CN102653557A - 抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法，所述的多克隆抗体能特异性结合博尔纳病病毒磷蛋白抗原。所述抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法,是制备重组博尔纳病病毒磷蛋白，将其免疫新西兰大白兔，制备抗血清，获得多克隆抗体。抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体在制备用于检测博尔纳病病毒的抗体检测试剂的应用，所述检测包括免疫印迹法、间接免疫荧光法和间接ELISA法。本发明提供的抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的特异性好，效价高；制备方法简便易行。

Description

抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及多克隆抗体，尤其涉及一种抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体，还涉及分泌多克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该多克隆抗体在博尔纳病病毒检测中的应用。

背景技术

博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）是一种具有高度嗜神经性的病毒，宿主几乎涵盖了所有的温血动物。被感染宿主表现出以明显精神、行为异常为特征的神经精神性症状，这与某些人类精神障碍的症状极为相似。美国、英国和日本等地的调查显示，在精神分裂症、抑郁症、双相情感障碍等疾病患者外周血液中可以检测出BDV相关抗原，BDV可能与这些神经递质功能异常的疾病存在某种联系。如果能够确认人类的神经精神性疾病与BDV有关，将会极大地帮助人们防治这类危害越来越大的疾病。但BDV对人体的感染致病性还存在很多疑问，需要进一步加以研究证实。由于该病毒对宿主处于持续慢性感染，复制程度低，检测病毒是否存在感染较为困难。因此需要建立高效灵敏和准确的检测技术对BDV进行更加全面的研究。

血清免疫学检测法是利用抗原和抗体之间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对血清中的抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。其中酶联免疫吸附分析法（ELISA）是最常见的测定方法，具有简单、快捷、灵敏等优点，在BDV流行病学检测和临床研究中已经作为一种重要手段，同时也可以结合核酸检测来增大诊断的准确率。

BDV的基因序列总长8.9 kb，是一种单股负链非分节段的RNA病毒，基因组开放式读码框（ORF）编码6种蛋白；其中ORFⅠ编码核蛋白（p40）和ORFⅡ编码磷蛋白（p24）是主要致病蛋白。BDV磷蛋白在被感染的细胞中含量丰富、变异程度最小，是进行血清学诊断的主要依据。国内曾有使用定量PCR方法检测某些动物血液中的BDV磷蛋白（p24）核酸片段（何丰,冯裕星,孙后超等.新疆伊犁地区动物脑组织博尔纳病病毒p24基因片段的检测[J].中华微生物学和免疫学杂志,2010,30(1):31-35. 展群领,张英英,徐鸣明等.新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒自然感染调查[J].中华流行病学杂志。但目前尚无制备BDV磷蛋白多克隆抗体以及相关ELISA检测的报道，由于ELISA检测适合临床多样本检测且特异性高，使在检测样本中的抗原或循环免疫复合物时具有更高的准确性和可靠性。此外该多克隆抗体尚可用于免疫组化、免疫荧光和动物实验等研究，因此研发BDV磷蛋白多克隆抗体和相关的应用技术是相当必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体及其制备方法。

本发明采用如下技术方案：一种抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将博尔纳病病毒磷蛋白原核表达载体pET41a-p24转化至感受态大肠杆菌中，培养，诱导，裂解，纯化，制得重组博尔纳病病毒磷蛋白。

步骤二，以步骤一中重组博尔纳病病毒磷蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清。

步骤三，纯化抗血清，即得。

步骤一中所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21（DE3）。所述诱导所用的诱导剂为IPTG。所述裂解是在冰浴下超声裂解直至菌液透彻清亮。

利用上述方法制备的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

一种检测博尔纳病病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括上述的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

进一步，所述间接免疫荧光检测试剂盒还包括间接免疫荧光检测方法通常用的试剂，该试剂盒能特异结合博尔纳病病毒分泌磷蛋白抗原，鉴定博尔纳病病毒磷蛋白的细胞定位。

一种检测博尔纳病病毒的ELISA试剂盒，包括上述的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

进一步，所述ELISA试剂盒还包括ELISA常用的试剂，该试剂盒能精确检测血浆、脑脊液及组织中博尔纳病病毒分泌的磷蛋白抗原。

一种检测博尔纳病病毒的Western-Blot试剂盒，包括上述的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

进一步，所述Western-Blot试剂盒还包括Western-Blot常用的试剂，该试剂盒能够检测组织、细胞、血浆、脑脊液中博尔纳病病毒分泌的磷蛋白抗原，用于检测博尔纳病毒感染。

本发明成功制备了BDV磷蛋白多克隆抗体，为深入研究DBV感染的机制以及相关疾病的诊断、治疗奠定了基础。

本发明的优点是：（1）本发明提供的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的特异性好，效价高，制备方法简单易行；（2）本发明供的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体可用于DVB的检测。

附图说明

图1为间接免疫荧光实验检测磷蛋白在BDV感染的OL细胞中的表达；

图2为间接免疫荧光实验检测磷蛋白在正常OL细胞中的表达；

图3为Western-Blot实验检测抗BDV磷蛋白多克隆抗体与重组磷蛋白和天然磷蛋白的特异性反应；

图中，1为重组磷蛋白+抗BDV磷蛋白多克隆抗体，2 为BDV感染的OL细胞+抗BDV磷蛋白多克隆抗体，3 为正常OL细胞+抗BDV磷蛋白多克隆抗体，4 为BDV重组核蛋白+抗BDV磷蛋白多克隆抗体。

具体实施方式

实施例1：BDV重组磷蛋白的制备

步骤1、蛋白诱导表达条件的优化

用博尔纳病病毒的ORFⅡ基因和pET41a质粒(购买于德国Novagen公司)采用重组质粒的常用构建方法，构建p24重组原核表达载体pET41a-p24，然后将p24重组原核表达载体pET41a-p24转化至感受态BL21（DE3）大肠杆菌中，卡那霉素抗性筛选，37℃恒温箱过夜培养，次日挑取单菌落，接种到5mL含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃ 220r/min摇床过夜培养，次日取50μL菌液接种到5管5mL含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃ 220r/min摇床培养3小时左右直到测菌液OD600值为0.6，这时在4管中分别加入IPTG至终浓度为0.5、1、1.5、2mmol/L进行诱导表达，同时设1管不加入IPTG作为阴性对照，继续恒温摇床振荡培养，在4、8和16小时分别收集1mL菌液，将菌液13000r/min离心1min，弃上清，用5×Loading buffer重悬沉淀，煮沸变性5分钟后进行SDS-PAGE凝胶电泳初步分析诱导条件对蛋白表达量的影响。

步骤2、重组蛋白的纯化

重新挑单菌落过夜培养，次日取2ml菌液接种到200mL LB培养基中，按2mmol/L 的IPTG诱导4小时进行表达，离心后弃上清，用20mL缓冲液（50mmol/L  Tris-HCl，PH值8.0）悬浮菌体，在冰浴下超声裂解直至菌液透彻清亮，12000r/min离心5分钟，使用孔径为0.45μm的滤膜对上清进行过滤。用平衡缓冲液平衡纯化柱，然后将过滤后的上清液过纯化柱进行亲和层析纯化，取含20mmol/L Tris-HCl（PH 8.0）、50mmol/L 咪唑和500mmol/L NaCl的洗涤缓冲液洗去未结合的杂蛋白，最后取含20mmol/L Tris-HCl（PH 8.0）、500mmol/L 咪唑和500mmol/L NaCl的洗脱缓冲液洗脱得到纯化的p24重组蛋白，取20μL纯化蛋白变性上样进行SDS-PAGE电泳分析蛋白表达形式和纯化效果，将剩余蛋白置-20℃保存。

实施例2：抗体制备

步骤1、免疫和注射

准备两只雄性8 周龄大的清洁级新西兰大白兔，每只约3 kg。用生理盐水稀释免疫原（0.5mg/家兔），然后与弗氏完全佐剂（CFA）进行1：1混合，用3mL注射器抽取该乳化液，抗原（实施例1获得的p24重组蛋白）和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位(一般在背部或腿后部)进行皮下注射，每个区域大约用1/4（0.125mg）的免疫原，保证免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。首次免疫前，尾静脉采血分离血清用作阴性对照，免疫程序如表1所示。

表1 免疫流程

免疫次数	时间	免疫形式	佐剂添加	抗原剂量
					首次免疫	第1天	皮下多点注射	CFA	500μg/只
第二次免疫	第14天	皮下多点注射	IFA	500μg/只
					第三次免疫	第35天	皮下多点注射	IFA	500μg/只
第四次免疫	第56天	腹腔注射	不加佐剂	500μg/只

弗氏完全佐剂：是一种油包水的乳浊液（Paraffin Oil），能够非常有效的诱导产生高滴度的抗体。弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，可以加强对抗原的抗体反应。弗氏不完全佐剂：在弗氏完全佐剂（Paraffin Oil 85%）中加入了结核分枝杆菌成分（Arlacel A 15%）。

步骤2、取血

将新西兰大白兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳缘静脉的上中部，用刀片倾斜45度在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。将血液在37℃恒温箱中放置30分钟，再在4℃放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4℃，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清。

步骤3、抗体纯化

首先是准备BDV磷蛋白（P24）sepharose CL-4B亲和柱。通常准备5mL或10 mL BDV磷蛋白（P24）sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15min以除去填料中的气泡，否则在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将BDV磷蛋白（P24）sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1 mL/min-2 mL/min，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。其次是制备抗血清，将抗血清放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37℃预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4℃，15,000xg离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂肪。

将抗血清用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以0.5 mL/min的速度将抗血清加入柱中,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至A（280nm）<0.008 后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100uL中和缓冲溶液的1.5 mL EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。在柱中加入10mL,pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至A（280nm）<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/mL可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2℃-8℃保存。

实施例3：多克隆抗体特异性的测定

间接免疫荧光染色法

将持续感染BDV的OL细胞涂片，以正常OL细胞为对照。移去培养基后，PBS洗片3次，每次3min。用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗片3次。加入0.2%Triton-X100破膜30min，PBS洗片3次。加入5%BSA封闭10min。实施例2所述的多克隆抗体（用PBS缓冲液1：200稀释）作为一抗加入，4℃水盒孵育过夜。次日用PBS洗片3次；避光，滴加FITC标记羊抗兔二抗（用PBS缓冲液1：50稀释），37℃孵育1h；PBS洗片3次。用蓝绿激发绿光在荧光显微镜下观察结果并拍照。结果如图1，图2所示：可见细胞核内有明亮的绿色局灶性荧光点，与文献中报道的磷蛋白主要在细胞核中分布的结果相一致，说明该多抗能和天然的磷蛋白特异性的结合。

免疫印迹法

取BDV感染的OL细胞和正常的OL细胞，使用蛋白提取试剂盒裂解细胞并分别提取细胞蛋白，将提取的蛋白和纯化的重组BDV磷蛋白各取20μL，加入5×Loading buffer煮沸5min进行蛋白变性，离心后各取上清2μL上样行SDS-PAGE电泳（100V，2h），根据预染Marker将目的条带切下，电转移至PVDF膜上（100V，75min），用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入实施例2所述的多克隆抗体（用TBST缓冲液配制的封闭液1：5000稀释）作为一抗4℃缓慢摇动过夜。次日用TBST缓冲液室温下洗膜3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（用TBST缓冲液配制的封闭液1：2000稀释）作为二抗37℃孵育1h后洗膜3次，用ECL发光试剂盒发光并使用凝胶成像仪拍照保存。结果如图3所示，该多抗能特异性识别重组磷蛋白和BDV感染的OL细胞蛋白，而正常OL细胞蛋白未出现特异性条带。

间接ELISA方法

用0.05mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃(PH 9.6) 包被缓冲液分别将博尔纳磷蛋白抗原、博尔纳核蛋白抗原和单纯疱疹病毒感染OL细胞提取蛋白(HSV-OL)稀释至10mg/L，每孔100μL加入酶标板中，4℃过夜。次日弃孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗3次，每孔加200μL封闭液于37℃封闭1h，用PBST洗板3次后，每孔加入100μL兔抗血清，用免疫前血清做为阴性对照，免疫兔血清为阳性对照，PBS为空白对照，37℃温育1h。用PBST再次洗板3次后，每孔中加入100μL 1：2500 稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃温育1h， PBST洗板4次，各反应孔中加入TMB底物溶液100μL，37℃温育10min。最后于各反应孔中加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。在ELISA酶标仪上于450nm处以空白对照孔调零后测各孔吸光值（A值）。判定标准为：OD值大于等于阴性对照的2.1倍为阳性。如表2所示，博尔纳P24多抗对博尔纳磷蛋白抗原更有特异性，对核蛋白及疱疹病毒感染OL细胞无交叉反应。

表2      ELISA检测多抗与BDV磷蛋白特异性反应

                                                 

间接免疫荧光、ELISA和Western-Blot的结果都证明了重组磷蛋白pET41a-p24抗原免疫兔产生的抗BDV磷蛋白多克隆抗体能特异性识别重组及天然磷蛋白，因此该抗体可以应用到检测博尔纳病病毒相关试剂盒中，从而为临床诊断和流行病调查奠定基础。同时利用该多抗和BDV磷蛋白能特异性结合的特点，可以将该多抗制备免疫亲和层析柱，来分离BDV磷蛋白。

Claims (8)

1.一种抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将博尔纳病病毒磷蛋白原核表达载体pET41a-p24转化至感受态大肠杆菌中，培养，诱导，裂解，纯化，制得重组博尔纳病病毒磷蛋白；

步骤二，以步骤一中重组博尔纳病病毒磷蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；

步骤三，纯化抗血清，即得。

2.根据权利要求1所述抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤一中所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21（DE3）。

3.根据权利要求1所述抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤一中所述诱导所用的诱导剂为IPTG。

4.根据权利要求1所述抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤一中所述裂解是在冰浴下超声裂解直至菌液透彻清亮。

5.利用权利要求1～4任一项所述方法制备的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

6.一种检测博尔纳病病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求5所述的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

7.一种检测博尔纳病病毒的ELISA试剂盒，其特征在于：包括权利要求5所述的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

8.一种检测博尔纳病病毒的Western-Blot试剂盒，其特征在于：包括权利要求5所述的抗博尔纳病病毒磷蛋白的多克隆抗体。

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