CN110446718A - Unylinker快速裂解 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用固体支持物的寡核苷酸合成领域，且特别涉及如下发现，当使用连接至UnyLinker类型的固体支持物的3’氧基‑LNA核苷时，裂解和托保护极快地发生。
Description
发明领域
本发明涉及使用固体支持物的寡核苷酸合成领域，特别涉及当使用连接至UnyLinker型固体支持物的3’氧基-LNA核苷时裂解和脱保护极为快速地发生的发现。
背景
Ravikumar等人，Organic Process Research&Development 2008，12，399-410报道了用于寡核苷酸合成的UnyLinker固体支持物，并且在55℃下8小时内实现了从UnyLinker支持物上的裂解和脱保护(小规模合成)。
Guzaev和Manoharan，J.AM.CHEM.SOC.2003，125，2380-2381公开了寡核苷酸从固体支持物上裂解的动力学比在3′末端带有2′-O-烷基核糖核苷残基的化合物快1-5-2.3倍。
WO2005/049621公开了5，6-二羟基-异吲哚衍生物作为用于寡聚体固相合成的接头。
发明描述
本发明提供了从固体支持物上裂解寡核苷酸的方法，所述方法包含下列步骤：(i)用浓氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸至少约30分钟且不超过约约6小时，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式I或II在3′位共价连接至固体支持物上，
其中
A′和A″之一为SM或L-SM，
SM是支持媒介物；
L为连接部分，
A′和A″的另一个为H或取代基；
Ru、Rv、Rw、RX、Ry和Rz各自为H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基或取代的炔基；
Y1和Y2各自彼此独立地为O、S、NR1CH2或CR1R1：R1为H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基或取代的炔基；
G1为O、S或NR′；其中R′为H或取代基；X为O或S，Rc为H或氰基乙基；其中碱基为核碱基，且R3为寡核苷酸的其余部分。
在一些实施方案中，Y1和Y2各自为O。
在一些实施方案中，Y1和Y2的至少一个为O。
在一些实施方案中，A″是苯基。
在一些实施方案中，A″为L-SM。
在一些实施方案中，A′为L-SM。
本发明提供了从固体支持物上裂解寡核苷酸的方法，所述方法包括下列步骤：(i)用浓氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸至少30分钟且不超过约6小时，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式I在3′位共价连接至固体支持物上。
本发明提供了从固体支持物上裂解寡核苷酸的方法，所述方法包括下列步骤：(i)用浓氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸至少30分钟且不超过约6小时，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式A或C在3′位共价连接至固体支持物上：
其中黑色圆圈表示固体支持物；Rc为H或氰基乙基，Re为芳基或C1-10烷基，例如苯基、异丙基或甲基；其中碱基为核碱基，R3为寡核苷酸的其余部分，且其中X为O或S。
本发明提供了从固体支持物上裂解寡核苷酸的方法，所述方法包含下列步骤：(i)用浓氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸至少30分钟且不超过约6小时，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式A在3′位共价连接至固体支持物上。
本发明提供了寡核苷酸合成方法，包含下列步骤：如从本发明的固体支持物上裂解寡核苷酸的方法，从本发明的固体支持物上裂解寡核苷酸。
本发明提供了寡核苷酸合成方法，包含下列依次的步骤：
a)提供式I或II或式B或D的固体支持物，
其中黑色圆圈表示固体支持物；Rc为H或氰基乙基，Re为芳基或C1-10烷基，例如苯基、异丙基或甲基；其中碱基为核碱基，X为O或S，且Rz为5’-OH阻断基，例如阻断基团，其选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb，
b)不阻断5’基团，得到5’末端-OH基团，
c)使亚磷酰胺单体偶联至5’末端-OH基团，
d)氧化偶联步骤中形成的核苷间键，
e)任选地封端任意未反应的亚磷酰胺5’末端-OH基团，
f)重复步骤b)-e)进行一个或多个另外的循环(链延长)，
g)任选地进行胺洗涤，
h)用浓氢氧化铵溶液从固体支持物上裂解寡核苷酸至少约30分钟并且不超过约6小时(或根据本发明要求保护的或本文描述的)，
i)任选地纯化寡核苷酸。
附图
图1：在Unylinker去磷酸化不完全时观察到的理论种类以及质量的增加，即如果该种类由于不完全去磷酸化而存在，将会观察到。
图2：来自实施例1的色谱图的实例，其中观察到来自图1的种类中的3种，如化合物编号1-4所示。FLP表示“全长产物”，其是期望的去磷酸化寡核苷酸。
图3：来自实施例1的在55℃下浓氢氧化铵中的Unylinker去磷酸化速率。
图4：来自实施例2的在室温下浓氢氧化铵中的Unylinker去磷酸化速率。
发明详述
除非另有说明，否则本文中关于数值使用的术语“约”可以是指示的整数的+/-10％(例如温度或时间整数)。
如本文所用，术语“芳基”是指芳环，其中成环的每个原子是碳原子。芳基环由五个、六个、七个、八个、九个或多于九个碳原子形成。芳基是取代或未取代的。在一个方面，芳基是苯基或萘基。根据结构的不同，芳基可以是单价的或二价的(即亚芳基)。在一个方面，芳基是C6-10芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基。此时，取代的芳基可以被选自如下的基团取代：C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基。多个取代基可从属或独立地选自C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C7-14芳烷基基团、C1-4烷基、C6-14芳基、C1-4烷氧基、C6-14芳基或C6-14芳基C1-4烷基；或选自卤化物的基团，如碘化物、氟化物、溴化物或氯化物，如被卤化物取代的苯基，如碘化物、氟化物、溴化物或氯化物。
″烷基″是指脂族烃基。烷基部分可以是饱和烷基(这意味着它不含任何不饱和单元，例如碳-碳双键或碳-碳三键)或烷基部分可以是不饱和烷基(这意味着它含有至少一个不饱和单元)。烷基部分，无论是饱和的还是不饱和的，可以是支链的、直链的、或包括环状部分。烷基的连接点位于不是环的一部分的碳原子上。“烷基”部分可具有1至10个碳原子(无论何时在本文中出现，数值范围如“1至10”是指给定范围内的每个整数；例如，“1至10个碳原子”表示烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，直至并包括10个碳原子，尽管本发明的定义还包括术语“烷基”的出现，其中没有指定数值范围)。烷基包括支链和直链烷基。本文所述化合物的烷基可称为″C1-6烷基″或类似的名称。仅举例来说，″C1-6烷基″表示烷基链中有一个、两个、三个、四个、五个或六个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、烯丙基、环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。在一方面，烷基为C1-6或C1-4烷基或C1-3烷基。C1-3烷基是指具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。C1-4烷基的实例是甲基、乙基、丙基和异丙基。C1-3烷基是指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基。C1-3烷基的实例为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。
“酰基保护基团”包含酰基-C(＝O)-R7，其中R7为末端基团，例如选自烷基-、烷基-、链烯基-、炔基-、环烷基-和芳基-的基团；或选自未取代的烷基-、未取代的链烯基-、未取代的炔基-、未取代的环烷基-或未取代的芳基-基团；或选自取代的烷基-、取代的链烯基-、取代的炔基-、取代的环烷基-或取代的芳基-的基团。在一些实施方案中，R7可以选自未取代的C1-6-烷基-、未取代的C2-6-链烯基-、未取代的C2-6-炔基-、未取代的C3-7-环烷基-或未取代的苯基-或取代的C1-6-烷基-、取代的C2-6-链烯基-、取代的C2-6-炔基-、取代的C3-7-环烷基-或取代的苯基-；其中当被取代时，取代基可以是单或多取代的，例如，被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、C1-6-烷基、C2-6-链烯基、C2-6-炔基、C1-6-烷氧基、任选取代的芳氧基或任选取代的芳基。在一些实施方案中，酰基保护基团为异丁基(-C(O＝)CH(CH3)2)(在本文中也称为iBu)。术语异丁基(isobuturyl)还可以拼写为异丁基。
LNA核苷
式A和C或如式B和D所示例的LNA核苷为氧基-LNA核苷，其中2′-4′双基为2’-O-CH2-4’。在一些实施方案中，氧基-LNA桥是β-D构型(如式A中所示例)。在一些实施方案中，氧基-LNA桥是β-D构型(如式C中所示例)。
LNA寡核苷酸
LNA寡核苷酸是包含至少一个LNA核苷的寡核苷酸。LNA寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。存在于式A、B、C或D中的寡核苷酸是LNA寡核苷酸，因为至少3′-核苷酸是LNA核苷酸。在一些实施方案中，两个3′最(3′末端)核苷是LNA核苷，例如两个3′末端β-D-氧基LNA核苷。
将本文使用的术语寡核苷酸定义为本领域技术人员通常将其理解为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。为了用作反义寡核苷酸，将寡核苷酸典型地合成为长度为7-30个核苷酸。
LNA寡核苷酸可以具有适合于反义寡核苷酸的设计，例如间隔体(gapmer)、头聚体(headmer)、尾聚体(tailmer)、全聚体(totalmer)(完全LNA)或混合聚体(mixmer)(LNA和非LNA核苷酸的交替区域，例如LNA/DNA混合聚体)。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”是指能够通过与靶核酸杂交，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸也可以通过其与靶核酸互补来定义。反义寡核苷酸是单链的。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA。反义寡核苷酸包含与靶核酸互补的连续核苷酸。反义寡核苷酸典型地包含一个或多个修饰的核苷间键，并且作为非限制性实例，可以是LNA间隔体或混合翼间隔体的形式。在其他实施方案中，寡核苷酸可以是LNA混合聚体(LNA和非LNA核苷酸，例如LNA和DNA(参见例如WO2007/112754，在此通过引用并入作为参考)，或LNA和2′-O-MOE核苷酸，或LNA、DNA和2′O-MOE核苷酸)，或LNA全聚体(仅LNA核苷酸-参见例如WO2009/043353，在此通过引用并入作为参考)。
核碱基
术语核碱基，在本文中也称为“碱基”，包括存在于核酸和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交期间具有功能性。在本文上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。这些变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊371.4.1中。
在一些实施方案中，通过将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶(例如取代的嘌呤或取代的嘧啶，例如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-硫代-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶5-噻唑基尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2′-硫代胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基)来修饰核碱基部分。
核碱基部分可以用每个相应核碱基的字母代码表示，例如，A，T，G，C或U，其中每个字母可任选地包括具有等同功能的修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A，T，G，C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA间隔体，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
核苷酸和核苷
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸，例如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其在核苷中不存在)。通过引入对核糖部分、核碱基部分或核苷间键的修饰，与等同的DNA或RNA核苷/核苷酸相比，修饰的核苷和核苷酸被修饰。核苷和核苷酸也可互换地称为“单元”或“单体”。
本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰而与等同的DNA或RNA核苷相比修饰的核苷。术语“修饰的核苷”在本文中也可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。修饰的核苷的实例在单独的“寡聚体修饰”部分及其子部分中描述。
修饰的核苷间键
在一些实施方案中，式A或C的LNA寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷间键。
将术语“修饰的核苷间键”定义为本领域技术人员通常理解为磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。修饰的核苷间键特别适用于稳定体内使用的寡核苷酸，并且可用于保护免受核酸酶裂解。由于核酸酶抗性，有益的药代动力学和易于制造，硫代磷酸酯核苷间键特别有用。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少70％，例如，至少80％或至少90％的核苷间键是硫代磷酸。
修饰的核苷间键可选自硫代磷酸、二硫代磷酸和硼烷磷酸酯。在一些实施方案中，修饰的核苷间键与本发明的寡核苷酸的RNaseH募集相容，例如硫代磷酸，二硫代磷酸或硼烷磷酸酯。
在一些实施方案中，核苷间键包含硫(S)，例如硫代磷酸核苷间键。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键是硫代磷酸。
进一步的核苷间键在WO2009/124238中公开(通过引用并入本文作为参考)。在一个实施方案中，核苷间键选自WO2007/031091中公开的接头(通过引用并入本文作为参考)。特别地，核苷间键可以选自-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-p(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-和/或核苷间连接基可选自核苷间连接基可以选自-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。
寡核苷酸可以包含除硫代磷酸之外的核苷间键，例如磷酸二酯键，特别是在其中修饰的核苷如LNA保护键免受核酸酶降解的区域中。包含磷酸二酯键，例如一个或两个键，特别是在修饰的核苷单元之间或附近(典型地在非核酸酶募集区域中)，可以改变寡核苷酸的生物利用度和/或生物分布-参见WO2008/113832，通过引用并入本文作为参考。
在一个实施方案中，寡核苷酸中的所有核苷间键都是硫代磷酸和/或硼烷磷酸酯(boranophosphate)键。优选地，寡核苷酸中的所有核苷间键都是硫代磷酸键。
在一些实施方案中，寡核苷酸是硫代磷酸寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸中的所有核苷间键是硫代磷酸核苷间键。在一些实施方案中，寡聚体的核苷键独立地选自磷酸二酯和硫代磷酸核苷酸间键。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个增强亲和力的核苷，例如本文所述的LNA或2′取代的核苷。增强亲和力的核苷，例如2′-O-MOE或2′-O-甲基，通常用于反义寡核苷酸中，或者与其它核苷组合，例如DNA核苷，例如混合聚体或间隔体的形式，或可用于完全糖修饰的寡核苷酸，其中所有核苷不是DNA或RNA。
在一些实施方案中，通过本发明的工艺或方法合成的寡核苷酸可以是间隔体、LNA间隔体或混合翼间隔体。
间隔体
如本文所用的术语间隔体是指反义寡核苷酸，其包含RNase H募集寡核苷酸区域(缝隙)，其通过一个或多个增强亲和力的修饰的核苷(侧翼)侧接5′和3′。本文描述了各种间隔体设计。引物和定型引物是能够募集RNase H的寡核苷酸，其中侧翼之一缺失，即寡核苷酸的仅一个末端包含增强亲和力的修饰的核苷。对于头聚体，3′侧翼缺失(即5′侧翼包含增强亲和力的修饰的核苷)，而对于尾聚体，5′侧翼缺失(即3′侧翼包含增强亲和力的修饰的核苷)。
LNA间隔体
术语LNA间隔体是间隔体寡核苷酸，其中增强亲和力的修饰核苷的至少一个是LNA核苷。
混合翼间隔体
术语混合翼间隔体是指LNA间隔体，其中侧翼区包含至少一个LNA核苷和至少一个非LNA修饰的核苷，例如至少一个2′取代的修饰核苷，例如2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)和2′-氟-ANA核苷。在一些实施方案中，混合翼间隔体具有一个侧翼，其包含LNA核苷(例如5′或3′)，而另一侧翼(分别3′或5′)包含2′取代的修饰核苷。
长度
当提及本文提及的核苷酸分子的长度时，长度相当于单体单元即核苷酸的数目，而与这些单体单元是核苷酸还是核苷酸类似物无关。关于核苷酸，术语单体和单元在本文中可互换使用。
本发明的方法特别适用于短寡核苷酸的纯化，例如，由7至30个核苷酸组成的寡核苷酸，例如7-10个核苷酸，例如7、8、9、10或10至20个核苷酸，例如12至18个核苷酸，例如12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。
从固体支持物上裂解
通过本发明的方法合成的寡核苷酸是包含3′末端LNA核苷的LNA寡核苷酸。如实施例中所示，本发明人已发现，在约室温(约20℃)至约60℃或约50℃至约60℃的温度下，使用浓氢氧化铵溶液在约30分钟至约6小时内进行全面脱保护和裂解的条件下，具有与固体支持物结合的3′末端LNA的LNA寡核苷酸(例如，如本文所公开的含有UnyLinker部分的支持物)可从固体支持物的Unylinker部分上裂解。实际上，在约30分钟至约4小时的全面脱保护中，具有3′LNA核苷的LNA寡核苷酸可以被有效地裂解并从UnyLinker固体支持物上脱保护。如实施例中所示例，本发明允许在室温下在约4小时内进行有效的裂解和脱保护。
在一些实施方案中，本发明提供了从固体支持物上裂解寡核苷酸的方法，所述方法包含下列步骤：(i)用浓氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸至少约30分钟且不超过约6的时间期限，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式A或C在3′位共价连接至固体支持物：
其中黑圈代表固体支持物；Rc为H或氰基乙基；Re为芳基或C1-10烷基，例如苯基、异丙基或甲基；其中碱基是核碱基，R3为寡核苷酸的其余部分，并且其中X为O或S。
在一些实施方案中，寡核苷酸从固体支持物上的裂解在约室温(约20℃)至约60℃，或约50℃至约60℃的温度下进行。
在一些实施方案中，与固体支持物结合的寡核苷酸的至少约90％在本发明的方法中从固体支持物上裂解，即有效裂解，例如至少约95％，例如至少约98％，例如至少约99％。在一些实施方案中，在本发明的方法期间，基本上所有与固体支持物结合的LNA寡核苷酸被裂解。
在一些实施方案中，Re为甲基。在一些实施方案中，Re是苯基。在一些实施方案中，Re为异丙基。
在一些实施方案中，固体支持物是聚苯乙烯支持物(例如多孔和多分散的二乙烯基苯交联的聚苯乙烯颗粒)。在一些实施方案中，固体支持物是玻璃支持物(例如受控的玻璃孔支持物)。在一些实施方案中，固体支持物是聚苯乙烯和玻璃支持物的组合。固体支持物(也称为树脂)是不溶性颗粒，典型地直径为50-200μm，寡核苷酸在合成期间结合到该颗粒上。已经使用了许多类型的固体支持物，但最常用的是受控孔径玻璃(CPG)和聚苯乙烯或其组合。这种固体支持物的实例包括CPG、CPG、KinnovatePrimer Support 5G、Prime Synthesis hybCPGTM。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约30分钟且不超过约5小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约30分钟且不超过约4小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约30分钟且不超过约3小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约30分钟且不超过约2小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约30分钟且不超过约90分钟。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约45分钟且不超过约5小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约45分钟且不超过约4小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约45分钟且不超过约3小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约45分钟且不超过约2小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约45分钟且不超过约90分钟。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约60分钟且不超过约5小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约60分钟且不超过约4小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约60分钟且不超过约3小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约60分钟且不超过约2小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约60分钟且不超过约90分钟。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约90分钟且不超过约5小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约90分钟且不超过约4小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约90分钟且不超过约3小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约90分钟且不超过约2小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至多约1小时或约1小时。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至多约90分钟。
在一些实施方案中，用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至多约120分钟。
在上述时间期限中，裂解步骤的温度可以约为20℃至约60℃或约50℃至约60℃。
在一些实施方案中，本发明的方法导致寡核苷酸的裂解和寡核苷酸的整体脱保护。如实施例中所示例，根据所使用的保护基团的不同，全面保护可在约30分钟内发生，或对于一些保护基团，例如iBu保护的鸟嘌呤残基(其中鸟嘌呤的环外氮用iBu保护基团保护)，可能需要超过1小时的时间期限，例如约90分钟。如实施例中所示，使用本发明的方法实现有效的脱保护，例如在30分钟内至少95％，例如至少98％或至少99％的脱保护(例如当使用DMF保护的鸟嘌呤残基时)，或对于包含iBu保护的鸟嘌呤残基的寡核苷酸，1至2小时。
在一些实施方案中，氢氧化铵处理进行至少约70分钟，例如至少约80分钟，例如至少约90分钟，例如至少约100分钟，例如至少约110分钟或至少约120分钟。
在一些实施方案中，例如当氢氧化铵处理进行至少60分钟或更长时，LNA寡核苷酸包含至少一个酰基保护的鸟嘌呤残基。酰基保护的鸟嘌呤可以在LNA核苷或非LNA核苷上，例如DNA核苷。
在一些实施方案中，将与固体支持物结合的LNA寡核苷酸用氢氧化铵溶液处理至少约2小时的时间期限，其中所述步骤进一步导致LNA寡核苷酸的全面脱保护，其中LNA寡核苷酸包含至少一个酰基保护的鸟嘌呤残基。
在一些实施方案中，LNA寡核苷酸不包含酰基保护的鸟嘌呤残基或iBu保护的鸟嘌呤残基。如实施例中所示例，具有除iBu或酰基以外的鸟嘌呤保护基团(例如DMF保护的鸟嘌呤残基)的LNA寡核苷酸或不包含鸟嘌呤残基的寡核苷酸的裂解和脱保护被非常快速地裂解和脱保护，基本上用约30分钟-约1小时。
在一些实施方案中，存在于连接至固体支持物的LNA寡核苷酸中的所有鸟嘌呤残基是DMF保护的鸟嘌呤残基。
在一些实施方案中，裂解步骤(步骤(i))使用浓氢氧化铵在约55℃-约60℃下进行。
在一些实施方案中，步骤(i)使用浓氢氧化铵在约55℃的温度下进行。
在一些实施方案中，寡核苷酸是长度为10-25个核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸。
寡核苷酸合成方法
本发明提供了寡核苷酸合成方法，包含以下步骤：
a)提供式B或D的固体支持物
其中黑色圆圈表示固体支持物；Rc为H或氰基乙基；Re为芳基或C1-10烷基，例如苯基、异丙基或甲基；其中碱基为核碱基，其中X为O或S。
并且Rz为5’-OH阻断基团，例如选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr、CH(Me)-O-MMTr、CH-Ra-O-DMTrRb和CH-Ra-O-MMTrRb的阻断基团。
b)解封闭5’基团，以得到5’末端-OH基团
c)使亚磷酰胺单体偶联至5’末端-OH基团
d)氧化在偶联步骤中形成的核苷间键
e)任选地封端任意未反应的5’末端-OH基团
f)重复步骤c)-e)用于一个或多个另外的循环(链延长)
g)任选地进行胺洗涤
h)通过本发明的方法从固体支持物上裂解寡核苷酸，例如用浓氢氧化铵溶液处理连接至固体支持物的寡核苷酸至少约30分钟且不超过约6小时的时间期限
i)任选地纯化裂解的寡核苷酸。
当重复步骤c)-e)时(进一步的延伸循环)(步骤f)-典型地以5′-OH基团被封闭的形式提供下一个亚磷酰胺单体(例如使用步骤a中涉及的阻断基团)，并在偶联之前解封闭。
在一些实施方案中，步骤a)中涉及或偶联前存在于亚磷酰胺单体中的阻断基团为-CH2-O-DMTr。
在一些实施方案中，用于步骤c)的存在于式B或D中和亚磷酰胺单体上的Rz为-CH2-O-DMTr。
胺洗涤步骤是指用于寡核苷酸合成的任选方法，其中在将寡核苷酸暴露于裂解步骤中使用的强碱性条件之前，用弱碱在有机溶剂中的溶液处理寡核苷酸，例如用乙腈中的10％-二乙胺或1∶1三乙胺/乙腈。胺洗涤导致除去磷酸酯保护基团而不从固体支持物上裂解寡核苷酸。包括胺洗涤的益处导致避免不需要的氰基乙基(cyanothyl)加合物，例如丙烯腈，其由于磷酸酯保护基团(Rc)的副反应而形成，例如氰基乙基保护基团和杂环碱基，特别是胸腺嘧啶。
纯化步骤i)可以使用任何适合的方法进行寡核苷酸纯化，例如离子交换纯化或反相色谱，或者离子交换纯化和反相色谱。在一些实施方案中，纯化包含连续步骤：a)离子交换纯化，b)脱盐，例如，通过渗滤，然后c)冷冻干燥和d)反相色谱。在纯化之前，典型地将氢氧化铵除去或至少稀释。
在一些实施方案中，纯化步骤可包含脱盐，例如通过渗滤或尺寸排阻色谱法脱盐。
或者，DMT-ON反相纯化后脱三苯甲基化也是纯化寡核苷酸的选择(参见Capaldi和Scozzari，第14章，Antisense Drug Technology：Principles，Strategies，andApplications，CRC Press 2008)。
在一些实施方案中，上述方法包含步骤(g)和(i)。
在一些实施方案中，上述方法包含步骤(e)、(g)和(i)。
在一些实施方案中，将步骤b)-e)(延伸循环)重复约7-25次，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或14次。
步骤b)-解封闭步骤可包括脱三苯甲基化。例如，当支持物结合的核苷具有5′-DMT保护基团(DMT＝4，4′-二甲氧基三苯甲基)时，其作用是在树脂官能化过程中防止聚合，并且必须在可以进行寡核苷酸合成之前从支持物结合的核苷上除去该保护基团(脱三苯甲基化)。
偶联典型地在适合的溶剂中进行，例如乙腈和活化剂。在一些实施方案中，溶剂包含N-甲基咪唑。在一些实施方案中，溶剂组合物包含浓度为0.01-约1M的N-甲基咪唑，例如约0.1M的N-甲基咪唑。在一些实施方案中，活化剂包含4，5-二氰基咪唑(DCI)、四唑或5-(苄硫基)-1H-四唑。
在一些实施方案中，溶剂组合物包含约0.5-约2M DCI。
偶联导致产生亚磷酸三酯中间体，然后在下一步骤中氧化，例如在碘(产生磷酸二酯键)或硫化剂存在下以产生硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，氧化是硫化步骤，其导致硫代磷酸键的产生：硫化可以通过用硫化试剂如3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物或苯基乙酰基二硫化物或苍耳烷氢化物在适合的溶剂如乙腈并任选包含芳族杂环溶剂如吡啶或3-甲基吡啶中处理来进行。在一些实施方案中，硫化在0.1M的苍耳烷氢化物的乙腈和吡啶1∶1v/v的溶液中进行。硫化典型地在室温下进行。
任选的封端步骤是有用的，因为在每个偶联步骤期间偶联收率典型地可以约为99.5％，在树脂结合的核苷酸上可能存在一定水平的未反应的5′-OH基团，如果遗留则可用于下一轮的偶联，导致最终寡核苷酸中的n-1杂质。偶联反应后的“封端”步骤，以封闭未反应的5′-羟基。在合成仪上使用两种封端溶液：乙酐和N-甲基咪唑(NMI)。在递送至合成柱之前，将这两种试剂(溶解在四氢呋喃和/或乙腈中并加入少量吡啶)在DNA合成仪上混合。亲电子混合物使醇迅速乙酰化，并且吡啶确保pH保持碱性以防止由乙酐与NMI反应形成的乙酸对载体结合的寡核苷酸的不期望的脱三苯甲基化。5′-羟基的乙酰化使它们对随后的反应呈惰性。
在一些实施方案中，当氧化为硫化时，封端在硫化步骤后进行。
在一些实施方案中，步骤c)中使用的亚磷酰胺单体具有式E：
其中R2选自氢、羟基、卤素例如-F、氨基、叠氮基、-SH、-CN、-OCN、-CF3、-OCF3、-O(Rm)-烷基、-S(Rm)-烷基、-N(Rm)-烷基、-O(Rm)-链烯基、-S(Rm)-链烯基、-N(Rm)-链烯基；-O(Rm)-炔基、-S(Rm)-炔基或-N(Rm)-炔基；O-烯基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)、-O-(CH2)2OCH3和-O-CH3，其中Rm和Rn各自独立地为H、氨基保护基或取代或未取代的C1-10烷基；
R4＝选自烷基、环-烷基、环-杂烷基、O-烷基、S-烷基、NH-烷基和氢；或者R4和R2一起形成构成双环核酸的核苷的核糖环C2’-C4’之间的双基桥，也称作锁定的核酸(LNA)。在一些实施方案中，R2-R4双基为-O-CH2-或-O-CH(CH3)-。
其中Rz为Rz为5’-OH阻断基团，例如选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr和CH(Me)-O-MMTr的阻断基团。
在一些实施方案中，存在于式AB或D中和/或步骤c)中使用的亚磷酰胺单体上的Rz为CH2-O-DMTr。
在一些实施方案中，R4为氢，且R2选自C1-6烷基、甲基、C2-6烷氧基、2’-O-甲氧基乙基、氨基和氟。
在一些实施方案中，R4为氢，且R2为氢。
在一些实施方案中，R4为氢，且R2为羟基。
在一些实施方案中，LNA寡核苷酸为硫代磷酸寡核苷酸，其中硫代磷酸寡核苷间键不是立体控制的，即立体随机的。
实施例
实施例1
使用Kinnovate Unylinker聚苯乙烯支持物进行7×20μmole规模合成，其中载量(如通过脱三苯甲基化测量)为200μmol/g。
合成如下寡核苷酸：
5’-[(dt)s]11T＊-3’
其中T＊表示T核苷，核苷的核糖部分不同于选自2′-脱氧核糖(DNA)、2′-O-甲氧基乙基核糖(2′-MOE)、LNA、氨基LNA和(S)cEt，如图3所示。固体支持物的3′-核苷与Unylinker部分之间的键不同于磷酸二酯键(式A的X＝O)或硫代磷酸酯键(式A的X＝S)，条件是如图3所示。因此进行了总计7次合成。
使用常规的5′-二甲氧基三苯甲基-3′-β-氰基乙基亚磷酰胺进行合成，如式D-H所示
使用如下合成步骤与如下所列的试剂进行合成：
a)使用3％二氯乙酸的二氯甲烷溶液(v/v)解封闭支持物结合的ODMTr基团，得到末端-OH基团
b)使用0.5M二氰基咪唑的乙腈溶液作为活化剂使式D-G的亚磷酰胺单体(0.1M的乙腈溶液)偶联至末端-OH基团
c)使用0，1M苍耳烷氢化物的1∶1乙腈和吡啶(X＝S)或吡啶/水/碘9/1/12,7(v/v/w)(X＝O)溶液氧化偶联步骤中形成的核苷间键
d)用封端剂A、封端剂B1和封端剂B2的2∶1∶1混合物封端：
封端剂A 20％1-甲基咪唑的乙腈溶液(v/v)
封端剂B1 40％乙酐的乙腈溶液(v/v)
封端剂B2 60％吡啶或2，6-卢剔淀的乙腈溶液(v/v)
重复步骤a)-d)用于一个或多个另外的循环(链延长)。
合成进行DMT-Off，这意味着在链延长结束时，进行步骤a)以裂解最终的5′-DMTr基团。此后，将支持物结合的寡核苷酸用二乙胺在乙腈中的溶液(20％V/V)处理1h。
然后将1/10所得固体支持物与1mL浓氢氧化铵混合，并在55℃下放置0.5-4h，如图1所示，然后真空蒸发，并通过反相UPLC-MS分析。
在所有情况下，根据图2，将％Unylinker计算为源自不完全去磷酸化确定的3个峰的总和。所有峰通过260nm处的吸光度检测。
结果如下表1中和图3中所示。
表1：对于所示的核糖修饰，发现作为55℃脱保护时间的函数的unylinker百分比，以及3′-核苷与Unylinker部分之间的键。
实施例2
使用Kinnovate Unylinker聚苯乙烯支持物进行7×20μmole规模合成，其中载量(如通过脱三苯甲基化测量)为200μmol/g。
合成如下寡核苷酸：
5’-[(dt)S]11T＊-3’
其中T＊表示T核苷，核苷的核糖部分不同于选自2′-脱氧核糖(DNA)、2′-O-甲氧基乙基核糖(2′-MOE)、LNA、氨基LNA和(S)cEt，如图4所示。固体支持物的3′-核苷与Unylinker部分之间的键不同于磷酸二酯键(式A的X＝O)或硫代磷酸酯键(式A的X＝S)，条件是如图4所示。因此进行了总计7次合成。
使用常规的5′-二甲氧基三苯甲基-3′-β-氰基乙基亚磷酰胺进行合成，如实施例1中的式D-H所示。
使用如下合成步骤与如下所列的试剂进行合成：
a)使用3％二氯乙酸的二氯甲烷溶液(v/v)解封闭支持物结合的ODMTr基团，得到末端-OH基团
b)使用0.5M二氰基咪唑的乙腈溶液作为活化剂使式D-G的亚磷酰胺单体(0.1M的乙腈溶液)偶联至末端-OH基团
c)使用0，1M苍耳烷氢化物的1∶1乙腈和吡啶(X＝S)或吡啶/水/碘9/1/12，7(v/v/w)(X＝O)溶液氧化偶联步骤中形成的核苷间键
d)用封端剂A、封端剂B1和封端剂B2的2∶1∶1混合物封端：
封端剂A 20％1-甲基咪唑的乙腈溶液(v/v)
封端剂B1 40％乙酐的乙腈溶液(v/v)
封端剂B2 60％吡啶或2，6-卢剔淀的乙腈溶液(v/v)
重复步骤a)-d)用于一个或多个另外的循环(链延长)。
合成进行DMT-Off，这意味着在链延长结束时，进行步骤a)以裂解最终的5′-DMTr基团。此后，将支持物结合的寡核苷酸用二乙胺在乙腈中的溶液(20％V/V)处理1h。
然后将1/10所得固体支持物与1mL浓氢氧化铵混合，并在室温下放置4或18小时，如图1所示，然后真空蒸发，并通过反相UPLC-MS分析。
在所有情况下，根据图2，将％Unylinker计算为源自不完全去磷酸化确定的3个峰的总和。所有峰通过260nm处的吸光度检测。
结果如下表2中和图4中所示。
表2：对于所示的核糖修饰，发现作为室温下脱保护时间的函数的unylinker百分比，以及3′-核苷与Unylinker部分之间的键。
Claims (18)
1.用于从固体支持物上裂解寡核苷酸的方法，所述方法包含下列步骤：(i)用浓氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸至少约30分钟并且不再超过约6小时，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷为LNA核苷，其如式I或II在3′位置共价连接至固体支持物上，
其中
A′和A″之一为SM或L-SM，
SM是支持媒介物；
L为连接部分，
A′和A″的另一个为H或取代基；
Ru、Rv、Rw、Rx、Ry和Rz各自为H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基或取代的炔基；
Y1和Y2各自彼此独立地为O、S、NR1CH2或CR1R1：R1为H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基或取代的炔基；
G1为O、S或NR′；其中R′为H或取代基，
X为O或S，Rc为H或氰基乙基；其中碱基为核碱基，且R3为寡核苷酸的其余部分。
2.根据权利要求1的方法，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式A或C在3′位共价连接至固体支持物上：
其中黑色圆圈表示固体支持物；X为O或S，Rc为H或氰基乙基；Re为芳基或C1-10烷基，例如苯基、异丙基或甲基；其中碱基为核碱基，R3为寡核苷酸的其余部分。
3.根据权利要求1或2的方法，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式I或式A在3′位置共价连接至固体支持物上。
4.根据权利要求1或2的方法，其中与固体支持物连接的寡核苷酸的3′核苷是LNA核苷，其如式II或式C在3′位置共价连接至固体支持物上。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中A”或Re为甲基、异丙基或苯基。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中Rc为氰基乙基。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中X为O。
8.根据权利要求1-6任一项的方法，其中X为S。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中用氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸的步骤在室温至约60℃的温度下进行。
10.根据权利要求1-8任一项的方法，其中用氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸的步骤在约50℃至约60℃例如在约55℃的温度下进行。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中用氢氧化铵溶液处理与固体支持物结合的寡核苷酸的步骤进行至少约30分钟且不超过约4小时的时间期限。
12.根据权利要求1-10任一项的方法，其中用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约30分钟且不超过约2小时。
13.根据权利要求1-10的方法，其中用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至多约1小时或约1小时。
14.根据权利要求1-11任一项的方法，其中用氢氧化铵溶液处理结合至固体支持物的寡核苷酸的步骤进行至少约2小时，其中该步骤还导致LNA寡核苷酸的全面脱保护，并且其中寡核苷酸保护至少一个酰基保护的鸟嘌呤残基。
15.根据权利要求1-14任一项的方法，其中LNA寡核苷酸不含酰基保护的鸟嘌呤残基或不含iBu保护的鸟嘌呤残基。
16.根据权利要求1-14任一项的方法，其中LNA寡核苷酸中存在的全部鸟嘌呤残基为DMF保护的鸟嘌呤残基。
17.根据权利要求1-16任一项的方法，其中寡核苷酸为10-25个核苷酸长度的硫代磷酸寡核苷酸。
18.寡核苷酸合成方法，其包含下列步骤：
a)提供根据权利要求1的式I或II或式B或D的固体支持物，
其中碱基、X、Y、Rc和Re如权利要求1-17任一项中所述，且Rz为5’-OH阻断基团，例如选自CH2ODMTr、CH2-烷基-O-DMTr、CH-Me-O-DMTr、CH2OMMTr、CH2-烷基-O-MMTr和CH(Me)-O-MMTr的阻断基团，
b)解封闭5’基团，得到5’末端-OH基团，
c)使亚磷酰胺单体偶联至5’末端-OH基团，
d)氧化偶联步骤中形成的核苷间键，
e)任选地封端未偶联的亚磷酰胺单体，
f)重复步骤b)-e)一个或多个另外的循环(链延长)，
g)任选地进行胺洗涤处理，
h)如权利要求1-17任一项所述从固体支持物上裂解寡核苷酸，
i)任选地纯化寡核苷酸。
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