CN102229914A

CN102229914A - 抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102229914A
Application number: CN 201110160656
Authority: CN
Inventors: 谢鹏; 徐晓艳; 金戈; 张亮
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2011-11-02

Abstract

本发明涉及一株保藏编号为：CCTCC No.C201116的分泌抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、一种由杂交瘤细胞株分泌的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是博尔纳病病毒核蛋白，该蛋白的序列为SEQIDNO1，分子量为40KD；还涉及所述抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体的制备方法,及抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体在制备用于检测博尔纳病病毒的抗体检测试剂的应用，所述检测包括免疫印迹法、间接免疫荧光法和间接ELISA法。本发明提供的抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的特异性好，效价高，制备方法简便易行。

Description

抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及了一种抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，还涉及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在博尔纳病病毒诊断或检测中的应用。属于免疫学和分子病毒学的交叉技术领域。

背景技术

博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）是一种具有高度嗜神经性的病毒，宿主几乎涵盖了所有的温血动物。被感染宿主表现出以明显精神、行为异常为特征的神经精神性症状，这与某些人类精神障碍的症状极为相似。美国、英国和日本等地的调查显示，在精神分裂症、抑郁症、双相情感障碍等疾病患者外周血液中可以检测出BDV相关抗原，BDV可能与这些神经递质功能异常的疾病存在某种联系。如果能够确认人类的神经精神性疾病与BDV有关，将会极大地帮助人们防治这类危害越来越大的疾病。但BDV对人体的感染致病性还存在很多疑问，需要进一步加以研究证实。由于该病毒对宿主处于持续慢性感染，复制程度低，检测病毒是否存在感染较为困难。因此需要建立高效灵敏和准确的检测技术对BDV进行更加全面的研究。

血清免疫学检测法是利用抗原和抗体之间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对血清中的抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。其中酶联免疫吸附分析法（ELISA）是最常见的测定方法，具有简单、快捷、灵敏等优点，在BDV流行病学检测和临床研究中已经作为一种重要手段，同时也可以结合核酸检测来增大诊断的准确率。

BDV是一种非分节段的单股负链RNA病毒，基因序列总长8.9 kb，基因组开放式读码框（ORF）共编码6种蛋白；其中ORFⅠ编码核蛋白（p40），ORFⅡ编码磷蛋白（p24）。BDV核蛋白在被感染的细胞中含量最丰富、变异程度最小，是进行血清学诊断的主要依据。国内曾有使用ELISA方法检测某些患者血清中的BDV磷蛋白抗体（杨爱英, 张凤民, 李均辉, 等. 用蛋白印迹试验检测精神分裂症患者血清中博尔纳病毒病毒-p24抗体的研究. 中华实验和临床病毒学杂志, 2003, 17(1): 85-87；李永杰, 王得新, 张凤民, 等. 中国慢性疲劳综合征患者血浆中BDV-p24抗体的检测. 中华实验和临床病毒学杂志, 2003, 17(4): 330-333），但目前尚无制备BDV核蛋白单克隆抗体以及相关ELISA检测的报道，由于单克隆抗体的高特异性，使在检测样本中的抗原或循环免疫复合物时具有更高的准确性和可靠性。此外该单克隆抗体尚可用于免疫组化、免疫荧光和动物实验等研究，因此研发BDV核蛋白单克隆抗体和相关的应用技术是相当必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体及其制备方法。本发明还提供了生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其名称为2F6E8,微生物保藏编号为：CCTCC C201116，保藏日期为：2011年4月12日。

本发明利用博尔纳病病毒(BDV)重组核蛋白为免疫原，经过小鼠免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化，建立了稳定分泌抗BDV核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2F6E8克隆株）。经ELISA、免疫印迹等方法的鉴定，杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能特异性地识别BDV核蛋白（序列为SEQ ID NO1）。

的成功制备，为深入研究BDV感染的机制以及相关疾病诊断、治疗奠定了基础，因此本发明还包括所述抗BDV核蛋白的单克隆抗体在制备用于检测博尔纳病病毒的抗体检测试剂的应用。所述检测包括免疫印迹法、间接免疫荧光法和间接ELISA法。所述应用包括：

（1）该抗体作为试剂盒可以测定各种体液如:血液、血浆、脑脊液中BDV感染的水平。

（2）利用该抗体，免疫学方法检测各种组织、细胞中的BDV感染的情况。

（3）利用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离BDV核蛋白。

本发明的优点在于：（1）本发明提供的抗BDV核蛋白单克隆抗体的特异性好，效价高；制备方法简便易行（2）本发明提供的抗BDV核蛋白单克隆抗体可用于BDV的诊断和检测。

附图说明

图1A 间接免疫荧光实验检测核蛋白在BDV感染的OL细胞中的表达；

图1B间接免疫荧光实验检测核蛋白在正常OL细胞中的表达；

图2 Western-Blot实验检测抗BDV核蛋白单克隆抗体与重组核蛋白和天然核蛋白的特异性反应，其中泳道1 为重组核蛋白+抗BDV核蛋白单克隆抗体，泳道2 为BDV感染的OL细胞+抗BDV核蛋白单克隆抗体，泳道3 为正常OL细胞+抗BDV核蛋白单克隆抗体，泳道4 为BDV重组磷蛋白+抗BDV核蛋白单克隆抗体。

具体实施方式

实施例1：BDV重组核蛋白的制备

将p40重组原核表达载体pQE30-p40转化至感受态BL21大肠杆菌中，涂板37℃恒温箱过夜培养，次日挑取单个菌落接种至5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温摇床过夜培养。再取菌液2mL接种至200mL含有氨苄青霉素的LB培养基中, 37℃恒温摇床震荡培养2～3h直至测菌液OD₆₀₀值为0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，继续37℃震荡培养4h，离心后弃上清收集菌体。用20ml缓冲液（50mm/L Tris-Hcl）悬浮菌体，在冰浴下超声裂解直至菌液清亮，离心，使用孔径为0.45μm的滤膜对上清进行过滤。用平衡缓冲液平衡HisTrap^TM纯化柱，然后将过滤后的上清液过纯化柱进行亲和层析纯化，取含20mM Tris-Hcl、50mM咪唑和500mM Nacl的洗涤缓冲液洗去未结合的杂蛋白，然后再洗脱得到纯化的重组核蛋白。进行SDS-PAGE电泳分析蛋白表达形式和纯化效果，将剩余蛋白置-20℃保存。

实施例2：杂交瘤细胞系的建立

步骤1、动物免疫

取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫前，尾静脉采血分离血清用作阴性对照，免疫程序如表1所示。

表1 免疫流程

免疫次数	时间	免疫形式	佐剂添加	抗原剂量
					首次免疫	第1天	皮下多点注射	CFA	100μl/只
第二次免疫	第14天	皮下多点注射	IFA	100μl/只
					第三次免疫	第28天	皮下多点注射	IFA	100μl/只
加强免疫	第45天	腹腔注射	不加佐剂	100μl/只

融合前一天取少量免疫BALB/c小鼠尾静脉血，用间接ELISA法检测免疫小鼠产生的抗体水平，取产生最高抗体水平的小鼠进行后续实验。

步骤2、细胞融合

在融合前2周开始复苏骨髓瘤细胞SP2/0。挑选处于对数生长期、形态良好、活细胞计数高于95%的SP2/0细胞。处死步骤2中挑选的免疫小鼠，在无菌条件下取出其脾脏，采用灌注法制备脾细胞悬液。根据常规细胞融合技术，先将免疫脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞以5：1的比例放于离心管中混匀，并加入不完全培养基中，离心后弃上清，轻弹管壁使沉淀细胞松散。在37℃水育中进行融合。将融合剂（50%PEG4000）1ml滴入离心管中，1分钟加完。再加入1ml无血清1640终止反应，补充无血清1640至40ml。离心后弃上清将沉淀细胞加入95mlHAT培养基中混匀。分铺于预加有饲养细胞（BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞）96孔培养板中，每孔约1ml。5%CO₂、 37℃温箱培育。5天后可见集落生长，2周后HT培养基半量换液，4周后，HT培养基完全换液维持培养。待集落生长至孔面积1/4左右时，取上清，以重组核蛋白为检测抗原，用间接ELISA法检测上清液的抗体水平，进行细胞株筛选。

步骤3、间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞

用0.05mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃(PH 9.6) 包被缓冲液将核蛋白抗原稀释至10mg/L ，每孔100μl加入酶标板中，4℃过夜。次日弃孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗3次，每孔加200μl封闭液于37℃封闭1h，用PBST洗板3次后，每孔加入100μl杂交瘤培养上清，用没有克隆生长孔的上清液做为阴性对照，免疫鼠血清为阳性对照，PBS为空白对照，37℃温育1h。用PBST再次洗板3次后，每孔中加入100μl 1：2500 稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃温育1h， PBST洗板4次，各反应孔中加入TMB底物溶液100μl，37℃温育10min。最后于各反应孔中加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。在ELISA酶标仪上于450nm处以空白对照孔调零后测各孔吸光值（A值）。判定标准为：OD值大于等于阴性对照的2.1倍为阳性。取ELISA结果阳性的克隆做有限稀释，进一步筛选克隆。

步骤4、阳性杂交瘤细胞的克隆化

将上述步骤3得到的克隆以HT培养基稀释至每孔1个细胞，铺于96孔细胞培养板，镜下观察每空实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆且ELISA 鉴定抗体分泌呈阳性，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之，从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F。该杂交瘤细胞株于2011年4月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201116。

实施例3：体外培养法制备单抗

将2F株杂交瘤克隆孔内的细胞吹打下来，分步接种于24孔、6孔及25cm²培养瓶中，每步扩大培养前均做ELISA检测，继续扩大培养。

实施例4：体内诱生腹水法制备单抗

取雌性6-8周龄的BALB/c小鼠，先腹腔注射0.5ml降植烷，1周后腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞5×10⁶个，接种细胞7-10天后可产生腹水。密切观察动物的健康状况和腹水征象，待腹水尽可能多，二小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。3000rpm，离心10min，收集上清，检测抗体阳性后，分装冻存。

实施例5：单抗的纯化

采用亲和纯化法纯化腹水单克隆抗体。先用10倍株床体积的Binding Buffer充分流洗预装有Sepharose-protein G的纯化柱。将实施例4所述的小鼠腹水用Binding Buffer稀释4倍，10000rpm离心30min，去除沉淀后上柱，流速8-10滴/min。重复上柱流穿。用20倍柱床体积的Binding Buffer充分洗涤后，再用Elution Buffer洗脱结合的单克隆抗体，装于预加有0.1ml的磷酸钾缓冲液的收集管中，每管0.5ml。通过A280nm检测洗脱液的吸光度，选择吸光值大于0.2的洗脱液进行透析，共透析48h。将纯化的抗体分装小管后置于-20℃低温保存。

实施例6：单克隆抗体的特性鉴定

步骤1、单克隆抗体的效价测定（腹水）

用PBS缓冲液倍比稀释实施例4中所述的腹水，以重组核蛋白为检测抗原，间接ELISA法（同实施例2步骤3）测定抗体效价，同时以SP2/0细胞培养上清作为阴性对照，免疫小鼠血清为阳性对照。以阳性孔的最大稀释度为该单抗的腹水效价。结果测得腹水ELISA效价为1:32000以上。

步骤2、单克隆抗体IgG亚类鉴定

取F2株杂交瘤细胞培养上清，利用SBA公司抗体亚型测定试剂盒测定其的Ig亚型。结果显示，单克隆抗体的重链为IgG2a,轻链为κ。

步骤3、单抗稳定性的测定

复苏杂交瘤细胞，收集不同传代次数的细胞上清，并用ELISA方法检测其效价。结果表明2F6E8细胞株能够稳定地产生单克隆抗体。

步骤4、单抗的特异性的测定

（1）间接免疫荧光染色法

将持续感染BDV的OL细胞涂片，以正常OL细胞为对照。移去培养基后，PBS洗片3次，每次3min。用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗片3次。加入0.2%Triton-X100破膜30min，PBS洗片3次。加入5%BSA封闭10min。实施例5所述的单克隆抗体（用PBS缓冲液1：500稀释）作为一抗加入，4℃水盒孵育过夜。次日用PBS洗片3次；避光，滴加FITC标记羊抗小鼠二抗（用PBS缓冲液1：50稀释），37℃孵育1h；PBS洗片3次。用蓝绿激发绿光在荧光显微镜下观察结果并拍照。结果如图1所示：可见细胞核内有明亮的绿色局灶性荧光点，与文献中报道的核蛋白主要在细胞核中分布的结果相一致，说明该单抗能和天然的核蛋白特异性的结合。

（2） Western-Blot免疫印迹法

取BDV感染的OL细胞和正常的OL细胞，使用蛋白提取试剂盒裂解细胞并分别提取细胞蛋白，将提取的蛋白和纯化的重组BDV核蛋白各取20μl，加入5×Loading buffer煮沸5min进行蛋白变性，离心后各取上清2μl上样行SDS-PAGE电泳（100V，2h），根据预染Marker将目的条带切下，电转移至PVDF膜上（100V，75min），用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入实施例5所述的单克隆抗体（用TBST缓冲液配制的封闭液1：5000稀释）作为一抗4℃缓慢摇动过夜。次日用TBST缓冲液室温下洗膜3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（用TBST缓冲液配制的封闭液1：2000稀释）作为二抗37℃孵育1h后洗膜3次，用ECL发光试剂盒发光并使用凝胶成像仪拍照保存。结果如图2所示，该单抗能特异性识别重组核蛋白和BDV感染的OL细胞蛋白，而正常OL细胞蛋白未出现特异性条带。

（3）间接ELISA方法

将实施例5制备的纯化单克隆抗体倍比稀释后用间接ELISA检测。方法同实施例2步骤3，同时用BDV病毒重组磷蛋白，疱疹病毒感染OL细胞提取蛋白(HSV-OL)作为对照。如表1所示，对比多抗，该单抗针对核蛋白更有特异性，对磷蛋白及疱疹病毒感染OL细胞无交叉反应。

表2 ELISA检测2F单抗与BDV核蛋白特异性反应

间接免疫荧光、ELISA和Western-Blot的结果都证明了2F6E8杂交瘤细胞株产生的抗BDV核蛋白单克隆抗体能特异性识别重组及天然核蛋白，因此该抗体可以应用到检测博尔纳病病毒相关试剂盒中，从而为临床诊断和流行病调查奠定基础。同时利用该单抗和BDV核蛋白能特异性结合的特点，可以将该单抗制备免疫亲和层析柱，来分离BDV核蛋白。

<110> 重庆医科大学

<120> 抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 1

<210> 1

<211> 370

<212> 氨基酸

<213> 人工序列(SEQ ID NO1)

<400> 1

MPPKRRLVDD ADAMEDQDLY EPPASLPKLP GKFLQYTVGG SDPHPGIGHE KDIRQSAVAL 60

LDQSRRDMFH TVTPSLVFLC LLIPGLHAAF VHGGVPRESY LSTPVTRGEQ TVVKTAKFYG 120

EKTTQRDLTE LEISSIFSHC CSLLIGVVIG SSSKIKAGAE QIKKRFKTMM AALNRPSHGE 180

TATLLQMFNP HEAIDWINGQ PWVGSFVLSL LTTDFESPGK EFMDQIKLVA SYAQMTTYTT 240

IKEYLAECMD ATLTIPVVAY EIRDFLEVSA KLKEEHADLF PFLGAIRHPD AIKLAPRSFP 300

NLASAAFYWS KKENPTMAGY RASTIQPGAS VKETQLARYR RREISRGEDG AELSGEVSAI 360

MKMIGVTGLN 370

Claims

1. 一株由中国典型培养物保藏中心保藏的分泌抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其名称为2F6E8,微生物保藏编号为：CCTCC C201116，保藏日期为：2011年4月12日。

2.一种抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。

3.根据权利要求2所述的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是博尔纳病病毒核蛋白，该蛋白的序列为SEQ ID NO1，分子量为40KD。

4.一种制备抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体的方法，其特征在于：所述的方法是从以制备博尔纳病病毒分子量为40KD的重组核蛋白为抗原开始，采用免疫学方法产生融合的杂交瘤细胞；再采用免疫学的检测筛选方法，筛选出抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体。

5.根据权利要求2或3所述的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体在制备用于检测博尔纳病病毒的抗体检测试剂的应用，所述检测包括免疫印迹法、间接免疫荧光法和间接ELISA法。