을 활용했다 (도 1C). 48 시간 동안 상이한 양의 글루코오스로 HaCaT 세포를 사전 인큐베이션한 후, "상처"를 세포의 컨플루언트 층에 도입함으로써 상기 검정을 수행했다. 16 시간 동안 "상처 치유" 진행은 배양 배지에서 상승된 글루코오스 수준이 용량-의존적 방식으로 상처 봉합 속도를 감소시킨 점을 나타낸다 (도 1D).
RNA 간섭에 의한 O-GlcNAc 경로에 대한 주요 효소의 유전자 녹다운은 인간 케라티노사이트 배양에서 상처 봉합의 속도에 영향을 미친다. 지연되는 상처 봉합과 HaCaT 세포에서 상승된 수준의 O-GlcNAc 개질간 명백한 연결은 우리로 하여금 보다 자세히 O-GlcNAc 단백질 개질 (OGT 및 OGA 각각) 의 부가 및 제거를 담당하는 효소의 역할을 추가 조사하게 만들었다. 이를 위해, 본 발명자들은 HaCaT 세포들을 상기 효소에 대한 shRNA 로 안정적으로 형질도입하고, 세포 융해물을 면역블롯 분석으로써 분석했다 (도 2A 및 2B). 세포 융해물의 면역블롯 분석은, shOGT 가 유의하게 감소된 수준의 O-GlcNAc 개질을 나타내고, O-GlcNAc 수준에 대한 RNAi 의 영향을 확인시켰다. shOGA 형질도입된 세포는 비(非)형질도입된 및 shGPF 대조군과 유사한 O-GlcNAc 개질 수준을 나타냈다 (도 2B). shRNA-형질도입된 세포의 스크래치-상처처리는 OGT 를 녹다운하는 것이 유의하게 상처 봉합의 속도를 증가시키는 반면에 OGA 에 있어서는 그 반대가 적용된다는 점을 나타낸다 (도2C 및 2D). shGFP 형질도입된 대조군은 비형질전환된 세포와 유의하게 상이하지 않았다. 총괄적으로, 이들 데이타는 O-GlcNAc (shOGT) 의 양을 감소시키는 것이 상처 치유를 가속화하는 반면에 O-GlcNAc (shOGA) 의 제거는 인간 케라티노사이트에서 상처 치유를 저해한다는 점을 강력하게 암시하며, 이에 따라 O-GlcNAc 수준과 상처 치유 속도간 연결점의 기저를 이룬다.
OGT 의 siRNA 녹다운은 케라티노사이트 O-GlcN아실화를 감소시키고, 고혈당 조건에서 상처 봉합을 가속화시킨다. 보다 치료학적으로 관련있는 OGT 유전자 발현을 표적화하기 위한 접근법을 이용하는 잠재능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 녹다운 OGT 에 대한 수단으로서 소형 간섭 RNA (siRNA) 를 시험했다 (도 3). OGT mRNA 서열에 대항해 지시되는 19mer siRNA 을 합성하고, HaCaT 세포를 대조군으로서 스크램블된 서열을 갖는 siRNA 를 이용해 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션후 2 일 후, 세포 융해물을 RL2 및 OGT 면역반응성에 대해 탐침하였다 (도 3A 및 3B). 그 결과는 OGT 에 대한 siRNA 가 면역블롯팅으로부터 정량화된 바와 같이 OGT 수준 및 RL2 면역반응성 양자 모두에서 현저한 녹 다운을 보였다.
다음으로, siRNA 트랜스펙션된 세포를 스크래치-상처처리 검정에서 테스트하여 시험관 내 상처 봉합에 대한 OGT RNAi 의 상기 형태의 영향을 조사하였다. 도 3C 는 26 시간점에서 상처 치유가 대조군 siRNA 및 미치료된 세포 양자 모두와 비교시 OGT siRNA 로 유의하게 보다 진척됨을 나타낸다 (도 3D). 이들 결과는 인간 케라티노사이트에서 세포내 O-GlcNAc 의 수준이 상처 봉합 속도와 연결되는 점 및 이것이 OGT 녹다운을 이용함으로써 조작될 수 있다는 점을 추가로 지지한다.
OGT 의 shRNA 녹다운은 케라티노사이트 세포내 단백질 O-글리코실화를 감소시키는 반면; OGA 녹다운은 단백질 O-글리코실화를 증가시킨다. GFP (대조군), OGT, 및 OGA 를 표적화하는 shRNA 로 안정적으로 트랜스펙션된 HaCaT 세포를 컨플루언시까지 성장시켰다. 이후, 세포 융해물을 도 8A 및 도 8B 에서 나타낸 바와 같이 (i) O-GlcNAc 개질 (RL2), (ii) OGT 단백질, 및 (iii) GAPDH (로딩 대조군) 에 대한 항체로 면역블롯팅함으로써 분석하였다. 보이는 바와 같이, OGT 의 유전적 녹다운은 O-GlcNAc 단백질 개질을 감소시키는 반면에; OGA 의 유전적 녹다운은 O-GlcNAc 단백질 개질을 증가시킨다.
OGT 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드는 상처에 국부적으로 적용시 시험 마우스의 피부에서 OGT 단백질 수준 및 O-GlcNAC 개질을 하향조절한다. 상처낸 후 t=0 및 t=24 시간에 WT 마우스의 전층 피부 상처에, 50 ul Pluronic® F-127 겔 중 10nM OGT 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드의 국부 적용. OGT 안티센스 ODN 또는 비히클 대조군으로 처리된 마우스의 병변 주변 피부를 상처낸 후 48 시간에 모았다. 피부 추출물을 SDSPAGE 로써 분리하고, 도 9 에 나타낸 바와 같이O-GlcNAc 개질 (RL2), OGT 단백질, 또는 GAPDH (로딩 대조군으로서) 에 대한 항체를 이용한 면역블롯팅에 의해 탐침했다.
논의
문헌으로부터의 증가되는 증거는 헥소사민 경로의 변경이 당뇨병의 병태생리학에 있어 중요한 역할을 수행한다는 점을 시사한다. 예를 들어, 마우스에서 OGT 의 과발현은 당뇨병 표현형을 야기하고 (8) 및 O-GlcN아실화의 증가된 수준은 건강한 대조군과 비교시 제 2 형 당뇨병 환자의 세포 및 조직에서 발견되어진다 (9,15). 이전에는 본 발명자들은 케라티노사이트에서 OGT 의 과 발현은 (i) 세포 단백질의 GlcNAc 개질을 증가시키고 (ii) 세포-세포 부착을 현저히 증가시킨다 (12) 는 점을 보고했다. 이들 관찰과 일관되게, 본 발명자들은 글루코오스의 농도를 증가시켜 성장된 인간 케라티노사이트 배양물에서 단백질 O-글리코실화의 용량 의존적 증가를 관찰했다.
나아가, 증가된 농도의 글루코오스 및 O-GlcNAc 단백질 개질은 용량 의존적 방식으로 지연된 상처 봉합과 연관되어 있었다. 현저히도, OGT 특이적 shRNA 또는 siRNA 로의 OGT 활성 침묵 (silencing) 은 케라티노사이트 단백질의 GlcNAc 개질을 감소시키고, 상승된 글루코오스 농도의 존재하에서도 스크래치 모델 검정에서 상처 치유를 촉진시킨다. 집합적으로, 이들 관찰은 효소 OGT 에 의해 매개된 증가된 세포내 O-글리코실화는 만성 당뇨병 피부 상처에서 지연된 상처 치유에 기여할 것으로 예상된다.
증가된 OGT 활성이 세포 부착을 촉진시키고 상처 치유를 지연시키는 것에 대한 영향은, 부분적으로, 본 발명자가 이전에 보고한 바와 같이 데소모좀, 부착 연접부 (adherens junction), 및 세포골격 요소를 비롯한 케라티노사이트 세포 부착 성분들의 조절로 인한 것일 수 있다. (12) 상기 맥락에서, 본 발명자들은 부착 연접부 및 데소모좀 세포-세포 부착 복합체 양자 모두의 성분인 플라코글로빈이 OGT 과발현 케라티노사이트에서 증가된 O-글리코실화에 의해 번역후 안정화된다는 점을 앞서 밝혔다. 이러한 증가된 플라코글로빈 단백질 수준은 부착 연접부 기저의 플라코글로빈 및 데스모좀의 형성을 구동하고 세포-세포 부착을 현저히 증강시켰다 (12). 이들 관찰은 케라티노사이트에서, O-글리코실화는 부분적으로 플라코글로빈의 번역후 안정성을 조절하고 유의하게는 케라티노사이트 세포-세포 부착을 조절하는 작용을 한다는 점을 나타낸다. 상처 치유 동안, 케라티노사이트는 상처로 이동해 재상피화를 촉진한다. 상처 단에서 케라티노사이트는 길게 뻗은 부위에서 인접 세포와의 부착을 하향조절하여 그 모서리로부터 상처 내로 이동을 허용해야 한다. 세포-세포 부착을 증가시킴으로써, 본 발명자들은 증가된 세포내 단백질 O-글리코실화가 상처 치유를 지연시키나 세포내 단백질 O-글리코실화의 하향 조절이 상처 치유를 촉진시킨다는 점을 제안한다.
O-글리코실화는 편재 세포내 개질이란 점에 주목할 가치가 있다. 세포 부착 및 구조 단백질을 개질하는 것에 덧붙여, 전사 인자 및 조절 효소는 또한 GlcNAc 의 세린 및 트레오닌 잔기의 OGT 촉매화 첨가에 의해 개질된다. 따라서, OGT 활성의 효과는 다면발현성이기 쉽다. 부착에 대한 이의 효과에 덧붙여, 세포내 단백질 O-글리코실화의 수준을 변경하는 것도 또한 세포 증식 및 화학주성에 영향을 미칠 수 있고, 이는 관찰된 지연된 상처 치유에 기여하는 이들 효과들의 조합일 수 있다.
당뇨병성 상처는 상당한 건강 관리의 부담이다. 이들 상처 치료의 발생 및 사회적 및 재정적 비용은 당뇨병 발병이 비만 및 노인 인구의 상승으로 인해 증가됨에 따라 증가되기 쉽다. 본 발명자들은 RNAi 를 이용한 OGT 의 녹다운을 통해 O-GlcN아실화의 전반적 수준을 감소시키는 것이 고혈당 케라티노사이트 배양 모델에서 상처 치유를 가속화한다는 점을 입증했다. 집합적으로, 이들 데이타는 OGT 를 국소적으로 표적화하는 것은 당뇨병성 궤양에서 치유를 촉진시키는 효과적인 접근법임을 드러낼 수 있다는 점을 보인다. 상처에서 손상된 경계 기능으로 올리고뉴클레오티드로의 트랜스펙션이 허용된다는 점을 이전에 입증한 바 (16), 본 발명자들은 OGT 에 대항하는 siRNA 의 국부 투여가 만성 당뇨병성 피부 상처에서뿐 아니라 일반적인 상처에서 치유를 촉진하는데 유효한 치료법일 수 있음을 제안한다.
실시예 2
당뇨병성 상처 치유를 촉진하기 위한 OGT 안티센스 올리고뉴클레오티드의 국부적 전달.
본 발명자들의 데이타는 핵-세포질 효소 O-GlcNAc 트랜스퍼라아제 (OGT) 에 의해 촉매작용된 단백질의 증가된 세포내 O-글리코실화가 만성 당뇨병성 피부 상처의 지연된 상처 치유에 기여한다는 점을 나타낸다. 본 실시예에 기재된 이러한 연구는 당뇨병성 피부 상처의 치유가 OGT 특이적 올리고뉴클레오티드의 직접적인 전달을 통해 피부에서 효소 OGT 의 녹다운에 의해 가속화될 수 있는지 여부를 테스트할 것이다. 본 발명자들은 피부 상처 부위로의 OGT 안티센스 올리고뉴클레오티드 (OGT 안티센스 ODN) 및/또는 OGT siRNA 의 국부 적용으로 인해 OGT 활성을 하향조절하는 것은 통상 및 당뇨병성 상처에서의 치유를 가속화할 것이라는 점을 고려한다.
본 실시예에 기재된 연구는 하기와 관련 있다:
I)
당뇨병성 마우스 모델에서 OGT 녹다운이 상처 치유 속도를 가속화할 수 있는지 여부 판단, 및
II)
OGT 매개된 세포내 O-글리코실화가 상처 치유를 조절하는 것에 의한 메카니즘의 추가적인 특성화.
당뇨병성 상처의 치유를 촉진하기 위한 OGT 안티센스 올리고뉴클레오티드의 국부적 전달
만성 상처는 미국 내 650 만명의 환자가 발병하는 질병률의 유의한 근원으로 연간 치료하는데 약 250 억 달러 비용이 든다. 당뇨병이 있는 환자는 만성의 비치유 상처가 발달될 위험이 증가한다. 아마도, 다양한 인자들로 인해, 당뇨병 환자에게 있어, 글루코오스 수준 상승을 야기하는 기초 내분비 기능장애뿐이 아닌 신경병, 혈관병을 비롯한 만성의 상처가 발달되는 경향이 있다.
세린 및 트레오닌 잔기의 O-글리코실화는 단백질 인산화와 유사한 통상적인 조절성 번역후 개질이고; 증가된 세포내 단백질 O-글리코실화는 당뇨병성 및 고혈당 상태에서 관찰된 바 있다. 2 개의 세포내 효소인 UDP-N-아세틸글루코사민-폴리펩티드 β-N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라아제 (OGT) 및 O-GlcNAc-선택적 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 (OGA) 는 각각 세포내 단백질 기질로부터 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 의 부가 및 제거를 중재한다. 세포내 단백질의 O-GlcNAc 개질에서의 변경은 당뇨병과 연결되고, 당뇨병 조직에서 발견되는 단백질 O-글리코실화의 증가 수준은 부분적으로 지연되는 상처 치유에 기여하는 관찰되는 기저 병태생리학의 일부를 부분적으로 설명할 수 있다.
케라티노사이트에서 증가된 OGT 활성은 상처 치유를 지연시킨다. 상처 치유 동안, 케라티노사이트는 상처로 이동하여 재상피화를 촉진한다. 상처 단에서 케라티노사이트는 길게 뻗은 부위에서 인접 세포와의 부착을 하향조절하여 그 모서리로부터 상처 내로 이동을 허용해야 한다. 세포-세포 부착을 증가시킴으로써, 본 발명자들은 증가된 세포내 단백질 O-글리코실화가 상처 치유를 지연시키나 세포내 단백질 O-글리코실화의 하향 조절이 상처 치유를 촉진시킨다는 점을 제안한다. 상기 제안에서, 본 발명자들은 상처 치유에서의 O-글리코실화의 역할을 추가로 특성화할 것이다. 예비 테스트로서, OGT 과발현 케라티노사이트에서 상처 봉합 시간을, 스크래치 검정을 이용한 대조군 케라티노사이트와 비교했다 (도 6). 세포내 단백질의 OGT 매개 O-글리코실화 증가 치유 지연을 야기한다. 상처낸 후 16 시간 후에, 대조군 케라티노사이트는 완전히 상처를 봉합했다. 반대로, OGT 과발현 케라티노사이트는 상처를 봉합하는 데 실패했다; 50% 미만의 상처 봉합이 상처 처리 후 16 시간에 OGT 세포에서 관찰되었다.
본 발명자들은 (i) 쥣과동물 케라티노사이트에서 OGT 의 과발현에 의해 단백질 O-글리코실화를 증가시키는 것이 상승된 단백질 O-글리코실화 및 과-부착 표현형을 도모한다는 점 (도 2 및 (17)) 및 (ii) 상승된 고혈당 조건 하에서 배양된 인간 케라티노사이트는 증가된 수준의 O-GlcNAc 개질을 나타낼뿐 아니라 시험관 내 상처 봉합 속도를 지연시킨다는 점 (도 7) 을 밝혔다. 본 발명자들은 RNA 간섭 (RNAi) 에 의한 OGT 의 특이적 녹다운이 상기 효과를 유의하게 역전시키고 (도 2, 3, 7), 이로써 당뇨병 환자의 지연된 상처 치유에서 OGT-표적화 치료적 개입에 대한 기회를 틀 수 있음을 추가로 발견한 바 있다. OGT 를 저해하는 것은 당뇨병 상처를 비롯한 만성 상처의 치유를 촉진할 것이라고 고려된다. 본 발명자들은 저해성 뉴클레오티드 (예, OGT 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA) 의 투여가 생체 내 상처 치유를 촉진한다는 것을 제안한다.
당뇨병에서 세포내 O-글리코실화. 고혈당증, 즉 과도한 글루코오스가 글루코사민 경로로 공급되어 OGT 를 위해 과량의 UDP-GlcNAc 를 제공해 세포내 단백질을 개질한다 (18). 과도한 글루코오스는 세포내 단백질의 OGT 개질을 위한 공여체 기질인 UDP-N-아세틸글루코사민 (UDP-GlcNAc) 로 궁극적으로는 전환되는 글루코사민으로 전환된다. 결과적으로, 고혈당증은 각종 단백질의 증가된 O-글리코실화와 관련있다. (18-22). 당뇨병을 비롯한 고혈당 상태에서 관찰되는 세포내 단백질의 증가된 GlcNAc 개질은 당뇨병과 연관된 병리학 일부에 기인하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 췌장 β-세포는 고수준의 OGT 를 갖고 세포내 O-GlcNAc 개질의 변경 및 근육과 지방 조직에서의 OGT 의 과발현에 민감하여 트랜스제닉 마우스 모델에서 당뇨병을 야기시킨다 (23).
증가된 세포내 단백질 O-글리코실화를 야기하는 돌연변이 및 당뇨병의 유전적 관련성. O-GlcNAcase (OGA) 를 인코딩하는 유전자에서 초기 종료화를 야기하는 돌연변이는 멕시코계 미국인 인구의 성인 발병형 제 2 형 당뇨병의 유전적 경향과 연관되어 있다 (24). OGA 는 세포내 단백질로부터 GlcNAc 를 제거하고, 동정된 OGA 돌연변이는 증가된 수준의 단백질 O-글리코실화를 일으킨다. 이러한 관찰은 당뇨병에서 증가된 세포내 O-글리코실화에 대한 병리학적 역할을 추가 지지한다.
사전 작업은 효소 OGT 에 의해 매개되는 증가된 세포내 O-글리코실화가 하기를 비롯하여 만성의 당뇨병성 피부에서 지연된 상처 치유의 원인이 된다는 점을 시사한다:
케라티노사이트에서 OGT 의 과발현은 (i) 세포성 단밸질의 GlcNAc 개질을 증가시키고, (ii) 세포-세포 부착을 현저히 증강시키고 (도 7)(1), 및 (iii) 상처 치유의 케라티노사이트 스크래치 검정 모델에서 상처 봉합을 지연시킴 (도 6);
세포성 단백질의 증가된 GlcNAc 개질은 당뇨병이 있는 마우스의 피부에서 관찰됨 (도 5);
인간 케라티노사이트 배양물에서 글루코오스의 증가된 농도는 케라티노사이트 단백질의 GlcNAc 개질 증가와 연관있고, 이는 용량 의존적 방식으로 상처 봉합을 저해함 (도 7); 및
OGT 특이적 shRNA 또는 siRNA 로의 OGT 활성 침묵은 케라티노사이트 단백질의 GlcNAc 개질을 감소시키고, 상승된 글루코오스 농도의 존재 하에서도 스크래치 모델 검정에서 상처 치유를 촉진함 (도 2, 3, 7).
세포 부착을 촉진하고 상처 치유를 지연시키는 것에 대한 증가된 OGT 활성의 효과는 부분적으로, 본 발명자가 이전에 보고한 바와 같이 데소모좀, 부착 연접부, 및 세포골격 요소를 비롯한 케라티노사이트 세포 부착 성분들의 조절로 인한 것일 수 있다 (17).
따라서, (i) 증가된 글루코오스 농도, 증가된 OGT 활성, 또는 감소된 OGA 활성에 의한 세포내 단백질 O-글리코실화를 증가시킴으로써 상피 상처의 치유 지연, 및 (ii) 단백질 O-글리코실화를 감소시키는 OGT 특이적 shRNA 또는 siRNA 에 의한 상처 치유 가속은 만성 당뇨병성 피부 상처의 지연된 치유에서 상기 경로의 역할을 지지한다.
당뇨병 및 고혈당 상태에서 케라티노사이트 상처 치유의 조절자로서의 OGT 의 동정 및 OGT 활성을 하향조절하는 것이 상처 치유를 촉진한다는 입증은 매우 신규하고 혁신적인 관찰이다. 생체 내 OGT 활성을 하향 조절하도록 국부 안티센스 OGT ODN 의 개발은, OGT 저해가 만성 당뇨병성 상처의 치유를 가속화할 것이라는 개념에 대한 증거를 제공할 것이다. 더욱이, 상처로의 안티센스 ODN 의 국부적 전달은 인간 대상체에서 상처에 존재하는 손상된 경계로 인해 표적 유전자를 하향 조절하는 것으로 입증된 바 있다. 그리하여, OGT 안티센스 ODN 의 국부적 전달은 치유를 촉진하기 위한 매우 신규하고, 실용적이고 실행가능한 접근법에 해당하고, 만성의 비치유 당뇨병성 상처의 관리에서 유의미한 진전을 나타낼 것이다. 치유 시간을 감축시킴으로써, 국부 OGT 안티센스 ODN 은 이들 상처를 관리하는 직접적인 비용뿐 아니라 발병 개체에서 생산성 손실로 인한 간접적인 비용 양자 모두를 감소시키는 것으로 예상된다. 이러한 제안은 당뇨병성 피부 상처의 치유가 OGT 특이적 올리고뉴클레오티드의 직접적인 전달을 통해 피부에서 효소 OGT 의 녹다운으로써 가속화될 수 있는지 여부를 시험할 것이다. 이는 생체 내 OGT 저해가 치유를 촉진할 수 있다는 개념의 증거에 의해, 만성의 당뇨병성 피부 상처를 갖는 환자에게서 OGT 안티센스 ODN 의 번역 임상 연구를 신속하게 도모할 수 있는 가능성이 있는 고위험 고충격 연구이다.
접근/방법:
I. 당뇨병성 마우스 모델에서 OGT 녹다운이 상처 치유 속도를 가속화할 수 있는지 여부 결정
당뇨병성 마우스 모델. 초기 생체 내 연구는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 로부터 얻은, 익히 특성화되고 용이하게 이용가능한 스트렙토조티신 (STZ) 유도 당뇨병성 C57BL/6J 마우스에 집중할 것이고; 비(非) 당뇨병성 C57BL/6J 마우스는 WT 대조군으로서 이용될 것이다. 대안적으로, 확립된 프로토콜을 이용하여 본 발명자들은 스트렙토조티신 (STZ) 의 50 mg STZ/kg 체중, qd x 5 일로 복강내 주사함으로써 6-8 주령 수컷 C57BL/6J 마우스에서 당뇨병을 유도할 수 있다. 주사 10 일 후, 혈액 글루코오스 수준이 당뇨병 마우스를 동정하는데 결정된다 (즉, 비(非)공복 혈액 글루코오스 수준 > 300-400 mg/dl). 탐구될 수 있는 추가적인 당뇨병성 마우스 모델에는 음식-유도 비만 모델 (예비 당뇨병 제 2 형 당뇨병 모델) 및/또는 db/db 마우스 (양자 모두, Jackson laboratories 에서 입수가능) 이 포함된다.
당뇨병성 마우스 모델에서의 상처-치유 실험. 마우스를 마취시키고, 면도하고, 전층 등쪽 중앙 상처 (6 mm 직경 원형 모양, 113 ㎟ 면적) 을, 6 mm 펀치 생검으로 피부를 절제하여 만든다. 상처를 낸 마우스는 치료를 받지 않거나 (그룹 1), 비히클을 단독으로 수여받거나 (그룹 2), 또는 비히클 중 OGT 안티센스-ODN (OGT 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드) 로 국부적으로 수여받거나 (그룹 3), 또는 비히클 중 대조군 (OGT 센스) ODN 으로 국부적으로 수여받는다 (그룹 4). 당뇨병성 및 대조군 마우스의 등쪽 중앙선의 한쪽 측 상에 면도된 등에 4 가지의 전층 절제 상처를 낸다. 얼음 상 냉각된 30% Pluronic F-127 겔 (SIGMA) 중 1μM OGT 안티센스-ODN 를 하나의 상처에. 1μM 대조군 OGT 센스-ODN 을 하나의 상처에, 비히클 단독을 하나의 상처에, 및 나머지 상처에는 아무것도 없음. OGT 녹다운의 정도 및 O-GlcNAc 개질에 대한 영향을 조사하기 위한 4 종의 실험을 위해, 상처 및 주변 피부를 다양한 시간 지점에서 (시간 지점 당 최소 8 마리의 마우스) 8 mm 펀치 생검으로 수집한다.
생체 내 투여 최적화. 최적의 농도 및 투여 요법을 동정하기 위해, 비히클 중 OGT 안티센스 ODN 의 용량 반응 곡선을 C57BL/6J 마우스 WT 백그라운드에 활용할 것이다. 비히클 중 ODN 의 농도 0.01 μM 내지 10 μM 가 초기에 사용될 것이며, 이는 생체 내 공개된 연구에 따르면 이것이 시험 동물의 피부에서 녹다운에 효과적인 것으로 밝혀져 있기 때문이다. 30% Pluronic® F-127 겔 (SIGMA) 은 이것이 생체 내 ODN 의 국부적 전달에 유효한 것으로 입증되어 있는 바, ODN 전달을 위한 초기 비히클일 것이다; 그러나 추가적인 비히클을 이용할 수 있다. 시간 경과 연구가 생체 내 최적의 투약 요법을 결정하는데 사용될 것이다. 예를 들어, 단일 투여의 전달 후 OGT 녹다운의 지속이 국부적 ODN 의 투여 후 24 시간, 48 시간, 4 일 및 7 일 후에 시험 동물의 피부의 생검에 의해 평가될 것이다. OGT 녹다운의 수준 및 세포내 단백질 O-GlcNAc 개질의 효과는 (i) 피부 생검 섹션의 면역퍼옥시다아제 염색 및/또는 면역형광 및 (ii) OGT 및 O-GlcNAc 에 대한 항체로의 피부 추출물의 면역블롯팅에 의해 검정될 것이다. 국부 ODN 의 투약 요법은 녹다운 효과의 반감기를 기반으로 할 것이다. 예를 들어, 녹다운ㄴ이 48 시간 지속된다면, 격일제로 국부 ODN 의 투약 요법이 생체 내 상처 치유 연구를 위해 이용될 것이다.
생체 내 상처 치유 검정. 완전한 상처 봉합이 달성될 때까지 동물을 상이한 시간 지점에서 임상적으로 조사할 것이다. 비(非)치료 마우스, 및 비히클 대조군 및 OGT 안티센스-ODN 치료 마우스의 완전한 치유까지 상처 봉합을 매일 측정한다. 개개의 마우스로부터의 상처를 디지털방식으로 사진찍고, 상처 면적을 정량하고 (Sigma-Scan; Sigma-Aldrich), 초기 상처 크기의 백분율 (100%) 로서 표준화 및 표시한다 (9). 평균값 (그룹 당 8 - 10 마리의 동물) 을 각 시간 지점에서 플롯팅한다 ± SEM. 스튜던트 티 테스트를 대조군 및 OGT 안티센스-ODN 치료군의 비교에 사용한다. 일단 상처 치유가 완료되면, 마우스를 Animal Care Committee of UNC-CH 에 의해 승인된 프로토콜에 따라 단두로써 희생시킬 것이다. 피부 조직 샘플을 OGT 수준에 대해 분석할 것이고, 항-OGT 특이적 항체 및 O-GlcNAc 특이적 항체 (클론 RL2 또는 CTD110.) 각각을 이용한 피부 생검의 직접적인 면역형광 민 면역퍼옥시다아제 염색에 의한 단백질 O-GlcNAc 개질에 대해 작용적으로 분석할 것이다. OGT 에 대한 항체 및 RL2 및 CTD 110.1 O-GlcNAc 특이적 항체를 활용하는 조직 추출물의 면역블롯팅은 OGT 안티센스 ODN 전달 및 OGT 의 작용적 녹다운의 효과를 조사하기 위한 추가적인 접근법이다.
II. OGT 매개된 O-글리코실화가 생체 내 및 실험관 내 상처 치유를 조절하는 것에 의한 메카니즘을 추가로 특성화한다.
부착에 더하여, 세포 증식 및/또는 화학 주성의 조절이 또한 고혈당 조건 또는 OGT 과발현 케라티노사이트에서 관찰되는 상처 치유 지연에 기인할 수도 있다. 이러한 연구는 (1) 세포-세포 부착, (2) 세포 증식 및 (3) 화학주성에 대한 케라티노사이트 세포내 단백질의 증가된 GlcNAc 개질의 효과를 추가로 특성화할 것이다. 본 발명자들은 (i) OGT 활성의 효과가 다면발현성이기 쉽고, (ii) 세포내 O-글리코실화의 수준이 세포 증식, 화학주성 및 부착을 변경하고, (iii) 이들 효과의 조합이 관찰되는 지연된 상처 치유에 기인한다는 점을 고려한다.
근거: 본 발명자들이 단층 스크래치 검정을 이용해 제작한 예비 자료는 케라티노사이트에서 증가된 세포내 O-글리코실화가 상처 치유를 지연시키고 OGT 녹다운이 상처 치유를 가속화시킨다는 점을 지시한다. O-글리코실화는 편재 세포내 개질이다. 세포 부착 및 구조적 단백질을 개질하는 것에 덧붙여, 전사 인자 및 조절 효소가 또한 GlcNAc 의 세린 및 트레오닌 잔기로의 OGT 촉매화 부가에 의해 개질된다. 부착 외에, 세포 증식 및/또는 화학주성의 O-GlcNAc 매개의 조절은 또한 고혈당 조건 또는 OGT 과발현 케라티노사이트에서 관찰되는 상처 치유 지연에 기여할 수 있다. 이러한 연구는 케라티노사이트 세포내 단백질의 증가된 GlcNAc 개질의 (1) 세포-세포 부착, (2) 세포 증식 및 (3) 화학 주성에 대한 효과를 특성화한다. 본 발명자들은 (i) OGT 활성의 효과가 다면발현성이기 쉽다는 점, (ii) 세포내 O-글리코실화의 수준이 세포 증식, 화학주성 및 부착을 변경시킨다는 점, 및 (iii) 이들 효과의 조합이 관찰되는 지연된 상처 치유에 기인한다는 점을 고려한다.
시험관 내 검정. 1차 인간 케라티노사이트뿐 아니라 영구적으로 트랜스펙션된 무한증식 케라티노사이트 세포주를 이용하여, 본 발명자들은 변경된 세포내 O-글리코실화의 효과를 조사할 것이다. O-글리코실화 수준은 세포주에서 인간 OGT 의 트랜스펙션에 의해, 내인성 OGT 및 내인성 OGA 의 shRNA 녹다운에 의해, 세포의 증가된 농도의 세포외 글루코오스로의 노출에 의해, 및 OGA 저해제 PUGNAc 를 활용함으로써 조작한다. 세포내 O-글리코실화 수준을 조작하는 상기 도구를 이용하여, 본 발명자들은 (1) 세포 증식, (2) 세포 이동, (3) 세포-세포 부착 및 (4) 상처 봉합에서 하기 개괄되는 바와 같이 변경에 대해 검정할 것이다.
본 발명자들은 세포내 O-글리코실화의 수준이 세포 증식에 영향을 미치는지 여부에 대해 결정할 것이다. 세포 증식에 대한 검정에는 정량 분석을 용이하게 하는 3H-티미딘 대사물 방사성 동위원소 실험 및 BrDu 혼입을 포함할 것이다. 인간 OGT 가 일시적으로 무한증식 케라티노사이트 A431 편평 상피 암종으로 트랜스펙션된 예비 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 증가된 OGT 활성 및 세포내 O-글리코실화가 증식을 감소시키는 반면에; 감소된 O-글리코실화가 증식을 증가시킬 것이라는 점을 예측한다.
본 발명자들은 세포내 O-글리코실화의 수준이 세포 화학주성에 영향을 미치는지 여부에 대해 결정할 것이다. 변경된 보이덴 챔버 검정을 활용하여, 소태아혈청, EGF, PDGF 및 GPCR 아고니스트를 포함해 케라티노사이트를 비롯해 케라티노사이트 운동성을 자극하는 것으로 공지된 각종 제제에 대한 변경된 화학주성에 대해 검정할 것이다. 본 발명자들은 증가된 OGT 활성 및 세포내 O-글리코실화가 화학주성을 감소시킬 것이라는 점을 예측한다.
본 발명자들은 세포내 O-글리코실화의 수준이 세포-세포 부착에 영향을 미치는지 여부에 대해 결정할 것이다. 디스파아제 검정을 이용하여 세포-세포 부착을 직접적으로 측정할 것이고, 기존에 기술된 바와 같은 연접부 단백질 수준 및 세포성 국소화에 대한 OGT 의 효과를 결정하도록 부착 연접부 및 데스모솜 성분에 대한 항체를 이용하는 IF 분석 및 면역블롯으로써, 연접부 단백질 성분의 효과가 면역블롯에 의해 분석될 것이다 (17). 본 발명자들은 증가된 OGT 활성 및 세포내 O-글리코실화가 세포-세포 부착을 증가할 것이라고 예측한다.
본 발명자들은 세가지 모든 효과들을 동시에 상처 치유 모델에서 조사할 것이다 (i. 스크래치 및 ii. 기관형적). 본 발명자들은 케라티노사이트 단층 스크래치 검정 및 피부 동등 기관형적 배양물 양자 모두를 이용하여 상처 치유에 대한 세포내 O-글리코실화의 효과를 조사할 것이다. 영구적으로 트랜스펙션된 OGT 케라티노사이트를 이용하여 3 가지 모델 시스템에서 증가된 세포내 O-글리코실화를 구동할 것이다. 추가적으로, 피부 등가물을 구축하는데 사용된 케라티노사이트에서 또는 단층 배양물 내 케라티노사이트에서 OGT 또는 O-GlcNAcase 의 shRNA 녹다운은 우리로 하여금 내인성 OGT 및 OGA 활성의 변경을 조사할 수 있게 한다. OGT shRNA 및 OGA shRNA 를 이용하여 감소 및 증가된 세포내 O-글리코실화 각각의 상처 치유 진행에 대한 효과를 조사할 것이다. 본 발명자들은 (1) 세포-세포 부착, (2) 세포 이동, (3) 세포 증식 및 (4) 상처 봉합에 대한 변경에 대해 검정할 것이다. 본 발명자들은 증가된 OGT 활성 및 세포내 O-글리코실화가 상처 치유를 감소시킬 것이라는 점을 예측한다.
시험관 내 검정:
OGT 활성 조작. 몇몇의 접근법이 활용되어 세포 및 조직 모델 시스템 내에서 OGT 활성을 조정할 것이다. 본 발명자들은 클로닝된 쥣과 동물 및 인간 OGT 각각의 과발현을 구동하는 영구적으로 트랜스펙션된 쥣과동물 및 인간 케라티노사이트 세포주를 만들었다. 추가적으로, 본 발명자들이 OGT 및 OGA mRNA, 단백질의 내인성 수준 및 활성을 유의하게 줄이는데 유효한 것으로 밝혀낸 OGT 및 OGA 양자에 대한 shRNA 구축물을 본 발명자들은 갖는다. 세포외 글루코오스 농도의 조정이 또한 세포내 단백질 GlcNAc 개질을 변경시키는 것으로 밝혀졌다 (2). 마지막으로, OGA 의 저해제, 구체적으로 PUGNAC 가 이용하여, 세린 및 트레오닌 잔기로부터 GlcNAC 의 제거를 촉매화하는 효소를 저해함으로써 세포내 O-글리코실화를 증가시킬 수 있다.
O-글리코실화에 대한 검정. 다수의 검정을 이용해 세포내 단백질의 증가된 OGT-매개된 GlcNAc 개질을 검출할 것이다. GlcNAc 개질된 단백질의 검출은 (i) 시판중인 GlcNAc 특이적 모노클로날 항체 RL2 (26-29) (Affinity Bioreagents) 또는 CTD110.6 (Covance) 를 이용한 면역블롯에 의해, (ii) 3H-GlcNAC 중 세포를 배양하는 것에 의한 단백질 기질로의 방사성표지의 특정 혼입으로써, 또는 (iii) 갈락토실트랜스퍼라아제 방사성표지에 의해; β-1,4-갈락토트랜스퍼라아제가 공여체 UDP-갈락토오스로부터 N-아세틸글루코사민의 OH-4 로 갈락토오스의 부가를 촉매작용하고 그리하여 3H-갈락토오스를 GlcNAc 개질된 세포 단백질로 특이적으로 혼입하는데 상기를 사용할 수 있는 것에 의한다 (30). 본 발명자들은 플라코글로빈 O-글리코실화를 증명하기 위한 상기 접근법들 중 각각을 이용한 바 있다 (17).
세포 증식 검정. 세포를 3 시간 동안 10 μM 티미딘 유사체 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) (새롭게 복제된 DNA 로 혼입되는 것이 바람직함) 와 함께 인큐베이션하고, 5% 수크로오스 (pH 7.0) 을 함유하는 4% 파라포름알데히드 중 20 분 동안 실온에서 고정시켰다. BrdU 를 혼입하는 핵을 힝-BrdU 항체로 검출하고, Zeiss 형광 현미경을 이용해 카운팅한다. 5 개 이상의 무작위로 선택한 상이한 분야를 포함해, 500 개 이상의 세포를 포인트 당 스코어링한다. 대안적으로, 증식 케라티노사이트는 3H-티미딘으로 표지되고; 각 실험 조건에 대해 정의된 수의 세포로 혼입된 3H 신호 수준은 세포 증식의 직접적인 정량 방안을 제공한다. 증식률을 측정하기 위한 기타 접근법으로는 크리스탈 바이올릿 또는 MTT 로의 염색 및 양성 염색된 세포의 수 카운팅을 포함한다.
세포-세포 부착에 대한 검정은 기술된 바와 같은 (17, 31, 32) 디스파아제-기재 해리를 통할 것이다. 요약하건대, 12 또는 24 웰 조직 배양 플레이트에서 삼중으로 컨플루언스까지 성장시킨 세포를 PBS 로 2 회 세정하고, 0.25 또는 0.05 ml 의 디스파아제 II (2.4 U/ml; Roche Diagnostics GmbH) 중 각각 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하고, ClayAdams 뉴테이터 (nutator) 상에서 앞뒤로 10 회 흔들고 단편수를 카운팅한다.
화학주성에 대한 검정. 화학주성을 폴리카르보네이트 필터 (25 x 80 mm, 12 μM 다공 크기) 를 이용해 개질된 보이덴 챔버에서 측정한다. 화학유인물질를 하부 챔버에 첨가하고, 세포를 5 x 104 세포/웰로 상부 챔버에 첨가한다. 명기된 시간점 (0-12 시) 에서, 상부 멤브레인 표면 상 비(非)이동성 세포를 기계적으로 제거하고 필터의 하부 표면을 횡단 및 퍼지는 세포를 고정하고 Diff-Quik (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 로 염색한다. 이동된 세포를 10 x 대물렌즈 및 현미경으로 카운팅한다. 각 데이타 포인트에 있어서, 4 가지 무작위 필드를 각 2 회 카운팅하고, 3 가지의 개별 웰의 평균 +/1 표준 편차 (SD) 를 측정한다. OGT 매개된 세포내 O-글리코실화의 화학주성에 대한 효과는 포괄적이거나 또는 경로 특이적이다. 이들 가능성들 간 구별하기 위해, 각종 화학주성제 (성장인자, 예컨대 EGF 및 PDGF, 혈청 및 GPCR 아고니스트) 에 대해 수행할 것이다.
생체 내 검정:
세포 부착을 변경하는 것에 덧붙여, OGT 는 증식에 영향을 미칠 수 있다. 케라티노사이트 증식을, Ki67, 핵 증식 항원 (33) 에 대한 피부 생검의 면역조직학적 염색으로써 생체 내 검정하여, 상처 후 생체 내 케라티노사이트 증식에 대한 OGT 녹다운의 효과를 판단할 것이다.
상처 치유 동안, 호중구 다음 대식세포에 의한 초기 침윤을 비롯해 염증성 침윤에 진보적인 변화가 존재한다. 염증성 변화는 초기의 상처 치유를 손상시키는 것으로 여겨지는 바, 그리하여 본 발명자들은 생체 내 상처에 대한 OGT 녹다운의 효과를 판단하기 위해, 염증성 침윤 효과에 대한 OGT 안티센스 ODN 의 효과에 대해 추가적으로 조직 샘플을 분석할 것이다.
호중구 및 대식세포 침윤은 상처가 난 후 1 일 및 3 일 후 상처의 피부 생검에 의해 평가될 것이다. 헤마톡실린 및 에오신으로 단면적을 염색하고, 세포/고출력장을 카운팅함으로써 호중구를 정량화할 것이다. 추가적으로, 골수세포형과산화효소 염색을 또한 상처로의 호중구 침윤물을 정량하는 추가적인 수단으로서 이용할 것이다. 대식세포는 피부 생검 샘플을 염색함으로써 정량할 것이다.
참고 문헌
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 인용 혼입되도록 지시되어 있는 바와 같이 동일하게 본원에 참조 인용되어 있다.
본 발명에서 개시된 주제의 여러 상세 사항은 본원에서 개시된 주제의 영역을 벗어나지 않는 한 변경할 수 있음은 자명할 것이다. 나아가, 앞서의 기재는 단지 설명을 위한 것으로, 제한의 목적이 있는 것이 아니다.
서열목록 자유 텍스트
SEQ ID NO: 1 은 OGT 센스 DNA/뉴클레오티드 서열- 코딩 (3141 nt) 이다.
SEQ ID NO: 2 는 OGT 폴리펩티드 서열 (1046 aa) 이다.
SEQ ID NO: 3 은 OGT 역평행 서열/OGT 안티센스 DNA 서열이다.
SEQ ID NOs: 4-11 는 OGT 안티센스 올리도데속시뉴클레오티드이고, 이때 SEQ. ID. NO. 4, 5, 및 6 은 코딩 영역이고, SEQ. ID. NO. 7 및 8 은 3'UTR 영역(들)을 동정하고, SEQ. ID. NO. 9, 10 및 11 은 인트론을 동정한다.
SEQ ID NOs: 12-168 는 OGT 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (코딩 영역) 을 동정한다.
SEQ ID NOs: 169-171 는 OGT siRNA 이다.
SEQ ID NO: 172 는 OGT shRNA 이다.
EQ ID NO: 173 는 OGT 센스 DNA/뉴클레오티드 서열, 조절 영역, 인트론 및 코딩 서열을 포함하는 전장 (49836 nt) 이다.
SEQUENCE LISTING
<110> University of North Carolina at Chapel Hill
Rubenstein, David
Runager, Kasper
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING O-LINKED
N-ACETYLGLUCOSAMINE TRANSFERASE AND PROMOTING WOUND HEALING
<130> UNC 13-0070 - UN148-13070
<140> PCT/US2014/023525
<141> 2014-03-11
<160> 173
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3141
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggcgtctt ccgtgggcaa cgtggccgac agcacagaac caacgaaacg tatgctttcc 60
ttccaagggt tagctgagtt ggcacatcga gaatatcagg caggagattt tgaggcagct 120
gagagacact gcatgcagct ctggagacaa gagccagaca atactggtgt gcttttatta 180
ctttcatcta tacacttcca gtgtcgaagg ctggacagat ctgctcactt tagcactctg 240
gcaattaaac agaaccccct tctggcagaa gcttattcga atttggggaa tgtgtacaag 300
gaaagagggc agttgcagga ggcaattgag cattatcgac atgcattgcg tctcaaacct 360
gatttcatcg atggttatat taacctggca gccgccttgg tagcagcggg tgacatggaa 420
ggggcagtac aagcttacgt ctctgctctt cagtacaatc ctgatttgta ctgtgttcgc 480
agtgacctgg ggaacctgct caaagccctg ggtcgcttgg aagaagccaa ggcatgttat 540
ttgaaagcaa ttgagacgca accgaacttt gcagtagctt ggagtaatct tggctgtgtt 600
ttcaatgcac aaggggaaat ttggcttgca attcatcact ttgaaaaggc tgtcaccctt 660
gacccaaact ttctggatgc ttatatcaat ttaggaaatg tcttgaaaga ggcacgcatt 720
tttgacagag ctgtggcagc ttatcttcgt gccctaagtt tgagtccaaa tcacgcagtg 780
gtgcacggca acctggcttg tgtatactat gagcaaggcc tgatagatct ggcaatagac 840
acctacaggc gggctatcga actacaacca catttccctg atgcttactg caacctagcc 900
aatgctctca aagagaaggg cagtgttgct gaagcagaag attgttataa tacagctctc 960
cgtctgtgtc ccacccatgc agactctctg aataacctag ccaatatcaa acgagaacag 1020
ggaaacattg aagaggcagt tcgcttgtat cgtaaagcat tagaagtctt cccagagttt 1080
gctgctgccc attcaaattt agcaagtgta ctgcagcagc agggaaaact gcaggaagct 1140
ctgatgcatt ataaggaggc tattcgaatc agtcctacct ttgctgatgc ctactctaat 1200
atgggaaaca ctctaaagga gatgcaggat gttcagggag ccttgcagtg ttatacgcgt 1260
gccatccaaa ttaatcctgc atttgcagat gcacatagca atctggcttc cattcataag 1320
gattcaggga atattccaga agccatagct tcttaccgca cggctctgaa acttaagcct 1380
gattttcctg atgcttattg taacttggct cattgcctgc agattgtctg tgattggaca 1440
gactatgatg agcgaatgaa gaagttggtc agtattgtgg ctgaccagtt agagaagaat 1500
aggttgcctt ctgtgcatcc tcatcatagt atgctatatc ctctttctca tggcttcagg 1560
aaggctattg ctgagaggca cggcaacctg tgcttagata agattaatgt tcttcataaa 1620
ccaccatatg aacatccaaa agacttgaag ctcagtgatg gtcggctgcg tgtaggatat 1680
gtgagttccg actttgggaa tcatcctact tctcacctta tgcagtctat tccaggcatg 1740
cacaatcctg ataaatttga ggtgttctgt tatgccctga gcccagacga tggcacaaac 1800
ttccgagtga aggtgatggc agaagccaat catttcattg atctttctca gattccatgc 1860
aatggaaaag cagctgatcg catccatcag gatggaattc atatccttgt aaatatgaat 1920
ggctatacta agggcgctcg aaatgagctt tttgctctca ggccagctcc tattcaggca 1980
atgtggctgg gataccctgg gacgagtggt gcgcttttca tggattatat tatcactgat 2040
caggaaactt cgccagctga agttgctgag cagtattccg agaaattggc ttatatgccc 2100
cacacttttt ttattggtga tcatgctaat atgttccctc acctgaagaa aaaagcagtc 2160
atcgatttta agtccaatgg gcacatttat gacaatcgga tagttctgaa tggcatcgac 2220
ctcaaagcat ttcttgatag tctaccagat gtgaaaattg tcaagatgaa gtgtcctgat 2280
ggaggagaca atgcagatag cagtaacaca gctcttaata tgcctgttat tcctatgaat 2340
actattgcag aagcagttat tgaaatgatt aaccgaggac agattcaaat aacaattaat 2400
ggattcagta ttagcaatgg actggcaact actcagatca acaataaggc tgcaactgga 2460
gaggaggttc cccgtaccat tattgtaacc acccgttctc agtacgggtt accagaagat 2520
gccatcgtat actgtaactt taatcagttg tataaaattg acccttctac tttgcagatg 2580
tgggcaaaca ttctgaagcg tgttcccaat agtgtactct ggctgttgcg ttttccagca 2640
gtaggagaac ctaatattca acagtatgca caaaacatgg gcctgcccca gaaccgtatc 2700
attttttcac ctgttgctcc taaagaggaa cacgtcagga gaggccagct ggctgatgtc 2760
tgcttggaca ctccactctg taatgggcac accacaggga tggatgtcct ctgggcaggg 2820
acccccatgg tgactatgcc aggagagact cttgcttctc gagttgcagc atcccagctc 2880
acttgcttag gttgtcttga gcttattgct aaaaacagac aagaatatga agacatagct 2940
gtgaagctgg gaactgatct agaatacctg aagaaagttc gtggcaaagt ctggaagcaa 3000
agaatatcta gccctctgtt caacaccaaa caatacacaa tggaactaga gcggctctat 3060
ctacagatgt gggagcatta tgcagctggc aacaaacctg accacatgat taagcctgtt 3120
gaagtcactg agtcagcata a 3141
<210> 2
<211> 1046
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Ser Ser Val Gly Asn Val Ala Asp Ser Thr Glu Pro Thr Lys
1 5 10 15
Arg Met Leu Ser Phe Gln Gly Leu Ala Glu Leu Ala His Arg Glu Tyr
20 25 30
Gln Ala Gly Asp Phe Glu Ala Ala Glu Arg His Cys Met Gln Leu Trp
35 40 45
Arg Gln Glu Pro Asp Asn Thr Gly Val Leu Leu Leu Leu Ser Ser Ile
50 55 60
His Phe Gln Cys Arg Arg Leu Asp Arg Ser Ala His Phe Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ala Ile Lys Gln Asn Pro Leu Leu Ala Glu Ala Tyr Ser Asn Leu Gly
85 90 95
Asn Val Tyr Lys Glu Arg Gly Gln Leu Gln Glu Ala Ile Glu His Tyr
100 105 110
Arg His Ala Leu Arg Leu Lys Pro Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Ile Asn
115 120 125
Leu Ala Ala Ala Leu Val Ala Ala Gly Asp Met Glu Gly Ala Val Gln
130 135 140
Ala Tyr Val Ser Ala Leu Gln Tyr Asn Pro Asp Leu Tyr Cys Val Arg
145 150 155 160
Ser Asp Leu Gly Asn Leu Leu Lys Ala Leu Gly Arg Leu Glu Glu Ala
165 170 175
Lys Ala Cys Tyr Leu Lys Ala Ile Glu Thr Gln Pro Asn Phe Ala Val
180 185 190
Ala Trp Ser Asn Leu Gly Cys Val Phe Asn Ala Gln Gly Glu Ile Trp
195 200 205
Leu Ala Ile His His Phe Glu Lys Ala Val Thr Leu Asp Pro Asn Phe
210 215 220
Leu Asp Ala Tyr Ile Asn Leu Gly Asn Val Leu Lys Glu Ala Arg Ile
225 230 235 240
Phe Asp Arg Ala Val Ala Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Ser Pro
245 250 255
Asn His Ala Val Val His Gly Asn Leu Ala Cys Val Tyr Tyr Glu Gln
260 265 270
Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Asp Thr Tyr Arg Arg Ala Ile Glu Leu
275 280 285
Gln Pro His Phe Pro Asp Ala Tyr Cys Asn Leu Ala Asn Ala Leu Lys
290 295 300
Glu Lys Gly Ser Val Ala Glu Ala Glu Asp Cys Tyr Asn Thr Ala Leu
305 310 315 320
Arg Leu Cys Pro Thr His Ala Asp Ser Leu Asn Asn Leu Ala Asn Ile
325 330 335
Lys Arg Glu Gln Gly Asn Ile Glu Glu Ala Val Arg Leu Tyr Arg Lys
340 345 350
Ala Leu Glu Val Phe Pro Glu Phe Ala Ala Ala His Ser Asn Leu Ala
355 360 365
Ser Val Leu Gln Gln Gln Gly Lys Leu Gln Glu Ala Leu Met His Tyr
370 375 380
Lys Glu Ala Ile Arg Ile Ser Pro Thr Phe Ala Asp Ala Tyr Ser Asn
385 390 395 400
Met Gly Asn Thr Leu Lys Glu Met Gln Asp Val Gln Gly Ala Leu Gln
405 410 415
Cys Tyr Thr Arg Ala Ile Gln Ile Asn Pro Ala Phe Ala Asp Ala His
420 425 430
Ser Asn Leu Ala Ser Ile His Lys Asp Ser Gly Asn Ile Pro Glu Ala
435 440 445
Ile Ala Ser Tyr Arg Thr Ala Leu Lys Leu Lys Pro Asp Phe Pro Asp
450 455 460
Ala Tyr Cys Asn Leu Ala His Cys Leu Gln Ile Val Cys Asp Trp Thr
465 470 475 480
Asp Tyr Asp Glu Arg Met Lys Lys Leu Val Ser Ile Val Ala Asp Gln
485 490 495
Leu Glu Lys Asn Arg Leu Pro Ser Val His Pro His His Ser Met Leu
500 505 510
Tyr Pro Leu Ser His Gly Phe Arg Lys Ala Ile Ala Glu Arg His Gly
515 520 525
Asn Leu Cys Leu Asp Lys Ile Asn Val Leu His Lys Pro Pro Tyr Glu
530 535 540
His Pro Lys Asp Leu Lys Leu Ser Asp Gly Arg Leu Arg Val Gly Tyr
545 550 555 560
Val Ser Ser Asp Phe Gly Asn His Pro Thr Ser His Leu Met Gln Ser
565 570 575
Ile Pro Gly Met His Asn Pro Asp Lys Phe Glu Val Phe Cys Tyr Ala
580 585 590
Leu Ser Pro Asp Asp Gly Thr Asn Phe Arg Val Lys Val Met Ala Glu
595 600 605
Ala Asn His Phe Ile Asp Leu Ser Gln Ile Pro Cys Asn Gly Lys Ala
610 615 620
Ala Asp Arg Ile His Gln Asp Gly Ile His Ile Leu Val Asn Met Asn
625 630 635 640
Gly Tyr Thr Lys Gly Ala Arg Asn Glu Leu Phe Ala Leu Arg Pro Ala
645 650 655
Pro Ile Gln Ala Met Trp Leu Gly Tyr Pro Gly Thr Ser Gly Ala Leu
660 665 670
Phe Met Asp Tyr Ile Ile Thr Asp Gln Glu Thr Ser Pro Ala Glu Val
675 680 685
Ala Glu Gln Tyr Ser Glu Lys Leu Ala Tyr Met Pro His Thr Phe Phe
690 695 700
Ile Gly Asp His Ala Asn Met Phe Pro His Leu Lys Lys Lys Ala Val
705 710 715 720
Ile Asp Phe Lys Ser Asn Gly His Ile Tyr Asp Asn Arg Ile Val Leu
725 730 735
Asn Gly Ile Asp Leu Lys Ala Phe Leu Asp Ser Leu Pro Asp Val Lys
740 745 750
Ile Val Lys Met Lys Cys Pro Asp Gly Gly Asp Asn Ala Asp Ser Ser
755 760 765
Asn Thr Ala Leu Asn Met Pro Val Ile Pro Met Asn Thr Ile Ala Glu
770 775 780
Ala Val Ile Glu Met Ile Asn Arg Gly Gln Ile Gln Ile Thr Ile Asn
785 790 795 800
Gly Phe Ser Ile Ser Asn Gly Leu Ala Thr Thr Gln Ile Asn Asn Lys
805 810 815
Ala Ala Thr Gly Glu Glu Val Pro Arg Thr Ile Ile Val Thr Thr Arg
820 825 830
Ser Gln Tyr Gly Leu Pro Glu Asp Ala Ile Val Tyr Cys Asn Phe Asn
835 840 845
Gln Leu Tyr Lys Ile Asp Pro Ser Thr Leu Gln Met Trp Ala Asn Ile
850 855 860
Leu Lys Arg Val Pro Asn Ser Val Leu Trp Leu Leu Arg Phe Pro Ala
865 870 875 880
Val Gly Glu Pro Asn Ile Gln Gln Tyr Ala Gln Asn Met Gly Leu Pro
885 890 895
Gln Asn Arg Ile Ile Phe Ser Pro Val Ala Pro Lys Glu Glu His Val
900 905 910
Arg Arg Gly Gln Leu Ala Asp Val Cys Leu Asp Thr Pro Leu Cys Asn
915 920 925
Gly His Thr Thr Gly Met Asp Val Leu Trp Ala Gly Thr Pro Met Val
930 935 940
Thr Met Pro Gly Glu Thr Leu Ala Ser Arg Val Ala Ala Ser Gln Leu
945 950 955 960
Thr Cys Leu Gly Cys Leu Glu Leu Ile Ala Lys Asn Arg Gln Glu Tyr
965 970 975
Glu Asp Ile Ala Val Lys Leu Gly Thr Asp Leu Glu Tyr Leu Lys Lys
980 985 990
Val Arg Gly Lys Val Trp Lys Gln Arg Ile Ser Ser Pro Leu Phe Asn
995 1000 1005
Thr Lys Gln Tyr Thr Met Glu Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Gln Met
1010 1015 1020
Trp Glu His Tyr Ala Ala Gly Asn Lys Pro Asp His Met Ile Lys
1025 1030 1035
Pro Val Glu Val Thr Glu Ser Ala
1040 1045
<210> 3
<211> 3141
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ttatgctgac tcagtgactt caacaggctt aatcatgtgg tcaggtttgt tgccagctgc 60
ataatgctcc cacatctgta gatagagccg ctctagttcc attgtgtatt gtttggtgtt 120
gaacagaggg ctagatattc tttgcttcca gactttgcca cgaactttct tcaggtattc 180
tagatcagtt cccagcttca cagctatgtc ttcatattct tgtctgtttt tagcaataag 240
ctcaagacaa cctaagcaag tgagctggga tgctgcaact cgagaagcaa gagtctctcc 300
tggcatagtc accatggggg tccctgccca gaggacatcc atccctgtgg tgtgcccatt 360
acagagtgga gtgtccaagc agacatcagc cagctggcct ctcctgacgt gttcctcttt 420
aggagcaaca ggtgaaaaaa tgatacggtt ctggggcagg cccatgtttt gtgcatactg 480
ttgaatatta ggttctccta ctgctggaaa acgcaacagc cagagtacac tattgggaac 540
acgcttcaga atgtttgccc acatctgcaa agtagaaggg tcaattttat acaactgatt 600
aaagttacag tatacgatgg catcttctgg taacccgtac tgagaacggg tggttacaat 660
aatggtacgg ggaacctcct ctccagttgc agccttattg ttgatctgag tagttgccag 720
tccattgcta atactgaatc cattaattgt tatttgaatc tgtcctcggt taatcatttc 780
aataactgct tctgcaatag tattcatagg aataacaggc atattaagag ctgtgttact 840
gctatctgca ttgtctcctc catcaggaca cttcatcttg acaattttca catctggtag 900
actatcaaga aatgctttga ggtcgatgcc attcagaact atccgattgt cataaatgtg 960
cccattggac ttaaaatcga tgactgcttt tttcttcagg tgagggaaca tattagcatg 1020
atcaccaata aaaaaagtgt ggggcatata agccaatttc tcggaatact gctcagcaac 1080
ttcagctggc gaagtttcct gatcagtgat aatataatcc atgaaaagcg caccactcgt 1140
cccagggtat cccagccaca ttgcctgaat aggagctggc ctgagagcaa aaagctcatt 1200
tcgagcgccc ttagtatagc cattcatatt tacaaggata tgaattccat cctgatggat 1260
gcgatcagct gcttttccat tgcatggaat ctgagaaaga tcaatgaaat gattggcttc 1320
tgccatcacc ttcactcgga agtttgtgcc atcgtctggg ctcagggcat aacagaacac 1380
ctcaaattta tcaggattgt gcatgcctgg aatagactgc ataaggtgag aagtaggatg 1440
attcccaaag tcggaactca catatcctac acgcagccga ccatcactga gcttcaagtc 1500
ttttggatgt tcatatggtg gtttatgaag aacattaatc ttatctaagc acaggttgcc 1560
gtgcctctca gcaatagcct tcctgaagcc atgagaaaga ggatatagca tactatgatg 1620
aggatgcaca gaaggcaacc tattcttctc taactggtca gccacaatac tgaccaactt 1680
cttcattcgc tcatcatagt ctgtccaatc acagacaatc tgcaggcaat gagccaagtt 1740
acaataagca tcaggaaaat caggcttaag tttcagagcc gtgcggtaag aagctatggc 1800
ttctggaata ttccctgaat ccttatgaat ggaagccaga ttgctatgtg catctgcaaa 1860
tgcaggatta atttggatgg cacgcgtata acactgcaag gctccctgaa catcctgcat 1920
ctcctttaga gtgtttccca tattagagta ggcatcagca aaggtaggac tgattcgaat 1980
agcctcctta taatgcatca gagcttcctg cagttttccc tgctgctgca gtacacttgc 2040
taaatttgaa tgggcagcag caaactctgg gaagacttct aatgctttac gatacaagcg 2100
aactgcctct tcaatgtttc cctgttctcg tttgatattg gctaggttat tcagagagtc 2160
tgcatgggtg ggacacagac ggagagctgt attataacaa tcttctgctt cagcaacact 2220
gcccttctct ttgagagcat tggctaggtt gcagtaagca tcagggaaat gtggttgtag 2280
ttcgatagcc cgcctgtagg tgtctattgc cagatctatc aggccttgct catagtatac 2340
acaagccagg ttgccgtgca ccactgcgtg atttggactc aaacttaggg cacgaagata 2400
agctgccaca gctctgtcaa aaatgcgtgc ctctttcaag acatttccta aattgatata 2460
agcatccaga aagtttgggt caagggtgac agccttttca aagtgatgaa ttgcaagcca 2520
aatttcccct tgtgcattga aaacacagcc aagattactc caagctactg caaagttcgg 2580
ttgcgtctca attgctttca aataacatgc cttggcttct tccaagcgac ccagggcttt 2640
gagcaggttc cccaggtcac tgcgaacaca gtacaaatca ggattgtact gaagagcaga 2700
gacgtaagct tgtactgccc cttccatgtc acccgctgct accaaggcgg ctgccaggtt 2760
aatataacca tcgatgaaat caggtttgag acgcaatgca tgtcgataat gctcaattgc 2820
ctcctgcaac tgccctcttt ccttgtacac attccccaaa ttcgaataag cttctgccag 2880
aagggggttc tgtttaattg ccagagtgct aaagtgagca gatctgtcca gccttcgaca 2940
ctggaagtgt atagatgaaa gtaataaaag cacaccagta ttgtctggct cttgtctcca 3000
gagctgcatg cagtgtctct cagctgcctc aaaatctcct gcctgatatt ctcgatgtgc 3060
caactcagct aacccttgga aggaaagcat acgtttcgtt ggttctgtgc tgtcggccac 3120
gttgcccacg gaagacgcca t 3141
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<223> synthetic
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gcctcttcaa tgtttccctg t 21
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<223> synthetic
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<223> synthetic
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<220>
<223> Synthesized
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ttcctcctag agcctcccac 20
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<220>
<223> Synthesized
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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tttgcttcca gactttgcca 20
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<220>
<223> Synthesized
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<220>
<223> Synthesized
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tagatcagtt cccagcttca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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cagctatgtc ttcatattct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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tgtctgtttt tagcaataag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthsized
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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atccctgtgg tgtgcccatt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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agacatcagc cagctggcct 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthesized
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 119
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthesized
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthesized
<400> 128
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthesized
<400> 129
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 130
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 131
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 132
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 133
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 134
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 135
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<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 136
caagggtgac agccttttca 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 137
aagtgatgaa ttgcaagcca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 140
caagctactg caaagttcgg 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 141
ttgcgtctca attgctttca 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 142
aataacatgc cttggcttct 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 143
tccaagcgac ccagggcttt 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 144
gagcaggttc cccaggtcac 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 145
tgcgaacaca gtacaaatca 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 146
ggattgtact gaagagcaga 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 147
gacgtaagct tgtactgccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 148
cttccatgtc acccgctgct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthesized
<400> 149
accaaggcgg ctgccaggtt 20
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<211> 20
<212> DNA
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<223> Synthesized
<400> 150
aatataacca tcgatgaaat 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthesized
<400> 151
caggtttgag acgcaatgca 20
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<211> 20
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tgtcgataat gctcaattgc 20
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ctcctgcaac tgccctcttt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 154
ccttgtacac attccccaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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ttcgaataag cttctgccag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 156
aagggggttc tgtttaattg 20
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 157
ccagagtgct aaagtgagca 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
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gatctgtcca gccttcgaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthesized
<400> 159
ctggaagtgt atagatgaaa 20
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 160
gtaataaaag cacaccagta 20
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 161
ttgtctggct cttgtctcca 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 162
gagctgcatg cagtgtctct 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 163
cagctgcctc aaaatctcct 20
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 164
gcctgatatt ctcgatgtgc 20
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 165
caactcagct aacccttgga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aggaaagcat acgtttcgtt 20
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 167
ggttctgtgc tgtcggccac 20
<210> 168
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 168
gttgcccacg gaagacgcca t 21
<210> 169
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 169
gcauguuauu ugaaagcaa 19
<210> 170
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 170
gcacaauccu gauaaauuu 19
<210> 171
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 171
gcccuaaguu ugaguccaa 19
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 172
gccctaagtt tgagtccaaa t 21
<210> 173
<211> 49836
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 173
attgtccttt cacatctggt tgctcataaa agcaaaacct accattcgag tgttcaattc 60
tagtgtgaag tgttttacca tgggagcaaa agcttgagct tgaaagataa cagtcattat 120
ggctatctgg gacaagaaaa aaaccatcta gcacatttgc tcacttttct tctgcctgtc 180
agtgtatgat tgcccccagc accattatta ttttgcaggt tttttcagct cctctgtaag 240
gcttgtcaca accatagtgt cactactttg gacagaatca tcaactcttg caaccccagg 300
aggacagtca ggattagaat tcaaatgaca gtgggtactt tcagacacac acatagacaa 360
ctgcacctgt gagtccacag aagttccttt agattctgta ttggaggtag taatgatgaa 420
agtgtcttca ggaatgtctt catggcttgc tcttgggctc tgcattgtaa ctccttacag 480
gtaccaatga acaagccatt cagagatgga tccacaaaga tctctggagc aacgaccagg 540
tcctgctcta cccgattctc agctttgggg atagaattcc cagaaacatc tgtgtccgga 600
gttggttcct tccagtgggt tcttggtctt gctgacttca agaatgaagc cgtggacctt 660
cgcggtgagt gttacagctc tttaaaggta gcacagaccc aaagagtgag cggcagcaag 720
atttattgtg aagagcaaaa gaacaaagct tccatagcgt gaaagggtac ccaagcaggt 780
tgccagtggg gctgggggcg gccagcattt attcctttat ttgtccccgc ccacatcctg 840
ctgattggtc cattttacag agtgctgatt ggtccatttt acagagtgct ctttggtgtt 900
tttacaattc tttagctaga cacagagcgc taattggtgc attttacaga gtgctgattg 960
gtgcatttac aatcctttag ctagaaacag agcgctgatt ggtgcgtttt gtttttgttt 1020
ttttttttga gacagagtct cgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg tgcaatctca 1080
gctcactgca acctccgcct cctgggttca tgccattctc atgcctcagc ctcccaagta 1140
gctgggacta caggtgcccg ccaccacgcc tgactaattt tttgtatttt tagtagagac 1200
ggggtttcac catgttagcc aggatggtct ccatctcctg acctcatgat ctgcctgctt 1260
cagcctccca aagtgctggg attacaggtg tgagccactg cacctggctg gtgcattttt 1320
acagagtgct gattggtgca tttacaatcc tttagctaaa cacagagtgc tgattggtgc 1380
gttttacaat cttcttgtaa gacacaaaag ttctccaagt ccccacccaa cccagaagtc 1440
cagctggctt caccactcac ttccatggga gaactgtcca gacaatagca tgacaccctt 1500
gcaaaggata aagcctctca tctaaaggca tagaatactg aatatagtct tgaggcataa 1560
gtccaataag tacaggcaca tgttccttga agtgaagatg caagtctcca ttctgaaatt 1620
ttgaactctt tactttgttc tttgtatgca gcttcaggct gaagatagtg aaaatccgtg 1680
ccagacttgg attggaagaa tgaaccaagg ctttgagtct cttcgtctca tctccgtttt 1740
gatacgtgtc tccttagttt gtaagccaag gagaggacta cagtgaggat tgtggaggga 1800
agtggacctt attggtcttt gagctctcac atctttaaag actgttggtg ctgagagaaa 1860
aagtatcctc atctggcaga actcccatag ggtgtgctcc ccttgctgtt ctgcttttgt 1920
tttgcagaaa gctgcctttt tcaatgtact cattaggctt tcattgtttt ttcctttttt 1980
acctttttca tctttcactg ttgatatcac aggtggccat atctttacca gtgcagctac 2040
caaataagaa atcatctttt ccacattcac tagttagtga tggttgttgt actaccatga 2100
aatcagtttc ttctttactt ttattcaggt tacaagattt ctggaaggtt ttaagatcaa 2160
ttttaattag tctttgtgac tggttacttc atccagggga ccaatttctc tctggaatat 2220
tagtcccgca cccctggaga gcctgtgcgg ctgcatctcc ctccggaggt ggttctggag 2280
ttggttcctt ttggtgggtt cctggtctcg ctgacttcaa gaatgaagcc acggaccttc 2340
acggtgagtg ttacagctct taaaggtggc acggactcaa agagtgagca gcagcaagat 2400
tcattgtgaa gacggaaaga acacagcttc cacggtgtgg aaagagaccc gagtgggttg 2460
ctactactgg cctggtgggt gggtgggtgg gtgggtgcgg aatgtggcca gcttttattc 2520
ccttatttgt ccccacccat gtcctgctga ttggtccatt ttacagagtg ctgattggtc 2580
cattttacaa ggtgctaatt ggtccatttt acagagcgct gattggtcca ttttacagac 2640
tgctgattgg tccattttac aaacctctag ctagccacag agcactgatt ggtgtgtttt 2700
tacagagcac tgattggcgc attttacaaa cctctagcta gccacagagc gctgattggt 2760
gcgttttaca atcctagcta cagagtgctg attggtgcat tttacaatcc tcttgtaaga 2820
cagaaaagtt ctttaagtcc ccacccaacc caggaagtcc agctggcttc tcctctcaca 2880
tctatgtatt tctttggctt catttaacct ttggagccat tttttttcag cagcagtgca 2940
acagcagcca ccagcccggg tctcatccag cgctggtgct actgctgtga aatgtgtgtt 3000
gttctgagca gctgtatttg tgatactttg ttacacagca gcaaaaaaag taatgcaaca 3060
tcagtggtgt tactgggtga caaagtttgg gattggggtt gaagacccag ctgatttaat 3120
tataattggt tctaaattta aaattgcaca taaaaaaaac ccagaaatca atgtgaacaa 3180
caataaaaaa catacaaaag cacttccttc aatgtctaga tcaaggcttc tttctcaccc 3240
cctccaacct tacctgtttc ctccctagat attcatagag agtaatatat tttatcatct 3300
aaatagtctt ctgtattgct ctctagtagc tttttgtgtc tacctaacta ggcttcagat 3360
tccttgaggg cgaggatttc tgttcatttt tgtgcccccc acagtgcctt gcacatagag 3420
actctagtaa atgttactta ttggctgaag aattaggaac atgacctgca tttaacaaca 3480
aaaagagttt ttgttaatta gctagcaccc gctcatcagc aaggcctaaa catctgccag 3540
tggaatctga gaagtctctt ctaaaagttg aaaagctgag tttactcatt acagataggg 3600
aacttgtagt aggtgtgtgt gtgcgggggg gaggttttac cagttaaatc aaattacaag 3660
aggttggtgc tcaattttca ggagagtttg tgtagtgatt tttgtctttt tcactgcatg 3720
atgtgactct tgattatggg atggaagaaa ttagcattat gaattttctc tgtgccattt 3780
ccataattaa ttgtttgttg actgttttga agaaatttaa gcagaatttg aggacttagt 3840
tttaaaaaat gtagtgaagg ggctaggtag caaaaacttt ttgaagaaat tcattgacct 3900
gctttcttag atcaaggact ttttgaaata aaaaggctct cagagatcca acttgtagcc 3960
tccagtggct tgtaatactt tcttgctgat gtggcaagct accttaagtc gtttctagaa 4020
caagaggtga agtataaata ccaatgtgac aaaatgtctg aacagtagac ttgaaactgc 4080
aggaagatcg taagaaccga tttgttcaag gaagtagagg caattcatga ctcaatctag 4140
acgtgtggtt taggcagatg gcaagtgaat tcatttatca ttgttgatct gctttgagct 4200
cagtggaatc gccgactgtg acaatgtgca gagctagctg gtggaaatga agtcacaact 4260
cgaggagagt catggatttt gacgaacgtg aatcaccttt aacattttta tggctgcctt 4320
cggagtgcaa acgcccagca tgtccctgag ttattaaaca tttgccctat caccgtgggc 4380
aggagtattc tgaataccaa aacgattttg aaatttcagg ctatacggcc aacattgaag 4440
gtgtctgcat tcaactggcc ctgtgaaagc ttcagtcttt ttcatcgaag tgctgaaatc 4500
gatggccgag tcacaatgaa gacgggctca aatcggaacc ctctcgctcc tcgttttgag 4560
cagctgtctt tgagaggcaa tcttctgaat tgactggctc agaattgatc cgtgagagtc 4620
gtaaccatcc gtttttgtac gaatacagtt gataaacttt tttagacgcc tttggcattt 4680
atgtttaaaa cgacaccacc tgctaagtaa caaacactct tcttaatcgc ggtggcaaaa 4740
acgtatccgt cccgtgtgtg tttgttttta cccttccgct acactcttaa gaaacttggc 4800
cgcttccgcc ccagagagtg ccctaaccac gagtcgggtt gacagggctg ctcgcatgcg 4860
cggtctccac cgtggtgttt gtcgcaatgg gcgctgcgcg gaggactaca tggaatctcg 4920
actttgcagc ttgaagtcat tttgttggcg gcgctggtta ccggctacct ccgcgcgggc 4980
acttgattgt aacagaaagt agttccggcc catgttgttt cggccgagga gccgtcgccg 5040
ccatttcaag accgtactag gtagatggtc aattagagtt cccagggttt gaagcctgta 5100
actgctgccg ccgctcaagc cctccagagc attgctacgg ctgctgccct tgtactacta 5160
cctccaaata cgttcttgct ggtagtggcg gcagcaggac caattacctc ttttttgctc 5220
tccctcgaga agctccagat ggcgtcttcc gtgggcaacg tggccgacag cacaggtacc 5280
ggtgtcccgt tctaccttgg cagatgcccc cttggggtct cgcgccgtcc tctaccttgt 5340
atcactcctt ccctcccttc cctcgaacca tccccattac atcagtgaca ttgctaagct 5400
tttcgtggtc tactggcatc tgatcacatc gggttttccg ctgttgtccg cttcccgaac 5460
atttcctcct cctcccttgc ttgctttttg ctgcctttct tgctttgttt ttatttcgta 5520
aatgttctag cattccactc tctccaggcg cttttatcac acgtgcgcgc ttagaatgtc 5580
gtggaatgga ctgcattgga atccctgccc tttcactcct ttgcagcggt tttctcccct 5640
aattccagct catcgcctct cctttttccc ctccatctcc tccttcatct ccccccccag 5700
tcttttcccc ttagccagat ttggtccttc tctgccaatc tagggcgggg gtgccgttcc 5760
gatgtaatca tatcctcact ttgcatcacc cgaggacgat caaaagctcg tcgatggtgc 5820
cacaagtcac ctcgagaaga ggggacattg agcagcaccc tgctaggcag tgcctttctg 5880
gtgttctttc ggttgagcgg tcccggttta gattggaaat ttccaggggt ttcctttgcc 5940
atcgcccaat tccaccgctg ccctcagcct ggatttccca ccctgtccgc ggggaaccac 6000
acccttccct tcgcgaggtt gccagccctg ttcacttcct atccttgggg gagaaaccac 6060
cccgatgctg ctgctttggc gttgaccacc ctgcccgccc aattctcgct ttgtgttact 6120
ttctcgatgt attcctccgc cgccgcctct gggtctgcca tccccattct tcagcccagt 6180
atctctttat tcacagggtg taatattctt ttaagtttcc atccctgctt gaagagtttg 6240
taaagcaact ggagtgtagc tgcacaagta caaggcggtt gcccttttag acacttcagt 6300
cgcgagcatt tggtactgaa aatacgaaaa caaccaaatt gtaggagtgt ccttcagctg 6360
cctttccata ttgaggcgat ttgggcggaa gggggtgggg aattgggctg cgcttctgag 6420
gtttcccgcg aggttatttt ttggttgttt ctcagttgag atgtgtggag ggttttagct 6480
actgttcctg gaagttgtgc tgtaagtagt aggtgaatcg tcaatagtgt cttatccgta 6540
attgtaggga gtgggattaa taattagtcc gtgctcctct ccccacgtct ccaccgtgat 6600
tttcaaaggt ttaagattct gtactggatt ctgtactagc ttgccctttt taatgtgtta 6660
tttatttgag aaagctgtcg tttcaagtgt taaaatagca gataagcggc attgaaaagt 6720
gacaaagtaa tgtgtgaaaa caaggagcta ggaagttcta gagacttagc taaaatgtaa 6780
ttttagtttc tattaaagat ataacctctc ccagatgtgg atgcaagtct caatgctctt 6840
tgtgttggtg gtcagctgtg cattctgtca ggaaatttac tttgctttcc tcagtatccg 6900
gaacgctcat cagctctgat gattggggag ctgggctcaa atttgaacta gtcaccttaa 6960
ccttggtaga attaaataat ttgtccatgg tttcccattt caaccagcta gtgaagtgct 7020
acggtcgaat tcccagttta agtatttaca gttgtgacaa gcagtttttt tttttttttt 7080
ttccctctct gggctttagc tatatccttt aaagatcttt atgtatctgg attaagtcac 7140
ttgcagcgaa gtgcttttat ttattcatta tgttgcgctt tatcaaatat attttagcgt 7200
ccatcctccc tccctcccaa cgttttgacc attgcagttg caggtaactg cctggcttat 7260
ataggcttgt ttgcaatgtc ttaatccttt agtcaatacc agagctgttt ggaaaatgtt 7320
agtgctaaac caacgtgggt gggatttagc caatttagtc tccttttgag tttgggatgg 7380
tagaggagca gtgtaatctt gggtctttat ttaaaatgtt tgatgacccc tttaactatt 7440
ttggctgttg tcaaatgaca aacatcttgt ttatcagctg ttttaaaaat agcactttga 7500
ctttttggtt tttcccttag gctcgtttct acttgtcctt ttaaagaatt aaattctgaa 7560
atatacaaaa attgatataa tttaaagaat taacacatct ggtgtcctca ctgaggttaa 7620
gattgataga ttgttaccag tactccacct caacaaatcc aacctgaaat atggcacaaa 7680
atattacgtt tcccaatatg ttattctgat attattaagt ctttgtgacc ttgcaaatca 7740
cacgtttaat attttgtttc tgtatgttaa ctaaggtata aggaataatg ttcagtgaat 7800
ccttagatgc tacctatgat ttataattta aaagtacaaa gtatttttgg tcataaaatg 7860
taatctcata tggaagtaaa tattcctttc tagtttggga aagaaagtat taatgggtga 7920
attctaaaaa tgccaattct gcacttgatg ttaacttgaa gatatacata acgtgcagaa 7980
cactctagtg ctttacatag tttcaagcat ttccattttt aagttaaata taccatattt 8040
ttacattttt ttggtttaca tttctaactt tttgttttcc cccctccttc cctcaaatgt 8100
tttgatgatt ctccagaacc aacgaaacgt atgctttcct tccaagggtt agctgagttg 8160
gcacatcgag aatatcaggc aggagatttt gaggcagctg agagacactg catgcagctc 8220
tggagacaag agccagacaa tactggtgtg cttttattac tttcatctat acacttccag 8280
tgtcgaaggc tggacaggta ggagatgttg gggtacctgc tcgtgattgc tgcctctggg 8340
tgctgagctt gaaaaatgat acttaaatat ttgaacttga aatttttcca gtaccgggtt 8400
tcaactgagc cgccaacgca catctgctct cttgcccact tgtgacatgc ccagctgcca 8460
gtttttctcc ttccttttgt ggtggtggtt atattatcag tatgactagg gaccttttct 8520
agatttttct atctgggtct gctgctttct agactctgtt caggtaataa attattatca 8580
atgtatatct gagcatccag tctccctttc atgagacctg tcagtttgag ggactgaaat 8640
gctcagaaat gatggttatg tatgctgtgg caggagatgc atacctggag tttcattaag 8700
ttgttatggt gtgttgcttt tagttaatca gttgaattaa tcaaaaggga agaatttgtg 8760
ttcctgtcct tttaataatt gttattctgg catatttaga cacttaaaga tgtgcatcat 8820
taaatcttaa atggaaaatg agactcgtgc acatagcttt ccatttttta tcttaatgat 8880
catgatttcc aatgtggtgg gttttttttt tttttttttt ttttgagacg gagtttcgct 8940
cttgttgcct aggctggagt gcagcggcgc catctcggct cactgcaact ctgcctcctg 9000
ggttcaagcg attcttctgc ctcagcctcc tgagtagctg ggattacagg catgtgccac 9060
cacgcccagc taatttttgt atttttagta gaaacggggt ttctccatgt tggtcaggct 9120
ggtctcaaac tcccgacctc aggtgatctg ctcgcattgg cttcccaaag tgctgggatt 9180
acagacatca gccaccgcgc ccggccaatg tggtagtttt gtaacaagac tctagttaga 9240
atttttttct tttttttgag gtggagtttt gctcttgtca cccaggctgg agtgcagtgg 9300
cgcaatctca gctcactgca acctccgcct cccgggttca agcgattctc ctgcctcagc 9360
ctcctgagta gttgagatta caggcgcctg ccatcatgcg tggctaaatt tttgtatttt 9420
tagtggagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct cgaacacctg acctcaggtg 9480
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tgaaaatctt tgatttccca aatttttctt gctatgcact agttaaaaga taaggtatta 9660
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ttctgtaacg tgcataccca tgcattaaca cttgtcgcct tttccagatc tgctcacttt 9780
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ccaactcctg gtctaaactg atagcatatg ctgtcatgta catccaccca tttttaacat 37860
tcttgtagta ttgtagagtt ataaccaaga aggagtcgat ctgtacatat gattatctct 37920
cagttcatca gacaagtttg cataagtggg atatcggata gctataactg gctcttaatc 37980
catagaacta aaataaaatg gcatgtttta cctttaggta atctggagat aattccttgg 38040
ttaatttttt ccccgatatc tgttttgttt tatgtttaga ggagagggga ggatagaaga 38100
gaagaggaag cagatgagta caggtctact gtccttaatc cttacttcct gatgttcaca 38160
aaaactctga aaatcaaaag ctttttcata agtgtgtggc aaatttgttt ggcagcaaaa 38220
ctacctgaac taacattagg gtatatatta gtccgttttc atgctgctat aaaggactgc 38280
ccgagactgg gtaatttata aaggaaagag gtttaattga ctcacagttc cgcgtggcta 38340
tggaggcctc aggaaactta gagttacggc ggaaaaggga gcaaacatgt ccttcttcgc 38400
gtgatggcag gaagaagggc tgagccaaag cggggaaagc cccttataaa gccatccgat 38460
cttgtgagaa ctcactctct atcacaagaa cagcagcatt ggaaataact gtccatgatt 38520
caattaccta ccactgggtc cctcccatga cacatggggc ttatgggaac tgcagttcaa 38580
gaagagagat ttgggtgggg gacacagtca aactatgtca gggtatttgt agtcttttat 38640
ttatttcatt tagtatgact gttcctgcat ctcaatgcag aggtactaat atgtttatag 38700
gaagttgctg ctgagggtgt taatgtgata catacacaca cagtactact tttttaaaat 38760
ctgaaatatt ctgaatttgg aaattcatct gttctcatag ctttcagaga aagggatttt 38820
gaacttacat ggtacataga gtagatgtaa atctaaatca ggagttggca aactatgacc 38880
tgtgggtcaa atccagccca ctgcttgttt ttgtaaataa aacttaatgg acacatagct 38940
atgcctactt gtttacacat tgtctgtggc tgctttcaag ctacagcaga agaactgagc 39000
agctatgaca gtccatgtgg ccacagaacc aaaaatattt gctatctggc cctttacaga 39060
aaagaccgat ttatattagg caaagaaagt taggcaagtg tgaggtaact ttcttggttg 39120
tatcatagtg ggggatttga aatttggaat gcaaaattcc tctctcagca aaacccactg 39180
cctgtgtcaa ttcccgcagg aggtagctgc ctcagatttt gcctgtcttt ctttgaactc 39240
actttgagga cagctaagca gaagagggat aattcaattg atctcattca tctctgtgaa 39300
ggaaagactt aagtccacag caggcttcta tctggatgga aagaatagag tgtggtagaa 39360
ttattagaga cctctgggag tctttgttga aaaaggcaga tctgctatta ataattattc 39420
ttattttccc tattttagat tctgaagcgt gttcccaata gtgtactctg gctgttgcgt 39480
tttccagcag taggagaacc taatattcaa cagtatgcac aaaacatggg cctgccccag 39540
aaccgtatca ttttttcacc tgttgctcct aaagaggaac acgtcaggag aggccagctg 39600
gctgatgtct gcttggacac tccactctgt aatgggcaca ccacagggat ggatgtcctc 39660
tgggcaggga cccccatggt gactatgcca ggtaagttgc tgataaatca ctggaatctt 39720
ccttgttcct ttgaaaatct ccgtttgggg gagaaacttc caggtgaaat tatatgtact 39780
aggagcaaca ttaaaggaaa ggtgatagaa agtgagactt gttctcactt cattctcttc 39840
atctgcgttg tgtggaggct taacataaat aacattaact ctgtgctgtt ttacgttctc 39900
agatgtgcag ttgttatctt ttgtattaca ggagagactc ttgcttctcg agttgcagca 39960
tcccagctca cttgcttagg ttgtcttgag cttattgcta aaaacagaca agaatatgaa 40020
gacatagctg tgaagctggg aactgatcta gaatagtaag taaacttttc cttgaacaaa 40080
ttatttggta aagtagagag aatatagctg ttataaaatg aaaccataaa ataagtgtaa 40140
tataaaatag gtgaactagt tgtatgccct ctggatggga gaagtacttc taaactctta 40200
gaaatgaagt gatcaatagg ttttactatg taaaaagtaa atggctgaat aaaaaatatt 40260
caagaaaatt aaaaagcaaa cgaggggaaa aaatcttttg tctcagataa caaagtatta 40320
attacctggc aatgtaaaga ctgcagaaca tttaaatttt ataatcccct aataggaaag 40380
taaaaatgga aatgaccaga cacctcactg aagtggaaat acaaaaggtt aacaagaaag 40440
tgtttcaggc tctgtagtag aaatgccaat taaaatggaa ttgaggctgg gtgtggtggc 40500
ttatgcctgt aatctcagca ctttgggagg cttaggcggg cggatcactt gagatcagga 40560
gttcgagacc agcctggcca acatggtgaa accctgtttc tactaaaaat acaaaaatta 40620
gttgggtgtg gtggcatgtg cctgtagtcc cagctactca ggaggctgag gcaggagaat 40680
cgcttgaacc cgggaggcag aggttgcagt gagccgagat cgcaccattg cactccagcc 40740
tgggtgacat agtgagactc tatctcaaaa acaaaaacaa aaacaaaaac aaacaaacaa 40800
aaaaaaaacc aaacaaacaa aaaaaaccaa aaaaagaacc tgaggtatat ccattatttg 40860
cctatacaat aaaaagattt tttgtatcag tgaggtagca ttgaggacta gcctttttat 40920
gcattggtga ataaattggt acagcccttc ctcagagttt ttagagcctt aaaagttaga 40980
tctttgggcc aggtgcggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga gggcgaggtg 41040
ggcggatcac gaggtcagga gatggagacc atcctggcta acacggtgaa acccccctct 41100
actaaaaata caaaaaatta gccaggcatg gtggcgggcg tctgtagtcc cagctacttg 41160
ggaggctgag gcaggagaat ggcatgagcc caggagacgg agcttgcagt gagctgagat 41220
tgcgtcactg cactccagcc tgggcaacag agcgagactc tgtctcaaaa gaaaaagtta 41280
gatctttgac cctaatactg tcacttcttc actacggtcg gtgtaagaaa taaacaaagc 41340
ataacttaaa tgcctgaaaa tgagtaggaa ttagaggggt gatgcttaga tgaggaggat 41400
ttatccatac aataaactag tatttctttc attcttttat tttttttgag ataggatttt 41460
actctgttgc ctaggttgga atgcagtggg gtgatcttgg ctcactgcag cctccacgtc 41520
ctgggctcag gtgatcctcc cacctcagcc acctgagtag cagggaccat aggactatag 41580
gtacatgcca ccatgtccca tgcctggcta atttttaaat ttttttgtag agattaagtt 41640
tcaatatgtt gcccaggctg gatatttctt ttttcttttc cttttttttt tctggacgga 41700
gtctcgctct gtcgcccagg ctggagtgca gtggcgcgat ctcggctcac tgcaacctcc 41760
acctcccggg ttcaagcaat tctcctgctt cagcctcccg agtagctggg actacaggtg 41820
cacgccacca cgcccggcta atttttgtat ttttagtaga gacggggttt caccatgttg 41880
gccaggctgg tcttgaactc ctgacctcgt gatccaccca ccttggcctc ccaaagtgct 41940
gcgattacag gagtgagcca ctgtgcctgg cgtttttttt tttttttttt ttttttttgg 42000
agacagcctc gcactgttgc ccgggctgaa gtgcaatggc acgatctcgg ctcactgcaa 42060
cctctgcctc ccgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcctgagtag ctgggattac 42120
aggcatccac caccacatcc agctaatttt tgtattttta gtggaggctg gatttcacta 42180
tgctggccag gctggtctcg aactcctgac ctcgtgatcc acccaccttg gcctcccaaa 42240
gtgctgggat tacaggcata agccaccgtg cctgacgggt atttcttaaa tgaggttttt 42300
ctttcggtat aatgggtgat gttttttctt tgtgtttttc tgagaagtag catattacat 42360
aataattaaa gaaacatact ttttgagtca gactacctga gtgaacccaa gctctcctac 42420
ttatgagttt tgagactttg ggcaaataaa tctctgtgtt gtgccttggt ttcttcttct 42480
gcaaaatgga gcataatgct agtgcctact ttgcagagat gatgtgagga ttaaaaaagg 42540
cattccatgt aaagtactta gaatagttgt tggtatctgg taaacattca gcagatgtta 42600
gctacttatt attttcagaa tttcctccat agaacatcac atacgtctaa gaaaagtgag 42660
aaatttgaac ccaggcatta aaaaaaaaat aagattcatg tccattagcc cagagataac 42720
tatagtaaaa aatgtagtgc gttttatttt cagacagggt ctcactctgt taactcaggc 42780
tggagtgcag tggcatgatc acggctcact gcaacctctg cctcctggga tcgagtgatc 42840
ctcccacctt agccttccag tagctgggac tacaggcaca tgccaccatg cctggctttt 42900
tttttttttt aatttaatat tttgtggaga cagggtctca ccaatattgc ccaggctggt 42960
aactcctggg cccaagcagt ccacccacct cggcctccca aagtggcggg attacaggcg 43020
cgtgagacac tgcacccagc ctgtggtgca ttttaaaatt tttattagac tctttggtac 43080
ttagtttggt tcatacaatg cttttcctca acatttttgt tctcaaaatt tttaatttta 43140
taataaacac atctatacct actgcttaga atctaccatt agcattttac tattcttgct 43200
ttattacata tctattcatc catttattcc ctttattcat ctgccaatcc atcttattgg 43260
acacattttg aaataaattg cagacatcag tacacttctc cttaaatact taagattggc 43320
tgtcattaac tggagttcag tacacatata tttttttgag gtagggtctc cctctgtttc 43380
ccaggctgga gtacagtgat acgatctccg ctcactgcaa cttccgcctc ccgggctcaa 43440
gcagtcttcc cctcaaactc ctgaatagct ggaaatacaa gcatgagcca ccacacctag 43500
ctaatttttg tatttttagt agaggcaggg ttttggcagg ttgcccaggc tggtctcaaa 43560
ctcctgacct caagtgatcc acctgccttg gcctcctgaa gtgttgggat tacaggcgtg 43620
agccactgcg cctggccatt tttttctttt gaggcggaag ttatatacag tgaaatacac 43680
aaatattcag tgagttttga gaaataaccc tttttttttt cgttttgaaa cggagtcttg 43740
ctctgtcgcc caagttggag tgcagtggtg tgatcttggc tcactgcagc ctctgcctcc 43800
tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cttgagtagc tgggactaca ggcacgtacc 43860
accacacccg gctaattttt catattttta gtagagatgg ggtttcaccg tgttagccag 43920
gatggtcttg atctcctgac cttgtgatcc acctgcctcg gcctcccaaa gtgctgggat 43980
tacaggtgtg agccacagtg cccaaccgag aaataccttt gtaacccaaa ttcctatgaa 44040
gacaaaaaac attatcactc cagagagttt cttcatgctc cttatcagtc agtctttttc 44100
accaaccccc agagacaacc actgttctgg agggtttttt tcccttccat aaattagttt 44160
tgcttttcta gaattttatc caaatggaac tatgtcaata tgcactctaa aggcttcttt 44220
catcaagttt atttcttttg ctgagtagta tttcactgta tgaatgcact acagtttatt 44280
ttcctattgg catagaattt taaaaaaata gagtgcacag gtctttctct ttggagggta 44340
gcattaatat ggacatggtt gtattgagac caacagatat gcacaaccat tttactgctt 44400
ctgtcacaac aaacattaaa acaaagttgg gcgtggtggc gcatgcctat aatcccggcg 44460
ctttaagagg ctgagggagg aggattgctt gagcccagga gttcgagacc agcctggaca 44520
acatggcgag accccatctc tacaaaaaat acaaaaatag ctgagtgtgg tgatgcgtgc 44580
ctgtagtctc agcttcccgg gaggctgggg caggaggatt gcttgagcta aggaggttca 44640
gtctgcagtg agccatcatc gttccattgc actccagcct gggcaacaga gtgagactct 44700
atttcaaaaa ttaaaagaaa ataaataaaa attattgctt ttaaaaatgc acagaaatgt 44760
tctggcttct ggttctaaag tatttatccc ttcatctaag aataatctca tgaaaaatat 44820
attcaaaagg gaagtagaaa tcttttcccc tgtgtttcct gaagaatcaa ttacttcttt 44880
tttatttttc tgaacagaac catactcttg gtgatattag caatttttaa aaatctgaac 44940
tcagttcagg tacaagtgga aaattacgag agtagactta ttgtatttct tttccccttg 45000
agtggttttc tgtttcatca aaatgaccat aaatcgaata cttcatctta tgtttatgct 45060
ttaacttttg taaatgatgc ttcaatgaat atctttgcat ggtcctgtat gtttttgcat 45120
ctgattattt ctttttaata gattttaaag tgttactgtt aggccagagg gttatgaaca 45180
tttaaggtta atacatactt gctaaattgc ttaccaaaaa ggtaagcaac agtacatagg 45240
aatagtcatg tgccgttgtc aattcttgtt attttaaagg tagaaacaag acgaaatgga 45300
gaacgcgtgg tatcccttgg atatacttgt ttaggaaaga actaagtttt ttcagagtat 45360
atggagttga gctcatttca gtgttagcat tatgcaagat gtgacccttc cctttttagc 45420
acgaagccaa tcaagaaatg agatagcgta gagtttggtc atgcattttt tgccacaaat 45480
gcgactaggt atttataggg tgtgtttctg agtttctgct ctgatttgta aactgggttc 45540
ttgtttttta ttacccagcc tgaagaaagt tcgtggcaaa gtctggaagc aaagaatatc 45600
tagccctctg ttcaacacca aacaatacac aatggaacta gagcggctct atctacagat 45660
gtgggagcat tatgcagctg gcaacaaacc tgaccacatg attaagcctg ttgaagtcac 45720
tgagtcagca taaataaaga ctgcacagga gaattacccc tatacctgag cctcaacctt 45780
ctgggggaaa gggaactaga taacatactt cttacttgtc tgtacagtac cttgttgcag 45840
atgggtgata tataatggta atagaatagc acagccagac ttgcttcctg catggtaggg 45900
agagacacaa aagatgggaa actgcttttc cacaaggaat ctccgtagaa ttttgcggcg 45960
accagatggt gcataggtct ggaaggtctg atctcccttg gtcttccatg ggatggttag 46020
tgtggagggg agatatagat tgtccggccg ctttgtgatt ccatggattg attcagtctt 46080
ctggattttt ttttctttat attttgggta ctggagcttt taaaaatgtt tggtttcagg 46140
tatttttatt catgtgaagt gtatatgatt ctcttgagat aaggttttaa gctaaaatgt 46200
tactccctgt tttagtttct gaactctgac agattgacag ggactttgct ggtgtagtct 46260
ttttataggt tttataaacc acttgagcct atatcagtcg ttttagtgtc tgacctaata 46320
tttggagcta tcagtgcttt gttgatttag atgatgactc aagatttttt ctggtccatt 46380
tcccatttcc ttttcttccc tgacccccat accctcaccc ttaaaattct cctgtaactc 46440
aactaacaaa atcaagcctg attcaaaaca tcctagggtg ttttaaacac accatctggt 46500
gccaaatgaa gatttttagg agtgattact aattatcaag ggcacagttg tggtactgtc 46560
attgataata atatagtttt tttttttttc ctaattttga cctgtttcac cagtgtttta 46620
cccttgactg ccccttctat gctgcttcca aaagtgatag tgtgtgtaag atttttacct 46680
tcctttctaa agtttttttt tttttttttt aagtgagtcc tgttcttcct atttctttca 46740
gcagaaatga aatcccaggt aagtataagt attcaagtat ttgatcagta agtcacagtt 46800
atctccagtg cattaaataa ccttcatcaa gaaataggtt ataggtaaaa tctctgaagg 46860
atcatctatg tattcaagta attatttttt agataataac tgtcttctgg acttggtctt 46920
gaagtctgta cagattcagc ctcagtagta gcgaactgca ctgctgtttg gtttggagta 46980
caaattagac ttatagtcct cctggaactt gagttattaa aatcatagga ataaaattat 47040
gggatctcaa caaagggtcg agggtttgag gcttaaacaa gccaacatat gaatatatgt 47100
tttgtctcgc tatactgcac ttacgctatc cagttgcagg taattttttg tctgctagta 47160
gtgttctaga ttatgtcttt ccaaagcgct gaggctgtgc acctattctg tagttgcagc 47220
tgatgcctga atgtatccta gctgacaaat tattgattaa taagaacttg aatttctgga 47280
agattcttac tgttaaccaa attttgagca aggagtctca aaggtaattc tgaaccagaa 47340
ttacatgtta atgaacagtg taccttttaa cagtgtaaat cacggaatat ccgtgaaggg 47400
atttcttaat ttatttttta ccggttgatt gaaatatcag ttaaaggttg ccagcatggt 47460
tgcagataaa ctgatgtttg aaattcgctg aaatacttaa tgtggaatag gataatatac 47520
ttccaatgcc ctcaaggctg tgaccttaca gccattttac atagcacatc attcctccta 47580
tagggatgaa ctttttcctg gcacgaaaag tagccgctct ggttgaagct ttgcttattg 47640
taacaggctt ttatttccag gtaatatgtc ttggaagact taattctgat tagagatata 47700
gatattactg gaaactaatt gttttttttc tattgtactc tgctttatca aagaagtaaa 47760
acatttaaat cgtactacag aaattaagat gttgtcttgc gatccttaat aaatgaatga 47820
tttcccttta atacggctga tgtattttgt atcctgttat attgagtgtt ggactgaaga 47880
atagtgtcat ccaatgatga aacctatatt taaacacctc caaacagcat gaaaggacca 47940
aatttcccta ctgtagctat gatattagga attgttttct cagccaggtc tggtagaggg 48000
tggggttagt ttatgatcca ttaagaaggc aaagtggcct tgtgtggtgg ctcacgcctg 48060
taaccccagc actttgggag gcggaggcag gtggatcact tgaggtcagg agttcaagac 48120
cagcctggct aacatggtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaaaa ctagccggga 48180
gtggtggcac acgcttgtaa tcccaactac atgcgaggct gagacaggag aatcgcttga 48240
acccgggagg cagaggttgc agtgagctga gatcgtgcca ttgcattcca gcctggacaa 48300
cagagtgaga tgtcatctca aaaaaaaaaa aagacaaagc ctgtgatccc caacacaccc 48360
attcatgctt gctcctcttt tgcttgtgac ctctctgctt tcatttaccc ttgtagtctc 48420
ggttttcatg tggaccattc ttttcttggc tcttgggggc aaaattattt tccttcctgc 48480
tctgtatagt ggtcgaactc tgccacaagc atcagggagg aagatatcaa ttcatgattg 48540
atatcatgaa ttgatatcat ggcaaatgct gtttgccagt tttctcagat atgagaggga 48600
agattttttt cagtaaaatt ttgcatgatt taattcccaa cttcttaaag ccctcatgtg 48660
gattggtgtt tgtttcctaa aagattatta tgggaagaaa gcctactcaa aagtttttac 48720
tcccattcgc ttctcttgaa aaatctacat tatttccagt ctacttcagc tcctcctgcc 48780
ttcaatctaa aggagttgct tgcacacctt gagtaaatgt gtgtaatttc tgaactgccc 48840
attttaagat ttgattccaa acctatccca ttcttttact tgaagcatat gcctctcaat 48900
tatagctaac atcctggttc tttgcccaag cctctgaggc acagttatgt aatccccatt 48960
cttataaaga ggcttgtaga ggttaatttg caacttcatt gtagagagag agagtaatca 49020
gcccccttta tccaattttt ttatcaactg agaaagtatc tgtatttagg taggcaatct 49080
ggtgcttaag agcaggtttt ggaactagag ttggagtttg aatctcagct ctgccacttt 49140
tttttttttt tttgagatgg agtctcgccc tgtccccatg ctggagtgca atggcacgat 49200
ctcggctcac tgcaacctcc gcctcccagg ttccagcgat tctcctgcct cagcctcccg 49260
agtagctggg attacaggcg cgggccacca cacgcggcta tttttttttt tttatcttta 49320
gtagagacgg ggtttcacca tgttgaccag gctggtctca agctcctgac ttcgtgatcc 49380
acccgcctca gcctcccaaa gtgctggggt tacaggcgtg agccactgtg cccggccagc 49440
tctgccactt tctagctgtg tgatctctaa aatgagagtg ctaacagttg cctacttttt 49500
aaagtgttgt atgaattaag tcgtaagaca cttggaataa tgcttagcac aaaatagtat 49560
caaacgcagg gacattttat gtgtgttctg ttacccaaag gcatacatta cgaaatatat 49620
agatgctcgc tggagaaact ggcacaatct agaaagcgct gttttccccg tttgtttttc 49680
ttggtgtgta tggagtgagt gccaaaaagc ctcaagtaac ctttttttat ctccagggtt 49740
tggagggttc tggaagtaaa catcatagtt cgccgttgcc aggcgctgtt gagttgctgc 49800
cttgctctta tctaggggtc tagatggcct tccctg 49836
Claims (85)
- 단리된 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드로서, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 18-30 뉴클레오티드이고, OGT mRNA 와 하이브리드화하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서,
SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열, 또는
SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열
을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드. - 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 중 내지 고 엄격성의 조건 하에서 OGT mRNA 와 하이브리드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- (i) 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 18-30 뉴클레오티드이고, OGT mRNA 와 하이브리드화하는 서열을 가짐; 및
(ii) 약학적으로 허용가능한 담체
를 포함하는 약학적 조성물. - 제 4 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가
SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열, 또는
SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열
을 갖는 조성물. - 제 4 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 중 내지 고 엄격성의 조건 하에서 OGT mRNA 와 하이브리드화하는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 의 코딩 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 173 의 조절 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 173 의 인트론 영역에서 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열, 또는 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편에 상응하는 서열을 포함하고, 이때 상기 서열은 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 서열이 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 18-30 뉴클레오티드 분자에 상응하도록, 폴리뉴클레오티드의 서열이 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나의 단편을 포함하고, 1-10 뉴클레오티드 잔기를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 올리고데옥시뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 겔인 조성물.
- 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 알코올을 포함하는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 포함하는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 Pluronic® F-127 을 포함하는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 알기네이트 또는 히드로겔을 포함하는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 셀룰로오스-기재 담체를 포함하는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰로오스-기재 담체가 히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국부 적용을 위해 제형화되는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국소 주사를 위해 제형화되는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 상처 드레싱으로 제형화되는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 콜로이드성 겔 드레싱으로 제형화되는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 지효성이도록 제형화되는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 서방성, 복효형, 또는 방출 제어형이도록 제형화되는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 액체, 크림, 고약, 에멀젼, 로션, 스프레이, 연고, 폼 또는 페인트인 조성물.
- 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 조성물이 상처가 있는 대상체의 치료를 위한 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 예상되는 속도로 치유되지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 지연되거나, 치유되기 곤란하거나 또는 만성인 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 OGT 발현 증가로 적어도 일부분 특징지어지는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 당뇨병이 있는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 제 1 형 당뇨병을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 제 2 형 당뇨병을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 통상 보다 높은 혈액 글루코오스 수준을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인슐린-저항 수용체를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 당뇨병이 있지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 상처 치유제를 추가로 포함하는 조성물.
- 제 4 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항-OGT 제제를 추가로 포함하는 조성물.
- 세포에 항-OGT 제제를 투여하는 것을 포함하는, 세포에서의 OGT 의 저해 방법으로서, 상기 항-OGT 제제는 하기로부터 선택되는 방법:
(i) 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 18-30 뉴클레오티드이고, OGT mRNA 와 하이브리드화하는 서열을 가짐;
(ii) OGT 의 발현을 저해하는 이중 가닥 RNA 분자; 및
(iii) OGT 의 발현을 저해하는 쇼트 헤어핀 RNA 분자. - 항-OGT 제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 상처가 있는 대상체의 치료 방법으로서, 이때 상기 항-OGT 제제는 하기로부터 선택되는 방법:
(i) 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드, 이때 폴리뉴클레오티드는 길이가 18-30 뉴클레오티드이고, OGT mRNA 와 하이브리드화하는 서열을 가짐;
(ii) OGT 의 발현을 저해하는 이중 가닥 RNA 분자; 및
(iii) OGT 의 발현을 저해하는 쇼트 헤어핀 RNA 분자. - 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 중 내지 고 엄격성의 조건 하 OGT mRNA 와 하이브리드화하는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 하기를 갖는 방법:
SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열 [상기 18-30 뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편에 상응함], 또는
SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열. - 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드인 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 안티센스 OGT 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 의 코딩 영역에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 173 의 조절 영역에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 173 의 인트론 영역에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열, 또는 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편에 상응하는 서열을 포함하고, 이때 상기 서열은 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 서열이 SEQ ID NO: 3 의 18-30 인접 뉴클레오티드 단편, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 173 에 제시된 18-30 뉴클레오티드 서열과 상보적인 18-30 뉴클레오티드 분자에 상응하도록, 폴리뉴클레오티드의 서열이 SEQ ID NOs: 4-168 중 어느 하나의 단편을 포함하고 1-10 뉴클레오티드 잔기를 추가로 포함하는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 단리된 이중 가닥 RNA 분자가 SEQ ID NOS: 169-171 로부터 선택된 서열을 포함하고 약 11 내지 27 개의 뉴클레오티드를 포함하는 제 1 가닥을 포함하는 방법.
- 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 소형 헤어핀 RNA 가 SEQ ID NO: 172 의 서열을 포함하는 방법.
- 제 38 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-OGT 제제가 약학적 조성물 내에 제공되는 방법.
- 제 54 항에 있어서, 약학적 조성물이 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 방법.
- 제 55 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 겔인 방법.
- 제 55 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 알코올을 포함하는 방법.
- 제 55 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 포함하는 방법.
- 제 55 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 Pluronic® F-127 를 포함하는 방법.
- 제 55 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 알기네이트 또는 히드로겔을 포함하는 방법.
- 제 55 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체가 셀룰로오스-기재 담체를 포함하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 셀룰로오스-기재 담체가 히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 54 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국부 적용을 위해 제형화되는 방법.
- 제 54 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국소 주사를 위해 제형화되는 방법.
- 제 54 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 상처 드레싱으로 제형화되는 방법.
- 제 54 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 콜로이드성 겔 드레싱으로 제형화되는 방법.
- 제 54 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 지효성이 되도록 제형화되는 방법.
- 제 54 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 서방성, 복효형, 또는 방출 제어형이 되도록 제형화되는 방법.
- 제 54 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 액체, 크림, 고약, 에멀젼, 로션, 스프레이, 연고, 폼 또는 페인트인 방법.
- 제 44 항 및 제 46 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-OGT 제제가 국부적으로 투여되는 방법.
- 제 44 항 및 제 46 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-OGT 제제가 국소 주사에 의해 투여되는 방법.
- 제 44 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 제제가 상처가 있는 대상체의 치료를 위한 방법.
- 제 72 항에 있어서, 상처가 예상되는 속도로 치유되지 않는 방법.
- 제 72 항에 있어서, 상처가 지연되거나, 치유되기 곤란하거나 또는 만성인 방법.
- 제 72 항에 있어서, 상처가 OGT 의 발현 증가에 의해 적어도 일부분 특징지어지는 방법.
- 제 44 항 및 제 46 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인슐린-저항 수용체를 포함하는 방법.
- 제 76 항에 있어서, 세포가 대상체 내에 존재하는 방법.
- 제 45 항 내지 제 75 항 및 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 당뇨병이 있지 않은 방법.
- 제 45 항 내지 제 75 항 및 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 당뇨병이 있는 방법.
- 제 79 항에 있어서, 대상체가 제 1 형 당뇨병을 갖는 방법.
- 제 79 항에 있어서, 대상체가 제 2 형 당뇨병을 갖는 방법.
- 제 45 항 내지 제 75 항 및 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 통상 보다 높은 혈액 글루코오스 수준을 가지는 방법.
- 제 45 항 내지 제 75 항 및 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인슐린-저항 수용체를 갖는 방법.
- 제 45 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 의 상처 치유제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 45 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 의 항-OGT 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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