TWI769197B - 用於治療多囊腎病之組成物 - Google Patents

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Abstract

本文提供使用靶向miR-17之經修飾寡核苷酸來治療包括常染色體顯性多囊腎病的多囊腎病的方法。

Description

用於治療多囊腎病之組成物
本申請案主張於2016年12月5日提出申請之美國臨時申請案第62/430,139號之優先權益，該申請案出於任何目的以全文引用之方式併入本文中。
本文提供用於治療多囊腎病之組成物及方法。
多囊腎病之特徵在於數個填充液體之囊腫在腎中之積累。此等囊腫由稱為囊腫上皮之單層上皮細胞內襯。隨著時間推移，由於囊腫上皮造成的細胞增殖增加及液體分泌主動，所以囊腫之尺寸增加。增大之囊腫壓迫周圍正常組織，導致腎功能下降。該疾病最終進展為需要透析或腎移植之末期腎病。在此階段，囊腫可由含有萎縮小管之纖維化區域包圍。
許多遺傳性疾病可導致多囊腎病(PKD)。各種形式的PKD係經由遺傳方式來區分，例如常染色體顯性或常染色體隱性遺傳；器官受累及腎外部表型之呈現；末期腎病之發作年齡，例如在出生時、兒童期或成年期；以及與疾病相關之潛在基因突變。參見，例如Kurschat等，2014,Nature Reviews Nephrology,10：687-699。
實施例1. 一種化合物，其包含由9個連接之核苷組成的經修飾寡核苷酸，其中該經修飾寡核苷酸在5’至3’取向上具有以下核苷模式：NSNSNMNFNFNFNMNSNS 其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷，且所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵；且其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列包含核苷鹼基序列5’-CACUUU-3’，其中各胞嘧啶獨立地選自非甲基化胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶；或其醫藥學上可接受之鹽。
實施例2. 如實施例第1項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列包含核苷鹼基序列5’-GCACUUU-3’，其中各胞嘧啶獨立地選自非甲基化胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶。
實施例3. 如實施例第1項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列為5’-AGCACUUUG-3’，其中各胞嘧啶獨立地選自非甲基化胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶。
實施例4. 如實施例第1、2或3項中任一項之化合物，其中各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。
實施例5. 如實施例第1至4項中任一項之化合物，其中該化合物由經修飾寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽組成。
實施例6. 如實施例第1至5項中任一項之化合物，其中該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽。
實施例7. 一種經修飾寡核苷酸，其具有以下結構：
Figure 106142317-A0202-12-0003-2
或其醫藥學上可接受之鹽。
實施例8. 如實施例第7項之經修飾寡核苷酸，其為該結構之醫藥學上可接受之鹽。
實施例9. 如實施例第7項之經修飾寡核苷酸，其為該結構之鈉鹽。
實施例10. 一種經修飾寡核苷酸，其具有以下結構：
Figure 106142317-A0202-12-0004-3
實施例11. 一種醫藥組成物，其包含如實施例第1至6項中任一項之化合物或如實施例第7至10項中任一項之經修飾寡核苷酸及醫藥學上可接受之稀釋劑。
實施例12. 如實施例第11項之醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之稀釋劑為水溶液。
實施例13. 如實施例第12項之醫藥組成物，其中該水溶液為鹽水溶液。
實施例14. 一種醫藥組成物，其包含如實施例第1至6項中任一項之化合物或如實施例第7至10項中任一項之經修飾寡核苷酸，其為凍乾組成物。
實施例15. 一種醫藥組成物，其基本上由於鹽水溶液中的如實施例第1至6項中任一項之化合物或如實施例第7至10項中任一項之經修飾寡核苷酸組成。
實施例16. 一種用於抑制細胞中miR-17家族之一或多個成員之活性的方法，該方法包含使該細胞與如實施例第1至6項中任一項之化合物或如實施例第7至10項中任一項之經修飾寡核苷酸接觸。
實施例17. 一種用於抑制受試者中miR-17家族之一或多個成員之活性的方法，該方法包含向該受試者投與如實施例第11至15項中任一項之醫藥組成物。
實施例18. 如實施例第17項之方法，其中該受試者患有與miR-17相關之疾病。
【詳細描述】
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同的意義。除非提供明確定義，否則關聯本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學使用之命名法及本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學之程序及技術為此項技術中熟知且通常使用者。在本文中之術語存在複數個定義之情況下，以本部分中之定義為準。可使用化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及治療受試者之標準技術。某些此類技術及程序可見於例如以下文獻中：「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」,Sanghvi及Cook編，American Chemical Society,Washington D.C.,1994；及「Remington's Pharmaceutical Sciences」,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，第18版，1990；且其出於任何目的以引用之方式併入本文中。除非另外指出，否則本文中之整篇揭示內容中提及之所有專利、專利申請案、公開申請案及公開案、GENBANK序列、網站及其他公開材料在允許時均以全文引用之方式併入本文中。在提及URL或其他類似識別符或位址的情況下，應瞭解此類識別符可改變並且網際網路上之特定資訊可改變，但可藉由搜尋網際網路找到等效資訊。對其之提及證明該資訊之可用性及公開傳播。
在揭示及描述本發明之組成物及方法之前，應瞭解本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的而不欲具有限制性。須指出，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。
定義
「多囊腎病」或「PKD」為特徵在於數個填充液體之囊腫在腎中之積累的囊性腎病。多個囊腫在至少一個腎中形成，經常導致受累及之腎的增大及腎功能之進行性損失。
「多囊腎病之標記」意謂用於評定多囊腎病之嚴重性、腎功能及/或患有多囊腎病之受試者對治療之反應的醫學參數。多囊腎病之標記之非限制性實例包括總腎體積、高血壓、腎絲球濾過率及腎疼痛。
「腎功能之標記」意謂用於評定受試者之腎功能的醫學參數。腎功能之標記之非限制性實例包括腎絲球濾過率、血尿素氮含量及血清肌酸酐含量。
「常染色體顯性多囊腎病」或「ADPKD」為由PKD1及/或PKD2基因中之一或多個基因突變引起的多囊腎病。85%的ADPKD由位於第16號染色體上之PKD1突變引起，大部分剩餘的ADPKD病例由位於第4號染色體上之PKD2突變引起。
「常染色體隱性多囊腎病」或「ARPKD」為由位於第6號染色體上之PKHD1基因中之一或多個基因突變引起的多囊腎病。多達50%的患有ARPKD之新生兒死於子宮內腎病之併發症，且約三分之一的倖存者在10年內發展成末期腎病(ESRD)。
「腎消耗病(Nephronophthisis)」或「NPHP」意謂特徵在於皮質髓質囊腫、管狀基底膜破裂及小管間質性腎病之常染色體隱性囊性腎病。
「總腎體積」或「TKV」為總腎體積之量測。總腎體積可藉由磁共振成像(MRI)、計算機斷層攝影術(CT)掃描或超音(US)成像來判定，且體積可藉由標準方法諸如橢球體體積方程(用於超音)或藉由定量體視學或邊界追蹤(用於CT/MRI)來計算。
「高度調整之總腎體積」或「HtTKV」為每單位高度的總腎體積之量度。HtTKV值
Figure 106142317-A0202-12-0007-47
600ml/m之患者預計在8年內發展成3期慢性腎病。
「腎疼痛」意謂需要醫療休假、藥理治療(麻醉劑或最後手段止痛劑)或侵入性干預的臨床上顯著之腎疼痛。
「高血壓惡化」意謂需要開始或增加高血壓治療之血壓變化。
「纖維化」意謂在器官或組織中形成或發展過量纖維結締組織。在某些實施例中，纖維化作為修復或反應性過程出現。在某些實施例中，纖維化回應於損害或損傷而出現。術語「纖維化」應理解為在器官或組織中作為修復或反應性過程形成或發展過量的纖維結締組織，而非形成纖維組織作為器官或組織的正常組分。
「血尿」意謂在尿中存在紅血球。
「白蛋白尿」意謂在尿中存在過量白蛋白，且包括(但不限於)正常量白蛋白尿、高正常量白蛋白尿、微量白蛋白尿及大量白蛋白尿。通常，由足狀突細胞、腎絲球基底膜及內皮細胞構成之腎絲球過濾滲透性障壁阻止血清蛋白質漏入尿中。白蛋白尿可反映腎絲球濾過滲透性障壁之損傷。白蛋白尿可由24小時尿樣品、隔夜尿樣品或點尿樣品計算。
「高正常量白蛋白尿」意謂特徵在於以下之白蛋白尿升高：(i)每24小時有15至<30mg白蛋白排出至尿中及/或(ii)雄性中白蛋白/肌酸酐比率為1.25至<2.5mg/mmol(或10至<20mg/g)或雌性中白蛋白/肌酸酐比率為1.75至<3.5mg/mmol(或15至<30mg/g)。
「微量白蛋白尿」意謂特徵在於以下之白蛋白尿升高：(i)每24小時有30至300mg白蛋白排出至尿中及/或(ii)雄性中白蛋白/肌酸酐比率為2.5至<25mg/mmol(或20至<200mg/g)或雌性中白蛋白/肌酸酐比率為3.5至<35mg/mmol(或30至<300mg/g)。
「大量白蛋白尿」意謂特徵在於以下之白蛋白尿升高：(i)每24小時有多於300mg白蛋白排出至尿中及/或(ii)雄性中白蛋白/肌酸酐比率為>25mg/mmol(或>200mg/g)或雌性中白蛋白/肌酸酐比率為>35mg/mmol(或>300mg/g)。
「白蛋白/肌酸酐比率」意謂每單位濃度尿肌酸酐(g/dL)對應之尿白蛋白(mg/dL)的比率且表示為mg/g。在某些實施例中，白蛋白/肌酸酐比率可由點尿樣品計算且可用作對歷經24小時時期之白蛋白排出之估計。
「腎絲球濾過率」或「GFR」意謂透過腎之濾過流體之流速，且用作受試者腎功能之指標。在某些實施例中，受試者之GFR藉由計算經估計之腎絲球濾過率來判定。在某些實施例中，受試者之GFR係使用菊糖法在受試者中直接量測。
「經估計之腎絲球濾過率」或「eGFR」意謂腎濾過肌酸酐之程度的量測，且用於粗略估計腎絲球濾過率。因為GFR之直接量測為複雜的，在臨床實踐中經常使用eGFR。正常結果之範圍可為90至120mL/min/1.73m2。低於60mL/min/1.73m2之位準達3或更多個月可為慢性腎病之指標。低於15mL/min/1.73m2之位準可為腎衰竭之指標。
「蛋白尿」意謂過量血清蛋白質在尿中之存在。蛋白尿之特徵可在於每24小時有>250mg蛋白質排出至尿中及/或尿蛋白質與肌酸酐之比率為
Figure 106142317-A0202-12-0009-48
0.20mg/mg。與蛋白尿相關升高之血清蛋白質包括(但不限於)白蛋白。
「血尿素氮含量」或「BUN含量」意謂血液中呈尿素形式之氮之量的量度。肝在尿素循環中產生尿素作為蛋白質消化之廢棄產物，且尿素由腎自血液移除。正常人類成人血液可含有每100ml血液介於7至21mg(7-21mg/dL)之間的尿素氮。血尿素氮含量之量測用作腎健康之指標。若腎不能自血液正常移除尿素，則受試者之BUN含量升高。
「升高的」意謂視為臨床相關的醫學參數之增加。健康專業人員可判定增加是否為臨床上顯著的。
「末期腎病(ESRD)」意謂腎功能完全或幾乎完全衰竭。
「生活品質」意謂受試者身體、心理及社會功能受疾病及/或疾病治療損害之程度。患有多囊腎病之受試者之生活品質可降低。
「腎功能受損」意謂腎功能相對於正常腎功能降低。
「減緩......之惡化」及「減緩惡化」意謂降低醫學病狀向晚期狀況發展之速率。
「延遲透析時間」意謂維持足夠腎功能以使對透析治療之需要得以延遲。
「延遲腎移植時間」意謂維持足夠腎功能以使對腎移植之需要得以延遲。
「提高預期壽命」意謂藉由治療受試者之疾病之一或多種症狀來使受試者壽命延長。
「受試者」意謂選用於治療或療法之人類或非人類動物。
「有需要之受試者」意謂被鑒別為需要療法或治療之受試者。
「懷疑患有......之受試者」意謂展現疾病之一或多種臨床指標的受試者。
「與miR-17相關之疾病」意謂由一或多個miR-17家族成員之活性調節之疾病或病狀。
「投與」意謂向受試者提供藥劑或組成物，且包括(但不限於)由醫學專業人員投與及自投與。
「非經腸投與」意謂透過注射或輸注投與。
非經腸投與包括(但不限於)皮下投與、靜脈內投與及肌肉內投與。
「皮下投與」意謂僅在皮膚以下投與。
「靜脈內投與」意謂投與至靜脈內。
「伴隨投與」係指兩種或兩種以上藥劑以其兩者之藥理學作用在患者體內同時表現之任何方式共同投與。伴隨性投與不需要兩種藥劑於單一醫藥組成物中、以相同劑型或藉由相同投與途徑投與。兩種藥劑之作用本身無需同時顯現。該等作用僅需重疊一定時期而無需共同延長。
「持續時間」意謂活性或事件持續之時期。在某些實施例中，治療之持續時間為投與藥劑或醫藥組成物之劑量的時期。
「療法」意謂疾病治療方法。在某些實施例中，療法包括但不限於向患有疾病之受試者投與一或多種醫藥藥劑。
「治療」意謂應用一或多種用於改善疾病之至少一個指標之特定程序。在某些實施例中，特定程序為投與一或多種藥劑。在某些實施例中，PKD之治療包括但不限於降低總腎體積、改善腎功能、降低高血壓及/或減輕腎疼痛。
「改善」意謂減輕病狀或疾病之至少一種指標的嚴重性。在某些實施例中，改善包括延遲或減緩病狀或疾病之一或多種指標的進展。指標之嚴重性可藉由熟習此項技術者已知之主觀或客觀量度來判定。
「處於發展......之風險中」意謂受試者易於發展病狀或疾病之狀態。在某些實施例中，處於發展病狀或疾病之風險中的受試者展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但並不展現足以診斷為患有該病狀或疾病之數目的症狀。在某些實施例中，處於發展病狀或疾病之風險中的受試者展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但程度輕於診斷為患有該病狀或疾病所需之程度。
「預防......發作」意謂預防處於發展疾病或病狀之風險中的受試者發展該病狀或疾病。在某些實施例中，處於發展疾病或病狀之風險中的受試者接受與已患該疾病或病狀之受試者所接受之治療類似的治療。
「延遲......發作」意謂延遲處於發展疾病或病狀之風險中的受試者發展該病狀或疾病。在某些實施例中，處於發展疾病或病狀之風險中的受試者接受與已患該疾病或病狀之受試者所接受之治療類似的治療。
「劑量」意謂單次投與中所提供之藥劑之指定量。在某些實施例中，可以兩次或兩次以上推注(bolus)、錠劑或注射投與劑量。舉例而言，在某些實施例中，在需要皮下投與時，所要劑量需要不易由單次注射提供之體積。在此類實施例中，可使用兩次或兩次以上注射來達成所要劑量。在某些實施例中，可以兩次或兩次以上注射投與劑量以使個體之注射部位反應減至最小。在某些實施例中，劑量係以緩慢輸注形式投與。
「劑量單位」意謂提供藥劑時所採用之形式。在某些實施例中，劑量單位為容納凍乾寡核苷酸之小瓶。在某些實施例中，劑量單位為容納復原寡核苷酸之小瓶。
「治療有效量」係指藥劑向動物提供治療效益之量。
「醫藥組成物」意謂包括藥劑的適於投與個體之物質之混合物。舉例而言，醫藥組成物可包含無菌水溶液。
「藥劑」意謂在向受試者投與時提供治療作用之物質。
「活性醫藥成分」意謂醫藥組成物中提供所要作用之物質。
「醫藥學上可接受之鹽」意謂本文提供之化合物之生理學上及醫藥學上可接受之鹽，亦即保留化合物之所要生物活性且在向受試者投與時不具不合需要之毒理學作用的鹽。本文提供之化合物之非限制性示範性醫藥學上可接受之鹽包括鈉及鉀鹽形式。除非另外特別指示，否則如本文中所使用之術語「化合物」、「寡核苷酸」及「經修飾寡核苷酸」包括其醫藥學上可接受之鹽。
「鹽水溶液」意謂氯化鈉於水中之溶液。
「器官功能改善」意謂器官功能朝向正常限度變化。在某些實施例中，藉由量測受試者血液或尿液中存在之分子來評定器官功能。舉例而言，在某些實施例中，腎功能改善係藉由血尿素氮含量減少、蛋白尿降低、白蛋白尿降低等加以量測。
「可接受之安全性概況」意謂臨床上可接受之限度內的副作用模式。
「副作用」意謂除所要作用以外的歸因於治療之生理反應。在某些實施例中，副作用包括(但不限於)注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝中毒、腎中毒、中樞神經系統異常及肌病。該等副作用可直接或間接偵測。舉例而言，血清中之轉胺酶含量升高可指示肝中毒或肝功能異常。舉例而言，膽紅素增加可指示肝中毒或肝功能異常。
如本文中所使用之術語「血液」涵蓋全血及血液部分，諸如血清及血漿。
「抗miR」意謂具有與微小RNA互補之核苷鹼基序列的寡核苷酸。在某些實施例中，抗miR為經修飾寡核苷酸。
「抗miR-17」意謂具有與一或多個miR-17家族成員互補之核苷鹼基序列的經修飾寡核苷酸。在某些實施例中，抗miR-17與一或多個miR-17家族成員完全互補(亦即，100%互補)。在某些實施例中，抗miR-17與一或多個miR-17家族成員至少80%、至少85%、至少90%或至少95%互補。
「miR-17」意謂具有核苷鹼基序列5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’(SEQ ID NO：1)之成熟miRNA。
「miR-20a」意謂具有核苷鹼基序列5’-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3’(SEQ ID NO：2)之成熟miRNA。
「miR-20b」意謂具有核苷鹼基序列5’-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3’(SEQ ID NO：3)之成熟miRNA。
「miR-93」意謂具有核苷鹼基序列5’-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3’(SEQ ID NO：4)之成熟miRNA。
「miR-106a」意謂具有核苷鹼基序列5’-AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’(SEQ ID NO：5)之成熟miRNA。
「miR-106b」意謂具有核苷鹼基序列5’-UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU-3’(SEQ ID NO：6)之成熟miRNA。
「miR-17種子序列」意謂存在於各miR-17家族成員中之核苷鹼基序列5’-AAAGUG-3’。
「miR-17家族成員」意謂具有包含miR-17種子序列之核苷鹼基序列且選自miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a及miR-106b之成熟miRNA。
「miR-17家族」意謂各自具有包含miR-17種子序列之核苷鹼基序列的以下群組之miRNA：miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a及miR-106b。
「目標核酸」意謂寡聚化合物設計用來雜交之核酸。
「定標」意謂設計及選擇將與目標核酸雜交之核苷鹼基序列的過程。
「靶向」意謂具有允許與目標核酸雜交之核苷鹼基序列。
「調節」意謂擾動功能、量或活性。在某些實施例中，調節意謂功能、量或活性增加。在某些實施例中，調節意謂功能、量或活性降低。
「表現」意謂基因所編碼之資訊藉以轉化為細胞中存在及運轉之結構的任何功能及步驟。
「核苷鹼基序列」意謂寡聚化合物或核酸中連續核苷鹼基之次序，通常按5’至3’取向列出，且與任何糖、鍵聯及/或核苷鹼基修飾無關。
「連續核苷鹼基」意謂核酸中彼此緊鄰之核苷鹼基。
「核苷鹼基互補性」意謂兩個核苷鹼基經由氫鍵結非共價配對之能力。
「互補」意謂一個核酸能夠與另一核酸或寡核苷酸雜交。在某些實施例中，互補係指寡核苷酸能夠與目標核酸雜交。
「完全互補」意謂寡核苷酸之各核苷鹼基皆能夠與目標核酸中各相應位置處之核苷鹼基配對。在某些實施例中，寡核苷酸與微小RNA完全互補(亦稱為100%互補)，亦即寡核苷酸之各核苷鹼基與微小RNA中相應位置處之核苷鹼基互補。經修飾寡核苷酸可與微小RNA完全互補，且具有許多小於微小RNA長度的鍵聯之核苷。舉例而言，寡核苷酸之各核苷鹼基與微小RNA中相應位置處之核苷鹼基互補的具有16個連接之核苷的寡核苷酸與微小RNA完全互補。在某些實施例中，各核苷鹼基與微小RNA莖-環序列之區內之核苷鹼基皆具有互補性之寡核苷酸與該微小RNA莖-環序列完全互補。
「互補性百分比」意謂寡核苷酸中與目標核酸之等長部分互補之核苷鹼基的百分率。互補性百分比藉由將寡核苷酸中與目標核酸中相應位置處之核苷鹼基互補之核苷鹼基的數目除以寡核苷酸中核苷鹼基之總數來計算。
「一致性百分比」意謂第一核酸中與第二核酸中相應位置處之核苷鹼基一致之核苷鹼基的數目除以第一核酸中核苷鹼基之總數。在某些實施例中，第一核酸為微小RNA且第二核酸為微小RNA。在某些實施例中，第一核酸為寡核苷酸且第二核酸為寡核苷酸。
「雜交」意謂透過核苷鹼基互補性發生之互補核酸之退火。
「失配」意謂第一核酸中之核苷鹼基不能與第二核酸中相應位置處之核苷鹼基進行沃森-克里克(Watson-Crick)配對。
「一致」在核苷鹼基序列之情況下意謂具有相同核苷鹼基序列，而與糖、鍵聯及/或核苷鹼基修飾無關且與所存在之任何嘧啶之甲基化狀態無關。
「微小RNA」意謂長度在18與25個核苷鹼基之間的內源性非編碼RNA，其為由酶Dicer裂解微小RNA前體之產物。成熟微小RNA之實例可見於稱為miRBase之微小RNA資料庫中(microrna.sanger.ac.uk/)。在某些實施例中，微小RNA縮寫為「miR」。
「微小RNA調控之轉錄物」意謂受微小RNA調控之轉錄物。
「種子匹配序列」意謂與種子序列互補並且長度與種子序列相同的核苷鹼基序列。
「寡聚化合物」意謂包含複數個鍵聯之單體次單元的化合物。寡聚化合物包括寡核苷酸。
「寡核苷酸」意謂包含複數個各自可彼此獨立地經修飾或未經修飾的鍵聯之核苷的化合物。
「天然存在之核苷間鍵」意謂核苷之間的3’至5’磷酸二酯鍵。
「天然糖」意謂DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中存在之糖。
「核苷間鍵聯」意謂相鄰核苷之間的共價鍵聯。
「鍵聯之核苷」意謂由共價鍵連接之核苷。
「核苷鹼基」意謂能夠與另一核苷鹼基非共價配對之雜環部分。
「核苷」意謂鍵聯至糖部分之核苷鹼基。
「核苷酸」意謂具有共價鍵聯至核苷之糖部分之磷酸酯基的核苷。
「包含由多個鍵聯之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物」意謂包括具有指定數目之鍵聯之核苷之經修飾寡核苷酸的化合物。因此，該化合物可包括另外取代基或結合物。除非另外指示，否則該經修飾寡核苷酸未與互補鏈雜交且該化合物不包括除經修飾寡核苷酸之彼等核苷以外的任何另外核苷。
「經修飾寡核苷酸」意謂相對於天然存在之末端、糖、核苷鹼基及/或核苷間鍵聯具有一或多個修飾之單鏈寡核苷酸。經修飾寡核苷酸可包含未經修飾核苷。
「經修飾核苷」意謂與天然存在之核苷相比具有任何變化之核苷。經修飾核苷可具有經修飾之糖及未經修飾核苷鹼基。經修飾核苷可具有經修飾之糖及經修飾核苷鹼基。經修飾核苷可具有天然糖及經修飾核苷鹼基。在某些實施例中，經修飾核苷為雙環核苷。在某些實施例中，經修飾核苷為非雙環核苷。
「經修飾核苷間鍵聯」意謂與天然存在之核苷間鍵聯相比存在任何變化。
「硫代磷酸酯核苷間鍵聯」意謂核苷間一個非橋連原子為硫原子之鍵聯。
「經修飾之糖部分」意謂與天然糖相比之取代及/或任何變化。
「未經修飾核苷鹼基」意謂RNA或DNA的天然存在之雜環鹼基：嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)及尿嘧啶(U)。
「5-甲基胞嘧啶」意謂包含連接於5位置之甲基的胞嘧啶。
「非甲基化胞嘧啶」意謂不具有連接於5位置之甲基的胞嘧啶。
「經修飾核苷鹼基」意謂不為未經修飾核苷鹼基的任何核苷鹼基。
「糖部分」意謂天然存在之呋喃醣基或經修飾之糖部分。
「經修飾之糖部分」意謂經取代之糖部分或糖替代物。
「2’-O-甲基糖」或「2’-OMe糖」意謂在2’位置處具有O-甲基修飾之糖。
「2'-O-甲氧基乙基糖」或「2'-MOE糖」意謂在2'位置處具有O-甲氧基乙基修飾之糖。
「2’-氟」或「2'-F」意謂在2'位置處具有氟修飾之糖。
「雙環糖部分」意謂包含4至7員環之經修飾糖部分(包括(但不限於)呋喃醣基)，其包含連接該4至7員環之兩個原子之橋鍵以形成第二環，從而產生雙環結構。在某些實施例中，4至7員環為糖環。在某些實施例中，4至7員環為呋喃醣基。在某些此類實施例中，橋鍵連接呋喃醣基之2'碳與4'碳。非限制性示範性雙環糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt及R-cEt。
「鎖核酸(LNA)糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含(CH2)-O橋的經取代之糖部分。
「ENA糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含(CH2)2-O橋的經取代之糖部分。
「限制性乙基(cEt)糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含CH(CH3)-O橋的經取代之糖部分。在某些實施例中，CH(CH3)-O橋限制呈S型取向。在某些實施例中，CH(CH3)-O限制呈R型取向。
「S-cEt糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含S型限制性CH(CH3)-O橋的經取代之糖部分。
「R-cEt糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含R型限制性CH(CH3)-O橋的經取代之糖部分。
「2'-O-甲基核苷」意謂具有2'-O-甲基糖修飾之2'位上經修飾核苷。
「2'-O-甲氧基乙基核苷」意謂具有2'-O-甲氧基乙基糖修飾之2'位上經修飾核苷。2'-O-甲氧基乙基核苷可包含經修飾或未經修飾核苷鹼基。
「2'-氟核苷」意謂具有2'-氟糖修飾之2'位上經修飾核苷。2'-氟核苷可包含經修飾或未經修飾核苷鹼基。
「雙環核苷」意謂具有雙環糖部分的2'位上經修飾核苷。雙環核苷可具有經修飾或未經修飾核苷鹼基。
「cEt核苷」意謂包含cEt糖部分之核苷。cEt核苷可包含經修飾或未經修飾核苷鹼基。
「S-cEt核苷」意謂包含S-cEt糖部分之核苷。
「R-cEt核苷」意謂包含R-cEt糖部分之核苷。
「β-D-去氧核糖核苷」意謂天然存在之DNA核苷。
「β-D-核糖核苷」意謂天然存在之RNA核苷。
「LNA核苷」意謂包含LNA糖部分之核苷。
「ENA核苷」意謂包含ENA糖部分之核苷。
概述
多囊腎病(PKD)為遺傳形式的腎疾病，其中填充液體之囊腫在腎中發展，造成腎功能不全且常常導致末期腎病。某些PKD之特徵亦在於腎增大。囊腫之過度增生為PKD之標誌性病理特徵。在PKD之管理中，治療之主要目標為管理諸如高血壓及感染之症狀、維持腎功能及預防末期腎病(ESRD)之發作，這轉而增加PKD受試者之預期壽命。
微小RNA之miR-17至92簇之miR-17家族成員在PKD小鼠模型中上調。PKD小鼠模型中miR-17至92簇之基因缺失減慢腎囊腫生長、改善腎功能且延長存活(Patel等，PNAS,2013；110(26)：10765-10770)。已經顯示用研究工具化合物抑制miR-17在PKD實驗模型中減小腎與體重比率且改善腎功能。此外，miR-17抑制亦遏制來源於人類供體囊腫之原代培養物之增生及囊腫生長。
為了鑒別足夠有效、安全且方便向PKD受試者投與的一或多個miR-17家族成員之抑制劑，設計包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列的約200個經修飾寡核苷酸，其具有變化的長度及化學組成。化合物之長度的範 圍為9至20個連接之核苷，且化合物之化學修飾的數目、類型及位置有所不同。因為藥理學、藥物動力學行為及安全性不能簡單地基於化合物的化學結構來預測，所以在一系列經設計以消除具有不利特性之化合物的檢定中在活體外及活體內評估化合物之特徵，包括效力、功效、藥物動力學行為、安全性及代謝穩定性。如本文所述，在若干活體外檢定(例如效力、毒理學、代謝穩定性)中首先測試將經200種化合物中之每一者，以鑒別適用於在更複雜的活體內檢定(例如藥物動力學概況、功效、毒理學)中進一步測試之較小組的化合物。此篩選過程鑒別用於治療PKD之候選藥劑。
本發明之某些化合物
本文提供包含由9個連接之核苷組成的經修飾寡核苷酸的化合物，其中該經修飾寡核苷酸在5’至3’取向上具有以下核苷模式：NSNSNMNFNFNFNMNSNS其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷；且其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列包含核苷鹼基序列5’-CACUUU-3’，其中各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶；或其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列為5’-AGCACUUUG-3’，其中各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。在一些實施例中，各鍵獨立地選自磷酸二酯鍵及硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵。
本文提供結構ASGSCMAFCFUFUMUSGS之化合物，其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶；或其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。在一些實施例 中，各鍵獨立地選自磷酸二酯鍵及硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵。
本文提供結構ASGSCMAFCFUFUMUSGS之化合物，其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶；或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，各鍵獨立地選自磷酸二酯鍵及硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵。
本文提供包含由9個連接之核苷組成的經修飾寡核苷酸的化合物，其中該經修飾寡核苷酸在5’至3’取向上具有以下核苷模式：NSNSNMNFNFNFNMNSNS其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷，且所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵；且其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列包含核苷鹼基序列5’-CACUUU-3’，其中各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶；或其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列為5’-AGCACUUUG-3’，其中各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。
本文提供結構ASGSCMAFCFUFUMUSGS之化合物，其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶，且所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵；或其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。
本文提供結構ASGSCMAFCFUFUMUSGS之化合物，其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」 之核苷為S-cEt核苷，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶，且所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵；或其醫藥學上可接受之鹽。
本文提供一種名為RG4326之經修飾寡核苷酸，其中經修飾寡核苷酸之結構為：
Figure 106142317-A0202-12-0022-4
。本文亦提供經修飾寡核苷酸 RG4326之醫藥學上可接受之鹽。因此，在一些實施例中，經修飾寡核苷酸具有以下結構：
Figure 106142317-A0202-12-0023-5
或其醫藥學上可接受之鹽。 RG4326之非限制性示範性醫藥學上可接受之鹽具有以下結構：
Figure 106142317-A0202-12-0024-6
在一些實施例中，與每分子存在的硫代磷酸酯及/或磷酸二酯鍵相比(亦即，一些硫代磷酸酯及/或磷酸二酯鍵為質子化的)，經修飾寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽包含較少陽離子相對離子(諸如Na+)。在一些實施例中，RG4326之醫藥學上可接受之鹽每分子RG4326包含少於8個陽離子相對離子(諸如Na+)。即，在一些實施例中，RG4326之醫藥學上可接受之鹽每分子RG4326平均上可包含1、2、3、4、5、6或7個陽離子相對離子，其餘的硫代磷酸酯基團為質子化的。
本發明之某些用途
本文提供用於抑制細胞中miR-17家族之一或多個成員之活性的方法，該方法包含使細胞與本文提供之化合物接觸，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。
本文提供用於抑制受試者中miR-17家族之一或多個成員之活性的方法，該方法包含向該受試者投與本文提供之醫藥組成物。在某些實施例中，受試者患有與miR-17家族之一或多個成員相關之疾病。
本文提供用於治療多囊腎病(PKD)之方法，該方法包含向有需要之受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。在某些實施例中，受試者患有多囊腎病。在某些實施例中，多囊腎病係選自常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)、常染色體隱性多囊腎病(ARPKD)及腎消耗病(NPHP)。在某些實施例中，多囊腎病係選自常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)及常染色體隱性多囊腎病(ARPKD)。
在某些實施例中，受試者患有特徵為多個非腎指標且特徵亦為多囊腎病之病症。此類病症包括例如朱伯特症候群及相關病症(JSRD)、梅克爾症候群(MKS)或巴德-畢德症候群(BBS)。因此，本文提供用於治療多囊腎病(PKD)之方法，該方法包含向受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列，其中該受試者患有朱伯特症候群及相關病症(JSRD)、梅克爾症候群(MKS)或巴德-畢德症候群(BBS)。本文提供用於治療多囊腎病(PKD)之方法，該方法包含投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列，其中該受試者懷疑患有朱伯特症候群及相關病症(JSRD)、梅克爾症候群(MKS)或巴德-畢德症候群(BBS)。
在某些實施例中，多囊腎病為常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)。ADPKD係由PKD1或PKD2基因突變引起。ADPKD為進行性疾病，在該進行 性疾病中，囊腫形成及腎增大造成腎功能不全，且最終在50%患者到60歲時導致末期腎病。ADPKD患者可能需要終身透析及/或腎移植。ADPKD為腎衰竭之最常見的遺傳原因。囊腫之過度增生為ADPKD之標誌性病理特徵。在PKD之管理中，治療之主要目標為維持腎功能及預防末期腎病(ESRD)之發作，這轉而增加PKD受試者之預期壽命。ADPKD患者之總腎體積通常逐步增加，此等增加與腎功能下降有關。本文提供用於治療ADPKD之方法，該方法包括向患有或懷疑患有ADPKD之受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，多囊腎病為常染色體隱性多囊腎病(ARPKD)。ARPKD係由PKHD1基因突變引起，且為兒童慢性腎病之原因。ARPKD之典型腎表型為腎增大；然而，ARPKD對其他器官(特別是肝)具有顯著影響。ARPKD患者進展為末期腎病，且需要在年僅15歲時進行腎移植。本文提供用於治療ARPKD之方法，該方法包括向患有或懷疑患有ARPKD之受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，多囊腎病為腎消耗病(NPHP)。腎消耗病為常染色體隱性囊性腎病，其為兒童中ESRD之常見原因。NPHP之特徵為腎尺寸正常或減小、囊腫集中於皮質髓質接合部、及腎小管間質纖維化。已經在NPHP患者中鑒別了若干NPHP基因之一(例如NPHP1)的突變。本文提供用於治療NPHP之方法，該方法包括向患有或懷疑患有NPHP之受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，患有多囊腎病之受試者患有朱伯特症候群及相關病症(JSRD)。JSRD包括寬範圍的標誌性特徵，包括腦、視網膜及骨骼異常。某些患有JSRD之受試者除具有JSRD之標誌性特徵之外，亦患有多囊腎病。因此，本文提供用於治療患有JSRD之受試者的多囊腎病之方法，該方法包含向患有 JSRD之受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。在某些實施例中，受試者懷疑患有JSRD。
在某些實施例中，患有多囊腎病之受試者患有梅克爾症候群(MKS)。MKS為在身體之許多部位(包括中樞神經系統、骨骼系統、肝、腎及心臟)具有嚴重體征及症狀之病症。MKS之共同特徵為數個液體填充之囊腫在腎中之存在及腎增大。因此，本文提供用於治療MKS之方法，該方法包括向患有MKS之受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。在某些實施例中，受試者懷疑患有MKS。
在某些實施例中，患有多囊腎病之受試者患有巴德-畢德症候群(BBS)。BBS為影響身體之許多部位(包括眼睛、心臟、腎、肝及消化系統)之病症。BBS之標誌性特徵為腎囊腫之存在。因此，本文提供用於治療患有BBS之受試者的多囊腎病之方法，該方法包含向患有BBS之受試者投與本文提供之化合物，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。在某些實施例中，受試者懷疑患有BBS。
在某些實施例中，受試者在投與包含經修飾寡核苷酸之化合物之前已診斷為患有PKD。PKD之診斷可藉由評估包括(但不限於)以下之參數達成：受試者之家族史、臨床特徵(包括(但不限於)高血壓、白蛋白尿、血尿及GFR受損)、腎成像研究(包括(但不限於)MRI、超音波及CT掃描)及/或組織學分析。
在某些實施例中，PKD之診斷包括篩選PKD1或PKD2基因中之一或多者之突變。在某些實施例中，ARPKD之診斷包括篩選PKHP1基因之突變。在某些實施例中，NPHP之診斷包括篩選NPHP1、NPHP2、NPHP3、NPHP4、NPHP5、NPHP6、NPHP7、NPHP8或NPHP9基因中之一或多者的一或多個突變。在某些實施例中，JSRD之診斷包括篩選NPHP1、NPHP6、AHI1、MKS3或RPGRIP1L基因之突變。在某些實施例中，MKS之診斷包括篩選NPHP6、 MKS3、RPGRIP1L、NPHP3、CC2D2A、BBS2、BBS4、BBS6或MKS1基因之突變。在某些實施例中，BBS之診斷包括篩選BBS2、BBS4、BBS6、MKS1、BBS1、BBS3、BBS5、BBS7、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS11或BBS12基因之突變。
在某些實施例中，受試者之總腎體積增加。在某些實施例中，總腎體積為高度調整之總腎體積(HtTKV)。在某些實施例中，受試者患有高血壓。在某些實施例中，受試者具有腎功能受損。在某些實施例中，受試者需要腎功能改善。在某些實施例中，受試者係鑒別為腎功能受損。
在某些實施例中，患有PKD之受試者之腎中的一或多個miR-17家族成員之含量增加。在某些實施例中，在投與之前，判定受試者腎中一或多個miR-17家族成員之含量增加。miR-17家族成員之含量可由腎生檢材料來量測。在某些實施例中，在投與之前，判定受試者在受試者之尿或血液中的一或多個miR-17家族成員之含量增加。
在本文提供之任何實施例中，受試者可經歷某些測試以診斷受試者之多囊腎病，例如以判定多囊腎病之原因、評估受試者之多囊腎病之程度及/或判定受試者對治療之反應。此類測試可評定多囊腎病之標誌。某些此等測試(諸如腎絲球濾過率及血尿素氮含量)亦為腎功能之指標。多囊疾病之標誌包括(但不限於)：受試者之總腎體積之量測；受試者之高血壓之量測；受試者之腎疼痛之評定；受試者之纖維化之量測；受試者之血尿素氮含量之量測；受試者之血清肌酸酐含量之量測；量測受試者之肌酸酐清除率；量測受試者之白蛋白尿；量測受試者之白蛋白：肌酸酐比率；量測受試者之腎絲球濾過率；量測受試者之血尿；受試者尿中之NGAL蛋白之量測；及/或受試者尿中KIM-1蛋白之量測。除非本文中另外指示，否則血尿素氮含量、血清肌酸酐含量、肌酸酐清除率、白 蛋白尿、白蛋白：肌酸酐比率、腎絲球濾過率及血尿係指受試者血液(諸如全血或血清)中之量測。
多囊腎病之標誌係藉由實驗室測試來判定。個別標誌之參考範圍可因實驗室而異。該變化可能是由於例如所使用之具體檢定中之差異。因此，群體內標誌之正常分佈之上限及下限(亦稱為正常上限(ULN)及正常下限(LLN))可因實驗室而異。對於任何特定的標誌，健康專業人員可判定在正常分佈之外的哪些含量為臨床相關的及/或疾病之指示。舉例而言，健康專業人員可判定腎絲球濾過率，該腎絲球濾過率可指示患有多囊腎病之受試者之腎功能速率下降。
在某些實施例中，本文提供之化合物之投與造成一或多種臨床有益的結果。在某些實施例中，投與改善受試者之腎功能。在某些實施例中，投與減緩受試者之腎功能之下降速率。在某些實施例中，投與降低受試者之總腎體積。在某些實施例中，投與減緩受試者之總腎體積之增加速率。在某些實施例中，投與減小高度調整之總腎體積(HtTKV)。在某些實施例中，投與減緩HtTKV之增加速率。
在某些實施例中，投與抑制受試者之囊腫生長。在某些實施例中，投與減緩受試者之囊腫生長的增加速率。在一些實施例中，囊腫存在於受試者之腎中。在一些實施例中，囊腫存在於除腎以外的器官(例如肝)中。
在某些實施例中，投與減輕受試者之腎疼痛。在某些實施例中，投與減緩受試者之腎疼痛的增強。在某些實施例中，投與延遲受試者之腎疼痛的發作。
在某些實施例中，投與減輕受試者之高血壓。在某些實施例中，投與減緩受試者之高血壓的惡化。在某些實施例中，投與延遲受試者之高血壓的發作。
在某些實施例中，投與減輕受試者之腎纖維化。在某些實施例中，投與減緩受試者之腎的纖維化的惡化。
在某些實施例中，投與延遲受試者之末期腎病之發作。在某些實施例中，投與延遲受試者至透析之時間。在某些實施例中，投與延遲受試者至腎移植之時間。在某些實施例中，投與延長受試者之預期壽命。
在某些實施例中，投與減輕受試者之白蛋白尿。在某些實施例中，投與減緩受試者之白蛋白尿之惡化。在某些實施例中，投與延遲患者之白蛋白尿之發作。在某些實施例中，投與減輕受試者之血尿。在某些實施例中，投與減緩受試者之血尿之惡化。在某些實施例中，投與延遲受試者之血尿之發作。在某些實施例中，投與降低受試者之血尿素氮含量。在某些實施例中，投與降低受試者之血清肌酸酐含量。在某些實施例中，投與改善受試者之肌酸酐清除率。在某些實施例中，投與降低受試者之白蛋白：肌酸酐比率。
在某些實施例中，投與改善受試者之腎絲球濾過率。在某些實施例中，投與減緩受試者之腎絲球濾過率之下降速率。在某些實施例中，腎絲球濾過率為經估計之腎絲球濾過率(eGFR)。在某些實施例中，腎絲球濾過率為經量測之腎絲球濾過率(mGFR)。
在某些實施例中，投與減少受試者尿中之嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)蛋白質。在某些實施例中，投與減少受試者尿中之腎損傷分子1(KIM-1)蛋白質。
在本文提供之任何實施例中，受試者可經歷某些測試以評估受試者之疾病程度。此類測試包括(但不限於)受試者之總腎體積之量測；受試者之高血壓之量測；受試者之腎疼痛之量測；受試者之腎纖維化之量測；受試者之血尿素氮含量之量測；量測受試者之血清肌酸酐含量；量測受試者血液之肌酸酐清除率；量測受試者之白蛋白尿；量測受試者之白蛋白：肌酸酐比率；量測受試者 之腎絲球濾過率，其中估計或量測腎絲球濾過率；受試者尿中之嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)蛋白質之量測；及/或受試者尿中之腎損傷分子1(KIM-1)蛋白質之量測。
在某些實施例中，患有多囊腎病之受試者經歷生活品質的降低。舉例而言，患有多囊腎病之受試者可能經歷腎疼痛，這可降低受試者之生活品質。在某些實施例中，投與改善受試者之生活品質。
在本文提供之任何實施例中，受試者為人類受試者。在某些實施例中，人類受試者為成人。在某些實施例中，成人為至少21歲。在某些實施例中，人類受試者為兒科受試者，亦即受試者小於21歲。兒科群體可由監管機構來定義。在某些實施例中，人類受試者為青少年。在某些實施例中，青少年為至少12歲且小於21歲。在某些實施例中，人類受試者為兒童。在某些實施例中，兒童為至少兩歲且小於12歲。在某些實施例中，人類受試者為嬰兒。在某些實施例中，且嬰兒為至少一個月且小於兩歲。在某些實施例中，受試者為新生兒。在某些實施例中，新生兒小於一個月。
本文所述之任何化合物皆可用於療法中。本文提供之任何化合物皆可用於治療多囊腎病。在某些實施例中，多囊腎病為常染色體顯性多囊腎病。在某些實施例中，多囊腎病為常染色體隱性多囊腎病。在某些實施例中，多囊腎病為腎消耗病。在某些實施例中，受試者患有朱伯特症候群及相關病症(JSRD)、梅克爾症候群(MKS)或巴德-畢德症候群(BBS)。
本文所述之任何經修飾寡核苷酸皆可用於療法中。本文提供之任何經修飾寡核苷酸皆可用於治療多囊腎病。
本文提供之任何化合物皆可用於製備藥物。本文提供之任何化合物皆可用於製備用於治療多囊腎病之藥物。
本文提供之任何經修飾寡核苷酸皆可用於製備藥物。本文提供之任何經修飾寡核苷酸可用於製備用於治療多囊腎病之藥物。
本文提供之任何醫藥組成物皆可用於治療多囊腎病。
某些另外的療法
用於多囊腎病或本文列出之任何病狀之治療可包括多於一種療法。因此，在某些實施例中，本文提供用於治療患有或懷疑患有多囊腎病之受試者的方法，該方法除投與本文提供之化合物之外亦包括投與至少一種療法，該化合物包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列。
在某些實施例中，至少一種另外療法包含藥劑。
在某些實施例中，藥劑為抗高血壓劑。抗高血壓劑用於控制受試者之血壓。
在某些實施例中，藥劑為血管加壓素受體2拮抗劑。在某些實施例中，血管加壓素受體2拮抗劑為托伐普坦(tolvaptan)。
在某些實施例中，藥劑包括血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)。在某些實施例中，血管緊張素II受體阻斷劑為坎地沙坦(candesartan)、伊貝沙坦(irbesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、洛沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)或依普沙坦(eprosartan)。
在某些實施例中，藥劑包括血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑。在某些實施例中，ACE抑制劑為卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、賴諾普利(lisinopril)、貝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)或雷米普利(ramipril)。
在某些實施例中，藥劑為利尿劑。在某些實施例中，藥劑為鈣通道阻斷劑。
在某些實施例中，藥劑為激酶抑制劑。在某些實施例中，激酶抑制劑為博舒替尼(bosutinib)或KD019。
在某些實施例中，藥劑為腎上腺素受體拮抗劑。
在某些實施例中，藥劑為醛固酮受體拮抗劑。在某些實施例中，醛固酮受體拮抗劑為螺內酯(spironolactone)。在某些實施例中，螺內酯係以範圍在每日10至35mg內之劑量投與。在某些實施例中，螺內酯係以每日25mg之劑量投與。
在某些實施例中，藥劑為雷帕黴素(rapamycin)之哺乳動物標靶(mTOR)抑制劑。在某些實施例中，mTOR抑制劑為依維莫司(everolimus)、雷帕黴素(rapamycin)或西羅莫司(sirolimus)。
在某些實施例中，藥劑為激素類似物。在某些實施例中，激素類似物為生長激素抑制素或促腎上腺皮質激素。
在某些實施例中，藥劑為抗纖維化劑。在某些實施例中，抗纖維化劑為與miR-21互補之經修飾寡核苷酸。
在某些實施例中，另外的療法為透析。在某些實施例中，另外的療法為腎移植。
在某些實施例中，藥劑包括消炎劑。在某些實施例中，消炎劑為類固醇消炎劑。在某些實施例中，類固醇消炎劑為皮質類固醇。在某些實施例中，皮質類固醇為強的松(prednisone)。在某些實施例中，消炎劑為非類固醇消炎藥。在某些實施例中，非類固醇消炎劑為布洛芬(ibuprofen)、COX-I抑制劑或COX-2抑制劑。
在某些實施例中，藥劑為阻斷對纖維發生信號之一或多個反應的藥劑。
在某些實施例中，另外的療法可為增強身體免疫系統之藥劑，包括低劑量環磷醯胺、胸腺刺激素、維生素及營養補充劑(例如抗氧化劑，包括維生素A、C、E、β-胡蘿蔔素、鋅、硒、麩胱甘肽、輔酶Q-10及紫花馬蘭菊(echinacea))以及疫苗，例如免疫刺激複合物(ISCOM)，其包含組合抗原之多聚呈現形式與佐劑之疫苗調配物。
在某些實施例中，另外的療法選用於治療或改善本發明之一或多種醫藥組成物之副作用。此等副作用包括(但不限於)注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常及肌病。舉例而言，血清中之轉胺酶含量升高可指示肝毒性或肝功能異常。舉例而言，膽紅素增加可指示肝毒性或肝功能異常。
某些微小RNA核苷鹼基序列
miR-17家族包括miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a及miR-106b。miR-17家族之各成員具有包含核苷鹼基序列5’-AAAGUG-3’或miR-17種子序列，miR-17種子序列為SEQ ID NO：1之位置2至7處的核苷鹼基序列。另外，miR-17家族之各成員在種子區域之外享有一定核苷鹼基序列一致性。因此，包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列的經修飾寡核苷酸除miR-17之外亦可靶向miR-17家族之其他微小RNA。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸靶向miR-17家族之兩個或兩個以上微小RNA。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸靶向miR-17家族之三個或三個以上微小RNA。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸靶向miR-17家族之四個或四個以上微小RNA。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸靶向miR-17家族之五個或五個以上微小RNA。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸靶向miR-17家族之六個微小RNA。舉例而言，具有核苷鹼基序列5’-AGCACUUUG-3’之經修飾寡核苷酸靶向miR-17家族之所有成員。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-CACUUU-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-GCACUUUG-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-AGCACUUU-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列為5’-AGCACUUUG-3’。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-CACTTT-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-CACUTT-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-CACUUT-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-CACTUT-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-CACUTT-3’。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含核苷鹼基序列5’-CACTTU-3’。
在某些實施例中，各胞嘧啶獨立地選自非甲基化胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，至少一個胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。在某些實施例中，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。在某些實施例中，至少一個胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，各胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之連接的核苷之數目小於其標靶微小RNA之長度。具有小於標靶微小RNA長度之數目的連接之核苷的經修飾寡核苷酸(其中經修飾寡核苷酸之各核苷鹼基與標靶微小RNA相應位置處之核苷鹼基互補)係視為具有與標靶微小RNA序列之區完全互補(亦稱為100%互補)的核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸。舉例而言，由9個連接之核苷組成的經修飾寡核苷酸(其中各核苷鹼基與miR-17之相應位置互補)與miR-17完全互補。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具有相對於標靶微小RNA之核苷鹼基序列具有一處失配之核苷鹼基序列。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸具 有相對於標靶微小RNA之核苷鹼基序列具有兩處失配之核苷鹼基序列。在某些此類實施例中，經修飾寡核苷酸具有相對於標靶微小RNA之核苷鹼基序列具有不多於兩處失配之核苷鹼基序列。在某些此類實施例中，失配之核苷鹼基為連續的。在某些此類實施例中，失配之核苷鹼基為不連續的。
雖然隨附於此申請之序列表根據需要將各核苷鹼基序列鑒別為「RNA」或「DNA」，但實際上，彼等序列可用本文指定之化學修飾之組合修飾。熟習此項技術者將易於瞭解，在序列表中，諸如「RNA」或「DNA」之用以描述經修飾寡核苷酸之名稱多少有些隨意。舉例而言，本文提供之包含含有具有2'-O-甲氧基乙基糖部分及胸腺嘧啶鹼基之核苷的經修飾寡核苷酸可描述為序列表中之DNA殘基，儘管核苷經修飾且不是天然DNA核苷。
因此，序列表中提供之核酸序列意欲涵蓋含有天然或經修飾RNA及/或DNA之任何組合之核酸，包括但不限於具有經修飾核苷鹼基之此等核酸。進一步舉例且不加限制，序列表中具有核苷鹼基序列「ATCGATCG」之經修飾寡核苷酸涵蓋具有此核苷鹼基序列(無論經修飾或未經修飾)之任何寡核苷酸，包括(但不限於)包含RNA鹼基之此等化合物，諸如具有序列「AUCGAUCG」者及具有一些DNA鹼基及一些RNA鹼基者(諸如「AUCGATCG」)及具有其他經修飾鹼基之寡核苷酸，諸如「ATmeCGAUCG」，其中meC指示5-甲基胞嘧啶。
某些修飾
在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸可包含一或多處核苷鹼基、糖及/或核苷間鍵之修飾，且因此為經修飾寡核苷酸。經修飾核苷鹼基、糖及/或核苷間鍵可因諸如細胞吸收增強、對其他寡核苷酸或核酸目標之親和力提高及在核酸酶存在下之穩定性提高的合意特性而優先於未經修飾形式加以選擇。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含一或多個經修飾核苷。
在某些實施例中，經修飾核苷為糖經修飾之核苷。在某些此類實施例中，糖經修飾之核苷可進一步包含天然或經修飾之雜環鹼基部分，且/或經由天然或經修飾之核苷間鍵連接至另一核苷，且/或可包括獨立於糖修飾之其他修飾。在某些實施例中，糖經修飾之核苷為2'位上經修飾之核苷，其中糖環在天然核糖或2'-去氧-核糖之2'碳上經修飾。
在某些實施例中，2'位上經修飾之核苷具有雙環糖部分。在某些此類實施例中，雙環糖部分為呈α組態之D型糖。在某些此類實施例中，雙環糖部分為呈β組態之D型糖。在某些此類實施例中，雙環糖部分為呈α組態之L型糖。在某些此類實施例中，雙環糖部分為呈β組態之L型糖。
包含此類雙環糖部分之核苷稱為雙環核苷或BNA。在某些實施例中，雙環核苷包括(但不限於)如下所描繪之(A)α-L-亞甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亞甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)伸乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)胺氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧胺基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亞甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(亦稱為限制性乙基或cEt)；(G)亞甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亞甲基-胺基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳環(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)c-MOE(4’-CH(CH2-OMe)-O-2’)BNA；及(K)伸丙基碳環(4’-(CH2)3-2’)BNA。
Figure 106142317-A0202-12-0037-49
Figure 106142317-A0202-12-0038-8
 其中Bx為核苷鹼基部分且R獨立地為H、保護基或C1-C12烷基。
在某些實施例中，2’位上經修飾之核苷包含選自以下之2’-取代基：F、OCF3、O-CH3(亦稱為「2’-OMe」)、OCH2CH2OCH3(亦稱為「2’-O-甲氧乙基」或「2’-MOE」)、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2及O-CH2-C(=O)-N(H)CH3。
在某些實施例中，2'位上經修飾之核苷包含選自以下之2'-取代基：F、O-CH3及OCH2CH2OCH3。
在某些實施例中，糖經修飾之核苷為4'-硫基修飾之核苷。在某些實施例中，糖經修飾之核苷為4'-硫基-2'-修飾之核苷。4'-硫基修飾之核苷具有β-D-核糖核苷，其中4'-O經4'-S置換。4'-硫基-2'位上經修飾之核苷為2'-OH經2'-取代基置換之4'-硫基經修飾之核苷。合適的2'-取代基包括2'-OCH3、2'-OCH2CH2OCH3及2'-F。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含一或多個核苷間修飾。在某些此類實施例中，經修飾寡核苷酸之各核苷間鍵為經修飾核苷間鍵。在某些實施例中，經修飾核苷間鍵包含磷原子。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之各核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸包含一或多個經修飾核苷鹼基。在某些實施例中，經修飾核苷鹼基係選自5-羥甲基胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤。在某些實施例中，經修飾核苷鹼基係選自7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-胺基吡啶及2-吡啶酮。在某些實施例中，經修飾核苷鹼基係選自5位上經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6及O-6經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。
在某些實施例中，經修飾核苷鹼基包含多環雜環。在某些實施例中，經修飾核苷鹼基包含三環雜環。在某些實施例中，經修飾核苷鹼基包含啡噁嗪衍生物。在某些實施例中，啡噁嗪可進一步經修飾以形成此項技術中稱為G形夾(G-clamp)之核苷鹼基。
在某些實施例中，經修飾寡核苷酸與一或多個增強所得反義寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞吸收之部分結合。在某些此類實施例中，該部分為膽固醇部分。在某些實施例中，該部分為脂質部分。用於結合之另外部分包括碳水化合物、肽、抗體或抗體片段、磷脂、生物素、啡嗪、葉酸鹽、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明(rhodamine)、香豆素及染料。在某些實施例中，碳水化合物部分為N-乙醯基-D-半乳胺糖(GalNac)。在某些實施例中，結合基團直接連接於寡核苷酸。在某些實施例中，結合基團藉由選自以下之連接部分連接至經修飾寡核苷酸：胺基、疊氮基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和度(例如雙鍵或三鍵)、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、6-胺基己酸(AHEX或AHA)、經取代之C1-C10烷基、經取代或未經取代之C2-C10烯基以及經取代或未經取代之C2-C10炔基。在某些此類實施例中，取代基係選自羥基、胺基、烷氧基、疊氮基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基及炔基。
在某些此類實施例中，化合物包含經修飾寡核苷酸，該寡核苷酸具有一或多個穩定基團連接於經修飾寡核苷酸之一端或兩端以增強諸如核酸酶穩定性之特性。在穩定基團中包括帽結構。此等末端修飾保護經修飾寡核苷酸免遭核酸外切酶降解，且可有助於傳遞及/或定位於細胞內。帽可存在於5’末端(5’帽)或3’末端(3’帽)處，或可存在於兩端上。帽結構包括例如反轉去氧無鹼基帽。
某些醫藥組成物
本文提供包含本文提供之化合物或經修飾寡核苷酸及醫藥學上可接受之稀釋劑的醫藥組成物。在某些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑為水溶液。在某些實施例中，水溶液為鹽水溶液。如本文所用，醫藥學上可接受之稀釋劑應瞭解為無菌稀釋劑。合適的投藥途徑包括(但不限於)靜脈內及皮下投與。
在某些實施例中，醫藥組合物以劑量單位形式投與。舉例而言，在某些實施例中，劑量單位為錠劑、膠囊或推注注射之形式。
在某些實施例中，藥劑為經修飾寡核苷酸，其已經在合適的稀釋劑中製備，在製備期間用酸或鹼調節至pH 7.0至9.0，且接著在無菌條件下凍乾。凍乾之經修飾寡核苷酸隨後用合適的稀釋劑(例如水溶液，諸如水或生理學上相容之緩衝液，諸如鹽水溶液、漢克斯氏溶液或林格氏溶液)復原。復原之產物以皮下注射形式或以靜脈內輸注形式投與。凍乾之藥品可包裝於用溴丁基橡膠蓋塞住且用鋁頂封密封之2mL I型透明玻璃小瓶(經硫酸銨處理)中。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物可另外含有此項技術中已確定之用量的習知見於醫藥組成物中之其他輔助組分。因此，例如，組成物可含有另外的相容性醫藥活性物質，諸如例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑。
在一些實施例中，本文提供之醫藥組成物可含有適用於物理調配本發明組成物之各種劑型的另外材料，諸如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、 遮光劑、增稠劑及穩定劑；此類另外的材料亦包括(但不限於)賦形劑，諸如乙醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、澱粉酶、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。在各種實施例中，此類材料在添加時應不會不當地干擾本發明組成物之組分之生物活性。調配物可經滅菌且必要時可與不會與調配物之寡核苷酸不利地相互作用之助劑混合，該等助劑為例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳香物質及其類似物。某些注射用醫藥組成物為於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。某些適用於注射用醫藥組成物中之溶劑包括(但不限於)親脂性溶劑及脂肪油，諸如芝麻油、合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯，以及脂質體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液之黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。視情況，此類懸浮液亦可含有適合的穩定劑或增加藥劑之溶解度以允許製備高度濃縮溶液之試劑。
已在多種方法中在核酸療法中使用脂質部分。在一種方法中，將核酸引入預成型之脂質體或由陽離子脂質與中性脂質之混合物製成之脂複合體(lipoplex)中。在另一方法中，在無中性脂質存在之情況下形成DNA與單陽離子脂質或聚陽離子脂質之複合體。在某些實施例中，脂質部分選用於增加藥劑向特定細胞或組織中之分佈。在某些實施例中，脂質部分選用於增加藥劑向脂肪組織中之分佈。在某些實施例中，脂質部分選用於增加藥劑向肌肉組織中之分佈。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物包含與核酸複合之多元胺化合物或脂質部分。在某些實施例中，此類製劑包含一或多種各自個別地具有由式(Z)定義之結構的化合物或其醫藥學上可接受之鹽，
Figure 106142317-A0202-12-0042-9
 其中各Xa及Xb在每次出現時獨立地為C1-6伸烷基；n為0、1、2、3、4或5；各R獨立地為H，其中製劑中至少約80%式(Z)化合物分子中的至少n+2個R部分不為H；m為1、2、3或4；Y為O、NR2或S；R1為烷基、烯基或炔基；其各自視情況經一或多個取代基取代；且R2為H、烷基、烯基或炔基；其各自視情況經一或多個取代基取代；其限制條件為，若n=0，則至少n+3個R部分不為H。此類製劑描述於PCT公開案WO/2008/042973中，該公開案對脂質製劑之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。某些另外的製劑描述於Akinc等人，Nature Biotechnology 26,561-569(2008年5月1日)中，該文獻對脂質製劑之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物係使用已知技術製備，該等技術包括(但不限於)混合、溶解、造粒、製糖衣藥丸、水磨、乳化、囊封、覆埋或製錠製程。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物為固體(例如散劑、錠劑及/或膠囊)。在某些此類實施例中，包含一或多種寡核苷酸之固體醫藥組成物係使用此項技術中已知之成分製備，此類成分包括(但不限於)澱粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑及崩解劑。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物係調配成儲槽式製劑。某些此類儲槽式製劑之作用時間通常比非儲槽式製劑長。在某些實施例中，此類製劑藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射投與。在某些實施例中，儲槽式製劑係使用適合的聚合材料或疏水性材料(例如於可接受之油中之乳液)或離子交換樹脂製備，或製備成微溶性衍生物，例如製備成微溶性鹽。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物包含傳遞系統。傳遞系統之實例包括(但不限於)脂質體及乳液。某些傳遞系統適用於製備某些醫藥組成物，包括包含疏水性化合物之醫藥組成物。在某些實施例中，使用某些有機溶劑，諸如二甲亞碸。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物包含一或多種經設計以將本發明之一或多種藥劑傳遞至特定組織或細胞類型的組織特異性傳遞分子。舉例而言，在某些實施例中，醫藥組成物包括包覆有組織特異性抗體之脂質體。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物包含持續釋放系統。該持續釋放系統之非限制性實例為固體疏水性聚合物之半通透性基質。在某些實施例中，持續釋放系統可視其化學性質而定在數小時、數天、數週或數月之時期內釋放藥劑。
某些注射用醫藥組成物以單位劑型存在於例如安瓿或多劑量容器中。
在某些實施例中，本文提供之醫藥組成物包含治療有效量之經修飾寡核苷酸。在某些實施例中，治療有效量足以預防、減輕或緩解疾病之症狀或延長所治療受試者之存活期。
在某些實施例中，本文提供之一或多種經修飾寡核苷酸係調配成前藥。在某些實施例中，活體內投與後，前藥在化學上轉化為寡核苷酸之生物學上、醫藥學上或治療上更具活性之形式。在某些實施例中，前藥因其比相應活性形式更易投與而適用。舉例而言，在某些情況下，前藥之生物可用率(例如通過經口投與)可比相應活性形式高。在某些情況下，前藥相比於相應活性形式可具有改良之溶解度。在某些實施例中，前藥之水溶性低於相應活性形式。在某些情況下，此類前藥具有較佳之跨細胞膜傳遞，其中水溶性不利於遷移。在某些實施例中，前藥為酯。在某些此類實施例中，酯在投與後代謝水解為羧酸。 在某些情況下，含羧酸化合物為相應活性形式。在某些實施例中，前藥包含結合於酸基之短肽(聚胺基酸)。在某些此類實施例中，肽在投與後裂解以形成相應活性形式。
在某些實施例中，藉由對醫藥活性化合物進行修飾而產生前藥，以使得活性化合物在活體內投與後再生。前藥可經設計以改變藥物之代謝穩定性或轉運特徵、遮蔽副作用或毒性、改良藥物之風味或改變藥物之其他特徵或特性。藉助於對活體內藥效動力學過程及藥物代謝之瞭解，熟習此項技術者在已知醫藥活性化合物後即可設計該化合物之前藥(參見例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford University Press,New York,第388-392頁)。
另外的投藥途徑包括(但不限於)經口、直腸、經黏膜、經腸、腸內、局部、栓劑、經由吸入、鞘內、心內、心室內、腹膜內、鼻內、眼內、腫瘤內、肌肉內及髓內投與。在某些實施例中，投與鞘內藥劑以達成局部暴露而非全身暴露。舉例而言，醫藥組成物可直接注射於所要作用之區域中(例如注射至腎中)。
某些套組
本發明亦提供套組。在一些實施例中，套組包含一或多種包含本文揭示之經修飾寡核苷酸的化合物。在一些實施例中，套組可用於向受試者投與化合物。
在某些實施例中，套組包含準備投與之醫藥組成物。在某些實施例中，醫藥組成物存在於小瓶內。複數個小瓶(諸如10個)可存在於例如分配包裝中。在一些實施例中，小瓶經製造以便於注射器出入。套組亦可含有用於使用化合物之說明書。
在一些實施例中，套組包含存在於預填充之注射器(諸如具有例如具針套之27號½吋針的單次劑量注射器)而非小瓶中之醫藥組成物。複數個預填充 之注射器(諸如10個)可存在於例如分配包裝中。套組亦可含有用於投與包含本文揭示之經修飾寡核苷酸的化合物的說明書。
在一些實施例中，套組包含作為凍乾藥品的本文提供之經修飾寡核苷酸及醫藥學上可接受之稀釋劑。在準備向受試者投與時，凍乾藥品在醫藥學上可接受之稀釋劑中復原。
在一些實施例中，除包含本文揭示之經修飾寡核苷酸的化合物之外，套組亦可包含以下中之一或多者：注射器、酒精棉簽、棉球及/或紗布墊。
某些實驗模型
在某些實施例中，本發明提供在實驗模型中使用及/或測試本發明之經修飾寡核苷酸的方法。熟習此項技術者能夠選擇及修改此類實驗模型之方案以評估本發明之藥劑。
一般而言，首先在培養細胞中測試經修飾寡核苷酸。適合的細胞類型包括與需要在活體內傳遞經修飾寡核苷酸之細胞類型相關的彼等細胞類型。舉例而言，適用於本文所述方法之研究的細胞類型包括初級細胞或培養細胞。
在某些實施例中，在培養細胞中評定經修飾寡核苷酸干擾一或多個miR-17家族成員之活性的程度。在某些實施例中，對微小RNA活性之抑制可藉由量測一或多個經預測或經驗證之微小RNA調控之轉錄物的含量來評定。對微小RNA活性之抑制可能導致miR-17家族成員調控之轉錄物及/或由miR-17家族成員調控之轉錄物編碼的蛋白質增加(亦即，將miR-17家族成員調控之轉錄物去阻遏)。此外，在某些實施例中，可量測某些表型結果。
熟習此項技術者可獲得若干動物模型以在人類疾病之模型中研究一或多個miR-17家族成員。多囊腎病之模型包括(但不限於)具有Pkd1及/或Pkd2之突變及/或缺失的模型；及包含其他基因之突變的模型。包含Pkd1及/或Pkd2之突變及/或缺失的PKD之非限制性示範性模型包括亞等位基因模型 (hypomorphic model)，諸如包含Pkd1之錯義突變的模型及Pkd2之表現降低或不穩定的模型；誘導型條件敲除模型；及條件敲除模型。包含除Pkd1及Pkd2之外的基因之突變的非限制性示範性PKD模型包括具有Pkhd1、Nek8、Kif3a及/或Nphp3之突變的模型。PKD模型係綜述於例如Shibazaki等，Human Mol.Genet.,2008；17(11)：1505-1516；Happe及Peters,Nat Rev Nephrol.,2014；10(10)：587-601；及Patel等，PNAS,2013；110(26)：10765-10770中。
某些定量檢定
在某些實施例中，微小RNA含量係在活體外或在活體內細胞或組織中定量。在某些實施例中，微小RNA含量之變化藉由微陣列分析來量測。在某些實施例中，微小RNA含量之變化藉由若干市售PCR檢定中之一者來量測，諸如TaqMan®微小RNA檢定(Applied Biosystems)。
用抗miR或微小RNA模擬物調節微小RNA活性可藉由mRNA之微陣列圖譜來評定。搜尋由抗miR或微小RNA模擬物調節(增加或減少)之mRNA序列中的微小RNA種子序列，以比較對作為微小RNA之目標之mRNA的調節作用與對不為微小RNA之目標之mRNA的調節作用。以此方式，可評估抗miR與其標靶微小RNA之相互作用或微小RNA模擬物與其標靶之相互作用。在抗miR之情況下，篩選表現量增加之mRNA中包含與抗miR所互補之微小RNA匹配之種子的mRNA序列。
用抗miR化合物調節微小RNA活性可藉由量測微小RNA之信使RNA標靶之含量或藉由量測信使RNA自身或由其轉錄之蛋白質之含量來評定。微小RNA之反義抑制通常導致微小RNA之信使RNA及/或信使RNA標靶之蛋白質之含量增加，亦即，抗miR治療導致一或多種標靶信使RNA之去阻遏。
實例
提供以下實例以便更充分地說明本發明之一些實施例。然而，其不應以任何方式視作限制本發明之廣泛範疇。此項技術中之一般技術人員將容易地採用本發明之基本原理來設計各種化合物而不背離本發明之精神。
實例1：miR-17在PKD中之作用
微小RNA之miR-17至92簇之miR-17家族成員在PKD小鼠模型中上調。PKD小鼠模型中miR-17至92簇之基因缺失降低腎囊腫生長、改善腎功能且延長存活(Patel等，PNAS,2013；110(26)：10765-10770)。miR-17至92簇含有6種不同的微小RNA，各自具有不同的序列：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19-b-1及miR-92a-1。
miR-17至92簇包括兩種微小RNA，亦即miR-17及miR-20a，其等為微小RNA之miR-17家族的成員。此家族之各成員享有種子序列一致性及種子區域之外的不同程度的序列一致性。miR-17家族之其他成員為miR-20b、miR-93、miR-106a及miR-106b。miR-20b及miR-106a位於人類X染色體上之miR-106a至363簇內，且miR-93及miR-106b位於人類第7號染色體上之miR-106b至25簇內。表1中顯示miR-17家族成員之序列。
使用研究工具抗miR-17化合物之先前研究鑒別miR-17在兩種不同的PKD模型(Pkd2-KO模型(亦稱為Pkhd1/cre；Pkd2 F/F模型)及Pcy模型)之PKD中的作用。在PKD小鼠模型中測試與miR-17互補之研究工具修飾之寡核苷酸。抗miR-17化合物為長度為19個連接之核苷 (5’-CTGCACTGTAAGCACTTTG-3’；SEQ ID NO：7)、具有DNA、2’-MOE及S-cEt糖部分的完全硫代磷酸化之寡核苷酸。儘管化合物相對於miR-17家族之其他成員具有錯配，但活體外檢定中之測試揭示其與miR-17家族之所有成員雜交且將其抑制。
Pkd2-KO小鼠自發發展多囊腎病。用20mg/kg工具抗miR-17化合物或對照寡核苷酸或用PBS處理小鼠。結果表明相對於對照處理，Pkd2-KO小鼠之抗miR-17處理使主要治療終點、亦即腎與體重比率降低了17%(p=0.017)。抗miR-17處理亦顯著降低Pkd2-KO小鼠中的BUN以及腎損傷mRNA生物標記Kim1及Ngal之表現。最後，抗miR-17處理導致Pkd2-KO小鼠中血清肌酸酐含量減少及囊腫指數降低的趨勢。在抗miR對照之情況下未觀察到此等結果，表明此特別係歸因於miR-17抑制。
攜帶Nphp3之突變的Pcy小鼠自發發展多囊腎病，疾病進展比在Pkd2-KO小鼠中所觀察到的更慢。每週用50mg/kg工具抗miR-17化合物或用PBS處理小鼠一次，持續總計26週。用抗miR-17處理的Pcy小鼠之腎重量與體重之平均比率比僅投與PBS之Pcy小鼠的腎重量與體重之平均比率低19%(p=0.0003)。與僅投與PBS之Pcy小鼠相比，用抗miR-17處理之Pcy小鼠顯示平均28%的囊腫指數降低(p=0.008)。
此等數據表明，在兩種不同的PKD實驗模型中，miR-17為用於治療PKD之經驗證之標靶。
實例2：化合物設計及篩選
雖然研究工具化合物在PKD模型中顯示出功效，但在活體內研究中觀察到該化合物為輕微促炎性的。此外，研究工具化合物對於開發作為用於治療PKD之藥劑並不足夠有效。因此，進行篩選以鑒別一或多個miR-17家族成員之抑制劑，該等抑制劑足夠有效、便於投與且對患有PKD之受試者是安全的。 另外的標準為足夠高的腎與肝傳遞比率，以提高傳遞至靶器官之抗miR-17化合物之比例。
設計包含與miR-17種子序列互補之核苷鹼基序列的約200個經修飾寡核苷酸，其具有不同的長度及化學組成。化合物之長度範圍為9至20個連接之核苷，且化合物之化學修飾的數目、類型及位置有所不同。因為功效及安全性不能基於化合物的核苷鹼基化學結構來預測，所以在一系列經設計以消除具有不利特性之化合物的檢定中在活體外及活體內評估化合物之特徵，包括效力、功效、藥物動力學行為、黏性、安全性及代謝穩定性。在某些檢定中，使用工具抗miR-17化合物作為與文庫化合物相比較之基準。如下所述，在若干活體外檢定(例如效力、毒理學、代謝穩定性)中首先測試幾乎200種化合物中之各者，以鑒別適用於在更複雜的活體內檢定(例如藥物動力學概況、功效、毒理學)中進一步測試之較小組的化合物。設計篩選過程以基於來自所有檢定之集合資料鑒別候選藥劑，著重於效力、藥物動力學概況(例如，向腎之傳遞)及安全性特徵。
活體外及活體內效力及功效
使用螢光素酶報告基因檢定評估活體外效力。用於miR-17之螢光素酶報告基因質粒在螢光素酶基因之3’-UTR中串聯有兩個完全互補之miR-17結合位點。若其等最大抑制大於工具抗miR-17化合物之最大抑制，則選擇較長長度之化合物。因為較短化合物(諸如9聚體)在用於較長化合物之相同檢定條件下通常不是最大活性的，所以基於相對於適當的對照化合物之最大抑制選擇較短化合物。以此方式，在進一步的測試中包括在長度及化學組成方面皆不同的化合物。
使用微小RNA多核糖體移動檢定(miPSA)評估活體內效力。此檢定係用於判定化合物在正常小鼠及PKD小鼠之腎中直接接合miR-17標靶之程 度。miPSA依賴於活性miRNA在翻譯活性高分子量(HMW)多核糖體中結合至其mRNA標靶而受抑制之miRNA位於低MW(LMW)多核糖體中的原理。用抗miR進行的處理導致微小RNA自HMW多核糖體移動至LMW多核糖體。因此，miPSA提供對互補抗miR與微小RNA標靶接合的直接量測(Androsavich等，Nucleic Acids Research,2015,44：e13)。
評估已經通過多個篩選標準之所選化合物在PKD實驗模型(例如，Pkd2-KO小鼠模型及Pcy小鼠模型)中之功效。用抗miR-17化合物處理小鼠，且評估臨床相關的終點，包括腎重量與體重之比率、血尿素氮含量、血清肌酸酐含量及腎囊腫指數。
藥物動力學特性
藉由在小鼠肝裂解物中培育各抗miR-17化合物來評估代謝穩定性。24小時後，計算剩餘的完整化合物之百分比。在24小時培育後不穩定的化合物在活體內可能不穩定。
在野生型C57BL6小鼠及JCK小鼠(PKD實驗模型)中評定所選化合物之藥物動力學特性及組織分佈。將化合物以0.3、3或30mg/kg之劑量投與至野生型小鼠，或以3、30或100mg/kg之劑量投與至JCK小鼠。七天后，處死小鼠。收集腎及肝組織。在肝及腎中量測抗miR-17化合物之濃度。相對於肝，在腎中積聚至較高位準(亦即具有較高的腎與肝比率)的化合物為較佳的。
在C57BL6小鼠中獲得已經通過多個篩選標準的所選化合物之完整的藥物動力學概況。在一項研究中，向小鼠單次皮下注射投與30mg/kg抗miR-17化合物。在另一項研究中，經兩個月時期向小鼠皮下注射投與39mg/kg抗miR-17化合物三次。在各研究中，在注射後1小時、4小時、8小時、1天、4天、7天、14天、28天及56天收集肝及腎樣品。
毒理學
在活體外檢定中，使用生物化學螢光結合檢定(FBA)及肝或腎切片檢定來評定毒性之可能性。藉由將螢光染料與各化合物一起培育且立即量測螢光來進行FBA。高度螢光化合物具有在活體內產生毒性之可能性。藉由培育自大鼠分離的核心肝樣品之組織切片來進行肝或腎切片檢定。培育24小時後，自組織切片中提取RNA，且量測18個促炎性基因之表現含量。促炎性基因表現之誘導指示活體內促炎性作用之可能性。
藉由向正常小鼠(Sv129小鼠)單次皮下注射投與300mg/kg抗miR-17化合物來進行另外的活體內毒理學評定。四天后，處死小鼠，收集血液以進行血清化學分析，對肝及脾進行稱重，且自腎及肝組織中分離RNA。量測促炎性基因之表現含量，亦即干擾素誘導之具有三十四肽重複序列(IFIT)的蛋白質。因為IFIT表現之誘導可能指示毒性，所以未誘導IFIT表現之化合物為較佳的。
在整個篩選過程中，某些抗miR-17化合物在多個檢定中表現良好。雖然沒有一種化合物在每個檢定中皆為最佳表現者，但在多個篩選階段後，某些化合物展現特別有利的特徵，諸如高效力及相對較高的腎與肝比率。在活體外檢定中測試的幾乎200種化合物中，約20種滿足活體內進一步測試的標準。最終將這20種化合物縮小為五種化合物，且最後縮小為一種化合物RG4326，其具有最佳的總體概況，並且選擇作為候選藥劑。在鑒別此化合物之後，進行另外的研究以評估效力、藥物動力學概況及功效。
RG4326具有以下序列及化學修飾模式：ASGSCMAFCFUFUMUSGS，其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷，各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶，且所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵。如以下實例中所示，此化合物展現活體內miR-17之強標靶接合、PKD小鼠模型中之功效及有利於分佈至腎的藥物動力學概況。另外，RG4326 之黏度在約150mg/mL之濃度下(在20℃的水中)判定為6cP，因此溶液中之RG4326適合藉由皮下注射來投與。
實例3：另外的短抗miR-17化合物
在所選檢定中測試其中各核苷為S-cEt核苷的另外的九核苷酸化合物(RG4047)，以相對於RG4326比較活性、安全性及藥物動力學概況。
所採用的一個檢定為螢光素酶檢定。如上所述，短的(例如，9個核苷酸)抗miR-17化合物雖然可在活體內研究中具有優勢，但在活體外轉染檢定中不一定表現良好。因此，螢光素酶檢定轉染條件針對短的抗miR-17化合物來優化，從而可量測化合物之抑制活性。
使用RG5124作為對照化合物。RG5124在長度上為9個連接之核苷，且與RG4326具有相同的糖修飾模式，但具有與miR-17不互補之核苷鹼基序列。
用於miR-17之螢光素酶報告基因質粒在螢光素酶基因之3’-UTR中含有完全互補之miR-17結合位點。將HeLa細胞用微小RNA模擬物及其同源螢光素酶報告基因轉染，隨後用0.001、3、10、30、100及300nM劑量的抗miR-17轉染。在24小時轉染期結束時，量測螢光素酶活性。如表2-1中所示，RG4047雖然不如RG4326有力，但以劑量依賴性方式抑制miR-17活性。SD指示標準偏差。
評估RG4047之活體內效力、安全性以及向腎及肝之分佈。與較大文庫篩選一樣，活體外效力未預測活體內行為。在腎及肝中皆產生輕微的促炎性訊號之RG4047與RG4326相比在野生型小鼠及PKD小鼠中在活體內為不太有效的miR-17抑制劑，且具有低得多的腎與肝比率(參見，表2-2)。此等研究顯露，RG4047之活性及特性相對於RG4326未改善。
為了進一步探究化學修飾之位置、類型及數目對9聚體化合物之活性及腎與肝比率的影響，在野生型小鼠及JCK小鼠中評估另外的抗miR-17化合物。JCK模型為與引起9型人類腎消耗病之相同基因有關的緩慢進行性腎囊性疾病之小鼠模型。此小鼠之腎囊腫在腎單位之多個區域中發展。
使用miPSA來評定野生型及JCK小鼠中藉由置換評分量測之各化合物之效力。藉由使用液液萃取(LLE)及/或固相萃取(SPE)萃取化合物，隨後使用離子配對反相高效液相層析偶聯飛行時間質譜(IP-RP-HPLC-TOF)來量測抗miR-17化合物之組織積累。
此等另外的化合物以及RG4326及RG4047之結果顯示於表2-2中。
向野生型小鼠投與3mg/kg之單次劑量以進行miPSA分析，且投與30mg/kg之單次劑量以進行組織積累分析。向JCK小鼠投與30mg/kg之單次劑量以進行miPSA及組織積累分析。在投與抗miR-17化合物後七天收集腎組織。如表2-2所示，經修飾核苷之類型及位置的變化對抗miR-17化合物之miR-17抑制活性及/或腎與肝比率展示出實質性影響。例如，雖然RG4324展示出藉由miPSA量測之效力，但腎：肝比率低於針對其他化合物所觀察到之腎：肝比率。對於其中主要作用部位為腎之疾病，較高的腎與肝比率通常為較佳的。相反，RG4327在PKD小鼠中展現出高的腎：肝比率，但展現出低效力。如上所述，RG4326展現用於治療PKD之最合適的效力及藥物動力學概況。
表2-2：抗miR-17化合物活性及組織積累之比較
實例4：在另外的活體外檢定中之RG4326活性
進行另外的活體外檢定以進一步探究RG4326之效力。使用螢光素酶報告基因檢定來測試RG4326抑制miR-17家族成員miR-17、miR-20a、miR-93及miR-106b之能力。建構miR-20a、miR-93及miR-106b各自之螢光素酶報告基因質粒，完全互補之微小RNA結合位點處於螢光素酶基因之3’-UTR中。將HeLa細胞用微小RNA模擬物及其同源螢光素酶報告基因轉染，隨後用100nM劑量的抗miR-17轉染。如表3所示，miR-17、miR-20a、miR-93及miR-106b中之各者被RG4326抑制，表明抗miR-17化合物抑制miR-17家族之多個成員。因為RG4326與未測試的其他miR-17家族成員(miR-20b及miR-106b)100%互補，所以預計其亦抑制此等微小RNA。表3中之數據亦示於圖1A中。
為了測試RG4326抑制內源性標靶之miR-17調節之能力，在來自正常小鼠及PKD小鼠腎的若干腎細胞類型中在活體外評定miR-17靶基因去阻遏。用0.3nM、1.2nM、4.7nM、18.8nM、75nM及300nM RG4326或對照寡 核苷酸RG5124處理小鼠腎集合管細胞(IMCD3)。其他對照組包括未經處理細胞及模擬轉染之細胞(僅用轉染試劑處理之細胞)。24小時轉染期後，收集細胞且提取RNA。量測由miR-17靶向之18種基因之mRNA含量，且平均化以提供相對於模擬轉染呈現為Log2倍數變化(Log2FC)的藥效學印記評分(PD Signature Score)。如表4所示，RG4326(而非對照處理)以劑量依賴性方式去阻遏miR-17標靶。數據亦示於圖2B中。
在另外的腎細胞類型中亦評估RG4326使miR-17標靶去阻遏之能力，該等另外的腎細胞類型來源於正常小鼠及PKD小鼠之腎。將細胞用30nM RG4326或對照寡核苷酸RG5124處理。24小時轉染期後，收集細胞且提取RNA。量測由miR-17靶向之18種基因之mRNA含量，且平均化以提供相對於模擬轉染呈現為Log2倍數變化(Log2FC)的藥效學印記評分(PD Signature Score)。如表5所示，在若干不同的健康及患病的腎來源細胞類型中，RG4326(而非對照寡核苷酸)使miR-17標靶去阻遏。「P<0.05」指示如藉由單向ANOVA計算的小於0.05之p值。「NS」指示統計學上不顯著之變化。
實例5：RG4326之活體內效力
使用微小RNA多核糖體移動檢定(miPSA)來鑒別在正常小鼠及PKD小鼠腎中直接接合miR-17之化合物。miPSA依賴於活性miRNA在翻譯活性高分子量(HMW)多核糖體中結合至其mRNA標靶而抑制之miRNA位於低MW(LMW)多核糖體中的原理。用抗miR進行的處理導致微小RNA自HMW多核糖體移動至LMW多核糖體。因此，miPSA提供對互補抗miR之微小RNA標靶接合的直接量測(Androsavich等，Nucleic Acids Research,2015,44：e13)。
對於此實驗，所選PKD模型為JCK模型，即與引起9人類腎消耗病之相同基因相關之緩慢進行性腎囊性疾病之小鼠模型。這種小鼠之腎囊腫在腎單位之多個區域中發展。
用0.3、3及30mg/kg的單次皮下劑量之RG4326或工具抗miR-17(實施例1中所述)處理C57BL6小鼠。用3、30及100mg/kg的單次皮下劑量之RG4326或工具抗miR-17處理JCK小鼠。使用PBS處理作為另外的對照。在處理後七天，處死小鼠，分離腎組織以進行miPSA。如表6所示，計算之置換評分表明RG4326在正常腎及PKD腎中之強標靶接合。用RG4326處理後之置換評分大於用工具抗miR-17化合物處理後之置換評分。野生型小鼠及JCK小鼠之數據亦分別示於圖3A及圖3B中。
實例6：RG4326在PKD實驗模型中之活體內功效
使用兩個PKD實驗模型來評估共功效。Pkd2-KO小鼠自發地發展多囊腎病，且將其用作ADPKD之模型。參見，Patel等，PNAS,2013；110(26)：10765-10770。攜帶Nphp3之突變的Pcy小鼠自發發展多囊腎病，疾病進展比在Pkd2-KO小鼠中所觀察到的更慢。使用Pcy模型作為腎消耗病之模型。參見，Happe及Peters,Nat.Rev.Nephrol.,2014；10：587-601。
Pkd2-KO 模型
在ADPKD之Pkd2-KO小鼠模型中測試RG4326。此模型亦稱為PKD2-KO模型。使用野生型小鼠作為對照小鼠。使用與miR-17無關之miRNA互補之寡核苷酸作為用於特異性之治療對照(RG5124)。
在第10、11、12及19日齡之每一天，對性別匹配的同窩小鼠皮下注射劑量為20mg/kg的RG4326(n=12)，劑量為20mg/kg的RG5124(n=12)，劑量為20mg/kg的工具抗miR-17(n=12)或PBS(n=12)。在28日齡時處死小鼠，量測腎重量、體重、囊腫指數、血清肌酸酐含量及血尿素氮(BUN)含量。BUN含量為腎功能之標記。較高BUN含量與較差腎功能相關，因此BUN含量之降低為腎損傷及損害降低以及功能改善之指標。藉由單向ANOVA用Dunnett氏多重校正來計算統計顯著性。
囊腫指數為囊性面積相對於總腎面積之組織學量測值。對於此分析，將一個腎用冷PBS及4%(wt/vol)多聚甲醛灌注，且接著收穫。將腎用4%多聚甲醛固定2小時，且接著在石蠟中包埋以進行切片。將腎之矢狀切片用蘇木精及伊紅(H&E)染色。所有圖像處理步驟皆為自動化的，且在可免費獲得的開源軟體中進行：使用EBImage Bioconductor程式包2及圖像處理工具之 ImageMagick3套件之功能的R1腳本。將Aperio SVS格式之腎H&E圖像轉換為TIFF圖像，且保留第一幀以進行圖像分析。首先，使用圖像分割計算總腎切片面積。類似地使用圖像分割以發現所有內部結構，包括腎囊腫。應用過濾器以去除小於三個像素之平均半徑的所有物體。囊性指數為與囊腫相關的圖像面積除以總腎面積。分別計算各個體動物之縱向及橫向腎切片之囊性指數。比較各處理組之個體動物之組合囊性指數。
結果顯於表7中。用RG4326處理的Pkd2-KO小鼠之腎重量與體重之平均比率(KW/BW比率)比投與PBS之Pkd2-KO小鼠之平均KW/BW比率低29%(p=0.0099)。與投與PBS之Pkd2-KO小鼠相比，用RG4326處理之Pkd2-KO小鼠顯示平均12%的囊腫指數降低，但差異並非統計學顯著的。在用PBS處理之Pkd2-KO小鼠中，平均BUN含量降低13%，但差異並非統計學顯著的。用RG4326處理之Pkd2-KO小鼠之平均血清肌酸酐含量比投與PBS之Pkd2-KO小鼠低18%，但結果並非統計學顯著的。在對照寡核苷酸之情況下未觀察到此等結果，指示其特別係歸因於miR-17抑制。雖然先前研究表明用工具抗miR-17化合物處理後的Pkd2-KO之KW/BW比率、BUN及囊腫指數降低，但在本研究中未觀察到統計學顯著的變化。用對照寡核苷酸RG5124處理未降低腎重量與體重比率、囊腫指數或BUN。KW/BW比率、BUN及囊性指數亦分別示於圖4A、圖4B及圖4C中。
此等結果表明，RG4326處理在Pkd2-KO小鼠中導致與PKD治療有關之生物學終點即腎體積相對於體重之陽性結果。關於此特定的終點，RG4326比工具抗miR-17化合物更有效。RG4326處理導致Pkd2-KO小鼠中BUN降低及囊腫指數降低的趨勢。
Pcy模型
在Pcy小鼠模型中測試RG4326。使用野生型小鼠作為對照組。自四週齡開始，每週用25mg/kg劑量的RG4326、25mg/kg劑量的工具抗miR-17、25mg/kg劑量的對照寡核苷酸RG5124或PBS經由皮下注射處理Pcy小鼠一次。每個處理組含有15只雄性小鼠。在55、56及57日齡時投與三次治療，且此後在6、7、8、9、10、11、12、13及14週齡時每週投與一次。亦測試托伐普坦，亦即血管加壓素V2受體拮抗劑(VRA)，將其開處方給予一些患有多囊腎病之患者。在15週齡時處死小鼠。記錄體重。提取一個腎且進行稱重，且處理另一個腎以進行組織學分析，以如對於Pkhd1/cre；Pkd2 F/F中之研究所述計算囊腫指數。量測血尿素氮(BUN)含量及血清肌酸酐含量。藉由單向ANOVA用Dunnett氏多重校正來計算統計顯著性。
結果顯於表8中。相對於PBS處理的小鼠之平均KW/BW比率，用25mg/kg RG4326處理之組的經處理Pcy小鼠之平均KW/BW比率低19%(P=0.0055)。另外，與投與PBS之Pcy小鼠相比，用RG4326處理之Pcy小鼠的囊腫指數降低34%(p=0.016)。相對於PBS處理之Pcy小鼠之BUN，用RG4326處理使Pcy小鼠之BUN降低16%(p=0.0070)。用對照寡核苷酸或工具抗miR-17化合物處理未導致KW/BW比率、BUN或囊腫指數之統計學顯著降低。托伐普坦在本研究中無效。表8中之數據亦示於圖5中。
此等資料表明，在另外的PKD模型中，用RG4326治療導致腎重量、BUN及囊腫指數降低。
實例7：RG4326藥物動力學評定
由於其血清蛋白結合能力降低，該血清蛋白結合為驅動體內寡核苷酸分佈之特性，預計短寡核苷酸不一定具有使其適用作藥物之藥物動力學特性。將RG4326在小鼠、猴或人類肝勻漿中培育。在24小時培育後判定RG4326及代謝物之特性及濃度。使用液液萃取(LLE)及/或固相萃取(SPE)萃取RG4326及代謝物，接著使用離子配對反相高效液相層析偶聯飛行時間質譜(IP-RP-HPLC-TOF)分析其一致性及濃度。如表9所示，儘管其長度短，但發現RG4326具有特別有利的藥物動力學概況，在24小時培育後超過95%的母體化合物RG4326保持完整。
藉由向野生型小鼠投與單次皮下30mg/kg劑量的RG4326或工具抗miR-17化合物來評定藥物動力學行為。在單次注射後一小時、四小時、八小時、一天、七天、14天、28天及56天時處死小鼠，且如上所述量測腎及肝組織中抗miR化合物之平均濃度(ug/g)。使用公式ug*h/g計算腎及肝組織之曲線下面積(AUC)，其中ug為組織中寡核苷酸之量，h為以小時計的組織收集時間點，且g 為組織之重量。判定腎AUC與肝AUC之比率。亦將腎組織處理為miPSA，以判定本研究中各化合物之標靶接合。使用公式Log2FC*h計算PSA AUC，其中Log2FC為置換值，h為以小時計的組織收集時間點。使用公式Log2FC+g/ug計算第7天時腎中之效力，其中Log2FC為由miPSA判定之置換值，g為腎組織之重量，且ug為第七天時腎組織中的抗miR之量。
如表10所示，與工具抗miR-17化合物相比，RG4326之腎AUC與肝AUC之比率更大。引人注目的是，雖然RG4326之腎AUC與工具抗miR-17化合物相比較低，但如由miPSA所判定之效力顯著更大。因此，RG4326在腎(PKD之主要靶組織)中在較低濃度下展現更大的效力。
在野生型(C57B16)小鼠及PKD(JCK)小鼠中進一步表徵RG4326之藥物動力學行為。5只小鼠之組各自在連續三天中之每一天接受三次10mg/kg皮下注射。在第三次及最後一次注射後一、四、七、14及21天時處死小鼠，且收集血漿、腎及肝樣品。對於RG4326之量測，使用液液萃取(LLE)及/或固相萃取(SPE)萃取RG4326，接著使用離子配對反相高效液相層析偶聯飛行時間質譜(IP-RP-HPLC-TOF)分析其一致性及濃度。
資料概述於表11中。觀察到RG4326在血漿及組織中穩定，在21天后剩餘超過90%的母體化合物。抗miR在注射後數小時內迅速分佈至組織， 且主要分佈至腎。野生型小鼠之肝及腎中之半衰期為約八天，JCK小鼠之肝中為約六天，且JCK小鼠之腎中為約8天。在野生型小鼠中，腎AUC與肝AUC之比率為17。在PKD小鼠中，腎AUC與肝AUC之比率為13。此等資料表明RG4326之藥物動力學概況在正常小鼠與PKD小鼠中係相當的。
實例8：RG4326安全性評定
在活體外、離體及活體內檢定中評估腎及肝之毒性之可能性。
使用生物化學螢光結合檢定(FBA)評定毒性之可能性。藉由將螢光染料與各化合物一起培育且立即量測螢光來進行FBA。將結果表示為相對於對照處理之樣品的倍數變化(線性FC)。高度螢光化合物具有在活體內產生毒性之可能性。
用肝或腎組織切片進行離體檢定。藉由培育自大鼠分離的核心肝或腎樣品之組織切片來進行肝或腎切片檢定。培育24小時後，自組織切片中提取RNA，且量測18個促炎性基因(包括IFIT)之表現含量。進行相對於PBS處理之倍數變化的log2轉換(Log2-FC)。促炎性基因表現之誘導指示活體內促炎性效應之可能性。
在正常Sv129小鼠中進行活體內檢定。投與300mg/kg單次皮下劑量的RG4326。包括PBS及與miR-17無關的兩種抗miR作為對照處理，已知一種抗miR為促炎性的(陽性對照)，且一種不為促炎性的(陰性對照)。四天后，處死 小鼠。分離腎及肝組織以進行RNA提取。量測已知在炎症反應期間誘導之基因IFIT之含量，且將其針對小鼠GAPDH正規化。進行相對於PBS處理之倍數變化的log2轉換(Log2-FC)。
此等資料表明，基於多個檢定，RG4326顯示有利的安全性概況及低的促炎性傾向風險。
圖1A至圖1B. (A)miR-17螢光素酶檢定中RG4326之活性。(B)miR-17家族成員螢光素酶檢定中之RG4326活性。
圖2. 用RG4326或對照RG5124處理後的IMCD3細胞之PD印記評分。
圖3A至圖3B. 顯示(A)野生型小鼠之腎及(B)RG4326處理之小鼠之腎中miR-17標靶接合之miPSA。
圖4A至圖4C. RG4326在PKD之Pkd2-KO模型中之功效。處理對(A)腎與體重比率；(B)血尿素氮(BUN)含量；及(C)囊性指數之影響。
圖5A至圖5C. RG4326在PKD之Pcy模型中之功效。處理對(A)腎與體重比率；(B)血尿素氮(BUN)含量；及(C)囊性指數之影響。
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<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
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<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
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<210> 3
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<212> RNA
<213> 智人
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<210> 4
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<212> RNA
<213> 智人
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<210> 5
<211> 23
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<210> 6
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<400> 6
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<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾寡核苷酸
<4.00> 7
Figure 106142317-A0305-02-0066-8

Claims (16)

  1. 一種化合物，其包含由9個連接之核苷組成的經修飾寡核苷酸，其中該經修飾寡核苷酸在5’至3’取向上具有以下核苷模式：NSNSNMNFNFNFNMNSNS其中後接下標「M」之核苷為2’-O-甲基核苷，後接下標「F」之核苷為2’-氟核苷，後接下標「S」之核苷為S-cEt核苷，且所有鍵皆為硫代磷酸酯鍵；且其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列係5’-AGCACUUUG-3’，其中各胞嘧啶獨立地選自非甲基化胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶；或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中各胞嘧啶為非甲基化胞嘧啶。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之化合物，其中該化合物由經修飾寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽組成。
  4. 如申請專利範圍第3項之化合物，其中該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽。
  5. 一種經修飾寡核苷酸，其具有以下結構：
    Figure 106142317-A0305-02-0068-9
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  6. 如申請專利範圍第5項之經修飾寡核苷酸，其為該結構之醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如申請專利範圍第5項之經修飾寡核苷酸，其為該結構之鈉鹽。
  8. 一種經修飾寡核苷酸，其具有以下結構：
    Figure 106142317-A0305-02-0069-10
  9. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物或如申請專利範圍第5至8項中任一項之經修飾寡核苷酸及醫藥學上可接受之稀釋劑。
  10. 如申請專利範圍第9項之醫藥組成物，其中該醫藥學上可接受之稀釋劑為水溶液。
  11. 如申請專利範圍第10項之醫藥組成物，其中該水溶液為鹽水溶液。
  12. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物或如申請專利範圍第5至8項中任一項之經修飾寡核苷酸，其為凍乾組成物。
  13. 一種醫藥組成物，其基本上由於鹽水溶液中的如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物或如申請專利範圍第5至8項中任一項之經修飾寡核苷酸組成。
  14. 一種用於抑制細胞中miR-17家族之一或多個成員之活性的體外方法，該方法包含使該細胞與如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物或如申請專利範圍第5至8項中任一項之經修飾寡核苷酸接觸。
  15. 一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物或如申請專利範圍第5至8項中任一項之經修飾寡核苷酸之用途，其係用以製備用於抑制受試者中miR-17家族之一或多個成員之活性的藥物。
  16. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該受試者患有與miR-17相關之疾病。
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