CN103848916A - 一种抗cp4 epsps单克隆抗体的制备方法、编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对转基因中常见的抗草甘膦抗性蛋白-5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)的单克隆抗体及其制备方法，目的是提供一种新的可以检测天然转基因植物(大豆、玉米、棉花和水稻等)中是否存在CP4 EPSPS蛋白的单克隆抗体。制备该单克隆抗体的专用抗原，是根据已公布的CP4 EPSPS基因序列通过大肠杆菌进行重组表达得到的。该单克隆抗体的亚型为IgG1，亲和常数达到2.35×10⁸。该单克隆抗体能识别转基因植物中的CP4 EPSPS蛋白，可用于转CP4 EPSPS基因植物的检测。本发明还提供了该单克隆抗体的轻链和重链可变区编码序列。

Description

一种抗CP4 EPSPS单克隆抗体的制备方法、编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种可以与转基因植物中外源基因表达蛋白结合的抗体。具体而言，本发明提供了一种抗转基因植物中常见的草甘膦抗性蛋白-5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)的单克隆抗体，可用于制备检测转基因植物中常见CP4 EPSPS蛋白的试剂盒，属于生物检测领域。 

背景技术

草甘膦(Glyphosate)是一种广泛使用的除草剂，具有高效、低毒、广谱和易分解的特点，我国是草甘膦的生产和使用大国。抗草甘膦的转基因植物是转基因研究的重要对象，目前抗草甘膦转基因植物是全球种植面积最大的转基因品种，在抗草甘膦的基因中使用最多的是草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N acetyhransferase)基因，即GAT基因和5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase)，即EPSPS，其中又以孟山都(Monsato)从土壤农杆菌的CP4株系(Agrobacterium strain CP4)克隆的CP4EPSPS基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases，美国专利US5633435)使用最为广泛，目前广泛用于大豆、玉米和棉花等转基因作物中。通过将该基因的5’端与来自矮牵牛(Petunia)EPSPS基因的叶绿体转运肽(Transit peptide)融合而使其产物高效定位于植物的叶绿体。 

随着转CP4 EPSPS基因植物的不断发展及其商品化的种类不断增加，转基因生物本身的安全性以及它们对人类健康和生态环境的潜在威胁成为国际社会和广大民众广泛关注的热点问题之一。包括我国在内的越来越多的国家制定并实施了转基因食品的强制标识制度。因此，转基因产品的科学管理和应用需要得到转基因产品及其成分检测技术的支持。目前，转基因产品及成分检测最常用的方法有两类：一类是针对其外源核酸成分的检测技术；另一类是针对其外源蛋白质成分的免疫学分析方法。基于DNA的检测方法只能在核酸水平上反映转基因样品是否含有外源 DNA，不能检测其外源基因是处于沉默还是表达，因此，其检测结果与转基因外源蛋白的实际含量并无直接关联。加之，DNA在加工过程中会因降解掉而难以检测，而核酸检测方法必须经过专门的核酸提取和纯化过程，增加了额外的工作量。利用。基于外源蛋白的免疫学分析方法，如酶联免疫分析法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现对转基因植物样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体，为提高检测的特异性和灵敏度，可以采用多克隆抗体与单克隆抗体配合或者单克隆抗体配合实现夹心ELISA检测的方式。 

用于抗草甘膦转基因的抗(耐)性基因主要是草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因和5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。对于转CP4 EPSPS植物的检测多采取基于PCR的核酸检测方法(刘彩霞，高宏伟，梁成珠，徐彪，孙敏及林超，用于检测抗草甘膦转基因大豆及加工品EPSPS基因的引物，中国专利200910003367.8；沈文飚，黄明，吴洪洪，肖笑，周兴虎，徐晟，谢彦杰，何健及周光宏，检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒，中国专利201010249480.7)及其它等温核酸扩增技术(汪琳，赖平安，柏亚铎，罗英，周琦，蒲静，张伟，高志强，张向东，齐玮，凌凤俊，张瑞宏，李东燕，乔彩霞，吴丹，谷强，张利峰，段向英及刘辉，一种检测转EPSPS基因作物的核酸恒温扩增试剂盒及方法，中国专利201010233350.4，曹以诚，杜正平，陈洵，李志勇及高东微，Roundup Ready转基因大豆EPSPS基因检测用引物组、快速诊断试剂盒和检测方法，中国专利200910213995.9)。在采用抗体检测的研究中多数为多抗方法(黄明，沈文飚，吴洪洪，肖笑，徐晟，周兴虎，何健及周光宏，与CP4-EPSPS蛋白发生特异性抗原抗体反应的多克隆抗体及其应用，中国专利201010225353.3；王保民，刘威，邓艾兴，李召虎，赵静，何素平，南铁贵，俞彩霞及何钟佩，一种EPSPS酶的抗体及其制备方法与专用抗原及应用，中国专利200610089306.4)。多抗的成分复杂，不同生产批次间的质量稳定性难以控制，并不适宜用于检测产品的开发。此外，相关专利所涉及的均为单一抗原性多肽为免疫原，难以获得亲和力很高的抗体。在CP4 EPSPS的单抗制备及试剂盒开发中敬凌霞等利用重组的CP4 EPSPS蛋白制备了单克隆抗体，其效价达到1×10⁶-1×10⁸，相对亲和力为1×10⁵到1×10⁶(敬凌霞，蔡雪飞，慕生枝，刘湘，张君，唐霓，郑建及黄爱龙，抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定，细胞与分子免疫学杂志2007，(5))。因其所获得的 单抗亲和力仅为10⁶左右，且两株抗体识别的表位相似或相同，故并不能满足配对检测和灵敏度的要求。其它相关基于抗体的免疫检测试剂盒的文献并未对所用抗体的性质给予明确阐述(林敏；张维；陈明；平淑珍；陆伟，一种联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒及方法，中国专利200510086760.X；梅曼彤；许少鹏；赵均良；姚涓；穆虹；周峰及姜大刚，一种检测耐除草剂大豆中EPSPS基因的酶联免疫试剂盒及其使用方法，中国专利200710027712.2)。 

目前国外已有多种检测CP4 EPSPS的产品问世(Agdia的试纸条产品STX 74000及夹心ELISA产品PSP 74000)，但这些产品以试纸条方法为主，且价格昂贵，不易推广使用，国内尚无同类产品生产和销售。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能针对转基因植物中常见的CP4 EPSPS蛋白的单克隆抗体制备方法。 

本发明的第二个目的是提供一种特异性好的单克隆抗体，该抗体能特异结合CP4E PSPS重组抗原和天然抗原。 

本发明的第三个目的是提供一种可以用于实验室或田间检测农作物种籽或叶片中是否带有CP4 EPSPS蛋白的检测试剂。 

解决技术问题所采用的技术手段 

本发明对转基因植物中常用的CP4 EPSPS蛋白，按照公布的序列合成引物，将编码CP4 EPSPS完整基因的序列克隆进带有标签肽的大肠杆菌表达质粒载体pET-BPI中进行重组表达，取表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组CP4 EPSPS筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。 

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，ProteinA/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为2.35×10⁸。免疫印记(Western blotting)实验显示该抗体能特异识别重组的CP4 EPSPS蛋白以及转CP4 EPSPS的转基因大豆标准品，而不识别其他转基因蛋白，如Cry1Ab/1Ac融合蛋白。与CP4 EPSPS多抗形成的双抗体夹心可以检测低至10ng/ml的CP4 EPSPS蛋白。 

本发明的优点及有益效果 

(1)本发明获得的单克隆抗体，能识别重组蛋白CP4 EPSPS，具有检测转CP4 EPSPS基因的转基因植物的用途。 

(2)本发明获得的单克隆抗体与从转基因大豆的种子的蛋白提取物中的CP4EPSPS蛋白的结合有极强特异性和敏感性。 

(3)本发明获得的单克隆抗体可应用于免疫印记(Western blotting)、双抗体夹心ELISA、间接ELISA、抗体芯片制备等转基因植物的检测与筛查，特异性和灵敏度高，具有很高的使用价值。 

附图说明

图1：纯化的CP4-EPSPS蛋白 

所纯化的重组CP4 EPSPS为可溶状态，其纯度在90％左右，浓度高于1.5mg/ml。1：经纯化的CP4 EPSPS重组蛋白；2：分子量标记。 

图2：CP4-EPSPS抗体的识别特性和实际应用效果 

应用纯化的CP4 EPSPS单克隆抗体可以特异的检出CP4 EPSPS重组蛋白及转基因大豆种籽中的CP4 EPSPS蛋白，但对于非转基因大豆和无关蛋白则没有结合活性。1：分子量标记；2：重组CP4 EPSPS 10ng；3：重组CP4 EPSPS 5ng；4：转基因大豆RRS蛋白提取物10μl；5：非转基因大豆对照10μl；6：无关蛋白对照Cry1Ab/1Ac 10ng。 

图3：CP4-EPSPS抗体用于双抗夹心ELISA的检测效果 

CP4 EPSPS单克隆抗体与多克隆抗体配对，可检测低至10ng/ml的CP4 EPSPS蛋白。包被抗体为本发明的CP4 EPSPS单克隆抗体，检测抗体为CP4 EPSPS多抗。检测样品为重组的标准CP4 EPSPS蛋白。 

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。 

实施例1重组Cry1A蛋白的制备 

一、基因克隆 

按照公布的CP4 EPSPS的基因编码序列(Genbank Accession No.AF464188)，设计特异性上游引物(SEQ ID No.3)和下游引物(SEQ ID No.4)从Roundup Ready(RR)转基因大豆DNA标准品中扩增CP4 EPSPS基因，在PCR的方法在该融合蛋白基因的5’和3’端分别加入NcoI和BamHI酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET-BPI进行NcoI和BamHI酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于表达重组的CP4 EPSPS蛋白。 

二、蛋白表达和纯化 

按1∶100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100ml LB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8。加入0.1mol/L的IPTG，25℃震荡培养8h，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用Ni柱进行蛋白质的亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测，图1为重组CP4 EPSPS蛋白的表达和纯化结果。重组CP4 EPSPS蛋白的纯度在90％以上，浓度约为1-1.5mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。 

实施例2杂交瘤细胞系的建立 

一、免疫 

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(由军事医学科学院提供)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。 

二、细胞融合 

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5∶1 比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。 

三、挑克隆 

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃ 5％CO₂培养箱中培养。 

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞 

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。 

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体 

一、腹水制备 

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。 

二、单克隆抗体的纯化 

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。 

实施例4单克隆抗体特性鉴定 

一、亚类鉴定 

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公 司)至0.5μg/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1∶1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体或1∶2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。 

二、亲和常数测定 

包被重组CP4EPSPS蛋白，包被浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1∶200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1∶20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为2.35×10⁸。 

实施例5CP4EPSPS单克隆抗体的可变区序列测定 

按照等G.C.霍华德等著《抗体制备与使用实验指南》及沈倍奋，陈志南，刘民培编著的《重组抗体》中相关描述进行抗体可变区基因的克隆，主要过程如下。 

一、总RNA提取 

液氮研磨新鲜收集的10⁶以上杂交瘤细胞后，移至Trizol中，剧烈振荡，室温放置10分钟，4℃离心10分钟。酚氯仿抽提后上清与等体积的异丙醇充分混匀，冰上沉淀30分钟。离心后的沉淀用预冷的70％乙醇洗涤、干燥。RNA干燥物溶于DEPC水中。 

二、反转录PCR 

取9μL总RNA，2.5μL oligo(dT)12-18primer(10mM)，及5μL dNTPs混合，70℃保温5分钟后置冰上5分钟。加入5μL RT buffer(5×)，2.5μL DTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。取1μL cDNA进行PCR扩增(95℃变性30S，退火温度时间1min，延伸72℃40S，30个循环)。 

三、PCR产物测序 

取10μL PCR产物进行电泳分析(1.5％琼脂糖胶)，轻链(κ轻链)的长度在320-360bps之间，重链的长度在340-370bps之间，切胶回收后与T载体做连接转化。蓝白斑挑选阳性克隆，菌落PCR验证阳性后送测序，根据DNA序列与氨基酸编码序列的相应关系，确定可变区的氨基酸序列。 

测序分析获得CP4EPSPS单克隆抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示。 

实施例6CP4 EPSPS单克隆抗体的单抗反应特异性和应用效果 

选择重组的CP4 EPSPS蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，以纯化的Cry1Ab/1Ac重组蛋白作为无关抗原检测其特异性。分别从经PCR方法确认的转基因和非转基因大豆种子中提取蛋白来检测本发明的单克隆抗体在检测转基因植物中的应用效果。 

免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入CP4EPSPS单克隆抗体(1∶1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1∶5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(普利莱公司)，用ImageQuant ECL仪器(GE公司)捕获显色图像。 

图2显示的是CP4EPSPS单克隆抗体对重组蛋白和转基因大豆种子蛋白的免疫印迹检测结果。该抗体可以特异性检出5ng和10ng的重组CP4 EPSPS蛋白及转基因大豆，而不识别与之无关的另一种转基因蛋白Cry1Ab/1Ac以及非转基因大豆样本，可见该抗体的检出特异性和灵敏度都很高。 

实施例7CP4 EPSPS单克隆抗体用于ELISA的效果 

与CP4 EPSPS多克隆抗体配对，用重组的CP4 EPSPS蛋白为标准品，检测CP4EPSPS单克隆抗体用于双抗夹心ELISA的效果。实验步骤如下： 

将CP4-EPSPS单克隆抗体(2μg/ml)，100μl/孔，4℃包被过夜。用1％BSA在37℃，封闭2h。取纯化后的CP4-EPSPS蛋白用PBST稀释成10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml的蛋白稀释液，以100μl/孔(2个重复)加入不同的孔，37℃孵育1h。每孔加入100μl稀释的CP4-EPSPS多克隆，37℃孵育1h。加入HRP标记的羊抗兔(1∶10000)，100μl/孔，37℃孵育0.5h。以上每步完成后均用0.05％PBST清洗酶标板5-8次，吸水纸彻底拍干。每孔加100μlTMB显色液，反应3-5分钟，加入50μl终止液终止反应。测定405nm波长下读取各孔OD值。 

如图3，夹心ELISA实验结果显示，CP4-EPSPS配对抗体可以检测到含量高于10ng/ml的转基因蛋白。 

Claims (7)

1.一种单克隆抗体，其特征在于其轻链和重链可变区序列具有SEQ ID No：5和6所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其可变区序列与SEQ ID No：5和6具有90％以上的同源性。

3.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组CP4 EPSPS蛋白。

4.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

5.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其识别重组和天然的CP4 EPSPS蛋白。

6.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其用于免疫印迹，酶联免疫检测转基因植物(大豆、玉米、棉花和水稻等)中的CP4 EPSPS蛋白。

7.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可以作为检测试剂用于转基因植物检测试剂盒的制备。

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