CN102559605A

CN102559605A - 一种羊口疮病毒蛋白orfv059单克隆抗体杂交瘤a3及单克隆抗体

Info

Publication number: CN102559605A
Application number: CN2012100173764A
Authority: CN
Inventors: 罗树红; 郝文波; 李宏; 廖小青; 李明
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤A3及单克隆抗体。一种抗羊口疮病毒ORFV059单克隆抗体杂交瘤细胞株A3，于2011年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5424。本发明以重组ORFV059蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对纯化的羊口疮病毒蛋白进行Western-blot证明该抗体可以识别ORFV059蛋白。本发明将此纯化抗体用于进行羊口疮病毒的免疫荧光染色以及羊口疮组织的免疫组化染色证明其能识别天然的ORFV059蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究的ORFV059功能和开发ORFV059的诊断试剂奠定了基础，为其作为羊口疮临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。

Description

一种羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤A3及单克隆抗体

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及羊口疮病毒结构蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤细胞株A3及单克隆抗体。

背景技术

羊传染性脓疱病（Orf）又称羊传染性脓疱性炎，俗称羊口疮，是由羊口疮病毒（ORFV）引起的山羊和绵羊的一种急性、接触性传染病。其病变特征是患羊口唇等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状结痂。羔羊极易感，多群发。本病在世界各地均有发生，我国主要养羊区也较常见，是危害羊群的主要疾病之一。该病毒抵抗力强，羊群一旦被感染则不易清除，可持续危害羊群多年，给畜牧业造成重大经济损失。

ORFV病毒属痘病毒科，副痘病毒属。病毒粒子呈砖形或椭圆形，其表面呈绳索样纵横交错排列结构。该病毒可在牛、绵羊、山羊的肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞上生长，并产生细胞病变。ORFV引发病灶的病理组织学特征包括角化细胞的空泡变化、肿胀，细胞间质玻璃样变性，表皮增生显著, 表皮内微肿胀，皮下组织中性粒细胞、树突状细胞(DCs)、T细胞和B细胞聚集。

羊口疮分布广泛，传染性强，一旦爆发会造成严重的经济损失。病毒在病变部位持续存在，患病动物易重复感染，目前无有效疫苗，防控困难。因此，羊口疮病毒的早期、准确检出对于疾病的控制和预防具有重要的意义。兽医临床上羊口疮病的诊断主要根据其典型症状进行诊断，但无法与口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）和羊痘（Capripox）区分。目前所采用的实验室诊断方法分为，(1) 免疫学方法，如ELISA, Western blotting等; (2) 病理组织学方法，如免疫组织化学（IHC）等; (3)分子生物学方法，如PCR和限制性片段长度多态性（RFLP）分析等。其中以免疫学诊断方法最为重要，因其具有灵敏、快速、准确的特点，而特异性的抗体尤其是单克隆抗体是免疫学诊断中最重要的工具。近年，在我国吉林省和甘肃省的羊群中几次爆发羊口疮疫情，由于特异性抗体的缺乏，疾病控制和进一步研究工作无法有效开展。

ORFV基因组全长约138kb，G+C含量丰富（63%-64%），含132个基因。通过对羊口疮病毒不同株(系)的基因组分析表明，ORFV059基因编码的是一个免疫显性蛋白。该蛋白定位于成熟病毒粒子胞膜，是C端锚定蛋白, 与痘苗病毒H3L免疫显性蛋白结构相似，它在病毒成熟、吸附、致病的分子机制以及疾病诊断和亚单位疫苗研发等过程中具有重要作用。因此，ORFV059有作为潜在的临床诊断靶标的可能，制备ORFV059的单克隆抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研究奠定基础，同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。

由于ORFV059定位于成熟病毒粒子胞膜，通常在组织标本中表达量较高，具有临床检测和验证的价值。由此，制备能用于临床标本免疫组化检测的ORFV059单克隆抗体进行大批量组织标本的验证，可为其作为羊口疮临床诊断靶标的验证提供有力工具。

本发明具有以下的特点和优势：

目前国内外尚未有商品化ORFV059的抗体，且其单抗亚型为IgG2b型，能用于ELISA、western-blot、免疫荧光以及免疫组织化学检测，从而为该蛋白作为临床靶标验证及其功能的研究奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot、免疫荧光以及免疫组织化学检测的抗羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的检测羊口疮病毒蛋白ORFV059的抗体是用原核重组表达的ORFV059蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株A3，杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG2b阳性，轻链为κ型。所述抗羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤A3，于2011年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5424。

本发明中羊口疮病毒蛋白ORFV059的氨基酸序列为AAR98154，如SEQ ID NO：1所示。本发明中羊口疮病毒蛋白ORFV059的基因序列为AY386263，如SEQ ID NO：2所示。

本发明中ORFV059的全长基因是由羊口疮病毒基因组为模板, 由PCR扩增获得。扩增ORFV059基因的引物序列为：上游引物：5’-CATTAAC CATGGATCCACCCGAAATCACGGC-3’（SEQ ID NO：3），下游引物：5'- AATCATCTCGAGCACGATGGCCGTGACCAGCAGC-3’（SEQ ID NO：4）。上游引入NcoI 内切酶位点，下游引入XhoI内切酶位点。原核表达载体选择pET-28a（+）。

所述的保藏号为CGMCC No.5424的杂交瘤细胞株A3的制备方法是：取血清效价大于1:10⁵的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50% PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用重组表达的ORFV059蛋白包被ELISA板，进行ELISA 筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗ORFV059单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为A3。应用此株杂交瘤细胞以1×10⁶/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。

与现有技术相比，本发明特色如下：

本发明以重组ORFV059蛋白包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对纯化的羊口疮病毒蛋白进行Western-blot证明该抗体可以识别ORFV059蛋白。

本发明将此纯化抗体用于进行羊口疮病毒的免疫荧光染色以及羊口疮组织的免疫组化染色证明其能识别天然的ORFV059蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研究的ORFV059功能和开发ORFV059的诊断试剂奠定了基础，为其作为羊口疮临床诊断和治疗靶标的验证提供有力的工具。

本发明的单克隆抗体其免疫原是原核重组表达ORFV059全长蛋白，其氨基酸序列为AAR98154，全长338个氨基酸。本发明的单克隆抗体除了能应用于ELISA 和Western检测变性ORFV059蛋白以外还可以应用于细胞免疫荧光和临床羊口疮组织标本免疫组化研究检测未变性的天然ORFV059蛋白，同时降低了应用成本。本发明的单克隆抗体能特异性识别多种羊口疮病毒分离株的ORFV059蛋白，与痘病毒科的其它病毒，如羊痘病毒、鸡痘病毒、痘苗病毒等无交叉反应。目前国内外尚无针对羊口疮病毒特异性抗体，而本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合，还能与具有高级结构的天然蛋白结合，从而能应用于免疫荧光和免疫组化实验。本发明针对ORFV059全长蛋白制备出的单克隆抗体对检测该蛋白具有较高的特异性和灵敏度，该抗体的应用将为ORFV059功能研究和其作为羊口疮标志物的临床标本验证工作提供支持。

附图说明

图1 是本发明单抗A3对羊口疮病毒免疫印迹的结果, 其结合条带的分子量约为39kDa。1.10μg OFTu细胞裂解蛋白；2. 2μg纯化重组ORFV059蛋白；3. 2μg纯化病毒蛋白。

图2 是本发明单抗A3对羊口疮病毒免疫荧光染色的结果，5 MOI羊口疮病毒感染OFTu细胞，分别于接种后12和24小时收集细胞，4%多聚甲醛固定，先后用单抗A3及绿色荧光标记的羊抗鼠二抗孵育，DAPI染色，荧光显微镜下观察结果。

图3 是本发明单抗A3对羊口疮病变组织免疫组织化学染色的结果，A. 抗ORFV059单克隆抗体A3，B.正常鼠血清（阴性对照），（显微镜放大倍数400倍）。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1 本发明单克隆抗体的制备和鉴定

1、单抗A3的制备

1）重组ORFV059抗原制备

以羊口疮病毒基因组为模板, 经PCR扩增获得全长ORFV059基因，构建原核重组表达载体pET28a(+)/ORFV059，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达，利用Ni Sepharose亲和层析纯化柱进行纯化，获得纯度达90%以上的重组ORFV059蛋白。

2）免疫小鼠

以纯化的重组抗原免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。

第一次免疫：取重组抗原与等体积的Bentonite佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔内注射BALB/c小鼠；

第二次免疫：隔2周后，取重组抗原与等体积的Bentonite佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔内注射BALB/c小鼠；

第三次免疫：再隔2周后，取重组抗原与等体积的Bentonite佐剂混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取血，以重组抗原包被，ELISA检测血清效价，取效价大于1:10⁵的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；

Bentonite佐剂使用商品化产品。

3）免疫血清效价测定

采用间接 ELISA法测定免疫血清效价。取50μg重组ORFV059蛋白溶解于10ml 0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。使用PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS进行10^-2～10^-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔 37℃ 1h，PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（Sigma,INC.），100μl/孔37℃30min，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2M H₂SO₂终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。

4）杂交瘤的制备

取血清效价大于1:10⁵的小鼠，融合前3天，取重组抗原与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1：1的比例混合，1000×g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃ 水浴中，将在37℃ 水浴保温的50%聚乙二醇（PEG，MW4000，Sigma）用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37℃ 预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000×g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液（次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）（HAT，Sigma））轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液（次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）（HT，Sigma））培养。

5）筛选分泌抗ORFV059单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100%细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗ORFV059单克隆抗体细胞株，标记为A3。将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。

6）腹水的制备和纯化

将A3杂交瘤细胞株以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。

2、本发明单克隆抗体的特性鉴定

1）抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞CGMCC No.5424制备的腹水经纯化后获得ORFV059单克隆抗体A3，使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度为0.51mg/ml。

2）抗体亚型鉴定：采用Roche公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，A3分泌抗体的亚型为IgG2b型，轻链为κ链。

3）纯化抗体的效价鉴定：50μg重组ORFV059抗原溶于10ml pH9.6 的0.05M 碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，每孔加入100μl纯化抗体，37℃孵育1h，PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS（含有0.05% (V/V) Tween-20）洗板三次，每孔加入100μl， TMB显色，37℃孵育15min后，加入2M H₂SO₄溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450 nm处检测。

4）抗体的Western blot鉴定：OFTu细胞裂解蛋白、纯化的羊口疮病毒蛋白及重组ORFV059蛋白用2×SDS裂解缓冲液裂解后上样，经12%SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，pH7.4的Tris-HCl缓冲液（含有0.1% (V/V) Tween-20）洗膜3次，每次5min，1:1000加入经纯化的杂交瘤细胞CGMCC No.5424制备的抗ORFV059单克隆抗体A3，4℃ 孵育过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液（含有0. 1% (V/V) Tween-20）洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体（Sigma）为二抗，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml Pierce-Thermo Scientific ECL系列Western化学发光底物反应液（A:B=1:1），使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤细胞CGMCC No.5424制备的抗ORFV059单克隆抗体A3出现单一的特异性条带，结果如图1所示。

5）抗体的免疫荧光鉴定：收集原代绵羊胎儿鼻甲骨(OFTu)细胞铺于玻璃片上生长过夜，羊口疮病毒（ORFV）感染（MOI=5），分别于12、24h后收集细胞, PBS洗涤细胞，使用预冷的多聚甲醛固定细胞，加入杂交瘤细胞CGMCC No.5424制备的抗ORFV059单克隆抗体A3（1:1000稀释），室温孵育1h，以PBS为阴性对照。PBS洗片后1:1000加入Alex 594（红色荧光）标记的羊抗鼠二抗（Sigma），室温孵育1h，DAPI（蓝色）染色10min, PBS洗片后，荧光显微镜下观察，经抗ORFV059单克隆抗体A3染色的细胞均观察到绿色荧光，如图2所示。结果证明杂交瘤细胞CGMCC No.5424制备的抗ORFV059单克隆抗体A3可识别天然的ORFV059蛋白。

6）抗体的免疫组化(IHC)鉴定：收集患羊病变组织，利用纯化后的杂交瘤细胞CGMCC No.5424制备的抗ORFV059单克隆抗体A3（1:1000稀释）进行免疫组化染色，使用福建迈新公司的免疫组化试剂盒，染色方法参照迈新试剂盒说明书，DAB显色，阴性对照组以正常鼠血清代替一抗，结果发现经抗ORFV059单克隆抗体A3染色的组织标本上细胞被染成棕黄色，如图3所示。病变组织的免疫组化染色结果证明杂交瘤细胞CGMCC No.5424制备的抗ORFV059单克隆抗体A3可识别天然的ORFV059蛋白。

7）抗体对不同羊口疮病毒分离株和其它痘病毒的反应性检测：采用ELISA和IHC方法检测抗ORFV059单克隆抗体A3对不同羊口疮病毒分离株和其它种属痘病毒的反应性。结果如表1所示，抗ORFV059单克隆抗体A3能识别从中国分离的各不同地区的ORFV分离株以及美国标准ORFV分离株OV-IA82，而与其它种属的痘病毒，如痘苗病毒、羊痘病毒和鸡痘病毒无交叉反应。

表1. 本发明单抗A3对不同羊口疮病毒分离株和其它痘病毒的反应性

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种羊口疮病毒蛋白ORFV059单克隆抗体杂交瘤A3及单克隆抗体

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 336

<212> PRT

<213> 羊口疮病毒

<400> 1

Met Asp Pro Pro Glu Ile Thr Ala Tyr Ile Ile Gly Val Ala Glu Gly

1 5 10 15

Arg Gly Thr Lys Glu Val Phe Pro Thr Leu Pro Tyr Leu Val Gly Leu

20 25 30

Ala Asp Asp Pro Pro Lys Pro Gln Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ser

35 40 45

Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ser

50 55 60

Pro Pro Ala Pro His Pro Lys Gly Asp His Val Leu Lys Ala Val Glu

65 70 75 80

Trp Lys Asp Val Asp Ser Lys Asp Tyr Pro His Phe Phe Thr Asp Met

85 90 95

Cys Lys Ser Thr Cys Pro Lys Glu Met Gln Arg Arg Ala Ala His His

100 105 110

Leu Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Gly Thr Val Ser Thr Lys Tyr

115 120 125

Ser Asp Asp Asp Ile Val Leu Val Val Asp Asn Asp Met Thr Leu Arg

130 135 140

Lys Pro Glu Met Val Lys Pro Leu Ile Glu Ala Met Arg Thr Asn Gly

145 150 155 160

Trp Tyr Met Ala Gln Leu Lys Glu Thr Tyr Met Thr Gly Ala Leu Ala

165 170 175

Thr Asn Val Pro Gly Thr Gly Asp Pro Glu Leu Met Val Tyr Pro Gly

180 185 190

Gly Tyr Asp Val Ser Leu Asp Ala Tyr Ile Ile Asn Val Gly Gly Met

195 200 205

Lys Lys Leu Tyr Asp Ala Ile Ile Lys Glu Gly Gly Leu Arg Ser Gly

210 215 220

Leu Leu Thr Glu Val Phe Thr Leu Glu Lys Arg Leu Ser Leu Ala Arg

225 230 235 240

Val Val Leu Ser Gly Ala Glu Gln Val Val Tyr Pro Glu Tyr Tyr Ile

245 250 255

Gln Val Lys Thr Arg Leu Ser Gly Ala Pro Ser Leu Trp Ser Leu Leu

260 265 270

Ala Thr Trp Leu Ala Arg Phe Trp Pro Gly Ala Ile Tyr Phe Leu Thr

275 280 285

Thr Pro Leu Phe Ser Phe Met Gly Leu Phe Asp Val Asp Val Val Asp

290 295 300

Ile Phe Ile Leu Ala Tyr Leu Leu Val Leu Val Leu Leu Leu Pro Asn

305 310 315 320

Ser Arg Leu Leu Trp Phe Ile Ala Gly Leu Leu Val Thr Ala Ile Val

325 330 335

<210> 2

<211> 1011

<212> DNA

<213> 羊口疮病毒

<400> 2

atggatccac ccgaaatcac ggcctacata atcggggttg ccgaaggccg cgggaccaag 60

gaggtgttcc ccacgctgcc gtacctggtg ggcctcgccg acgacccgcc caagcctcaa 120

cccgcaccta agcctgctcc ctctcctgcg ccggcccccg caccggcccc cgcgccagca 180

cccaagccat ctcctcccgc gccgcacccc aagggcgacc acgtgctcaa ggcggtggaa 240

tggaaagacg ttgactccaa agactacccg cacttcttca cggacatgtg caagtccacg 300

tgtccgaagg agatgcagcg ccgcgcggca caccacctca acctctggga gagcatatcg 360

gccggcaccg tctccaccaa gtactccgac gatgacatcg tcctggtggt cgacaacgac 420

atgaccctcc gcaagcccga gatggtaaag ccgctcatcg aggcgatgag gacgaacggc 480

tggtacatgg cgcagctcaa ggagacctac atgaccggcg cgctggccac caacgtcccc 540

ggcaccggcg accccgagct catggtctac cccggcgggt acgacgtctc gctagacgcc 600

tacatcatca acgtcggcgg catgaagaag ctctacgacg cgatcatcaa ggagggaggg 660

ctgcgcagcg gcctgctcac cgaggtgttc acgctggaga agcggctctc tctggcgcgc 720

gtggtgctct ccggcgccga gcaggtggtc taccccgagt actacataca ggtgaagacg 780

cggctaagcg gcgcgccctc cctgtggtcg ctgctcgcca cgtggctggc gcgcttctgg 840

cccggcgcca tctacttcct caccacgccg ctcttctcct tcatggggct cttcgacgtg 900

gacgtggtcg acatcttcat cctggcatac ctgctggtgc tcgtgctgct gctgccgaac 960

tcgcggctgc tgtggttcat cgccgggctg ctggtcacgg ccatcgtgtg a 1011

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

cattaaccat ggatccaccc gaaatcacgg c 31

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

aatcatctcg agcacgatgg ccgtgaccag cagc 34

Claims

1.一种抗羊口疮病毒ORFV059单克隆抗体杂交瘤细胞株A3，于2011年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5424。

2.一种抗羊口疮病毒ORFV059单克隆抗体A3，其特征是由权利要求1所述杂交瘤细胞株A3分泌所得。

3.权利要求1所述抗羊口疮病毒ORFV059单克隆抗体杂交瘤细胞株A3的制备方法，其特征是：取血清效价大于1：10⁵的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用重组表达的羊口疮病毒ORFV059蛋白包被ELISA板，进行ELISA 筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗羊口疮病毒ORFV059单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为A3。

4.一种检测羊口疮病毒ORFV059表达情况的免疫检测试剂，其特征是含有权利要求2所述抗羊口疮病毒ORFV059单克隆抗体A3。