BR112019011164A2

BR112019011164A2 - composto, oligonucleotídeo modificado, composição farmacêutica, método para inibir a atividade de um ou mais membros da família mir-17 em uma célula e em um sujeito

Info

Publication number: BR112019011164A2
Application number: BR112019011164A
Authority: BR
Inventors: R Allerson Charles
Original assignee: Regulus Therapeutics Inc
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2019-10-08
Also published as: ZA201903605B; CN110036019A; US20210095282A1; AU2017370560C1; US20200165606A1; EP3548503A1; TWI769197B; JP2024123177A; TW201821618A; MX2019006332A; PH12019501224A1; EA201991360A1; TW202300647A; JP2019536804A; KR20190085951A; WO2018106566A1; US20230109466A1; IL266871A; MA46999A; CL2019001522A1

Abstract

são fornecidos neste documento métodos para o tratamento de doença renal policística, incluindo doença renal policística dominante autossômica, usando oligonucleotídeos modificados direcionados para mir-17.

Description

COMPOSTO, OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA INIBIR A ATIVIDADE DE UM OU MAIS MEMBROS DA FAMÍLIA MIR-17 EM UMA CÉLULA E EM UM SUJEITO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica o beneficio de prioridade do Pedido Provisório US Ν^Ω 62/430.139 depositado em 05 de dezembro de 2016, cujo pedido é incorporado neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

CAMPO DA INVENÇÃO [0002] São fornecidos neste documento composições e métodos para o tratamento da doença renal policistica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0003] A doença renal policistica é caracterizada pelo acúmulo de numerosos cistos cheios de liquido no rim. Esses cistos são revestidos por uma única camada de células epiteliais chamada epitélio cistico. Ao longo do tempo, os cistos aumentam de tamanho devido à proliferação celular elevada e à secreção ativa de fluido pelo epitélio cistico. Os cistos aumentados comprimem o tecido normal circundante, resultando em um declinio da função renal. A doença eventualmente progride para doença renal terminal, necessitando de diálise ou transplante de rins. Neste estágio, os cistos podem estar rodeados por áreas de fibrose contendo túbulos atróficos.

[0004] Vários distúrbios genéticos podem resultar em doença renal policistica (PKD). As várias formas de PKD distinguem-se pela maneira de herança, por exemplo, herança autossômica dominante ou autossômica recessiva; o envolvimento de órgãos e apresentação de fenótipos fora do rim; a idade de inicio da doença renal terminal, por exemplo, no nascimento,

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2/97 na infância ou na idade adulta; e a mutação genética subjacente associada à doença. Vide, por exemplo, Kurschat et al., 2014, Nature Reviews Nephrology, 10: 687-699.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Modalidade 1. Um composto compreendendo um oligonucleotideo modificado que consiste em 9 nucleosideos ligados, em que o oligonucleotideo modificado tem o seguinte padrão nucleosidico na orientação 5' para 3':

NsNsNmNfNfNfNmNsNs em que nucleosideos seguidos por subscrito M são 2 '-O-metil nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito F são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito S são S-cEt nucleosideos, e todas as ligações são fosforotioato; e em que a sequência de nucleobase do oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobase 5'-CACUUU-3', em que cada citosina é independentemente selecionada dentre uma citosina não metilada e uma 5-metilcitosina; ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

Modalidade 2. O composto, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de nucleobases do oligonucleotido modificado compreende a sequência de nucleobases 5'-GCACUUU3', em que cada citosina é independentemente selecionada dentre uma citosina não metilada e uma 5-metilcitosina.

Modalidade 3. O composto, de acordo com a modalidade 1, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotideo modificado é 5'-AGCACUUUG-3', em que cada citosina é independentemente selecionada dentre uma citosina não metilada e uma 5-metilcitosina.

Modalidade 4. O composto, de acordo com qualquer uma

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3/97 das modalidades 1, 2 ou 3, em que a citosina é uma citosina não metilada.

Modalidade 5. 0 composto, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 4, em que o composto consiste no oligonucleotideo modificado ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Modalidade 6. 0 composto, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 5, em que o sal f armaceut icamente aceitável é sal sódico.

Modalidade 7. Um oligonucleotideo modificado que tem a estrutura:

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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Modalidade 8. 0 oligonucleotideo modificado, de acordo com a modalidade 7, que é um sal f armaceut icamente aceitável da estrutura.

Modalidade 9. 0 oligonucleotideo modificado, de acordo com a modalidade 7, que é um sal sódico da estrutura.

Modalidade 10. Um oligonucleotideo modificado que tem a estrutura:

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Modalidade 11. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 6, ou um oligonucleotpideo modificado de acordo com qualquer uma das modalidades de 7 a 10 e um diluente farmaceuticamente aceitável.

Modalidade 12. A composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 11, em que o diluente farmaceuticamente aceitável é uma solução aquosa.

Modalidade 13. A composição farmacêutica, de acordo

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6/97 com a modalidade 12, emq ue a solução aquosa é uma solução salina .

Modalidade 14. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 6, ou um oligonucleotideo modificado de acordo com qualquer uma das modalidades de 7 a 10, que é uma composição liofilizada.

Modalidade 15. Uma composição farmacêutica que consiste essencialmente em um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 6, ou um oligonucleotideo modificado de acordo com qualquer uma das modalidades de 7 a 10 em uma solução salina.

Modalidade 16. Um método para inibir a atividade de um ou mais membros da família miR-17 em uma célula, compreendendo colocar a célula em contato com um composto de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 6, ou um oligonucleotideo modificado de acordo com qualquer uma das modalidades de 7 a 10.

Modalidade 17. Um método para inibir a atividade de um ou mais membros da família miR-17 em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades de 11 a 15.

Modalidade 18. O método, de acordo com a modalidade 17, em que o sujeito tem uma doença associada a miR-17.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0005] Figuras 1A-1B. (A) Atividade de RG4326 no ensaio de luciferase de miR-17. (B) Atividade de RG4326 em ensaios de luciferase do membro da família miR-17.

[0006] Figura 2. Contagem de assinatura PD em células IMCD3 após tratamento com RG4326 ou controle RG5124.

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7/97 [0007] Figura 3A-3B. miPSA mostrando ο envolvimento de miR-17 alvo em rim (A) de camundongos do tipo selvagem e (B) rim de camundongos tratados com RG4326.

[0008] Figura 4A-4C. Eficácia de RG4326 no modelo Pkd2-KO de PKD. Efeitos do tratamento em (A) razão de peso rim para corpo, (B) nivel de nitrogênio ureico no sangue (BUN) e (C) indice cistico.

[0009] Figura 5A-5C. Eficácia de RG4326 no modelo Pcy de PKD. Efeitos do tratamento em (A) razão de peso rim para corpo, (B) nivel de nitrogênio ureico no sangue (BUN) e (C) indice cistico.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0010] A menos que definido o contrário, todos os termos técnicos e cientificos usados neste documento têm o mesmo significado, como é comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. A menos que as definições especificas sejam fornecidas, a nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos e técnicas de quimica analitica, quimica orgânica sintética e quimicas farmacêutica e medicinal descritos neste documento são aqueles bem-conhecidos e comumente usados na técnica. No caso de existir uma pluralidade de definições para termos neste documento, aqueles desta seção prevalecem. Técnicas padrão podem ser usadas para sintese quimica, análise quimica, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento de sujeitos. Certas técnicas e procedimentos podem ser encontrados, por exemplo, em Carbohydrate Modifications in Antisense Research Editado por Sanghvi e Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; e Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton,

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Pensilvânia, 18^a edição, 1990; e que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins. Quando permitido, todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos publicados e publicações, sequências do GENBANK, sites e outros materiais publicados referidos durante toda a divulgação neste documento, salvo indicação em contrário, são incorporados por referência na sua totalidade. Onde a referência é feita a um URL ou outros tal identificador ou endereço, é entendido que esses identificadores podem alterar e determinadas informações na internet podem mudar, mas informações equivalentes podem ser encontradas através de pesquisa na internet. A referência à mesma evidencia a disponibilidade e divulgação de tais informações.

[0011] Antes das presentes composições e métodos serem divulgados e descritos, deve ser entendido que a terminologia usada neste documento é para o fim de descrever apenas modalidades especificas e pretender ser limitativa. Deve-se notar que, conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares um uma e o/a incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

Definições [0012] Doença renal policistica ou PKD é uma doença renal cistica caracterizada pelo acúmulo de vários cistos cheios de liquido no rim. Os múltiplos cistos se formam em pelo menos um rim, frequentemente levando ao aumento do(s) rim(ns) afetado(s) e à perda progressiva da função renal.

[0013] Marcador de doença renal policistica significa um parâmetro médico que é usado para avaliar a gravidade da doença renal policistica, função renal e/ou

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9/97 resposta de um sujeito tendo doença renal policistica ao tratamento. Os exemplos não limitativos de marcadores de doença renal policistica incluem volume renal total, hipertensão, taxa de filtração glomerular e dor renal.

[0014] Marcador da função renal significa um parâmetro médico que é usado para avaliar a função renal em um sujeito. Os exemplos não limitativos de marcadores da função renal incluem taxa de filtração glomerular, nivel de nitrogênio uréico no sangue e nivel de creatinina sérica.

[0015] Doença renal de rim policistico autossômica dominante ou ADPKD é uma doença renal policistica causada por uma ou mais mutações genéticas no gene PKD1 e/ou PKD2. 85% da ADPKD é causada por mutações na PKD 1, que está localizada no cromossomo 16, com a maioria dos casos restantes de ADPKD causada por mutações na PKD2, localizada no cromossomo 4.

[0016] doença renal policistica autossômica recessiva ou ARPKD é uma doença renal policistica causada por uma ou mais mutações genéticas no gene PKHD1, localizado no cromossomo 6. Até 50% dos neonatos com ARPKD morrem de complicações da doença renal intra-uterina, e cerca de um terço dos que sobrevivem desenvolvem doença renal terminal (ESRD) em 10 anos.

[0017] Nefronoftise ou NPHP significa uma doença renal cistica autossômica recessiva caracterizada por cistos corticomedulares, ruptura da membrana basal tubular e nefropatia tubulointersticial.

[0018] Volume renal total ou TKV é uma medição do volume renal total. O volume total renal pode ser determinado por ressonância magnética (RM), tomografia

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10/97 computadorizada (TC) ou ultrassonografia (US), e o volume calculado por uma metodologia padrão, como uma equação de volume elipsoidal (para ultrassonografia) ou estereologia quantitativa ou traçado de contorno (para CT/MRI).

[0019] Volume renal total ajustado à altura ou HtTKV é uma medição do volume renal total por unidade de

altura.	Prevê-se	que os	pacientes com	um valor de	HtTKV > 600
ml/m desenvolvam	doença	renal crônica	de estágio	3 dentro de
8 anos.	[0020]	Dor	nos rins	significa	dor renal

clinicamente significativa, necessitando de licença médica, tratamento farmacológico (agentes analgésicos narcóticos ou de último recurso) ou intervenção invasiva.

[0021] Agravamento da hipertensão significa uma alteração na pressão arterial que requer o inicio ou o aumento do tratamento de hipertensão.

[0022] Fibrose significa a formação ou desenvolvimento de excesso de tecido conjuntivo fibroso em um órgão ou tecido. Em certas modalidades, a fibrose ocorre como um processo reparativo ou reativo. Em certas modalidades, a fibrose ocorre em resposta a danos ou lesões. O termo fibrose deve ser entendido como a formação ou desenvolvimento de tecido

conjuntivo fibroso	em excesso em	um órgão ou	tecido como	um
processo reparativo	ou reativo, em oposição a	uma formação	de
tecido fibroso como um constituinte normal	de um órgão	ou
tecido.
[0023]	Hematúria	significa a	l presença	de
glóbulos vermelhos	na urina.
[0024]	Albuminúria	significa	a presença	de
excesso de albumi	na na urina	e inclui,	sem limitação,

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11/97 albuminúria normal, albuminúria normal alta, microalbuminúria e macroalbuminúria. Normalmente, a barreira de permeabilidade da filtração glomerular, que é composta por podócitos, membrana basal glomerular e células endoteliais, impede que as proteínas séricas vazem para a urina. A albuminúria pode refletir lesão da barreira de permeabilidade da filtração glomerular. A albuminúria pode ser calculada a partir de uma amostra de urina de 24 horas, uma amostra de urina durante a noite ou uma amostra de urina no local.

[0025] Albuminúria normal alta significa albuminúria elevada caracterizada por (i) a excreção de 15 a <30 mg de albumina na urina por 24 horas e/ou (ii) uma relação albumina/creatinina de 1,25 a < 2,5 mg/mmol (ou 10 a <20 mg/g) em machos ou 1,75 a <3,5 mg/mmol (ou 15 a <30 mg/g) em fêmeas.

[0026] Microalbuminúria significa albuminúria elevada caracterizada por (i) a excreção de 30 a 300 mg de albumina na urina por 24 horas e/ou (ii) uma relação albumina/creatinina de 2,5 a <25 mg/mmol (ou 20 a <200 mg/g) em machos ou 3,5 a <35 mg/mmol (ou 30 a <300 mg/g) em fêmeas.

[0027] Macroalbuminúria significa albuminúria elevada caracterizada pela excreção de mais de 300 mg de albumina na urina por 24 horas e/ou (ii) uma razão de albumina/creatinina de > 25 mg/mmol (ou > 200 mg/g) em machos ou > 35 mg/mmol (ou> 300 mg/g) em fêmeas.

[0028] Razão albumina/creatinina significa a razão de albumina na urina (mg/dl) por creatinina na urina (g/dl) e é expressa em mg/g. Em certas modalidades, a razão albumina/creatinina pode ser calculada a partir de uma amostra de urina no local e pode ser usada como uma estimativa da excreção de albumina durante um período de 24 horas.

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12/97 [0029] Taxa de filtração glomerular ou GFR significa a taxa de fluxo do fluido filtrado através do rim e é usado como um indicador da função renal em um sujeito. Em certas modalidades, a GFR de um sujeito é determinada calculando uma taxa de filtração glomerular estimada. Em certas modalidades, a GFR de um sujeito é medição diretamente no sujeito, usando o método da inulina.

[0030] Taxa de filtração glomerular estimada ou eGFR significa uma medição de quão bem os rins estão filtrando a creatinina e é usada para se aproximar da taxa de filtração glomerular. Como a medição direta da GFR é complexa, a eGFR é frequentemente usada na prática clinica. Os resultados normais podem variar de 90 a 120 mL/min/1,73 m². Os niveis abaixo de 60 mL/min/1,73 m² por 3 ou mais meses podem ser indicadores de uma doença renal crônica. Os niveis abaixo de 15 mL/min/1,73 m² podem ser indicadores de insuficiência renal.

[0031] Proteinúria significa a presença de um excesso de proteinas séricas na urina. A proteinúria pode ser caracterizada pela excreção de > 250 mg de proteina na urina por 24 horas e/ou uma razão de > 0,20 mg/mg entre proteina para creatinina na urina. Proteinas séricas elevadas em associação com proteinúria incluem, sem limitação, albumina.

[0032] Nivel de nitrogênio ureico no sangue ou nivel de BUN significa uma medição da quantidade de nitrogênio no sangue sob a forma de ureia. O figado produz ureia no ciclo da ureia como um produto residual da digestão de proteinas, e a ureia é removida do sangue pelos rins. O sangue humano adulto normal pode conter entre 7 e 21 mg de nitrogênio ureico por 100 ml (7-21 mg/dl) de sangue. A medição do nivel de nitrogênio ureico no sangue é usada como um

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13/97 indicador de saúde renal. Se os rins não são capazes de remover a ureia do sangue normalmente, o nivel de BUN do paciente aumenta.

[0033] Elevado significa um aumento em um parâmetro médico que é considerado clinicamente relevante. Um profissional de saúde pode determinar se um aumento é clinicamente significativo.

[0034] Doença renal em estádio terminal (ESRD) significa a insuficiência completa ou quase completa da função renal.

[0035] Qualidade de vida significa a extensão em que o funcionamento fisico, psicológico e social de um sujeito é prejudicado por uma doença e/ou tratamento de uma doença. A qualidade de vida pode ser reduzida em sujeitos com doença renal policistica.

[0036] Função renal prejudicada significa função renal reduzida, em relação à função renal normal.

[0037] Diminuir o agravamento e piora lenta significa reduzir a taxa em que uma condição médica se move em direção a um estado avançado.

[0038] Tempo de retardo para diálise significa manter uma função renal suficiente de tal forma que a necessidade de tratamento de diálise é retardada.

[0039] Tempo de retardo para o transplante renal significa manter uma função renal suficiente de tal modo que a necessidade de um transplante renal seja retardada.

[0040] Melhora a espectativa de vida significa prolongar a vida de um sujeito tratando um ou mais sintomas de uma doença no sujeito.

[0041] Sujeito significa um humano ou animal

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14/97 não humano selecionado para tratamento ou terapia.

[0042] Sujeito em necessidade significa um sujeito identificado como necessitando de uma terapia ou de um tratamento.

[0043] Sujeito suspeito de ter significa um sujeito que exibe um ou mais indicadores clínicos de uma doença.

[0044] Doença associada ao miR-17 significa uma doença ou condição que é modulada pela atividade de um ou mais membros da família miR-17.

[0045] Administrar significa fornecer uma composição ou um agente farmacêutico a um animal e inclui, mas não está limitado a, administração por um profissional médico e autoadministração.

[0046] Administração parentérica significa administração por injeção ou infusão.

[0047] A administração parentérica inclui, mas não está limitada a, administração subcutânea, administração intravenosa e administração intramuscular.

[0048] Administração subcutânea significa a administração logo abaixo da pele.

[0049] Administração intravenosa significa administração em uma veia.

[0050] Administrados concomitantemente se refere à coadministração de dois ou mais agentes em qualquer forma em que os efeitos f armacológicos de ambos são manifestados no paciente ao mesmo tempo.

[0051] A administração concomitante não exige que ambos os agentes sejam administrados em uma única composição farmacêutica, na mesma forma de dosagem ou pela mesma via de

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15/97 administração. Os efeitos de ambos os agentes não precisam se manisfestar ao mesmo tempo. Os efeitos precisam apenas ser sobrepostos por um periodo de tempo e não precisam ser coextensivos.

[0052] Duração significa o periodo durante o qual uma atividade ou evento continua. Em certas modalidades, a duração do tratamento é o periodo durante o qual as doses de um agente farmacêutico ou composição farmacêutica são administradas.

[0053] Terapia significa um método de tratamento da doença. Em certas modalidades, a terapia inclui, mas não está limitada a, administração de um ou mais agentes farmacêuticos a um sujeito com uma doença.

[0054] Tratar significa aplicar um ou mais procedimentos específicos usados para a melhoria de pelo menos um indicador de uma doença. Em certas modalidades, o procedimento específico é a administração de um ou mais agentes farmacêuticos. Em certas modalidades, o tratamento de PKD inclui, mas não está limitado a, redução do volume total do rim, melhoria da função renal, redução da hipertensão e/ou redução da dor renal.

[0055] Melhorar significa diminuir a gravidade de pelo menos um indicador de uma condição ou doença. Em determinadas modalidades, melhora inclui um retardo ou diminuição da progressão de um ou mais indicadores de uma condição médica ou doença. A gravidade dos indicadores pode ser determinada por medidas subjetivas ou objetivas, que são conhecidas por aqueles versados na técnica.

[0056] Em risco de desenvolvimento significa o estado em que um sujeito está predisposto a desenvolver uma

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16/97 condição ou doença. Em certas modalidades, um sujeito em risco de desenvolver uma condição ou doença exibe um ou mais sintomas da condição ou doença, porém não exibe um número suficiente de sintomas a serem diagnosticados com a condição ou doença. Em certas modalidades, um sujeito em risco de desenvolver uma condição ou doença exibe um ou mais sintomas da condição ou doença, porém em um grau menor requerido para ser diagnosticado com a condição ou doença.

[0057] Prevenir o aparecimento de significa prevenir o desenvolvimento de uma condição médica ou doença em um paciente que corre risco de desenvolver a doença ou condição médica. Em certas modalidades, um sujeito que corre risco de desenvolver a doença ou condição médica recebe tratamento semelhante ao tratamento recebido por um sujeito que já tem a doença ou condição médica.

[0058] Retardar o aparecimento de significa retardar o desenvolvimento de uma condição médica ou doença em um paciente que corre risco de desenvolver a doença ou condição médica. Em certas modalidades, um sujeito que corre risco de desenvolver a doença ou condição médica recebe tratamento semelhante ao tratamento recebido por um sujeito que já tem a doença ou condição médica.

[0059] Dose significa uma quantidade especificada de um agente farmacêutico fornecida em uma única administração. Em certas modalidades, uma dose pode ser administrada em dois ou mais bolos, comprimidos ou injeções. Por exemplo, em determinadas modalidades onde a administração subcutânea é desejada, a dose desejada requer um volume não facilmente acomodado por uma única injeção. Em tais modalidades, duas ou mais injeções podem ser usadas para

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17/97 atingir a dose desejada. Em determinadas modalidades, uma dose pode ser administrada em duas ou mais injeções para minimizar a reação do local de injeção em um individuo. Em certas modalidades, uma dose é administrada como uma infusão lenta.

[0060] Unidade de dosagem significa uma forma em que é administrado um agente farmacêutico. Em certas modalidades, uma unidade de dosagem é um frasco contendo oligonucleotideo liofilizado. Em certas modalidades, uma unidade de dosagem é um frasco contendo oligonucleotideo reconstituído.

[0061] Quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade de um agente farmactico que fornece um beneficio terapêutico a um animal.

[0062] Composição farmacêutica significa uma mistura de substâncias adequadas para a administração a um individuo que inclui um agente farmacêutico. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender uma solução aquosa estéril.

[0063] Agente farmacêutico significa uma substância que fornece um efeito terapêutico quando administrada a um sujeito.

[0064] Ingrediente farmacêutico ativo significa a substância em uma composição farmacêutica que fornece um efeito desejado.

[0065] Sal farmaceuticamente aceitável significa um sal fisiologicamente e farmaceuticamente aceitável de um composto fornecido neste documento, ou seja, um sal que retém a atividade biológica desejada do composto e não tem efeitos toxicológicos indesejados quando administrados a um sujeito. Sais farmaceuticamente aceitáveis

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18/97 exempli!icativos não limitantes dos compostos fornecidos neste documento incluem formas de sal de sódio e sal de potássio. Os termos composto, oligonucleotideo e oligonucleotideo modificado, conforme usados neste documento, incluem sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, a menos que especificamente indicado em contrário.

[0066] Solução salina significa uma solução de cloreto de sódio em água.

[0067] Função orgânica melhorada significa uma mudança na função do órgão em relação aos limites normais. Em certas modalidades, a função dos órgãos é avaliada por medição de moléculas encontradas no sangue ou na urina de um sujeito. Por exemplo, em certas modalidades, a função renal melhorada é medida por uma redução no nivel de nitrogênio da ureia no sangue, uma redução na proteinúria, uma redução na albuminúria, etc.

[0068] Perfil de segurança aceitável significa um padrão de efeitos colaterais que está dentro dos limites clinicamente aceitáveis.

[0069] Efeitos colaterais significam respostas fisiológicas atribuíveis a um tratamento diferente dos efeitos desejados. Em determinadas modalidades, os efeitos colaterais incluem, sem limitação, reações no local de injeção, anormalidades do teste de função hepática, anormalidades da função renal, toxicidade hepática, toxicidade renal, anormalidades do sistema nervoso central e miopatias. Tais efeitos colaterais podem ser detectados direta ou indiretamente. Por exemplo, niveis aumentados de aminotransferase no soro podem indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, a bilirrubina

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19/97 aumentada pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática.

[0070] O termo sangue, conforme usado neste documento, abrange sangue total e frações de sangue, tais como soro e plasma.

[0071] Anti-miR significa um oligonucleotideo tendo uma sequência de nucleobase complementar a um microRNA. Em certas modalidades, um anti-miR é um oligonucleotideo modificado.

[0072] Anti-miR-17 significa um oligonucleotideo modificado tendo uma sequência de nucleobases complementar a um ou mais membros da família de miR-17. Em certas modalidades, um anti-miR-17 é totalmente complementar (isto é, 100% complementar) a um ou mais membros da família de miR-17. Em certas modalidades, um anti-miR-17 é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% complementar a um ou mais membros da família de miR-17.

[0073] miR-17 significa o miRNA maduro que tem a sequência de nucleobas 5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3 '(SEQ ID NO: 1).

[0074] miR-20a significa o miRNA maduro com a sequência de nucleobase 5'-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3 '(SEQ ID NO: 2).

[0075] miR-20b significa o miRNA maduro que tem a sequência de nucleobase 5'-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG -3 '(SEQ ID NO: 3).

[0076] miR-93 significa o miRNA maduro com a sequência de nucleobase 5'-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3 '(SEQ ID NO: 4).

[0077] miR-106a significa o miRNA maduro com a

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20/97 sequência de nucleobase 5'-AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3 '(SEQ ID NO: 5).

[0078] miR-106b significa o miRNA maduro com a sequência de nucleobase 5'-UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU-3 '(SEQ ID NO: 6).

[0079] sequência de semente de miR-17 significa a sequência de nucleobases 5'-AAAGUG-3, 'que está presente em cada um dos membros da família de miR-17.

[0080] Membro da família miR-17 significa um miRNA maduro tendo uma sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência semente de miR-17 e que é selecionada dentre miR17, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-106a e miR-106b.

[0081] família miR-17 significa o seguinte grupo de miRNAs: miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-106a e miR-106b, cada um com uma sequência de nucleobase compreendendo a sequência semente miR-17.

[0082] Ácido nucleico alvo significa um ácido nucleico para o qual um composto oligomérico é concebido para hibridizar.

[0083] Segmentação significa o processo de concepção e selecção da sequência da nucleobase que irá hibridar com um ácido nucleico alvo.

[0084] Direcionado para significa ter uma sequência de nucleobases que permitirá a hibridação com um ácido nucleico alvo.

[0085] Modulação significa uma perturbação da função, quantidade ou atividade. Em certas modalidades, a modulação significa um aumento na função, quantidade ou atividade. Em certas modalidades, a modulação significa uma diminuição na função, quantidade ou atividade.

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21/97 [0086] Expressão denota todas as funções e etapas pelas quais as informações codificadas de um gene é convertida em estruturas presentes e que operam em uma célula.

[0087] Sequência de nucleobase significa a ordem de nucleobases continuas em um composto oligomérico ou ácido nucleico, tipicamente listadas em uma orientação 5' para 3' e independente de qualquer modificação de açúcar, ligação e/ou nucleobase.

[0088] Nucleobases continuas significam nucleobases imediatamente adjacentes uma a outra em um ácido nucleico.

[0089] Complementaridade de nucleobases significa a capacidade das duas nucleobases de se emparelharem de forma não covalente por meio de uma ligação de hidrogênio.

[0090] Complementar significa que um ácido nucleico é capaz de hibridar com outro ácido nucleico ou oligonucleotideo. Em certas modalidades, complementar referese a um oligonucleotideos capaz de hibridar-se com um ácido nucleico alvo.

[0091] Totalmente complementar significa que cada nucleobase de um oligonucleido capaz de emparelhar com uma nucleobase em cada posio correspondente em um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, um oligonucleotideo é totalmente complementar (também referido como uma complementaridade de 100%) a um microRNA, ou seja, cada nucleobase do oligonucleotideo é complementar a uma nucleobase a uma posição correspondente no microRNA. Um oligonucleotideo modificado pode ser totalmente complementar a um microRNA, e ter vários nucleotideos ligados que são menores do que o comprimento do microRNA. Por exemplo, um oligonucleotideo com

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22/97 nucleotídeos ligados, onde cada nucleobase do oligonucleotideo é complementar a uma nucleobase em uma posição correspondente em um microRNA, é totalmente complementar ao microRNA. Em certas modalidades, um oligonucleotideo em que cada nucleobase tem complementaridade a uma nucleobase dentro de uma região de uma sequência stem-loop de microRNA é totalmente complementar à sequência stem-loop de microRNA.

[0092] Porcentagem complementar significa a percentagem de nucleobases de um oligonucleotideo que são complementares a uma poro de comprimento igual de um ácido nucleico alvo. A complementaridade percentual é calculada ao dividir o número de nucleobases do oligonucleotideo que são complementares a nucleobases em posições correspondentes no ácido nucleico alvo em um número total de nucleobases no oligonucleotideo.

[0093] A Identidade percentual significa o número de nucleobases em um primeiro ácido nucleico que são idênticas às nucleobases nas posições correspondentes em um segundo ácido nucleico dividido pelo número total de nucleobases no primeiro ácido nucleico. Em certas modalidades, o primeiro ácido nucleico é um microRNA e o segundo ácido nucleico é um microRNA. Em certas modalidades, o primeiro ácido nucleico é um oligonucleotideo e o segundo ácido nucleico é um oligonucleotideo.

[0094] Hibridizar significa a hibridização de ácidos nucleicos complementares que ocorre através da complementaridade de nucleobases.

[0095] Não corresponder denota uma nucleobase de um primeiro ácido nucleico que não é capaz de emparelhamento de Watson-Crick com uma nucleobase em uma posição

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23/97 correspondente de um segundo ácido nucleico.

[0096] Idêntico no contexto de sequências de nucleobases, significa ter a mesma sequência de nucleobases, independente de modificações de açúcar, ligação e/ou nucleobase e independente do estado de metilação de quaisquer pirimidinas presentes.

[0097] MicroRNA significa um RNA endógeno não codificante entre 18 e 25 nucleobases de comprimento, que é o produto da divagem de um pré-microRNA pela enzima Dicer. Os exemplos de microRNAs maduros são encontrados no banco de dados de microRNA conhecido como miRBase (microrna.sanger.ac.uk/). Em certas modalidades, o microRNA é abreviado como miR.

[0098] Transcrito regulado por microRNA significa um transcrito que é regulado por um microRNA.

[0099] Sequência de correspondência de semente significa uma sequência de nucleobase que é complementar a uma sequência de semente e tem o mesmo comprimento que a sequência de semente.

[0100] Composto oligomérico significa um composto que compreende uma pluralidade de subunidades monomélicas ligadas. Os compostos oligoméricos incluem oligonucleotideos.

[0101] Oligonucleotideo significa um composto compreendendo uma pluralidade de nucleosideos ligados, cada um dos quais pode ser modificado ou não modificado, independente um do outro.

[0102] Ligação internucleosideo de ocorrência natural significa uma ligação de fosfodiéster 3' -para 5' entre nucleosideos.

[0103] Açúcar natural significa um açúcar

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24/97 encontrado no DNA (2'-H) ou RNA (2'-OH).

[0104] Ligação internucleosidica significa uma ligação covalente entre nucleosideos adjacentes.

[0105] Nucleosideos ligados significa nucleosideos ligados por uma ligação covalente.

[0106] Nucleobase significa uma porção heterociclica capaz de emparelhamento não covalente com outra nucleobase.

[0107] Nucleosideo significa uma nucleobase ligada a uma fração de açúcar.

[0108] Nucleotideo significa um nucleosideo que tem um grupo fosfato covalentemente ligado à fração de açúcar de um nucleosideo.

[0109] Composto compreendendo um oligonucleotideo modificado que consiste em um número de nucleosideos ligados significa um composto que inclui um oligonucleotideo modificado tendo o número especificado de nucleosideos ligados. Portanto, o composto pode incluir substituintes ou conjugados adicionais. A menos que indicado em contrário, o oligonucleotideo modificado não é hibridado com uma cadeia complementar e o composto não inclui quaisquer nucleosideos adicionais além dos do oligonucleotideo modificado.

[0110] Oligonucleotideo modificado significa um oligonucleotideo de fita simples tendo uma ou mais modificações relativas a uma ligação de terminal, açúcar, nucleobase e/ou internucleosideo de ocorrência natural. Um oligonucleotideo modificado pode compreender nucleosideos não modificados.

[0111] Nucleosideo modificado significa um nucleosideo que tem qualquer alteração de um nucleosideo de

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25/97 ocorrência natural. Um nucleosídeo modificado pode ter um açúcar modificado e uma nucleobase não modificada. Um nucleosídeo modificado pode ter um açúcar modificado e uma nucleobase modificada. Um nucleosídeo modificado pode ter um açúcar natural e uma nucleobase modificada. Em certas modalidades, um nucleosídeo modificado é um nucleosídeo bicíclico. Em certas modalidades, um nucleosídeo modificado é um nucleosídeo não bicíclico.

[0112] Ligação internucleosídica modificada significa qualquer alteração de uma ligação internucleosídica de ocorrência natural.

[0113] Ligação internucleosídica de fosforotioato significa uma ligação entre nucleosídeos em que um dos átomos não em ponte é um átomo de enxofre.

[0114] Porção de açúcar modificado significa substituição e/ou qualquer alteração de um açúcar natural.

[0115] Nucleobase não modificada significa as bases heterocíclicas de RNA ou DNA que ocorrem naturalmente: as bases purinas adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) (incluindo 5metilcitosina) e uracila (U).

[0116] 5-metilcitosina significa uma citosina compreendendo um grupo metil ligado à posição 5.

[0117] Citosina não metilada significa uma citosina que não tem um grupo metil ligado à posição 5.

[0118] Nucleobase modificada significa qualquer nucleobase que não seja uma nucleobase não modificada.

[0119] Porção de açúcar significa um furanosil que ocorre naturalmente ou uma fração de açúcar modificada.

[0120] Fração de açúcar modificado se refere a

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26/97 uma fração de açúcar substituída ou a um substituto do açúcar.

[0121] 2'-0-metil-açúcar ou 2'-OMe açúcar significa um açúcar que tem uma modificação O-metílica na posição 2'.

[0122] Açúcar 2'-0-metoxietil ou açúcar 2'MOE significa um açúcar tendo uma modificação O-metoxietil na posição 2'.

[0123] 2'-fluoro ou 2'-F significa um açúcar com uma modificação de fluor da posição 2'.

[0124] Fração de açúcar bicíclico significa uma fração de açúcar modificada compreendendo um anel de 4 a 7 membros (incluindo, mas não se limitando a um furanosil) compreendendo uma ponte que conecta dois átomos do anel de 4 a 7 membros para formar um segundo anel, resultando em uma estrutura bicíclica. Em certas modalidades, o anel de 4 a 7 membros é um anel de açúcar. Em certas modalidades, o anel de 4 a 7 membros é um furanosil. Em certas modalidades, a ponte liga o carbono 2' e o carbono 4' do furanosil.

[0125] As frações de açúcar bicíclico exemplificativas não limitativas incluem LNA, ENA, cEt, S-cEt e R-cEt.

[0126] Porção de açúcar de ácido nucleico bloqueado (LNA) significa uma porção de açúcar substituído compreendendo uma ponte (CH2)-0 entre os átomos do anel 4' e 2 ' furanose.

[0127] Fração de açúcar ENA significa uma fração de açúcar compreendendo uma ponte de (CtRH-O entre os átomos do anel de furanose 4' e 2'.

[0128] Fração de açúcar de etil restringida (cEt) significa uma fração de açúcar substituída

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27/97 compreendendo uma ponte de CH(CH3)-0 entre os átomos do anel de furanose 4' e 2'. Em certas modalidades, a ponte CH(CH3)-0 é limitada na orientação S. Em certas modalidades, o CH (CH3)0 é restringido na orientação R.

[0129] Porção de açúcar S-cEt significa uma fração de açúcar substituído compreendendo uma ponte CH(CH3) O entre os átomos do anel de furanose 4' e 2'.

[0130] Fração de açúcar R-cEt significa uma fração de açúcar substituída compreendendo uma ponte CH (CH3) O entre os átomos do anel de furanose 4' e 2'.

[0131] 2'-0-metil nucleosideo significa um nucleosideo 2'-modificado tendo uma modificação de açúcar 2'0-metil.

[0132] 2'-O-metoxietil nucleosideo significa um nucleosideo modificado em 2' com uma modificação de açúcar 2'O-metoxietil. Um nucleosideo 2'-O-metoxietil pode compreender uma nucleobase modificada ou não modificada.

[0133] 2'-fluoro nucleosideo significa um nucleosideo 2'-modificado tendo uma modificação de açúcar 2'fluoro. Um 2'-fluoro nucleosideo pode compreender uma nucleobase modificada ou não modificada.

[0134] Nucleosideo biciclico significa um nucleosideo 2'-modificado tendo uma fração de açúcar biciclico. Um nucleosideo biciclico pode ter uma nucleobase modificada ou não modificada.

[0135] Nucleosideo cEt significa um nucleosideo que compreende uma porção de açúcar cEt. Um nucleosideo cEt pode compreender uma nucleobase modificada ou não modificada.

[0136] Nucleosideo S-cEt significa um nucleosideo compreendendo uma fração de açúcar S-cEt.

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28/97 [0137] Nucleosídeo R-cEt significa um nucleosideo compreendendo uma fração de açúcar R-cEt.

[0138] β-D-desoxirribonucleosídeo significa um nucleosideo de DNA de ocorrência natural.

[0139] β-D-ribonucleosídeo significa um nucleosideo de RNA de ocorrência natural.

[0140] Nucleosídeo de LNA significa um nucleosídeo que compreende uma porção de açúcar LNA.

[0141] Nucleosídeo ENA significa um nucleosídeo compreendendo uma fração de açúcar ENA.

Perspectiva Geral [0142] A doença renal policística (PKD) é uma forma hereditária de doença renal na qual os cistos cheios de líquido se desenvolvem nos rins, levando à insuficiência torácica e, muitas vezes, à doença renal terminal. Certas PKDs também são caracterizadas por aumento dos rins. A proliferação excessiva de cistos é uma característica patológica marcante da PKD. Ao lidar com a PKD, o objetivo principal para o tratamento é controlar sintomas tais como hipertensão e infecções, manter a função renal e prevenir o surgimento de doença renal terminal (ESRD), o que, por usa vez, melhora a espectativa de vida de sujeitos com PKD.

[0143] Os membros da família miR-17 do agrupamento miR-17-92 de microRNAs são regulados para cima em modelos de camundongos com PKD. A deleção genética do agrupamento miR-17 ~ 92 em um modelo de camundongo com PKD reduz o crescimento do cisto renal, melhora a função renal e prolonga a sobrevivência (Patel et al, PNAS, 2013; 110 (26) : 10765-10770) . Foi mostrado que a inibição de miR-17 com um composto de ferramentas de pesquisa reduz a razão do peso do

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29/97 rim para o corpo e melhora a função renal em um modelo experimental de PKD. Além disso, a inibição de miR-17 também suprimiu a proliferação e o crescimento do cisto de culturas primárias derivadas de cistos de doadores humanos.

[0144] Para identificar inibidores de um ou mais membros da famlia miR-17 que so suficientemente eficazes, seguros e convenientes para administrar a sujeitos com PKD, foram desenhados aproximadamente 200 oligonucleotideos modificados compreendendo uma sequência de nucleobase complementar da sequência semente de miR-17, tendo comprimentos variveis e composição quimica. O comprimento dos compostos variou de 9 a 20 nucleosideos ligados, e os compostos variaram em número, tipo e colocação de modificações químicas. Como farmacologia, comportamento farmacocinético e segurança não podem ser previstos simplesmente com base na estrutura quimica de um composto, os compostos foram avaliados in vitro e in vivo para características incluindo potência, eficácia, comportamento farmacocinético, segurança e estabilidade metabólica, em uma série de ensaios projetados para eliminar compostos com propriedades desfavoráveis. Conforme descrito neste documento, cada um dos quase 200 compostos foi primeiro testado em vários ensaios in vitro (por exemplo, potência, toxicologia, estabilidade metabólica), para identificar um conjunto menor de compostos adequados para testes adicionais em ensaios in vivo mais complexos (por exemplo, perfil farmacocinético, eficácia, toxicologia). Este processo de seleção identificou um agente farmacêutico candidato, o RG4326, para o tratamento da PKD. Conforme ilustrado neste documento, as variações no tipo e colocação de frações de açúcar resultaram em efeitos substanciais nas propriedades dos

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30/97 compostos testados, incluindo potência e distribuição nos tecidos. O RG4326 foi selecionado como o agente farmacêutico candidato, uma vez que este composto exibiu os perfis farmacodinâmico, de segurança e farmacocinéticos mais adequados relativos a outros compostos tendo o mesmo comprimento e sequência de nucleobase, porém padrões de modificação de açúcar diferentes.

Certos Compostos da Invenção [0145] São fornecidos neste documento compostos compreendendo um oligonucleotideo modificado que consiste em 9 nucleosideos ligados, em que o oligonucleotideo modificado tem o seguinte padrão nucleosidico na orientação 5' para 3':

NsNsNmNfNfNfNmNsNs em que nucleosideos seguidos por M subscrito são 2 '-O-metil nucleosideos, nucleosideos seguidos por F subscrito são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por S subscrito são nucleosideos S-cEt; e em que a sequência de nucleobase do oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobase 5'-CACUUU-3', em que cada citosina ou é uma citosina não metilada ou uma 5-metilcitosina; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em certas modalidades, a sequência de nucleobase do oligonucleotideo modificado é 5'AGCACUUUG-3' , em que cada citosina é ou uma citosina não metilada ou uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, cada citosina é uma citosina não metilada. Em algumas modalidades, cada ligação é independentemente selecionada dentre uma ligação fosfodiéster e uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, todas as ligações são ligações fosforotioato.

[0146] São fornecidos neste documento compostos da estrutura AsGsCmAfCfUfUmUsGs em que nucleosideos seguidos por

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31/97 subscrito M são 2'-0-metil nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito F são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito S são nucleosideos ScEt, cada citosina é uma citosina não metilada ou uma 5metilcitosina; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em certas modalidades, cada citosina é uma citosina não metilada. Em algumas modalidades, cada ligação é independentemente selecionada dentre uma ligação fosfodiéster e uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, todas as ligações são ligações fosforotioato.

[0147] São fornecidos neste documento compostos da estrutura AsGsCmAfCfUfUmUsGs em que os nucleosideos seguidos por subscrito M são 2'-0-metil nucleosideos, os nucleosideos seguidos por subscrito F são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito S são nucleosideos ScEt, cada citosina é uma citosina não metilada; ou um sal farmaceuticamente do mesmo. Em algumas modalidades, cada ligação é independentemente selecionada dentre uma ligação fosfodiéster e uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, todas as ligações são ligações fosforotioato.

[0148] São fornecidos neste documento compostos compreendendo um oligonucleotideo modificado que consiste em 9 nucleosideos ligados, em que o oligonucleotideo modificado tem o seguinte padrão nucleosidico na orientação 5' para 3':

NsNsNmNfNfNfNmNsNs em que nucleosideos seguidos por M subscrito são 2 '-0-metil nucleosideos, nucleosideos seguidos por F subscrito são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por S subscrito são nucleosideos S-cEt; e todas as ligações são ligações de f osf orot ioato; e em que a sequência de

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32/97 nucleobase do oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobase 5'-CACUUU-3', em que cada citosina ou é uma citosina não metilada ou uma 5-metilcitosina; ou urn sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em certas modalidades, a sequência de nucleobase do oligonucleotideo modificado é 5'AGCACUUUG-3' , em que cada citosina é ou uma citosina não metilada ou uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, cada citosina é uma citosina não metilada.

[0149] São fornecidos neste documento compostos da estrutura AsGsCmAfCfUfUmUsGs em que nucleosideos seguidos por subscrito M são 2'-O-metil nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito F são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito S são nucleosideos ScEt, cada citosina é uma citosina não metilada ou uma 5metilcitosina; e todas as ligações são ligações de fosforotioato; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em certas modalidades, cada citosina é uma citosina não metilada.

[0150] São fornecidos neste documento compostos da estrutura AsGsCmAfCfUfUmUsGs em que os nucleosideos seguidos por subscrito M são 2'-0-metil nucleosideos, os nucleosideos seguidos por subscrito F são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por subscrito S são nucleosideos ScEt, cada citosina é uma citosina não metilada; e todas as ligações são ligações fosforotioato; ou um sal farmaceuticamente do mesmo.

[0151] É fornecido neste documento um oligonucleotideo modificado denominado RG4326, em que a estrutura do oligonucleotideo modificado é:

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[0152] São fornecidos neste documento também sais farmaceuticamente aceitáveis do oligonucleotideo modificado RG4326. Portanto, em algumas modalidades, um oligonucleotideo modificado tem a estrutura:

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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Um sal farmaceuticamente aceitável exemplificativo não limitativo de RG4326 tem a estrutura:

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[0153] Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotideo modificado compreende menos contraions catiônicos (tais como Na⁺) do que ligações de fosforotioato e/ou fosfodiéstier por molécula (ou seja, algumas ligações de fosforotioato e/ou ligações de fosfodiéster são protonadas). Em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente aceitável de RG4326 compreende menos do que 8 contraions catiônicos (tais como Na⁺) por molécula de RG4326. Isto é, em algumas modalidades, um sal farmaceuticamente

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36/97 aceitável de RG4326 pode compreender, em média, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 contraions catiônicos por molécula de RG4326, com os grupos de fosforotioato remanescentes sendo protonados.

Certos Usos da Invenção [0154] São fornecidos neste documento os métodos para inibir a atividade de um ou mais membros da familia de miR-17 em uma célula, compreendendo o contato de uma célula com um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobases complementar à sequência de semente de miR-17.

[0155] São fornecidos neste documento métodos para inibir a atividade de um ou mais membros da familia miR17 em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica fornecida neste documento. Em certas modalidades, o sujeito tem uma doença associada a um ou mais membros da familia miR-17.

[0156] São fornecidos neste documento métodos para o tratamento de doença renal policistica (PKD), compreendendo a administração a um sujeito em necessidade do mesmo de um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobases complementar à sequência de semente de miR-17. Em certas modalidades, o sujeito tem uma doença renal policistica. Em certas modalidades, a doença renal policistica é selecionada dentre doença renal policistica autossômica dominante (ADPKD), doença renal policistica autossômica recessiva (ARPKD) e nefronoftise (NPHP). Em certas modalidades, a doença renal policistica é seleccionada dentre doença renal policistica autossômica dominante (ADPKD) e doença renal policistica autossômica recessiva (ARPKD).

[0157] Em certas modalidades, o sujeito tem um

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37/97 distúrbio que é caracterizado por múltiplos indicadores não renais, e também por doença renal policistica. Tais distúrbios incluem, por exemplo, a sindrome de Joubert e distúrbios relacionados (JSRD), sindrome de Meckel (MKS) ou sindrome de Bardet-Biedl (BBS) . Consequentemente, são fornecidos neste documento métodos para o tratamento de doença renal policistica (PKD), compreendendo administrar a um sujeito um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobase complementar à sequência semente de miR-17, em que o sujeito tem sindrome de Joubert e distúrbios relacionados (JSRD), sindrome de Meckel (MKS) ou sindrome de Bardet-Biedl (BBS) . São fornecidos neste documento métodos para o tratamento da doença renal policistica (PKD), compreendendo a administração de um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência nucleobásica complementar à sequência de semente de miR-17, em que se suspeita que o sujeito tem sindrome de Joubert e distúrbios relacionados (JSRD), Sindrome de Meckel (MKS) ou sindrome de Bardet-Biedl (BBS).

[0158] Em certas modalidades, a doença renal policistica é doença renal policistica autossômica dominante (ADPKD). A ADPKD é causada por mutações no gene PKD1 ou PKD2. AADPKD é uma doença progressiva, na qual a formação de cistos e o aumento renal levam à insuficiência renal e, em última instância, à doença renal terminal em 50% dos pacientes aos 60 anos. Os pacientes com ADPKD podem necessitar de diálise ao longo da vida e/ou transplante renal. ADPKD é a causa genética mais frequente de insuficiência renal. A proliferação excessiva de cistos é uma característica patológica marcante da ADPKD. Ao lidar com a PKD, o objetivo principal para o tratamento é manter a função renal e prevenir o surgimento de

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38/97 doença renal terminal (ESRD), o que, por usa vez, melhora a espectativa de vida de sujeitos com PKD. 0 volume renal total geralmente aumenta constantemente nos pacientes com ADPKD, com aumentos correlacionados com um declínio da função renal. São fornecidos neste documento métodos para o tratamento de ADPKD, compreendendo a administração a um sujeito tendo ou suspeito de ter ADPKD um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobases complementar à sequência semente miR-17.

[0159] Em certas modalidades, a doença renal policística é doença renal policística autossômica recessiva (ARPKD). A ARPKD é causada por mutações no gene PKHD1 e é uma causa de doença renal crônica em crianças. Um fenótipo renal típico de ARPKD é rins aumentados; no entanto, ARPKD tem efeitos notáveis em outros órgãos, particularmente no fígado. Os pacientes com ARPKD progridem para doença renal em estágio terminal e necessitam de um transplante renal a partir dos 15 anos de idade. São fornecidos neste documento métodos para o tratamento de ARPKD, compreendendo a administração a um sujeito tendo ou suspeito de ter ARPKD um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobases complementar à sequência semente miR-17.

[0160] Em certas modalidades, a doença renal policística é nefronoftise (NPHP).

[0161] A nefronoftise é uma doença renal cística autossômica recessiva ESRD que é uma causa frequente de doença renal terminal em crianças. A NPHP é caracterizada por rins de tamanho normal ou reduzido, cistos concentrados na junção corticomedular e fibrose tubulointersticial. As mutações em um dos vários genes NPHP, por exemplo, NPHP1, foram identificadas

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39/97 em pacientes com NPHP. São fornecidos neste documento métodos para o tratamento de NPHP, compreendendo a administração a um sujeito tendo ou suspeito de ter NPHP um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobases complementar à sequência semente miR-17.

[0162] Em certas modalidades, um sujeito com doença renal policistica tem sindrome de Joubert e distúrbios relacionados (JSRD). O JSRD inclui uma ampla faixa de características marcantes, incluindo anormalidades cerebrais, retinianas e esqueléticas. Certos sujeitos com JSRD têm doença renal policistica, além de características marcantes do JSRD. Consequentemente, são fornecidos neste documento métodos para o tratamento de doença renal policistica em um sujeito tendo JSRD, compreendendo administraar a um sujeito tendo JSRD um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobase complementar à sequência semente de miR-17. Em certas modalidades, um sujeito é suspeito de ter JSRD.

[0163] Em certas modalidades, um sujeito com doença renal policistica tem sindrome de Meckel (MKS). A MKS é um distúrbio com sinais e sintomas graves em muitas partes do corpo, incluindo o sistema nervoso central, o sistema esquelético, o fígado, os rins e o coração. As características comuns do MKS são a presença de numerosos cistos cheios de líquido no rim e aumento dos rins. Em conformidade, são fornecidos neste documento métodos para o tratamento de MKS, compreendendo a administração a um sujeito tendo ou suspeito de ter MKS um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobases complementar à sequência semente miR-17. Em certas modalidades, um sujeito é

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40/97 suspeito de ter MKS.

[0164] Em certas modalidades, um sujeito com doença renal policistica tem a sindrome de Bardet-Biedl (BBS). BBS é distúrbio que afeta muitas partes do corpo, incluindo o olho, coração, rim, figado e sistema digestivo. Uma caracteristica marcante do BBS é a presença de cistos renais. Consequentemente, são fornecidos neste documento métodos para o tratamento de doença renal policistica em um sujeito tendo BBS, compreendendo administraar a um sujeito tendo BBS um composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobase complementar à sequência semente de miR-17. Em certas modalidades, um sujeito é suspeito de ter BBS .

[0165] Em certas modalidades, o sujeito foi diagnosticado como tendo PKD antes da administração do composto compreendendo o oligonucleotideo modificado. O diagnóstico de PKD pode ser obtido através da avaliação de parâmetros incluindo, sem limitação, história familiar de um sujeito, caracteristicas clinicas (incluindo sem limitação hipertensão, albuminúria, hematúria e GFR prejudicada), estudos de imagem renal (incluindo, sem limitação, RM, ultrassonografia e TC escaneamento) e/ou análise histológica.

[0166] Em certas modalidades, o diagnóstico de PKD inclui a triagem de mutações em um ou mais dos genes PKD1 ou PKD2. Em certas modalidades, o diagnóstico de ARPKD inclui a triagem de mutações no gene PKHP1. Em certas modalidades, o diagnóstico de NPHP inclui a triagem de uma ou mais mutações em um ou mais dos genes NPHP1, NPHP2, NPHP3, NPHP4, NPHP5, NPHP6, NPHP7, NPHP8 ou NPHP9. Em certas modalidades, o diagnóstico de JSRD inclui a triagem de mutações nos genes

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NPHP1, NPHP 6, AHI1, MKS3 ou RPGRIP1L. Em certas modalidades, o diagnóstico de MKS inclui a triagem de mutações nos genes NPHP6, MKS3, RPGRIP1L, NPHP3, CC2D2A, BBS2, BBS4, BBS6 ou MKS1. Em certas modalidades, o diagnóstico de BBS inclui a triagem de mutações nos genes BBS2, BBS4, BBS6, MKS1, BBS1, BBS3, BBS5, BBS7, BBS7, BBS8, BBS9, BBS10, BBS11 ou BBS12.

[0167] Em certas modalidades, o sujeito tem um volume renal total aumentado. Em certas modalidades, o volume total do rim é o volume total do rim ajustado à altura (HtTKV). Em certas modalidades, o sujeito tem hipertensão. Em certas modalidades, o sujeito tem função renal comprometida. Em certas modalidades, o sujeito necessita de uma função renal melhorada. Em certas modalidades, o sujeito é identificado como tendo uma função renal comprometida.

[0168] Em certas modalidades, os níveis de um ou mais membros da família miR-17 são aumentados no rim de um sujeito com PKD. Em certas modalidades, antes da administração, determina-se que um sujeito tenha um nível aumentado de um ou mais membros da família miR-17 no rim. O nível de um membro da família miR-17 pode ser medido a partir de material de biópsia renal. Em certas modalidades, antes da administração, determina-se que um sujeito tenha um nível aumentado de um ou mais membros da família de miR-17 na urina ou no sangue do sujeito.

[0169] Em qualquer uma das modalidades fornecidas neste documento, um sujeito pode passar por certos testes para diagnosticar a doença renal policística no sujeito, por exemplo, para determinar a causa da doença renal policística, para avaliar a extensão da doença renal policística no sujeito e/ou para determinar a resposta do sujeito ao tratamento. Esses

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42/97 testes podem avaliar marcadores de doença renal policistica. Alguns desses testes, como a taxa de filtração glomerular e o nivel de nitrogênio uréico no sangue, também são indicadores da função renal. Os marcadores de doença policistica incluem, sem limitação: medição do volume total do rim no sujeito; medida de hipertensão no sujeito; avaliação da dor renal no sujeito; medição de fibrose no sujeito; medição do nivel de nitrogênio da ureia no sangue no sujeito; medição do nivel de creatinina no soro no sujeito; medir a depuração de creatinina no sujeito; medir albuminúria no sujeito; medição da albumina: razão de creatinina no sujeito; medir a taxa de filtração glomerular no sujeito; medir hematúria no sujeito; medição da proteína NGAL na urina do sujeito; e/ou medição da proteína KIM-1 na urina do sujeito. A menos que indicado em contrário neste documento, o nível de nitrogênio de ureia no sangue, o nível de creatinina sérico, depuração de creatinina, albuminuria, razão de creatinina para albumina, taxa de filtração glomerular e hematúria refere-se a uma medição no sangue (tal como sangue ou soro total) de um sujeito.

[0170] Os marcadores da doença renal policistica

são determinados	por testes	de	laboratório.	As	faixas	de
referência	para	marcadores	individuais podem	variar	de
laboratório	para	laboratório.	A	variação pode	ser	devida	a,

por exemplo, diferenças nos ensaios específicos usados. Portanto, os limites superior e inferior da distribuição normal do marcador dentro de uma população, também conhecidos como limite superior do normal (ULN) e limite inferior do normal (LLN), respectivamente, podem variar de laboratório para laboratório. Para qualquer marcador em particular, um profissional de saúde pode determinar quais níveis fora da

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43/97 distribuição normal são clinicamente relevantes e/ou indicativos de doença. Por exemplo, um profissional de saúde pode determinar a taxa de filtração glomerular que pode ser indicativa de um declinio na taxa de função renal em um sujeito com doença renal policistica.

[0171] Em certas modalidades, a administração de um composto fornecido neste documento resulta em um ou mais resultados clinicamente benéficos. Em certas modalidades, a administração melhora a função renal no sujeito. Em certas modalidades, a administração diminui a taxa de declinio da função renal no sujeito. Em certas modalidades, a administração reduz o volume total do rim no sujeito. Em certas modalidades, a administração diminui a taxa de aumento no volume total do rim no sujeito. Em certas modalidades, a administração reduz o volume total renal ajustado à altura (HtTKV). Em certas modalidades, a administração diminui a taxa de aumento em HtTKV.

[0172] Em certas modalidades, a administração inibe o crescimento de cistos no sujeito. Em certas modalidades, a administração diminui a taxa de aumento no crescimento de cistos no sujeito. Em algumas modalidades, um cisto está presente no rim de um sujeito. Em algumas modalidades, um cisto está presente em um órgão diferente do rim, por exemplo, o figado.

[0173] Em certas modalidades, a administração alivia a dor do rim no sujeito. Em certas modalidades, a administração retarda a taxa de aumento na dor no rim no sujeito. Em certas modalidadades, a administração retarda o inicio da dor no rim no sujeito.

[0174] Em certas modalidades, a administração

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44/97 reduz a hipertensão no sujeito. Em certas modalidades, a administração retarda o agravamento da hipertensão no sujeito. Em certas modalidadades, a administração retarda o inicio da hipertensão no sujeito.

[0175] Em certas modalidades, a administração reduz a fibrose no rim do sujeito. Em certas modalidades, a administração retarda o agravamento da fibrose no rim do sujeito.

[0176] Em certas modalidades, a administração retarda o inicio da doença renal terminal no sujeito. Em certas modalidades, a administração retarda o tempo para diálise para o sujeito. Em certas formas de realização, a administração retarda o tempo para o transplante renal para o indivíduo. Em certas modalidades, a administração melhora a espectativa de vida do sujeito.

[0177] Em certas modalidades, a administração reduz a albuminúria no sujeito. Em certas modalidades, a administração retarda o agravamento da albuminúria no sujeito. Em certas modalidadades, a administração retarda o início da albuminúria no sujeito. Em certas modalidades, a administração reduz a hematúria no sujeito. Em certas modalidades, a administração retarda o agravamento da hematúria no sujeito. Em certas modalidadades, a administração retarda o início da hematúria no sujeito. Em certas modalidades, a administração reduz o nível de nitrogênio de ureia no sangue no sujeito. Em certas modalidades, a administração reduz o nível de creatinina no soro no sujeito. Em certas modalidades, a administração melhora a depuração de creatinina no sujeito. Em certas modalidades, a administração reduz a razão de albumina: creatinina no sujeito.

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45/97 [0178] Em certas modalidades, a administração melhora a taxa de filtração glomerular no sujeito. Em certas modalidades, a administração diminui a taxa de declinio da taxa de filtração glomerular no sujeito. Em certas modalidades, a taxa de filtração glomerular é uma taxa de filtração glomerular estimada (eGFR). Em certas modalidadess, a taxa de filtração glomerular é uma taxa de filtração glomerular medida (mGFR).

[0179] Em certas modalidades, a administração reduz a proteina lipocalina associada a gelatinase de neutrófilos (NGAL) na urina do sujeito. Em certas modalidades, a administração reduz a proteina da molécula de lesão renal-1 (KIM-1) na urina do sujeito.

[0180] Em qualquer uma das modalidades fornecidas neste documento, um sujeito pode ser submetido a certos testes para avaliar a extensão da doença no sujeito. Tais testes incluem, sem limitação, a medição do volume total do rim no sujeito; medição de hipertensão no sujeito; medição de dor no rim no sujeito; medição de fibrose no rim do sujeito; medição do nivel de nitrogênio ureico no sangue no sujeito; medir o nivel de creatinina no soro no sujeito; medir a depuração da creatinina no sangue do sujeito; medir albuminúria no sujeito; medição da razão de albumina:creatinina no sujeito; medir a taxa de filtração glomerular no sujeito, em que a taxa de ajustamento glomerular é estimada ou medida; medição da proteina lipocalina associada a gelatinase de neutrófilos (NGAL) na urina do sujeito; e/ou medição da proteina de molécula-1 (KIM-1) de lesão do rim na urina do sujeito.

[0181] Em certas modalidades, um sujeito com doença renal policistica experimenta uma qualidade de vida

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46/97 reduzida. Por exemplo, um sujeito com doença renal policística pode sentir dor nos rins, o que pode reduzir a qualidade de vida do sujeito. Em certas modalidades, a administração melhora a qualidade de vida do sujeito.

[0182] Em qualquer uma das modalidades fornecidas neste documento, o sujeito é um sujeito humano. Em certas modalidades, o sujeito humano é um adulto. Em certas modalidades, um adulto tem pelo menos 21 anos de idade. Em certas modalidades, o sujeito humano é um sujeito pediátrico, isto é, o sujeito tem menos de 21 anos de idade. As populações pediátricas podem ser definidas por agências reguladoras. Em certas modalidades, o sujeito humano é um adolescente. Em certas modalidades, um adolescente tem pelo menos 12 anos de idade e menos de 21 anos de idade. Em certas modalidades, o sujeito humano é uma criança. Em certas modalidades, uma criança tem pelo menos dois anos de idade e menos de 12 anos de idade. Em certas modalidades, o sujeito humano é um lactente. Em certas modalidades, o lactente tem pelo menos um mês de idade e menos de dois anos de idade. Em certas modalidades, o sujeito é um recém-nascido. Em certas modalidades, um recém-nascido tem menos de um mês de idade.

[0183] Qualquer um dos compostos descritos neste documento pode ser usado em terapia. Qualquer um dos compostos fornecidos neste documento pode ser usado no tratamento da doença renal policística. Em certas modalidades, a doença renal policística é doença renal policística autossômica dominante. Em certas modalidades, a doença renal policística é doença renal policística autossômica recessiva. Em certas modalidades, a doença renal policística é nefronoftise. Em certas modalidades, o sujeito tem síndrome de Joubert e

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47/97 distúrbios relacionados (JSRD), síndrome de Meckel (MKS) ou síndrome de Bardet-Biedl (BBS).

[0184] Qualquer um dos oligonucleotideos modificados descritos neste documento pode ser usado em terapia. Qualquer um dos oligonucleotídeos modificados fornecidos neste documento pode ser usado no tratamento da doença renal policística.

[0185] Qualquer um dos compostos fornecidos neste documento pode ser para uso na preparação de um medicamento. Qualquer dos compostos fornecidos neste documento pode ser usado na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença renal policística.

[0186] Qualquer um dos oligonucleotídeos modificados fornecidos neste documento pode ser para uso na preparação de um medicamento. Qualquer um dos oligonucleotídeos modificados fornecidos neste documento pode ser usado na preparação de um medicamento para o tratamento da doença renal policística.

[0187] Qualquer uma das composições farmacêuticas fornecidas neste documento pode ser usada no tratamento da doença renal policística.

Certas Terapias Adicionais [0188] Os tratamentos para doença renal policística ou qualquer uma das condições listadas neste documento pode compreender mais de uma terapia. Como tal, em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos para tratar um sujeito tendo ou com suspeita de ter uma doença renal policística compreendendo administrar pelo menos uma terapia além de administrar o composto fornecido neste documento, que compreende uma sequência de nucleobase

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48/97 complementar à sequência semente de miR-17.

[0189] Em certas modalidades, pelo menos uma terapia adicional compreende um agente farmacêutico.

[0190] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um agente anti-hipertensivo. Os agentes antihipertensivos são usados para controlar a pressão arterial do sujeito.

[0191] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um antagonista do receptor 2 da vasopressina. Em certas modalidades, um antagonista do receptor 2 da vasopressina é o tolvaptano.

[0192] Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos incluem bloqueadores dos receptores da angiotensina II (ARB). Em certas modalidades, um bloqueador do receptor da angiotensina II é candesartan, irbesartana, olmesartana, losartana, valsartana, telmisartana ou eprosartana.

[0193] Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos incluem inibidores da enzima conversora de angiotensina II (ACE). Em certas modalidades, um inibidor de ACE é captopril, enalapril, lisinopril, benazepril, quinapril, fosinopril ou ramipril.

[0194] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um diurético. Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um bloqueador dos canais de cálcio.

[0195] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um inibidor de quinase. Em certas modalidades, um inibidor de quinase é bosutinib ou KD019.

[0196] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um antagonista do receptor adrenérgico.

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49/97 [0197] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um antagonista do recetor de aldosterona. Em certas modalidades, um antagonista do receptor de aldosterona é espironolactona. Em certas modalidades, a espironolactona é administrada em uma dose variando de 10 a 35 mg por dia. Em certas modalidades, a espironolactona é administrada em uma dose de 25 mg por dia.

[0198] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um alvo de rapamicina em mamíferos (mTOR). Em certas modalidades, um inibidor de mTOR é everolimus, rapamicina ou sirolimus.

[0199] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um análogo de hormona. Em certas modalidades, um análogo da hormona é a somatostatina ou a hormona adrenocorticotrófica.

[0200] Em	certas modalidades,	um	agente
farmacêutico é um	agente anti-fibrótico.	Em	certas
modalidades, um agente modificado complementar	anti-fibrótico é um oligonuc ao miR-21.	leotideo
[0201] Em	certas modalidades,	uma	terapia
adicional é diálise. Em certas modalidades, adicional é o transplante de rim.	uma	terapia
[0202] Em	certas modalidades,	os	agentes

farmacêuticos incluem agentes anti-inflamatórios. Em certas modalidades, um agente anti-inflamatório é um agente antiinflamatório esteroidal. Em certas modalidades, um agente anti-inflamatório esteroide é um corticosteroide. Em certas modalidades, um corticosteroide é prednisona. Em certas modalidades, um agente anti-inflamatório é um fármaco antiinflamatório não esteroidal. Em certas modalidades, um agente

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50/97 antiinflamatório não esteroide é o ibuprofeno, um inibidor de COX-I ou um inibidor de COX-2.

[0203] Em certas modalidades, um agente farmacêuticco é um agente farmacêutico que bloqueia uma ou mais respostas aos sinais fibrogênicos.

[0204] Em certas modalidades, uma terapia adicional pode ser um agente farmacêutico que potencializa o sistema imune do corpo, incluindo uma ciclofosfamida de baixa dose, timostimulina, vitaminas e suplementos nutricionais (por exemplo, antioxidantes, incluindo vitaminas A, C, E, betacaroteno, zinco, seleênio, glutationa, coenzima Q-10 e equinácea) e vacinas, por exemplo, complexo imunoestimulante (ISCOM), que compreende uma formulação de vacina que combina uma apresentação multimérica do antigeno com um adjuvante.

[0205] Em certas modalidades, a terapia adicional é selecionada para tratar ou melhorar um efeito colateral de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Tais efeitos colaterais incluem, sem limitação, reações no local de injeção, anormalidades do teste de função hepática, anormalidades da função renal, toxicidade hepática, toxicidade renal, anormalidades do sistema nervoso central e miopatias. Por exemplo, níveis aumentados de aminotransferase no soro podem indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, a bilirrubina aumentada pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática.

Certas sequências de Nucleobase MicroRNA [0206] A família miR-17 inclui miR-17, miR-20a, miR-2 0b, miR-93, miR-106a e miR-106b. Cada membro da família miR-17 tem uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases 5 '-AAAGUG-3' ou a sequência semente

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51/97 de miR-17, que é a sequência de nucleobases nas posições 2 a 7 da SEQ ID NO: 1. Além disso, cada membro da familia miR-17 compartilha alguma identidade de sequência de nucleobase fora da região de semente. Consequentemente, um oligonucleotideo modificado compreendendo uma sequência de nucleobases complementar à sequência de semente miR-17 pode ter como alvo outros microRNAs da familia miR-17, para além de miR-17. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado visa dois ou mais microRNAs da familia miR-17. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado visa três ou mais microRNAs da familia miR-17. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado visa quatro ou mais microRNAs da familia miR-17. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado visa cinco ou mais microRNAs da familia miR-17. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado visa seis ou mais microRNAs da familia miR-17. Por exemplo, um oligonucleotideo modificado que tem a sequência de nucleobases 5'-AGCACUUUG-3' visa todos os membros da familia miR-17.

[0207] Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nuclobase 5'-CACUUU-3'. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobase 5'-GCACUUUG-3'. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobases 5'-AGCACUUU-3'. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotideo modificado é 5'-AGCACUUUG-3'.

[0208] Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobase 5'-CACTTT-3'. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobases 5'-CACUTT-3'. Em certas

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52/97 modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobases 5'-CACUUT-3'. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobases 5'-CACTUT-3'. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobases 5'-CACUTT-3'. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende a sequência de nucleobases 5'-CACTTU-3'.

[0209] Em certas modalidades, cada citosina é independentemente selecionada dentre uma citosina não metilada e uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, pelo menos uma citosina é uma citosina não metilada. Em certas modalidades, cada citosina é uma citosina não metilada. Em certas modalidades, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, cada citosina é uma 5-metil citosina.

[0210] Em certas modalidades, o número de nucleosideos de um oligonucleotideo modificado é menor do que o comprimento de seu microRNA alvo. Um oligonucleotideo modificado tendo um número de nucleosideos ligados que é menor do que o comprimento do microRNA alvo, em que cada nucleobase do oligonucleotideo modificado é complementar a uma nucleobase em uma posição correspondente do microRNA alvo, é considerado ser um oligonucleotideo modificado tendo uma sequência de nucleobase que é totalmente complementar (também referida como 100% complementar) a uma região da sequência de microRNA alvo. Por exemplo, um oligonucleotideo modificado que consiste em 9 nucleosideos ligados, onde cada nucleobase é complementar a uma posição correspondente de miR-17, é totalmente complementar a miR-17.

[0211] Em certas modalidades, um oligonucleotideo

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53/97 modificado tem uma sequência de nucleobase com uma não correspondência em relação à sequência de nucleobases de um microRNA alvo. Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado tem uma sequência de nucleobase tendo duas não correspondências em relação à sequência de nucleobase de um microRNA alvo. Em certas destas modalidades, um oligonucloetideo modificado tem uma sequência de nucleobase tendo não mais do que duas não correspondências em relação à sequência de nucleobase de um microRNA alvo. Em certas destas modalidades, as nucleoases não correspondentes são continuas. Em certas destas modalidades, as nucleobases não correspondentes não são continuas.

[0212] Embora a listagem de sequências que acompanha este depósito identifique cada sequência de nucleobases como RNA ou DNA, conforme requerido, na prática, essas sequências podem ser modificadas com uma combinação de modificações quimicas especificadas neste documento. Um versado na técnica irá prontamente apreciar que na listagem de sequência, tal designação como RNA ou DNA para descrever oligonucleotideos modificados é, de alguma forma, arbitrária. Por exemplo, um oligonucleotideo modificado fornecido neste documento compreendendo um nucleosideo compreendendo uma porção açúcar 2'-O-metoxietil e uma base de timina pode ser descrito como um residue de DNA na listagem de sequência, mesmo que o nucleosideo seja modificado e não seja um nucleosideo de DNA natural.

[0213] Em conformidade, as sequências de ácido nucleico fornecidas na listagem de sequência se destinam a englobar ácidos nucleicos contendo qualquer combinação de RNA e/ou DNA natural ou modificado, incluindo, mas não limitados

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54/97 a, esses ácidos nucleicos modificados com nucleobases modificadas. A titulo de exemplo adicional e sem limitações, um oligonucleotideo modificado tendo a sequência de nucleobase ATCGATCG na listagem de sequência engobla qualquer oligonucleotideo tendo tal sequência de nucleobase, modificada ou não modificada, incluindo, mas não limitada a, tais compostos compreendendo bases de RNA, tal como os que têm a sequência AUCGAUCG e os tendo algumas bases de DNA e algumas bases de RNA, tais como [0214] AUCGATCG e oligonucleotídeos tendo outras bases modificadas, tal como AT^meCGAUCG, em que ^meC indica um 5-metilcitosina.

Certas Modificações [0215] Em certas modalidades, os oligonucleotideos fornecidos neste documento podem compreender uma ou mais modificações para uma nucleobase, açúcar e/ou ligação intemucleosidica e, como tal, é um oligonucleotideo modificado. Uma nucleobase, açúcaar e/ou ligação intemucleosidica modificados podem ser selecionados sobre uma forma não modificada devido a propriedades desejadas tais como, por exemplo, absorção celular potencializada, afinidade potencializada para outros oligonucleotideos ou alvos de ácido nucleico e estabilidade aumentada na presença de nucleases.

[0216] Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende um ou mais nucleosideos modificados.

[0217] Em certas modalidades, um nucleosideo modificado é um nucleosideo modificado com açúcar. Em certas destas modalidades, os nucleosideos modificados por açúcar podem compreender adicionalmente uma fração de base heterciclica natural ou modificada e/ou pode ser conectada a

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55/97 um outro nucleosídeo através de uma ligação de internucleosidica e/ou pode incluir adicionalmente modificações indenpendentes da modificação de açúcar. Em certas modalidades, um nucleosídeo modificado com açúcar é um nucleosídeo 2'-modificado, em que o anel de açúcar é modificado no carbono 2' a partir de ribose natural ou 2'-deoxirribose.

[0218] Em certas modalidades, um nucleosídeo 2'modifiçado tem uma fração de açúcar bicíclico. Em certas destas modalidades, a porção de açúcar bicíclico é um açúcar D na configuração alfa. Em certas destas modalidades, a porção de açúcar bicíclico é um açúcar D na configuração beta. Em certas destas modalidades, a porção de açúcar bicíclico é um açúcar L na configuração alfa. Em certas destas modalidades, a porção de açúcar bicíclico é um açúcar L na configuração beta.

[0219] Os nucleosídeos compreendendo tais porções de açúcar bicíclico são referidos como nucleosídeos bicíclicos ou BNAs. Em certas modalidades, os nucleosídeos bicíclicos incluem, mas não estão limitados a, (A) BNA de α-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2'); (B) BNA de β-D-metilenoxi (4'-CH₂-O-2'); (C) BNA de etilenoxi (4 ' - (CH₂) ₂-O-2 ' ) ; (D) BNA de aminoxi (4'-CH₂-ON (R)-2 ' ) ; (E) BNA de oxiamino (4 '-CH₂-N (R)-0-2 ' ) ; (F) BNA de metil(metilenoxi) (4'-CH (CH3) -0-2') (também referido como etil restringido ou cEt); (G) BNA de metileno-tio (4'-CH₂-S-2'); (H) BNA de metileno-amino (4'-CH2-N(R)-2'); (I) BNA de carbocíclico metil (4'-CH₂-CH (CH3)-2'); (J) BNA de c-MOE (4' — CH (CH₂-0Me)-0-2') e (K) cabocíclico propileno (4'-(CH₂)32'')BNA, conforme representado abaixo.

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em que Bx é uma fração de nucleobase e R é, independentemente, H, um grupo de proteção ou C1-C12 alquil.

[0220] Em certas modalidades, um nucleosideo modificado 2 ' compreende um grupo substituto 2 ' selecionado dentre F, OCF3, O-CH3 (também referido como 2'-OMe), OCH2CH2OCH3 (também referido como 2 ' -O-metoxietii ou 2'MOE), 2 '-O (CH₂) 2SCH3, O-(CH₂) 2-0-N (CH₃) 2, -O (CH₂) 2O (CH₂) ₂N (CH₃) 2, e O-CH2-C(=0)-N(H)CH₃.

[0221] Em certas modalidades, um nucleosideo 2'modificado compreende um grupo substituinte 2 ' selecionado dentre F, O-CH3 e OCH2CH2OCH3.

[0222] Em certas modalidades, um nucleosideo modificado com açúcar é um nucleosideo modificado 4'-tio. Em certas modalidades, um nucleosideo modificado com açúcar é um

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57/97 nucleosídeo modificado 4'-tio-2'. Um nucleósido 4'-tio modificado tem um β-D-ribonucleosídeo onde o 4'-0 é substituído por 4'-S. Um nucleosídeo modificado com 4'-tio-2' é um nucleosídeo 4'-tio modificado tendo o 2'-OH substituído por um grupo substituinte 2 ' . Grupos substituintes 2 ' apropriados incluem 2'-0CH₃, 2 '-OCH2CH2OCH3, e 2 '-F .

[0223] Em certas modalidades, um oligonucletideo modificado compreende uma ou mais modificações internucleosídicas. Em certas modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucleotideo modificado é uma ligação internucleosídica modificada. Em certas modalidades, uma ligação internucleosídica modificada compreende um átomo de fósforo.

[0224] Em certas modalidades, o oligonucleotideo modificado compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em certas modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucleotideo modificado é uma ligação de fosforotioato.

[0225] Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado compreende um ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, uma nucleobase modificada é selecionada dentre 5-hidroximetilcitosina, 7-deazaguanina e 7-deazadenina. Em certas modalidades, uma nucleobase modificada é selecionada dentre 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2aminopiridina e 2-piridona. Em certas modalidades, uma nucleobase modificada é selecionada dentre pirimidinas substituídas em 5, 6-azapirimidinas e purinas substituídas N2, N-6 e 0-6, incluindo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracil e 5-propinilcitosina.

[0226] Em certas modalidades, uma nucleobase

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58/97 modificada compreende um heterociclo policiclico. Em certas modalidades, uma nucleobase modificada compreende um heterociclo triciclico. Em certas modalidades, uma nucleobase modificada compreende um derivado de fenoxazina. Em certas modalidades, a fenoxazina pode ser adicionalmente modificada para formar uma nucleobase conhecida na técnica como um grampoG.

[0227] Em certas modalidades, um oligonucleotideo modificado é conjugado com uma ou mais porções que aumentam a atividade, distribuição celular ou absorção celular dos oligonucleotideos antisense resultantes. Em certas destas modalidades, a fração é uma fração de colesterol. Em certas destas modalidades, a fração é uma fração lipidica. As frações adicionais para conjugação incluem hidratos de carbono, peptideos, anticorpos ou fragmentos de anticorpos, fosfolipidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, cumarinas e corantes. Em certas modalidades, a fração de carboidrato é Nacetil-D-galactosamina (GalNac). Em certas modalidades, um grupo conjugado é anexado diretamente a um oligonucleotideo. Em certas modalidades, um grupo conjugado é anexado a um oligonucleotideo modificado por uma fração de ligação selecionada dentre amino, azido, hidroxil, ácido carboxílico, tiol insaturações (por exemplo, ligações duplas ou triplas), ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), ciclobexano-1carboxilato de succinimidil 4-(N-maleimidometil) (SMCC), ácido 6-amino-hexanoico (AHEX ou AHA), C1-C10 alquil substituído, C2-C10 alquenil substituído ou não substituído e C2-C10 alquinil substituído ou não substituído. Em certas destas modalidades, um grupo substituinte é selecionado dentre

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59/97 hidroxil, amino, alcoxi, azido, carboxi, benzil, fenil, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquil, aril, alcenil e alcinil.

[0228] Em certas destas modalidades, o composto compreende um oligonucleotideo modificado tendo um ou mais grupos estabilizadores que estão ligados a um ou a ambos os terminais de um oligonucleotideo modificado para potencializar propriedades tais como, por exemplo, estabilidade de nucleases. Incluídas nos grupos de estabilização estão as estruturas de revestimento. Estas modificações terminais protegem um oligonucleotideo modificado da degradação por exonuclease e podem ajudar na distribuição e/ou localização dentro de uma célula. O revestimento pode estar presente no 5'-terminal (5'-revestimento), ou no 3'-terminal (3'— revestimento), ou pode estar presente em ambos os terminais. Estruturas de revestimento incluem, por exemplo, revestimentos desoxi-abásicos invertidos.

Certas Composições Farmacêuticas [0229] São fornecidas neste documento composições farmacêuticas compreendendo um composto ou oligonucleotideo modificado fornecido neste documento e um diluente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o diluente farmaceuticamente aceitável é uma solução aquosa. Em certas modalidades, a solução aquosa é uma solução salina. Conforme usado neste documento, os diluentes farmaceuticamente aceitáveis são entendidos como sendo diluentes estéreis. As vias de administração adequadas incluem, sem limitação, administração intravenosa e subcutânea.

[0230] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica é administrada na forma de uma unidade de dosagem. Por exemplo, em certas modalidades, uma unidade de dosagem

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60/97 está na forma de um comprimido, cápsula ou uma injeção de bolus.

[0231] Em certas modalidades, um agente farmacêutico é um oligonucleotideo modificado que foi preparado em um diluente adequado, ajustado a pH 7,0-9,0 com ácido ou base durante a preparação, e depois liofilizado sob condições estéreis. O oligonucleotideo modificado liofilizado é subsequentemente reconstituído por um diluente adequado, por exemplo, solução aquosa, tal como água ou tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução salina, solução de Hanks ou solução de Ringer. O produto reconstituído é administrado por injeção subcutânea ou por infusão intravenosa. O produto farmacológico liofilizado pode ser embalado em um frasco de vidro transparente Tipo I de 2 ml (tratado com sulfato de amônio) , tampado com uma tampa de borracha de bromobutil e lacrada com um lacre de alumínio.

[0232] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas fornecidas neste documento podem conter adicionalmente outros componentes adjuntos convencionalmente encontrados em composições farmacêuticas, nos seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Portanto, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente ativos adicionais compatíveis, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios .

[0233] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas fornecidas neste documento podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes flavorizantes, conservatives,

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61/97 antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizadores; tais materiais adicionais também incluem, mas não estão limitados a, excipientes tais como álcool, polietilenoglicois, gelatina, lactose, amilase, estearato de magnésio, talco, ácido silicico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose e polivinilpirrolidona. Em várias modalidades, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente nas atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizadores, agentes molhantes, emulsificante, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, flavorizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que não interagem de forma prejudicial com o(s) oligonucleotideo(s) da formulação. Determinadas composições farmacêuticas para injeção podem estar na forma de suspensões, soluções ou emulsões, em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou agentes dispersantes. Determinados solventes adequados para uso em composições farmacêuticas para injeção incluem, mas não estão limitados a, solventes lipofílicos e óleos graxos, tais como óleo de sésamo, ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como oleato de etil ou triglicerídeos e lipossomas. As suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, essas suspensões também podem conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos agentes farmacêuticos para permitir a

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62/97 preparação de soluções altamente concentradas.

[0234] As frações lipídicas foram usadas em terapias de ácido nucleico em vários métodos. Em um método, o ácido nucleico é introduzido em lipossomas pré-formadas ou lipoplexos feitos de misturas de lipidios catiônicos e lipidios neutros. Em um outro método, os complexos de DNA com lipidios mono ou policat iônicos são formados sem a presença de um lipidio neutro. Em determinadas modalidades, uma fração lipidica é selecionada para aumentar a distribuição de um agente farmacêutico para uma célula ou tecido especifico. Em determinadas modalidades, uma fração lipidica é selecionada para aumentar a distribuição de um agente farmacêutico ao tecido adiposo. Em determinadas modalidades, uma fração lipidica é selecionada para aumentar a distribuição de um agente farmacêutico para um tecido muscular.

[0235] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica fornecidada neste documento compreende um composto de poliamina ou uma porção lipidica complexada com um ácido nucleico. Em certas modalidades, tais preparações compreendem um ou mais compostos, cada um individualmente tendo uma estrutura definida pela fórmula (Z) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma,

X -s I v b

L em que, cada X^a e X^b, para cada ocorrência, é independentemente Ci-e alquilleno; n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; cada R é independentemente H, em que pelo menos n + 2 das frações de R em pelo menos cerca de 80% das moléculas do composto de fórmula (Z) na preparação não são H; m é 1, 2, 3 ou 4; Y é O,

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NR², ou S; R¹ é alquil, alquenil ou alquinil; cada um dos quais é opcionalmente substituído por um ou mais substituintes; e R²é H, alquil, alquenil ou alquinil; cada um dos quais é opcionalmente substituído por um ou mais substituintes; uma vez que, se n = 0, então pelo menos n+3 das frações de R não são H. Tais preparações são descritas na publicação PCT WO/2008/042973, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade para a divulgação de preparações lipídicas. Certas preparações adicionais são descritas em Akinc et al. , Nature Biotechnology 26, 561 - 569 (1 de maio de 2008), que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade para a divulgação de preparações lipídicas.

[0236] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica fornecida neste documento é preparada usando técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a processos de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulamento, processos de aprisionamento ou formação de comprimidos.

[0237] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica fornecida neste documento é um sólido (por exemplo, um pó, comprimido e/ou cápsula) . Em certas modalidades, uma composição farmacêutica sólida compreendendo um ou mais oligonucleotídeos é preparada usando ingredientes conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes e agentes de desintegração.

[0238] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica fornecida neste documento é formulada como uma preparação de depósito. Certas preparações de depósito são tipicamente de ação mais longa do que as preparações sem

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64/97 depósito. Em certas modalidades, tais preparações são administradas por implantação (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Em certas modalidades, as preparações de depósito são preparadas usando materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

[0239] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica fornecida neste documento compreende um sistema de distribuição. Exemplos de sistemas de distribuição incluem, entre outros, lipossomas e emulsões. Certos sistemas de administração são úteis para preparar certas composições farmacêuticas, incluindo aquelas que compreendem compostos hidrofóbicos. Em determinadas modalidades, determinados solventes orgânicos, como dimetilsulfóxido são usados.

[0240] Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica aqui prevista compreende uma ou mais moléculas de entrega específicas do tecido destinadas a entregar um ou mais agentes farmacêuticos da presente invenção aos tecidos ou aos tipos de células específicas. Por exemplo, em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas incluem lipossomas revestidos com um anticorpo específico para o tecido.

[0241] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica fornecida neste documento compreende um sistema de liberação prolongada. Um exemplo não limitativo de um referido sistema de administração contínua é uma matriz semipermeável de polímeros hidrofóbicos sólidos. Em certas

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65/97 modalidades, os sistemas administração continua podem, dependendo da sua natureza química, liberar agentes farmacêuticos durante um período de horas, dias, semanas ou

meses.

[0242] Certas composições farmacêuticas para

injeção são apresentadas na forma de dosagem unitária, por

exemplo, em ampolas ou em recipientes de multidosagem.

[0243] Em determinadas modalidades, uma

composição farmacêutica fornecida neste documento compreende um oligonucleotideo modificado em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em certas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas de uma doença ou para prolongar a sobrevivência do sujeito a ser tratado.

[0244] Em determinadas modalidades, um ou mais oligonucleotídeos modificados fornecidos neste documento são formulados como um pró-fármaco. Em determinadas modalidades, mediante administração in vivo, um pró-fármaco é quimicamente convertido em uma forma biologicamente, farmaceuticamente ou terapeuticamente mais ativa de um oligonucleotideo. Em certas modalidades, os pró-fármacos são úteis porque são mais fáceis de administrar do que a forma ativa correspondente. Por exemplo, em certos casos, um pró-fármaco pode ser mais biodisponível (por exemplo, através de administração oral) do que a forma ativa correspondente. Em certos casos, um prófármaco pode ter uma solubilidade melhorada em comparação com a forma ativa correspondente. Em certas modalidades, os prófármacos são menos solúveis em água do que a forma ativa correspondente. Em certos casos, tais pró-fármacos têm transmissão superior através das membranas celulares, onde a

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66/97 solubilidade em água é prejudicial para a mobilidade. Em certas modalidades, um pró-fármaco é um éster. Em certas de tais modalidades, o éster é metabolicamente hidrolisado em ácido carboxilico por administração. Em certos casos, o composto contendo ácido carboxilico é a forma ativa correspondente. Em certas modalidades, um pró-fármaco compreende um peptideo curto (poliaminoácido) ligado a um grupo ácido. Em certas destas modalidades, o peptideo é clivado mediante administração para formar a forma ativa correspondente.

[0245] Em certas modalidades, um pró-fármaco é produzido por modificação de um composto farmaceuticamente ativo de tal modo que o composto ativo será regenerado após administração in vivo. O pró-fármaco pode ser concebido para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de um fármaco, para mascarar efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de um fármaco ou para alterar outras características ou propriedades de um fármaco. Em virtude do conhecimento dos processos farmacodinâmicos e do metabolismo do fármaco in vivo, os especialistas nesta técnica, uma vez conhecido um composto farmaceuticamente ativo, podem conceber pró-fármacos do composto (vide, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, páginas 388-392).

[0246] As vias de administração adicionais incluem, mas não estão limitadas a, oral, rectal, transmucosa, intestinal, entérica, tópica, supositório, por inalação, intratecal, intracardíaco, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intratumoral, intramuscular e intramedular. Em determinadas modalidades, intratecais farmacêuticos são administrados para atingir exposições locais

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67/97 ao invés de sistêmicas. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser injetadas diretamente na área do efeito desejado (por exemplo, no rim).

Certos Kits [0247] A presente invenção também fornece kits. Em algumas modalidades, os kits compreendem um ou mais compostos compreendendo um oligonucleotideo modificado divulgado neste documento. Em algumas modalidades, os kits podem ser usados para administração do composto a um sujeito.

[0248] Em certas modalidades, o kit compreende uma composição farmacêutica pronta para administração. Em certas modalidades, a composição farmacêutica está presente dentro de um frasco. Uma pluralidade de frascos, tal como 10, pode estar presente, por exemplo, em pacotes de distribuição. Em algumas modalidades, o frasco é fabricado de modo a ser acessível com uma seringa. O kit também pode conter instruções para usar os compostos.

[0249] Em algumas modalidades, o kit compreende uma composição farmacêutico presente em uma seringa pré-cheia (ta como uma seringa de dose única com, por exemplo, uma agulha de calibre 27, de ½ polegada com um protetor de agulha), ao invés de em um frasco. Uma pluralidade de seringas pré-cheias, tal como 10, pode estar presente, por exemplo, em pacotes de distribuição. O kit pode também conter instruções para administrar os compostos compreendendo um oligonucleotideo modificado divulgado neste documento.

[0250] Em algumas modalidades, o kit compreendeu um oligonucleotideo modificado neste documento como um produto farmacológico liofilizado e um diluente farmaceuticamente aceitável. Na preparação para administração a um sujeito, o

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68/97 produto farmacológico liofilizado é reconstituído no diluente farmacêuticamente aceitável.

[0251] Em algumas modalidades, além de compostos compreendendo um oligonucleotideo modificado divulgado neste documento, o kit pode compreender adicionalmente um ou mais dos seguintes: seringa, zaragatoa com álcool, bola de algodão e/ou compressa de gaze. Certos Modelos Experimentais [0252] Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de uso e/ou teste de oligonucleotídeos modificados da presente invenção em um modelo experimental. Os versados na técnica são capazes de selecionar e modificar os protocolos para tais modelos experimentais para avaliar um agente farmacêutico da invenção.

[0253] Geralmente, os oligonucleotídeos modificados são primeiro testados em células cultivadas. Os tipos de células adequados incluem aqueles que estão relacionados com o tipo de célula para o qual a distribuição de um oligonucleotideo modificado é desejada in vivo. Por exemplo, tipos celulares adequados para o estudo dos métodos descritos neste documento incluem células primárias ou cultivadas.

[0254] Em certas modalidades, a extensão em que um oligonucleotideo modificado interfere com a atividade de um ou mais membros da família de miR-17 é avaliada em células cultivadas. Em certas modalidades, a inibição da atividade de microRNA pode ser avaliada medindo o nível de um ou mais de um transcrito regulado por microRNA previsto ou validado. Uma inibição da atividade de microRNA pode resultar no aumento do transcrito regulado pelos membros da família miR-17 e/ou a

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69/97 proteína codificada pelo transcrito regulado pelos membros da família miR-17 (isto é, o transcrito regulado pelos membros da família miR-17 é desreprimido). Além disso, em certas modalidades, certos resultados fenotípicos podem ser medidos.

[0255] Vários modelos de animais estão disponíveis aos versados na técnica para o estudo de um ou mais membros da família miR-17 em modelos de doença humana. Os modelos de doença renal policistica incluem, mas não estão limitados a, modelos com mutações e/ou deleções em Pkdl e/ou Pkd2; e modelos compreendendo mutações em outros genes. Os modelos exemplificativos não limitativos de PKD compreendendo mutações e/ou deleções em Pkdl e/ou Pkd2 incluem modelos hipomórficos, tais como modelos compreendendo mutações de sentido errado em Pkdl e modelos com expressão reduzida ou instável de Pkd2; modelos knockout condicionais indutíveis; e modelos knockout condicionais. Os modelos de PKD exemplificativos não limitativos compreendendo mutações em genes diferentes de Pkdl e Pkd2 incluem modelos com mutações em PKHD1, Nek8, Kif3a e/ou Nphp3. Os modelos de PKD são revistos, por exemplo, em Shibazaki et al., Human Mol. Genet 2008; 17 (1 1) : 1505-1516; Happe e Peters, Nat Rev Nephrol, 2014; 10 (10) : 587-601; e Patel et al, PNAS, 2013; 1 10 (26) : 10765-10770.

Certos Ensaios de Quantificação [0256] Em certas modalidades, os níveis de microRNA são quantificados em células ou tecidos in vitro ou in vivo. Em certas modalidades, as alterações nos níveis de microRNA são medidas por análise de microarray. Em certas modalidades, as alterações nos níveis de microRNA são medidas por um dos vários ensaios de PCR comercialmente disponíveis,

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70/97 tais como o ensaio TaqMan® MicroRNA (Applied Biosystems).

[0257] A modulação da atividade de microRNA com uma simulação de anti-miR ou microRNA pode ser avaliada pela perfilação de microarray de mRNAs. As sequências dos mRNAs modulados (aumentados ou diminuídos) pelo imitador anti-miR ou microRNA são pesquisadas para sequências de sementes de microRNAs, para comparar a modulação de mRNAs que são alvos do microRNA para modulação de mRNAs que não são alvos do microRNA. Desta maneira, a interação do anti-miR com seu microRNA alvo, ou uma simulação de microRNA com seus alvos, pode ser avaliada. No caso de um anti-miR, mRNAs cujos níveis de expressão são aumentados são triados para as sequências de mRNA que compreendem uma semente correspondente ao microRNA ao qual o anti-miR é complementar.

[0258] A modulação da atividade de microRNA com um composto anti-miR pode ser avaliado ao pedir o nível de um RNA mensageiro alvo do microRNA, seja por medição do nível do RNA mensageiro em si, ou da proteína transcrita a partir do mesmo. A inibição antisense de um microRNA geralmente resulta no aumento no nível de RNA mensageiro e/ou proteína do RNA mensageiro alvo do microRNA, ou seja, o tratamento de anti-miR resulta na desrepressão de um ou mais RNAs mensageiros alvo.

EXEMPLOS [0259] Os exemplos a seguir são apresentados a fim de ilustrar mais completamente algumas modalidades da invenção. Eles não devem, entretanto, ser considerados como limitantes do amplo escopo da invenção. Os comumente versados na técnica irão facilmente adotar os princípios subjacentes desta descoberta para projetar vários compostos sem se desviar do espírito da atual invenção.

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Exemplo 1: 0 papel do miR-17 no PKD [0260] Os membros da família miR-17 do agrupamento miR-17~92 de microRNAs são regulados para cima em modelos de camundongos com PKD. A deleção genética do agrupamento miR-17 ~ 92 em um modelo de camundongo com PKD reduz o crescimento do cisto renal, melhora a função renal e prolonga a sobrevivência (Patel et al, PNAS, 2013; 1 10(26): 10765-10770). O agrupamento de miR-17~92 contém 6 microRNAs diferentes, cada um com uma sequência distinta: miR-17, miR18a, miR-19a, miR-19-b-l e miR-92a-l.

[0261] O agrupamento de miR~17-92 inclui dois microRNAs, miR-17 e miR-20a, que são membros da família miR17 de microRNAs. Cada membro dessa família compartilha identidade de sequência de sementes e vários graus de identidade de sequência fora da região de semente. Os outros membros da família miR-17 são miR-20b, miR-93, miR-106a e miR106b. O miR-20b e o miR-106a residem no agrupamento de miR106a ~ 363 no cromossomo humano X, e o miR-93 e o miR-106b residem no agrupamento de miR-106b ~ 25 no cromossomo humano 7. As sequências dos membros da família miR-17 são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1: Família miR-17 de microRNAs

microRNA	SEQUÊNCIA (5 ' PARA 3 ') região semente em negrito	SEQ ID NO:
miR-17	CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	1
miR-2 0a	UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG	2
miR2 0b	CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG	3
miR-93	CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG	4
miR-10 6a	AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	5
miR-10 6b	UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU	6

[0262] Os estudos anteriores usando uma ferramenta de pesquisa do composto anti-miR-17 identificaram

Petição 870190050773, de 30/05/2019, pág. 77/235 / 97 um papel para o miR-17 na PKD em dois modelos diferentes de PKD, o modelo de Pkd2-K0 (também conhecido como o modelo PKHDl/cre; Pkd2^F/F ) e o modelo de Pcy. 0 oligonucleot ideo modificado da ferramenta de pesquisa complementar ao miR-17 foi testado em modelos de camundongo com PKD. 0 composto antimiR-17 era um nucleosideo ligado ao oligonucleotideo 19 totalmente fosforotado de comprimento (5'-CTGCACTGTAAGCACTTTG3'; SEQ ID NO: 7), com unidades de açúcar de DNA, 2'-MOE e ScEt. Embora o composto tenha não correspondências em relação a outros membros da família miR-17, testes em ensaios in vitro revelaram que ele híbrida e inibe todos os membros da família miR-17.

[0263] Os camundongos com PKD2-KO desenvolvem espontaneamente doença renal policística. Os camundongos foram tratados com 20 mg/kg de composto anti-miR-17 ou oligonucleotideo de controle, ou com PBS. Os resultados demonstraram que o tratamento com anti-miR-17 de camundongos com PKD2-KO reduziu o desfecho primário do tratamento, a razão de peso do rim para o corpo, em 17%, relativa ao tratamento controle (p = 0,017). O tratamento com anti-miR-17 também reduziu significativamente o BUN e a expressão de biomarcadores de mRNA de lesão renal, Kiml e Ngal, em camundongos com PKD2KO. Finalmente, o tratamento com anti-miR-17 resultou em uma tendência de redução do nível sérico de creatinina e redução do índice de cisto nos camundongos com PKD2-KO. Esses resultados não foram observados com o controle anti-miR, indicando que eles são especificamente devido à inibição de miR-17.

[0264] Os camundongos Pcy portadores de uma mutação em Nphp3 desenvolvem espontaneamente doença renal

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73/97 policística, com uma progressão mais lenta da doença do que a observada nos camundongos com PKD2-KO. Os camundongos foram tratados com 50 mg/kg de composto anti-miR-17, ou com PBS, uma vez por semana durante um total de 26 semanas. A razão média do peso do rim para peso corporal nos camundongos Pcy tratados com anti-miR-17 foi 19% menor do que a razão média de peso do rim para peso corporal nos camundongos Pcy administrados apenas com PBS (p = 0,0003). Os camundongos Pcy tratados com antimiR-17 mostraram uma redução média de 28% no índice de cisto em comparação com camundongos Pcy administrados somente com PBS (p = 0, 008) .

[0265] Estes dados demonstraram que em dois modelos experimentais diferentes de PKD, o miR-17 é um alvo validado para o tratamento de PKD.

Exemplo 2: Concepção e Triagem de Compostos [0266] Enquanto o composto ferramenta de pesquisa mostrou eficácia em modelos de PKD, o composto foi observado para ser ligeiramente pró-inflamatório em um estudo in vivo. Além disso, o composto de ferramentas de pesquisa não foi suficientemente eficaz para o desenvolvimento como um agente farmacêutico para o tratamento de PKD.

[0267] Consequentemente, foi realizada uma triagem para identificar inibidores de um ou mais membros da famia miR-17 que são suficientemente eficazes, convenientes para administrar e seguros para administração a sujeitos com PKD. Um critério adicional foi uma razão de distribuição de rim para fígado suficientemente alta para potencialziar a proporção do composto anti-miR-17 que é administrado ao órgão alvo.

[0268] Aproximadamente 200 oligonucleotídeos

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74/97 modificados compreendendo uma sequência nucleobásica complementar à sequência de sementes miR-17 foram concebidos, tendo comprimentos e composição quimica variados. 0 comprimento dos compostos variou de 9 a 20 nucleosideos ligados, e os compostos variaram em número, tipo e colocação de modificações quimicas. Uma vez que potência e segurança não podem ser previstos com base na estrutura quimica de nuclease de um composto, os compostos foram avaliados in vitro e in vivo para características incluindo potência, eficácia, comportamento farmacocinético, viscosidade, segurança e estabilidade metabólica, em uma série de ensaios projetados para eliminar compostos com propriedades desfavoráveis. Em certos ensaios, a ferramenta anti-miR-17 foi usada como referência à qual os compostos da biblioteca foram comparados. Conforme descrito abaixo, cada um dos quase 200 compostos foi primeiro testado em vários ensaios in vitro (por exemplo, potência, toxicologia, estabilidade metabólica), para identificar um conjunto menor de compostos adequados para testes adicionais em ensaios in vivo mais complexos (por exemplo, perfil farmacocinético, eficácia, toxicologia). O processo de triagem foi projetado para identificar um agente farmacêutico candidato com base em dados agregados de todos os ensaios, com ênfase na potência, perfil farmacocinético (por exemplo, entrega ao rim) e características de segurança.

Potência e Eficácia In Vtro e In Vivo [0269] A potência in vitro foi avaliada usando um ensaio repórter de luciferase. Um plasmideo repórter de luciferase para miR-17, com dois sitios de ligação de miR-17 totalmente complementares em tandem na 3'-UTR do gene de luciferase. Os compostos de maiores comprimentos foram

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75/97 selecionados se sua inibição máxima fosse maior que a da ferramenta anti-miR-17. Uma vez que compostos mais curtos, tais como 9-meros, não são tipicamente ativos no máximo nas mesmas condições de ensaio usadas para compostos mais compridos, foram selecionados compostos mais curtos com base na inibição máxima em relação aos compostos de controle apropriados. Desta forma, os compostos que são diversos em comprimento e composição química foram incluídos em testes adicionais.

[0270] A potência in vivo foi avaliada usando o ensaio de mudança de polissoma de microRNA (miPSA). Este ensaio foi usado para determinar a extensão em que os compostos atacam diretamente o alvo miR-17 no rim em camundongos normais e PKD. O miPSA baseia-se no princípio de que os miRNAs ativos se ligam a seus alvos de mRNA em polissomas ativos de alto peso molecular (HMW), enquanto os miRNAs inibidos residem nos polissomas de baixo MW (LMW). O tratamento com anti-miR resulta em um desvio do microRNA dos polissomas HMW para os polissomas LMW. Assim, o miPSA fornece uma medição direta do envolvimento do alvo de microRNA por um anti-miR complementar (Androsavich et al., Nucleic Acids Research, 2015, 44: e 13).

[0271] Os compostos selecionados que passaram por múltiplos critérios de triagem foram avaliados quanto à eficácia em modelos experimentais de PKD, por exemplo, o modelo de camungondo Pkd2-KO e o modelo de camundongo Pcy. Os camundongos foram tratados com o composto anti-miR-17 e foram avaliados desfechos clinicamente relevantes, incluindo a relação entre o peso do rim e o peso corporal, o nível de nitrogênio ureico no sangue, os níveis de creatinina no soro e o índice de cisto renal.

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Propriedades Farmacocinéticas [0272] A estabilidade metabólica foi avaliada incubando cada composto anti-miR-17 em um lisado de fígado de camundongo. Após 24 horas, a porcentagem de composto intacto restante é calculada. Os compostos que não são estáveis após uma incubação de 24 horas não são potencialmente estáveis in vivo.

[0273] As propriedades farmacocinéticas e a distribuição nos tecidos de compostos selecionados foram avaliadas em camundongos C57BL6 do tipo selvagem e em camundongos JCK (um modelo experimental de PKD) . O composto foi administrado a camundongos do tipo selvagem a uma dose de 0,3, 3 ou 30 mg/kg, ou a camundongos JCK a uma dose de 3, 30 ou 100 mg/kg. Após sete dias, os camundongos foram sacrificados. Tecidos renais e hepáticos foram coletados. A concentração do composto anti-miR-17 foi medida no fígado e no rim. Os compostos que se acumulam a um maior nível no rim, em relação ao fígado (ou seja, têm uma maior razão rim-fígado) foram os preferidos.

[0274] Um perfil farmacocinótico completo para compostos selecionados que passaram por critérios de triagem foi obtido em camundongos C57BL6. Em um estudo, os camundongos são administrados em uma injeção subcutânea única do composto de anti-miR-17 em 30 mg/kg. Em outro estudo, administrou-se aos camundongos três injeções subcutâneas de composto antimiR-17 a 39 mg/kg, durante um período de dois meses. Em cada estudo, amostras de fígado e rim são coletadas em 1 hora, 4 horas, 8 horas, 1 dia, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 28 dias e 56 dias após as injeções.

Toxicologia

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77/97 [0275] Em ensaios in vitro, o potencial de toxicidade foi avaliado usando um ensaio de ligação fluorescente bioquímica (FBA) e um ensaio de corte hepático ou renal. A FBA é realizada incubando um corante fluorescente com cada composto e medindo imediatamente a fluorescência. Os compostos altamente fluorescentes têm o potencial de produzir toxicidade in vivo. O ensaio de corte hepático ou renal é realizado incubando uma fatia de tecido de uma amostra hepática de núcleo isolada do rato. Após uma incubação de 24 horas, o RNA é extraído do corte do tecido, e os niveis de expressão de 18 genes pró-inflamatórios são medidos. Uma indução na expressão gênica pró-inflamatória indica um potencial para efeitos pró-inflamatórios in vivo.

[0276] Realizaram-se avaliações toxicológicas in vivo adicionais administrando a camundongos normais (camundongos Svl29) uma única injeção subcutânea de 300 mg/kg de composto anti-miR-17. Após quatro dias, os camundongos foram sacrificados, o sangue foi coletado para análise quimica do soro, o figado e o baço foram pesados e o RNA foi isolado dos tecidos renal e hepático. O nivel de expressão de um gene próinf lamatório, proteína induzida por interferon com repetições tetratricopeptidicas (IFIT), foi medido. Como uma indução na expressão de IFIT é potencialmente indicativa de toxicidade, os compostos que não induzem a expressão de IFIT são preferidos.

[0277] Ao longo do processo de triagem, certos compostos anti-miR-17 tiveram um bom desempenho em múltiplos ensaios. Enquanto nenhum composto foi o melhor desempenho em todos os ensaios, após múltiplos estágios de triagem, certos compostos exibiram características particularmente favoráveis,

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78/97 tais como alta potência e razão relativamente alta de rim para fígado. Dos quase 200 compostos que foram testados em ensaios in vitro, aproximadamente 20 preencheram os critérios para testes adicionais in vivo. Estes 20 compostos foram eventualmente reduzidos a cinco compostos e finalmente a um composto, RG4326, que tinha o melhor perfil global e foi selecionado como um agente farmacêutico candidato. Após a identificação deste composto, foram realizados estudos adicionais para avaliar a potência, o perfil farmacocinético e a eficácia.

[0278] RG4326 tem a seguinte sequência e padrão de modificação química: AsGsCmAfCfUfUmUsGs, onde nucleosideos seguidos por M subscrito são 2'-O-metil nucleosideos, nucleosideos seguidos por F subscrito são 2'-fluoro nucleosideos, nucleosideos seguidos por S subscrito são nucleosideos S-cEt, cada citosina é uma citosina não metilada e todas as ligações são ligações de fosforotioato. Tal como ilustrado nos exemplos seguintes, este composto exibiu um forte envolvimento alvo de miR-17 in vivo, eficácia em modelos de rato de PKD e um perfil farmacocinético que favoreceu a distribuição para o rim.

[0279] Adicionalmente, a viscosidade de RG4326 foi determinada como sendo 6 cP a uma concentração de aproximadamente 150 mg/mL (em água a 20° C), assim o RG4326 em solução é adequado para administração por injeção subcutânea.

Exemplo 3: Compostos Anti-miR-17 Curtos Adicionais [0280] Um composto adicional de nove nucleotídeos (RG4047), em que cada nucleosídeo é um nucleosídeo S-cEt, foi testado em ensaios selecionados, para comparar a atividade, a segurança e o perfil farmacocinético do RG4326.

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79/97 [0281] Um dos ensaios usados foi o ensaio da luciferase. Como notado acima, os compostos anti-miR-17 curtos (por exemplo, 9 nucleótidos), embora possam ter uma vantagem em estudos in vivo, não têm necessariamente um bom desempenho em ensaios de transfecção in vitro. Consequentemente, as condições de transfecção do ensaio da luciferase foram otimizadas para compostos anti-miR-17 curtos, de modo que a atividade inibidora dos compostos pudesse ser medida.

[0282] O RG5124 foi usado como um composto de controle. O RG5124 tem 9 nucleosideos ligados em comprimento e tem o mesmo padrão de modificação do açúcar que o RG4326, mas tem uma sequência de nucleobases que não é complementar ao miR-17.

[0283] O plasmídeo repórter de luciferase para miR-17 continham um sitio de ligação a miR-17 totalmente complementar na 3'-UTR do gene luciferase. As células HeLa foram transfectadas com a simulação de microRNA e seu repórter de luciferase cognato, seguido por transfecção com anti-miR17 nas doses de 0, 001, 3, 10, 30, 100 e 300 nM. No final do período de transfecção de 24 horas, a atividade da luciferase foi medida. Como se mostra na Tabela 2-1, o RG4047, embora não tão potente como o RG4326, inibiu a atividade de miR-17 de um modo dependente da dose. SD indica desvio padrão.

Tabela 2-1: Ensaio de Repórter de Luciferase

			Desrepressão de Dobra de Luciferase em cada concentração de anti-miR-17 (nM)
			300 nM	100 nM	30 nM	10 nM	3 nM	0,00 1 nM
RG432 6	AsGsCmAfCfUfUmUs G_s	Médi a	11, 7	13, 9	14, 1	10, 4	5, 3	1
SD	3, 6	6,5	6, 9	4, 9	1, 8	0,2

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RG512 4	AsCsAmAfUfGfCmAs Cs	Médi a	1	0,7	1	2, 6	1, 2	1
SD	0,3	0,4	0,4	2,8	0, 4	0,2
RG4 0 4 7	AsGsCsAsCsUsUsUs G_s	Médi a	7,5	8,2	3,5	2,2	1, 6	1
SD	3	3	3	3	3	60

[0284] O RG4047 foi avaliado quanto à potência in vivo, segurança e distribuição ao rim e fígado. Tal como na triagem maior da biblioteca, a potência in vitro não previu o comportamento in vivo. O RG4047 produziu um leve sinal próinflamatório tanto no rim como no fígado, foi um inibidor menos potente do miR-17 do que o RG4326 in vivo tanto no camundongo do tipo selvagem quanto no PKD, e teve uma razão de rim para o fígado muito menor (vide Tabela 2-2). Esses estudos revelaram que a atividade e as propriedades do RG4047 não melhoraram em relação ao RG4326.

[0285] Para explorar ainda mais os efeitos da colocação, tipo e número de modificações químicas na atividade e razão de rim para fígado dos compostos 9-meros, os compostos anti-miR-17 adicionais foram avaliados em camundongos selvagens e camundongos JCK. O modelo JCK é um modelo de camundongo de doença cística renal em progressão lenta associada ao mesmo gene causador da nefronofisia do tipo humano 9. Os cistos renais neste camundongo desenvolvem-se em múltiplas regiões do néfron.

[0286] O miPSA foi usado para avaliar a potência de cada composto, medida pela pontuação de deslocamento, em camundongos do tipo selvagem e JCK. O acúmulo de tecido do composto anti-miR-17 foi medido por extração do composto usando extração líquido-líquido (LLE) e/ou extração em fase sólida (SPE), seguido por análise da identidade e concentração do

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81/97 composto usando cromatografia liquida de alto desempenho de fase reversa de pareamento iônico acoplada a espectometria de massa de tempo de vôo (IP-RP-HPLC-TOF).

[0287] Os resultados para estes compostos adicionais, bem como para RG4326 e RG4047, são mostrados na Tabela 2-2.

[0288] Os camundongos do tipo selvagem receberam uma dose única de 3 mg/kg para a análise de miPSA e uma dose única de 30 mg/kg para a análise de acumulação de tecido. Os camundongos JCK foram administrados com uma dose única de 30 mg/kg para ambas as análises de miPSA e acúmulo de tecido. O tecido renal foi coletado sete dias após a administração do composto anti-miR-17. Conforme mostrado na Tabela 2-2, as variações no tipo e colocação de nucleosídeos modificados exibiram efeitos substanciais na atividade inibidora de miR17 e/ou na razão de rim para fígado de compostos anti-miR-17. Por exemplo, enquanto o RG4324 exibiu potência medida pelo miPSA, a razão rim:fígado foi menor do que a observada para outros compostos. Uma razão de rim para fígado mais alta é geralmente preferida para uma doença na qual o sítio de ação primário é o rim. Por outro lado, o RG4327 exibiu uma alta razão renal: fígado, mas uma baixa potência em camundongos com PKD. Como notado acima, o RG4326 exibiu a potência e o perfil farmacocinético mais adequados para o tratamento de PKD.

Tabela 2-2: Comparação da Atividade Composta de anti-miR-17 e Acumulação no Tecido

Composto

Sequência (5' para 3') e Modificações Químicas

Razão de Rim para Fígado em Camundo

Pontuaç ão de miPSA em Camundo ngos do

Pontuaç ão de miPSA em Camundo

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		ngos do Tipo Selvage m	ngos com PKD	Tipo selvage m	ngos com PKD
4047	AsGsCsAsCsUsUsUsGs	4,4	2,1	1,76	1,80
4324	AsGsCmAsCmUsUmUsGs	5, 0	3, 9	2,81	2,53
4325	AsGsCmAmCmUmUmUsGs	12,4	5,7	1, 82	2,00
4326	AsGsCmAfCfUmUsGs	9, 8	6, 0	2, 63	2, 65
4327	AsGmCfAfCfUfUfUmGs	24, 9	9, 4	2,85	1,53

Exemplo 4: Atividade de RG4326 em Ensaios In Vitro

Adicionais [0289] Ensaios in vitro adicionais foram conduzidos para explorar adicionalmente a potência de RG4326. Um ensaio repórter de luciferase foi usado para testar a capacidade de RG4326 de inibir os membros miR-17, miR-20a, miR-93 e miR-106b da familia miR-17. Um plasmideo repórter de luciferase para cada um de miR-20a, miR-93 e miR-106b foi construído, com um sitio de ligação de microRNA totalmente complementar na 3'-UTR do gene de luciferase. As células HeLa foram transfectadas com a simulação de microRNA e seu repórter de luciferase cognato, seguido por transfecção com anti-miR17 a uma dose de 100 nm. Conforme mostrado na Tabela 3, cada um dos miR-17, miR-20a, miR-93 e miR-106b foi inibido por RG4326, demonstrando que os compostos anti-miR-17 inibem múltiplos membros da familia miR-17. Como o RG4326 é 100% complementar aos outros membros da familia miR-17 não testados, miR-20b e miR-106b, espera-se que ele também iniba esses microRNAs. Os dados da Tabela 3 também são mostrados na Figura IA.

Tabela 3: Inibição da familia miR-17 in vitro

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	Depressão de Dobra de Luciferase Média	SD
miR-17	13, 1	1, 6
miR-2 0	21,7	2,8
miR-93	10, 9	0, 9
miR-10 6	17,7	5,5

[0290] Para testar a capacidade do RG4326 para inibir a regulação miR-17 de alvos endógenos, a desrepressão do gene alvo miR-17 foi avaliada in vitro em vários tipos de células renais de rins normais e de camundongos com PKD. As células de duto coletor de rim de camundongo (IMCD3) foram tratadas com 0,3 nM, 1,2 nM, 4,7 nM, 18,8 nM, 75 nM e 300 nM de RG4326 ou um oligonucleotido de controle, RG5124. Os grupos de controle adicionais incluiram células não tratadas e células transfectadas de forma estável (células tratadas apenas com reagente de transfecção). Após um periodo de transfecção de 24 horas, as células foram coletadas e o RNA foi extraído. Os níveis de mRNA de 18 genes alvejados pelo miR-17 foram medidos, e calculados a média para fornecer um escore de assinatura farmacodinâmico (PD Signature Score), representado como uma dobra de Log2 (Log2FC) em relação à transfecção estável. Como mostrado na Tabela 4, o RG4326, mas não o tratamento de controle, desreprimiu os alvos de miR-17 de um modo dependente da dose. Os dados também são mostrados na Figura 2B.

Tabela 4: Pontuação de assinatura miR-17 PD em células IMCD3

		Concentração do composto anti-miR-17 (nM)
		0,3	1,2	4,7	18,8	75	300
RG4326	Log2Fc Médio	-0,075	-0,067	0, 027	0,272	0,369	0,373
	SD	0,020	0, 017	0, 014	0,037	0,006	0,002

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RG5124	Log2Fc Médio	-0,083	-0,103	-0,097	-0,108	-0,124	-0,065
	SD	0,033	0,013	0,026	0, 041	0,039	0,037

[0291] A capacidade do RG4326 de desreprimir alvos de miR-17 foi também avaliada em tipos de células renais adicionais, derivados dos rins de camundongos normais e com PKD. As células foram tratadas com 30 nM de RG4326 ou oligonucleotideo de controle RG5124. Após um periodo de transfecção de 24 horas, as células foram coletadas e o RNA foi extraído. Os níveis de mRNA de 18 genes alvejados pelo miR-17 foram medidos, e calculados a média para fornecer um escore de assinatura farmacodinâmico (PD Signature Score), representado como uma dobra de Log2 (Log2FC) em relação à transfecção estável. Como mostrado na Tabela 5, RG4326, mas não o oligonucleotideo de controle, os alvos de miR-17 nãoreprimidos em vários tipos diferentes de células derivadas de rim saudáveis e doentes. P <0,05 indica um p-valor inferior a 0,05, conforme calculado pela ANOVA de um fator. NS indica uma alteração que não é estatisticamente significativa.

Tabela 5: Desrepressão de alvos de miR-17 em tipos de células renais

Rim de Camundongo do Tipo Selvagem	Nomenclatura de Linhagem Celular	Origem do Rim de Camundongo	RG4326 Pontuação de Assinatura PD (Log2FC a 30 nM)	RG5124 Pontuação de Assinatura PD (Log2FC a 30 nM)
Dutos de Coleta	DBA-WT	Normal	0,40 ± 0,09, p<0,05	0, 10 ± 0,05; ns
Dutos de Coleta	DBA-PKD	PKD	0,52 ± 0,06, p<0,05	-0,07 ± 0,02; ns

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Dutos de Coleta	IMCD3	Normal	0,57 ± 0,06, p<0,05	-0,03 ± 0,05; ns
Dutos de Coleta	Ml	Normal	0,18 ± 0,18, p<0,05	-0,08 ± 0,02; ns
Túbulos Distais	MDCT	Normal	0,10 ± 0,01, p<0,05	0, 03 ± 0,01; ns
Túbulos Proximais	LTL-WT	Normal	0,35 ± 0,02, p<0,05	-0,04 ± 0,02; ns
Túbos Proximais	LTL-PKD	PKD	0,39 ± 0,01, p<0,05	-0,03 ± 0,04; ns

Exemplo 5: Potência In Vivo de RG4326 [0292] O ensaio de troca polissômica do microRNA (miPSA), foi usado para identificar os compostos que engatam diretamente no miR-17 no rim de camundongos normais e com PKD. O miPSA baseia-se no principio de que os miRNAs ativos se ligam a seus alvos de mRNA em polissomas ativos de alto peso molecular (HMW), enquanto os miRNAs inibidos residem nos polissomas de baixo MW (LMW). O tratamento com anti-miR resulta em um desvio do microRNA dos polissomas HMW para os polissomas LMW. Portanto, o miPSA fornece uma medição direta do acoplamento do alvo de microRNA por um anti-miR complementar (Androsavich et al., Nucleic Acids Research, 2015, 44: el3) .

[0293] Para este experimento, o modelo de PKD selecionado foi o modelo JCK, um modelo de camundongo de doença cistica renal de progressão lenta associado ao mesmo gene que causa a nefronofisia humana do tipo 9. Os cistos renais neste camundongo desenvolvem-se em múltiplas regiões do néfron.

[0294] Os camundongos C57BL6 foram tratados com uma dose subcutânea única de 0,3, 3 e 30 mg/kg de RG4326 ou ferramenta anti-miR-17 (descrita no Exemplo 1). Os camundongos

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JCK foram tratados com uma dose subcutânea única de 3, 30 e 100 mg/kg de RG4326 ou ferramenta anti-miR-17. O tratamento de PBS foi usado como um controle adicional.

[0295] Sete dias após o tratamento, os camundongos foram sacrificados e o tecido renal foi isolado para o miPSA. As pontuações de deslocamento calculadas, mostradas na Tabela 6, demonstraram um forte envolvimento do alvo pelo RG4326 em rins normais e com PKD. As pontuações de deslocamento após o tratamento com RG4326 foram superiores às pontuações de deslocamento após o tratamento com o composto anti-miR-17 da ferramenta. Os dados para camundongos do tipo selvagem e camundongos JCK são também mostrados na Figura 3A e na Figura 3B, respectivamente.

Tabela 6: Engate de Alvo por RG4326 in Vivo

		Camundongos Normais			Camundongos JCK
		Dose anti-miR			Dose Anti-miR
		0,3 mg/k g	3 mg/k g	30 mg/k g			3 mg/k g	30 mg/k g	100 mg/k g
RG4326	Médi a	2.29	2, 91	3,19		Médi a	1, 63	2,58	2,73
	SD	0,52	0, 97	0,81		SD	0,04	0,32	0,53

Ferrament a AntimiR-17	Médi a	1,51	2,05	2,77		Médi a	0, 97	1, 67	2,08
	SD	0,51	0,79	0,55		SD	0,21	0,27	0,46

PBS	Médi a	0, 03				Médi a	0, 00
	SD	0,52				SD	0,28

Exemplo 6: Eficácia In Vivo de RG4326 em Modelos

Experimentais de PKD [0296] Dois modelos experimentais de PKD foram usados para avaliar a eficácia. Os camundongos com Pkd2-KO

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87/97 desenvolvem espontaneamente doença renal policistica e foram usados como modelo da ADPKD. Vide Patel et al, PNAS, 2013; 110 (26) : 10765-10770. Os camundongos Pcy portadores de uma mutação em Nphp3 desenvolvem espontaneamente doença renal policistica, com uma progressão mais lenta da doença do que a observada nos camundongos com PKD2-KO. O modelo de Pcy é usado como modelo de nefronoftise. Vide Happe e Peters, Nat. Rev. Nephrol., 2014; 10: 587-601.

Modelo de Pkd2-K0 [0297] O RG4326 foi testado no modelo de camundongo com PKd2-KO de ADPKD. Este modelo também é conhecido como o modelo de PKD2-KO. Os camundongos do tipo selvagem foram usados como camundongos de controle. Um oligonucleotideo complementar a um miRNA não relacionado ao miR-17 foi usado como controle de tratamento para especificidade (RG5124).

[0298] Em cada um dos dias 10, 11 12 e 19 de idade, foram administradas ninhadas de camundongos organizadas por sexo com uma injeção subcutânea de RG4326 em uma dose de 20 mg/kg (n = 12), RG5124 em uma dose de 20 mg/kg (n = 12), ferramenta anti-miR-17 na dose de 20 mg/kg (n = 12), ou PBS (n = 12). Os camundongos foram sacrificados aos 28 dias de idade e foram medidos o peso dos rins, o peso corporal, o índice de cisto, o nível de creatinina no soro e o nível de nitrogênio ureico no sangue (BUN). O nível de BUN é um marcador da função renal. Um nível mais alto de BUN se correlaciona com pior função renal, portanto, uma redução no nível de BUN é um indicador de lesão e dano renal reduzido e melhora da função. A significância estatística foi calculada por ANOVA unidirecional com correção múltipla de Dunnett.

[0299] O índice de cisto é uma medida histológica

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88/97 da área cística em relação à área total do rim. Para esta análise, um rim foi perfundido com PBS frio e 4% (p/v) de paraformaldeido e depois coletado. Os rins foram fixados com paraformaldeido a 4% por 2 horas e, então, embebidos em parafina para seccionamento. Seções sagitais dos rins foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E). Todas as etapas de processamento de imagens foram automatizadas e ocorreram em software livre e de código aberto: um script RI que usava funções do pacote EB Image Bioconductor2 e do pacote ImageMagick3 de ferramentas de processamento de imagem. As imagens H & E do rim no formato Aperio SVS foram convertidas em imagens TIFF e o primeiro quadro foi retido para análise de imagem. Primeiro, a área total da seção do rim foi calculada usando a segmentação de imagem. A segmentação de imagens foi usada de forma semelhante para encontrar todas as estruturas internas, incluindo o cisto renal. Um filtro foi aplicado para remover todos os objetos com menos de um raio médio de três pixels. 0 índice cístico é a área da imagem associada aos cistos dividida pelas áreas totais do rim. 0 índice cístico foi calculado separadamente para cortes renais longitudinais e transversais para cada animal individual.

[0300] O índice cístico combinado de animais individuais foi comparado para cada grupo de tratamento.

[0301] Os resultados são mostrados na Tabela 7. A razão média entre o peso do rim e o peso corporal (razão de KW/BW) em camundongos Pkd2-KO tratados com RG4326 foi 29% menor que a razão de KW/BW média em camundongos Pkd2-KO administrados com PBS (p = 0, 0099) . Os camundongos Pkd2-KO tratados com RG4326 mostraram uma redução média de 12% no índice de cisto em comparação com camundongos Pkd2-KO administrados com PBS,

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89/97 embora a diferença não tenha sido estatisticamente significativa. Os niveis médios de BUN foram reduzidos em 13% nos camundongos Pkd2-KO tratados com PBS, embora a diferença não tenha sido estatisticamente significativa. Os niveis médios de creatinina sérica em camundongos Pkd2-KO tratados com RG4326 foram 18% menores do que em camundongos Pkd2-KO administrados com PBS, embora o resultado não tenha sido estatisticamente significativo. Esses resultados não foram observados com o oligonucleotideo de controle, indicando que eles são especificamente devido à inibição de miR-17. Enquanto um estudo anterior demonstrou reduções na relação KW/BW, BUN e indice de cisto em Pkd2-KO após o tratamento com a ferramenta anti-miR-17, nenhuma alteração estatisticamente significativa foi observada neste estudo. 0 tratamento com o oligonucleotideo de controle, RG5124, não reduziu o peso do rim para a razão de peso corporal, índice cístico ou BUN. A relação KW/BW, BUN e índice cístico também são mostrados na Figura 4A, Figura 4B e Figura 4G, respectivamente.

Tabela 7: Eficácia do RG4326 no Modelo de Pkd2-KO de

PKD

		Razão de KW/BW mg/ g	BUN mg/ dL	índice Cístico	Greatina Sérica mg/ dL
RG4326	Média	40, 98	72, 92	50,3	0,26
	SD	5, 973	15, 1	10,21	0,05
RG5124	Média	55,35	86, 67	56, 67	0,31
	SD	11,73	20,18	6, 679	0,08
PBS	Média	57,72	83,58	56, 86	0,31
	SD	18,47	23, 96	7, 928	0, 14

0302] Estes resultados demonstram que o tratamento com RG4326 conduz a um resultado positivo em camundongos com Pkd2-K0 para um desfecho biológico relevante para o tratamento de PKD, volume renal relativo ao peso

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90/97 corporal. Com relação a este desfecho em particular, o RG4326 foi mais eficaz do que o composto anti-miR-17 da ferramenta. O tratamento com RG4326 resultou em uma tendência para redução do BUN e redução do índice de cisto nos camundongos com Pkd2KO.

Modelo de Pcy [0303] O RG4326 foi testado no modelo de camundongo Pcy. Os camundongos do tipo selvagem foram usados como grupo de controle. A partir das quatro semanas de idade, os camundongos Pcy foram tratados uma vez por semana via injeção subcutânea com RG4326 na dose de 25 mg/kg, ferramenta anti-miR-17 na dose de 25 mg/kg, oligonucleotideo RG5124 de controle na dose de 25 mg/kg ou PBS. Cada grupo de tratamento continha 15 camundongos machos. Três tratamentos foram administrados aos 55, 56 e 57 dias de idade, e semanalmente às 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14 semanas de idade. Também foi testado o tolvaptano, um antagonista dos receptores V2 da vasopressina (VRA) que é prescrito para alguns pacientes com doença renal policística. Os camundongos foram sacrificados às 15 semanas de idade. O peso corporal foi registrado. Um rim foi extraído e pesado e o outro processado para análise histológica para calcular o índice de cisto, conforme descrito para o estudo no PKHDl/cre; Pkd2^F/F. O nível de nitrogênio ureico no sangue (BUN) e o nível de creatinina sérica foram medidos. A significância estatística foi calculada por ANOVA unidirecional com correção múltipla de Dunnett.

[0304] Os resultados são mostrados na Tabela 8. Em relação à razão KW/BW média nos camundongos tratados com PBS, a razão KW/BW média nos camundongos Pcy tratados foi 19% menor no grupo tratado com 25 mg/kg de RG4326 (p = 0,0055).

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91/97

Além disso, o índice cístico foi reduzido em 34% em camundongos Pcy tratados com RG4326 em comparação com camundongos Pcy administrados com PBS (p = 0,016) . O tratamento com RG4326 reduziu o BUN em camundongos Pcy em 16%, em relação ao BUN em camundongos Pcy tratados com PBS (p = 0, 0070) . O tratamento com o oligonucleotideo de controle ou o composto anti-miR-17 da ferramenta não resultou em reduções estatisticamente significativas na razão KW/BW, no BUN ou no índice cístico. O tolvaptano não foi eficaz neste estudo. Os dados da Tabela 8 também são mostrados na Figura 5.

Tabela 8: Eficácia de RG4326 no Modelo de Pcy

		Razão de KW/BW	BUN mg/ dL	índice Cístico
RG4326	Média	18, 1	19,7	0,16
	SD	2,0	2,8	0,06
RG5124	Média	21,4	21,2	0,23
	SD	3,4	2,3	0,08
Tolvaptano	Média	20,1	24,4	026
	SD	4,5	3,4	0,09
PBS	Média	22,5	23,4	0,24
	SD	3, 9	3, 8	0,07

[0305] Estes dados demonstram, em um modelo adicional de PKD, que o tratamento com RG4326 leva a uma redução no peso renal, no BUN e no índice cístico.

Exemplo 7: Avaliação Farmacocinética de RG4326 [0306] Devido à sua reduzida capacidade de ligação às proteínas do soro, que é uma propriedade que conduz a distribuição de oligonucleotídeos no corpo, não é necessariamente esperado que os oligonucleotídeos curtos tenham propriedades farmacocinéticas que os tornem adequados para uso como fármacos. O RG4326 foi incubado em homogenato de camundongo, macaco ou fígado humano. A identidade e concentração de RG4326 e metabolites foi determinada após uma

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92/97 incubação de 24 horas. 0 RG4326 e os metabólitos foram extraídos com extração líquido-líquido (LLE) e/ou extração em fase sólida (SPE), que foram analisados quanto à identidade e concentração por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa e pareamento de ions acoplada a especrometria de massa de tempo de voo (IP-RP-HPLC-TOF) . Como mostrado na Tabela 9, apesar do seu comprimento curto, verificou-se que o RG4326 tinha um perfil farmacocinético particularmente favorável, com mais de 95% do composto progenitor RG4326 permanecendo intacto após a incubação de 24 horas.

Tabela 9: Estabilidade Metabólica In Vitro no Lisado de Camundongo, Macaco e Fígado Humano

Lisado Hepático Ex Vivo (% de Analito)
Composto	Sequência	Camundong o	Macaco	Humano
RG4326	5' - AsGsCmAfCfUfUmUsGs -3 '	99, 1	95, 9	98,7
Metabólito 1	AsGsCmAfCf-3''	0,3	1,8	0, 6
Metabólito 2	5'- AsGsCmAf-3'	0, 6	2,3	0,7

[0307] O comportamento farmacocinético foi avaliado pela administração de uma dose única subcutânea de 30 mg/kg de RG4326 ou da ferramenta anti-miR-17 composto a camundongos do tipo selvagem. À uma hora, quatro horas, oito horas, um dia, sete dias, 14 dias, 28 dias e 56 dias após a injeção única, os camundongos foram sacrificados e a concentração média do composto anti-miR no tecido renal e hepático foi medida (ug/g), conforme descrito acima. Calculouse a área sob a curva (AUG) para o tecido renal e hepático usando a fórmula ug * h/g, em que ug é a quantidade de oligonucleotideo no tecido, h é o momento da coleta de tecidos

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93/97 em horas e g é o peso do tecido. A razão de AUC renal e a AUC hepática foi determinada. 0 tecido renal também foi processado para o miPSA, para determinar o envolvimento do alvo para cada composto neste estudo. A AUC da PSA foi calculada usando a fórmula Log2FC * h, em que Log2FC é o valor de deslocamento, h é o ponto no tempo da coleta de tecido em horas. A potência no rim no dia 7 foi calculada usando a fórmula Log2FC+g/ug onde Log2FC é o valor de deslocamento conforme determinado pelo miPSA, g é o peso do tecido renal, e ug é a quantidade de anti-miR no tecido renal no dia 7.

[0308] Conforme mostrado na Tabela 10, a razão de AUC renal para AUC do fígado para RG4326 é maior do que para o composto anti-miR-17 da ferramenta. Surpreendentemente, embora a AUC dos rins seja mais baixa para o RG4326 do que para o composto anti-miR-17 da ferramenta, a potência determinada por miPSA é substancialmente maior. Portanto, o RG4326 exibe maior potência em concentrações mais baixas no rim, o tecido alvo primário para PKD.

Tabela 10: Perfil Farmacocinético de RG4326

Perfil In Vivo após dose única a 30 mg/kg	Ferramenta Anti-miR-17	RG4326
Farmacocinética	AUC Renal (ug*h/g; uma hora a 56 dias)	20711	5347
	AUC Hepática (ug*h/g; uma hora a 56 dias)	20275	1206
	Razão Kauc/Lauc	1,0	4,4
Inibição de miR-17	AUC Renal de miPSA (Log2FC*h; 8 horas a 7 dias)	296	463

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Potência

D7 Renal (Log2FC*g/ug)

0, 047

0,351

[0309] O comportamento farmacocinético de RG4326 foi adicionalmente caracterizado em camundongos do tipo selvagem (C57B16) e camundongos com PKD (JCK). Grupos de 5 camundongos receberam, cada um, três injeções subcutâneas de 10 mg/kg em cada um dos três dias consecutivos. Em um, quatro, sete, 14 e 21 dias após a terceira e última injeção, os camundongos foram sacrificados e amostras de plasma, rim e figado foram coletadas. Para medição do RG4326, o RG4326 e foi extraído usando extração liquido-liquido (LLE) e/ou extração em fase sólida (SPE), que foi analisado quanto à identidade e concentração por cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa e pareamento de ions acoplada a especrometria de massa de tempo de voo (IP-RP-HPLC-TOF).

[0310] Os dados estão resumidos na Tabela 11. Observou-se que o RG4326 é estável tanto no plasma como nos tecidos, com mais de 90% do composto principal remanescente após 21 dias. O anti-miR é distribuído rapidamente aos tecidos, poucas horas após a injeção e, principalmente, nos rins. A meia-vida é de aproximadamente oito dias no figado e rim de camundongos do tipo selvagem, aproximadamente seis dias no figado de camundongos JCK, e aproximadamente 8 dias no rim de camundongos JCK. Nos camundongos do tipo selvagem, a razão entre a AUG renal e a AUG hepática foi de 17. Nos camundongos com PKD, a relação entre a AUG renal e a AUG hepática foi de 13. Estes dados demonstram que o perfil farmacocinético do RG4326 é comparável em camundongos normais e com PKD.

Tabela 11: Perfil Farmacocinético do RG4326 em Camundongos Normais e com PKD

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Modelo de Camundongo	Normal	PKD
Cepa de Camundongo	C57BL6	JCK
Matriz de Tecido	Fígado	Rim	Fígado	Rim
%Parental	>90%	>90%	>90%	>90%
C24h	1,6 ug/g	61,4 ug/g	5,9 ug/g	66,5 ug/g
Tl/2	~8 dias	~8 dias	~6 dias	~8 dias
AUCo-21dias	17 ug*dia/g	282 ug*dia/g	37 ug*dia/g	497 ug*dia/g
Razão de K/L (AUC)	17	13
Razão de K/L (C24h)	38	11

Exemplo 8: Avaliação de Segurança de RG4326 [0311] O potencial de toxicidade renal e hepática foi avaliado em ensaios in vitro, ex vivo e in vivo.

[0312] O potencial de toxicidade foi avaliado usando um ensaio bioquímico de ligação fluorescente (FBA). A FBA é realizada incubando um corante fluorescente com cada composto e medindo imediatamente a fluorescência. Os resultados são expressos como alteração de dobra (FC linear) em relação a amostras tratadas com controle.

[0313] Os compostos altamente fluorescentes têm o potencial de produzir toxicidade in vivo.

[0314] Os ensaios ex vivo foram realizados com cortes de tecido hepático ou renal. O ensaio de corte hepático ou renal é realizado incubando um corte de tecido de uma amostra hepática de núcleo isolado do rato. Após uma incubação de 24 horas, o RNA é extraído do corte do tecido, e os níveis de expressão de 18 genes pró-inflamatórios, incluindo IFIT, são medidos. Foi realizada uma transformação log2 da alteração da dobra (Log2-FC) em relação ao tratamento com PBS. Uma

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96/97 indução na expressão gênica pró-inflamatória indica um potencial para efeitos pró-inflamatórios in vivo.

[0315] Um ensaio in vivo foi realizado em camundongos normais, Svl29. Uma única dose subcutânea de 300 mg/kg de RG4326 foi administrada. Incluídos como tratamentos de controle foram PBS, e dois anti-miRs não relacionados ao miR-17, um conhecido por ser pró-inflamatório (controle positivo) e um que não é pró-inflamatório (controle negativo). Quatro dias depois, os camundongos foram sacrificados. O tecido renal e hepático foi isolado para extração de RNA. O nível de um gene que se sabe ser induzido durante uma resposta inflamatória, IFIT, foi medido e normalizado para GAPDH de camundongo. Foi realizada uma transformação log2 da alteração da dobra (Log2-FC) em relação ao tratamento com PBS.

Tabela 11: Perfil de Segurança de RG4326

	Controle Positivo	Controle Negativo	RG4326
Ensaio de Ligação de Fluorescência Bioquímica Unidade de Fluorescência Relativa (FC Linear)	136,4 ± 14, 9	4 6,3 ± 14,7	24,9 ± 3, 1
Ensaio de Cortes Renais Ex Vivo Pontuação de Assinatura PróInflamatória (Log2-FC)	1,35 ± 0,35	0,39 ±0,07	-0,30 ± 0,22
Ensaio de Cortes Hepáticos Ex Vivo Expressão de IFIT3 (Log2-FC)	7,57 ± 0, 62	0,54 ± 0, 60	1, 11 ± 0,32
Ensaio Agudo In Vivo Expressão de IFIT Renal (Log2-FC)	1,29 ± 0,58	0,28 ± 0,31	0,34 (n=l)
Expressão de IFIT Hepática (Log2-FC)	2,24 ± 0, 84	0, 62 ± 0,54	0,21 ± 0, 08

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97/97 [0316] Esses dados demonstraram que o RG4326 apresentou perfil de segurança favorável e risco mínimo de risco pró-inflamatório baseado em múltiplos ensaios.

Claims

1. COMPOSTO, caracterizado por compreender um oligonucleotideo modificado que consiste em 9 nucleosideos ligados, em que o oligonucleotideo tem o seguinte padrão de nucleosídeo na orientação de 5' para 3':

2. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência de nucleobases do oligonucleotideo modificado compreender a sequência de nucleobases 5'-GCACUUU-3', em que cada citosina é independentemente selecionada dentre uma citosina não metilada e uma 5-metilcitosina.

3. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência de nucleobase do oligonucleotideo modificado ser 5'-AGCACUUUG-3', em que cada citosina é independentemente selecionada dentre uma citosina não metilada e uma 5-metilcitosina.

4. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela citosina ser uma citosina não metilada.

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2/5

5. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por consistir no oligonucleotideo modificado ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo sal farmaceuticamente aceitável ser sal sódico.

7. OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO, caracterizado por ter a estrutura:

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3/5

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8 . OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser um sal farmaceuticamente aceitável da estrutura.

9. OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser um sal sódico da estrutura.

10. OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO, caracterizado por ter a estrutura:

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4/5

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um oligonucleotideo modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações

7 a 10 e um diluente farmaceuticamente aceitável.

12 . COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação caracterizada pelo diluente farmaceuticamente aceitável ser uma solução aquosa.

13 . COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a

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5/5 reivindicação 12, caracterizada pela solução aquosa ser uma solução salina.

14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um oligonucleotideo modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, que é uma composição liofilizada.

15. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por consistir essencialmente em um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um oligonucleotideo modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10 em uma solução salina.

16. MÉTODO PARA INIBIR A ATIVIDADE DE UM OU MAIS MEMBROS DA FAMÍLIA MIR-17 EM UMA CÉLULA, caracterizado por compreender colocar a célula em contato com um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um oligonucleotideo modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10.

17. MÉTODO PARA INIBIR A ATIVIDADE DE UM OU MAIS MEMBROS DA FAMÍLIA MIR-17 EM UM SUJEITO, caracterizado por compreender administrar ao sujeito uma composição conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 11 a 15.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo sujeito ter uma doença associada a miR-17.