CN117230021B - 一种cp4 epsps单抗杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CP4 EPSPS单抗杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用，所述杂交瘤细胞株为1H5 3C5，已于2023年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45606。该细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价为1:256000，所述单抗可以特异识别原核表达的重组CP4 EPSPS蛋白及转基因玉米中的内源CP4 EPSPS蛋白。本发明的分泌抗CP4 EPSPS耐除草剂蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及到一种CP4 EPSPS单抗杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用。
背景技术
由于农业耕作劳动力短缺，使得使用除草剂控制杂草成了最常见的手段。转有抗除草剂基因作物的种植，使在田间喷洒除草剂成为有效防除杂草方式，也因而使抗除草剂性状成为农业生产中最具优势的性状之一。目前，抗除草剂作物占全球转基因作物的80％以上。从发展趋势上看，转基因的作物比例仍在不断增加。耐辐射球菌cp4 epsps基因表达的蛋白CP4 EPSPS赋予转基因作物耐除草剂草甘膦特性。
随着转基因作物的飞速发展带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题。因此建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物的安全管理，保障人、动物以及微生物的安全，能够保护生态环境。为了对转基因玉米、大豆或者其衍生物中CP4 EPSPS蛋白进行检测，研究并得到抗除草剂 CP4 EPSPS蛋白的抗体具有非常大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CP4 EPSPS单抗杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法，其分泌的单抗为实现转基因作物中耐除草剂蛋白CP4 EPSPS的检测奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供了一种杂交瘤细胞株1H5 3C5，该杂交瘤细胞株已于2023年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为CP4单抗杂交瘤细胞株，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.45606。
该杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
a) 通过原核表达得到CP4 EPSPS重组蛋白；
b) 免疫动物：将CP4 EPSPS重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c) 细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d) 细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
上述制备方法在一种实施方式中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株1H5 3C5所产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞株1H5 3C5所产生的单克隆抗体的类型为IgG2b。上述单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价为1:256000。
本发明的单克隆抗体的制备方法包括将杂交瘤细胞株1H5 3C5接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后对收集的腹水进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
本发明还提供了上述单克隆抗体在检测CP4 EPSPS耐除草剂蛋白中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用工程菌株表达、纯化得到的高纯度耐除草剂蛋白CP4 EPSPS作为抗原，通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗CP4 EPSPS的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株1H5 3C5，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价为1:256000，抗体亚型为IgG2b，所述单抗可以特异识别原核表达的重组CP4EPSPS蛋白及转基因玉米中的内源CP4 EPSPS蛋白，分泌抗CP4 EPSPS耐除草剂蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
附图说明
图1是本发明的CP4 EPSPS重组蛋白SDS-PAGE电泳结果图；
图2 是本发明的CP4 EPSPS重组蛋白单抗筛选Western结果图，
其中：
所有非Marker泳道上样：转cp4 epsps基因玉米叶片蛋白提取液
一抗：
泳道1：杂交瘤细胞培养上清2A7 2G2
泳道2：杂交瘤细胞培养上清1H5 3C5
泳道3：小鼠多抗5 μg/mL
二抗: IgG(H+L)-HRP(1:5000)
Marker：250/150/100/70/50/40/35/25/20/15（kD）；
图3是本发明的杂交瘤细胞株1H5 3C5纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE 电泳结果图；
图4是本发明的杂交瘤细胞株1H5 3C5所产生的单克隆抗体滴度；
图5是本发明的杂交瘤细胞株1H5 3C5所产生的单克隆抗体特异性检测转基因玉米叶片中的CP4 EPSPS Western结果图，
其中：
泳道1上样：转cp4 epsps基因玉米叶片蛋白提取液
泳道2上样：非转基因对照郑58玉米叶片蛋白提取液
一抗：杂交瘤细胞培养上清1H5 3C5
二抗: IgG(H+L)-HRP(1:5000)
Marker：250/150/100/70/50/40/35/25/20/15（kDa）。
图 6 是本发明的杂交瘤细胞株1H5 3C5所产生的单克隆抗体检测几种常用耐除草剂蛋白的Western结果图，其中左图为SDS-PAGE电泳后结果图，右图为Western后结果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购得。
实施例1：杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1. 免疫抗原的制备
1.1重组蛋白CP4 EPSPS表达菌株构建、菌体培养及裂解
CP4 EPSPS编码基因扩增：以转cp4 epsps基因玉米基因组DNA为模板，用高保真Fastpfu进行PCR扩增。
扩增到的PCR产物经（1.0%）琼脂糖凝胶电泳鉴定后，酶切、连接到pET28a质粒，转化Trans10感受态细胞（北京全式金），挑取克隆，进行菌落PCR鉴定，阳性克隆由北京六合华大基因公司进行测序。
将鉴定正确的重组表达载体pET28a-cp4 epsps转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素（50 µg/mL）的LB平板上，37℃过夜培养。次日在平板上挑取单克隆接种含相同浓度卡那霉素的液体LB培养基中，于37℃过夜培养。所得的表达菌株菌液与50%的甘油溶液等体积混匀，于-80℃冻藏。
将保存的重组蛋白CP4 EPSPS表达菌株复苏培养，菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆接种液体LB（含卡那霉素）培养基中37℃过夜培养。第二天以1%接种量接种，于37℃培养至OD600为0.8左右，加入IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白。诱导结束将菌液冰浴，于4℃，4000 rpm，10 min离心收集菌体，弃上清，菌体经PBS洗涤后用裂解液（50 mM Tris-HCl，pH7.6，300 mM NaCl，5v/v%甘油，10 mM 咪唑）悬浮；超声破碎（2s on/4s off，Amp：45%，Time：3 min）；4℃，15000 rpm 离心1 hr，收集上清。
1.2重组蛋白纯化
菌体裂解液上清与经裂解液平衡的Ni Sepharose 6 FF Beads(GE Healthcare)混合，于4℃结合2-3 hrs，3000 rpm离心3 min弃上清；已结合蛋白的Ni Sepharose 6 FFbeads经清洗液洗2-3次；再用洗脱液洗脱。收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。
将亲和纯化得到的蛋白样品透析至蛋白储存溶液（25 mM Tris-HCl， pH7.6，150mM NaCl，5v/v% 甘油），并用经相同溶液平衡的Superdex 200 Increase 10/30 GL(GEHealthcare)进一步纯化，收集蛋白峰组分并经SDS-PAGE检测蛋白样品的纯度，通过图1可得，经过凝胶过滤最后获得电泳纯的CP4 EPSPS蛋白，分子量约为50 kDa。
2. 免疫动物
用步骤1.2质控合格的CP4 EPSPS重组蛋白作为抗原免疫8只8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠（购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018），抗原与等体积完全弗氏佐剂（首免）或不完全弗氏佐剂（加强免疫）混合并进行乳化，充分混合至油包水状态后进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期 2 周，之后进行效价检测，高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250 μL的 PBS 中。具体免疫程序及免疫剂量如表1所示。
表1 免疫程序及免疫剂量
免疫示例：一免中，将50 μg的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。
3. 细胞融合
末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合（1:5-1:10），50% PEG1450作用1 min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20%胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5% CO2，37℃下培养。
4. 细胞建株
1）融合板检测：
待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在ELISA质控合格（即阴性对照OD450<0.2，阳性对照OD450>1.0）后挑选阳性孔（一般 OD450≥0.5）作亚克隆。
2）亚克隆方法及检测：
挑出融合板中检测阳性值高(OD450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板60%的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。
3）细胞株建立：
将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及western-blotting验证其稳定性，通过图2可知，CP4 EPSPS单抗杂交瘤细胞株1H5 3C5分泌的单抗能特异检测到内源样本CP4 EPSPS，收集细胞扩大于10 cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出OD450>2.0的2株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存，即杂交瘤细胞株1H5 3C5，已于2023年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.45606。
4）细胞株冻存鉴定，在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：
①复苏活细胞数≥100 万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50 万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌、真菌、支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA（OD450>2.0），以确定是否分泌阳性抗体的同时做 western-blotting的鉴定，通过图5可知，CP4 EPSPS单抗杂交瘤细胞株1H53C5分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白CP4 EPSPS。
5. 制备腹水
先用降植烷或液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后分别将杂交瘤细胞株1H5 3C5接种到小鼠腹腔中，细胞定株后扩大培养选用10%胎牛血清培养基，当细胞密度达到1×106-2×106/mL时，800 rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬后，腹腔注入到小鼠（液体石蜡）体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。
6. 抗体纯化
收集后的腹水经过预处理后选用 Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：
1）缓冲液：起始缓冲液为pH7.0，20 mM磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.7 0.1 mM甘氨酸盐酸。
2）准备收集管：取1.5 mL离心管，每支离心管加70 μL pH9.0 1 M Tris-HCl。
3）样品准备：经50% SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm 微孔滤膜滤过。
4）纯化过程：用足够的起始缓冲液（8-10 mLProtein A-琼脂糖亲和层析柱（HiTrap Protein A 1 mL，Pharmacia Biotech）。取待纯化的样品（每毫升样品含蛋白10.2-21.1 mg）15-25 mL上柱，流速为0.5 mL/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7-8 mL、洗脱缓冲液6-7 mL、起始缓冲液5 mL洗涤，每管1 mL收集洗脱液。
5）纯度及活性鉴定：纯化的单克隆抗体（McAb）用 SDS-PAGE 鉴定其纯度，详见图3，通过图3可知，杂交瘤细胞株1H5 3C5单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带（55 kDa和25 kDa）。
7. 单克隆抗体的亚类鉴定和效价测定
将纯化好的单抗与sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG2b，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM抗体进行ELISA检测，检测结果（见表2）表明：单抗类型为IgG2b，以重组蛋白CP4 EPSPS为抗原，用间接ELISA方法检测纯化单抗效价，通过图4可知，经ELISA测定，纯化得到的1H5 3C5单抗滴度为1:256000。
表2 杂交瘤细胞株1H5 3C5所产生的单克隆抗体的浓度及亚型
| 单抗杂交瘤细胞编号 | 抗体（IgG）浓度 | 抗体亚型 |
| 1H5 3C5 | 1.0 mg/mL | IgG2b |
8. 单克隆抗体特异性检测
分别提取转cp4 epsps基因玉米及其转化亲本内源蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜用纯化单抗（1H5 3C5）作为一抗，Alexa FlurorTM 680 goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)为二抗，用Odyssey infrared740 imager（9120, Li-COR Biosciences,Lincolin, NE)红外扫描仪western检测结果，通过图5可知，纯化得到的1H5 3C5单抗能特异识别内源样本中的CP4 EPSPS。
其中，转基因玉米蛋白提取方法:
组织液氮速冻，磨碎，加1 mL（按样品量，一般0.5 g加1-2 mL）蛋白提取液，4℃混匀30 min，12,000 rpm 4℃离心15 min，取上清，蛋白提取液配方见表3：
表3蛋白提取液配方
| 成分 | 用量 |
| 1 M Tris, pH 7.5 | 500 μL |
| 1 M NaCL | 1.5 mL |
| 0.5 M EDTA | 20 μL |
| 50%glycerol | 2 mL |
| 10% SDS | 1 mL |
| 双蒸水（ddH2O） | 配成10 mL |
| 蛋白酶抑制剂(Roche) | 用时添加一片 |
| 1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟, Sigma） | 用时添加50 μL |
9. 转基因作物中常用耐除草剂蛋白的特异性检测
除CP4 EPSPS外，转基因作物中常用耐除草剂蛋白还有G2 EPSPS和G10 EPSPS。为了检测本发明的杂交瘤细胞株1H5 3C5所产生的单抗的特异性，用该单抗进行Western检测G2 EPSPS、G10 EPSPS（购买于上海佑隆公司）和CP4 EPSPS（前述原核表达纯化获得），检测结果见图6，结果表明纯化得到的1H5 3C5所产生的单抗能特异识别CP4 EPSPS，但不能有效识别其他耐除草剂蛋白G2 EPSPS和G10 EPSPS。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (3)
1. 一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45606。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后对收集的腹水进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体在检测CP4 EPSPS耐除草剂蛋白中的应用。
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