CN103288954A - 条石鲷虹彩病毒orf049l重组蛋白的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.7304条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白杂交瘤细胞分泌产生。制备方法按如下步骤进行：通过基因克隆、原核表达获得分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白；用所获得的重组蛋白作为抗原免疫小鼠；取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过免疫印迹法、斑点酶联免疫法和间接免疫荧光法，筛选分泌条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞；利用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体及其制备方法。
背景技术
条石鲷虹彩病毒（Red bream iridovirus，RBIV）是导致条石鲷养殖严重经济损失的主要病原体，其跨膜蛋白是细胞识别的重要抗原表位，因而也是药物设计的关键靶标及制备疫苗的抗原。ORF049L是条石鲷虹彩病毒的一个非常重要的跨膜蛋白，Kim等（2007）研究发现利用条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白制备的多克隆抗体可阻断RBIV对蓝太阳鱼鳃细胞（BF-2）的侵染，具有一定的中和作用，而且依赖该蛋白抗体可建立条石鲷虹彩病毒的特异性免疫学检测技术。多克隆抗体虽然具有检测灵敏度高等优点，但其成本高，产量少，并易受到动物组织及其它病原体干扰而出现假阳性，给实际应用带来不便。单克隆抗体可以特异性识别单一抗原决定簇，能够在实验室通过细胞培养而得到批量生产，在诊断上具有专一性强、重复性好、操作简便等优点，有较高的使用价值，而且还可以对强毒株和弱毒株进行鉴别诊断，同时还能克服PCR检测易出现假阳性和对相关操作人员技能要求的缺点。但是，迄今为止尚未有关于条石鲷虹彩病毒跨膜蛋白ORF049L单克隆抗体的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体及其制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.7304的抗条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株所分泌，结合的抗原是分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白。
一种山述条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 通过基因克隆、原核表达获得分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白；
b．用分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠；
c. 取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过免疫印迹法、斑点酶联免疫法和间接免疫荧光法，筛选分泌条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞；
d．利用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。
所述a步骤按如下方法进行：
a.1取濒死条石鲷的脾脏100mg，置于1.5ml的Eppendorf管中，在10℃条件下，按CTAB方法提取病毒DNA；
a.2根据质粒pET-28a（+）酶切位点设计引物如下：
上游引物P1：5'-GAATTCATGT ACCCTGACTGTCCCAG-3'；
下游引物P2：5'-GTCGACTTATTTCATAAGCCTTGCAC A-3'；
PCR反应总体系25μl，反应条件为：95℃预变性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，共30个循环，72℃再延伸8min；
PCR产物经电泳鉴定、产物回收纯化后克隆入pMD-18T载体，然后转化DH5α 感受态细胞；
a.3提取pMD-18T-ORF049L重组质粒，然后用EcoR I、Sal I限制性内切酶同时对重组质粒pMD-18T-ORF049L及pET-28a质粒进行双酶切，用T4 DNA连接酶将切胶回收的目的片段与pET-28a质粒连接后转化于DH5α感受态细胞，并挑选阳性克隆测序；将经测序结果正确的pET28a-ORF049L质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，涂布于有Kan 30μg/ml抗体的LB筛选平板上；次日挑取转化LB平板上长出的阳性菌落，于LB液体培养基（Kan 30μg/ml）中37℃活化过夜，然后按1：100（V/V）转接于新鲜的LB液体培养基（Kan 30μg/ml）中，培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养4h后的菌液15000 r/min离心l min收集菌体；
a.4 菌体进行超声破碎后，10000r/min，离心15min收集沉淀，然后用含变性剂的1×Bind Buffer ( 500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5mM咪唑，6M盐酸胍，pH7.9 )冰上充分溶解，12000r/min，离心30min后上清用0.45μm微孔滤膜过滤；过滤后上清加入至已平衡好的Ni亲和层析柱中，所得蛋白为分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白。
所述c步骤按如下方法进行：在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用45% PEG1500融合，融合细胞用HAT选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养，两周后，检测杂交瘤细胞上清液，经过免疫印迹法、斑点酶联免疫法和间接免疫荧光法，筛选分泌条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
所述d步骤是采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞：将阳性杂交瘤细胞用1640培养液重悬，10倍梯度稀释至102cells/ml，取1 ml细胞液加入9 ml培养液，混合均匀，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1 ml，选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔，待细胞长满孔底2/3以上时，取上清液进行检测。
本发明提取了分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白，通过应用免疫学方法，产生融合的杂交瘤细胞，再经过免疫学的检测筛选方法，筛选出条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体，克服了应用条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的多克隆抗体进行检测所存在的缺点，充分发挥以条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体进行检测的优势。本发明所采用的免疫印迹鉴定方法，具有特异性强、灵敏度高的优点，可直接确定所制备的单抗与RBIV ORF049L重组蛋白发生特异性结合；通过间接免疫荧光法或斑点酶联免疫法可更加直观和准确的显示所制备的抗RBIV ORF049L重组蛋白单克隆抗体可与RBIV病毒粒子结合。
附图说明
图1为本发明实施例免疫印迹检测结果图。
图2为本发明实施例间接免疫荧光检测结果图。
图3为本发明实施例斑点酶联免疫检测结果图。
RBIV-3F8杂交瘤细胞保藏日期：2013年2月21日；
分类命名：抗条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏号：CGMCC No.7304。
具体实施方式
实施例1：
本发明的制备方法按照如下步骤进行：
a. 通过基因克隆、原核表达获得分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白：
a.1取濒死条石鲷的脾脏100mg，置于1.5ml的Eppendorf管中，在10℃条件下，按CTAB方法提取病毒DNA；
a.2根据质粒pET-28a（+）酶切位点设计引物如下：
上游引物P1：5'-GAATTCATGT ACCCTGACTGTCCCAG-3'；
下游引物P2：5'-GTCGACTTATTTCATAAGCCTTGCAC A-3'；
PCR反应总体系25μl，反应条件为：95℃预变性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，共30个循环，72℃再延伸8min；
PCR产物经电泳鉴定、产物回收纯化后克隆入pMD-18T载体，然后转化DH5α 感受态细胞；
a.3提取pMD-18T-ORF049L重组质粒，然后用EcoR I、Sal I限制性内切酶同时对重组质粒pMD-18T-ORF049L及pET-28a质粒进行双酶切，用T4 DNA连接酶将切胶回收的目的片段与pET-28a质粒连接后转化于DH5α感受态细胞，并挑选阳性克隆测序；将经测序结果正确的pET28a-ORF049L质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，涂布于有Kan 30μg/ml抗体的LB筛选平板上；次日挑取转化LB平板上长出的阳性菌落，于LB液体培养基（Kan 30μg/ml）中37℃活化过夜，然后按1：100（V/V）转接于新鲜的LB液体培养基（Kan 30μg/ml）中，培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养4h后的菌液15000 r/min离心l min收集菌体；
a.4 菌体进行超声破碎后，10000r/min，离心15min收集沉淀，然后用含变性剂的1×Bind Buffer ( 500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5mM咪唑，6M盐酸胍，pH7.9 )冰上充分溶解，12000r/min，离心30min后上清用0.45μm微孔滤膜过滤；过滤后上清加入至已平衡好的Ni亲和层析柱中，所得蛋白为分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白。
b．用分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠，每次免疫剂量为0.1ml，共免疫4次，具体免疫程序如下：
b.1 基础免疫，ORF049L重组蛋白与福氏完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方式；
b.2两周后第一次加强免疫，ORF049L重组蛋白与福氏不完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方式；
b.3三周后第二次加强免疫，采用尾静脉注射方式，无佐剂；
b.4四周后第三次加强免疫，采用尾静脉注射方式，无佐剂；
b.5 第三次加强免疫后的第3天，将小鼠脱颈椎处死；
c. 取小鼠脾脏进行细胞融合，得阳性杂交瘤细胞：
在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用45% PEG1500融合，融合细胞用HAT选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养，两周后，检测杂交瘤细胞上清液，经过免疫印迹法、斑点酶联免疫法和间接免疫荧光法，筛选分泌条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
d．克隆阳性杂交瘤细胞：
将阳性杂交瘤细胞用1640培养液重悬，10倍梯度稀释至102cells/ml，取1 ml细胞液加入9 ml培养液，混合均匀，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1 ml，选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔，待细胞长满孔底2/3以上时，取上清液进行检测。
免疫印迹法筛选：
（1）由浓度为12%分离胶和浓度为5%浓缩胶两部分配制电泳凝胶；
（2）本发明的ORF049L重组蛋白与电泳样品缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl pH6.8；1%SDS；1%疏基乙醇；10%甘油；0.02%溴酚蓝）等体积混合，加热煮沸3 min；
（3）采用Tris—甘氨酸（Gly）电泳缓冲液（0.025 mol/L Tris；0.25 mol/L Gly；0.1% SDS；pH 8.3），4℃条件电泳；
（4）电泳完成后，取出凝胶，一份考马斯亮兰染色，一份移到电泳转移槽；
（5）稳流200mA，转移5h；
（6）将转移后的硝酸纤维素膜用3%牛血清白蛋白4℃封闭过夜，次日PBS-T（0.05%Tween-20）浸洗3次，每次5min；
（7）加入本发明的杂交瘤细胞培养上清液，37 ℃孵育45 min，PBS-T浸洗3次，每次5 min，
（8）加入碱性磷酸酶标记羊抗小鼠Ig抗体，37℃孵育45min，PBS-T浸洗3次，每次5 min；
（9）加NBT/BCIP，室温显色。
结果：与本发明的分子量为16.9kDa的ORF049L重组蛋白发生特异性反应的上清夜，显示紫褐色条带，为本发明的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体，其相对应的杂交瘤细胞为保藏号为CGMCC No.7304的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白杂交瘤细胞。
免疫印迹检测结果如图1所示：图1中，M为分子量标准；1为条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的电泳图谱，可见重组蛋白的分子量为16.9kDa；2为本发明实施例的单克隆抗体与转印后ORF049L的免疫印迹结果，可见在16.9kDa处有一条清晰的条带，而阴性对照无条带显示。
间接免疫荧光抗体法筛选：
（1）取患病条石鲷（PCR检测RBIV为阳性）和健康条石鲷（PCR检测RBIV为阴性）脾脏，切成约8mm×5mm×7mm的小块，用组织冷冻包埋剂OCT包埋，-20℃放置30min，冰冻切片，切片厚度5μm。丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；
（2）以本发明的杂交瘤细胞培养上清液为第一抗体，加在切片上；
（3）37℃湿盒孵育45 min，PBS-T浸洗3次，每次5min；
（4）异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠Ig抗体，加在切片上；
（5）37℃湿盒孵育45 min，PBS-T浸洗3次，每次5min；
（6）甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照。
结果如图2所示：A为患条石鲷虹彩病毒病的鱼体的检测结果，可以清晰的观察到呈绿色荧光的肿大细胞；B为健康条石鲷的检测结果，无黄绿色荧光。
既与患条石鲷虹彩病毒病的鱼体反应，呈绿色荧光的肿大细胞的杂交瘤细胞培养上清液即为本发明的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体。
斑点酶联免疫法筛选：
（1）取患病条石鲷（PCR检测RBIV为阳性）和健康条石鲷（PCR检测RBIV为阴性）脾脏，按照1:10（W/V）比例加入TNE缓冲液（0.2 mol/L NaCL，0.02 mol/L Tris-HCL，0.02 mol/L EDTA，PH 7.4），匀浆；
（2）匀浆液于3000r/min，离心15min，吸取上清液；
（3）等体积加入20 mmol/L抗坏血酸，37℃ 作用30min，以彻底消除组织内源酶的影响；
（4）将第（3）步处理后的组织匀浆上清液，点在硝酸纤维素膜上，每点2ul，晾干；将点好样品的硝酸纤维素膜移入酶标孔中；
（5）每孔加入3%牛血清白蛋白200 ul，37℃ 封闭45min;
（6） PBST洗涤3次，每次5min；
（7）将本发明的杂交瘤细胞培养上清液加入酶标孔中，每孔100ul，37℃孵育45min；
（8）PBST洗涤3次，每次5min；
（9）将碱性磷酸酶标记羊抗鼠Ig抗体加入酶标孔中，每孔100ul，37℃孵育45min；
（10）PBST洗涤3次，每次5min；
（11）加入100ul NBT—BCIP发色液，室温暗处发色3-5min，观察记录结果。
结果如图3所示：1-8分别为8条患病条石鲷（PCR检测RBIV为阳性）的检测结果，可见硝酸纤维素膜上呈现蓝紫色，9-10为2条健康条石鲷（PCR检测RBIV为阴性）的检测结果，硝酸纤维素膜上无蓝紫色信号。
既点有患病条石鲷脾脏样品的硝酸纤维素膜呈现蓝紫色的杂交瘤细胞培养上清液即为本发明的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体。
实验结果同时表明：本发明制备了条石鲷虹彩病毒粒子ORF049L重组蛋白的单克隆抗体，其可与ORF049L重组蛋白结合，同时可与条石鲷虹彩病毒粒子结合。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120>条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体及其制备方法
<160>24
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
GAATTCATGT ACCCTGACTGTCCCAG 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
GTCGACTTATTTCATAAGCCTTGCACA 27
Claims (5)
1.一种条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.7304的抗条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株所分泌，结合的抗原是分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白。
2.一种如权利要求1所述条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 通过基因克隆、原核表达获得分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白；
b．用分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠；
c. 取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过免疫印迹法、斑点酶联免疫法和间接免疫荧光法，筛选分泌条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞；
d．利用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。
3.根据权利要求2所述条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述a步骤按如下方法进行：
a.1取濒死条石鲷的脾脏100mg，置于1.5ml的Eppendorf管中，在10℃条件下，按CTAB方法提取病毒DNA；
a.2根据质粒pET-28a（+）酶切位点设计引物如下：
上游引物P1：5'-GAATTCATGT ACCCTGACTGTCCCAG-3'；
下游引物P2：5'-GTCGACTTATTTCATAAGCCTTGCAC A-3'；
PCR反应总体系25μl，反应条件为：95℃预变性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，共30个循环，72℃再延伸8min；
PCR产物经电泳鉴定、产物回收纯化后克隆入pMD-18T载体，然后转化DH5α 感受态细胞；
a.3提取pMD-18T-ORF049L重组质粒，然后用EcoR I、Sal I限制性内切酶同时对重组质粒pMD-18T-ORF049L及pET-28a质粒进行双酶切，用T4 DNA连接酶将切胶回收的目的片段与pET-28a质粒连接后转化于DH5α感受态细胞，并挑选阳性克隆测序；将经测序结果正确的pET28a-ORF049L质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，涂布于有Kan 30μg/ml抗体的LB筛选平板上；次日挑取转化LB平板上长出的阳性菌落，于LB液体培养基（Kan 30μg/ml）中37℃活化过夜，然后按1：100（V/V）转接于新鲜的LB液体培养基（Kan 30μg/ml）中，培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养4h后的菌液15000 r/min离心l min收集菌体；
a.4 菌体进行超声破碎后，10000r/min，离心15min收集沉淀，然后用含变性剂的1×Bind Buffer ( 500 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，5mM咪唑，6M盐酸胍，pH7.9 )冰上充分溶解，12000r/min，离心30min后上清用0.45μm微孔滤膜过滤；过滤后上清加入至已平衡好的Ni亲和层析柱中，所得蛋白为分子量为16.9kDa的条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白。
4.根据权利要求3所述条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述c步骤按如下方法进行：在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用45% PEG1500融合，融合细胞用HAT选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养，两周后，检测杂交瘤细胞上清液，经过免疫印迹法、斑点酶联免疫法和间接免疫荧光法，筛选分泌条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述条石鲷虹彩病毒ORF049L重组蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述d步骤是采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞：将阳性杂交瘤细胞用1640培养液重悬，10倍梯度稀释至102cells/ml，取1 ml细胞液加入9 ml培养液，混合均匀，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1 ml，选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔，待细胞长满孔底2/3以上时，取上清液进行检测。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130911 |