JP4120002B2 - miRNAを用いた癌の予後判定方法、癌の遺伝子治療ベクター及び癌治療用医薬組成物 - Google Patents
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(1)癌患者由来の生物学的サンプルにおいて、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAから転写されるmiRNA、pre-miRNA及びpri-miRNAからなる群から選択されるいずれか1つの発現量を測定することを特徴とする癌患者の予後判定方法。
(2)上記癌患者が肺癌患者であることを特徴とする、(1)記載の癌患者の予後判定方法。
(3)上記癌患者由来の生物学的サンプルが癌組織であることを特徴とする、(1)記載の癌患者の予後判定方法。
(4)上記miRNAが、配列番号2〜7に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、(1)記載の癌患者の予後判定方法。
(5)上記pre-miRNAが、配列番号8〜16に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、(1)記載の癌患者の予後判定方法。
(6)上記pri-miRNAが、配列番号17〜25に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、(1)記載の癌患者の予後判定方法。
(7)配列番号1に示される塩基配列を含むDNAを有する、癌の遺伝子治療ベクター。
(8)上記配列番号1に示される塩基配列を含むDNAが、配列番号2〜25に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAであることを特徴とする、(7)記載の癌の遺伝子治療ベクター。
(9)治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、(7)記載の癌の遺伝子治療ベクター。
(10)(7)〜(9)のいずれか1記載の癌の遺伝子治療ベクターを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
(11)治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、(10)記載の癌治療用医薬組成物。
(12)配列番号1に示される塩基配列を含むDNAを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
(13)上記配列番号1に示される塩基配列を含むDNAが、配列番号2〜25に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAであることを特徴とする、(12)記載の癌治療用医薬組成物。
(14)治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、(12)記載の癌治療用医薬組成物。
(15)配列番号1に示される塩基配列を含むDNAから転写されるmiRNA、pre-miRNA及びpri-miRNAからなる群から選択されるいずれか1つを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物。
(16)上記miRNAが、配列番号2〜7に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、(15)記載の癌治療用医薬組成物。
(17)上記pre-miRNAが、配列番号8〜16に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、(15)記載の癌治療用医薬組成物。
(18)上記pri-miRNAが、配列番号17〜25に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、(15)記載の癌治療用医薬組成物。
(19)治療対象の癌が肺癌であることを特徴とする、(15)記載の癌治療用医薬組成物。
実験対象集団
82人の肺非小細胞癌(以下、「NSCLC」という)組織検体(54人の腺癌の組織検体、18人の扁平上皮癌の組織検体、5人の大細胞癌の組織検体、1人の大細胞神経内分泌癌の組織検体及び4人の腺扁平上皮癌の組織検体)を、愛知県がんセンターの審査会の承認のもと取得した。
なお、組織検体が由来する患者の平均年齢は、62歳(32〜80歳の範囲)であり、病期は37 pStageI、12 pStage II、17 pStageIIIであった。
分析すべき全てのヒトNSCLC細胞系を、5%(v/v)FCS含有RPMI-1640中、37℃、5%CO2で培養した。また、BEAS-2B細胞(不死化ヒト正常気管支上皮細胞系)及びHPL1D細胞(不死化ヒト末梢肺上皮細胞系)を、ウシインシュリン(5μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、10-7Mヒドロコルチゾン、2 x 10-10Mトリヨードチロニン、ペニシリン(100 IU/ml)及びストレプトマイシン(100μg/ml)を補足した1%FCS含有Ham’s F-12中、37℃、5%CO2で培養した(Reddel RR, Ke Y, Gerwin BIら, Cancer Res, 1988年, 48巻, p.1904-9、及びMasuda A, Kondo M, Saito Tら, Cancer Res, 1997年, 57巻, p.4898-904参照)。腫瘍検体を、切除直後にグアニジンイソチオシアネートホモジナイゼーションバッファー中でホモジナイズし、上記審査会の承認により使用するまで-30℃で保存した。なお、RNA抽出に用いる全ての細胞系及び組織サンプルの処理は、既に記載したように実施した。
RNA10μgを、15%変性ポリアクリルアミドゲル中で分離した。次いで、分離したRNAをZeta-Probe GTブロッティングメンブレンに電気泳動的に一晩転写した。
リアルタイムRT-PCRを、ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems)、SYBR Green PCRマスターミックス(Perkin-Elmer Applied Biosystems)及びランダムプライミングcDNA (組織サンプルから抽出した全RNA20ngに対応する)を用いて実施した。
・let-7a-1S(センス; 5’-CCTGGATGTTCTCTTCACTG-3’)(配列番号28)及びlet-7a-1AS(アンチセンス; 5’-GCCTGGATGCAGACTTTTCT-3’)(配列番号29)
・let-7a-2S(センス; 5’-TTCCAGCCATTGTGACTGCA-3’)(配列番号30)及びlet-7a-2AS(アンチセンス; 5’-CTCACCATGTTGTTTAGTGC-3’)(配列番号31)
・let-7a-3S(センス; 5’-ACCAAGACCGACTGCCCTTT-3’)(配列番号32)及びlet-7a-3AS(アンチセンス; 5’-CTCTGTCCACCGCAGATATT-3’)(配列番号33)
・let-7f-1S(センス; 5’-TGTACTTTCCATTCCAGAAG-3’)(配列番号34)及びlet-7f-1AS(アンチセンス; 5’-TAATGCAGCAAGTCTACTCC-3’)(配列番号35)
・let-7f-2S(センス; 5’-TGAAGATGGACACTGGTGCT-3’)(配列番号36)及びlet-7f-2AS(アンチセンス; 5’-CAGTCGGAGAAGAAGTGTAC-3’)(配列番号37)
・5S-S(センス; 5’-TACGGCCATACCACCCTGAA-3’)(配列番号38)及び5S-AS(アンチセンス; 5’-TAACCAGGCCCGACCCTGCT-3’)(配列番号39)
PCR増幅条件は、最初の変性ステップ(95℃:10分間)並びに95℃:30秒、56℃〜60℃:30秒(各プライマーセットに応じて最適化)及び72℃:15秒の55サイクルであった。
階層的クラスタリング及びデータセットの視覚化のために、CLUSTER及びTREEVIEWプログラムを使用した(Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998年, 95巻, p.14863-8)。各発現に対する蛍光比率を対数変換し、次いで全てのサンプルに対するデータを平均センタリングした。さらに、得られたデータをクラスタリングアルゴリズムに供した。凝縮型階層的クラスタリングを、完全連結法を用いて行い、遺伝子発現プロファイル間の相関性に基づく腫瘍サンプルの本来のグルーピングの証拠が存在するか否かを調査した。
カプラン−マイヤー(Kaplan-Meier)法を用いて、時間の関数として生存を評価し、生存差異を対数順位検定により分析した。また、生存に関連する可能性がある因子のコックス回帰分析を行い、独立した因子が組み合わさって生存に対して有意に影響を及ぼすか否かを確認した。
let-7 miRNA発現構築物及び対照プラスミドを、let-7a(センス; 5’-GATCCCCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTT-3’(配列番号40)及びアンチセンス; 5’-AGCTAAAAACTATACAACCTACTACCTCAGGG-3’(配列番号41))、let-7f(センス; 5’-GATCCCCTGAGGTAGTAGATTGTATAGTTTTT-3’(配列番号42)及びアンチセンス; 5’-AGCTAAAAACTATACAATCTACTACCTCAGGG-3’(配列番号43))、又は対照(センス; 5’-GATCCCCTTTTTTTTGGAAA-3’(配列番号44)及びアンチセンス; 5’-AGCTTTTCCAAAAAAAAGGG-3’(配列番号45))のアニーリングオリゴヌクレオチドをpH1-RNApuroにクローニングすることによって構築した。なお、pH1-RNApuroにおいては、遺伝子の発現は、ヒトゲノムDNAのPCR増幅により調製したRNAポリメラーゼIII H1-RNA遺伝子プロモーターの制御下にあった。let-7a及びlet-7f miRNA発現構築物をA549肺腺癌細胞系に、製造業者の取り扱い説明書に従い、FuGENE6試薬(Roche, Inc.)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後に、細胞をピューロマイシン(1μg/ml)添加により選択し、次いで37℃で2週間培養した。ピューロマイシン選択の2週間後に、プレートをギムザ染色し、耐性コロニー数を計数した。
in vitro及びin vivoの双方におけるヒト肺癌中のlet-7 miRNA発現の低下
まず、ノーザンブロット分析を、16種のヒト肺癌細胞系並びに2種の不死化ヒト正常肺上皮細胞系(以下、「HNLEC」と呼ぶ)においてlet-7発現を分析するために実施した。代表的な9種のヒト肺癌細胞系に関する結果を図1Aに示す。図1Aにおいて、5Sは、ローディング対照である5SリボソームRNAを示す。
次に、let-7 miRNA発現低下が肺癌の臨床病理学的特性と関連するか否かをpri-miRNAレベルで調査した。この目的のために、NSCLCの手術による治療的切除を受けた肺癌患者の66症例を、let-7 pri-miRNAアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたリアルタイムRT-PCR分析により検査した。その結果として、let-7 pri-miRNAの発現レベルが、肺癌の症例によりかなり変動することが示された。一方、let-7 pri-miRNAの発現レベルは、肺癌の症例の間で同様に調節されている傾向にあった。なお、最も多量のlet-7 pri-miRNAアイソフォームは、let-7a-1(let7a pri-miRNAのうちの1つ)及びlet-7f-1(let7f pri-miRNAのうちの1つ)であった。これらlet-7a-1及びlet-7f-1は、ヒトゲノムにおいて数百塩基内にクラスター化されていることが知られている(非特許文献4)。
肺癌患者の生存の短さと関連して肺癌におけるlet-7の発現低下を確認したことから、肺癌発生におけるlet-7 miRNAの生物学的有意性の可能性を調べることにした。
配列番号26及び27は、プローブである。
配列番号28〜39は、プライマーである。
配列番号40〜45は、オリゴヌクレオチドである。
Claims (4)
- 肺癌患者由来の肺癌組織サンプルにおいて、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAから転写されるmiRNA、pre-miRNA及びpri-miRNAからなる群から選択されるいずれか1つの発現量を測定することを特徴とする、肺癌患者における予後を判定するための検査方法。
- 上記miRNAが、配列番号2〜7に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 上記pre-miRNAが、配列番号8〜16に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 上記pri-miRNAが、配列番号17〜25に示される塩基配列からなるDNAの群から選択されるいずれか1つのDNAから転写されるものであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
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