ES2406686T3 - Micromirs - Google Patents

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ES2406686T3
ES2406686T3 ES08801378T ES08801378T ES2406686T3 ES 2406686 T3 ES2406686 T3 ES 2406686T3 ES 08801378 T ES08801378 T ES 08801378T ES 08801378 T ES08801378 T ES 08801378T ES 2406686 T3 ES2406686 T3 ES 2406686T3
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Susanna Obad
Sakari Kauppinen
Joacim ELMÉN
Morten Lindow
Markus Heidenblad
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Santaris Pharma AS
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Abstract

Un oligómero de una longitud de 7-10 bases nucleotídicas, que comprende una secuencia de bases nucleotídicas contigua de 7-10 bases nucleotídicas, en el que al menos el 70 % de las unidades de bases nucleotídicas del oligómero son unidades de bases nucleotídicas de ácido nucleico bloqueado (LNA) y en el que el oligómero comprende al menos un enlace fosforotioato y en el que el oligómero es para uso en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula u organismo.

Description

Micromirs
Campo de la invención
La presente invención se refiere a oligonucleótidos muy cortos que están dirigidos e inhiben microARN in vivo y a su uso en medicamentos y composiciones farmacéuticas.
Antecedentes de la invención
Los microARN (microARN) son una clase abundante de ARN endógenos cortos que actúan como reguladores postranscripcionales de la expresión génica mediante apareamiento de bases con sus ARNm diana. Se procesan a partir de precursores de tipo horquilla más largos (de aproximadamente 70-80 nucleótidos) denominados pre-miARN a través del dícero enzimático RNasa III. Los microARN se ensamblan en complejos de ribonucleoproteínas denominados mirRNP y reconocen sus sitios diana mediante complementariedad antisentido de modo que participan en la regulación por disminución de sus genes diana. La complementariedad casi perfecta o perfecta entre el miARN y su sitio diana tiene como resultado la escisión del ARNm diana, mientras que una complementariedad limitada entre el microARN y el sitio diana tiene como resultado la inhibición traduccional del gen diana.
Un resumen del papel de los microARN en enfermedades humanas y la inhibición de microARN usando oligonucleótidos monocatenarios se proporciona en los documentos WO 2007/112754, WO 2007/112753. El documento WO 2008046911 proporciona secuencias de microARN que están asociadas con cáncer. Numerosos microARN se han relacionado con fenotipos de enfermedad y, por tanto, es deseable proporcionar sustancias capaces de modular la disponibilidad de microARN in vivo. Los documentos WO 2007/112754 y WO 2007/112753 divulgan oligonucleótidos monocatenarios cortos que se considera que forman un dúplex fuerte con su ARNmi diana. Las SEC ID Nº 1-45 son ejemplos de oligonucleótidos microARN como se divulgan en el documento WO 2007/112754 y WO 2007/112753.
Fabini y Gait, 2008 (RNA vol 14 pág. 336-346), Elmén J y col. 2008 (Nature Vol 452, p142), Elmén J y col., 2007 (Nucleic Acid Research vol 36 pág. 1153-1162) divulgan LNA y oligonucleótidos antimir modificados con 2'O-metilo que son más largos que 10 unidades de nucleótidos. Obad S y col., 2008 (European Journal of Cancer Supplements vol.6 p142) hace referencia a LNA cortos-oligonucleótidos antimir, sin indicar ninguna longitud adicional de dichos oligonucleótidos. El documento WO 2007/112753 hace referencia a oligonucleótidos de una longitud que es improbable que forme un complejo de siARN y con suficiente carga de análogos nucleotídicos de alta afinidad que casi se adhieren de forma permanente a su miARN diana, formando con eficacia un dúplex estable y no funcional con el miARN. El documento WO 2007/11275 divulga oligonucleótidos que tienen una longitud de 8 y 10 nucleótidos, y divulga oligonucleótidos que consisten en análogos nucleotídicos sustituidos en 2’ con LNA.
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad sobre cuatro solicitudes: US 60/977497 presentada el 4 de octubre de 2007, US 60/979217 presentada el 11 de octubre de 2007, US 61/028062 presentada el 12 de febrero de 2008 y EP 08104780 presentada el 17 de julio de 2008.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de que el uso de oligonucleótidos muy cortos que están dirigidos a microARN y que tienen una proporción elevada de nucleótidos LNA es muy eficaz en el alivio de la represión de los ARN, tal como un ARNm, mediante los microARN al que están dirigidos in vivo.
La presente invención proporciona a un oligómero una secuencia contigua de una longitud de 7, 8, 9 o 10 unidades nucleotídicas para usar en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula o un organismo, en el que al menos el 70 %, tal como al menos el 80 % de las unidades nucleotídicas del oligómero son unidades de LNA y en el que el oligómero comprende al menos un enlace fosforotioato y en el que el oligómero es para uso en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula u organismo.
La presente invención proporciona a un oligómero una secuencia contigua de una longitud de 7, 8, 9 o 10 unidades nucleotídicas para usar en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula o un organismo, en el que al menos el 70 % de las unidades nucleotídicas del oligómero son unidades de LNA y en el que el oligómero comprende al menos un enlace fosforotioato y en el que el oligómero es para uso en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula u organismo.
La invención proporciona oligómeros de una longitud entre 7-10 nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de un total de entre 7-10 nucleótidos, tal como 7, 8, 9 unidades nucleotídicas, en el que al menos el 70 % de las unidades nucleotídicas del oligómero son análogos nucleotídicos de LNA y en el que el oligómero comprende al menos un enlace fosforotioato y en el que el oligómero es para uso en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula u organismo.
La invención proporciona además un oligómero de una longitud entre 7-10 nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de un total de entre 7-10 nucleótidos, tal como 7, 8, 9 o 10 unidades nucleotídicas, en el que la secuencia de nucleótidos es complementaria a una correspondiente secuencia de nucleótidos encontrada en microARN de mamífero o viral, y en el que al menos el 70 % de las unidades nucleotídicas del oligómero son análogos nucleotídicos de LNA y en el que el oligómero comprende al menos un enlace fosforotioato y en el que el oligómero es para uso en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula u organismo.
La presente invención proporciona oligómeros de acuerdo con la invención como medicamento.
Los oligómeros de la invención se pueden usar en composiciones farmacéuticas de la presente invención que comprenden el oligómero de la invención y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona un conjugado que comprende un oligómero de acuerdo con la invención, conjugado con al menos un no nucleótido o entidad polinucleotídica, tal como un esterol, tal como colesterol.
La invención proporciona el uso de un oligómero o un conjugado de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para l tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión de un microARN, tal como uno o más de los microARN a los que se hace referencia en el presente documento.
Los oligómeros de la invención se pueden usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar una composición (tal como la composición farmacéutica) que comprende un oligómero o conjugado de acuerdo con la invención a un paciente que sufre, o es probable que sufra, dicha enfermedad o trastorno médico.
La invención proporciona un procedimiento in Vitro para reducir la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula, que comprende administrar a la célula el oligómero de la invención, o una composición (tal como una composición farmacéutica) que comprende el oligómero o conjugado de acuerdo con la invención.
La invención proporciona un procedimiento in vitro para reducir la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula, que comprende administrar a la célula el oligómero o conjugado o composición farmacéutica de acuerdo con la invención.
La invención proporciona un procedimiento in vitro para desreprimir un ARNm (o uno o más ARN) diana en una célula, que comprende administrar a dicha célula el oligómero o conjugado de acuerdo con la invención o una composición que comprende dicho oligómero o conjugado.
La invención proporciona el uso in vitro de un oligómero o un o conjugado de acuerdo con la invención para inhibir el microARN en una célula, que comprende dicho microARN, tal como una célula humana.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Presentación esquemática de los LNA-antimiR miR-21, miR-155 y miR-122 de 8 unidades, que indica las posiciones diana con el LNA-antimiR fosforotiolado y completamente modificado con LNA. También Se indican las posiciones de hibridación preferidas para oligonucleótidos LNA de 7, 8, 9 y 10 unidades del microARN maduro.
Figura 2. Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante anti-miR de LNA de SEC ID Nº 3205 y SEC ID Nº 3204 en células MCF-7 usando un ensayo sensor de luciferasa. Las células MCF-7 se co-transfectaron con plásmidos con sensor de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-21 o un sitio diana de coincidencia errónea (.mm2) y LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestra la media de las proporciones de renilla/luciérnaga para tres experimentos distintos (barras= SEM), en los que todos se han normalizado frente a psiCHECK2 0 nM (=control).
Figura 3. Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante anti-miR de LNA de SEC ID Nº 3205 y SEC ID Nº 3204 en células HeLa usando un ensayo sensor de luciferasa. Las células HeLa se co-transfectaron con plásmidos con sensor de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-21 (mir-21) o un sitio diana de coincidencia errónea (mm2) y LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestra la media de las proporciones de renilla/luciérnaga para tres experimentos distintos (barras= SEM), en los que todos se han normalizado frente a psiCHECK2 0 nM (=control).
Figura 4. Evaluación del antagonismo de miR-155 mediante anti-miR de LNA de SEC ID Nº 3206 y SEC ID Nº 3207 en células RAW de ratón tratadas con LPS usando un ensayo sensor de luciferasa. Las células RAW se cotransfectaron con miR-155 y los diferentes LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestra la media de las proporciones de renilla/luciérnaga todas normalizadas frente a psiCHECK2 0 nM.
Figura 5. Evaluación del antagonismo de miR-122 mediante anti-miR de LNA de SEC ID Nº 3208 y SEC ID Nº 4 en células HuH-7 usando un ensayo sensor de luciferasa. Las células HuH-7 se co-transfectaron con un sensor de luciferasa miR-122 que contiene un sitio diana de miR-122 de coincidencia perfecta en los diferentes LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestra la media de las proporciones de renilla/luciérnaga para tres experimentos distintos (barras= SEM), en los que todos se han normalizado frente a psiCHECK2 0 nM (=control).
Figura 6. Presentación esquemática de los constructos indicadores de la luciferasa miR-21.
Figura 7. Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) frente a LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3204) en células PC3 usando un ensayo indicador de luciferasa. Las células PC3 se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-21 o un sitio diana de coincidencia errónea y LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR. Los nucleótidos LNA se indican con óvalos y los residuos de ADN se indican con barras.
Figura 8. Evaluación de la especificidad del antagonismo de miR-21 mediante un LNA-antimiR de 8 unidades en células HeLa usando un ensayo indicador de luciferasa. Las células HeLa se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta o un sitio diana de coincidencia errónea para miR-21 y LNA-antimiR (SEC ID Nº 3205) o un oligo control de coincidencia errónea de LNA de 8 unidades (SEC ID Nº 3218) a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNAantimiR. Las coincidencias erróneas se indican con óvalos rellenos.
Figura 9. Evaluación de la longitud más corta posible de un LNA-antimiR modificado con LNA que media en el antagonismo eficaz de miR-21. Las células HeLa se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta o de coincidencia errónea para miR-21 y los LNA-antimiR a diferentes concentraciones (SEC ID Nº 3209 =6 unidades y SEC ID Nº 3210=7 unidades). Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 10. Evaluación de la longitud de LNA-antimiR sustituidos completamente con LNA que antagonizan miR-21. Las células HeLa se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta o de coincidencia errónea para miR-21 y los LNA-antimiR a diferentes concentraciones (SEC ID Nº 3211 =9 unidades y SEC ID Nº 3212=10 unidades, SEC ID Nº 3213= 12 unidades y SEC ID Nº 3214= 14 unidades). Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 11. Determinación de la posición más óptima para un LNA-antimiR de 8 unidades dentro de la secuencia de reconocimiento de la diana de miR. Las células HeLa se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta o de coincidencia errónea para miR-21 y los LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 12. Validación de la interacción de la Pdcd4-3'-UTR y miR-21 mediante el LNA-antimiR de 8 unidades de SEC ID Nº 3205. Las células HeLa se co-transfectaron con un plásmido indicador de la luciferasa que contiene parte de la 3'UTR del gen de Pdcd4 y LNA-antimiR a concentraciones diferentes (SEC ID Nº 3205= 8 unidades, coincidencia perfecta; SEC ID Nº 3218= 8 unidades, coincidencia errónea; SEC ID Nº 3204= 15 unidades; mezcla de LNA/ADN, SEC ID Nº 3220= 15 unidades, gápmero). Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran las proporciones de renilla/luciérnaga que se han normalizado frente a 0 nM. También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 13. Comparación de un LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3207) con un LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3206) en el antagonismo de miR-155 en células RAW de ratón. Las células RAW de ratón se cotransfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen una coincidencia perfecta para miR-155 y los diferentes LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana de miR155 (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-155 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 14. Evaluación de c/EBP. Evaluación de /EBPer LNA-antimiR (SEC ID Nº 3207) con un LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3206) en el antagonismo de miR-155 en células RAW de ratón. Las células RAW de ratón se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen una coincidencia perfecta para miR-155 y the diffter 20 horas, se recogieron las células y se realizó un análisis de transferencia de tipo western de los extractos proteicos de las células RAW. Se indican las diferentes isoformas de c/EBPβ y las proporciones calculadas en c/EBPβ LIP y beta-tubulina se muestran más adelante.
Figura 15. Antagonismo de miR-106b por un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3221) o por una mezcla de antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3228). Las células HeLa se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen una coincidencia perfecta para miR-1 06b y los diferentes LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios de cuatro duplicados en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana en miARN (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-106b y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 16. Antagonismo de miR-19b por un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3222) o por una mezcla de antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3229). Las células HeLa se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen una coincidencia perfecta para miR-19a y los dos LNAantimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios de cuatro duplicados en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana en miR-19a (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-19a y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 17. Presentación esquemática que muestra las secuencias de miR-221 y miR-222 maduras. En el cuadrado se muestra la secuencia semilla (7 unidades) que está conservada en ambas secuencias de miARN.
Figura 18. Objetivo la familia de microARN usando LNA-antimiR cortos completamente sustituidos con LNA. Las células PC3 se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa para miR-221 y miR-222 por separado o juntos y con los diferentes LNA-antimiR a concentraciones variables. En la co-transfectación con los LNA-antimiR (15 unidades) SEC ID Nº 3223 (contra miR-221) y SEC ID Nº 3224 (contra miR-222), la concentración total fue 2 nM (1 nM cada uno), mientras que en la transfección de las células con la SEC ID Nº 3225 (7 unidades), las concentraciones fueron 0, 1, 5, 10 o 25 nM. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana en miARN (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-221/222 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 19. Evaluación de los niveles de la proteína p27 como lectura funcional del antagonismo de la familia miR221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225. Las células PC3 se transfectaron con el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225 dirigido a miR-221 y miR-222 a concentraciones variables. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midieron los niveles proteicos en una transferencia de tipo western. Se muestran las proporciones de p27/tubulina.
Figura 20. Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) frente a LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3204) y una de 8 unidades con 2 coincidencias erróneas (SEC ID Nº 3218) en células HepG2 usando un ensayo indicador de luciferasa. Las células HepG2 se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta miR-21 y LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 21. Validación de la interacción de la Pdcd43'-UTR y miR-21 mediante el LNA-antimiR de 8 unidades de SEC ID Nº 3205 frente al de 15 unidades (SEC ID Nº 3204) y una de 8 unidades con dos coincidencias erróneas (SEC ID Nº 3218). Las células HuH-7 se co-transfectaron con un plásmido indicador de luciferasa que contiene parte de la 3'UTR del gen Pdcd4, pre-miR-21 (10 nM) y LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (=control). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR-21 y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 22. El antagonismo de miR-21 o la SEC ID Nº 3205 conduce a mayores niveles de la proteína Pdcd4. Las células HeLa se transfectaron con LNA-antimiR 5 mM SEC ID Nº 3205 (coincidencia perfecta) o el LNA de SEC ID Nº 3219 mezclado (8 unidades) o la SEC ID Nº 3218 (coincidencia errónea de 8 unidades). Las células se recogieron tras 24 horas y se sometieron a transferencia de tipo western con anticuerpo frente a Pdcd4.
Figura 23. Niveles de ALT y AST en ratones tratados con la SEC ID Nº 3205 (coincidencia perfecta) o la SEC ID Nº 3218 (control de coincidencia errónea). Se sacrificó a los ratones tras 14 días y después de recibir 25 mg/kg en días alternos.
Figura 24. Evaluación de los niveles de la proteína PU.1 como lectura funcional del antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR corto (SEC ID Nº 3207). Las células THP-1 se co-transfectaron con pre-miR-155 (5 nmol) y diferentes oligonucleótidos de LNA (5 nM) y se añadió LPS 100 ng/ml. Tras 24 horas se recogieron las células y se realizó análisis de transferencia de tipo western de los extractos proteicos de las células THP-1. Se indican la PU.1 y la tubulina.
Figura 25. Evaluación de los niveles de la proteína p27 como lectura funcional del antagonismo de la familia miR221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225. Las células PC3 se transfectaron con el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225 dirigido a miR-221 y miR-222 y un LNA mezclado control a 5 y 25 nM. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midieron los niveles proteicos en una transferencia de tipo western. Se muestran las proporciones de p27/tubulina.
Figura 26. La eliminación de miR-221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225 (coincidencia perfecta) reduce la formación de colonias en agar blando en células PC3. Las células PC3 se transfectaron con 25 nM del LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225 dirigido a miR-221 y miR-222 o control mezclado de 7 unidades (SEC ID Nº 3231). Tras 24 horas, se recogieron las células y se sembraron en agar blando. Tras 12 días se contaron las colonias. Se ha realizado un experimento por triplicado.
Figura 27. Visión general de la familia let-7 humana y de los antagonistas analizados. (superior) Las secuencias representan el miARN maduro para cada miembro y el recuadro representa los nucleótidos 2-16, las posiciones normalmente antagonizadas por LNA-antimiR. Las columnas de la derecha muestran el número de diferencias de nucleótidos comparados con let-7a, dentro de la semilla (S: posición 2-8), semilla extendida (SE; posición 2-9) y la secuencia restante típicamente objetivo de LNA-antimiR (NE; posición 9-16), respectivamente. Los nucleótidos con colores invertidos están alterados en comparación con let-7a. (inferior) Resumen de los antagonistas analizados contra la familia let-7, incluida la información sobre el diseño, la longitud y las dianas perfectamente complementarias. Todos los compuestos están completamente fosforotiolados.
Figura 28. Evaluación del antagonismo de let-7 por seis LNA-antimiR diferentes en células HuH-7 usando un ensayo sensor de luciferasa. Las células Huh-7 se co-transfectaron con plásmidos sensores de luciferasa que contienen una HMGA2 3'UTR parcial (con cuatro sitios de unión en let-7), con o sin un precursor de let-7a (barras de color gris y negro, respectivamente) y con 6 LNA-antimiR diferentes a concentraciones crecientes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestra la media de las proporciones de renilla/luciérnaga para mediciones por duplicado y desviaciones estándar para cada ensayo. Dentro de cada grupo de LNA-antimiR todas las proporciones se han normalizado al promedio de pocillos que no contienen precursor de let-7a (barras negras).
Figura 29. Resultados de luciferasa de células Huh-7 transfectadas con el plásmido sensor con HMGA2 3'UTR, LNAantimiR de SEC ID Nº 3226 (izquierda) y la SEC ID Nº 3227 (derecha), y pre-miR para let-7a (A), let-7d (B), let-7e (C), y let-7i (D). Las barras grises indican la desrepresión diana tras la preinclusión de miR, mientras que las barras control negras representan el nivel equivalente sin adición de pre-miR. Cada proporción se basa en mediciones por cuadruplicado y se han normalizado frente al promedio de pocillos que no contienen precursor (barras negras) dentro de cada grupo de tratamiento.
Figura 30. Resultados de luciferasa de células HeLa transfectadas con el plásmido sensor con HMGA2 3'UTR o vector control y el LNA-antimiR de SEC ID Nº 3227 a varias concentraciones. Cada proporción se basa en mediciones por cuadruplicado normalizadas frente al vector control vacío sin tratar (0 nM) (psi-CHECK-2; barras grises).
Figura 31. Evaluación del antagonismo de miR-21 por el de 8 unidades (nº 3205) en células HCT116 usando un ensayo sensor de luciferasa. Las células HCT116 se co-transfectaron con plásmidos sensores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-21 (barras grises) y LNA-antimiR y oligonucleótidos control a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestra un ejemplo típico de dos en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM (=barras negras).
Figura 32. La silenciación de miR-21 por el LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205 reduce la formación de colonias en agar blando en células PC3. Las células PC3 se transfectaron con 25 nM del LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205 dirigido a miR-21. Tras 24 horas se recogieron las células y se sembraron en agar blando. Tras 12 días se contaron las colonias. Se muestra la media de tres experimentos distintos, cada uno realizado por triplicado y normalizados frente al control 0 nM (es decir, transfección pero sin LNA). p=0,01898 para el nº 3205.
Figura 33. La eliminación de miR-21 por el LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205 reduce la formación de colonias en agar blando en células HepG2. Las células HepG2 se transfectaron con 25 nM del LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205 dirigido a miR-21. Tras 24 horas se recogieron las células y se sembraron en agar blando. Tras 17 días se contaron las colonias. Se muestra la media de tres duplicados de un experimento (barras= SEM).
Figura 34. Cierre de heridas en la línea celular invasiva de próstata humana PC3 tras tratamiento con el nº 3205. (A) Las células PC3 se transfectaron el día 3 con LNA-antimiR y oligonucleótidos control a 25 nM, nº 3205 (8 unidades, coincidencia perfecta) y el nº 3219 (8 unidades, coincidencia errónea) y al día siguiente se realizó un raspado. Se realizaron fotos tras 24 horas con el fin de controlar la migración. (B) El área de cada punto de tiempo se ha medido con el programa de software Image J y se normalizaron frente al correspondiente punto de tiempo a 0 horas.
Figura 35. Evaluación de la longitud de LNA-antimiR completamente sustituido con LNA antagonista de miR-155. Las células RAW se co-transfectaron con plásmidos indicadores de luciferasa que contienen un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-155 y oligonucleótidos LNA-antimiR a concentraciones diferentes. Tras 24 horas, se recogieron las células y se midió la actividad de luciferasa. Se muestran los valores medios (barras = SEM) de tres experimentos independientes en los que las proporciones de renilla/luciérnaga se han normalizado frente al vector vacío 0 nM sin sitio diana (= simulado). También se muestra una presentación esquemática de la secuencia de miR y el diseño y la posición de os LNA-antimiR.
Figura 36. Unión de LNA-antimiR-21 (nº 3205) marcado con 5'-FAM a proteínas plasmáticas de ratón. (A)% del compuesto LNA-antimiR-21 no unido como función de la concentración de oligonucleótidos en plasma de ratón. (B) Concentración del compuesto LNA-antimiR-21 no unido nº 3205 como función de la concentración del nº 3205 en plasma de ratón.
Figura 37. Cuantificación de los niveles de la proteína Ras mediante análisis de transferencia de tipo western.
A. Imagen en gel que muestra las proteínas Ras y tubulina (patrón interno) en muestras de pulmón y riñón tratadas (anti-let-7, 8 unidades) frente a no tratadas (solución salina). B Cuantificación de los niveles de la proteína Ras en pulmón y riñón, respectivamente, de ratones tratados con LNA-antimiR (barras negras), normalizados frente a controles de solución salina (barras grises) usando tubulina como control de igual carga.
B. La silenciación de miR-21 por el nº 3205 conduce a mayores niveles de la proteína Pdcd4 in vivo.
C. En los ratones se inyectó solución salina o LNA-antimiR (nº 3205) 25 mg/kg durante 14 días en días alternos, con un total de 5 dosis. Se sacrificó a los ratones y se aisló la proteína del riñón y se sometió a análisis de transferencia de tipo western con anticuerpo frete a la proteína Pdcd4. A. Imagen en gel que muestra las proteínas Pdcd4 y Gapdh (patrón interno) en muestras de riñón tratadas (antimiR-21; 8 unidades) frente a no tratadas (solución salina) (M1, ratón 1; M2, ratón 2). B. Cuantificación de los niveles de la proteína Pdcd4 en riñones de ratones tratados con LNA-antimiR (barras de color gris oscuro) normalizados frente a la media de controles de solución salina equivalentes (barras de color gris claro) usando Gapdh como control de carga.
Descripción detallada de la invención
A partir del sector de reactivos in vitro se conocen oligonucleótidos cortos que incorporan LNA (véase, por ejemplo, los documentos WO 2005/098029 y WO 2006/069584). No obstante, las moléculas diseñadas para uso diagnóstico
o reactivo son muy diferentes en términos de diseño a las diseñadas para uso in vivo o farmacéutico. Por ejemplo, los nucleótidos terminales de los oligos reactivos normalmente no son LNA, sino ADN, y los enlaces internucleosídicos normalmente son distintos a fosforotioato, el enlace preferido para usar en los oligonucleótidos de la presente invención. Por tanto, la invención proporciona una nueva clase de oligonucleótidos (denominados en el presente documento oligómeros) per se.
Las siguientes realizaciones hacen referencia a ciertas realizaciones del oligómero de la invención, que se pueden usar en una composición farmacéutica. Los aspectos que se refieren al oligómero pueden también hacer referencia a secuencias nucleotídicas contiguas y al contrario.
El oligómero
El oligómero de la invención es un oligonucleótido monocatenario que comprende al menos un 70 % de análogos nucleotídicos de LNA, que forman parte de, o la totalidad de la secuencia nucleotídica contigua del oligonucleótido, y el oligómero comprende al menos un enlace fosforotioato. La secuencia nucleotídica del oligómero consiste en una secuencia nucleotídica contigua.
El término “oligonucleótido” (o simplemente “oligo”), que se usa de forma intercambiable con el término "oligómero",
hace referencia en el contexto de la presente invención a una molécula formada mediante enlace covalente de dos o más nucleótidos. Cuando se usa en el contexto del oligonucleótido de la presente invención (también denominado oligonucleótido monocatenario), el término “oligonucleótido” puede tener, en una realización, por ejemplo entre 7 - 10 nucleótidos, tal como en realizaciones individuales, 7, 8, 9 o 10.
El término “nucleótido” hace referencia a nucleótidos, tales como ADN y ARN, y análogos nucleotídicos. Debe reconocerse que, en algunos aspectos, el término base nucleotídica también se puede usar para hacer referencia a un nucleótido que puede ser natural o no; a este respecto, el término base nucleotídica y nucleótido se pueden usar de forma intercambiable en el presente documento.
En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica contigua consiste en 7 análogos nucleotídicos. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica contigua consiste en 8 análogos nucleotídicos. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica contigua consiste en 9 análogos nucleotídicos.
Al menos un 70 % de los nucleótidos del oligómero son nucleótidos LNA, tal como al menos aproximadamente el 75 %, tal como al menos aproximadamente el 80 %, tal como al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, tal como al menos aproximadamente el 95 %, o tal como el 100 %. También será evidente que el oligonucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que consiste únicamente en análogos nucleotídicos. Idóneamente, el oligómero puede comprender al menos cinco monómeros de LNA, tal como 6, 7, 8, 9 o 10 monómeros de LNA. Como se describe más adelante, la secuencia de nucleótidos contigua puede consistir únicamente en unidades de LNA (incluidos grupos de enlace, tal como enlaces fosforotioato) o puede consistir en unidades de LNA o ADN, o LNA y otros análogos nucleotídicos. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua comprende uno o dos nucleótidos de ADN, siendo el resto de los nucleótidos LNA.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en 6 análogos nucleotídicos de LNA y un único nucleótido de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en 7 análogos nucleotídicos de LNA y un único nucleótido de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en 8 análogos nucleotídicos de LNA y un único nucleótido de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en 9 análogos nucleotídicos de LNA y un único nucleótido de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en 7 análogos nucleotídicos de LNA y dos nucleótidos de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en 8 análogos nucleotídicos de LNA y dos nucleótidos de ADN.
El oligómero puede consistir en la secuencia de nucleótidos contigua.
En una forma de realización especialmente preferida, todos los análogos nucleotídicos son LNA. En una forma de realización preferida adicional, todos los nucleótidos del oligómero son LNA. En una forma de realización preferida adicional, todos los nucleótidos del oligómero son LNA y todos los grupos de enlaces internucleosídicos son fosforotioato.
En el presente documento, con la expresión “base nitrogenada” se pretende abarcar purinas y pirimidinas, tal como las bases nucleotídicas de ADN A, C T y G, las bases nucleotídicas de ARN A, C, U y G, así como bases nucleotídicas que no son de ADN/ARN, tales como 5-metilcitosina, isocitosina (MeC), isocitosina, pseudocitosina, 5bromouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinil-6-fluorouracilo, 5-metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propin-7-deazaadenina, 7-propin-7-deazaguanina y 2-cloro-6-aminopurina, en concreto MeC. Se entenderá que la selección actual de la base nucleotídica no ADN/ARN dependerá del correspondiente nucleótido (o coincidente) presente en la hebra del microARN al que se pretende dirigir el oligonucleótido. Por ejemplo, en el caso en el que el correspondiente nucleótido sea G, normalmente será necesario seleccionar una base nucleotídica no ADN/ARN que sea capaz de establecer puentes de hidrógeno con G. En este caso específico, en el que el nucleótido correspondiente es G, un ejemplo típico de una base nucleotídica no ADN/ARN es MeC.
Debe reconocerse que el término en “una realización” no necesariamente debe limitarse a hacer referencia a una realización específica sino que puede hacer referencia a una característica que puede estar presente en “algunas realizaciones” o incluso como característica genérica de la invención. Asimismo, el uso de la expresión “algunas realizaciones” puede usarse para describir una característica de una realización específica o un conjunto de
características, o incluso como una característica genérica de la invención.
Los términos “correspondiente a” y “corresponde a” hacen referencia a la comparación entre la secuencia de
nucleótidos del oligómero o la secuencia de nucleótidos contigua (una primera secuencia) y la secuencia de nucleótidos equivalente de una secuencia adicional seleccionada de i) una subsecuencia de la complementaria inversa del ácido nucleico microARN diana (tal como una diana de microARN seleccionada de las SEC ID 40 - SEC ID 76, y/o ii) la secuencia de nucleótidos proporcionada en el presente documento, tal como el grupo que consiste en las SEC ID Nº 977 - 1913 o las SEC ID Nº 1914 - 2850 o las SEC ID Nº 2851 - 3787. Los análogos nucleotídicos se comparan directamente con sus nucleótidos equivalentes o correspondientes. Una primera secuencia que corresponde a una secuencia adicional en i) o ii) normalmente es idéntica a la secuencia sobre la longitud de la primera secuencia (tal como la secuencia de nucleótidos contigua).
Cuando se hace referencia a la longitud de una molécula nucleotídica como se hace referencia en el presente documento, la longitud corresponde al número de unidades monoméricas, es decir nucleótidos, con independencia de si las unidades monoméricas son nucleótidos o análogos nucleotídicos. Con respecto a los nucleótidos o bases nucleotídicas, los términos monómero y unidad se usan de forma intercambiable en el presente documento.
Debe entenderse que cuando el término “aproximadamente" se usa en el contexto de valores o intervalos de valores específicos, la divulgación se leerá de modo que incluya el valor o intervalo de valores específico al que se hace referencia.
Como se usa en el presente documento, “hibridación” significa unión de hidrógeno, que puede ser unión de Watson-Crick, de Hoogsteen, de hidrógeno de Hoogsteen inverso, etc. entre nucleósidos o bases nucleotídicas complementarias. Las cuatro bases nucleotídicas que normalmente se encuentran en el ADN son G, A, T y C, de las que G se aparea con C y A se aparea con T. En el ARN, la base nucleotídica T se sustituye por la base nucleotídica uracilo (U), que se aparea con A. Los grupos químicos en las bases nucleotídicas que participan en la formación del dúplex estándar constituyen la cara de Watson-Crick. Hoogsteen demostró un par de años después que las bases nucleotídicas de purina (G y A), además de su cara de Watson-Crick, tienen una cara de Hoogsteen que se puede reconocer desde el exterior de un dúplex y usarse para unir los oligonucleótidos de pirimidina a través de puentes de hidrógeno formando de este modo una estructura de triple hélice.
En el contexto de la presente invención, “complementario” se refiere a la capacidad para aparear de forma precisa
dos secuencias de nucleótidos entre sí. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición determinada de un oligonucleótido es capaz de unirse a través de hidrógeno con un nucleótido en la posición correspondiente de una molécula de ADN o de ARN, el oligonucleótido y el ADN o ARN se consideran complementarios entre sí en dicha posición. La hebra de ADN o ARN se consideran complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleótidos en el oligonucleótido pueden formar puentes de hidrógeno con los nucleótidos correspondientes en el ADN o ARN diana para permitir la formación de un complejo estable. Para ser estable in vitro o in vivo, la secuencia de un oligonucleótido no tiene que ser complementaria al 100 % de su microARN diana. Por tanto, las expresiones "complementario" y “específicamente hibridizable” implican que el oligonucleótido se une con la suficiente fuerza y de forma específica a la molécula diana para proporcionar la interferencia deseada con la función normal del ARNm diana mientras que no afecta a la función de los ARN no diana. No obstante, en una realización preferida, el término complementario deberá significar complementario al 100 % o completamente complementario.
En un ejemplo preferido, el oligonucleótido de la invención es complementario al 100 % de una secuencia de miARN, tal como una secuencia de microARN humano, o una de las secuencias de microARN a las que se hace referencia en el presente documento.
En un ejemplo preferido, el oligonucleótido de la invención comprende una secuencia contigua, que es complementaria al 100 % con la región semilla de la secuencia de microARN humano.
Preferentemente, el término “microARN” o “miARM”, en el contexto de la presente invención, significa un ARN
oligonucleótido con una longitud de entre 18 y 25 nucleótidos. En término funcionales, los miARN normalmente son moléculas de ARN endógeno regulador.
Las expresiones "microARN diana" o "miARN diana" hacen referencia a un microARN con una función biológica en la enfermedad humana, por ejemplo un miARN oncogénico regulado por aumento o un miARN supresor tumoral en cáncer, siendo de este modo una diana para la intervención terapéutica de la enfermedad en cuestión.
Las expresiones “gen diana” o “ARNm diana” hace referencia a ARNm reguladores dianas de microARN, en los que dicho “gen diana” o “ARNm diana” está regulado postranscripcionalmente por el microARN basado en una complementariedad perfecta o casi perfecta entre el miARN y su sitio diana, lo que tiene como resultado una escisión del ARNm diana, o una complementariedad limitada, a menudo conferida a una complementariedad entre la denominada secuencia semilla (nucleótidos 2-7 del miARN) y el sitio diana que tiene como resultado una inhibición de la traducción del ARNm diana.
En el contexto de la presente invención, el oligonucleótido es monocatenario, esto se refiere a la situación en la que el oligonucleótido está en ausencia de un oligonucleótido complementario, es decir no es un complejo oligonucleotídico bicatenario, tal como un siARN. En una realización, la composición de acuerdo con la invención no comprende un oligonucleótido adicional que tiene una región de complementariedad con el oligómero de 5 o más, tal como 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos consecutivos, tal como ocho o más.
Longitud
Sorprendentemente, los inventores han encontrado que dichos “antimiR” cortos proporcionan una mejor inhibición específica de los microARN in vivo, al tiempo que conservan una considerable especificidad por el microARN diana. Se ha encontrado como beneficio adicional la capacidad para inhibir varios microARN de forma simultánea debido a la conservación de secuencias cortas homólogas entre especies de microARN, tal como las regiones diana como se describe en el presente documento. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que es particularmente ventajoso tener oligonucleótidos cortos de 7, 8, 9, 19 nucleótidos, tal como de 7, 8 o 9 nucleótidos.
Secuencias
La secuencia de nucleótidos contigua es complementaria (tal como complementaria al 100 %, es decir perfectamente complementaria) a una región correspondiente de una secuencia de microARN (miARN) de mamífero, humano o virus, preferentemente una secuencia de miARN humana o de virus.
La secuencia de microARN puede ser, idóneamente, un microARN maduro. En algunas realizaciones, el microARN puede ser un precursor de microARN.
La secuencia de microARN humano se puede seleccionar de las SEC ID Nº 1 - 558, como se divulga en el documento WO 2008/046911. Como se describe en el documento WO 2008/046911, estos microARN están relacionados con cáncer.
La secuencia de microARN de virus, puede seleccionarse, en algunas realizaciones, del grupo que consiste en el virus 1 del herpes simple, virus herpes asociados con el sarcoma de Kaposi, virus de Epstein Barr y citomegalovirus humano.
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria (tal como complementaria al 100 %) de una región correspondiente de una secuencia de miARN seleccionada del grupo de miARN indicado en la tabla 1. La tabla 1 proporciona oligómeros de 7 unidades, 8 unidades y 9 unidades, dirigidos a microARN diana humanos o virales publicados en la miRBase (versión 12.0 - http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/).
En algunas realizaciones, los oligómeros de acuerdo con la invención pueden consistir en, o comprender, una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria con una secuencia de microARN correspondiente seleccionada del grupo que consiste en miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR221, miR-222, miR-375.
Por tanto, en una realización, el miARN (es decir, el ARNmi diana) se selecciona del grupo que consiste en miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222 y miR-375.
En una realización, el miARN diana es un miembro del clúster de miR 17 - 92, tal como miR 17, miR 106a, miR 106b, miR 18, miR 19a, miR 19b/1, miR 19b/2, miR20/93, miR92/1, miR92/2 y miR25.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región correspondiente de una secuencia de microARN (miARN) seleccionada del grupo que consiste en miR-21, miR-155, miR-221, mir-222 y mir-122.
En algunas realizaciones, dicho miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-1, miR-10miR-29, miR-125b, miR-126, miR-133, miR-141, miR-143, miR-200b, miR-206, miR-208, miR-302, miR-372, miR-373, miR-375, y miR520c/e.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región correspondiente de una secuencia de microARN (miARN) presente en el clúster de miR 17 - 92, tal como un microARN seleccionado del grupo que consiste en miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b, miR-18a/b, miR-19a/b, miR-25, miR-92a, miR
363.
En una realización, el miARN (es decir, el miARN diana) es miR-21, tal como mhsa-miR-21. En una realización, el miARN (es decir, el miARN diana) es miR-122, tal como hsa-miR-122. En una realización, el miARN (es decir, el miARN diana) es miR-19b, tal como hsa-miR-19b. En una realización, el miARN (es decir, el miARN diana) es miR155, tal como hsa-miR-155. En una realización, el miARN (es decir, el miARN diana) es miR-375, tal como hsa-miR
375. En una realización, el miARN (es decir, el miARN diana) es miR-375, tal como hsa-miR-106b.
Idóneamente, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región correspondiente de un microARN, tal como un hsa-miR, seleccionado del grupo que consiste en 19b, 21, 122, 155 y 375.
La región semilla y los seedmeros
Los inventores han encontrado que oligonucleótidos monocatenarios cortos cuidadosamente diseñados que comprenden o consisten en análogos nucleotídicos, tales como análogos nucleotídicos de alta afinidad tales como unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA), muestran una silenciación significativa de microARN, lo que tiene como resultado menores niveles de microARN. Se descubrió que la unión estrecha de dichos oligonucleótidos a la denominada secuencia semilla, normalmente los nucleótidos de 2 a 8 o de 2 a 7, contando desde el extremo 5’, de los microARN diana, era importante. El nucleótido 1 de los microARN diana es una base no apareada y, con gran probabilidad, escondido en una cavidad de unión en la proteína Ago 2. Sin desear quedar anclado a teoría específica alguna, los presentes inventores consideran que seleccionando las secuencias de la región semilla, en particular con oligonucleótidos que comprenden LNA, preferentemente unidades de LNA en la región que es complementaria a la región semilla, el dúplex entre miARN y el oligonucleótido es particularmente eficaz sobre los miARN diana, evitando los efectos diana y posiblemente proporcionando una característica adicional que evita la función del miARN dirigida a RISC.
Los inventores han descubierto que la silenciación del microARN está todavía más potenciada cuando los
oligonucleótidos monocatenarios modificados con LNA no contienen un nucleótido en el extremo 3’ correspondiente
a este nucleótido 1 no apareado. Además se descubrió que al menos dos unidades de LNA en el extremo 3' de los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención hacían dichos oligonucleótidos altamente resistentes a la nucleasa.
En una realización, el primero o el segundo nucleótido en 3’ del oligómero corresponden al segundo nucleótido en 5’ de la secuencia del microARN y puede ser un análogo nucleotídico, tal como LNA.
En una realización, las unidades nucleotídicas 1 a 6 (ambas incluidas) del oligómero, medidas desde la región en el extremo 3' del oligómero, son complementarias a la secuencia de la región semilla del microARN y todas pueden ser análogos nucleotídicos, tale como LNA.
En una realización, las unidades nucleotídicas 1 a 7 (ambas incluidas) del oligómero, medidas desde la región en el extremo 3' del oligómero, son complementarias a la secuencia de la región semilla del microARN y todas pueden ser análogos nucleotídicos, tale como LNA.
En una realización, las unidades nucleotídicas 2 a 7 (ambas incluidas) del oligómero, medidas desde la región en el extremo 3' del oligómero, son complementarias a la secuencia de la región semilla del microARN y todas pueden ser análogos nucleotídicos, tale como LNA.
En una realización, el oligómero comprende al menos una unidad análoga nucleotídica, tal como al menos una unidad de LNA, en una posición que está dentro de la región complementaria a la región semilla del miARN. En una realización, el oligómero puede comprender entre una y 6 o entre 1 y 7 unidades de análogos nucleotídicos, tal como entre 1 y 6 y entre 1 y 7 unidades de LNA, en una posición que está dentro de la región complementaria a la región semilla del miARN.
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria (tal como complementaria al 100 %) a la secuencia semilla de dicho microARN.
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de las secuencias del seedmero enumeradas en la tabla 1.
En una realización, el nucleótido en 3’ del seedmero forma el nucleótido más en 3’ de la secuencia de nucleótidos contigua, en la que la secuencia de nucleótidos contigua puede comprender, opcionalmente, uno o dos nucleótidos adicionales en 5’ de la secuencia del seedmero.
En una realización, el oligómero no comprende un nucleótido que corresponde al primer nucleótido presente en la secuencia de microARN contando desde el extremo 5'.
En una realización, el oligonucleótido de acuerdo con la invención no comprende un nucleótido en el extremo 3’ que corresponda al primer nucleótido en el extremo 5’ del microARN diana.
Análogos nucleotídicos
De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que es particularmente ventajoso tener oligonucleótidos cortos de 7, 8, 9, 19 nucleótidos, tal como de 7, 8 o 9 nucleótidos, en los que al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o tal como el 100 % de las unidades nucleotídicas del oligómero son nucleótidos de LNA.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 7, 8 o 9 nucleótidos y comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria de una región semilla de un microARN humano o viral y en el que al menos el 75 %, tal como al menos el 80 %, tal como al menos el 85 %, tal como al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, tal como al menos el 100 %, de los nucleótidos son unidades nucleotídicas de ácido nucleico bloqueado (LNA).
En dichos oligómeros, al menos uno de los grupos de enlace es un enlace fosforotioato.
En una realización, todas las unidades nucleotídicas de la secuencia de nucleótidos contigua son unidades nucleotídicas de LNA.
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 7, 8, 9 o 10 unidades nucleotídicas de LNA, preferentemente contiguas.
En una realización adicional preferida, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 7, 8 o 9 nucleótidos y comprende una secuencia contigua de nucleótidos que es complementaria a una región semilla de un microARN humano o viral y en el que al menos el 80 % de los nucleótidos son LNA y en el que al menos el 80 %, tal como el 85 %, tal como el 90 %, tal como el 95 %, tal como el 100 %, de los enlaces internucleotídicos son enlaces fosforotioato. Se reconocerá que la secuencia contigua de nucleótidos del oligómero (un seedmero) puede extenderse más allá de la región semilla.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 7 nucleótidos, todos LNA.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 8 nucleótidos, de los cuales hasta 1 nucleótido puede ser distinto de LNA. En algunas realizaciones, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 9 nucleótidos, de los cuales hasta 1 o 2 nucleótidos pueden ser distintos de LNA. En algunas realizaciones, el oligonucleótido de la invención tiene una longitud de 10 nucleótidos, de los cuales hasta 1, 2 o 3
nucleótidos pueden ser distintos de LNA. Los nucleótidos “distintos de LNA” pueden ser, por ejemplo, ADN o análogos nucleotídicos sustituidos en 2’.
Los análogos nucleotídicos de alta afinidad son análogos nucleotídicos que tienen como resultado oligonucleótidos que tienen una estabilidad térmica del dúplex con un nucleótido de ARN complementario mayor que la afinidad de unión de un nucleótido de ADN equivalente. Esto se puede determinar midiendo la Tm.
En algunas realizaciones se seleccionan otras unidades de análogos nucleotídicos presentes en la secuencia de nucleótidos contigua opcionalmente de forma independiente, del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN, unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN, unidad PNA, unidad HNA, unidad INA y una unidad 2’MOE ARN.
En algunas realizaciones, las otras unidades de análogos nucleotídicos presentes en la secuencia de nucleótidos contigua se seleccionan, opcionalmente de forma independiente, del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN, unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN y una unidad 2’MOE ARN.
El término 2’-fluoro-ADN hace referencia a un análogo de ADN con una sustitución a flúor en la posición 2' (2'F). 2’fluoro-ADN es una forma preferida de 2’-fluoro-nucleótido.
En algunas realizaciones, el oligómero comprende al menos 5 unidades de análogos nucleotídicos, tal como al menos 6 unidades de análogos nucleotídicos, tal como al menos 7 unidades de análogos nucleotídicos, tal como al menos 8 unidades de análogos nucleotídicos, tal como al menos 9 unidades de análogos nucleotídicos, tal como 10 unidades de análogos nucleotídicos.
El oligómero comprende al menos 5 unidades LNA, tal como al menos 6 unidades LNA, tal como al menos 7 unidades LNA, tal como al menos 8 unidades LNA, tal como al menos 9 unidades LNA, tal como 10 unidades LNA.
En una realización en la que al menos uno de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, es citosina o guanina, tal como entre 1 - 10 de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, es citosina o guanina, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, es citosina o guanina.
En una realización, al menos dos de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, son citosina o guanina. En una realización, al menos tres de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, son citosina o guanina. En una realización, al menos cuatro de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, son citosina o guanina. En una realización, al menos cinco de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, son citosina o guanina. En una realización, al menos seis de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, son citosina o guanina. En una realización, al menos siete de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, son citosina o guanina. En una realización, al menos ocho de los análogos nucleotídicos, tal como unidades LNA, son citosina o guanina.
En una realización preferida, los análogos nucleotídicos tienen una estabilidad térmica del dúplex para un nucleótido de ARN complementario mayor que la afinidad de unión de un nucleótido de ADN equivalente a dicho nucleótido de ARN complementario.
En una realización, los análogos nucleotídicos confieren mayor estabilidad en suero al oligonucleótido monocatenario.
5 Aunque las SEC ID específicas en el listado de secuencias y la tabla 1 hacen referencia a los oligómeros de monómeros de LNA con una estructura de fosforotioato (PS), se reconocerá que la invención también abarca el uso de otros análogos nucleotídicos y/o enlaces, en combinación con LNA y al menos un enlace PS. Como tal, la secuencia de nucleótidos (bases) que se muestra en el listado de secuencias puede ser LNA/PS o puede ser
10 oligómeros que comprenden una química estructural alternativa, tal como una química de azúcar/enlace, además de las unidades de LNA y el o los enlaces PS, al tiempo que conserva la misma secuencia de bases (A, T, C o G).
Aunque se prevé que otros análogos nucleotídicos, tales como nucleótidos 2’-MOE-ARN o 2'-fluoro, pueden ser útiles en los oligómeros de acuerdo con la invención, los oligómeros tienen al menos un 70 % de nucleótidos LNA.
15 El otro análogo nucleotídico puede ser un análogo de ADN tal como un análogo de ADN, en el que el grupo 2’-H está sustituido con una sustitución distinta a -OH (ARN), por ejemplo mediante sustitución con -O-CH3, - O-CH2-CH2O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH o -F. El otro análogo nucleotídico puede ser un análogo de ARN, tal como un análogo de ARN que se ha modificado en su grupo 2’-OH, por ejemplo mediante sustitución con un grupo distinto de -H (ADN), por ejemplo O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH
20 o -F.
LNA
Cuando se usan en el presente contexto, las expresiones “unidad de LNA”, “monómero de LNA”, “residuo de LNA”,
25 “unidad de ácido nucleico bloqueado” o “residuo de ácido nucleico bloqueado” hacen referencia aun análogo de nucleósido bicíclico. Las unidades de LNA se describen en, entre otros, los documentos WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 y WO 03/095467. La unidad de LNA puede
también definirse con respecto a su fórmula química. Por tanto, una “unidad de LNA”, como se usa en el presente
documento, tiene la estructura química mostrada en el Esquema 1 a continuación: 30
en el que X se selecciona del grupo que consiste en O, S y NRH, en la que RH es H o alquilo-C1-4; Y es (-CH2)r, en la que r es un número entero de 1-4; y B es una base nitrogenada.
En una realización preferida de la invención, r es 1 o 2, en particular 1, es decir una unidad de LNA preferida tiene la estructura química mostrada en el Esquema 2 siguiente:
40 en el que X y B son como se ha definido con anterioridad.
En una realización interesante, las unidades de LNA incorporadas en los oligonucleótidos de la invención se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste en unidades tio-LNA, unidades amino-LNA y unidades 45 oxi-LNA.
Por tanto, la unidad tio-LNA puede tener la estructura química mostrada en el Esquema 3 siguiente:
en el que B es como se ha definido anteriormente.
Preferentemente, la unidad tio-LNA está en su forma beta-D, es decir que tiene la estructura mostrada en 3A anterior, asimismo, la unidad amino-LNA puede tener la estructura química mostrada en el Esquema 4 siguiente:
10 en el que B y RH como se ha definido con anterioridad. Preferentemente, la unidad amino-LNA está en su forma beta-D, es decir que tiene la estructura mostrada en 4A anterior. 15 La unidad oxi-LNA puede tener la estructura química mostrada en el Esquema 5 siguiente:
en el que B es como se ha definido anteriormente.
20 Preferentemente, la unidad oxi-LNA está en su forma beta-D, es decir que tiene la estructura mostrada en 5A anterior. Como se ha indicado anteriormente, B es una base nitrogenada que puede ser de origen natural o no natural. Ejemplos específicos de bases nitrogenadas incluyen adenina (A), citosina (C), 5-metilcitosina (MeC), isocitosina, pseudocitosina, guanina (G), timina (T), uracilo (U), 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinil-6
25 fluorouracilo, 5-metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propin-7deazaadenina, 7-propin-deazaguanina y 2-cloro-6-aminopurina.
La expresión “unidad tio-LNA” hace referencia a una unidad de LNA en la que X en el Esquema 1 es S. Una unidad tio-LNA puede estar en forma beta-D y en forma alfa-L. Generalmente, se prefiere la forma beta-D de la unidad tio30 LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad tio-LNA se muestran en el Esquema 3 como los compuestos 3A y 3B, respectivamente.
El término “unidad amino-LNA” hace referencia a una unidad de LNA en la que X en el Esquema 1 es NH o NRH, en la que RH es hidrógeno o alquilo-C1-4. Una unidad amino-LNA puede estar tanto en forma beta-D como en forma alfa35 L. Generalmente, se prefiere la forma beta-D de la unidad amino-LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad amino-LNA se muestran en el Esquema 4 como los compuestos 4A y 4B, respectivamente.
La expresión “unidad oxi-LNA” hace referencia a una unidad de LNA en la que X en el Esquema 1 es O. Una unidad oxi-LNA puede estar en forma beta-D y en forma alfa-L. Generalmente, se prefiere la forma beta-D de la unidad oxi40 LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L de una unidad oxi-LNA se muestran en el Esquema 5 como los compuestos 5A y 5B, respectivamente.
En el presente contexto, con el término “alquilo C1-6” se quiere decir una cadena de hidrocarburo saturado lineal o ramificada, en la que las cadenas más largas tienen de uno a seis átomos de carbono, tal como metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, ventilo, isopentilo, neopentilo y hexilo. Con una cadena de hidrocarburo ramificada se pretende querer decir un alquilo-C1-6 sustituido en cualquier carbono con una cadena de hidrocarburo.
En el presente contexto, con el término “alquilo C1-4” se quiere decir una cadena de hidrocarburo saturado lineal o ramificada, en la que las cadenas más largas tienen de uno a cuatro átomos de carbono, tal como metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo. Con una cadena de hidrocarburo ramificada se pretende querer decir un alquilo-C1-4 sustituido en cualquier carbono con una cadena de hidrocarburo.
Cuando se usa en el presente documento, con el término “alcoxi-C1-6” se quiere decir alquiloxi-C1-6, tal como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentoxi, isopentoxi, neopentoxi y hexoxi.
En el presente contexto, con él término “alquenilo-C2-6” se pretende querer decir un grupo hidrocarburo lineal o ramificado que tiene de dos a seis átomos de carbono y que contiene uno o más dobles enlaces. Ejemplos ilustrativos de grupos alquenilo-C2-6 incluyen alilo, homo-alilo, vinilo, crotilo, butenilo, butadienilo, pentenilo, pentadienilo, hexenilo y hexadienilo. La posición de la insaturación (el doble enlace) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena carbonada.
En el presente contexto, con él término “alquinilo-C2-6” se pretende querer decir un grupo hidrocarburo lineal o ramificado que tiene de dos a seis átomos de carbono y que contiene uno o más triples enlaces. Ejemplos ilustrativos de grupos alquinilo-C2-6 incluyen acetileno, propinilo, butinilo, pentinilo y hexinilo. La posición de la instauración (el triple enlace) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena carbonada. Más de un enlace puede estar insaturado, de modo que el “alquinilo-C2-6” es un di-ino o enedi-ino, como conoce el experto en la técnica.
Al hacer referencia a la sustitución de una unidad de ADN por su correspondiente unidad de LNA en el contexto de
la presente invención, con la expresión “unidad de LNA correspondiente” se pretende decir que la unidad de ADN se
ha sustituido por una unidad de LNA que contiene la misma base nitrogenada que la unidad de ADN que se ha sustituido, por ejemplo la correspondiente unidad de LNA de una unidad de ADN que contiene la base nitrogenada A también contiene la base nitrogenada A. La excepción es que cuando una unidad de ADN contiene la base C, la correspondiente unidad de LNA puede contener la base C o la base MeC, preferentemente MeC.
En el presente documento, la expresión “unidad no LNA” hace referencia a un nucleósido diferente de una unidad de LNA, es decir la expresión “unidad no LNA” incluye una unidad de ADN así como una unidad de ARN. Una unidad no LNA preferida es una unidad de ADN.
Los términos “unidad”, “residuo" y “monómero” se usan de forma intercambiable en el presente documento.
La expresión “al menos uno” abarca un número entero mayor o igual a 1, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y así sucesivamente.
Con los términos “un” y “uno/una” como se usa sobre un nucleótido, un agente, una unidad de LNA etc. se pretende decir uno o más. En concreto, la expresión “un componente (tal como un nucleótido, un agente, una unidad de LNA
o similares) seleccionado del grupo que consiste en…” se pretende decir que se puede seleccionar uno o más de los componentes citados. Por tanto, expresiones como “un componente seleccionado del grupo que consiste en A, B y C” se pretende que incluyan todas las combinación de A, B y C, es decir A, B, C, A+B, A+C, B+C y A+B+C.
Enlaces internucleosídicos
Con la expresión "grupo de enlace internucleosídico” se pretende decir un grupo capaz de acoplar covalentemente dos nucleótidos, tal como entre unidades de ADN, entre unidades de ADN y análogos nucleotídicos, entre dos unidades no-LNA, entre una unidad no LNA y una unidad de LNA, y entre dos unidades de LNA etc. Ejemplos incluyen fosfato, grupos fosfodiéster y grupos fosforotioato.
En algunas realizaciones, al menos uno de los enlaces internucleosídicos en el oligómero es fosfodiéster. No obstante, para el uso in vivo se pueden preferir los enlaces fosforotioato.
Grupos de enlace internucleosídico típicos en los oligonucleótidos son grupos fosfato, pero estos se pueden reemplazar con grupos enlace internucleosídico que no sean fosfato. El oligonucleótido de la invención está modificado en su estructura del grupo de enlace internucleosídico, es decir el oligonucleótido modificado comprende un grupo de enlace internucleosídico que no es fosfato. De acuerdo con lo anterior, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención comprende al menos un grupo de enlace internucleosídico fosforotioato.
Ejemplos específicos de grupos de enlaces internucleosídicos que difieren de fosfato (-O-P(O)2-O-) incluyen -OP(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NR-CO-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, - O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, en los que RH se selecciona de hidrógeno o alquilo C1-4.
Cuando el grupo de enlace internucleosídico está modificado, el grupo de enlace internucleosídico es, preferentemente, un grupo fosforotioato (O-P(O,S)-O-). En una realización preferida, todos los grupos de enlace internucleosídico de los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención son fosforotioato.
Otro enlace internucleosídico se puede seleccionar del grupo que consiste: -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, "O"P(O)2"S", -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -OPO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, y/u otro enlace internucleosídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -SCH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, en los que RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4. Idóneamente, en algunas realizaciones se pueden preferir enlaces internucleosídicos que contienen azufre (S) como se ha indicado en lo que antecede. Los enlaces internucleosídicos se pueden seleccionar de forma independiente, o ser todos iguales, es decir enlaces fosforotioato. En una realización, al menos el 75 %, tal como el 80% u 85% o 90% o 95% o todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos contigua son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
Oligonucleótidos micromir dirigidos a más de un microARN
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a la correspondiente secuencia de al menos dos secuencias de miARN, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de miARN. El yso de una única base universal puede dejar dirigir un único oligómero de la invención a dos microARN independientes, de los que uno o los dos tienen una única coincidencia errónea en la región que corresponde al oligómero en la posición en la que está colocado el nucleótido universal.
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de al menos dos secuencias de la región semilla de miARN, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de la región semilla de miARN.
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a la correspondiente región de miR-221 y miR-222.
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a la región correspondiente de más de un miembro del clúster de miR-17-92, tal como dos o más o todos de miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b; o dos o más o todos de miR-25, miR-92a y miR-363..
En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria a 5'GCTACAT3'.
Diseño del oligómero
En una realización, el primer nucleótido del oligómero de acuerdo con la presente invención, contando desde el
extremo 3’, es un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA. En una realización, que puede ser igual o diferente, el último nucleótido del oligómero de acuerdo con la invención, contando desde el extremo 3’, es un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA.
En una realización, el segundo nucleótido del oligómero de acuerdo con la presente invención, contando desde el
extremo 3’, es un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA.
En una realización, el noveno y/o décimo nucleótido del oligómero de acuerdo con la presente invención, contando
desde el extremo 3’, es un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA.
En una realización, el noveno nucleótido del oligómero de acuerdo con la presente invención, contando desde el
extremo 3’, es un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA.
En una realización, el décimo nucleótido del oligómero de acuerdo con la presente invención, contando desde el extremo 3’, es un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA.
En una realización, tanto el noveno como el décimo nucleótido del oligómero de acuerdo con la presente invención,
calculado desde el extremo 3’, es un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA.
En una realización, el oligómero de acuerdo con la invención no comprende una región de más de 3 unidades nucleotídicas de ADN consecutivas, En una realización, el oligómero de acuerdo con la invención no comprende una región de más de 2 unidades nucleotídicas de ADN consecutivas,
En una realización, el oligómero comprende al menos una región que consiste en al menos dos unidades de análogos nucleotídicos consecutivos, tal como al menos dos unidades de LNA consecutivas.
En una realización, el oligómero comprende al menos una región que consiste en al menos tres unidades de análogos nucleotídicos consecutivos, tal como al menos tres unidades de LNA consecutivas.
Otros patrones de análogos nucleotídicos tales como LNA en el oligómero
Aunque se prevé que puede ser preferible los oligómeros que contienen al menos 6 LNA, tal como al menos 7 unidades de nucleótidos de LNA, el descubrimiento de que dichos oligómeros cortos son muy eficaces al estar dirigidos a microARN in vivo puede usarse para preparar oligómeros más cortos de la invención que comprendan otros análogos nucleotídicos, tales como análogos nucleotídicos de alta afinidad. De hecho, la combinación de LNA con otros análogos nucleotídicos de alta afinidad se considera parte de la presente invención.
Modificación de los nucleótidos en las posiciones 1 a 2 contando desde el extremo 3’. El nucleótido en las posiciones 1 y/o 2 puede ser un análogo nucleotídico, tal como un análogo nucleotídico de alta afinidad, tal como LNA, o un análogo nucleotídico seleccionado del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN, unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN, unidad 2'-MOE-ARN, unidad LNA, unidad PNA, unidad HNA, unidad INA. Por tanto, los dos nucleótidos en 3’ pueden ser Xx, xX, XX o xx, en los que: En una realización, X es LNA y x es ADN u otro análogo nucleotídico, tal como un análogo nucleotídico sustituido en 2’ seleccionado del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN, unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN, LNA y una unidad 2’MOE ARN. Dicha unidad no LNA (x) puede ser, por tanto, 2’MOE ARN o 2-fluoro-ADN. Como alternativa, X es un análogo nucleotídico y x es ADN.
La modificación anterior en los 2 nucleótidos en el extremo 3’ se puede combinar con la modificación de nucleótidos en las posiciones 3 -8 contando desde el extremo 3’, como se describe más adelante. A este respecto, los nucleótidos designados como X y x pueden ser iguales a lo largo del oligómero. Cabe destacar que cuando el oligómero tiene una longitud de únicamente 7 nucleótidos, el 8º nucleótido contando desde el extremo 3’ se debe descartar. En las realizaciones siguientes que hacen referencia a la modificación de los nucleótidos en las
posiciones 3 a 8 contando desde el extremo 3’:
X es LNA.
En una realización, cuando el oligómero tiene una longitud de al menos 8 nucleótidos de la invención, los
oligonucleótidos de la invención están modificados en las posiciones 3 a 8, contando desde el extremo 3’. El diseño
de esta secuencia se puede definir con el número de unidades no LNA presentes o con el número de unidades de LNA presentes.
En una realización adicional, cuando el oligómero tiene una longitud de al menos 8 nucleótidos de la invención, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención comprende al menos cuatro unidades de LNA en las
posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 3’. En una realización de la misma, el oligonucleótido de acuerdo
con la presente invención comprende cuatro unidades de LNA en las posiciones tres a ocho, contando desde el
extremo 3’. El patrón de sustitución para los nucleótidos en las posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 3’,
se puede seleccionar del grupo que consiste en xxXXXX, xXxXXX, xXXxXX, xXXXxX, xXXXXx, XxxXXX, XxXxXX, XxXXxX, XxXXXx, XXxxXX, XXxXxX, XXxXXx, XXXxxX, XXXxXx y XXXXxx, donde “X” indica una unidad de LNA y “x” indica una unidad no LNA.
En otra realización adicional, cuando el oligómero tiene una longitud de al menos 8 nucleótidos de la invención, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención comprende al menos cinco unidades de LNA en las posiciones
tres a ocho, contando desde el extremo 3’. En una realización de la misma, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención comprende cinco unidades de LNA en las posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 3’. El patrón de sustitución para los nucleótidos en las posiciones tres a ocho, contando desde el extremo 3’, se puede seleccionar del grupo que consiste en xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX y XXXXXx, donde “X” indica una unidad de LNA y “x” indica una unidad no LNA.
En otra realización adicional, cuando el oligómero tiene una longitud de al menos 8 nucleótidos de la invención, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención comprende al menos seis unidades de LNA en las posiciones
tres a ocho, contando desde el extremo 3’.
En algunas realizaciones, cuando X es LNA, dicha unidad no LNA (x) es otra unidad de análogo nucleotídico, tal como un análogo nucleotídico sustituido en 2’ seleccionado del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN,
unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN, LNA y una unidad 2’MOE ARN. Dicha unidad no LNA (x) puede ser, por tanto, 2’MOE ARN o 2-fluoro-ADN.
Para los oligómeros que tienen 9 o 10 nucleótidos, el nucleótido en las posiciones 9 y/o 10 puede ser un análogo nucleotídico, tal como un análogo nucleotídico de alta afinidad, tal como LNA, o un análogo nucleotídico seleccionado del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN, unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN, unidad 2'-MOE-ARN, unidad LNA, unidad PNA, unidad HNA, unidad INA. Por tanto, los dos nucleótidos en 5’ pueden ser
Xx, xX, XX o xx, en las que: En una realización, X es LNA y x es ADN u otro análogo nucleotídico, tal como un análogo nucleotídico sustituido en 2’ seleccionado del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN, unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN y una unidad 2’MOE ARN. Dicha unidad no LNA (x) puede ser, por tanto, 2’MOE ARN o 2-fluoro-ADN.
La modificación anterior en los 2 nucleótidos en el extremo 5’ se puede combinar con la modificación de nucleótidos en las posiciones 3 -8 contando desde el extremo 3’, y/o los 2 nucleótidos en 3’, como se ha descrito con anterioridad. A este respecto, los nucleótidos designados como X y x pueden ser iguales a lo largo del oligómero.
En una realización preferida de la invención, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención contiene una unidad de LNA en el extremo 5’. En otra realización preferida, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención contiene una unidad de LNA en las primeras dos posiciones, contando desde el extremo 5’.
En una realización, la invención proporciona además un oligómero como se describe en el contexto de la composición farmacéutica de la invención o para usar in vivo en un organismo, tal como un medicamento, en la que dicho oligómero (o secuencia de nucleótidos contigua) comprende
i) al menos un enlace fosforotioato y ii) al menos una unidad de LNA en el extremo 3’, y/o iii) al menos una unidad de LNA en el extremo 5’.
Por tanto, el oligómero contiene al menos un enlace fosforotioato, siendo todos los enlaces fosforotioatos, y puede contener al menos una unidad de LNA en el extremo 3', y al menos una unidad LNA en el extremo 5'.
Para la mayoría de los usos terapéuticos es preferible que el oligonucleótido esté completamente fosforotiolado, siendo una excepción los oligonucleótidos terapéuticos para uso en el SNC, tal como en el cerebro o la columna vertebral, lugares en los que la fosforotiolación puede ser tóxica, y debido a la ausencia de nucleasas, se pueden usar enlaces fosfodiéster, incluso entre unidades de ADN consecutivas.
Como se hace referencia en el presente documento, otro en otro aspecto del oligonucleótido de acuerdo con la
invención es que el segundo nucleótido en 3’ y/o el 9º y 10º (desde el extremo 3’, si está presente, puede también
ser LNA.
En una realización, el oligómero comprende al menos cinco unidades de análogos nucleotídicos de LNA, tal como en las posiciones que son complementarias a la región semilla del miARN.
En una realización, la secuencia de nucleótidos del oligómero que es complementaria a la secuencia de la región semilla de microARN se selecciona del grupo que consiste en (X)xXXXXX, (X)XxX)CXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX and (X)XXXXXx, en las que "X" indica una unidad de LNA, (X) indica un análogo nucleotídico opcional,
tal como una unidad de LNA, y “x” indica una unidad nucleotídica de ADN o ARN.
En una realización, el oligómero comprende seis o siete unidades de LNA, en las posiciones que son complementarias a la región semilla del miARN.
En una realización, la secuencia de nucleótidos del oligómero que es complementaria a la secuencia de la región semilla de microARN se selecciona del grupo que consiste en (XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXXX, XXXxXXX,
XXXXxXX, XXXXXxX y XXXXXXx, en las que "X" indica una unidad de LNA, tal como una unidad de LNA y “x” indica
una unidad nucleotídica de ADN o ARN.
En una realización, los dos motivos nucleotídicos en la posición 7 a 8, contando desde el extremo 3’ del oligómero, se seleccionan del grupo que consiste en xx, XX, xX y Xx, en las que "X" indica un análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA, tal como una unidad de LNA, y “x” indica una unidad nucleotídica de ADN o ARN.
En una realización, los dos motivos nucleotídicos en la posición 7 a 8, contando desde el extremo 3’ del oligómero,
se seleccionan del grupo que consiste en XX, xX and Xx, en las que "X" indica un análogo nucleotídico, tal como una
unidad de LNA, tal como una unidad de LNA, y “x” indica una unidad nucleotídica de ADN o ARN.
En una realización, el oligómero comprende una unidad de análogo nucleotídico, tal como una unidad de LNA, en el
extremo 5’.
En una realización, otras unidades de análogos nucleotídicos se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste en: una unidad 2'-O-alquilo-RNA, una unidad 2'-OMe-RNA, una unidad 2'-amino-ADN, unidad 2'-fluoro-ADN, una unidad 2'-MOE-ARN, una unidad PNA, una unidad HNA, una unidad INA.
En una realización, todos los nucleótidos del oligómero de la invención son unidades de análogos nucleotídicos.
En una realización, el oligómero comprende unidades de análogos de LNA y al menos una unidad de análogo nucleotídico adicional distinta a LNA.
En una realización, la unidad o unidades de análogo nucleotídico no LNA se seleccionan de forma independiente de unidades 2’-OMe-ARN y unidades 2’-fluoro-ADN.
En una realización, el oligómero consiste en al menos una secuencia XYX o YXY, en la que X es LNA e Y es una unidad 2’-OMe-ARN y una unidad 2’-fluoro-ADN.
En una realización, el oligómero comprende unidades de LNA y ADN alternantes (Xx) o (xX). En una realización, el oligómero comprende un motivo de LNA alternantes seguidas de 2 unidades de ADN (Xxx), xXx o xxX.
Diseños adicionales para oligómeros de la invención
La tabla 1 más adelante proporciona ejemplos no limitantes de secuencias de microARN cortos a las que ventajosamente se podría dirigir un oligonucleótido de la presente invención.
Los oligonucleótidos de acuerdo con la invención, como los divulgados en la tabla 1 pueden tener, en una realización, una secuencia de 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de LNA 5' - 3' LLLLLLL(L)(L)(L), en la que L= LNA y los residuos entre paréntesis son opcionales.
Composición farmacéutica y aplicación médica
El oligómero de la invención se puede usar en una composición farmacéutica que comprende el oligómero de acuerdo con la invención y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además el uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención, tal como los que pueden formar parte de la composición farmacéutica, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión (regulación por aumento) del microARN.
La composición se puede usar en un procedimiento para tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN, que comprende la etapa de administrar a una persona que necesite dicho tratamiento una composición (tal como la composición farmacéutica) de acuerdo con la invención.
La invención proporciona además un procedimiento in vitro para reducir la cantidad eficaz de un miARN en una célula u organismo, que comprende administrar a la célula u organismo una composición (tal como la composición farmacéutica) de acuerdo con la invención o un oligómero de acuerdo con la invención. En este contexto, reducir la cantidad eficaz hace referencia a la reducción del miARN funcional presente en la célula u organismo. Se reconoce que los oligonucleótidos preferidos de acuerdo con la invención no siempre pueden reducir significativamente la cantidad real de miARN en la célula u organismo, ya que normalmente forman dúplex muy estables con sus miARN diana. La reducción de la cantidad eficaz de miARN en una célula puede medirse, en una realización, detectando el nivel de desrepresión de la diana del miARN en la célula.
La invención proporciona además un procedimiento in vitro para la des-represión de un ARNm diana de un miar en una célula u organismo, que comprende administrar a la célula u organismo una composición (tal como la composición farmacéutica) o un oligómero de acuerdo con la invención.
La invención proporciona además el uso del oligómero de una longitud de entre 7 y 10, tal como 7, 8, 9 o 10, nucleótidos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN.
En una realización, la afección médica (o enfermedad) es hepatitis C (VHC) y el miARN es miR-122.
En una realización, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de un trastorno médico o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: infección por el virus de la hepatitis C e hipercolesterolemia y trastornos relacionados, y cánceres.
En una realización, el trastorno médico o enfermedad es una enfermedad del SNC, tal como una enfermedad del SNC en la que están indicados uno o más microARN.
En el contexto de los trastornos relacionados con la hipercolesterolemia se hace referencia a enfermedades tales como aterosclerosis o hiperlipidemia. Ejemplos adicionales de enfermedades relacionadas también incluyen tipos diferentes de desequilibrio del colesterol HDULDL; dislipidemias, por ejemplo hiperlipidemias combinada familiar (HLCF), hiperlipidemia adquirida, hipercolesterolemia resistente a estatinas, arteriopatía coronaria (CAD), cardiopatía coronaria (CHD), ateroesclerosis.
En una realización, la composición farmacéutica comprende además un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la vía de ensamblaje de las VLDL, tal como un inhibidor de la ApoB, o un inhibidor de las MTP (como los divulgados en el documento US 60/977497).
La composición se puede usar en un procedimiento para tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN, que comprende la etapa de administrar a una persona que necesite dicho tratamiento una composición (tal como la composición farmacéutica) que comprende un oligómero de acuerdo con la invención.
La invención proporciona además un procedimiento in vitro para reducir la cantidad eficaz de una diana de miARN (es decir, miARN “disponible”) en una célula u organismo, que comprende administrar a la célula u organismo una composición (tal como la composición farmacéutica) que comprende un oligómero de acuerdo con la invención.
Debe reconocerse que “reducir la cantidad eficaz" de uno o más microARN en una célula u organismo se refiere a la inhibición de la función de microARN en la célula u organismo. La célula es, preferentemente, una célula de mamífero o una célula humana que expresa el microARN o varios microARN.
La invención proporciona además un procedimiento in vitro para la des-represión de un ARNm diana de un miARN en una célula u organismo, que comprende un oligómero de acuerdo con la invención o (o una composición que comprende dicho oligonucleótido) a la célula u organismo.
Como se ha mencionado anteriormente, los microARN están relacionados con una serie de enfermedades. Por tanto, el oligonucleótido como se ha definido en el presente documento se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de microARN seleccionados del grupo que consiste en atrofia muscular espinal, síndrome de Tourette, hepatitis C, retraso mental por cromosoma X frágil, síndrome de DiGeorge y cáncer, tal como, en un ejemplo no limitante, leucemia linfocítica crónica, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de colon, en concreto cáncer.
Procedimientos de síntesis
Del oligómero de la invención dirigido contra un microARN humano, tal como un oligómero descrito en el presente documento se puede sintetizar mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
a.
Seleccionar opcionalmente un primer nucleótido, contando desde el extremo 3’, que es un nucleótido LNA.
b.
Seleccionar opcionalmente un segundo nucleótido, contando desde el extremo 3’, que es un nucleótido LNA.
c.
Seleccionar una región del oligómero que corresponde a la región semilla del miARN, en el que dicha región es como se ha definido en el presente documento.
d.
Seleccionar un séptimo, y opcionalmente un octavo, nucleótido como se ha definido en el presente documento.
e.
Seleccionar opcionalmente uno o dos más en 5’ del oligómero como se ha definido en el presente documento.
En el que la síntesis se realiza mediante síntesis secuencial de las regiones definidas en las etapas a - e, en el que dicha síntesis se puede realizar en dirección 3'-5' (a - f) o 5' - 3' (e - a) y en el que dicho oligómero es complementario de una secuencia del miARN diana.
El oligómero de acuerdo con la invención se puede preparar mediante un procedimiento que comprende las etapas de a) comparar las secuencias de dos o más secuencias de miARN para identificar dos o más secuencias de miARN que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua común de una longitud de al menos 7 nucleótidos, tal como una longitud de 7, 8, 9 o 10 nucleótidos (es decir, una secuencia encontrada en ambos miARN no idénticos), b) preparar una secuencia de oligómero que consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es complementaria a dicha secuencia de nucleótidos contigua común, en el que dicho oligómero es de acuerdo con el oligómero de la invención. En un ejemplo preferido, la secuencia de nucleótidos contigua común consiste en o comprende la región semilla de cada uno de dichas dos o más secuencias de miARN (que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua común de una longitud de al menos 6 nucleótidos). En una realización, las regiones semilla de los dos o más miARN son idénticas. Idóneamente, el oligómero consiste en o comprende una secuencia de seedmero de una longitud de 7 u 8 nucleótidos que comprende una secuencia que es complementaria de dichos dos o más miARN. Este procedimiento se puede usar junto con la etapa c del procedimiento anterior.
El procedimiento para la síntesis del oligómero se puede realizar usando síntesis estándar de oligonucleótidos en fase sólida.
En una realización, el procedimiento para la síntesis de un oligómero dirigido contra un microARN humano se realiza en dirección 3’ a 5’ a-e.
Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento in Vitro para reducir los niveles de microARN diana poniendo en contacto el microARN diana con un oligonucleótido de acuerdo con la invención, en el que el oligonucleótido (i) es complementario de la secuencia de microARN diana (ii) no contiene un nucleótido en el
extremo 3’ que corresponda al primer nucleótido en el extremo 5’ del microARN diana.
Estabilidad del dúplex y Tm
En una realización, el oligómero de la invención es capaz de formar un dúplex con una molécula de acido nucleico ARN monocatenario complementaria (normalmente de aproximadamente la misma longitud de dicho oligonucleótido monocatenario) con enlaces internucleosídicos fosfodiéster, en el que el dúplex tiene una Tm de entre 30 ºC y 70 ºC u 80 ºC, tal como entre 30 ºC y 60 ºC o 70 ºC, o entre 30 ºC y 50 ºC o 60 ºC. En una realización, la Tm desde al menos 40 ºC. La Tm se puede determinar determinando la Tm del oligómero y un ARN diana complementario en las siguientes condiciones tampón. NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, Na-fosfato 10 mM, pH 7,0 (véase en los ejemplos un protocolo detallado). Un análogo de alta afinidad se puede definir como un análogo que, cuando se usa en el oligómero de la invención, tiene como resultado un incremento de la Tm del oligómero en comparación con un oligómero idéntico que contiene únicamente bases de ADN.
Conjugados
En una realización, dicho oligómero está conjugado con uno o más compuestos no nucleotídicos (o polinucleotídicos).
En el contexto, con el término “conjugado” se pretende indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente (“conjugación”) del oligómero como se describe en el presente documento a uno o más restos no
nucleotídicos o no polinucleotídicos. Ejemplos de más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos incluyen agentes macromoleculares, tales como proteínas, cadenas de ácidos grasos, residuos de azúcares, glucoproteínas, polímeros o combinaciones de los mismos. Normalmente, las proteínas pueden ser anticuerpos frente a una proteína diana. Los polímeros típicos pueden ser polietilenglicol.
Por tanto, en varias realizaciones el oligómero de la invención puede comprender una región polinucleotídica que normalmente consiste en una secuencia contigua de nucleótidos y una región no nucleotídica adicional. En referencia al oligómero de la invención que consiste en una secuencia contigua de nucleótidos, el compuesto puede comprender componentes no nucleotídicos, tales como un componente conjugado.
En varias realizaciones de la invención, el compuesto oligomérico está unido a ligandos/conjugados, que pueden usarse para, por ejemplo, aumentar la captación celular de compuestos oligoméricos. El documento WO 2007/031091 proporciona ligandos y conjugados adecuados.
La invención también proporciona un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente a dicho compuesto. Por tanto, en varias realizaciones en las que el compuesto de la invención consiste en un ácido nucleico o una secuencia nucleotídica especificados, como se divulga en el presente documento, el compuesto puede comprender también al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico (p. ej., que no comprende uno o más nucleótidos o análogos nucleotídicos) unido covalentemente a dicho compuesto.
La conjugación (a un resto conjugado) puede potenciar la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligómero de la invención. Dichos restos incluyen, entre otros, anticuerpos, polipéptidos, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo hexil-s-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo dodecadiol o residuos de undecilo, un fosfolípidos, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2di-o-hexadecil-rac-glicero-3-h-fosfonato, una poliaminas o una cadena de polietilenglicol, Un ácido adamantano acético, un resto de palmitilo, una octadecilamina o un resto de hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
Los oligómeros de la invención también pueden estar conjugados con sustancias farmacólogicas activas, por ejemplo aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
En ciertas realizaciones, el resto conjugado es un esterol, tal como colesterol.
En varias realizaciones, el resto conjugado comprende o cosiste en un polímero cargado positivamente, tal como péptidos cargados positivamente de una longitud de, por ejemplo, entre 1 y 50, tal como 2-20, tal como 3-10
5 residuos aminoácidos y/u óxido de polialquileno tal como polietilglicol (PEG) o polipropilenglicol, véase el documento WO 2008/034123. Idóneamente, el polímero cargado positivamente, tal como un óxido de polialquileno puede estar unido al oligómero de la invención a través de un ligador tal como el ligador liberable descrito en el documento WO 2008/034123.
10 A modo de ejemplo, en los conjugados de la invención se pueden usar los siguientes restos conjugados:
Oligómeros activados
15 La expresión “oligómero activado”, como se usa en el presente documento, hace referencia a un oligómero de la invención que está unido covalentemente (es decir, funcionalizado) a al menos un resto funcional que permite la unión covalente del oligómero a uno o más restos conjugados, es decir restos que no son en sí mismos ácidos nucleicos o monómeros, para formar los conjugados descritos en el presente documento. Normalmente, un resto
20 funcional comprenderá un grupo químico que es capaz de unirse de forma covalente al oligómero a través de, por ejemplo, un grupo 3’-hidroxilo o el grupo NH2 exocíclico de la base adenina, un espaciador que es, preferentemente, un grupo hidrofílico y terminal que es capaz de unirse a un resto conjugado (p. ej., un grupo amino, sulfhidrilo o hidroxilo). En algunas realizaciones, este grupo terminal no está protegido, por ejemplo es un grupo NH2. En otras realizaciones, el grupo terminal está protegido, por ejemplo mediante cualquier grupo protector adecuado tal como
25 los descritos en ’Protective Groups in Organic Synthesis’, de Theorodora W. Greene y Peter G. M. Wuts, 3ª Edicioón (John Wiley & Sons, 1999). Ejemplos de grupos protectores hidroxilo adecuados incluyen ésteres tales como éster de acetato, grupos aralquilo tal como bencilo, difenilmetilo o trifenilmetilo y tetrahidropiranilo. Ejemplos de grupos protectores amino adecuados incluyen bencilo, alfa-metilbencilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, benciloxicarbonilo, tercbutoxicarbonilo y grupos acilo tales como tricloroacetilo o trifluoroacetilo. En algunas realizaciones, el resto funcional
30 es de autoescisión. En otras realizaciones, el resto funcional es biodegradable. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 7.087.229.
En algunas realizaciones, los oligómeros de la invención están funcionarizados en el extremo 5’ con el fin de permitir la unión covalente del resto conjugado al extremo 5’ del oligómero. En otras realizaciones de la invención, los
35 oligómeros de la invención pueden estar funcionarizados en el extremo 3’. En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención pueden estar funcionalizados a lo largo de la estructura o en el resto de base heterocíclica. En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención pueden estar funcionalizados en más de una posición seleccionada de forma independiente del extremo 5’. El extremo 3’, la estructura y la base.
40 En algunas realizaciones, los oligómeros activados de la invención se sintetizan incorporando durante la síntesis uno
o más monómeros que están unidos covalentemente a un resto funcional. En otras realizaciones, los oligómeros activados de la invención se sintetizan con monómeros que no se han funcionalizado y el oligómero se funcionaliza tras la finalización de la síntesis. En algunas realizaciones, los oligómeros están funcionalizados con un éster impedido que contiene un ligador aminoalquilo, en el que la porción alquilo tiene la fórmula (CH2)w, en la que w es un
45 número entero que varía de 1 a 10, preferentemente aproximadamente 6, en el que la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada, y en el que el grupo funcional está unido al oligómero a través de un grupo éster (-O-C(O)-(CH2)wNH).
En otras realizaciones, los oligómeros están funcionalizados con un éster impedido que contiene un ligador (CH2w
50 sulfhidrilo (SH) , en el que w es un número entero que varía de 1 a 10, preferentemente aproximadamente 6, en el que la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada, y en el que el grupo funcional está unido al oligómero a través de un grupo éster (-O-C(O)-(CH2)wNH).
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos activados por sulfhidrilo están conjugados con restos poliméricos tales 55 como polietilenglicol o péptidos (mediante la formación de un puente disulfuro).
Los oligómeros activados que contienen ésteres impedidos como se ha descrito con anterioridad se pueden sintetizar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica y, en concreto, mediante procedimientos divulgados en la publicación PCT nº WO 2008/034122 y los ejemplos en la misma.
En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención se funcionalizan introduciendo grupos sulfhidrilo, amino o hidroxilo en el oligómeros por medio de un reactivo de funcionalización sustancialmente como se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.962.029 y 4.914.210, es decir un reactivo sustancialmente lineal que tiene una fosforoamidita en un extremo unida a través de una cadena espaciadora hidrofílica al extremo opuesto, que comprende un grupo sulfhidrilo, amino o hidroxilo protegido o no protegido. Dichos reactivos reaccionan principalmente con grupos hidroxilo del oligómeros. En algunas realizaciones, dichos oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 5’-hidroxilo del oligómero. En otras realizaciones, los oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 3’-hidroxilo. En otras realizaciones más, los oligómeros activados de la invención tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo hidroxilo sobre la estructura del oligómero. En otras realizaciones adicionales, el oligómeros de la invención está funcionalizado con más de uno de los reactivos de funcionalización como se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.962.029 and
4.914.210. Procedimientos de sintetizar dichos reactivos de funcionalización y de incorporarlos en monómeros y oligómeros se divulgan en las patentes de EE.UU. nº 4.962.029 y 4.914.210.
En algunas realizaciones, el extremo 5’ de un oligómeros unido en fase sólida está funcionalizado con un derivado dienilfosforoamidita, seguido de la conjugación del oligómeros desprotegido con, por ejemplo, un aminoácido o péptido mediante una reacción de cicloadición de Diels-Alder.
En varias realizaciones, la incorporación de monómeros que contienen modificaciones de 2'-azúcar, tal como un azúcar sustituido con 2'-carbamato o un azúcar desoxirribosa-2'-(O-pentil-N-ftalimido) en el oligómero facilita la unión covalente de restos conjugados a los azúcares de oligómero. En otras realizaciones se prepara un oligómeros con
un ligador que contiene amino en la posición 2’ de uno o más monómeros usando un reactivo tal como, por ejemplo,
5'-dimetoxitritil-2'-O-(e-ftalimidilaminopentil)-2'-desoxiadenosina-3'-- N,N-diisopropil-cianoetoxi fosforoamidita. Véase, por ejemplo, Manoharan, y col., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171.
En otras realizaciones adicionales, los oligómeros de la invención pueden tener restos funcionales que contienen amina sobre el nucleótido, incluido sobre los grupos amino de purina N6, sobre el N2 exocíclico de la guanina o sobre las posiciones N4 o 5 de la citosina. En varias realizaciones, dicha funcionalización se puede conseguir usando un reactivo comercial que ya está funcionalizado en la síntesis del oligómero.
Algunos restos funcionales están disponibles comercialmente, por ejemplo restos de unión heterobifuncional y homobifuncional están disponibles en Pierce Co. (Rockford, III.). Otros grupos de unión disponibles comercialmente son los reactivos 5’-amino-modificador C6 y 3’-amino-modificador, ambos disponibles en Glen Research Corporation (Sterling, Va.). El 5’-amino-modificador también está disponible en ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) como Aminolink-2, y 3'-Amino-Modificador también está disponible en Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.).
Terapia y composiciones farmacéuticas- formulación y administración
Como se ha explicado inicialmente, los oligonucleótidos de la invención constituirán fármacos adeucados con propiedades mejoradas. El diseño de un fármaco potente y seguro requiere un ajuste fino de varios parámetros tales como afinidad/especificidad, estabilidad en los fluidos biológicos, captación celular, modo de acción, propiedades farmacocinéticas y tonicidad.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional el oligómero se puede usar en una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de acuerdo con la invención y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dicho vehículo es solución salina o solución salina tamponada.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere un oligonucleótido de acuerdo con la presente invención para su uso como medicamento.
Como se entenderá, la dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta del estado de enfermedad que se va a tratar y el curso de tratamiento que dura de varios días a varios meses o hasta que se efectúa una cura y se consigue una disminución del estado de la enfermedad. Pautas de dosificación óptimas se pueden calcular a partir de mediciones de la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Las dosificaciones óptimas pueden variar en función de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales. En general, se puede estimar sobre la base de las CE50 que se ha encontrado que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es de 0,01 g a 1 g por kg de peso corporal y se puede administrar una o más veces al día, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada de 2 a 10 años o mediante infusión continua durante de horas a varios meses. Las tasas de repetición para la administración de la dosis se pueden estimar sobre la base de los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del fármaco en los fluidos o tejidos corporales. Tras un tratamiento con éxito, puede ser deseable someter al paciente a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de la enfermedad.
Como se ha indicado anteriormente, la invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un oligonucleótido de la invención como principiom activo. Debe entederse que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende, opcionalmente, un vehículo farmacéutico, y que la composición farmacéutica comprende, opcionalmente, otros compuestos tales como compuestos quimioterapéuticos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales y/o compuestos inmunomoduladores.
Los oligonucleótidos de la invención se pueden emplear “como tales” o en forma de una variedad de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente memoria, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales que conservan la actividad biológica deseada de los oligonucleótidos identificados en el presente documento y que exhiben efectos toxicológicos indeseados mínimos. Ejemplos no limitantes de estas sales se pueden formar con aminoácido orgánico y sales de adición de base formadas con cationes metálicos tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión formado de amoniaco, N,N-dimenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio o etilendiamina.
En una realización de la invención, el oligonucleótido puede estar en forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son en virtud iones cargados negativamente. Debido a la naturaleza lipofílica de las membranas celulares, la captación celular de oligonucleótidos se reduce en comparación con los equivalentes neutros o lipófilos. Esta
“hidrancia” de polaridad se puede evitar usando el enfoque del profármaco (véase, por ejemplo, Crooke, R. M.
(1998) in Crooke, S. T., Antisense Research and Application Springer-Verlag, Berlin, Alemania, vol. 131, pág. 103140).
Los agentes de unión y adyuvantes farmacéuticamente aceptables pueden formar parte del fármaco formulado.
Ejemplos de procedimientos de liberación para liberar los agentes terapéuticos descritos en el presente documento, así como detalles de las formulaciones farmacéuticas, sales, pueden estar bien descritos en otros lugares, por ejemplo en las solicitudes provisionales de EE.UU. 60/838710 y 60/788995, y en las solicitudes danesas PA 2006 00615.
Las composiciones farmacéuticas incluyen, entre otras, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, entre otros, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. La liberación del fármaco al tejido tumoral puede potenciarse mediante liberación mediada por transportador incluidos, entre otros, liposomas cariónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27). Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar de forma conveniente en forma de monodosis, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de poner en contacto los ingredientes activos con el(los) transportador(es) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto de forma uniforme y estrecha los ingredientes activos con vehículos de líquidos o transportadores sólidos finamente divididos o con ambos y, después, en caso necesario, dando forma al producto. Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles, tales como, entre otros, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones también se pueden formular en forma de suspensiones en medio acuoso, no acuoso o mixto. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, incluidas, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. Los compuestos de la invención también pueden estar conjugados con sustancias farmacólogicas activas, por ejemplo aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
En otra realización, las composiciones pueden contener uno o más compuestos oligonucleotídicos dirigidos a un primer microARN y uno o más compuestos oligonucleotídicos adicionales dirigidos a un segundo microARN diana. Dos o más compuestos combinados se pueden usar juntos o de forma secuencial.
Los compuestos divulgados en el presente documento son útiles para una serie de aplicaciones terapéuticas, como se ha indicado anteriormente. En general, los procedimientos terapéuticos incluyen la administración a un mamífero, en particular a un ser humano, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido. En una determinada realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos de la invención y (b) uno o más agentes quimioterapéuticos. Cuadndo se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos se pueden usar individualmente, secuencialmente o en combinación con uno o más de estos otros agentes quimioterapéuticos o en combinación con radioterapia. Todos los compuestos quimioterapéuticos conocidos para un experto en la técnica se incorporan en el presente documento como tratamientos de combinación con un compuesto de acuerdo con la invención. Otros agentes activos, tales como fármacos antiinflamatorios, incluidos, entre otros, fármacos antiinflamatorios no esteroides y corticosteroides, fármacos antivirales y fármacos inmunomoduladores, también se pueden combinar en composiciones de la invención. Dos o más compuestos combinados se pueden usar juntos o de forma secuencial.
Ejemplos de indicaciones terapéuticas que se pueden tratar con las composiciones farmacéuticas de la invención: El ARNm del gen supresor tumora de la tropomiosina 1 (TPM1) se ha indicado como diana de miR-21. El ARNm de la miotrofina (mtpn) se ha indicado como diana de miR 375.
microRNA
Posibles indicaciones médicas
miR-1
Arritmia cardíaca
miR-21
Glioblastoma, cáncer de mama, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, sensibilización de gliomas a fármacos citotóxicos, hipertrofia cardíaca
miR-21, miR-200b y miR-141
Respuesta a quimioterapia y regulación del crecimiento del colangiocarcinoma
miR-122
Hipercolesterolemia, infección por hepatitis C, hemocromatosis
miR-19b
Linfoma y otros tipos de tumores
miR-26a
Diferenciación en osteoblastos de las células madre humanas
miR-155
Linfoma, desarrollo de tumor pancreático, cáncer de mama y de pulmón
miR-203
Psoriasis
miR-375
Diabetes, trastornos metabólicos, secreción de insulina inducida por glucosa desde las células endocrinas pancreáticas
miR-181
Diferenciación de mioblastos, trastornos autoinmunitarios
miR-10b
Invasión y metástasis de células de cáncer de mama
miR-125b-1
Cáncer de mama, pulmón, ovarios y cervical
miR-221 y 222
Carcinom de próstata, cáncer papilar tiroideo humano, carcinoma hepatocelular humano
miR-372 y -373m
Tumores de células germinales testiculares
miR-142
Leucemia de linfocitos B
Clúster de miR-17 - 19b
Linfomas de linfocitos B, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular
5 En todavía un aspecto adicional, el oligonucleótido de acuerdo con la invención se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemias, cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón, diabetes, trastornos metabólicos, diferenciación de mioblastos, trastornos inmunitarios.
10 Los oligonucleótidos de acuerdo con la invención pueden ser para uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemias, cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón, diabetes, trastornos metabólicos, diferenciación de mioblastos, trastornos inmunitarios.
15 Los oligómeros de la invención se pueden usar en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que sufre una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en: aterosclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemias, cáncer, glioblastoma, cáncer de mama, linfoma, cáncer de pulmón, diabetes, trastornos metabólicos, diferenciación de mioblastos, trastornos inmunitarios, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al sujeto que lo necesite un oligonucleótido o composición farmacéutica de la invención.
20 Los oligómeros se pueden usar en un kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la invención y un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la vía de ensamblaje de las VLDL, tal como un inhibidor de la ApoB o un inhibidor de las MTP.
25 Cáncer
El oligonucleotido de acuerdo con la invención se puede usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En otro aspecto, los oligómeros de la invención se pueden usar en un procedimiento para el tratamiento, o la profilaxis, del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la administración a un paciente que lo
30 necesite un oligonucleótido de la invención o una composición farmacéutica de la invención.
Dichos cánceres pueden incluir neoplasia linforeticular, leucemia linfoblástica, tumores cerebrales, tumores gástricos, plasmacitomas, mieloma múltiple, leucemia, tumores del tejido conjuntivo, linfomas y tumores sólidos.
35 En el uso de un compuesto de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, dicho cáncer puede estar, idóneamente, en forma de un tumor sólido. De un modo análogo, en el procedimiento para el tratamiento del cáncer divulgado en el presente documento, dicho cáncer puede estar, idóneamente, en forma de un tumor sólido.
Además, dicho cáncer es, también idóneamente, un carcinoma. Normalmente, el carcinoma se selecciona del grupo que consiste en melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma ovárico, carcinoma de mama, cáncer pulmonar macrocítico, carcinoma de células renales, carcinoma de vejiga urinara, cáncer de cejiga urinaria superficial recurrente, carcinoma de estómago, carcinoma de próstata, carcinoma pancreático, carcinoma pulmonar, carcinoma cervial, displasia cervical, papilomatosis laríngea, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides. Más típicamente, dicho carcinoma se selecciona del grupo que conisste en melanoma maligno, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma de mama, carcinoma de colon y carcinoma de células renales. Normalmente, el melanoma maligno se selecciona del grupo que consiste en melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular, melanoma léntigo maligno, melanoma acral, melanoma amelanótico y melanoma desmoplástico.
Como alternativa, el cáncer puede ser, idóneamente, un sarcoma. Normalmente, el sarcoma está en la forma seleccionada del grupo que consiste en osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma y sarcoma de Kaposi.
Como alternativa, el cáncer puede ser, idóneamente, un glioma.
Una realización adicional está dirigida al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en el que dicho medicamento comprende además un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo constituido por adrenocorticosteroides, tales como prednisona, desametasona o decadrón:altertamina (hexaleno, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidex); andrógenos, tales como testosterona; asparaginasa (elspar); bacilo de calmette-guerin; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (myleran); carboplatino (paraplatino); carmustina (BCNU, BiCNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatino (platinol); citosina arabinósido (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen); daunorubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorubicina (adriomicina); epirubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, tales como dietilestilbestrol (DES); etópsido (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexina); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goderelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hidrea); idarubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleuquina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprólido (luprón); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza de nitrógeno); melfalán (alqueran); mercaptopurina (purinetol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona); octreótida (sandostatina); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estrptozocona; tamoxifeno (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipósido (vurmon, VM-26); tiotepa; topotecán (hicamtin); tretinoína (vesanoide, ácido retinoico todo trans); vinblastina (valbán); vincristina (oncovin) y vinorelbina (navelbina). Idóneamente, el agente quimioterapéutico adicional se selecciona de taxanos tales como Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.
De un modo similar, la invención también está dirigida al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en el que dicho tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico adicional seleccionado del grupo constituido por adrenocorticosteroides, tales como prednisona, desametasona o decadrón:altertamina (hexaleno, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidex); andrógenos, tales como testosterona; asparaginasa (elspar); bacilo de calmette-guerin; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (myleran); carboplatino (paraplatino); carmustina (BCNU, BiCNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatino (platinol); citosina arabinósido (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen); daunorubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorubicina (adriomicina); epirubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, tales como dietilestilbestrol (DES); etópsido (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexina); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goderelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hidrea); idarubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleuquina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprólido (luprón); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza de nitrógeno); melfalán (alqueran); mercaptopurina (purinetol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona); octreótida (sandostatina); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estrptozocona; tamoxifeno (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipósido (vurmon, VM-26); tiotepa; topotecán (hicamtin); tretinoína (vesanoide, ácido retinoico todo trans); vinblastina (valbán); vincristina (oncovin) y vinorelbina (navelbina). Idóneamente, dicho tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico adicional seleccionado de taxanos tales como Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.
Los oligómeros de la invención se pueden usar en un procedimiento para el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento la administración a un paciente que lo necesite un oligonucleótido de la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención y que además comprende la administración de un agente quimioterapéutico adicional. Dicha administración adicional puede ser tal que el agente quimioterapéutico adicional está conjugado al compuesto de la invención, está presente en la composición farmacéutica o se administra en una formulación separada.
Enfermedades infecciosas
Se contempla que los compuestos de la invención pueden ser ampliamente aplicables a un amplio abanico de enfermedades infecciosas, tales como difteria, tétanos, pertussis, polio, hepatitis B, hepatitis C, hemophilus influenza, sarampión, paperas y rubéola.
Hsa-miR122 está indicado en la infección de hepatitis C y como tal, los oligonucleótidos de acuerdo con la invención dirigidos a miR-122 se pueden usar para tratar la infección de hepatitis C.
De acuerdo con lo anterior, el oligonucleótido de acuerdo con la invención se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, además de un procedimiento para tratar una enfermedad infecciosa, en el que dicho procedimiento comprende administrar a un paciente que lo necesite un oligonucleótido de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención.
En una realización preferida, el oligómero de la invención se puede usar en un tratamiento de combinación que proporciona un oligómero anti miR-12 en combinación con un inhibidor del ensamblaje de las VLDL, tal como un inhibidor de la apoB, o de las MTP.
Enfermedades inflamatorias
La respuesta inflamatoria es un mecanismo esencial de defensa del organismo contra el ataque de agentes infecciosos y también está implicada en la patogenia de muchas enfermedades agudas y crónicas, incluidos trastornos autoinmunitarios. A pesar de ser necesaria para combatir a los patógenos, los efectos de una descarga inflamatoria pueden ser devastadores. Por tanto, a menudo es necesario restringir la sintomatología de la inflamación con el uso de fármacos antiinflamatorios. La inflamación es un proceso complejo que normalmente es desencadenado por lesiones tisulares que incluye la activación de una gran serie de enzimas, el incremento de la permeabilidad vascular y la extravasación de fluidos de la sangre, migración celular y liberación de mediadores químicos, todos dirigidos tanto a la destrucción como a la reparación del tejido dañado.
En otro aspecto más, el oligonucleotido de acuerdo con la invención se puede usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
En una realización preferida de la invención, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad reumática y/o enfermedades del tejido conjuntico, talescomo artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus, esclerodermia, polimiositis, enfermedad intestinal inflamatoria, dermatomiositis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, vasculitis, artrisis psoriásica, dermatitis psoriásica exfoliativa, pénfigo vulgar y síndrome de Sjorgren, en concreto enfermedad intestinal inflamatoria y enfermedad de Crohn.
Como alternativa, la enfermedad inflamatoria puede ser una inflamación no reumática, como bursitis, sinovitis, capsulitis, tendinitis y/u otras lesiones inflamatorias de origen traumático y/o deportivo.
Enfermedades metabólicas
Una enfermedad metabólica es un trastorno causado por la acumulación de sustancias químicas producidas de forma natural en el cuerpo. Normalmente estas enfermedades son graves, algunas incluso potencialmente mortales. Otras pueden ralentizar el desarrollo físico o producir retraso mental. La mayoría de los lactantes con estos trastornos no muestran signos obvos de enfermedad al principio. Un cribado adecuado en el momento del nacimiento a menudo puede descubrir estos problemas. Con un diagnóstico y tratamiento tempranos, las enfermedades metabólicas a menudo se pueden tratar con eficacia.
En otro aspecto más, el oligonucleotido de acuerdo con la invención o un conjugado del mismo se puede usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad metabólica.
En una realización preferidade la invención, la enfermedad metabólica se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis, biotinidasa, OMIM (hrencia mendeliana online en varones), síndrome de Crigler Najjar, Diabetes, Grupo de información y soporte sobre Fabry, trastornos de la oxidación de los ácidos grasos, galactosemia, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), aciduria glutárica, Organización Internacional de la Acidemia glutárica, acidemia glutárica de tipo I, Acidemia glutárica de tipo II, Acidemia glutárica de tipo I, Acidemia glutárica de tipo II, F-HYPDRR - hipofosfatemia familiar, raquitismo resistente a vitamina D, enfermedad de Krabbe, deficiencia de la 3 hidroxiacil CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCHAD), Grupo de Manosidosis, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, trastornos mitocondriales, síndromes de mucopolisacaridosis: Niemann Pick, academias orgánicas, PKU, enfermedad de Pompe, porfiria, síndrome metabólico, hiperlipidemias y trastornos lipídicos hereditarios, trimetilaminuria: el síndrome del olor a pescado y trastornos del ciclo de la urea.
Trastornos hepáticos
En otro aspecto más, el oligonucleotido de acuerdo con la invención o un conjugado del mismo se puede usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno hepático.
En una realización preferida de la invención, el trastorno hepático se selecciona del grupo que consiste en atresia biliar, síndrome de Argille, alfa-1-antitripsina, tirosinemia, hepatitis del neonato y enfermedad de Wilson.
Otros usos
Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden utilizar como reactivos de investigación para diagnóstico, terapéutica y profilaxis. En investigación, el oligonucleótido se puede usar para inhibir específicamente la síntesis de los genes diana en células y animales experimentales, de modo que se facilita el análisis funcional de la diana o una evaluación de su utilidad como diana para la intervención terapéutica. En diagnóstico, los oligonucleótidos se pueden usar para detectar y cuantificar la expresión de la diana en células y tejidos mediante transferencia de tipo Northern, hibridación in situ o técnicas similares. Para las terapéuticas, un animal o un ser humano (en particular un ser humano) del que se sospecha que presenta una enfermedad o trastorno, que se puede tratar mediante modulación de la expresión de la diana es tratado mediante la administración de compuestos oligonucleotídicos de acuerdo con la presente invención. También se proporcionan procedimientos de tratamiento de un animal, en concreto un ratón y una rata, y de tratamiento de un ser humano, del que se sospecha que presenta o es propenso a sufrir una enfermedad o afección asociada con la expresión de la diana, mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más de los compuestos oligonucleotídicos o composiciones de la invención.
Uso terapéutico de oligonucleótidos dirigidos a miR-122a
Los inventores han demostrado que un LNA-antimiR, dirigido a miR-122a, reduce los niveles de colesterol en plasma. Por tanto, los oligonucleótidos descritos anteriormente dirigidos a miR-122a se pueden usar como medicamento.
En otro aspecto más, los oligonucleótidos descritos anteriormente dirigidos a miR-122a se pueden usar para la preparación de un medicamento para el tratamiento de niveles incrementados de colesterol en plasma (o hipercolesterolemia y trastornos seleccionados). El experto apreciará que niveles incrementados de colesterol en plasma son indeseables, ya que aumenta el riesgo de varias afecciones, por ejemplo aterosclerosis.
En otro aspecto más, los oligonucleótidos descritos anteriormente dirigidos a miR-122a se pueden usar para regular por aumento de los niveles del ARNm de Nrdg3, Aldo A, Bckdk o CD320.
Realizaciones
Las siguientes realizaciones se pueden usar en combinación con las otras realizaciones descritas en el presente documento.
1.
Una composición farmacéutica que comprende uno del oligómero de la invención de una longitud de entre 7 y 10 nucleótidos, en el que dicho oligómero comprende una secuencia de nucleótidos contigua de un total de 7, 8, 9 o 10 unidades nucleotídicas, en el que al menos el 70 % de las unidades de bases nucleotídicas del oligómero son unidades de análogos nucleotídicos de LNA de alta afinidad y un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
2.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 1, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región correspondiente de una secuencia de microARN (miARN) de mamífero, humano o viral.
3.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 2, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región correspondiente de una secuencia de miARN seleccionada del grupo de miARN enumerados en una cualquiera de las tablas 3, 4 o 5.
4.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 2 o 3, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia semilla de dicho microARN.
5.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 2 a 4, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de las secuencias enumeradas en la tabla 3 o 4.
6.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 4 o 5, en la que la base nucleotídica en 3’ del seedmero forma la base nucleotídica más en 3’ de la secuencia de nucleótidos contigua, en la que la secuencia de nucleótidos contigua puede comprender, opcionalmente, una o dos bases nucleotídicas adicionales en 5’.
7.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-6, en la que dicha secuencia de nucleótidos contigua no comprende un nucleótido que corresponde al primer nucleótido presente en la secuencia
de microARN contando desde el extremo 5’.
8.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-7, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una secuencia de nucleótidos contigua presente en un miARN seleccionado de las mostradas en las tablas 3 o 4 o 5.
9.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 8, en la que dicho miARN se selecciona grupo que consiste en miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222 y miR-375.
10.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-9, en la que al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o todas las unidades de bases nucleotídicas de la secuencia de nucleótidos contigua son unidades de análogos nucleotídicos.
11.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 10, en la que además de al menos un 70 % de las unidades nucleotídicas de LNA, las unidades de análogos nucleotídicos se seleccionan del grupo que consiste en unidad 2’-O-alquil-ARN, unidad 2’-OMe-ARN, unidad 2’-amino-ADN, unidad 2’-fluoro-ADN, unidad PNA, unidad HNA, unidad INA y una unidad 2’MOE ARN.
12.
La composición farmacéutica de acuerdo con las realizaciones 10 u 11, en la que al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o todas las unidades de bases nucleotídicas de la secuencia de nucleótidos contigua son unidades de bases nucleotídicas de ácido nucleico bloqueado (LNA).
13.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 12, en la que todas las unidades de bases nucleotídicas de la secuencia de nucleótidos contigua son unidades de bases nucleotídicas de LNA.
14.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-13, en la que la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 7, 8, 9 o 10 unidades de bases nucleotídicas de LNA, preferentemente contiguas.
15.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-14, en la que el oligómero consiste en 7, 8, 9 o 10 unidades de bases nucleotídicas contiguas y en la que al menos 7 unidades de bases nucleotídicas son unidades de análogos nucleotídicos.
16.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 15, en la que las unidades de análogos nucleotídicos son unidades de bases nucleotídicas de ácido nucleico bloqueado (LNA).
18.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-16, en la que al menos el 75 %, tal como el 80 % o 85 % o 90 % o 95 % o todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de bases nucleotídicas de la secuencia de nucleótidos contigua son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
19.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-18, en la que dicho oligómero está conjugado con uno o más compuestos que no son bases nucleotídicas.
20.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-19, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a la correspondiente secuencia de al menos dos secuencias de miARN, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de miARN.
21.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-20, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de al menos dos secuencias de la región semilla de miARN, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de la región semilla de miARN.
22.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 20 o 21, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a la correspondiente región de miR-221 y miR-222.
23.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 22, en la que la secuencia de nucleótidos contigua consiste en o comprende una secuencia que es complementaria a 5'GCUACAU3'.
24.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-23, en la que el oligómero
está constituido como un profármaco.
25.
La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 - 24, en la que la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una correspondiente región de has-miR-122.
26.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 25, para uso en el tratamiento de un trastorno médico o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: infección por el virus de la hepatitis C e hipercolesterolemia y trastornos relacionados.
27.
La composición farmacéutica de acuerdo con la realización 25 o 26, en la que la composición comprende además un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la vía de ensamblaje de las VLDL, tal como un inhibidor de la ApoB o un inhibidor de las MTP.
28.
Un kit que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la realización 25 o 26 y un segundo principio activo independiente que es un inhibidor de la vía de ensamblaje de las VLDL, tal como un inhibidor de la ApoB o un inhibidor de las MTP.
30.
Un oligómero, como se ha definido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1-25.
31.
Un conjugado que comprende el oligómero de acuerdo con la realización 30 y al menos un compuesto que no es una base nucleotídica.
32.
El uso de un oligómero o un conjugado como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 30-31 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno médico asociado con la presencia o sobreexpresión del microARN.
33.
Un procedimiento in Vitro para reducir la cantidad, o la cantidad eficaz, de un miARN en una célula, que comprende administrar un oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones precedentes a la célula que expresa dicho miARN de modo que reduzca la cantidad, o la cantidad eficaz del miARN en la célula.
34.
Un procedimiento in vitro para la des-represión de un ARNm cuya expresión está reprimida por un miARN en una célula, que comprende administrar un oligómero, un conjugado o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones precedentes a la célula que expresa tanto dicho ARNm como dicho miARN con el fin de des-reprimir la expresión del ARNm. Referencias: En los documentos de prioridad se proporcionan detalles de las referencias.
Ejemplos
La síntesis de monómeros y oligonucleótidos de LNA se realizó usando la metodología a la que se hace referencia en los ejemplos 1 y 2 del documento WO 2007/11275. La estabilidad de los oligonucleótidos de LNA en plasma humano o de rata se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 4 del documento WO 2007/112754. El tratamiento de las células in vitro con oligonucleótido antisentido anti-miR de LNA (dirigido a miR122) se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 6 del documento WO 2007/11275. El análisis de la inhibición por oligonucleótidos de la expresión de miR mediante PCR cuantitativa específica de microARN en un modelo tanto in vitro como in vivo se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 7 del documento WO 2007/11275. La evaluación de la especificidad de deficiencia LNA-antimiR usando el perfil de expresión en micromatriz de miARN se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 8 del documento WO 2007/112754. La detección de microARN mediante hibridación in sito se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 9 del documento WO 2007/112754. El aislamiento y análisis de la expresión del ARNm (aislamiento del ARN total y síntesis de ADNc para análisis del ARNm) en un modelo tanto in vitro como in vivo se realiza usando la metodología a la que se hace referencia en el ejemplo 10 del documento WO 2007/112754.Los experimentos in vivo usando oligómeros de la invención dirigidos a microARN-122 y el posterior análisis se realizan usando los procedimientos divulgados en los ejemplos 11-27 del documento WO 2007/112754.
Ejemplo 1: Diseño de los oligonucleótidos LNA-antimiR y temperaturas de fusión
Tabla 2. Oligómeros usados en los ejemplos y figuras. El nº de SEC es un identificador usado en los ejemplos y figuras, también se proporciona la SEC ID Nº que se usa en el listado de secuencias.
Nº de SEC del ejemplo/figura
SEC ID Nº Secuencia del compuesto Comentarios
Nº 3204
1 TcAGtCTGaTaAgCT
Nº 3205
2 GATAAGCT
Nº 3206
3 TcAcAATtaGCAtTA
Nº 3207
4 TAGCATTA
Nº 4
5 CcAttGTcaCaCtCC
Nº 3208
6 CACACTCC
Nº 3209
7 TAAGCT
Nº 3210
8 ATAAGCT
Nº 3211
9 TGATAAGCT
Nº 3212
10 CTGATAAGCT
Nº 3213
11 GTCTGATAAGCT
Nº 2114
12 CAGTCTGATAAGCT
Nº 3215
13 TCTGATAA
Nº 3216
14 ATCAGTCT
Nº 3217
15 TCAACATC
Nº 3218/Nº 3230
16 GGTAAACT Subrayado= coincidencia errónea
Nº 3219
17 CGTAATGA Subrayado= coincidencia errónea
Nº 3220
18 TCAgtctgataaGCTa Marcador fluorescente en 5’ (FAM)
Nº 3221
19 AGCACTTT
Nº 3222
20 ATTTGCAC
Nº 3223
21 AgCagACaaTgTaGC Marcador fluorescente en 5’ (FAM)
Nº 3224
22 GtAgcCAgaTgTaGC Marcador fluorescente en 5’ (FAM)
Nº 3225
23 ATGTAGC
Nº 3226
24 ACaAcCTacTaCcTC
Nº 3227
25 ACTACCTC
Nº 3228
26 CaCtgTCagCaCtTT
Nº 3229
27 TgCatAGatTtGcAC
Nº 3231
28 GTAGACT
Nº 3232
29 TACCTC
Nº 3233
30 CTACCTC
Nº 3234
31 TNCTACCTC N = base universal.
Nº 3235
32 TNCTACCTC N = base universal.
Nº 3236
33 GCaAcCTacTaCcTC
Nº 3237
34 ACaAcCTccTaCcTC
Nº 3238
35 ACaAaCTacTaCcTC
Nº 3239
36 CTACCTC
Nº 3240
37 CTAACTC
Nº 3241
38 TTAGCATTA
Nº 3242
39 CGATTAGCATTA
Nº 3243
977 CACGATTAGCATTA
Nº 3244
978 GCATTA
Nº 3245
979 AGCATTA
Las letras mayúsculas y minúsculas indican -NA y ADN, respectivamente. Las citosinas de LNA son, preferentemente, metil-citosina/5’-metil-citosina* Todos los enlaces internucleosídicos son, preferentemente, fosforotioato* Todos los LNA pueden ser, por ejemplo, beta-D-oxi LNA* *Usado en los ejemplos específicos.
Ejemplo 2: Modelo in vitro: Cultivo celular
El efecto de los oligonucleótidos de LNA sobre la expresión del ácido nucleico diana (cantidad) se puede analizar en cualquiera de una variedad de tipos celulares, con la condición de que el ácido nucleico diana esté presente a niveles mensurables. La diana se puede expresar de forma endógena o mediante transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica dicho ácido nucleico.
El nivel de expresión del ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria usando, por ejemplo, análisis de transferencia de tipo Northern (incluido Northern de microARN), PCR cuantitativa (incluida la PCRc de microARN), ensayos de protección de ribonucleasa. Los siguientes tipos celulares se proporcionan con fines ilustrativos, pero se pueden utilizar otros tipos celulares de forma rutinaria, siempre que la diana se exprese en el tipo celular escogido.
Las células se cultivaron en el medio adecuado tal como se describe a continuación y se mantuvieron a 37ºC a una humedad del 95-98 % y 5 % de CO2. Las células se pasaron de forma rutinaria 2-3 veces a la semana.
15PC3: La línea celular de cáncer de próstata humano 15PC3 fue donada amablemente por el Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, Países Bajos y se cultivó en DMEM (Sigma) + 10% de suero bovino fetal (FBS) + Glutamax I + Gentamicina.
PC3: La línea celular de cáncer de próstata humano PC3 se adquirió de la ATCC y se cultivó en medio de Coon con glutamina (Gibco) + 10% FBS + gentamicina.
518A2: La línea celular de cáncer de melanoma humano 518A2 fue donada amablemente por el Dr. B. Jansen, Section of experimental Oncology, Molecular Pharmacology, Department of Clinical Pharmacology, University of Vienna y se cultivó en DMEM (Sigma) + 10% de suero bovino fetal (FBS) + Glutamax I + gentamicina.
HeLa: La línea celular de carcinoma cervical HeLa se cultivó en MEM (Sigma) que contiene 10 % de suero bovino fetal, gentamicina a 37 ºC, 95 % de humedad y 5 % de CO2.
MPC-11: La línea celular de mieloma múltiple murino MPC-11 se adquirió de la ATCC y se mantuvo n DMEM con Glutamax 4mM + 10% de suero de caballo.
DU -145: La línea celular de cáncer de próstata humano DU-145 se adquirió de la ATCC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + 10% de FBS.
RCC-4 +/- VHL: La línea celular de cáncer renal humano RCC4 se transfectó de forma estable con el plásmido que expresa VHL o el plásmido vacío se adquirió de ECACC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
786-0: La línea celular de cáncer renal humano 786-0 se adquirió en la ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
HUVEC: La línea de células endoteliales de la vena umbilical humana HUVEC se adquirió de Camcrex y se mantuvo en medio EGM-2.
K562: La línea celular de leucemia mielógena crónica humana K562 se adquirió de la ECACC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + 10% de FBS. U87MG: La línea celular glioblastoma humano U87MG se adquirió en la ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
B16: La línea celular de melanoma murino B16 se adquirió en la ATCC y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
LNCap: La línea celular de cáncer de próstata humano LNCap se adquirió de la ATCC y se mantuvo en RPMI con Glutamax + 10% de FBS.
Huh-7: Hígado humano, epitelial, cultivado en medio MEM de Eagle con 10 % de FBS, Glutamax I 2Mm, 1 x aminoácidos no esenciales, gentamicina
L428: (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Alemania)): Linfoma de células B humano mantenido en RPMI 1640 suplementado con 10 % de FCS, L-glutamina y antibióticos.
5 L1236: (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Alemania)): Linfoma de células B humano mantenido en RPMI 1640 suplementado con 10 % de FCS, L-glutamina y antibióticos.
Ejemplo 3: Diseño de una biblioteca antimiR LNA para todas las secuencias de microARN humano en la base de datos de miRBase microARN.
10 La versión de miRBase usada fue la versión 12. como se indica en Griffiths-Jones, S., Grocock, R.J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A.J. 2006. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34: D140-4, y disponible en http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml.
15 La tabla 1 muestra secuencias de nucleótidos de 7, 8 y 8 unidades que comprenden la secuencia de seedmero de microARN de acuerdo con la base de datos miRBase microARN. La secuencia del seedmero comprende la complementaria inversa de la región semilla del microARN. En algunas realizaciones, el oligómero de la invención tiene una secuencia de nucleótidos contigua seleccionada de las secuencias de 7, 8 o 9 unidades. Con respecto a las secuencias de 7, 8 o 9 unidades, en algunas realizaciones, todos los enlaces internucleosídicos son
20 fosforotioato. Las secuencias de nucleótidos de 7, 8 o 9 unidades pueden consistir en la secuencia de análogos nucleotídicos como se describe en el presente documento, tal como análogos nucleotídicos de LNA. Las citosinas de LNA pueden ser metil-citosina (5’-metil-citosina). En algunas realizaciones, el LNA es beta-D-oxi-LNA.
La tabla 3 proporciona una lista de microARN agrupados en aquéllos a los que se pueden dirigir los mismos
25 oligómeros de seedmero, tal como los de 7, 8 o 9 unidades proporcionados en el presente documento (véase la tabla 1).
Tabla 3
hsa-let-7a*, hsa-let-7f-1*
hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7f, hsa-miR-98, hsa-let-7g, hsa-let-7i
hsa-miR-1, hsa-miR-206
hsa-miR-103, hsa-miR-107
hsa-miR-10a, hsa-miR-10b
hsa-miR-125b, hsa-miR-125a-5p
hsa-miR-129*, hsa-miR-129-3p
hsa-miR-130a, hsa-miR-301a, hsa-miR-130b, hsa-miR-454, hsa-miR-301b
hsa-miR-133a, hsa-miR-133b
hsa-miR-135a, hsa-miR-135b
hsa-miR-141, hsa-miR-200a
hsa-miR-146a, hsa-miR-146b-5p
hsa-miR-152, hsa-miR-148b
hsa-miR-154*, hsa-miR-487a
hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-15b, hsa-miR-195, hsa-miR-497
hsa-miR-17, hsa-miR-20a, hsa-miR-93, hsa-miR-106a, hsa-miR-106b, hsa-miR-20b, hsa-miR-526b*
hsa-miR-181a, hsa-miR-181c
hsa-miR-181b, hsa-miR-181d
hsa-miR-18a, hsa-miR-18b
hsa-miR-190, hsa-miR-190b
hsa-miR-192, hsa-miR-215
hsa-miR-196a, hsa-miR-196b
hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b-3p
hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-199b-5p
hsa-miR-19a*, hsa-miR-19b-1*, hsa-miR-19b-2*
hsa-miR-19a, hsa-miR-19b
hsa-miR-200b, hsa-miR-200c
hsa-miR-204, hsa-miR-211
hsa-miR-208a, hsa-miR-208b
hsa-miR-212, hsa-miR-132
hsa-miR-23a*, hsa-miR-23b*
hsa-miR-23a, hsa-miR-23b, hsa-miR-130a*
hsa-miR-24-1*, hsa-miR-24-2*
hsa-miR-25, hsa-miR-92a, hsa-miR-367, hsa-miR-92b
hsa-miR-26a, hsa-miR-26b
hsa-miR-26a-1*, hsa-miR-26a-2*
hsa-miR-27a, hsa-miR-27b
hsa-miR-29a, hsa-miR-29b, hsa-miR-29c
hsa-miR-302a, hsa-miR-302b, hsa-miR-302c, hsa-miR-302d, hsa-miR-373, hsa-miR-520e, hsa-miR-520a-3p, hsamiR-520b, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-520d-3p
hsa-miR-302b*, hsa-miR-302d*
hsa-miR-30a*, hsa-miR-30d*, hsa-miR-30e*
hsa-miR-30a, hsa-miR-30c, hsa-miR-30d, hsa-miR-30b, hsa-miR-30e
hsa-miR-330-5p, hsa-miR-326
hsa-miR-34a, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-449a, hsa-miR-449b
hsa-miR-362-3p, hsa-miR-329
hsa-miR-374a,hsa-miR-374b
hsa-miR-376a, hsa-miR-376b
hsa-miR-378, hsa-miR-422a
hsa-miR-379*, hsa-miR-411*
hsa-miR-381, hsa-miR-300
hsa-miR-509-5p, hsa-miR-509-3-5p
hsa-miR-515-5p, hsa-miR-519e*
hsa-miR-516b*, hsa-miR-516a-3p
hsa-miR-517a, hsa-miR-517c
hsa-miR-518a-5p, hsa-miR-527
hsa-miR-518f, hsa-miR-518b, hsa-miR-518c, hsa-miR-518a-3p, hsa-miR-518d-3p
hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-519a
hsa-miR-519c-5p, hsa-miR-519b-5p, hsa-miR-523*, hsa-miR-518f*, hsa-miR-526a, hsa-miR-520c
5p, hsa-miR-518e*, hsa-miR-518d-5p, hsa-miR-522*, hsa-miR-519a*
hsa-miR-519e, hsa-miR-33b*
hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-525-5p
hsa-miR-520g, hsa-miR-520h
hsa-miR-524-5p, hsa-miR-520d-5p
hsa-miR-525-3p, hsa-miR-524-3p
hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-548d-5p
hsa-miR-7-1*, hsa-miR-7-2*
hsa-miR-99a, hsa-miR-100, hsa-miR-99b
Los inventores han construido un LNA-antimiR de 8 unidades contra miR-21, miR-155 and miR-122 (designado en el presente documento como micromiR) que está completamente modificado con LNA y fosforotiolado (véase la figura 1 y la tabla 6).
5 Los resultados de experimentos repetidos en células MCF-7, HeLa, Raw and Huh-7 usando un plásmido sensor de luciferasa para miR-21, miR-155 y miR-122 demuestran que los LNA-antimiR cortos modificados completamente con LNA son muy potentes antagonizando los microARN.
10 Tabla 4. LNA_antimiR y secuencias de MicromiR y Tm previstas.
SEC ID Nº
microARN Secuencia Tm (°C)
3204
miR-21 T c A G t C T G a T a A g C T 73
3205
G A T A A G C T 33
3206
miR-155 T c A c A A T t a G C A t T A 63
3207
T A G C A T T A 45
4
miR-122 C c A t t G T c a C a C t CC 73
3208
C A C A C T C C 62
Las letras en mayúscula son unidades de LNA, tal como beta-D-oxi LNA. Las letras en minúscula son unidades de ADN. Los enlaces internucleosídicos son, preferentemente, fosforotioato. Las citosinas de LNA son, preferentemente, metil-citosina/5-metil-citosina.
15 Las temperaturas de fusión se pueden evaluar hacia la secuencia de microARN madura usando un oligonucleótido de microARN sintético (que normalmente consiste en nucleótidos de ARN con una estructura fosfodiéster). Las Tm medidas normalmente son mayores que las Tm previstas cuando se usan oligómeros de LNA contra el ARN diana.
20 Ejemplo 4: Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante LNA-antimiR de SEC ID Nº 3205 en células MCF7 usando un ensayo sensor de luciferasa.
Con el fin de evaluar la eficiencia de un oligonucleótido LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3205) a la hora de apuntar y antagonizar miR-21 se realizaron constructos sensores de luciferasa
25 que contenían un sitio diana de coincidencia perfecta para el miR-21 maduro como control, un sitio diana con dos mutaciones en la semilla (figura 6). Con el fin de monitorizar la inhibición de microRNA-21, la línea celular de carcinoma de mama MCF-7 se transfectó con los diferentes constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 de SEC ID Nº 3205 a varias concentraciones en comparación con el LNA-antimiR de 15 unidades de SEC ID Nº 3204 contra miR-21. Tras 24 horas se midió la actividad de la luciferasa.
30 Resultados: Como se ve en la figura 22, el nuevo LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3205) muestra dos veces más potencia en comparación con la SEC ID Nº 3204, como se muestra mediante la des-represión de la actividad de la luciferasa. Por el contrario, el constructor sensor de miR-21 CONTROL CON DOS coincidencias erróneas en la semilla miR-21 no mostró ninguna des-represión de la actividad
35 luciferasa de luciérnaga, de modo que se demuestra la especificidad del sensor miR-21 de coincidencia perfecta en la monitorización de la actividad de miR-21 en las células. La des-represión de la actividad luciferasa por el LNAantimiR de 8 unidades depende claramente de la dosis, que no se ve con la SEC ID Nº 3204. Además, el nuevo de 8 unidades también es mucho más potente a dosis menores que la SEC ID Nº 3204.
40 Para concluir, el LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) muestra una potencia significativamente mejorada en la inhibición de miR-21 in vitro en comparación con el LNA-antimviR de 15 unidades de SEC ID Nº 3204 dirigido a miR-21.
Materiales y procedimientos:
45 Línea celular: La línea celular de carcinoma de mama MCF-7 se adquirió de la ATCC (#HTB-22™). Las células MCF-7 se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 400.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células MCF-7 se transfectaron con 0,8 ug de miR-21 coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío (SDS Promega) junto con 1 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa. Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con raspador celular, tras lo cual se centrifugaron las células durante 5 minutos a 10.000 rpm. Se descartó el sobrenadante y al sedimento celular se añadieron 50 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las células se introdujeron en hielo durante 30 minutos. Las células lisadas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 20 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 5: Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante LNA-antimiR de SEC ID Nº 3205 en células HeLa usando un ensayo sensor de luciferasa.
Para evaluar adicionalmente la eficiencia del LNA-antimiR de 8 unidades modificado completamente con LNA de SEC ID Nº 3205 dirigido a miR-21, la línea celular de carcinoma de cerviz HeLa también se transfectó con los constructos sensores de luciferasa de miR-21 descritos anteriormente junto con la SEC ID Nº 3205 a varias concentraciones como se ha descrito en la sección anterior (figura 3).
Resultados: La SEC ID Nº 3205 muestra la des-represión completa del constructo sensor de luciferasa miR-21 en células HeLa ya a 5 nM en comparación con la SEC ID Nº 3204, que no mostró des-represión completa hasta la dosis más alta (50 nM ). Además, el antagonismo de miR-21 por el LNA-antimiR de 8 unidades de SEC ID Nº 3205 depende de la dosis. Para demostrar la especificidad del ensayo sensor de luciferasa miR-21, un sitio diana de miR21 de coincidencia errónea (2 coincidencias erróneas en la semilla) también se transfectó en células HeLa, pero no mostró ninguna des-represión de la actividad luciferasa de luciérnaga.
Para concluir, la SEC ID Nº 3205 modificada completamente con LNA muestra una potencia significativamente mejorada en la inhibición de miR-21 in vitro tanto en células MCF-7 como HeLa en comparación con el LNA-antimiR de 15 unidades de SEC ID Nº 3204.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cerviz humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 60.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 ug de miR-21 coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa. Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 100 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 10 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 6: Evaluación del antagonismo de miR-155 mediante LNA-antimiR de SEC ID Nº 3207 en células RAW usando un ensayo sensor de luciferasa.
Para ver si un LNA-antimiR de 8 unidades modificado completamente con LNA puede antagonizar con eficacia miR155, se clonó un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-155 en el mismo vector de luciferasa (psiCHECK2) y se transfectó en la línea de células RAW de macrófagos monocitos leucémicos de ratón. Dado que los niveles endógenos de miR-155 son bajos en la línea celular RAW, las células fueron tratadas LPS 100 ng/ml durante 24 horas con el fin de inducir la acumulación de miR-155.
Resultados: Las mediciones de la luciferasa mostraron que el LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA de SEC ID Nº 3207 DIRIGIDO A miR-155 fue similarmente eficaz en cuanto a antagonizar miR155 en comparación con el LNA-antimiR de 15 unidades de SEC ID Nº 3206 (figura 4). Ambos LNA-antimir mostraron una des-represión > 50 % del sensor de luciferasa de miR-155 a una concentración de 0,25 nM e inhibió el miR-155 de un modo dependiente de la dosis.
Conclusión: Estos datos avalan también los resultados del antagonismo de miR-21, como se muestra en los ejemplos 1 y 2, lo que demuestra que un LNA-antimiR de 8 unidades completamente tiolado es muy potente al usar los microARN como objetivo.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea de monocitos macrófagos leucémicos de ratón RAW 264.7 se adquirió en la ARCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 4 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 500.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células MCF-7 se transfectaron con 0,3 ug de miR-155 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 10 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con el fin de inducir la acumulación de miR-155, a las células RAW se añadió LPS (100 ng/ml) después de la incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Tras otras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con raspador celular, tras lo cual se centrifugaron las células durante 5 minutos a 2,500 rpm. Se descartó el sobrenadante y al sedimento celular se añadieron 50 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las células se introdujeron en hielo durante 30 minutos. Las células lisadas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 20 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 7: Evaluación del antagonismo de miR-122 mediante LNA-antimiR de SEC ID Nº 3208 en células HuH-7 usando un ensayo sensor de luciferasa.
La potencia del LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado de SEC ID Nº 3208 contra miR-122 se evaluó en la línea celular de hepatoma humano HuH-7. Las células HuH-7 se transfectaron con el constructor sensor de luciferasa que contiene un sitio diana de miR-122 de coincidencia perfecta. Tras 24 horas se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa (figura 5).
Resultados: El LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA de SEC ID Nº 3208 es más potente que el LNA-antimiR de 15 unidades de SEC ID Nº 4 a concentración baja, como se muestra mediante la desrepresión del sensor de luciferasa de miR-122. Ambos LNA-antimiR inhiben miR-122 de un modo dependiente de la dosis (figura 5).
Conclusión: El LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA de SEC ID Nº 3208 dirigido a miR122 muestra una potencia mejorada en la inhibición de miR-122 in vitro.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de hepatoma humano HuH-7 fue un amable regalo de R. Bartenschlager, Heidelberg. Las células Huh-7 se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 8.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HuH-7 se transfectaron con 57 ug de miR-122 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 1 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen). Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa. Ensayo de la luciferasa: A cada pocillo se añadieron 50 l 1 x de tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual la placa de 96 pocillos se introdujo en un agitador orbital durante 30 minutos. A cada pocillo se añadió el sistema dual de ensayo indicador de luciferasa (Promega) y se realizaron las mediciones de la actividad de luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 8. Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante comparación de LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) frente a LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3204) en células de carcinoma de próstata humano (PC3).
Previamente, los inventores han mostrado (en el presente documento) que el LNA-antimiR de 8 unidades que está completamente modificado con LNA y fosforotiolado puede des-reprimir completamente los niveles indicadores de luciferasa miR-21 en la línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7. Después, los inventores extendieron este enfoque de selección a la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Para evaluar la eficiencia de los diferentes oligonucleótidos LNA-antimiR contra miR-21 se generaron constructos indicadores de luciferasa en los que un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-21 maduro y un sitio diana con dos coincidencias erróneas en la semilla se clonaron en la región 3'UTR del gen de la luciferasa de renilla (figura 7). Con el fin de monitorizar la inhibición de miR-21, las células PC3 se transfectaron con los diferentes constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 de SEC ID Nº 3205 (8 unidades) y para una comparación con el LNA-antimiR de 15 unidades con coincidencia perfecta de SEC ID Nº 3204 a varias concentraciones. Tras 24 horas, se midió la actividad de luciferasa.
Resultados: Los experimentos indicadores de luciferasa mostraron una des-represión dependiente de la dosis de la actividad indicadora de luciferasa de miR-21 con el LNA-antimiR de 15 unidades contra miR-21 (SEC ID Nº 3204). No obstante, la des-represión completa del indicador de luciferasa no se obtuvo ni siquiera a las concentraciones más altas (figura 7). En contraste, las células que se transfectaron con el LNA-antimiR de 8 unidades completamente sustituido con LNA mostró des-represión completa ya a 1 nM, lo que indica una potencia significativamente mejorada en comparación con el LNA-antimiR de 15 unidades. El indicador control de la luciferasa que aloja un sitio diana de coincidencia errónea para miR-21 no se vio afectado por ningún LNA-antimiR, lo que demuestra una elevada especificidad de ambos LNA-antimiR.
Conclusión: El micromir es mucho más potente que el LNA-antimiR de 15 unidades a la hora de dirigirse a miR-21 y hasta ahora ha mostrado que es más potente en células de carcinoma de próstata.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de próstata humano PC3 se adquirió de la ECACC (#90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 0,3 ug de miR-21 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 1,2 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNAantimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a los pocillos se añadieron 250 l de 1x tampón de lisis pasiva (Promega). Las placas se introdujeron en un agitador durante 30 minutos, tras lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos de eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 minutos y 2.500 rpm, tras lo cual se transfirieron 20 l a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 9. Evaluación de la especificidad del antagonismo de miR-21 mediante un LNA-antimiR de 8 unidades
Para investigar la especificidad del LNA-antimiR corto dirigido a miR-21, los inventores diseñaron un LNA-antimiR control de coincidencia errónea de 8 unidades (SEC ID Nº 3218) que contiene 2 coincidencias erróneas en la secuencia de reconocimiento de semilla (véase la figura 8). Los constructos indicadores de luciferasa descritos en el ejemplo 1 se transfectaron en la línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa junto con el oligo control de coincidencia errónea de LNA de SEC ID Nº 3218 y su eficacia se comparó con el LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) miR-21. Tras 24 horas se midió la actividad de la luciferasa.
Resultados: Como se muestra en la figura 8, la transfección del LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA en células HeLa tuvo como resultado una des-represión completa del indicador miR-21 de luciferasa ya a 5 nM. En contraste, cuando las células se transfectaron con el oligo control de coincidencia errónea de LNA de 8 unidades, combinado con los resultados obtenidos con el indicador de luciferasa de miR-21 control que tiene dos coincidencias erróneas en la semilla miR-21, estos datos demuestran una especificidad elevada del LNAantimiR de 8 unidades completamente sustituido con LNA en términos de dirigirse a miR-21 en células HeLa.
El análisis de la base de datos de secuencias de miRBase microRNA mostró que la secuencia de reconocimiento demiR-21 del LNA-antimiR de SEC ID Nº 3205 ES ÚNICA PARA microRNA-21. No obstante, cuando se disminuye la longitud del micromer a 7 nucleótidos, no es específica de únicamente miR-21, ya que también se han dirigido a athmiR-844, mmu-miR-590-3p y has-miR-590-3p.
Conclusión: El intercambio de dos posiciones de nucleótidos dentro del LNA-antimiR de 8 unidades con dos nucleótidos de coincidencia errónea abolió completamente la actividad de antagonismo del LNA-antimiR para miR
21.
Materiales y procedimientos: Línea celular: La línea celular de carcinoma de cerviz humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 60.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 ug de miR-21 coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 100 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 10 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 10. Evaluación de la longitud más corta posible de un LNA-antimiR completamente modificado con LNA que participa en el antagonismo eficaz de miR-21.
Para investigar más los requisitos de longitud de LNA-antimiR, los inventores diseñaron un LNA-antimiR de 7 unidades y de 6 unidades dirigido a miR-21, ambos oligonucleótidos completamente modificados con LNA y fosforotiolados. Los constructos indicadores de luciferasa de miR-21 se transfectaron en células HeLa junto con los LNA-antimiR a varias concentraciones. Se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa tras 24 horas.
Resultados: Como se ve en la figura 9, el LNA-antimiR de 7 unidades media la des-represión del plásmido indicador de luciferasa de miR-21, pero a menor potencia en comparación con el LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205). No obstante, todavía se puede observar una tendencia dependiente de la dosis. En contraste, el LNA-antimiR de 6 unidades no mostró ninguna actividad inhibidora.
Conclusión: Para concluir, la longitud más corta posible de un LNA-antimiR que es capaz de participar en la inhibición de miR-21 es 7 nucleótidos. No obstante, el LNA-antimiR de 7 unidades es menos potente en comparación con el LNA-antimiR de 8 unidades para miR-21.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 60.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 ug de miR-21 coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 100 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 10 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 11. Evaluación de la longitud de LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA que antagonizan miR-21
Después, los inventores investigaron el efecto de incrementar la longitud de un LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA de 9 unidades a 14 unidades sobre el antagonismo de miR-21 en células HeLa. Los LNAantimiR resultantes se transfectaron en células HeLa junto con los constructos indicadores de luciferasa de miR-21. Se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa tras 24 horas.
Resultados: El LNA-antimiR de 9 unidades de SEC ID Nº 3211 (9 unidades) mostró des-represión dependiente de la dosis del indicador de luciferasa de miR-21, que no alcanzó una des-represión completa, como se ha demostrado para el LNA-antimiR de 7 unidades (SEC ID Nº 3210). El incremento de la longitud de 10 unidades a 14 unidades (SEC ID Nº 3212, SEC ID Nº 3213 y SEC ID Nº 3214) disminuyó la potencia como se muestra mediante la desrepresión menos eficiente del indicador de miR-21.
Conclusión: Como se muestra en la figura 19, el LNA-antimiR más largo completamente modificado por LNA y fosforotiolado que todavía es capaz de participar en la inhibición de miR-21 es un LNA-antimiR de 9 unidades de SEC ID Nº 3211. No obstante, es claramente menos eficiente que los LNA-antimiR de 8 unidades y de 7 unidades.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 60.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 ug de miR-21 coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 100 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 10 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 12. Determinación de la posición más óptima para un LNA-antimiR de 8 unidades dentro de la secuencia de reconocimiento de la diana de miR.
Los experimentos de los inventores han mostrado que el LNA-antimiR completamente modificado con LNA fosforotiolado más potente tiene una longitud de 8 nucleótidos. Para evaluar la posición más óptima para un LNAantimiR de 8 unidades dentro de la secuencia de reconocimiento diana de miR, los inventores diseñaron cuatro LNAantimiR de 8 unidades completamente modificados con LNA a través de la secuencia madura de miR-21 como se muestra en la figura 11. Los diferentes LNA-antimiR se co-transfectaron junto con los constructos indicadores de luciferasa de miR-21 en células HeLa. Se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa tras 24 horas.
Resultados: El único LNA-antimiR que participó en la silenciación eficiente de miR-21 medido mediante el indicador de luciferasa fue la SEC ID Nº 3205, que está dirigido a la región semilla de miR-21. Ni la SEC ID Nº 3215 que se ha
diseñado para cubrir el extremo 3’ de la semilla (50 % de semilla objetivo) no mostró ningún efecto ni tampoco los
otros dos LNA-antimiR de SEC ID Nº 3216 o SEC ID Nº 3217, que estaban colocados para apuntar a la región central y el extremo 3’ del miR-21 maduro, respectivamente.
Conclusión: El único LNA-antimiR de 9 unidades que participa en la potente silenciación de miR-21 es el que está dirigido a la semilla de miR-21.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 60.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 ug de miR-21 coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 100 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 10 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 13. Validación de la interacción del sitio diana de miR-21 en la Pdcd4-3'-UTR y miR-21 usando el LNA-antimiR de 8 unidades de SEC ID Nº 3205.
La proteína supresora tumoral Pdcd4 inhibe la transformación neoplásica inducida por TPA, la estimulación tumoral y la progresión. También se ha mostrado que Pdcd4 está regulada por aumento en la apoptosis en respuesta a diferentes inductores. Además, la regulación por disminución de Pdcd4 en el cáncer de pulmón y colorrectal también se ha asociado con un mal pronóstico para el paciente. Recientemente, Asangani y col., y Frankel y col., mostraron que la Pdcd4-3'-UTR contiene un sitio diana conservado para miR-21 y transfectar las células con un antimiR-21 tuvo como resultado un incremento de la proteína Pdcd4. Por tanto, los inventores construyeron un plásmido indicador de luciferasa que aloja 313 nt de la región 3'UTR de Pdcd4, que abarca el sitio diana de miR-21 mencionado anteriormente, que se co-transfectó junto con diferentes LNA-antimiR en células HeLa. Los diferentes LNA-antimiR fueron de SEC ID Nº 3205 (8 unidades, coincidencia perfecta) o de SEC ID Nº 3218 (8 unidades, coincidencia errónea). Se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa tras 24 horas.
Resultados: Como se muestra en la figura 12, en células transfectadas con el indicador de la luciferasa de Pdcd4 3'UTR y la SEC ID Nº 3205 se observó un incremento de la actividad de luciferasa, lo que indica una interacción entre Pdcd4 3'UTR and miR-21. No obstante, transfectar las células con el compuesto con coincidencia errónea, SEC ID N1 3218, no se observaron cambios en la actividad de luciferasa, lo que estaba previsto ya que el compuesto no antagoniza miR-21. Cuando se comparó el LNA-antimiR de 8 unidades contra dos LNA-antimiR diseñados más largos, el LNA-antimiR corto completamente modificado con LNA y fosforotiolado fue significativamente más potente, lo que confirma los datos previos del ensayo de luciferasa.
Conclusión: Estos datos concluyen que la SEC ID Nº 3205, que antagoniza miR-21, puede regular la interacción entre Pdcd4 3'UTR y miR-21.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 60.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 0,2 ug de Pdcd4-3'UTR/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,7 Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de oligonucleótidos de LNA-antimiR Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 100 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 10 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 14. Comparación de un LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3207) con un LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3206) en el antagonismo de miR-155 en células RAW de ratón.
Para saber si el enfoque de usar LNA-antimiR cortos se podía adaptar a apuntar a otros miARN, los inventores diseñaron un LNA-antimiR de 9 unidades completamente modificado con LNA contra microARN-155. Un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-155 se clonó en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el plásmido indicador psiCHECK2 y se transfectó en la línea celular de macrófagos RAW de ratón junto con un LNA-antimiR de 9 o de 15 unidades. Dado que los niveles endógenos de miR-155 son bajos en la línea celular RAW, las células fueron tratadas LPS 100 ng/ml durante 24 horas con el fin de inducir la acumulación de miR-155. Tras 24 horas, se realizó un análisis de la luciferasa.
Resultados: Las mediciones de la luciferasa mostraron que el LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA de SEC ID Nº 3207 DIRIGIDO A miR-155 fue similarmente eficaz en cuanto a antagonizar miR155 en comparación con el LNA-antimiR de 15 unidades de SEC ID Nº 3206 (figura 13). Ambos LNA-antimiR mostraron una des-represión > 50 % del sensor de luciferasa de miR-155 a una concentración de 0,25 nM e inhibió el miR-155 de un modo dependiente de la dosis.
El análisis de la base de datos de secuencias de miRBase microRNA mostró que la secuencia de reconocimiento demiR-155 del LNA-antimiR de SEC ID Nº 3207 ES ÚNICA PARA microRNA-155. No obstante, cuando se disminuye la longitud del micromer a 7 nucleótidos, no es específica de únicamente miR-155, mdv1-miR-M4 y kshv-miR-K12
11.
Conclusión: Un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA y fosforotiolado es igualmente potente en comparación con un LNA-antimiR de 15 unidades de un diseño mixto LNA/ADN a la hora de antagonizar miR-155.
Por tanto, el enfoque lo los inventores de usar LNA-antimiR cortos se puede adaptar fácilmente a dirigirlos a otros miARN.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7 se adquirió en la ATCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 4 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 500.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células RAW 264.7 se transfectaron con 0,3 ug de miR-155 coincidencia perfecta/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 10 de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Con el fin de inducir la acumulación de miR-155, a las células RAW se añadió LPS (100 ng/ml) después de la incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Tras otras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con raspador celular, tras lo cual se centrifugaron las células durante 5 minutos a 2.500 rpm. Se descartó el sobrenadante y al sedimento celular se añadieron 50 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las células se introdujeron en hielo durante 30 minutos. Las células lisadas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 20 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 15. Evaluación de los niveles de la proteína c/EBPβ como lectura funcional del antagonismo de miR155 por LNA-antimiR corto (SEC ID Nº 3207).
Como lectura funcional del antagonismo de miR-155 por LNA-antimiR corto (SEC ID Nº 3207), los inventores determinaron los niveles de proteína de una nueva diana de miR-155, c/EBPβ. La línea celular de macrófagos de ratón RAW se transfectó junto con un LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3207) o de 15 unidades (SEC ID Nº 3206) en ausencia o presencia de pre-miR 155. Como controles de coincidencia errónea para el de 15 unidades se usó la SEC ID Nº 4, que está dirigida a miR-122 y para el de 8 unidades se usó la SEC ID Nº 3205, que está dirigida a miR-21. Estos dos miARN control no regulan los niveles de expresión de c/EBPβ. Se usó LPS para inducir acumulación de miR-155 y las células se recogieron tras 16 horas con LPS. c/EBPβ tiene tres isoformas, LIP, LAP y LAP*, que se detectaron mediante análisis de transferencia de tipo western y las mismas membranas se volvieron a sonda con beta-tubulina como control de carga.
Resultados: Se calcularon las proporciones para c/EBPβ LIP y beta-tubulina como se indica en la figura 14. Las células RAW se transfectaron con el LNA-antimiR de 15 unidades y ningún pre-miR-155 mostró proporciones c/EBPβ LIP/beta-tubulina iguales, debido a que la inhibición de miR-155 aumenta los niveles de c/EBPβ LIP (figura 14, panel de la izquierda). Por comparación, la transfección de pre-miR-155 en las células RAW tuvo como resultado una disminución de los niveles de c/EBPβ LIP según lo previsto, si c/EBPβ era una diana de miR-155, como se muestra en los controles con extractos proteicos de las células RAW tratadas sin LNA o una coincidencia errónea. No obstante, los extractos proteicos de las células RAW transfectadas con LNA-antimiR contra miR-155 mostraron un incremento de los niveles de c/EBPβ LIP. Los mismos experimentos también se llevaron a cabo con el LNAantimiR-155 de 8 unidades (SEC ID Nº 3207) y, como se muestra en la figura 14 (panel de la derecha) se obtuvieron resultados comprables a los del LNA-antimiR de 15 unidades SEC ID Nº 3206.
Conclusión: El antagonismo de miR-155 usando un LNA-antimiR de 8 unidades o de 15 unidades conduce a la des
represión de la c/EBPβ.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7 se adquirió en la ATCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 4 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 500.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células RAW 264.7 se transfectaron con 5 nmol de pre-miR-155 (Ambion) y/o LNA-antimiR 5 nM junto con 10 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Con el fin de inducir la acumulación de miR-155, a las células RAW se añadió LPS (100 ng/ml) después de la incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Tras 16 horas, se recogieron las células para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia de tipo western. Análisis de transferencia de tipo Western: Las células se lavaron con PBS, se digirieron con tripsina, se transfirieron a tubos de eppendorf y se añadieron 250 l de tampón de lisis (1xRIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 minutos y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, La concentración de proteínas se midió con Coomassie Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cargaron 80 ug sobre un gel de 4-12 % de BIS-TRIS.
La membrana se incubó durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario monoclonal de ratón C/EBP β (Santa Cruz) con una concentración de 1:100. Se visualizaron bandas inmunorreactivas con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 16. Antagonismo de miR-106b por un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3221)
Para confirmar que el enfoque de los inventores de usar LNA-antimiR cortos se podía adaptar a apuntar otros miARN, los inventores diseñaron un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA contra microARN-106B. Un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-106b se clonó en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el vector (psiCHECK2) y se transfectó en la línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa junto con un LNAantimiR corto (SEC ID Nº 3221) o con un LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3228) a concentraciones variables. Se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa tras 24 horas.
Resultados: La transfección del LNA-antimiR de 8 unidades, SEC ID Nº 3221, contra miR-1 06b tuvo como resultado una inhibición dependiente de la dosis de miR-106b, como muestra la des-represión del indicador de luciferasa, que se des-reprimió completamente a una concentración del LNA-antimiR de 1 nM. Se obtuvieron resultados comparables usando el LNA-antimiR de 15 unidades, SEC ID Nº 3228, lo que demuestra que un LNA-antimiR de 8 unidades tiene una potencia similar al de 15 unidades.
Conclusión: El uso de miR-1 06b como objetivo en las células HeLa muestra que un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA y fosforotiolado tiene la misma potencia que el LNA-antimiR mixto de LNA/ADN de 15 unidades.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 5.200 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 57 ng de
coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,14 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 30 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 17. Antagonismo de miR-19a por un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3222)
Para confirmar además que el enfoque de los inventores de usar LNA-antimiR cortos se podía adaptar a apuntar otros miARN, los inventores diseñaron un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA contra microARN-19a. Un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-19a se clonó en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el vector psiCHECK2. El plásmido indicador se transfectó en la línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa junto con un LNA-antimiR corto (SEC ID Nº 3222) o con un LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3229) dirigidos a miR-19a a concentraciones variables. Se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa tras 24 horas.
Resultados: Como se muestra en la figura 16, la transfección del LNA-antimiR de 15 unidades SEC ID Nº 3229 en HeLa antagoniza de forma eficiente miR-19a, como demuestra la des-represión completa a una concentración de LNA-antimiR de 1 nM. Por comparación, la transfección del LNA-antimiR de 8 unidades, SEC ID Nº 3222, tuvo como resultado un antagonismo eficaz de miR-19a ya a una concentración de 0,5 nM, lo que indica que este LNA-antimiR de 8 unidades tiene al menos la misma potencia que un LNA-antimiR de 15 unidades en las células HeLa.
Conclusión: El uso de miR-19a como objetivo en las células HeLa muestra que un LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA y fosforotiolado tiene al menos la misma potencia que el LNA-antimiR mixto de LNA/ADN de 15 unidades.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 5.200 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con 57 ng de
coincidencia perfecta/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 0,14 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a cada pocillo se añadieron 30 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las placas de 24 pocillos se introdujeron en un agitador orbital durante 30 minutos. Se recogieron las células y se transfirieron a u tubo eppendorf y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 18. Objetivo la familia de microARN usando LNA-antimiR cortos completamente sustituidos con LNA.
Después, los inventores investigaron si era posible apuntar a la familia de microARN usando un solo LNA-antimiR corto de 7 unidades complementario a la secuencia semilla que es común a todos los miembros de la familia (véase la figura 17), En este experimento, los inventores se centraron en miR-221 y miR-222 que se sobreexpresan en tumores sólidos del colon, páncreas, próstata y estómago. También se ha demostrado que miR-221 y miR-222 son los microARN regulados por aumento de forma más significativa en el glioblastoma multiforme. Además, la sobreexpresión de miR-221 y miR-222 puede contribuir al crecimiento y la progresión del carcinoma de próstata, al menos en parte, bloqueando la proteína supresora tumoral p27. Un sitio diana de coincidencia perfecta para miR221 y miR-222, respectivamente, se clonó en la 3'UTR del gen de la luciferasa y dio como resultado dos constructos indicadores. Después, estos constructos se transfectaron por separado o combinados en la línea celular de carcinoma de próstata PC3. Además, al de 7 unidades, dirigido a miR-221 y miR-222, los inventores también cotransfectaron un LNA-antimiR (15mer) de 15 unidades dirigido a miR-221 (SEC ID Nº 3223) o A miR-222 (SEC ID Nº 3224), cada uno transfectado por separado o juntos (véase la figura 18, izquierda).
Resultados: Como se muestra en la figura 18, la transfección de las células PCR con el LNA-antimiR de SEC ID Nº 3223 contra miR-221 tuvo como resultado una inhibición eficiente de miR-221 a una concentración de LNA-antimiR de 1 nM. También se observa un efecto inhibidor cuando se usa el plásmido indicador de luciferasa para miR-222, así como cuando se co-transfecta los indicadores de luciferasa para miR-221 y miR-222 de forma simultánea en las células PC3. Este efecto inhibidor es muy probable que se deba a la secuencia semilla compartida entre miR-221 y miR-222. De un modo similar, la transfección de las células PC3 con el LNA-antimiR, SEC ID Nº 3224, contra miR222, tuvo como resultado una inhibición eficiente de miR-222 a una concentración de LNA-antimiR de 1 nM como muestra la des-represión completa del indicador de luciferasa para miR-222. También se observa un efecto inhibidor cuando se usa el plásmido indicador de luciferasa para miR-222 así como cuando se co-transfectan ambos indicadores de luciferasa para miR-221 y miR-222 de forma simultánea en las células PC3. La co-transfección de ambos compuestos LNA-antimiR, SEC ID Nº 3223 y SEC ID Nº 3224, contra miR-221 and miR-222 respectivamente (véase la figura 18, izquierda), tuvo como resultado una inhibición eficaz de ambos miARN como muestra la desrepresión completa de los plásmidos indicadores cuando se transfectan por separado y cuando se co-transfectan en las células PC3. Es interesante el hecho de que la transfección de un solo LNA-antimiR de 7 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3225) dirigido a la secuencia semilla de miR-221 y miR-222 en células PC3 tuvo como resultado un antagonismo eficaz dependiente de la dosis de miR-221 y miR-222 de forma simultánea, como muestra la des-represión completa de los plásmidos indicadores cuando se transfectan por separado y cuando se co-transfectan en las células PC3. Esto demuestra que un único LNA-antimiR corto sustituido con LNA puede dirigirse de forma eficaz a secuencias semilla, de modo que antagoniza todas las familias de microARN de forma simultánea. El análisis de la base de datos de secuencias de miRBase microRNA mostró que la secuencia de reconocimiento semilla miR-221/222 del LNA-antimiR de SEC ID Nº 3225 es única para ambos miARN.
Conclusión: Los resultados de los inventores demuestran que el LNA permite el diseño y la síntesis de oligonucleótidos LNA-antimiR cortos sustituidos completamente con LNA que puedan dirigirse de forma eficaz a secuencias semilla de microARN, de modo que antagonizan todas las familias de microARN de forma simultánea.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de próstata humano PC3 se adquirió en la ECACC (#90112714). Las células PC3 cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 0,3 ug del plásmido indicador de luciferasa para miR-221 o miR-222 o con el vector psiCHECK2 vacío sin el sitio diana de miARN como control junto con 1,2 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa. Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a los pocillos se añadieron 250 l de 1x tampón de lisis pasiva (Promega). Las placas se introdujeron en un agitador durante 30 minutos, tras lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos de eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 minutos y 2.500 rpm, tras lo cual se transfirieron 20 l a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 19. Evaluación de los niveles de la proteína p27 como lectura funcional del antagonismo de la familia miR-221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225.
Los trabajos previos han mostrado (le Sage et al. 2007, Galardi et al. 2007) que miR-221 y miR-222 regulan postranscripcionalmente la expresión del gen supresor tumoral p27, que está implicado en la regulación del ciclo celular. En estos estudios, se demostró que la regulación por disminución de miR-221 y miR-222 aumentaba los niveles de expresión de p27. Por tanto, como lectura funcional del antagonismo de la familia de the miR-221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225, los inventores determinaron que los niveles de proteínas de p27 tras la transfección del LNA-antimiR de SEC ID Nº 3225 en células PC3 en comparación con un control de coincidencia errónea de LNA de 8 unidades. Tras 24 horas, se recogieron las células para el análisis de transferencia de tipo western (figura 19).
Resultados: Como se muestra en la figura 19, la transfección con el LNA-antimiR de 7 unidades SEC ID Nº 3225 dirigido a la secuencia semilla en miR-221 y miR-222 tuvo como resultado un incremento dependiente de la dosis de los niveles de la proteína p27 en comparación con las células PCR no transfectadas o transfectadas con el control de coincidencia errónea de LNA. Estos resultados demuestran claramente que el LNA-antimiR de 7 unidades puede antagonizar de forma eficaz la familia miR-221/222, lo que conduce a la des-represión de la p27 diana directa a nivel proteico.
Conclusión: Un LNA-antimiR de 7 unidades completamente modificado con LNA dirigido a la secuencia semilla en la familia miR-221/222 antagonizó de forma eficaz ambos miARN, lo que conduce a la des-represión de la p27 diana directa a nivel proteico.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de próstata humano PC3 se adquirió en la ECACC (#90112714). Las células PC3 cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 250.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con LNA-antimiR a varias concentraciones con lipofectamina2000. Tras 24 horas, se recogieron las células para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia de tipo western.
Análisis de transferencia de tipo Western: Las células se lavaron con PBS, se digirieron con tripsina, se transfirieron a tubos de eppendorf y se añadieron 250 l de tampón de lisis (1xRIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 minutos y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, La concentración de proteínas se midió con Coomassie Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cargaron 100 ug sobre un gel de 4-12 % de BIS-TRIS. La membrana se incubó durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario monoclonal de ratón p27 (BD Biosciences) a una dilución de 1:1000. Se visualizaron bandas inmunorreactivas con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 20. Temperaturas de fusión del dúplex (Tm) de los LNA-antimiR.
Como se muestra en la tabla 5, los valores de Tm aumentan cuando aumenta la longitud de los LNA-antimiR cortos completamente modificados (véanse los valores de Tm para las SEC ID Nº 3205, SEC ID Nº 3209-3214 en la tabla 7). El efecto inhibidor más óptimo se alcanzó con el LNA-antimiR de 8 unidades de SEC ID Nº 3205 contra miR-21, mientras que la Tm muy baja de la SEC ID Nº 3209 de 6 unidades es muy probable que no sea suficiente para participar en el antagonismo del miR-21 diana. Por otro lado, aumentar la longitud a más de 10 unidades (SEC ID Nº 32112) aumenta significativamente la Tm, al tiempo que disminuye simultáneamente la actividad inhibidora medida usando el indicador miR-21 de la luciferasa, que es muy probable que se deba a la elevada propensión de los LNAantimiR completamente modificados de 12 y 14 unidades a formar homodímeros. Los experimentos que usan una ventana deslizante de LNA-antimiR completamente modificados de 8 unidades a través de la secuencia de reconocimiento de mir-21 demuestran claramente que además del valor de la Tm adecuado el LNA-antimiR, la región semilla es la más crítica para la función de los miARN y, por tanto, la región más óptima a la que dirigir un LNAantimiR.
Tabla 5. Valores de Tm para LNA-antimiR de miR-21 medidos contra un oligonucleótido de ARN complementario.
SEC ID Nº
microARN Longitud (pb) Secuencia Tm medida (ARN) ºC
3205
miR-21 8 5'- GATAAGCT -3' 64,0
3209
miR-21 6 5'- TAAGCT -3' 32,0
3210
miR-21 7 5'- ATAAGCT -3' 45,0
3211
miR-21 9 5'- TGATAAGCT -3' 65,0
3212
miR-21 10 5'- CTGATAAGCT -3' 63,0
3213
miR-21 12 5'- GTCTGATAAGCT -3' 86,8
3214
miR-21 14 5'- CAGTCTGATAAGCT -3' 89,9
3215
miR-21 8 5'- TCTGATAA - 3' 56,0
3216
miR-21 8 5'- ATCAGTCT - 3 72,0
3217
miR-21 8 5'- TCAACATC - 3 48,0
10 Conclusión: Los valores de Tm junto con datos experimentales obtenidos con indicadores de la luciferasa muestran que el potente antagonismo mediante LNA-antimiR no solo depende de la Tm sino que también depende de la posición del LNA-antimiR dentro de la secuencia de reconocimiento de microARN.
15 Materiales y procedimientos:
solución se calentó hasta 95 ºC durante 3 minutos y después se dejó hibridar a TA durante 3 minutos. Las
20 temperaturas de fusión (Tm) del dúplex se midieron en un espectrofotómetro Lambda 40 UV/VIS equipado con un programador de temperatura Peltier PTP6 usando el software PE Templab (Perkin Elmer). La temperatura se subió desde 20 ºC a 5 ºC y después se bajó a 25 ºC, registrando la absorción a 260 nm. El primer derivado y los máximos locales de la fusión y la hibridación se usaron para evaluar las temperaturas de fusión del dúplex.
25 Ejemplo 21. Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante comparación de LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) frente a LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3204) en la línea celular hepatocítica humana HepG2.
Anteriormente los inventores han mostrado en esta solicitud que un LNA-antimiR de 8 unidades que está
30 completamente modificado con LNA y fosforotiolado antagoniza con eficacia el miR-21 en la línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa, la línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7 y la línea celular de cáncer de próstata humano PC3. Los inventores han ampliado este enfoque de cribado a la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2. Para evaluar la eficiencia del oligonucleótido LNA-antimiR de 8 unidades contra miR-21 se generaron constructos indicadores de luciferasa en los que se clonó un sitio diana de coincidencia
35 perfecta para miR-21 maduro en la región 3'UTR del gen de la luciferasa de renilla. Con el fin de monitorizar la inhibición de miR-21, las células HepG2 se transfectaron con los diferentes constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 de SEC ID Nº 3205 (8 unidades) y para una comparación de la especificidad con el LNAantimiR de 8 unidades con coincidencia errónea (SEC ID Nº 3218) y para comparar la potencia junto con el de 15 unidades (SEC ID Nº 3204) a varias concentraciones. Tras 24 horas, se midió la actividad de luciferasa.
40 Resultados: Los experimentos indicadores de luciferasa mostraron una des-represión dependiente de la dosis de la actividad indicadora de luciferasa de miR-21 con el LNA-antimiR de 15 unidades contra miR-21 (SEC ID Nº 3204). No obstante, la des-represión completa del indicador de luciferasa no se obtuvo ni siquiera a las concentraciones más altas (figura 20). En contraste, las células que se transfectaron con el LNA-antimiR de 8 unidades
45 completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3205) mostró des-represión completa ya a 5 nM, lo que indica una potencia significativamente mejorada en comparación con el LNA-antimiR de 15 unidades.
Al comparar la especificidad de la coincidencia perfecta de 8 unidades y de la coincidencia errónea de 8 unidades, el LNA-antimiR de coincidencia errónea (SEC ID Nº 3218) no mostró ninguna des-represión en absoluto, lo que demuestra una especificidad elevada del compuesto LNA-antimiR contra miR-21.
Conclusión: El de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) es más potente que el LNA-antimiR de 15 unidades en cuanto a estar dirigido a miR-21 y el antagonismo de miR-21 por el nº 3205 es específico.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular HepG2 hepatocítica humana se adquirió de la ECACC (#85011430). Las células HepG2 se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 650.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se realizó transfección inversa. Las células HepG2 se transfectaron con 0,6 ug de miR-21 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 2,55 Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a los pocillos se añadieron 300 l de 1x tampón de lisis pasiva (Promega). Las placas se introdujeron en un agitador durante 30 minutos, tras lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos de eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 minutos y 2.500 rpm, tras lo cual se transfirieron 50 l a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 22. Validación de la interacción del sitio diana de miR-21 en la Pdcd43'-UTR y miR-21 usando el LNA-antimiR de 8 unidades de SEC ID Nº 3205 en la línea celular hepatocelular humana Huh-7.
La proteína supresora tumoral Pdcd4 inhibe la estimulación y la progresión tumoral. Además, la regulación por disminución de Pdcd4 en el cáncer de pulmón y colorrectal también se ha asociado con un mal pronóstico para el paciente. Recientemente, Asangani y col. (Oncogene 2007) y Frankel y col., (J Biol Chem 2008) mostraron que la Pdcd43'-UTR contiene un sitio diana conservado para miR-21 y transfectar las células con un antimiR-21 tuvo como resultado un incremento de la proteína Pdcd4. Por tanto, los inventores construyeron un plásmido indicador de luciferasa que aloja 313 nt de la región 3'UTR de Pdcd4, que abarca el sitio diana de miR-21 mencionado anteriormente, que se co-transfectó junto con diferentes LNA-antimiR y pre-miR-21 (10 nM) en células Huh-7. Los diferentes LNA-antimiR fueron de SEC ID Nº 3205 (8 unidades, coincidencia perfecta), de SEC ID Nº 3218 (8 unidades, coincidencia errónea) y de SEC ID Nº 3204 (15 unidades, mixto ADN/LNA). Se realizaron mediciones de la actividad de luciferasa tras 24 horas.
Resultados: Como se muestra en la figura 21, en células transfectadas con el indicador de la luciferasa de Pdcd4 3'UTR y la SEC ID Nº 3205 se observó un incremento de la actividad de luciferasa, lo que indica una interacción entre Pdcd4 3'UTR and miR-21. No obstante, transfectar las células con el compuesto con coincidencia errónea, SEC ID N1 3218, no se observaron cambios en la actividad de luciferasa, lo que estaba previsto ya que el compuesto no antagoniza miR-21. Cuando se comparó el LNA-antimiR de 8 unidades contra el LNA-antimiR de 15 unidades (SEC ID Nº 3204), el LNA-antimiR corto completamente modificado con LNA y fosforotiolado fue significativamente más potente, lo que confirma los datos previos.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de hepatoma humano Huh-7 fue un amable regalo de R. Bartenschlager, Dept Mol Virology, University of Heidelberg). Las células Huh-7 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 11.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células Huh-7 se transfectaron con 20 ug de Pdcd43'UTR/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con pre-miR-21 10 nM (Ambion) y 0,14 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de oligonucleótidos de LNA-antimiR. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron y a cada pocillo se añadieron 30 l 1 x de tampón de lisis pasivo (Promega), tras lo cual las placas de 96 pocillos se introdujeron en un agitador orbital. Tras 30 minutos, 50 sustrato de luciferasa disueltos en el tampón de ensayo de luciferasa II (Dual-Luciferase Reporter Assay System from Promega, nº de cat. E1910) se añadieron a los pocillos con las células lisadas y se realizaron mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 23. Evaluación de los niveles de la proteína Pdcd4 como lectura funcional del antagonismo de miR21 por LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3205).
5 Además, los inventores también transfectaron células HeLa con la SEC ID Nº 3205 (coincidencia perfecta), SEC ID Nº 3218 (coincidencia errónea), SEC ID Nº 3219 (mixto) y se analizaron los niveles de la proteína Pdcd4 tras 24 horas con transferencia de tipo western (figura 22). Como se ha mostrado, en los extractos proteicos de las células en las que se ha añadido la SEC ID Nº 3205, los niveles de la proteína Pdcd4 aumentan, debido al antagonismo de mir-2 por la SEC ID Nº 3205 en contraste con los dos oligonucleótidos de LNA control.
10 Conclusión: El antagonismo de miR-21 usando uno de 8 unidades (SEC ID Nº 3205) conduce a la des-represión del antagonismo de Pdcd4 diana directo de miR-21.
Materiales y procedimientos:
15 Línea celular: La línea celular de carcinoma de cérvix humano HeLa se adquirió de la ECACC (#93021013). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
20 Transfección: Se sembraron 200.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa se transfectaron con oligonucleótidos de LNA 5 nM y 2,5 pg/ml de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras 24 horas, se recogieron las células para el análisis de transferencia de tipo western.
25 Análisis de transferencia de tipo Western: Las células se lavaron con PBS, se digirieron con tripsina, se transfirieron a tubos de eppendorf y se añadieron 50 l de tampón de lisis (1xRIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 minutos y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, Se cargaron cantidades iguales (15 l del lisado celular) en un gel de 4-12% BIS-TRIS. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot
30 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario de suero de conejo purificado por afinidad de Pdcd4 (Rockland) con una concentración de 1:2000. Como control se usaron anticuerpos anti-beta-tubulina (Thermo Scientific) a una dilución de 1:5000. Se visualizaron bandas inmunorreactivas con ECL Plus (Amersham).
35 Ejemplo 24. Evaluación de la potencial hepatotoxicidad del LNA-antimiR de coincidencia perfecta de 8 unidades SEC ID Nº 3205 y el control de coincidencia errónea de LNA SEC ID Nº 3218.
Cada compuesto se inyectó en ratones NMRI hembra a dosis de 25 mg/kg, 5 mg/kg y 1 mg/kg, en días alternos durante 2 semanas. Se sacrificó a los animales y se recogió el suero de la sangre entera para realizar análisis de
40 ALT y AST. Como se ve en la figura 23, los niveles de ALT y AST no estaban elevados para la SEC ID Nº 3205 en comparación con la solución salina o con la SEC ID Nº 3218 (control de coincidencia errónea). No obstante, un ratón mostró niveles elevados (en rojo), ya que las muestras de suero estaban contaminadas con glóbulos rojos, que contienen niveles de ALT y AST 6-8 veces mayores en comparación con el plasma. Los ratones que recibieron 5 mg/kg y 1 mg/kg también se analizaron para determinar los niveles de ALT y AST y no mostraron cambios en
45 comparación con los animales control tratados con solución salina (datos no mostrados).
Materiales y procedimientos:
Diseño experimental:
Nº de gr.
Nº de Id del animal Nº de ratones Nivel de dosis de compuesto al día Conc. a vol. de dosis de 10 ml/kg Vía de administración Posología
1
1-10 10 NaCl 0,9% - i.v 0, 2, 4, 7, 9
2
11-15 5 SEC ID Nº 3205 25 mg/kg 2,5 mg/ml i.v 0, 2, 4, 7, 9
3
16-20 5 SEC ID Nº 3205 5 mg/kg 0,5 mg/ml i.v 0, 2, 4, 7, 9
4
21-25 5 SEC ID Nº 3205 1 mg/kg 0,1 mg/ml i.v 0, 2, 4, 7, 9
5
26-30 5 SEC ID Nº 3230 25 mg/kg 2,5 mg/ml i.v 0, 2, 4, 7, 9
6
31-35 5 SEC ID Nº 3230 5 mg/kg 0,5 mg/ml i.v 0, 2, 4, 7, 9
Sacrificio: Se sacrificó a los animales mediante dislocación cervical.
Obtención de muestras de suero para análisis de ALT/AST: Se anestesió a los animales con 70 % de CO2-30% O2 antes de recoger la sangre del seno retroorbital. La sangre se recogió en viales con suero-gel S-monovette. De cada ratón individual se recogieron las muestras de suero y se almacenaron. Las muestras de sangre se almacenaron a temperatura ambiente durante dos horas y, después, se centrifugaron 10 minutos a 3.000 rpm a temperatura ambiente. Las fracciones se suero se recolectaron en tubos Eppendorf en hielo húmedo. Determinaciones de los niveles de ALT y AST: Las determinaciones de los niveles de ALT y AST se realizaron en placas de 96 pocillos usando reactivos ara ALT y AST de ABX Pentra (A11A01627 - ALT, A11A01629 - AST) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las muestras de suero se diluyeron por 2,5 con H2O y cada muestra se analizó por duplicado. Tras la adición de 50 l de la muestra diluida o estándar (multical from ABX Pentra -A11A01652) a cada pocillo, a cada pocillo se añadieron 200 l de la mezcla de reactivos para AST o ALT a 37 ºC. Se realizaron determinaciones cinéticas durante 5 minutos con un intervalo de 30 s a 340 nm y 37 ºC.
Ejemplo 25. Evaluación de los niveles de la proteína PU.1 como lectura funcional del antagonismo de miR155 por LNA-antimiR corto (SEC ID Nº 3207).
Los inventores han mostrado previamente que el miR-155 de 8 unidades antagonizante (SEC ID Nº 3207) conduce a la des-represión de la diana de miR-155 c/EBPbeta en células macrófagos de ratón RAW. Para verificar adicionalmente la potencia de la SEC ID Nº 3207, los inventores determinaron los niveles de proteína de otra diana de miR-155, U.1 As como lectura funcional para el antagonismo de miR-155 por el LNA-antimiR corto (SEC ID Nº 3207) mediante análisis de transferencia de tipo western. El antagonismo se verificó en la línea celular monocítica humana THP-1 que se transfectó junto con un LNA de 8 unidades de coincidencia perfecta (SEC ID Nº 3207) o control de 8 unidades en ausencia o presencia de pre-miR-155. Se usó LPS para inducir la acumulación de miR-155 y las células se recogieron tras 24 horas.
Resultados: Las células THP-1 que se transfectaron con pre-miR-155 muestra una disminución de los niveles de PU.1 (figura 24). Transfectar las células con la SEC ID Nº 3207 completamente modificada con LNA y fosforotiolada antagoniza con eficacia miR-155, lo que conduce a niveles no alterados de la proteína PU.1. Por comparación, la transfección de las células con un LNA control de 8 unidades disminuyó los niveles de PU.1, lo que indica que el antagonismo de miR-155 por el LNA-antimiR de SEC ID 3207 es específico.
Conclusión: El antagonismo de miR-155 usando uno de 8 unidades conduce a la des-represión de la PU.1 diana directa en células THP-1 humanas.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de monocitos humanos THP-1 se adquirió de la ECACC (#88081201). Las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 con L-glutamina suplementado con 10% de suero bovino fetal.
Transfección: Se sembraron 200.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos el día antes. El día de la transfección, las células THP-1 se transfectaron con 5 nmol de pre-miR-155 (Ambion) y/o LNA-antimiR 5 nM junto con Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió LPS (100 ng/ml) a las células después de la incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Tras 24 horas, se recogieron las células para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia de tipo western.
Análisis de transferencia de tipo Western: Las células se lavaron con PBS, se digirieron con tripsina, se transfirieron a tubos de eppendorf y se añadieron 50 l de tampón de lisis (1xRIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 minutos y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, Se cargaron cantidades iguales (15 l del lisado celular) en un gel de 4-12% BIS-TRIS. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo monoclonal de conejo PU.1 (Cell Signaling) con una concentración de 1:2.000. Como carga equivalente se usó tubulina (Thermo Scientific) a una dilución de 1:5.000. Se visualizaron bandas inmunorreactivas con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 26. Evaluación de los niveles de la proteína p27 como lectura funcional del antagonismo de la familia miR-221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225.
Los trabajos previos han mostrado (le Sage et al. 2007, Galardi et al. 2007) que miR-221 y miR-222 regulan postranscripcionalmente la expresión del gen supresor tumoral p27, que está implicado en la regulación del ciclo celular. En estos estudios, se demostró que la regulación por disminución de miR-221 y miR-222 aumentaba los niveles de expresión de p27. Por tanto, como lectura funcional del antagonismo de la familia de the miR-221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225, los inventores determinaron que los niveles de proteínas de p27 tras la transfección del LNA-antimiR de SEC ID Nº 3225 en células PC3.
Resultados: Como se muestra en la figura 25, la transfección con el LNA-antimiR de 7 unidades SEC ID Nº 3225 dirigido a la secuencia semilla en miR-221 y miR-222 tuvo como resultado un incremento dependiente de la dosis de los niveles de la proteína p27 en comparación con las células PC3 no transfectadas o transfectadas con el control mixto de LNA. Estos resultados demuestran claramente que el LNA-antimiR de 7 unidades puede antagonizar de forma eficaz la familia miR-221/222, lo que conduce a la des-represión de la p27 diana directa a nivel proteico a concentraciones tan bajas como de 5 nM.
Conclusión: Un LNA-antimiR de 7 unidades completamente modificado con LNA dirigido a la secuencia semilla en la familia miR-221/222 a 5 nM antagonizó de forma eficaz ambos miARN, lo que conduce a la des-represión de la p27 diana directa a nivel proteico.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de próstata humano PC3 se adquirió de la ECACC (#90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 250.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con oligonucleótidos de LNA a varias concentraciones (véase la figura 25) con lipofectamina2000. Tras 24 horas, se recogieron las células para la extracción de proteínas y el análisis de transferencia de tipo western.
Análisis de transferencia de tipo Western: Las células se lavaron con PBS, se digirieron con tripsina, se transfirieron a tubos de eppendorf y se añadieron 50 l de tampón de lisis (1xRIPA). El lisado celular se colocó en hielo durante 20 minutos y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, Se cargaron cantidades iguales (15 l del lisado celular) en un gel de 4-12% BIS-TRIS. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario monoclonal de ratón p27 (BD Biosciences) a una dilución de 1:1000. Como carga control se usó tubulina (Thermo Scientific) a una dilución de 1:5.000. Se visualizaron bandas inmunorreactivas con ECL Plus (Amersham).
Ejemplo 27. La eliminación de miR-221/222 por el LNA-antimiR de 7 unidades de SEC ID Nº 3225 reduce la formación de colonias en células PC3.
Una característica principal de la transformación celular es la capacidad de las células tumorales para crecer de un modo independiente de un ancla en medio semisólido. Por tanto, los inventores realizaron un ensayo en agar blando que es un ensayo fenotípico que es relevante para el cáncer, dado que mide la disminución de las células tumorales. Los inventores transfectaron la SEC ID Nº 3225 (coincidencia perfecta) y la SEC ID Nº 3231 (mixto) en las células PC3 y tras 24 horas se sembraron en agar blando. Tras 12 días se contaron las colonias. En la figura 26, los inventores muestran que la inhibición de miR-221 y miR-222 por la SEC ID Nº 3225 puede reducir la cantidad de colonias que crecen en agar blando, en comparación con el LNA-antimiR control mixto, lo que indica disminución de las células tumorales.
Conclusión: El de 7 unidades (SEC ID Nº 3225) dirigido a la familia miR-221/222 reduce el número de colonias en agar blando, lo que indica una detención de la proliferación en las células PC3.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de próstata humano PC3 se adquirió de la ECACC (#90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 250.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 25 nM de diferentes oligonucleótidos de LNA con lipofectamina2000.
Crecimiento clonogénico en agar blando: 2,5 x 103 células PC3 se sembraron en 0,35% de agar encima de una capa base que contiene 0,5 % de agar. Las células se sembraron en placas 24 horas después de la transfección. Las placas se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO2 en un incubador humidificado durante 12 días y se tiñeron con 0,005 % de cristal violeta durante 1 hora, tras lo cual las células se contaron. El ensayo se realizó por triplicado.
Ejemplo 28: Evaluación del antagonismo de let-7 mediante LNA-antimiR de 6-9 unidades en células HuH-7 transfectadas con el miARN precursor de let-7a y ensayo sensor de luciferasa.
Con el fin de evaluar la eficiencia de los oligonucleótidos de 6-9 unidades completamente modificados con LNA en apuntar y antagonizar la familia let-7 de miARN se realizó un constructor sensor de luciferasa que contiene aproximadamente 800 pb de la HMGA2 3'UTR. La secuencia clonada en el vector contiene cuatro de siete sitios de unión a let-7 funcionales (sitios 2-5), como previamente han demostrado Mayr y col., (Science, 2007) y Lee y Dutta (Genes Dev, 2007). Con el fin de monitorizar la inhibición de let-7, la línea celular de carcinoma hepatocelular Huh-7 (con niveles bajos o inexistentes de let-7 endógena) se transfectó con el constructo sensor de luciferasa, con miARN precursor de let-7a y con los antagonistas de 6-9 unidades de let-7 de SEC ID Nº 3232, -3233, -3227, -3234, -3235; véase la figura 27) a concentraciones crecientes. Los LNA-antimiR de 6-9 unidades se compararon con la SEC ID Nº 3226, uno de 15 unidades contra let-7a como control positivo. Tras 24 horas, se midió la actividad de luciferasa.
Resultados: Como se ve en la figura 28, los LNA-antimiR de 8 y 9 unidades modificados completamente con LNA (SEC ID N 3227, SEC ID Nº 3234 y SEC ID Nº 3235) muestran potencias similares en la des-represión de las dianas de let-7 en el ensayo sensor de luciferasa, como control positivo de la SEC ID Nº 3226 de 15 unidades. La desrepresión diana completa para estos compuestos altamente potentes ya se consigue a 1-5 nM, mientras que la SEC ID Nº 3233 de 7 unidades tiene que estar presente a concentraciones ligeramente mayores (10 nM) para generar el mismo efecto. No obstante, la SEC ID Nº 3232 de 6 unidades no muestra ningún efecto incluso concentraciones altas como 50 nM. La des-represión de la actividad luciferasa por los LNA-antimiR de 7-9 y de 15 unidades depende de la dosis, que está particularmente claro en el caso del a SEC ID 3233 ligeramente menos potente.
Conclusión: Para concluir, los LNA-antimiR de 8-9 unidades (SEC ID Nº 3227, SEC ID Nº 3234 y SEC ID Nº 3235) muestran potencias antagonistas iguales en la inhibición de let-7a in vitro en comparación con el LNA-antimviR de 15 unidades de SEC ID Nº 3226 dirigido a let-7a. También se observa un potente efecto, aunque a concentraciones ligeramente mayores, de la SEC ID Nº 3233 de 7 unidades, mientras que la de 6 unidades no tiene efecto a las concentraciones analizadas.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma hepatocelular humano Huh-7 fue un amable regalo de R. Bartinschlager (Dept Mol Virology, University of Heidelberg). Las células Huh-7 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 8.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 60-80% al día siguiente. El día de la transfección, las células Huh-7 de cada pocillo se co-transfectaron con 20 ng de HMGA2 3'UTR/plásmido psiCHECK2, el miARN precursor de let-7a (Dharmacon; concentración final 10 nM), LNA-antimiR de SEC ID Nº 3232, 3233, 3227, 3224, 3235, 3226, (0-50 nM, concentraciones finales) junto con 0,17 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa. Ensayo de la luciferasa: Se descartó el medio de crecimiento y a cada pocillo se añadieron 30 l de 1x tampón de lisis pasiva (Promega). Tras 15-30 minutos de incubación en un agitador orbital se realizaron mediciones de la luciferasa de renilla y de luciérnaga de acuerdo las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 29: Evaluación del antagonismo de toda la familia let-7 por los LNA-antimiR de 8 y 15 unidades en células HuH-7 transfectadas con un ensayo sensor de luciferasa.
Con el fin de evaluar la eficiencia de un oligonucleótido de 8 unidades completamente modificado con LNA en antagonizar la familia let-7 de miARN se usó el mismo constructo sensor de luciferasa que se ha descrito en el ejemplo anterior, De nuevo, las células Huh-7 (con niveles bajos o inexistentes de let-7 endógeno) se transfectaron con el constructo sensor, con uno de los precursores representantes de la familia let-7a, let-7d, let-7e, o let-7i y con el antagonista de SEC ID Nº 3227 a concentraciones crecientes. Los LNA-antimiR de 8 unidades se comparó con la SEC ID Nº 3226, uno de 15 unidades contra let-7a como control positivo y potente. Tras 24 horas, se midió la actividad de luciferasa.
Resultados: Como se ve en la figura 29, los LNA-antimiR de 8 y 9 unidades modificados completamente con LNA (SEC ID N 3227, SEC ID Nº 3234 y SEC ID Nº 8) muestran potencias similares en la des-represión de las diversas dianas de let-7 en el ensayo sensor de luciferasa, como control positivo de la SEC ID Nº 3226 de 15 unidades. Casi toda la des-represión de la diana para el compuesto de 8 unidades ya se consigue a 0,5-1 nM, excepto en el caso con let-7e premiR (figura 29C), del que solo hibridan con la diana 7 de 8 nucleótidos de la SEC ID Nº 3227. No obstante, a pesar de la coincidencia errónea terminal en este caso, la SEC ID Nº 3227 genera una des-represión completa de la diana a 5 nM. El control positivo de 15 unidades muestra un potente antagonismo de todos los precursores y da una des-represión casi completa a 0,5 nM. La des-represión de la actividad luciferasa por los LNAantimiR de 8 y de 15 unidades depende claramente de la dosis, como se ve en los cuatro paneles (figura 29A-D).
Conclusión: Para concluir, el LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3227) es un potente antagonista de cuatro miembros representativos de la familia let-7 in vitro y, por tanto, probablemente de toda la familia En comparación con un antagonista control positivo de 15 unidades, la SEC ID Nº 3226, el de 8 unidades tiene la misma potencia para tres de cuatro dianas y es ligeramente menos potente para la cuarta diana, let-7e, que se explica por una coincidencia errónea terminal en este caso.
Materiales y procedimientos: Línea celular: La línea celular de carcinoma hepatocelular Huh-7 fue un amable regalo de R. Bartenschlager, Dept Mol Virology, University of Heidelberg). Las células Huh-7 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 8.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 60-80% al día siguiente. El día de la transfección, las células Huh-7 de cada pocillo se co-transfectaron con 20 ng de HMGA2 3'UTR/plásmido psiCHECK2, con el miARN precursor de let-7a, 7d, -7e, o -7i (Dharmacon; concentración final 10 nM) y con LNA-antimiR de SEC ID Nº 3227 y SEC ID Nº 3226; 0 50 nM, concentraciones finales, junto con 0,17 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa. Ensayo de la luciferasa: Se descartó el medio de crecimiento y a cada pocillo se añadieron 30 l de 1x tampón de lisis pasiva (Promega). Tras 15-30 minutos de incubación en un agitador orbital se realizaron mediciones de la luciferasa de renilla y de luciérnaga de acuerdo las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 30. Evaluación del antagonismo de let-7 endógeno mediante anti-miR de LNA de 8 unidades de SEC ID Nº 3227 en células HeLa transfectadas con un ensayo sensor de luciferasa.
Con el fin de determinar la eficiencia de un oligonucleótido de 8 unidades completamente modificado con LNA para apuntar y antagonizar el let-7 endógeno, el mismo constructor sensor de la luciferasa que se ha descrito en los dos ejemplos anteriores se co-transfectó con la SEC ID Nº 3227 en la línea celular de cáncer cervical HeLa (que expresa niveles de moderados a altos de let-7 como determina la Q-PCR, datos no mostrados). Como control negativo se incluyó el vector psiCHECK-2 vacío.
Resultados: Como se ve en la figura 30, el LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA (SEC ID Nº 3227) muestra un potente antagonismo del let-7 endógeno y proporciona una des-represión completa de la diana a las concentraciones de 5-10 nM. La des-represión de la actividad luciferasa depende de la dosis, comenzando alrededor de 1 nM y alcanzando un equilibrio a aproximadamente 10 nM.
Conclusión: Para concluir, el LNA-antimiR de 8 unidades (SEC ID Nº 3227) es un potente antagonista del let-7 endógeno in vitro y, por tanto, proporciona una evidencia definitiva de que todas las familias de miARN pueden ser objetivos satisfactorios de antagonistas completamente modificados con LNA y cortos.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de cáncer cervical HeLa se adquirió de la ATCC (#CCL-2™). Las células HeLa se cultivaron en medio EMEM de Eagle suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM, 1x NEAA y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 8.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50-70% al día siguiente. El día de la transfección, las células HeLa de cada pocillo se co-transfectaron con 20 ng de HMGA2 3'UTR/plásmido psiCHECK2 o psiCHECK2 (vector vacío) y con LNA-antimiR de SEC ID Nº 3227 (0-50 nM, concentraciones finales) junto con 0,17 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Se descartó el medio de crecimiento y a cada pocillo se añadieron 30 l de 1x tampón de lisis pasiva (Promega). Tras 15-30 minutos de incubación en un agitador orbital se realizaron mediciones de la luciferasa de renilla y de luciérnaga de acuerdo las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 31. Evaluación del antagonismo de miR-21 mediante LNA-antimiR-21 de 8 unidades (nº 3205) frente a LNA control mixto de 8 unidades (nº 3219) en la línea celular de carcinoma de colon humano HCT116.
Anteriormente los inventores han mostrado en esta solicitud que un LNA-antimiR de 8 unidades que está completamente modificado con LNA y fosforotiolado antagoniza con eficacia el miR-21 en la línea celular de carcinoma de cerviz humano HeLa, la línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7, la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 y la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2. Los inventores han ampliado este enfoque de cribado a la línea celular de carcinoma de colon HCT116. Para evaluar la eficiencia del oligonucleótido LNA-antimiR de 8 unidades contra miR-21 se generaron constructos indicadores de luciferasa en los que se clonó un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-21 maduro en la región 3'UTR del gen de la luciferasa de renilla. Con el fin de monitorizar la inhibición de miR-21, las células HCT116 se transfectaron con los constructos de luciferasa junto con el antagonista de miR-21 nº 3205 (8 unidades) y para una comparación de la especificidad con el LNA-control mixto de 8 unidades (nº 3219). Tras 24 horas, se midió la actividad de luciferasa.
Resultados: Los experimentos indicadores de luciferasa mostraron una des-represión dependiente de la dosis de la actividad indicadora de luciferasa de miR-21 con el LNA-antimiR de 8 unidades contra miR-21 (nº 3205) y se obtuvo una des-represión completa a 5 nM (figura 31). Al comparar la especificidad de la coincidencia perfecta de 8 unidades y del control mixto de 8 unidades, el LNA-antimiR control mixto (nº 3219) no mostró ninguna des-represión en absoluto, lo que demuestra una especificidad elevada del compuesto LNA-antimiR contra miR-21.
Conclusión: El de 8 unidades (nº 3205) es potente frente a miR-21 y el antagonismo de miR-21 por el nº 3205 es específico.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de colon humano HCT116 se adquirió de la ATCC (CCL-247). Las células HCT116 se cultivaron en medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 110.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos y se realizó transfección. Las células HCT116 se transfectaron con 0,3 ug del plásmido sensor de luciferasa miR-21 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 1,2 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. También se transfectaron LNA-antimiR y oligonucleótidos control como concentraciones variables. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y a los pocillos se añadieron 250 l de 1x tampón de lisis pasiva (Promega). Las placas se introdujeron en un agitador durante 30 minutos, tras lo cual los lisados celulares se transfirieron a tubos de eppendorf. El lisado celular se centrifugó durante 10 minutos y 2.500 rpm, tras lo cual se transfirieron 50 l a una placa de 96 pocillos y se realizaron mediciones de la luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Ejemplo 32. La eliminación de miR-21 por el LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205 reduce la formación de colonias en células PC3.
Una característica principal de la transformación celular es la capacidad de las células tumorales para crecer de un modo independiente de un ancla en medio semisólido. Por tanto, los inventores realizaron un ensayo en agar blando que es un ensayo fenotípico que es relevante para el cáncer, dado que mide la disminución de las células tumorales. Los inventores transfectaron el nº 3205 (LNA-antimiR-21 de coincidencia perfecta) y el nº 3219 (control mixto de LNA) en las células PC3 y tras 24 horas se sembraron en agar blando. Tras 12 días se contaron las colonias. En la figura 32, los inventores muestran que la inhibición de miR-21 por el nº 3205 puede reducir la cantidad de colonias que crecen en agar blando, en comparación con el control tratado o no tratado con LNA control mixto (transfeccionado, pero sin LNA), lo que demuestra la disminución de las células tumorales.
Conclusión: El de 8 unidades (nº 3205) dirigido a la familia miR-21 reduce el número de colonias en agar blando, lo que demuestra una detención de la proliferación en las células PC3.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de próstata humano PC3 se adquirió de la ECACC (#90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 250.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células PC3 se transfectaron con 25 nM de diferentes oligonucleótidos de LNA con lipofectamina2000.
Crecimiento clonogénico en agar blando: 2,5 x 103 células PC3 se sembraron en 0,35% de agar encima de una capa base que contiene 0,5 % de agar. Las células se sembraron en placas 24 horas después de la transfección. Las placas se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO2 en un incubador humidificado durante 12 días y se tiñeron con 0,005 % de cristal violeta durante 1 hora, tras lo cual las células se contaron. El ensayo se realizó por triplicado.
Ejemplo 33. La silenciación de miR-21 por el LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205 reduce la formación de colonias de las células HepG2.
Se sobreexpresa miR-21 en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y los inventores han mostrado anteriormente que eran capaces de regular la actividad de la luciferasa de un plásmido sensor de miR-21 con el nº 3205 en estas células. Las células HepG2 se transfectaron con el nº 3205 y el nº 3219 (mixto 8 unidades) y tras 24 horas se sembraron en agar blando. Las colonias se contaron tras 17 días con un microscopio.
Resultados: En la figura 33, los inventores muestran que la inhibición de miR-21 por el nº 3205 puede reducir la cantidad de colonias que crecen en agar blando, lo que demuestra que se ha producido la detención de la proliferación. Además, el control mixto de 8 unidades, nº 3219, no tenía ningún efecto significativo sobre el número de colonias.
Conclusión: El de 8 unidades (nº 3205) dirigido a miR-21 reduce el número de colonias en agar blando, lo que indica una detención de la proliferación en las células HepG2.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular HepG2 hepatocítica humana se adquirió de la ECACC (#85011430). Las células HepG2 se cultivaron en medio EMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 650.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se realizó transfección inversa. Las células HepG2 se transfectaron con 0,6 ug del plásmido sensor de luciferasa miR-21 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 2,55 l de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. También se transfectaron LNA-antimiR y oligonucleótidos control como concentraciones variables. Tras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Crecimiento clonogénico en agar blando: 2,0 x 103 células HepG2 se sembraron en 0,35% de agar encima de una capa base que contiene 0,5 % de agar. Las células se sembraron en placas 24 horas después de la transfección. Las placas se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO2 en un incubador humidificado durante 17 días y se tiñeron con 0,005 % de cristal violeta durante 1 hora, tras lo cual las células se contaron. El ensayo se realizó por triplicado.
Ejemplo 34. La silenciación de miR-21 por el LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205 inhibe la migración celular en células PC3.
La migración celular se puede monitorizar realizando un ensayo de cicatrización de heridas (= ensayo se raspado),
en el que se realiza un “raspado” en una monocapa celular y se capturan imágenes al principio y a intervalos
regulares durante la migración celular. Comparando las imágenes se puede determinar la cuantificación de la tasa de migración de las células. Esto se realizó en la línea de cáncer de próstata humano PC3,. Se sembraron las células y el día 3 las células se transfectaron y, al día siguiente, cuando se alcanzó un 100 % de confluencia, se realizó un raspado (= herida). Cuando se realizó el raspado se tomaron imágenes con el fin de documentar la herida inicial. Después se mide el área de cierre de la herida a diferentes puntos de tiempo con el programa de software libre Image J. Como se muestra en la figura 34A, las células PC3 se habían tratado con nº 3205 25 nM (coincidencia perfecta, miR-21), el control nº 3219 o se dejaron sin transfectar. Se tomaron fotos tras 24 horas y se calculó el área para el cierre de la herida a cada punto de tiempo. El cierre de la herida para las células transfectadas y para el control nº 3219 fue más rápido en comparación con el LNA-antimiR contra miR-21, nº 3205, lo que indica que nº 3205 inhibe miR-21 y evita la migración de las células (figura 34B).
Conclusión: El de 8 unidades (nº 3205) dirigido a miR-21 inhibe la migración celular de las células PC3 en comparación con las células no transfectadas y las transfectadas control.
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de carcinoma de próstata humano PC3 se adquirió de la ECACC (#90112714). Las células PC3 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 2 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Ensayo de raspado: Se sembraron 150.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos tres días antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 100% al día siguiente. A las 24 horas de la transfección se realizó un raspado en la monocapa celular con una punta de 200 l. Las imágenes se tomaron a 0 h y a las 24 horas usando una cámara digital acoplada a un microscopio. Se usó el programa de software Image J para determinar el cierre de la herida.
Ejemplo 35. Evaluación de la longitud de LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA que antagonizan miR-155.
Anteriormente los inventores han mostrado una evaluación de la longitud para miR-21 sobre LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA y se mostró que los LNA-antimiR más potentes tenían una longitud de 7, 8 o 9 nucleótidos. Se repitió el mismo experimento con miR-155. Un sitio diana de coincidencia perfecta para miR-155 se clonó en la 3'UTR del gen de la luciferasa en el plásmido indicador psiCHECK2 y se transfectó en la línea celular de macrófagos RAW de ratón junto con LNA-antimiR completamente sustituidos con LNA de diferentes longitudes. Dado que los niveles endógenos de miR-155 son bajos en la línea celular RAW, las células fueron tratadas LPS 100 ng/ml durante 24 horas con el fin de inducir la acumulación de miR-155. Tras 24 horas, se realizó un análisis de la luciferasa.
Resultados: Como se muestra en la figura 35, los LNA-antimiR más potentes son nº 3207 (8 nucleótidos) y el nº 3241 (9 nucleótidos), que alcanzar una des-represión de casi el 80 % a una concentración de LNA de únicamente 0,25 nM. El de 6 unidades (nº 3244) no muestra una des-represión significativa. El incremento de la longitud de 12 unidades a 14 unidades (nº 3242 y nº 3243) disminuyó la potencia como se muestra mediante la des-represión menos eficiente del indicador de miR-155.
Conclusión: Los LNA-antimiR sustituidos completamente con LNA más potentes dirigidos a miR.155 fueron los de 8 y 9 unidades (nº 3207 y nº 3241).
Materiales y procedimientos:
Línea celular: La línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7 se adquirió en la ATCC (TIB-71). Las células RAW se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, Glutamax 4 mM y Gentamicina 25 ug/ml.
Transfección: Se sembraron 500.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos el día antes de la transfección, con el fin reobtener una confluencia de 50% al día siguiente. El día de la transfección, las células RAW 264.7 se transfectaron con 0,3 ug de miR-155 coincidencia perfecta/psiCHECK2 o el vector psiCHECK2 vacío junto con 10 de Lipofectamina2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transfección también se realizó a varias concentraciones de LNA-antimiR. Con el fin de inducir la acumulación de miR-155, a las células RAW se añadió LPS (100 ng/ml) después de la incubación durante 4 horas con los complejos de transfección. Tras otras 24 horas, se recogieron las células para medir la actividad de luciferasa.
Ensayo de la luciferasa: Las células se lavaron con PBS y se recogieron con raspador celular, tras lo cual se centrifugaron las células durante 5 minutos a 2.500 rpm. Se descartó el sobrenadante y al sedimento celular se añadieron 50 l 1x tampón de lisis pasiva (Promega), tras lo cual las células se introdujeron en hielo durante 30 minutos. Las células lisadas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos, tras lo cual 20 l se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se realizaron las mediciones de la actividad luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 36. Unión de las proteínas plasmáticas para el nº 3205 de 8 unidades completamente sustituido con LNA dirigido a miR-21 (LNA-antimiR-21).
Las proteínas plasmáticas no están saturadas con nº 3205 a las concentraciones plasmáticas en el experimento que se muestra en la figura 36A. En un amplio abanico de concentraciones del nº 3205 en el plasma, la unión de las proteínas es de aproximadamente el 95 % del LNA-antimiR-21 nº 3205 en la figura 36B. A las concentraciones del nº 3205 de 50,1 M (174 g/ml), la capacidad de unión de las proteínas plasmáticas por nº 3205 marcado con FAM no se ha saturado. Materiales y procedimientos:
El plasma de ratón plasma (100 L) se contaminó con nº 3205 marcado con FAM hasta una concentración de 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 y 50,1 M Las soluciones se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Las soluciones se transfirieron a un filtro Microcon Ultracel YM-30 (celulosa regenerada 30.000 MWCO). Los filtros se agitaron durante 20 minutos a 2.000 g y a temperatura ambiente en una microcentrífuga. El filtrado se diluyó 5, 10 y 20 veces y muestras de 100 l se transfirieron a una placa de microtitulación (de poliestireno, negras, NUNC-237108). La fluorescencia se detectó usando un lector de elisa FLUOstar Optima con excitación a 458 nm y emisión a 520 nm. La cantidad de nº 3205 marcado con FAM no unida se calculó a partir de una curva estándar derivada del plasma filtrado contaminado con nº 3205 marcado con FAM a 12 concentraciones diferentes (0,45-1.000 nM). Los números se corrigieron con el número de recuperación establecido en los experimentos de filtración con las concentraciones del nº 3205 0,167, 1,67, 5,01, 10,02, 16,7, 25,05 y 50,1 M en plasma filtrado. La recuperación de nº 3205 marcado con FAM fue del 86%.
Ejemplo 37. Estudio autorradiográfico cuantitativo de todo el cuerpo en ratones hembra pigmentaas tras una única administración intravenosa de NA-antimiR-21 nº 3205 marcado con 35S.
Con el fin de determinar la biodistirbución de un LNA-antimiR corto completamente modificado con LNA (nº 3205, 8 uniddes) se realizó en los ratones una distribución tisular de cuerpo entero del compuesto marcado radioactivamente. Se administró a los ratones el nº 3205 marcado con 35S mediante una única adminisración intravenosa y se sacrificó a los ratones a diferentes puntos de tiempo variables desde 5 minutos a 21 días.
Tabla 6(i). Concentraciones tisulares individuales ( g del nº 3205/g de tejido) tras una única adminisración intravenosa del nº 3205 marcado con 35S en ratones hembra pigmentadas. Las cifras son valores medios de tres mediciones para cada tejido y proporción. El coeficiente de variación (CV) normalmente es de aproximadamente 10%.
Tejido
Conc. máx. del oligo g nº 3205/g tejido Tiempo de conc. máx. horas T½ horas
Glándula suprarrenal
13,6 0,083 374
Bilis
4 1
Médula ósea
7,2 0,083 411
Cerebro
0,4 0,083
Grasa parda
8,8 0,083
Mucosa gástrica
10,1 0,083
Sangre de corazón
26,2 0,083 10,3
Corteza renal
58,7 24 104
Hígado
11,8 0,083 588
10,7
24
Pulmón
13,2 0,083 289
Ganglios linfáticos
5 0,083 262
2,4
48
Linfa
18,8 4
20,8
168
Miocardio
8,1 0,083 662
Ovarios
13 0,083 198
Páncreas
5 0,083
Hipófisis
6,7 0,083
Glándula salival
8,6 0,083 405
5,5
168
Músculo esquelético
4,8 0,083
Pig. de la piel
5,4 0,25
Bazo
9,8 0,083 564
Timo
3,8 0,083 185
Glándula tiroides
10,9 0,083 592
Orina
328,9 0,083
Útero
9,6 0,25 177
Úvea del ojo
13,6 0,083
LOQ
0,045 0,083
0,033
24
0,03
168
Tabla 6(ii). Proporciones tejido/hígado tras una única administración intravenosa del nº 3205 marcado con 35S en ratones hembra pigmentadas.
35S-Nº 3205
Nº de animal
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tiempo de superv. (h)
0,083 0,25 1 h. 4 h 24 h 48 h 96 h 168 504
Órgano
Gl. suprarrenal
Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado Hígado
Bilis
1,15 1,08 0,52 0,27 0,24 0,26 0,23 0,18 0,17
Médula ósea
0,03 0,11 0,55 0,10 0,03 0,07 0,04 0,03 0,04
Cerebro
0,61 0,81 0,55 0,45 0,40 0,48 0,43 0,42 0,34
Grasa parda
0,03 0,03 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Mucosa gástrica
0,75 0,57 0,29 0,12 0,07 0,12 0,08 0,10 0,07
Sangre de corazón
0,86 0,71 0,31 0,22 0,10 0,21 0,15 0,16 0,12
Corteza renal
2,23 1,91 0,74 0,11 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Hígado
2,87 3,94 6,45 6,95 5,51 6,68 3,92 2,24 0,40
Pulmón
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Ganglios linfáticos
1,12 0,97 0,63 0,09 0,04 0,04 0,03 0,02 0,02
Linfa
0,43 0,30 0,25 0,19 0,11 0,32 0,20 0,17 0,12
Miocardio
0,82 1,09 1,78 2,78 1,03 2,05 1,62 3,17 1,89
Ovarios
0,69 0,63 0,30 0,13 0,10 0,15 0,09 0,11 0,12
Páncreas
1,10 1,40 0,61 0,31 0,27 0,28 0,21 0,21 0,08
Hipófisis
0,42 0,37 0,22 0,18 0,12 0,17 0,12 0,15 0,11
Glándula salival
0,57 0,54 0,28 0,11 0,15 0,16 0,12 0,10 0,08
Músculo esquelético
0,73 0,81 0,38 0,25 0,25 0,42 0,23 0,85 0,24
Pig. de la piel
0,40 0,28 0,14 0,04 0,02 0,04 0,03 0,03 0,03
Bazo
0,34 0,69 0,65 0,36 0,20 0,26 0,20 0,19 0,13
Timo
0,83 0,86 0,44 0,32 0,24 0,34 0,35 0,29 0,31
Glándula tiroides
0,32 0,31 0,14 0,07 0,09 0,08 0,05 0,04 0,02
Orina
0,9 1,2 0,43 0,28 0,25 0,34 0,19 0,26 0,25
Útero
27,96 39,48 9,90 5,44 0,24 0,39 0,12 0,15 0,03
Úvea del ojo
0,56 1,23 0,65 0,30 0,30 0,07 0,27 0,16 0,08
Conclusiones: El nº 3205 muestra aclaramiento sanguíneo de la radioactividad con semividas de eliminación de 8-10 horas. Se registraron niveles elevados de radioactividad en la corteza renal, la linfa, el hígado, la médula ósea, el bazo, los ovarios y el útero. El mayor nivel de radioactividad se registró en la corteza renal, que mostró cinco veces
5 más que el hígado para el nº 3205. Se observó una fuerte retención de la radioactividad en la corteza renal, la linfa, el hígado, la médula ósea y el bazo para el LNA-antimiR-21 nº 3205.
Materiales y procedimientos:
10 Administración de la dosis: Se pesó a todos los ratones antes de la administración. A nueve ratones hembra se les administraron 10 mg/kg de 35S- Nº 3205 por vía intravenosa en una vena de la cola. El volumen administrado a cada animal fue de 10 mL/kg de la formulación de ensayo. La actividad específica 75,7 Ci/mg. Se sacrificó a cada ratón 5 min, 15 min, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 2 días, 4 días, 7 días y 21 días después de la administración del nº 3205. Autorradiografía de cuerpo entero: Se anestesió a los ratones con sevoflurano y, después, se les sumergió
15 inmediatamente en heptano, se enfrió con hielo seco hasta -80 ºc. ABR-SOP-0130. Los cadáveres congelados se incluyeron en un gel de carboximetilcelulosa (CMC) acuosa, se congelaron en etanol, se enfriaron con hielo seco (80 ºC) y se seccionaron sagitalmente para una autorradiografía de cuerpo entero según el procedimiento estándar, ABR-SOP-0131. De cada animal se cortaron secciones de 20 m a diferentes niveles con un criomiotomo (Leica CM 3600) a una temperatura de aproximadamente -20 ºC. Las secciones obtenidas se taparon con celo (Minnesota
20 Mining and Manufacturing Co., No. 810) y se numeraron de forma consecutiva con tinta radioactiva, Después de liofilizar a -20 ºC durante aproximadamente 24 horas, determinadas secciones se cubrieron con una capa fina de aluminio de mylar y se colocaron en placas para obtención de imágenes (Fuji, Japón). La exposición tuvo lugar en casetes herméticos a la luz en una caja con protección de plomo a -20ºC para proteger las placas de imagen de la radiación ambiental. Tras la exposición se realizó un escáner de las placas de imagen con un tamaño de píxel de 50
25 m y se analizaron mediante radioluminografía usando un sistema de análisis de bioimagen (Bas 2500, Fuji, Japan) y se describieron en ABR-SOP-0214. Una solución de ensayo estándar hidrosoluble de radiactividad 35S se mezcló con sangre entera y se usó para la producción de una escala de calibración, ABR-SOP-0251. No obstante, los diferentes patrones sanguíneos se disolvieron en 500 ul de Solueno-35. Después, a las muestras disueltas se añadieron 4,5 ml de Ultima Gold. Dado que 35S y 14C tienen espectros de energía muy similares se usó un programa de 14C estándar (Packard 2200CA) cuando se estableció la radioactividad para las diferentes muestras de sangre.
Cálculos farmacocinéticos: La radioactividad 35S medida en sangre entera y tejidos se expresó como nCi/g de tejido y se recalculó a nmol equiv/g de tejido para le evaluación farmacocinética. Los parámetros farmacocinéticos Cmáx, t1/2 and AUC se determinaron para la sangre entera y los ejidos mediante análisis no compartimental usando WinNonlin Professional (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA). Tras la administración intravenosa, la concentración se extrapoló de nuevo a cero y se expresó como (C0). La constante de la velocidad de eliminación se estimó mediante análisis de regresión lineal de la pendiente terminal de la curva logarítmica concentración en plasma tiempo. La semivida de eliminación t1/2, se calculó usando la ecuación t1/2 = In2// . Los últimos tres puntos de tiempo por encima del LOQ se usaron en los cálculos de la semivida de eliminación, si no se indica lo contrario.
Ejemplo 38. Evaluación de la inhibición de let-7 in vivo por un LNA-antimiR de 8 unidades, determinada mediante cuantificación de la proteína Ras en pulmón y riñón de ratón.
Con el fin de investigar la posibilidad de antagonizar la familia de let-7 de expresión abundante in vivo, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (i.v.) un antagonista LNA-antimiR de 8 unidades o solución salina. Para medir el efecto del tratamiento se aislaron las proteínas de pulmones y riñones. Dado anteriormente Johnson y col., (Cell, 2005) han mostrado que la familia Ras de proteínas (N-Ras, K-Ras, and H-Ras), en concreto N-Ras and K-Ras, estaba regulada (reprimida) por la familia let-7, el objetivo era analizar si estas dianas de let-7 podrían des-reprimirse
in vivo.
Resultados: Como se ve en la figura 37, el LNA-antimiR de 8 unidades des-reprimió de forma potente los niveles de proteína Ras en los riñones de ratones tratados, normalizados frente a controles de solución salina. La regulación por incremento en este órgano fue más de triple, lo que muestra un claro efecto in vivo. Sin embargo, en los pulmones solo se observó una des-represión mínima (1,2 veces) de Ras (figura 1 B), lo que sugiere que en este órgano han entrado cantidades insuficientes de LNA-antimiR con el fin de inhibir sus cantidades masivas de let-7, como previamente han descrito Johnson y col., (Cancer Research, 2007).
Conclusión: El LNA-antimiR de 8 unidades muestra un claro efecto en la regulación del miARN de let-7 diana in vivo, como se evalúa en base a los niveles de la proteína Ras en ratones tratados frente a control. Mientras que el efecto parece ser menor en los pulmones, los niveles de Ras en el riñón muestran una regulación por aumento sustancial tras el tratamiento con antimiR.
Materiales y procedimientos:
Animales y dosificación: Ratones C57BL/6 hembra se trataron con 10 mg/kg de LNA-antimiR o solución salina durante tres días consecutivos (0, 1 y 2) y se les sacrificó el día 4. Las muestras de tejido de los pulmones y los riñones se ultracongelaron y almacenaron a -80 ºC hasta su posterior procesamiento.
Análisis de transferencia de tipo Western: Las proteínas de pulmón y de riñón de ratones tratados con solución salina o con LNA-antimiR se separaron NuPAGE Bis Tris 4-12% (Invitrogen) usando 100 g por muestra. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó bloqueo, dilución con anticuerpo y detección según las especificaciones del fabricante. Para la detección de Ras se usó un anticuerpo principal anti-Ras de conejo (SC-3339, Santa Cruz Biotechnology) y un anticuerpo secundario de conejo anti-cerdo conjugado con HRP (P0399, Dako) y para la detección de tubulina se usó un anticuerpo primario frente a alfa-tubulina (MS-581-P1, Neomarkers) y uno secundario de ratón anti-cabra conjugado con HRP (P0447, Dako).
Ejemplo 40. Evaluación de la eficacia un vivo del LNA-antimiR de 8 unidades (nº 3205) dirigido a miR-21, determinado por la regulación por aumento de la proteína Pdcd4 en riñón de ratón.
Los inventores han mostrado que un LNA-antimiR de 8 unidades que está completamente modificado por LNA antagoniza miR-21 y tiene la capacidad para regular los niveles proteicos de la diana miR-21 Pdcd4 in vitro. Por tanto, los inventores inyectaron el LNA-antimiR en ratones para determinar los efectos del LNA-antimiR in vivo. Los ratones recibieron 25 mg/kg del nº 3205 mediante inyección i.v. en días alternos durante 14 días (un total de 5 dosis). Se sacrificó a los ratones el día 14, se extirpó el riñón y se aisló la proteína. Con el fin de determinar la regulación de la diana se realizó un análisis de transferencia de tipo western.
Resultados: Como se muestra en la figura 37, el tratamiento de los ratones con nº 3205 mostró niveles de la proteína Pdcd4 significativamente mayores en comparación con el control de solución salina. Aunque la proporción de Pdcd4 frente a Gapdh normalizada fue consistente en ambas muestras de solución salina, la regulación por incremento de la proteína en los dos ratones tratados con LNA-antimiR (nº 32059) se midió de 3,3 a 6,3 veces, respectivamente, lo
que demuestra un efecto famacológico in vivo del LNA-antimiR de 8 unidades nº 3205.
Conclusión: El LNA-antimiR de 8 unidades completamente modificado con LNA nº 3205 antagoniza miR-21 in vivo, como se demuestra mediante su capacidad para des-reprimir (regular por aumento) os niveles en riñón de ratón de 5 Pdcd4, una diana validada de miR-21.
Materiales y procedimientos:
Animales y dosificación: En todos los experimentos se usaron ratones C57BL/6 hembra con un peso corporal medio
10 de 20 g en la primera dosis, y recibieron una dieta con pienso regular (Altromin no 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca). Las sustancias se formularon en solución salina fisiológica (0,9 % de NaCl). A los animales se administró LNA-antimiR o solución salina o (0,9 % de NaCl) y recibieron una inyección de 25 mg/kg durante 14 días en días alternos, con un total de 5 dosis. Se sacrificaron los animales el día 14.
15 Análisis de transferencia de tipo Western: 80 g de tejido renal de ratones tratados con solución salina o con LNA se separaron NuPAGE Bis Tris 4-12% (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La membrana se incubó con el anticuerpo Pdcd4 (Bethyl Laboratories), seguido de anticuerpo de cerdo anti-conejo conjugado con HRP (Dako). Como control de carga igual se usó GAPDH (Abcam), seguido de anticuerpo de cerdo anti-conejo conjugado con HRP. Las
20 membranas se visualizaron mediante quimioluminiscencia (ECL, Amersham).
Tabla 1
microARN
Secuencia de microARN SEC ID Nº 9 unidades SEC ID Nº 8 unidades SEC ID Nº 7 unidades SEC ID Nº
ebv-miR-BART1-3p
UAGCACCGCUAUCCACUAUGUC 40 AGCGGTGCT 977 GCGGTGCT 1914 CGGTGCT 2851
ebv-miR-BART1-5p
UCUUAGUGGAAGUGACGUGCUGUG 41 TCCACTAAG 978 CCACTAAG 1915 CACTAAG 2852
ebv-miR-BART10
UACAUAACCAUGGAGUUGGCUGU 42 TGGTTATGT 979 GGTTATGT 1916 GTTATGT 2853
ebv-miR-BART10*
GCCACCUCUUUGGUUCUGUACA 43 AAGAGGTGG 980 AGAGGTGG 1917 GAGGTGG 2854
ebv-miR-BART113p
ACGCACACCAGGCUGACUGCC 44 TGGTGTGCG 981 GGTGTGCG 1918 GTGTGCG 2855
ebv-miR-BART115p
UCAGACAGUUUGGUGCGCUAGUUG 45 AACTGTCTG 982 ACTGTCTG 1919 CTGTCTG 2856
ebv-miR-BART12
UCCUGUGGUGUUUGGUGUGGUU 46 CACCACAGG 983 ACCACAGG 1920 CCACAGG 2857
ebv-miR-BART13
UGUAACUUGCCAGGGACGGCUGA 47 GCAAGTTAC 984 CAAGTTAC 1921 AAGTTAC 2858
ebv-miR-BART13*
AACCGGCUCGUGGCUCGUACAG 48 CGAGCCGGT 985 GAGCCGGT 1922 AGCCGGT 2859
ebv-miR-BART14
UAAAUGCUGCAGUAGUAGGGAU 49 GCAGCATTT 986 CAGCATTT 1923 AGCATTT 2860
ebv-miR-BART14*
UACCCUACGCUGCCGAUUUACA 50 GCGTAGGGT 987 CGTAGGGT 1924 GTAGGGT 2861
ebv-miR-BART15
GUCAGUGGUUUUGUUUCCUUGA 51 AACCACTGA 988 ACCACTGA 1925 CCACTGA 2862
ebv-miR-BART16
UUAGAUAGAGUGGGUGUGUGCUCU 52 CTCTATCTA 989 TCTATCTA 1926 CTATCTA 2863
ebv-miR-BART173p
UGUAUGCCUGGUGUCCCCUUAGU 53 CAGGCATAC 990 AGGCATAC 1927 GGCATAC 2864
ebv-miR-BART175p
UAAGAGGACGCAGGCAUACAAG 54 CGTCCTCTT 991 GTCCTCTT 1928 TCCTCTT 2865
ebv-miR-BART183p
UAUCGGAAGUUUGGGCUUCGUC 55 ACTTCCGAT 992 CTTCCGAT 1929 TTCCGAT 2866
ebv-miR-BART185p
UCAAGUUCGCACUUCCUAUACA 56 GCGAACTTG 993 CGAACTTG 1930 GAACTTG 2867
ebv-miR-BART193p
UUUUGUUUGCUUGGGAAUGCU 57 GCAAACAAA 994 CAAACAAA 1931 AAACAAA 2868
ebv-miR-BART195p
ACAUUCCCCGCAAACAUGACAUG 58 CGGGGAATG 995 GGGGAATG 1932 GGGAATG 2869
ebv-miR-BART2-3p
AAGGAGCGAUUUGGAGAAAAUAAA 59 ATCGCTCCT 996 TCGCTCCT 1933 CGCTCCT 2870
ebv-miR-BART2-5p
UAUUUUCUGCAUUCGCCCUUGC 60 GCAGAAAAT 997 CAGAAAAT 1934 AGAAAAT 2871
ebv-miR-BART203p
CAUGAAGGCACAGCCUGUUACC 61 TGCCTTCAT 998 GCCTTCAT 1935 CCTTCAT 2872
ebv-miR-BART205p
UAGCAGGCAUGUCUUCAUUCC 62 ATGCCTGCT 999 TGCCTGCT 1936 GCCTGCT 2873
ebv-miR-BART3
CGCACCACUAGUCACCAGGUGU 63 TAGTGGTGC 1000 AGTGGTGC 1937 GTGGTGC 2874
ebv-miR-BART3*
ACCUAGUGUUAGUGUUGUGCU 64 AACACTAGG 1001 ACACTAGG 1938 CACTAGG 2875
ebv-miR-BART4
GACCUGAUGCUGCUGGUGUGCU 65 GCATCAGGT 1002 CATCAGGT 1939 ATCAGGT 2876
ebv-miR-BART5
CAAGGUGAAUAUAGCUGCCCAUCG 66 ATTCACCTT 1003 TTCACCTT 1940 TCACCTT 2877
ebv-miR-BART6-3p
CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA 67 CCGATCCCC 1004 CGATCCCC 1941 GATCCCC 2878
ebv-miR-BART6-5p
UAAGGUUGGUCCAAUCCAUAGG 68 ACCAACCTT 1005 CCAACCTT 1942 CAACCTT 2879
ebv-miR-BART7
CAUCAUAGUCCAGUGUCCAGGG 69 GACTATGAT 1006 ACTATGAT 1943 CTATGAT 2880
ebv-miR-BART7*
CCUGGACCUUGACUAUGAAACA 70 AAGGTCCAG 1007 AGGTCCAG 1944 GGTCCAG 2881
ebv-miR-BART8
UACGGUUUCCUAGAUUGUACAG 71 GGAAACCGT 1008 GAAACCGT 1945 AAACCGT 2882
ebv-miR-BART8*
GUCACAAUCUAUGGGGUCGUAGA 72 AGATTGTGA 1009 GATTGTGA 1946 ATTGTGA 2883
ebv-miR-BART9
UAACACUUCAUGGGUCCCGUAGU 73 TGAAGTGTT 1010 GAAGTGTT 1947 AAGTGTT 2884
ebv-miR-BART9*
UACUGGACCCUGAAUUGGAAAC 74 GGGTCCAGT 1011 GGTCCAGT 1948 GTCCAGT 2885
ebv-miR-BHRF1-1
UAACCUGAUCAGCCCCGGAGUU 75 GATCAGGTT 1012 ATCAGGTT 1949 TCAGGTT 2886
ebv-miR-BHRF1-2
UAUCUUUUGCGGCAGAAAUUGA 76 GCAAAAGAT 1013 CAAAAGAT 1950 AAAAGAT 2887
ebv-miR-BHRF1-2*
AAAUUCUGUUGCAGCAGAUAGC 77 AACAGAATT 1014 ACAGAATT 1951 CAGAATT 2888
ebv-miR-BHRF1-3
UAACGGGAAGUGUGUAAGCACA 78 CTTCCCGTT 1015 TTCCCGTT 1952 TCCCGTT 2889
hcmv-miR-UL112
AAGUGACGGUGAGAUCCAGGCU 79 ACCGTCACT 1016 CCGTCACT 1953 CGTCACT 2890
hcmv-miR-UL148D
UCGUCCUCCCCUUCUUCACCG 80 GGGAGGACG 1017 GGAGGACG 1954 GAGGACG 2891
hcmv-miR-UL22A
UAACUAGCCUUCCCGUGAGA 81 AGGCTAGTT 1018 GGCTAGTT 1955 GCTAGTT 2892
hcmv-miR-UL22A*
UCACCAGAAUGCUAGUUUGUAG 82 ATTCTGGTG 1019 TTCTGGTG 1956 TCTGGTG 2893
hcmv-miR-UL36
UCGUUGAAGACACCUGGAAAGA 83 TCTTCAACG 1020 CTTCAACG 1957 ' TTCAACG 2894
hcmv-miR-UL36*
UUUCCAGGUGUUUUCAACGUGC 84 CACCTGGAA 1021 ACCTGGAA 1958 8 CCTGGAA 2895
hcmv-miRUL70-3p
GGGGAUGGGCUGGCGCGCGG 85 GCCCATCCC 1022 CCCATCCC 1959 CCATCCC 2896
hcmv-miRUL70-5p
UGCGUCUCGGCCUCGUCCAGA 86 CCGAGACGC 1023 CGAGACGC 1960 GAGACGC 2897
hcmv-miRUS25-1
AACCGCUCAGUGGCUCGGACC 87 CTGAGCGGT 1024 TGAGCGGT 1961 GAGCGGT 2898
hcmv-miRUS25-1*
UCCGAACGCUAGGUCGGUUCUC 88 AGCGTTCGG 1025 GCGTTCGG 1962 CGTTCGG 2899
hcmv-miRUS25-2-3p
AUCCACUUGGAGAGCUCCCGCGG 89 CCAAGTGGA 1026 CAAGTGGA 1963 AAGTGGA 2900
hcmv-miRUS25-2-5p
AGCGGUCUGUUCAGGUGGAUGA 90 ACAGACCGC 1027 CAGACCGC 1964 AGACCGC 2901
hcmv-miRUS33-3p
UCACGGUCCGAGCACAUCCA 91 CGGACCGTG 1028 GGACCGTG 1965 GACCGTG 2902
hcmv-miRUS33-5p
GAUUGUGCCCGGACCGUGGGCG 92 GGGCACAAT 1029 GGCACAAT 1966 GCACAAT 2903
hcmv-miR-US4
CGACAUGGACGUGCAGGGGGAU 93 GTCCATGTC 1030 TCCATGTC 1967 CCATGTC 2904
hcmv-miRUS5-1
UGACAAGCCUGACGAGAGCGU 94 AGGCTTGTC 1031 GGCTTGTC 1968 GCTTGTC 2905
hcmv-miRUS5-2
UUAUGAUAGGUGUGACGAUGUC 95 CCTATCATA 1032 CTATCATA 1969 TATCATA 2906
hsa-let-7a
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 96 TACTACCTC 1033 ACTACCTC 1970 CTACCTC 2907
hsa-let-7a*
CUAUACAAUCUACUGUCUUUC 97 GATTGTATA 1034 ATTGTATA 1971 TTGTATA 2908
hsa-let-7b
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 98 TACTACCTC 1035 ACTACCTC 1972 CTACCTC 2909
hsa-let-7b*
CUAUACAACCUACUGCCUUCCC 99 GGTTGTATA 1036 GTTGTATA 1973 TTGTATA 2910
hsa-let-7c
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 100 TACTACCTC 1037 ACTACCTC 1974 CTACCTC 2911
hsa-let-7c*
UAGAGUUACACCCUGGGAGUUA 101 TGTAACTCT 1038 GTAACTCT 1975 TAACTCT 2912
hsa-let-7d
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 102 TACTACCTC 1039 ACTACCTC 1976 CTACCTC 2913
hsa-let-7d*
CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU 103 GGTCGTATA 1040 GTCGTATA 1977 TCGTATA 2914
hsa-let-7e
UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 104 TCCTACCTC 1041 CCTACCTC 1978 CTACCTC 2915
hsa-let-7e*
CUAUACGGCCUCCUAGCUUUCC 105 GGCCGTATA 1042 GCCGTATA 1979 CCGTATA 2916
hsa-let-7f
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 106 TACTACCTC 1043 ACTACCTC 1980 CTACCTC 2917
hsa-let-7f1*
CUAUACAAUCUAUUGCCUUCCC 107 GATTGTATA 1044 ATTGTATA 1981 TTGTATA 2918
hsa-let-7f2*
CUAUACAGUCUACUGUCUUUCC 108 GACTGTATA 1045 ACTGTATA 1982 CTGTATA 2919
hsa-let-7g
UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 109 TACTACCTC 1046 ACTACCTC 1983 CTACCTC 2920
hsa-let-7g*
CUGUACAGGCCACUGCCUUGC 110 GCCTGTACA 1047 CCTGTACA 1984 CTGTACA 2921
hsa-let-7i
UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 111 TACTACCTC 1048 ACTACCTC 1985 CTACCTC 2922
hsa-let-7i*
CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU 112 GCTTGCGCA 1049 CTTGCGCA 1986 TTGCGCA 2923
hsa-miR-1
UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU 113 TTACATTCC 1050 TACATTCC 1987 ACATTCC 2924
hsa-miR100
AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 114 TCTACGGGT 1051 CTACGGGT 1988 TACGGGT 2925
hsa-miR100*
CAAGCUUGUAUCUAUAGGUAUG 115 TACAAGCTT 1052 ACAAGCTT 1989 CAAGCTT 2926
hsa-miR101
UACAGUACUGUGAUAACUGAA 116 CAGTACTGT 1053 AGTACTGT 1990 GTACTGT 2927
hsa-miR101*
CAGUUAUCACAGUGCUGAUGCU 117 GTGATAACT 1054 TGATAACT 1991 GATAACT 2928
hsa-miR103
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA 118 CAATGCTGC 1055 AATGCTGC 1992 ATGCTGC 2929
hsa-miR103-as
UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCU 119 AGGGCTATG 1056 GGGCTATG 1993 GGCTATG 2930
hsa-miR105
UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU 120 GAGCATTTG 1057 AGCATTTG 1994 GCATTTG 2931
hsa-miR105*
ACGGAUGUUUGAGCAUGUGCUA 121 AAACATCCG 1058 AACATCCG 1995 ACATCCG 2932
hsa-miR106a
AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 122 AAGCACTTT 1059 AGCACTTT 1996 GCACTTT 2933
hsa-miR106a*
CUGCAAUGUAAGCACUUCUUAC 123 TACATTGCA 1060 ACATTGCA 1997 CATTGCA 2934
hsa-miR106b
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU 124 CAGCACTTT 1061 AGCACTTT 1998 GCACTTT 2935
hsa-miR106b*
CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC 125 CACAGTGCG 1062 ACAGTGCG 1999 CAGTGCG 2936
hsa-miR107
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA 126 CAATGCTGC 1063 AATGCTGC 2000 ATGCTGC 2937
hsa-miR10a
UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG 127 CTACAGGGT 1064 TACAGGGT 2001 ACAGGGT 2938
hsa-miR10a*
CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA 128 TACGAATTT 1065 ACGAATTT 2002 CGAATTT 2939
hsa-miR10b
UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG 129 CTACAGGGT 1066 TACAGGGT 2003 ACAGGGT 2940
hsa-miR10b*
ACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAU 130 TCGAATCTG 1067 CGAATCTG 2004 GAATCTG 2941
hsa-miR1178
UUGCUCACUGUUCUUCCCUAG 131 CAGTGAGCA 1068 AGTGAGCA 2005 GTGAGCA 2942
hsa-miR1179
AAGCAUUCUUUCAUUGGUUGG 132 AAGAATGCT 1069 AGAATGCT 2006 GAATGCT 2943
hsa-miR1180
UUUCCGGCUCGCGUGGGUGUGU 133 GAGCCGGAA 1070 AGCCGGAA 2007 GCCGGAA 2944
hsa-miR1181
CCGUCGCCGCCACCCGAGCCG 134 GCGGCGACG 1071 CGGCGACG 2008 GGCGACG 2945
hsa-miR1182
GAGGGUCUUGGGAGGGAUGUGAC 135 CAAGACCCT 1072 AAGACCCT 2009 AGACCCT 2946
hsa-miR1183
CACUGUAGGUGAUGGUGAGAGUGGGCA 136 ACCTACAGT 1073 CCTACAGT 2010 CTACAGT 2947
hsa-miR1184
CCUGCAGCGACUUGAUGGCUUCC 137 TCGCTGCAG 1074 CGCTGCAG 2011 GCTGCAG 2948
hsa-miR1185
AGAGGAUACCCUUUGUAUGUU 138 GGTATCCTC 1075 GTATCCTC 2012 TATCCTC 2949
hsa-miR1197
UAGGACACAUGGUCUACUUCU 139 ATGTGTCCT 1076 TGTGTCCT 2013 GTGTCCT 2950
hsa-miR1200
CUCCUGAGCCAUUCUGAGCCUC 140 GGCTCAGGA 1077 GCTCAGGA 2014 CTCAGGA 2951
hsa-miR1201
AGCCUGAUUAAACACAUGCUCUGA 141 TAATCAGGC 1078 AATCAGGC 2015 ATCAGGC 2952
hsa-miR1202
GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG 142 CAGCTGGCA 1079 AGCTGGCA 2016 GCTGGCA 2953
hsa-miR1203
CCCGGAGCCAGGAUGCAGCUC 143 TGGCTCCGG 1080 GGCTCCGG 2017 GCTCCGG 2954
hsa-miR1204
UCGUGGCCUGGUCUCCAUUAU 144 CAGGCCACG 1081 AGGCCACG 2018 GGCCACG 2955
hsa-miR1205
UCUGCAGGGUUUGCUUUGAG 145 ACCCTGCAG 1082 CCCTGCAG 2019 CCTGCAG 2956
hsa-miR1206
UGUUCAUGUAGAUGUUUAAGC 146 TACATGAAC 1083 ACATGAAC 2020 CATGAAC 2957
hsa-miR1207-3p
UCAGCUGGCCCUCAUUUC 147 GGCCAGCTG 1084 GCCAGCTG 2021 CCAGCTG 2958
hsa-miR1207-5p
UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG 148 CTCCCTGCC 1085 TCCCTGCC 2022 CCCTGCC 2959
hsa-miR1208
UCACUGUUCAGACAGGCGGA 149 TGAACAGTG 1086 GAACAGTG 2023 AACAGTG 2960
hsa-miR122
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG 150 TCACACTCC 1087 CACACTCC 2024 ACACTCC 2961
hsa-miR122*
AACGCCAUUAUCACACUAAAUA 151 TAATGGCGT 1088 AATGGCGT 2025 ATGGCGT 2962
hsa-miR1224-3p
CCCCACCUCCUCUCUCCUCAG 152 GGAGGTGGG 1089 GAGGTGGG 2026 AGGTGGG 2963
hsa-miR1224-5p
GUGAGGACUCGGGAGGUGG 153 GAGTCCTCA 1090 AGTCCTCA 2027 GTCCTCA 2964
hsa-miR1225-3p
UGAGCCCCUGUGCCGCCCCCAG 154 CAGGGGCTC 1091 AGGGGCTC 2028 GGGGCTC 2965
hsa-miR1225-5p
GUGGGUACGGCCCAGUGGGGGG 155 CCGTACCCA 1092 CGTACCCA 2029 GTACCCA 2966
hsa-miR1226
UCACCAGCCCUGUGUUCCCUAG 156 GGGCTGGTG 1093 GGCTGGTG 2030 GCTGGTG 2967
hsa-miR1226*
GUGAGGGCAUGCAGGCCUGGAUGGGG 157 ATGCCCTCA 1094 TGCCCTCA 2031 GCCCTCA 2968
hsa-miR1227
CGUGCCACCCUUUUCCCCAG 158 GGGTGGCAC 1095 GGTGGCAC 2032 GTGGCAC 2969
hsa-miR1228
UCACACCUGCCUCGCCCCCC 159 GCAGGTGTG 1096 CAGGTGTG 2033 AGGTGTG 2970
hsa-miR1228*
GUGGGCGGGGGCAGGUGUGUG 160 CCCCGCCCA 1097 CCCGCCCA 2034 CCGCCCA 2971
hsa-miR1229
CUCUCACCACUGCCCUCCCACAG 161 GTGGTGAGA 1098 TGGTGAGA 2035 GGTGAGA 2972
hsa-miR1231
GUGUCUGGGCGGACAGCUGC 162 GCCCAGACA 1099 CCCAGACA 2036 CCAGACA 2973
hsa-miR1233
UGAGCCCUGUCCUCCCGCAG 163 ACAGGGCTC 1100 CAGGGCTC 2037 AGGGCTC 2974
hsa-miR1234
UCGGCCUGACCACCCACCCCAC 164 GTCAGGCCG 1101 TCAGGCCG 2038 CAGGCCG 2975
hsa-miR1236
CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG 165 GGGGAAGAG 1102 GGGAAGAG 2039 GGAAGAG 2976
hsa-miR1237
UCCUUCUGCUCCGUCCCCCAG 166 AGCAGAAGG 1103 GCAGAAGG 2040 CAGAAGG 2977
hsa-miR1238
CUUCCUCGUCUGUCUGCCCC 167 GACGAGGAA 1104 ACGAGGAA 2041 CGAGGAA 2978
hsa-miR124
UAAGGCACGCGGUGAAUGCC 168 GCGTGCCTT 1105 CGTGCCTT 2042 GTGCCTT 2979
hsa-miR124*
CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU 169 TGTGAACAC 1106 GTGAACAC 2043 TGAACAC 2980
hsa-miR1243
AACUGGAUCAAUUAUAGGAGUG 170 TGATCCAGT 1107 GATCCAGT 2044 ATCCAGT 2981
hsa-miR1244
AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 171 CCAACTACT 1108 CAACTACT 2045 AACTACT 2982
hsa-miR1245
AAGUGAUCUAAAGGCCUACAU 172 TAGATCACT 1109 AGATCACT 2046 GATCACT 2983
hsa-miR1246
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG 173 AAAATCCAT 1110 AAATCCAT 2047 AATCCAT 2984
hsa-miR1247
ACCCGUCCCGUUCGUCCCCGGA 174 CGGGACGGG 1111 GGGACGGG 2048 GGACGGG 2985
hsa-miR1248
ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA 175 ACAAGAAGG 1112 CAAGAAGG 2049 AAGAAGG 2986
hsa-miR1249
ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA 176 GGAAGGGCG 1113 GAAGGGCG 2050 AAGGGCG 2987
hsa-miR1250
ACGGUGCUGGAUGUGGCCUUU 177 CCAGCACCG 1114 CAGCACCG 2051 AGCACCG 2988
hsa-miR1251
ACUCUAGCUGCCAAAGGCGCU 178 CAGCTAGAG 1115 AGCTAGAG 2052 GCTAGAG 2989
hsa-miR1252
AGAAGGAAAUUGAAUUCAUUUA 179 ATTTCCTTC 1116 TTTCCTTC 2053 TTCCTTC 2990
hsa-miR1253
AGAGAAGAAGAUCAGCCUGCA 180 CTTCTTCTC 1117 TTCTTCTC 2054 TCTTCTC 2991
hsa-miR1254
AGCCUGGAAGCUGGAGCCUGCAGU 181 CTTCCAGGC 1118 TTCCAGGC 2055 TCCAGGC 2992
hsa-miR1255a
AGGAUGAGCAAAGAAAGUAGAUU 182 TGCTCATCC 1119 GCTCATCC 2056 CTCATCC 2993
hsa-miR1255b
CGGAUGAGCAAAGAAAGUGGUU 183 TGCTCATCC 1120 GCTCATCC 2057 CTCATCC 2994
hsa-miR1256
AGGCAUUGACUUCUCACUAGCU 184 GTCAATGCC 1121 TCAATGCC 2058 CAATGCC 2995
hsa-miR1257
AGUGAAUGAUGGGUUCUGACC 185 ATCATTCAC 1122 TCATTCAC 2059 CATTCAC 2996
hsa-miR1258
AGUUAGGAUUAGGUCGUGGAA 186 AATCCTAAC 1123 ATCCTAAC 2060 TCCTAAC 2997
hsa-miR1259
AUAUAUGAUGACUUAGCUUUU 187 CATCATATA 1124 ATCATATA 2061 TCATATA 2998
hsa-miR125a-3p
ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC 188 CCTCACCTG 1125 CTCACCTG 2062 TCACCTG 2999
hsa-miR125a-5p
UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA 189 GTCTCAGGG 1126 TCTCAGGG 2063 CTCAGGG 3000
hsa-miR125b
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 190 GTCTCAGGG 1127 TCTCAGGG 2064 CTCAGGG 3001
hsa-miR125b-1*
ACGGGUUAGGCUCUUGGGAGCU 191 CCTAACCCG 1128 CTAACCCG 2065 TAACCCG 3002
hsa-miR125b-2*
UCACAAGUCAGGCUCUUGGGAC 192 TGACTTGTG 1129 GACTTGTG 2066 ACTTGTG 3003
hsa-miR126
UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG 193 CACGGTACG 1130 ACGGTACG 2067 CGGTACG 3004
hsa-miR126*
CAUUAUUACUUUUGGUACGCG 194 AGTAATAAT 1131 GTAATAAT 2068 TAATAAT 3005
hsa-miR1260
AUCCCACCUCUGCCACCA 195 GAGGTGGGA 1132 AGGTGGGA 2069 GGTGGGA 3006
hsa-miR1261
AUGGAUAAGGCUUUGGCUU 196 CCTTATCCA 1133 CTTATCCA 2070 TTATCCA 3007
hsa-miR1262
AUGGGUGAAUUUGUAGAAGGAU 197 ATTCACCCA 1134 TTCACCCA 2071 TCACCCA 3008
hsa-miR1263
AUGGUACCCUGGCAUACUGAGU 198 AGGGTACCA 1135 GGGTACCA 2072 GGTACCA 3009
hsa-miR1264
CAAGUCUUAUUUGAGCACCUGUU 199 ATAAGACTT 1136 TAAGACTT 2073 AAGACTT 3010
hsa-miR1265
CAGGAUGUGGUCAAGUGUUGUU 200 CCACATCCT 1137 CACATCCT 2074 ACATCCT 3011
hsa-miR1266
CCUCAGGGCUGUAGAACAGGGCU 201 AGCCCTGAG 1138 GCCCTGAG 2075 CCCTGAG 3012
hsa-miR1267
CCUGUUGAAGUGUAAUCCCCA 202 CTTCAACAG 1139 TTCAACAG 2076 TCAACAG 3013
hsa-miR1268
CGGGCGUGGUGGUGGGGG 203 ACCACGCCC 1140 CCACGCCC 2077 CACGCCC 3014
hsa-miR1269
CUGGACUGAGCCGUGCUACUGG 204 CTCAGTCCA 1141 TCAGTCCA 2078 CAGTCCA 3015
hsa-miR127-3p
UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU 205 ACGGATCCG 1142 CGGATCCG 2079 GGATCCG 3016
hsa-miR127-5p
CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU 206 TGAGCTTCA 1143 GAGCTTCA 2080 AGCTTCA 3017
hsa-miR1270
CUGGAGAUAUGGAAGAGCUGUGU 207 ATATCTCCA 1144 TATCTCCA 2081 ATCTCCA 3018
hsa-miR1271
CUUGGCACCUAGCAAGCACUCA 208 AGGTGCCAA 1145 GGTGCCAA 2082 GTGCCAA 3019
hsa-miR1272
GAUGAUGAUGGCAGCAAAUUCUGAAA 209 CATCATCAT 1146 ATCATCAT 2083 TCATCAT 3020
hsa-miR1273
GGGCGACAAAGCAAGACUCUUUCUU 210 TTTGTCGCC 1147 TTGTCGCC 2084 TGTCGCC 3021
hsa-miR1274a
GUCCCUGUUCAGGCGCCA 211 GAACAGGGA 1148 AACAGGGA 2085 ACAGGGA 3022
hsa-miR1274b
UCCCUGUUCGGGCGCCA 212 CGAACAGGG 1149 GAACAGGG 2086 AACAGGG 3023
hsa-miR1275
GUGGGGGAGAGGCUGUC 213 TCTCCCCCA 1150 CTCCCCCA 2087 TCCCCCA 3024
hsa-miR1276
UAAAGAGCCCUGUGGAGACA 214 GGGCTCTTT 1151 GGCTCTTT 2088 GCTCTTT 3025
hsa-miR1277
UACGUAGAUAUAUAUGUAUUUU 215 TATCTACGT 1152 ATCTACGT 2089 TCTACGT 3026
hsa-miR1278
UAGUACUGUGCAUAUCAUCUAU 216 CACAGTACT 1153 ACAGTACT 2090 CAGTACT 3027
hsa-miR1279
UCAUAUUGCUUCUUUCU 217 AGCAATATG 1154 GCAATATG 2091 CAATATG 3028
hsa-miR128
UCACAGUGAACCGGUCUCUUU 218 TTCACTGTG 1155 TCACTGTG 2092 CACTGTG 3029
hsa-miR1280
UCCCACCGCUGCCACCC 219 AGCGGTGGG 1156 GCGGTGGG 2093 CGGTGGG 3030
hsa-miR1281
UCGCCUCCUCCUCUCCC 220 GAGGAGGCG 1157 AGGAGGCG 2094 GGAGGCG 3031
hsa-miR1282
UCGUUUGCCUUUUUCUGCUU 221 AGGCAAACG 1158 GGCAAACG 2095 GCAAACG 3032
hsa-miR1283
UCUACAAAGGAAAGCGCUUUCU 222 CCTTTGTAG 1159 CTTTGTAG 2096 TTTGTAG 3033
hsa-miR1284
UCUAUACAGACCCUGGCUUUUC 223 TCTGTATAG 1160 CTGTATAG 2097 TGTATAG 3034
hsa-miR1285
UCUGGGCAACAAAGUGAGACCU 224 GTTGCCCAG 1161 TTGCCCAG 2098 TGCCCAG 3035
hsa-miR1286
UGCAGGACCAAGAUGAGCCCU 225 TGGTCCTGC 1162 GGTCCTGC 2099 GTCCTGC 3036
hsa-miR1287
UGCUGGAUCAGUGGUUCGAGUC 226 TGATCCAGC 1163 GATCCAGC 2100 ATCCAGC 3037
hsa-miR1288
UGGACUGCCCUGAUCUGGAGA 227 GGGCAGTCC 1164 GGCAGTCC 2101 GCAGTCC 3038
hsa-miR1289
UGGAGUCCAGGAAUCUGCAUUUU 228 CTGGACTCC 1165 TGGACTCC 2102 GGACTCC 3039
hsa-miR129*
AAGCCCUUACCCCAAAAAGUAU 229 GTAAGGGCT 1166 TAAGGGCT 2103 AAGGGCT 3040
hsa-miR129-3p
AAGCCCUUACCCCAAAAAGCAU 230 GTAAGGGCT 1167 TAAGGGCT 2104 AAGGGCT 3041
hsa-miR129-5p
CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC 231 CCGCAAAAA 1168 CGCAAAAA 2105 GCAAAAA 3042
hsa-miR1290
UGGAUUUUUGGAUCAGGGA 232 CAAAAATCC 1169 AAAAATCC 2106 AAAATCC 3043
hsa-miR1291
UGGCCCUGACUGAAGACCAGCAGU 233 GTCAGGGCC 1170 TCAGGGCC 2107 CAGGGCC 3044
hsa-miR1292
UGGGAACGGGUUCCGGCAGACGCUG 234 CCCGTTCCC 1171 CCGTTCCC 2108 CGTTCCC 3045
hsa-miR1293
UGGGUGGUCUGGAGAUUUGUGC 235 AGACCACCC 1172 GACCACCC 2109 ACCACCC 3046
hsa-miR1294
UGUGAGGUUGGCAUUGUUGUCU 236 CAACCTCAC 1173 AACCTCAC 2110 ACCTCAC 3047
hsa-miR1295
UUAGGCCGCAGAUCUGGGUGA 237 TGCGGCCTA 1174 GCGGCCTA 2111 CGGCCTA 3048
hsa-miR1296
UUAGGGCCCUGGCUCCAUCUCC 238 AGGGCCCTA 1175 GGGCCCTA 2112 GGCCCTA 3049
hsa-miR1297
UUCAAGUAAUUCAGGUG 239 ATTACTTGA 1176 TTACTTGA 2113 TACTTGA 3050
hsa-miR1298
UUCAUUCGGCUGUCCAGAUGUA 240 GCCGAATGA 1177 CCGAATGA 2114 CGAATGA 3051
hsa-miR1299
UUCUGGAAUUCUGUGUGAGGGA 241 AATTCCAGA 1178 ATTCCAGA 2115 TTCCAGA 3052
hsa-miR1300
UUGAGAAGGAGGCUGCUG 242 TCCTTCTCA 1179 CCTTCTCA 2116 CTTCTCA 3053
hsa-miR1301
UUGCAGCUGCCUGGGAGUGACUUC 243 GCAGCTGCA 1180 CAGCTGCA 2117 AGCTGCA 3054
hsa-miR1302
UUGGGACAUACUUAUGCUAAA 244 TATGTCCCA 1181 ATGTCCCA 2118 TGTCCCA 3055
hsa-miR1303
UUUAGAGACGGGGUCUUGCUCU 245 CGTCTCTAA 1182 GTCTCTAA 2119 TCTCTAA 3056
hsa-miR1304
UUUGAGGCUACAGUGAGAUGUG 246 TAGCCTCAA 1183 AGCCTCAA 2120 GCCTCAA 3057
hsa-miR1305
UUUUCAACUCUAAUGGGAGAGA 247 GAGTTGAAA 1184 AGTTGAAA 2121 GTTGAAA 3058
hsa-miR1306
ACGUUGGCUCUGGUGGUG 248 GAGCCAACG 1185 AGCCAACG 2122 GCCAACG 3059
hsa-miR1307
ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG 249 CACGCCGAG 1186 ACGCCGAG 2123 CGCCGAG 3060
hsa-miR1308
GCAUGGGUGGUUCAGUGG 250 CCACCCATG 1187 CACCCATG 2124 ACCCATG 3061
hsa-miR130a
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU 251 CATTGCACT 1188 ATTGCACT 2125 TTGCACT 3062
hsa-miR130a*
UUCACAUUGUGCUACUGUCUGC 252 ACAATGTGA 1189 CAATGTGA 2126 AATGTGA 3063
hsa-miR130b
CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU 253 CATTGCACT 1190 ATTGCACT 2127 TTGCACT 3064
hsa-miR130b*
ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC 254 GGGAAAGAG 1191 GGAAAGAG 2128 GAAAGAG 3065
hsa-miR132
UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG 255 TAGACTGTT 1192 AGACTGTT 2129 GACTGTT 3066
hsa-miR132*
ACCGUGGCUUUCGAUUGUUACU 256 AAGCCACGG 1193 AGCCACGG 2130 GCCACGG 3067
hsa-miR1321
CAGGGAGGUGAAUGUGAU 257 CACCTCCCT 1194 ACCTCCCT 2131 CCTCCCT 3068
hsa-miR1322
GAUGAUGCUGCUGAUGCUG 258 CAGCATCAT 1195 AGCATCAT 2132 GCATCAT 3069
hsa-miR1323
UCAAAACUGAGGGGCAUUUUCU 259 TCAGTTTTG 1196 CAGTTTTG 2133 AGTTTTG 3070
hsa-miR1324
CCAGACAGAAUUCUAUGCACUUUC 260 TTCTGTCTG 1197 TCTGTCTG 2134 CTGTCTG 3071
hsa-miR133a
UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG 261 GGGGACCAA 1198 GGGACCAA 2135 GGACCAA 3072
hsa-miR133b
UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA 262 GGGGACCAA 1199 GGGACCAA 2136 GGACCAA 3073
hsa-miR134
UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG 263 ACCAGTCAC 1200 CCAGTCAC 2137 CAGTCAC 3074
hsa-miR135a
UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA 264 AAAAGCCAT 1201 AAAGCCAT 2138 AAGCCAT 3075
hsa-miR135a*
UAUAGGGAUUGGAGCCGUGGCG 265 AATCCCTAT 1202 ATCCCTAT 2139 TCCCTAT 3076
hsa-miR135b
UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA 266 AAAAGCCAT 1203 AAAGCCAT 2140 AAGCCAT 3077
hsa-miR135b*
AUGUAGGGCUAAAAGCCAUGGG 267 AGCCCTACA 1204 GCCCTACA 2141 CCCTACA 3078
hsa-miR136
ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGA 268 CAAATGGAG 1205 AAATGGAG 2142 AATGGAG 3079
hsa-miR136*
CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU 269 GACGATGAT 1206 ACGATGAT 2143 CGATGAT 3080
hsa-miR137
UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG 270 TAAGCAATA 1207 AAGCAATA 2144 AGCAATA 3081
hsa-miR138
AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG 271 AACACCAGC 1208 ACACCAGC 2145 CACCAGC 3082
hsa-miR138-1*
GCUACUUCACAACACCAGGGCC 272 GTGAAGTAG 1209 TGAAGTAG 2146 GAAGTAG 3083
hsa-miR138-2*
GCUAUUUCACGACACCAGGGUU 273 GTGAAATAG 1210 TGAAATAG 2147 GAAATAG 3084
hsa-miR139-3p
GGAGACGCGGCCCUGUUGGAGU 274 CCGCGTCTC 1211 CGCGTCTC 2148 GCGTCTC 3085
hsa-miR139-5p
UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG 275 GCACTGTAG 1212 CACTGTAG 2149 ACTGTAG 3086
hsa-miR140-3p
UACCACAGGGUAGAACCACGG 276 CCCTGTGGT 1213 CCTGTGGT 2150 CTGTGGT 3087
hsa-miR140-5p
CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG 277 AAAACCACT 1214 AAACCACT 2151 AACCACT 3088
hsa-miR141
UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG 278 GACAGTGTT 1215 ACAGTGTT 2152 CAGTGTT 3089
hsa-miR141*
CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA 279 CTGGAAGAT 1216 TGGAAGAT 2153 GGAAGAT 3090
hsa-miR142-3p
UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA 280 AAACACTAC 1217 AACACTAC 2154 ACACTAC 3091
hsa-miR142-5p
CAUAAAGUAGAAAGCACUACU 281 CTACTTTAT 1218 TACTTTAT 2155 ACTTTAT 3092
hsa-miR143
UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC 282 CTTCATCTC 1219 TTCATCTC 2156 TCATCTC 3093
hsa-miR143*
GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU 283 GCACTGCAC 1220 CACTGCAC 2157 ACTGCAC 3094
hsa-miR144
UACAGUAUAGAUGAUGUACU 284 CTATACTGT 1221 TATACTGT 2158 ATACTGT 3095
hsa-miR144*
GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAG 285 GATGATATC 1222 ATGATATC 2159 TGATATC 3096
hsa-miR145
GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU 286 AAAACTGGA 1223 AAACTGGA 2160 AACTGGA 3097
hsa-miR145*
GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU 287 CCAGGAATC 1224 CAGGAATC 2161 AGGAATC 3098
hsa-miR1468
CUCCGUUUGCCUGUUUCGCUG 288 GCAAACGGA 1225 CAAACGGA 2162 AAACGGA 3099
hsa-miR1469
CUCGGCGCGGGGCGCGGGCUCC 289 CCGCGCCGA 1226 CGCGCCGA 2163 GCGCCGA 3100
hsa-miR146a
UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU 290 TCAGTTCTC 1227 CAGTTCTC 2164 AGTTCTC 3101
hsa-miR146a*
CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG 291 ATTTCAGAG 1228 TTTCAGAG 2165 TTCAGAG 3102
hsa-miR146b-3p
UGCCCUGUGGACUCAGUUCUGG 292 CCACAGGGC 1229 CACAGGGC 2166 ACAGGGC 3103
hsa-miR146b-5p
UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU 293 TCAGTTCTC 1230 CAGTTCTC 2167 AGTTCTC 3104
hsa-miR147
GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC 294 TTCCACACA 1231 TCCACACA 2168 CCACACA 3105
hsa-miR1470
GCCCUCCGCCCGUGCACCCCG 295 GGCGGAGGG 1232 GCGGAGGG 2169 CGGAGGG 3106
hsa-miR1471
GCCCGCGUGUGGAGCCAGGUGU 296 ACACGCGGG 1233 CACGCGGG 2170 ACGCGGG 3107
hsa-miR147b
GUGUGCGGAAAUGCUUCUGCUA 297 TTCCGCACA 1234 TCCGCACA 2171 CCGCACA 3108
hsa-miR148a
UCAGUGCACUACAGAACUUUGU 298 AGTGCACTG 1235 GTGCACTG 2172 TGCACTG 3109
hsa-miR148a*
AAAGUUCUGAGACACUCCGACU 299 TCAGAACTT 1236 CAGAACTT 2173 AGAACTT 3110
hsa-miR148b
UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU 300 GATGCACTG 1237 ATGCACTG 2174 TGCACTG 3111
hsa-miR148b*
AAGUUCUGUUAUACACUCAGGC 301. AACAGAACT 1238 ACAGAACT 2175 CAGAACT 3112
hsa-miR149
UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC 302 CGGAGCCAG 1239 GGAGCCAG 2176 GAGCCAG 3113
hsa-miR149*
AGGGAGGGACGGGGGCUGUGC 303 GTCCCTCCC 1240 TCCCTCCC 2177 CCCTCCC 3114
hsa-miR150
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG 304 GGTTGGGAG 1241 GTTGGGAG 2178 TTGGGAG 3115
hsa-miR150*
CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG 305 CCTGTACCA 1242 CTGTACCA 2179 TGTACCA 3116
hsa-miR151-3p
CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG 306 TTCAGTCTA 1243 TCAGTCTA 2180 CAGTCTA 3117
hsa-miR151-5p
UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 307 AGCTCCTCG 1244 GCTCCTCG 2181 CTCCTCG 3118
hsa-miR152
UCAGUGCAUGACAGAACUUGG 308 CATGCACTG 1245 ATGCACTG 2182 TGCACTG 3119
hsa-miR153
UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC 309 GACTATGCA 1246 ACTATGCA 2183 CTATGCA 3120
hsa-miR1537
AAAACCGUCUAGUUACAGUUGU 310 AGACGGTTT 1247 GACGGTTT 2184 ACGGTTT 3121
hsa-miR1538
CGGCCCGGGCUGCUGCUGUUCCU 311 GCCCGGGCC 1248 CCCGGGCC 2185 CCGGGCC 3122
hsa-miR1539
UCCUGCGCGUCCCAGAUGCCC 312 ACGCGCAGG 1249 CGCGCAGG 2186 GCGCAGG 3123
hsa-miR154
UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG 313 GGATAACCT 1250 GATAACCT 2187 ATAACCT 3124
hsa-miR154*
AAUCAUACACGGUUGACCUAUU 314 GTGTATGAT 1251 TGTATGAT 2188 GTATGAT 3125
hsa-miR155
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU 315 TTAGCATTA 1252 TAGCATTA 2189 AGCATTA 3126
hsa-miR155*
CUCCUACAUAUUAGCAUUAACA 316 TATGTAGGA 1253 ATGTAGGA 2190 TGTAGGA 3127
hsa-miR15a
UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 317 TGTGCTGCT 1254 GTGCTGCT 2191 TGCTGCT 3128
hsa-miR15a*
CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA 318 ATATGGCCT 1255 TATGGCCT 2192 ATGGCCT 3129
hsa-miR15b
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 319 TGTGCTGCT 1256 GTGCTGCT 2193 TGCTGCT 3130
hsa-miR15b*
CGAAUCAUUAUUUGCUGCUCUA 320 TAATGATTC 1257 AATGATTC 2194 ATGATTC 3131
hsa-miR16
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 321 CGTGCTGCT 1258 GTGCTGCT 2195 TGCTGCT 3132
hsa-miR16-1*
CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA 322 TTAATACTG 1259 TAATACTG 2196 AATACTG 3133
hsa-miR16-2*
CCAAUAUUACUGUGCUGCUUUA 323 GTAATATTG 1260 TAATATTG 2197 AATATTG 3134
hsa-miR17
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 324 AAGCACTTT 1261 AGCACTTT 2198 GCACTTT 3135
hsa-miR17*
ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAG 325 TCACTGCAG 1262 CACTGCAG 2199 ACTGCAG 3136
hsa-miR181a
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 326 GTTGAATGT 1263 TTGAATGT 2200 TGAATGT 3137
hsa-miR181a*
ACCAUCGACCGUUGAUUGUACC 327 GGTCGATGG 1264 GTCGATGG 2201 TCGATGG 3138
hsa-miR181a-2*
ACCACUGACCGUUGACUGUACC 328 GGTCAGTGG 1265 GTCAGTGG 2202 TCAGTGG 3139
hsa-miR181b
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 329 AATGAATGT 1266 ATGAATGT 2203 TGAATGT 3140
hsa-miR181c
AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU 330 GTTGAATGT 1267 TTGAATGT 2204 TGAATGT 3141
hsa-miR181c*
AACCAUCGACCGUUGAGUGGAC 331 GTCGATGGT 1268 TCGATGGT 2205 CGATGGT 3142
hsa-miR181d
AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU 332 AATGAATGT 1269 ATGAATGT 2206 TGAATGT 3143
hsa-miR182
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 333 CATTGCCAA 1270 ATTGCCAA 2207 TTGCCAA 3144
hsa-miR182*
UGGUUCUAGACUUGCCAACUA 334 TCTAGAACC 1271 CTAGAACC 2208 TAGAACC 3145
hsa-miR1825
UCCAGUGCCCUCCUCUCC 335 GGGCACTGG 1272 GGCACTGG 2209 GCACTGG 3146
hsa-miR1826
AUUGAUCAUCGACACUUCGAACGCAAU 336 GATGATCAA 1273 ATGATCAA 2210 TGATCAA 3147
hsa-miR1827
UGAGGCAGUAGAUUGAAU 337 TACTGCCTC 1274 ACTGCCTC 2211 CTGCCTC 3148
hsa-miR183
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 338 CAGTGCCAT 1275 AGTGCCAT 2212 GTGCCAT 3149
hsa-miR183*
GUGAAUUACCGAAGGGCCAUAA 339 GGTAATTCA 1276 GTAATTCA 2213 TAATTCA 3150
hsa-miR184
UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU 340 TCTCCGTCC 1277 CTCCGTCC 2214 TCCGTCC 3151
hsa-miR185
UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA 341 TTTCTCTCC 1278 TTCTCTCC 2215 TCTCTCC 3152
hsa-miR185*
AGGGGCUGGCUUUCCUCUGGUC 342 GCCAGCCCC 1279 CCAGCCCC 2216 CAGCCCC 3153
hsa-miR186
CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU 343 GAATTCTTT 1280 AATTCTTT 2217 ATTCTTT 3154
hsa-miR186*
GCCCAAAGGUGAAUUUUUUGGG 344 ACCTTTGGG 1281 CCTTTGGG 2218 CTTTGGG 3155
hsa-miR187
UCGUGUCUUGUGUUGCAGCCGG 345 CAAGACACG 1282 AAGACACG 2219 AGACACG 3156
hsa-miR187*
GGCUACAACACAGGACCCGGGC 346 TGTTGTAGC 1283 GTTGTAGC 2220 TTGTAGC 3157
hsa-miR188-3p
CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA 347 CATGTGGGA 1284 ATGTGGGA 2221 TGTGGGA 3158
hsa-miR188-5p
CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGG 348 GCAAGGGAT 1285 CAAGGGAT 2222 AAGGGAT 3159
hsa-miR18a
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG 349 ATGCACCTT 1286 TGCACCTT 2223 GCACCTT 3160
hsa-miR18a*
ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGG 350 TTAGGGCAG 1287 TAGGGCAG 2224 AGGGCAG 3161
hsa-miR18b
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAG 351 ATGCACCTT 1288 TGCACCTT 2225 GCACCTT 3162
hsa-miR18b*
UGCCCUAAAUGCCCCUUCUGGC 352 ATTTAGGGC 1289 TTTAGGGC 2226 TTAGGGC 3163
hsa-miR190
UGAUAUGUUUGAUAUAUUAGGU 353 AAACATATC 1290 AACATATC 2227 ACATATC 3164
hsa-miR1908
CGGCGGGGACGGCGAUUGGUC 354 GTCCCCGCC 1291 TCCCCGCC 2228 CCCCGCC 3165
hsa-miR1909
CGCAGGGGCCGGGUGCUCACCG 355 GGCCCCTGC 1292 GCCCCTGC 2229 CCCCTGC 3166
hsa-miR1909*
UGAGUGCCGGUGCCUGCCCUG 356 CCGGCACTC 1293 CGGCACTC 2230 GGCACTC 3167
hsa-miR190b
UGAUAUGUUUGAUAUUGGGUU 357 AAACATATC 1294 AACATATC 2231 ACATATC 3168
hsa-miR191
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 358 GATTCCGTT 1295 ATTCCGTT 2232 TTCCGTT 3169
hsa-miR191*
GCUGCGCUUGGAUUUCGUCCCC 359 CAAGCGCAG 1296 AAGCGCAG 2233 AGCGCAG 3170
hsa-miR1910
CCAGUCCUGUGCCUGCCGCCU 360 ACAGGACTG 1297 CAGGACTG 2234 AGGACTG 3171
hsa-miR1911
UGAGUACCGCCAUGUCUGUUGGG 361 GCGGTACTC 1298 CGGTACTC 2235 GGTACTC 3172
hsa-miR1911*
CACCAGGCAUUGUGGUCUCC 362 ATGCCTGGT 1299 TGCCTGGT 2236 GCCTGGT 3173
hsa-miR1912
UACCCAGAGCAUGCAGUGUGAA 363 GCTCTGGGT 1300 CTCTGGGT 2237 TCTGGGT 3174
hsa-miR1913
UCUGCCCCCUCCGCUGCUGCCA 364 AGGGGGCAG 1301 GGGGGCAG 2238 GGGGCAG 3175
hsa-miR1914
CCCUGUGCCCGGCCCACUUCUG 365 GGGCACAGG 1302 GGCACAGG 2239 GCACAGG 3176
hsa-miR1914*
GGAGGGGUCCCGCACUGGGAGG 366 GGACCCCTC 1303 GACCCCTC 2240 ACCCCTC 3177
hsa-miR1915
CCCCAGGGCGACGCGGCGGG 367 CGCCCTGGG 1304 GCCCTGGG 2241 CCCTGGG 3178
hsa-miR1915*
ACCUUGCCUUGCUGCCCGGGCC 368 AAGGCAAGG 1305 AGGCAAGG 2242 GGCAAGG 3179
hsa-miR192
CUGACCUAUGAAUUGACAGCC 369 CATAGGTCA 1306 ATAGGTCA 2243 TAGGTCA 3180
hsa-miR192*
CUGCCAAUUCCAUAGGUCACAG 370 GAATTGGCA 1307 AATTGGCA 2244 ATTGGCA 3181
hsa-miR193a-3p
AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 371 TAGGCCAGT 1308 AGGCCAGT 2245 GGCCAGT 3182
hsa-miR193a-5p
UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA 372 CAAAGACCC 1309 AAAGACCC 2246 AAGACCC 3183
hsa-miR193b
AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU 373 AGGGCCAGT 1310 GGGCCAGT 2247 GGCCAGT 3184
hsa-miR193b*
CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA 374 CAAAACCCC 1311 AAAACCCC 2248 AAACCCC 3185
hsa-miR194
UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA 375 TGCTGTTAC 1312 GCTGTTAC 2249 CTGTTAC 3186
hsa-miR194*
CCAGUGGGGCUGCUGUUAUCUG 376 GCCCCACTG 1313 CCCCACTG 2250 CCCACTG 3187
hsa-miR195
UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC 377 TGTGCTGCT 1314 GTGCTGCT 2251 TGCTGCT 3188
hsa-miR195*
CCAAUAUUGGCUGUGCUGCUCC 378 CCAATATTG 1315 CAATATTG 2252 AATATTG 3189
hsa-miR196a
UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGG 379 AAACTACCT 1316 AACTACCT 2253 ACTACCT 3190
hsa-miR196a*
CGGCAACAAGAAACUGCCUGAG 380 CTTGTTGCC 1317 TTGTTGCC 2254 TGTTGCC 3191
hsa-miR196b
UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG 381 AAACTACCT 1318 AACTACCT 2255 ACTACCT 3192
hsa-miR197
UUCACCACCUUCUCCACCCAGC 382 AGGTGGTGA 1319 GGTGGTGA 2256 GTGGTGA 3193
hsa-miR198
GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC 383 CCTCTGGAC 1320 CTCTGGAC 2257 TCTGGAC 3194
hsa-miR199a-5p
CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC 384 GAACACTGG 1321 AACACTGG 2258 ACACTGG 3195
hsa-miR199b-3p
ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA 385 AGACTACTG 1322 GACTACTG 2259 ACTACTG 3196
hsa-m-iR199b-5p
CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC 386 AAACACTGG 1323 AACACTGG 2260 ACACTGG 3197
hsa-miR19a
UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA 387 GATTTGCAC 1324 ATTTGCAC 2261 TTTGCAC 3198
hsa-miR19a*
AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA 388 ATGCAAAAC 1325 TGCAAAAC 2262 GCAAAAC 3199
hsa-miR19b
UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 389 GATTTGCAC 1326 ATTTGCAC 2263 TTTGCAC 3200
hsa-miR19b-1*
AGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGC 390 CTGCAAAAC 1327 TGCAAAAC 2264 GCAAAAC 3201
hsa-miR19b-2*
AGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCA 391 CTGCAAAAC 1328 TGCAAAAC 2265 GCAAAAC 3202
hsa-miR200a
UAACACUGUCUGGUAACGAUGU 392 GACAGTGTT 1329 ACAGTGTT 2266 CAGTGTT 3203
hsa-miR200a*
CAUCUUACCGGACAGUGCUGGA 393 CGGTAAGAT 1330 GGTAAGAT 2267 GTAAGAT 3204
hsa-miR200b
UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA 394 GGCAGTATT 1331 GCAGTATT 2268 CAGTATT 3205
hsa-miR200b*
CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA 395 CAGTAAGAT 1332 AGTAAGAT 2269 GTAAGAT 3206
hsa-miR200c
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA 396 GGCAGTATT 1333 GCAGTATT 2270 CAGTATT 3207
hsa-miR200c*
CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG 397 GGGTAAGAC 1334 GGTAAGAC 2271 GTAAGAC 3208
hsa-miR202
AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA 398 CTATACCTC 1335 TATACCTC 2272 ATACCTC 3209
hsa-miR202*
UUCCUAUGCAUAUACUUCUUUG 399 TGCATAGGA 1336 GCATAGGA 2273 CATAGGA 3210
hsa-miR203
GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG 400 AACATTTCA 1337 ACATTTCA 2274 CATTTCA 3211
hsa-miR204
UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU 401 ACAAAGGGA 1338 CAAAGGGA 2275 AAAGGGA 3212
hsa-miR205
UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG 402 GAATGAAGG 1339 AATGAAGG 2276 ATGAAGG 3213
hsa-miR206
UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG 403 TTACATTCC 1340 TACATTCC 2277 ACATTCC 3214
hsa-miR208a
AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU 404 CTCGTCTTA 1341 TCGTCTTA 2278 CGTCTTA 3215
hsa-miR208b
AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU 405 TTCGTCTTA 1342 TCGTCTTA 2279 CGTCTTA 3216
hsa-miR20a
UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG 406 AAGCACTTT 1343 AGCACTTT 2280 GCACTTT 3217
hsa-miR20a*
ACUGCAUUAUGAGCACUUAAAG 407 ATAATGCAG 1344 TAATGCAG 2281 AATGCAG 3218
hsa-miR20b
CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG 908 GAGCACTTT 1345 AGCACTTT 2282 GCACTTT 3219
hsa-miR20b*
ACUGUAGUAUGGGCACUUCCAG 409 ATACTACAG 1346 TACTACAG 2283 ACTACAG 3220
hsa-miR21
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 410 TGATAAGCT 1347 GATAAGCT 2284 ATAAGCT 3221
hsa-miR21*
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 411 ACTGGTGTT 1348 CTGGTGTT 2285 TGGTGTT 3222
hsa-miR210
CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA 412 ACACGCACA 1349 CACGCACA 2286 ACGCACA 3223
hsa-miR211
UUCCCUUUGUCAUCCUUCGCCU 413 ACAAAGGGA 1350 CAAAGGGA 2287 AAAGGGA 3224
hsa-miR212
UAACAGUCUCCAGUCACGGCC 414 GAGACTGTT 1351 AGACTGTT 2288 GACTGTT 3225
hsa-miR214
ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU 415 TGCCTGCTG 1352 GCCTGCTG 2289 CCTGCTG 3226
hsa-miR214*
UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC 416 TAGACAGGC 1353 AGACAGGC 2290 GACAGGC 3227
hsa-miR215
AUGACCUAUGAAUUGACAGAC 417 CATAGGTCA 1354 ATAGGTCA 2291 TAGGTCA 3228
hsa-miR216a
UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA 418 GCTGAGATT 1355 CTGAGATT 2292 TGAGATT 3229
hsa-miR216b
AAAUCUCUGCAGGCAAAUGUGA 419 GCAGAGATT 1356 CAGAGATT 2293 AGAGATT 3230
hsa-miR217
UACUGCAUCAGGAACUGAUUGGA 420 TGATGCAGT 1357 GATGCAGT 2294 ATGCAGT 3231
hsa-miR218
UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU 421 TCAAGCACA 1358 CAAGCACA 2295 AAGCACA 3232
hsa-miR218-1*
AUGGUUCCGUCAAGCACCAUGG 422 ACGGAACCA 1359 CGGAACCA 2296 GGAACCA 3233
hsa-miR218-2*
CAUGGUUCUGUCAAGCACCGCG 423 CAGAACCAT 1360 AGAACCAT 2297 GAACCAT 3234
hsa-miR219-1-3p
AGAGUUGAGUCUGGACGUCCCG 424 ACTCAACTC 1361 CTCAACTC 2298 TCAACTC 3235
hsa-miR219-2-3p
AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU 425 CCACAATTC 1362 CACAATTC 2299 ACAATTC 3236
hsa-miR219-5p
UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU 426 TGGACAATC 1363 GGACAATC 2300 GACAATC 3237
hsa-miR22
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 427 CTGGCAGCT 1364 TGGCAGCT 2301 GGCAGCT 3238
hsa-miR22*
AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA 428 CTGAAGAAC 1365 TGAAGAAC 2302 GAAGAAC 3239
hsa-miR220a
CCACACCGUAUCUGACACUUU 429 TACGGTGTG 1366 ACGGTGTG 2303 CGGTGTG 3240
hsa-miR220b
CCACCACCGUGUCUGACACUU 430 ACGGTGGTG 1367 CGGTGGTG 2304 GGTGGTG 3241
hsa-miR220c
ACACAGGGCUGUUGUGAAGACU 431 AGCCCTGTG 1368 GCCCTGTG 2305 CCCTGTG 3242
hsa-miR221
AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 432 CAATGTAGC 1369 AATGTAGC 2306 ATGTAGC 3243
hsa-miR221*
ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU 433 TATGCCAGG 1370 ATGCCAGG 2307 TGCCAGG 3244
hsa-miR222
AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 434 AGATGTAGC 1371 GATGTAGC 2308 ATGTAGC 3245
hsa-miR222*
CUCAGUAGCCAGUGUAGAUCCU 435 GGCTACTGA 1372 GCTACTGA 2309 CTACTGA 3246
hsa-miR223
UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA 436 CAAACTGAC 1373 AAACTGAC 2310 AACTGAC 3247
hsa-miR223*
CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU 437 CAAATACAC 1374 AAATACAC 2311 AATACAC 3248
hsa-miR224
CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU 438 TAGTGACTT 1375 AGTGACTT 2312 GTGACTT 3249
hsa-miR23a
AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 439 GCAATGTGA 1376 CAATGTGA 2313 AATGTGA 3250
hsa-miR23a*
GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU 440 CAGGAACCC 1377 AGGAACCC 2314 GGAACCC 3251
hsa-miR23b
AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 441 GCAATGTGA 1378 CAATGTGA 2315 AATGTGA 3252
hsa-miR23b*
UGGGUUCCUGGCAUGCUGAUUU 442 CAGGAACCC 1379 AGGAACCC 2316 GGAACCC 3253
hsa-miR24
UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG 443 AACTGAGCC 1380 ACTGAGCC 2317 CTGAGCC 3254
hsa-miR24-1*
UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU 444 TCAGTAGGC 1381 CAGTAGGC 2318 AGTAGGC 3255
hsa-miR24-2*
UGCCUACUGAGCUGAAACACAG 445 TCAGTAGGC 1382 CAGTAGGC 2319 AGTAGGC 3256
hsa-miR25
CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA 446 AAGTGCAAT 1383 AGTGCAAT 2320 GTGCAAT 3257
hsa-miR25*
AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG 447 GTCTCCGCC 1384 TCTCCGCC 2321 CTCCGCC 3258
hsa-miR26a
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 448 ATTACTTGA 1385 TTACTTGA 2322 TACTTGA 3259
hsa-miR26a-1*
CCUAUUCUUGGUUACUUGCACG 449 CAAGAATAG 1386 AAGAATAG 2323 AGAATAG 3260
hsa-miR26a-2*
CCUAUUCUUGAUUACUUGUUUC 450 CAAGAATAG 1387 AAGAATAG 2324 AGAATAG 3261
hsa-miR26b
UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 451 ATTACTTGA 1388 TTACTTGA 2325 TACTTGA 3262
hsa-miR26b*
CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC 452 GGAGAACAG 1389 GAGAACAG 2326 AGAACAG 3263
hsa-miR27a
UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC 453 CCACTGTGA 1390 CACTGTGA 2327 ACTGTGA 3264
hsa-miR27a*
AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA 454 GCTAAGCCC 1391 CTAAGCCC 2328 TAAGCCC 3265
hsa-miR27b
UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC 455 CCACTGTGA 1392 CACTGTGA 2329 ACTGTGA 3266
hsa-miR27b*
AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC 456 GCTAAGCTC 1393 CTAAGCTC 2330 TAAGCTC 3267
hsa-miR28-3p
CACUAGAUUGUGAGCUCCUGGA 457 CAATCTAGT 1394 AATCTAGT 2331 ATCTAGT 3268
hsa-miR28-5p
AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 458 TGAGCTCCT 1395 GAGCTCCT 2332 AGCTCCT 3269
hsa-miR296-3p
GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC 459 CCCAACCCT 1396 CCAACCCT 2333 CAACCCT 3270
hsa-miR296-5p
AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU 460 GGGGGGCCC 1397 GGGGGCCC 2334 GGGGCCC 3271
hsa-miR297
AUGUAUGUGUGCAUGUGCAUG 461 ACACATACA 1398 CACATACA 2335 ACATACA 3272
hsa-miR298
AGCAGAAGCAGGGAGGUUCUCCCA 462 TGCTTCTGC 1399 GCTTCTGC 2336 CTTCTGC 3273
hsa-miR299-3p
UAUGUGGGAUGGUAAACCGCUU 463 ATCCCACAT 1400 TCCCACAT 2337 CCCACAT 3274
hsa-miR299-5p
UGGUUUACCGUCCCACAUACAU 464 CGGTAAACC 1401 GGTAAACC 2338 GTAAACC 3275
hsa-miR29a
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA 465 GATGGTGCT 1402 ATGGTGCT 2339 TGGTGCT 3276
hsa-miR29a*
ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG 466 AGAAATCAG 1403 GAAATCAG 2340 AAATCAG 3277
hsa-miR29b
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU 467 AATGGTGCT 1404 ATGGTGCT 2341 TGGTGCT 3278
hsa-miR29b-1*
GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA 468 TGAAACCAG 1405 GAAACCAG 2342 AAACCAG 3279
hsa-miR29b-2*
CUGGUUUCACAUGGUGGCUUAG 469 GTGAAACCA 1406 TGAAACCA 2343 GAAACCA 3280
hsa-miR29c
UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA 470 AATGGTGCT 1407 ATGGTGCT 2344 TGGTGCT 3281
hsa-miR29c*
UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC 471 AAATCGGTC 1408 AATCGGTC 2345 ATCGGTC 3282
hsa-miR300
UAUACAAGGGCAGACUCUCUCU 472 CCCTTGTAT 1409 CCTTGTAT 2346 CTTGTAT 3283
hsa-miR301a
CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC 473 TATTGCACT 1410 ATTGCACT 2347 TTGCACT 3284
hsa-miR301b
CAGUGCAAUGAUAUUGUCAAAGC 474 CATTGCACT 1411 ATTGCACT 2348 TTGCACT 3285
hsa-miR302a
UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA 475 GAAGCACTT 1412 AAGCACTT 2349 AGCACTT 3286
hsa-miR302a*
ACUUAAACGUGGAUGUACUUGCU 476 ACGTTTAAG 1413 CGTTTAAG 2350 GTTTAAG 3287
hsa-miR302b
UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG 477 GAAGCACTT 1414 AAGCACTT 2351 AGCACTT 3288
hsa-miR302b*
ACUUUAACAUGGAAGUGCUUUC 478 ATGTTAAAG 1415 TGTTAAAG 2352 GTTAAAG 3289
hsa-miR302c
UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG 479 GAAGCACTT 1416 AAGCACTT 2353 AGCACTT 3290
hsa-miR302c*
UUUAACAUGGGGGUACCUGCUG 480 CCATGTTAA 1417 CATGTTAA 2354 ATGTTAA 3291
hsa-miR302d
UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU 481 GAAGCACTT 1418 AAGCACTT 2355 AGCACTT 3292
hsa-miR302d*
ACUUUAACAUGGAGGCACUUGC 482 ATGTTAAAG 1419 TGTTAAAG 2356 GTTAAAG 3293
hsa-miR302e
UAAGUGCUUCCAUGCUU 483 GAAGCACTT 1420 AAGCACTT 2357 AGCACTT 3294
hsa-miR302f
UAAUUGCUUCCAUGUUU 484 GAAGCAATT 1421 AAGCAATT 2358 AGCAATT 3295
hsa-miR30a
UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG 485 GATGTTTAC 1422 ATGTTTAC 2359 TGTTTAC 3296
hsa-miR30a*
CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC 486 CGACTGAAA 1423 GACTGAAA 2360 ACTGAAA 3297
hsa-miR30b
UGUAAACAUCCUACACUCAGCU 487 GATGTTTAC 1424 ATGTTTAC 2361 TGTTTAC 3298
hsa-miR30b*
CUGGGAGGUGGAUGUUUACUUC 488 CACCTCCCA 1425 ACCTCCCA 2362 CCTCCCA 3299
hsa-miR30c
UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC 489 GATGTTTAC 1426 ATGTTTAC 2363 TGTTTAC 3300
hsa-miR30c-1*
CUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC 490 CCTCTCCCA 1427 CTCTCCCA 2364 TCTCCCA 3301
hsa-miR30c-2*
CUGGGAGAAGGCUGUUUACUCU 491 CTTCTCCCA 1428 TTCTCCCA 2365 TCTCCCA 3302
hsa-miR30d
UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 492 GATGTTTAC 1429 ATGTTTAC 2366 TGTTTAC 3303
hsa-miR30d*
CUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGC 493 TGACTGAAA 1430 GACTGAAA 2367 ACTGAAA 3304
hsa-miR30e
UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG 494 GATGTTTAC 1431 ATGTTTAC 2368 TGTTTAC 3305
hsa-miR30e*
CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC 495 CGACTGAAA 1432 GACTGAAA 2369 ACTGAAA 3306
hsa-miR31
AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU 496 CATCTTGCC 1433 ATCTTGCC 2370 TCTTGCC 3307
hsa-miR31*
UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU 497 TGGCATAGC 1434 GGCATAGC 2371 GCATAGC 3308
hsa-miR32
UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA 498 ATGTGCAAT 1435 TGTGCAAT 2372 GTGCAAT 3309
hsa-miR32*
CAAUUUAGUGUGUGUGAUAUUU 499 CACTAAATT 1436 ACTAAATT 2373 CTAAATT 3310
hsa-miR320a
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 500 CCCAGCTTT 1437 CCAGCTTT 2374 CAGCTTT 3311
hsa-miR320b
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCAA 501 CCCAGCTTT 1438 CCAGCTTT 2375 CAGCTTT 3312
hsa-miR320c
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGU 502 CCCAGCTTT 1439 CCAGCTTT 2376 CAGCTTT 3313
hsa-miR320d
AAAAGCUGGGUUGAGAGGA 503 CCCAGCTTT 1440 CCAGCTTT 2377 CAGCTTT 3314
hsa-miR323-3p
CACAUUACACGGUCGACCUCU 504 GTGTAATGT 1441 TGTAATGT 2378 GTAATGT 3315
hsa-miR323-5p
AGGUGGUCCGUGGCGCGUUCGC 505 CGGACCACC 1442 GGACCACC 2379 GACCACC 3316
hsa-miR324-3p
ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG 506 CTGGGGCAG 1443 TGGGGCAG 2380 GGGGCAG 3317
hsa-miR324-5p
CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU 507 AGGGGATGC 1444 GGGGATGC 2381 GGGATGC 3318
hsa-miR325
CCUAGUAGGUGUCCAGUAAGUGU 508 ACCTACTAG 1445 CCTACTAG 2382 CTACTAG 3319
hsa-miR326
CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG 509 GGCCCAGAG 1446 GCCCAGAG 2383 CCCAGAG 3320
hsa-miR328
CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU 510 AGAGGGCCA 1447 GAGGGCCA 2384 AGGGCCA 3321
hsa-miR329
AACACACCUGGUUAACCUCUUU 511 CAGGTGTGT 1448 AGGTGTGT 2385 GGTGTGT 3322
hsa-miR330-3p
GCAAAGCACACGGCCUGCAGAGA 512 TGTGCTTTG 1449 GTGCTTTG 2386 TGCTTTG 3323
hsa-miR330-5p
UCUCUGGGCCUGUGUCUUAGGC 513 GGCCCAGAG 1450 GCCCAGAG 2387 CCCAGAG 3324
hsa-miR331-3p
GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA 514 GCCCAGGGG 1451 CCCAGGGG 2388 CCAGGGG 3325
hsa-miR331-5p
CUAGGUAUGGUCCCAGGGAUCC 515 CCATACCTA 1452 CATACCTA 2389 ATACCTA 3326
hsa-miR335
UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU 516 TTGCTCTTG 1453 TGCTCTTG 2390 GCTCTTG 3327
hsa-miR335*
UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC 517 TAATGAAAA 1454 AATGAAAA 2391 ATGAAAA 3328
hsa-miR337-3p
CUCCUAUAUGAUGCCUUUCUUC 518 CATATAGGA 1455 ATATAGGA 2392 TATAGGA 3329
hsa-miR337-5p
GAACGGCUUCAUACAGGAGUU 519 GAAGCCGTT 1456 AAGCCGTT 2393 AGCCGTT 3330
hsa-miR338-3p
UCCAGCAUCAGUGAUUUUGUUG 520 TGATGCTGG 1457 GATGCTGG 2394 ATGCTGG 3331
hsa-miR338-5p
AACAAUAUCCUGGUGCUGAGUG 521 GGATATTGT 1458 GATATTGT 2395 ATATTGT 3332
hsa-miR339-3p
UGAGCGCCUCGACGACAGAGCCG 522 GAGGCGCTC 1459 AGGCGCTC 2396 GGCGCTC 3333
hsa-miR339-5p
UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG 523 AGGACAGGG 1460 GGACAGGG 2397 GACAGGG 3334
hsa-miR33a
GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA 524 TACAATGCA 1461 ACAATGCA 2398 CAATGCA 3335
hsa-miR33a*
CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC 525 GGAAACATT 1462 GAAACATT 2399 AAACATT 3336
hsa-miR33b
GUGCAUUGCUGUUGCAUUGC 526 AGCAATGCA 1463 GCAATGCA 2400 CAATGCA 3337
hsa-miR33b*
CAGUGCCUCGGCAGUGCAGCCC 527 CGAGGCACT 1464 GAGGCACT 2401 AGGCACT 3338
hsa-miR340
UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU 528 TGCTTTATA 1465 GCTTTATA 2402 CTTTATA 3339
hsa-miR340*
UCCGUCUCAGUUACUUUAUAGC 529 CTGAGACGG 1466 TGAGACGG 2403 GAGACGG 3340
hsa-miR342-3p
UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU 530 CTGTGTGAG 1467 TGTGTGAG 2404 GTGTGAG 3341
hsa-miR342-5p
AGGGGUGCUAUCUGUGAUUGA 531 TAGCACCCC 1468 AGCACCCC 2405 GCACCCC 3342
hsa-miR345
GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC 532 AGGAGTCAG 1469 GGAGTCAG 2406 GAGTCAG 3343
hsa-miR346
UGUCUGCCCGCAUGCCUGCCUCU 533 CGGGCAGAC 1470 GGGCAGAC 2407 GGCAGAC 3344
hsa-miR34a
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 534 GACACTGCC 1471 ACACTGCC 2408 CACTGCC 3345
hsa-miR34a*
CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU 535 TTGCTGATT 1472 TGCTGATT 2409 GCTGATT 3346
hsa-miR34b
CAAUCACUAACUCCACUGCCAU 536 TTAGTGATT 1473 TAGTGATT 2410 AGTGATT 3347
hsa-miR34b*
UAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUG 537 ACACTGCCT 1474 CACTGCCT 2411 ACTGCCT 3348
hsa-miR34c-3p
AAUCACUAACCACACGGCCAGG 538 GTTAGTGAT 1475 TTAGTGAT 2412 TAGTGAT 3349
hsa-miR34c-5p
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC 539 TACACTGCC 1476 ACACTGCC 2413 CACTGCC 3350
hsa-miR361-3p
UCCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUU 540 ACCTGGGGG 1477 CCTGGGGG 2414 CTGGGGG 3351
hsa-miR361-5p
UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC 541 ATTCTGATA 1478 TTCTGATA 2415 TCTGATA 3352
hsa-miR362-3p
AACACACCUAUUCAAGGAUUCA 542 TAGGTGTGT 1479 AGGTGTGT 2416 GGTGTGT 3353
hsa-miR362-5p
AAUCCUUGGAACCUAGGUGUGAGU 543 TCCAAGGAT 1480 CCAAGGAT 2417 CAAGGAT 3354
hsa-miR363
AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA 544 CCGTGCAAT 1481 CGTGCAAT 2418 GTGCAAT 3355
hsa-miR363*
CGGGUGGAUCACGAUGCAAUUU 545 GATCCACCC 1482 ATCCACCC 2419 TCCACCC 3356
hsa-miR365
UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU 546 AGGGGCATT 1483 GGGGCATT 2420 GGGCATT 3357
hsa-miR367
AAUUGCACUUUAGCAAUGGUGA 547 AAGTGCAAT 1484 AGTGCAAT 2421 GTGCAAT 3358
hsa-miR367*
ACUGUUGCUAAUAUGCAACUCU 548 TAGCAACAG 1485 AGCAACAG 2422 GCAACAG 3359
hsa-miR369-3p
AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU 549 ATGTATTAT 1486 TGTATTAT 2423 GTATTAT 3360
hsa-miR369-5p
AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC 550 CGGTCGATC 1487 GGTCGATC 2424 GTCGATC 3361
hsa-miR370
GCCUGCUGGGGUGGAACCUGGU 551 CCCAGCAGG 1488 CCAGCAGG 2425 CAGCAGG 3362
hsa-miR371-3p
AAGUGCCGCCAUCUUUUGAGUGU 552 GGCGGCACT 1489 GCGGCACT 2426 CGGCACT 3363
hsa-miR371-5p
ACUCAAACUGUGGGGGCACU 553 CAGTTTGAG 1490 AGTTTGAG 2427 GTTTGAG 3364
hsa-miR372
AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGU 554 GCAGCACTT 1491 CAGCACTT 2428 AGCACTT 3365
hsa-miR373
GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU 555 GAAGCACTT 1492 AAGCACTT 2429 AGCACTT 3366
hsa-miR373*
ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCC 556 CATTTTGAG 1493 ATTTTGAG 2430 TTTTGAG 3367
hsa-miR374a
UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG 557 TGTATTATA 1494 GTATTATA 2431 TATTATA 3368
hsa-miR374a*
CUUAUCAGAUUGUAUUGUAAUU 558 ATCTGATAA 1495 TCTGATAA 2432 CTGATAA 3369
hsa-miR374b
AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG 559 TGTATTATA 1496 GTATTATA 2433 TATTATA 3370
hsa-miR374b*
CUUAGCAGGUUGUAUUAUCAUU 560 ACCTGCTAA 1497 CCTGCTAA 2434 CTGCTAA 3371
hsa-miR375
UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA 561 AACGAACAA 1498 ACGAACAA 2435 CGAACAA 3372
hsa-miR376a
AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU 562 CCTCTATGA 1499 CTCTATGA 2436 TCTATGA 3373
hsa-miR376a*
GUAGAUUCUCCUUCUAUGAGUA 563 GAGAATCTA 1500 AGAATCTA 2437 GAATCTA 3374
hsa-miR376b
AUCAUAGAGGAAAAUCCAUGUU 564 CCTCTATGA 1501 CTCTATGA 2438 TCTATGA 3375
hsa-miR376c
AACAUAGAGGAAAUUCCACGU 565 CCTCTATGT 1502 CTCTATGT 2439 TCTATGT 3376
hsa-miR377
AUCACACAAAGGCAACUUUUGU 566 TTTGTGTGA 1503 TTGTGTGA 2440 TGTGTGA 3377
hsa-miR377*
AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC 567 GGCAACCTC 1504 GCAACCTC 2441 CAACCTC 3378
hsa-miR378
ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG 568 CAAGTCCAG 1505 AAGTCCAG 2442 AGTCCAG 3379
hsa-miR378*
CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU 569 GAGTCAGGA 1506 AGTCAGGA 2443 GTCAGGA 3380
hsa-miR379
UGGUAGACUAUGGAACGUAGG 570 TAGTCTACC 1507 AGTCTACC 2444 GTCTACC 3381
hsa-miR379*
UAUGUAACAUGGUCCACUAACU 571 ATGTTACAT 1508 TGTTACAT 2445 GTTACAT 3382
hsa-miR380
UAUGUAAUAUGGUCCACAUCUU 572 ATATTACAT 1509 TATTACAT 2446 ATTACAT 3383
hsa-miR380*
UGGUUGACCAUAGAACAUGCGC 573 TGGTCAACC 1510 GGTCAACC 2447 GTCAACC 3384
hsa-miR381
UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU 574 CCCTTGTAT 1511 CCTTGTAT 2448 CTTGTAT 3385
hsa-miR382
GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG 575 GAACAACTT 1512 AACAACTT 2449 ACAACTT 3386
hsa-miR383
AGAUCAGAAGGUGAUUGUGGCU 576 CTTCTGATC 1513 TTCTGATC 2450 TCTGATC 3387
hsa-miR384
AUUCCUAGAAAUUGUUCAUA 577 TTCTAGGAA 1514 TCTAGGAA 2451 CTAGGAA 3388
hsa-miR409-3p
GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU 578 AGCAACATT 1515 GCAACATT 2452 CAACATT 3389
hsa-miR409-5p
AGGUUACCCGAGCAACUUUGCAU 579 CGGGTAACC 1516 GGGTAACC 2453 GGTAACC 3390
hsa-miR410
AAUAUAACACAGAUGGCCUGU 580 GTGTTATAT 1517 TGTTATAT 2454 GTTATAT 3391
hsa-miR411
UAGUAGACCGUAUAGCGUACG 581 CGGTCTACT 1518 GGTCTACT 2455 GTCTACT 3392
hsa-miR411*
UAUGUAACACGGUCCACUAACC 582 GTGTTACAT 1519 TGTTACAT 2456 GTTACAT 3393
hsa-miR412
ACUUCACCUGGUCCACUAGCCGU 583 CAGGTGAAG 1520 AGGTGAAG 2457 GGTGAAG 3394
hsa-miR421
AUCAACAGACAUUAAUUGGGCGC 584 GTCTGTTGA 1521 TCTGTTGA 2458 CTGTTGA 3395
hsa-miR422a
ACUGGACUUAGGGUCAGAAGGC 585 TAAGTCCAG 1522 AAGTCCAG 2459 AGTCCAG 3396
hsa-miR423-3p
AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU 586 AGACCGAGC 1523 GACCGAGC 2460 ACCGAGC 3397
hsa-miR423-5p
UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 587 CTGCCCCTC 1524 TGCCCCTC 2461 GCCCCTC 3398
hsa-miR424
CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA 588 ATTGCTGCT 1525 TTGCTGCT 2462 TGCTGCT 3399
hsa-miR424*
CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU 589 TCACGTTTT 1526 CACGTTTT 2463 ACGTTTT 3400
hsa-miR425
AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA 590 TCGTGTCAT 1527 CGTGTCAT 2464 GTGTCAT 3401
hsa-miR425*
AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCCC 591 CATTCCCGA 1528 ATTCCCGA 2465 TTCCCGA 3402
hsa-miR429
UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU 592 GACAGTATT 1529 ACAGTATT 2466 CAGTATT 3403
hsa-miR431
UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA 593 CTGCAAGAC 1530 TGCAAGAC 2467 GCAAGAC 3404
hsa-miR431*
CAGGUCGUCUUGCAGGGCUUCU 594 AGACGACCT 1531 GACGACCT 2468 ACGACCT 3405
hsa-miR432
UCUUGGAGUAGGUCAUUGGGUGG 595 TACTCCAAG 1532 ACTCCAAG 2469 CTCCAAG 3406
hsa-miR432*
CUGGAUGGCUCCUCCAUGUCU 596 AGCCATCCA 1533 GCCATCCA 2470 CCATCCA 3407
hsa-miR433
AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU 597 CCATCATGA 1534 CATCATGA 2471 ATCATGA 3408
hsa-miR448
UUGCAUAUGUAGGAUGUCCCAU 598 ACATATGCA 1535 CATATGCA 2472 ATATGCA 3409
hsa-miR449a
UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU 599 TACACTGCC 1536 ACACTGCC 2473 CACTGCC 3410
hsa-miR449b
AGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGC 600 TACACTGCC 1537 ACACTGCC 2474 CACTGCC 3411
hsa-miR450a
UUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAU 601 CATCGCAAA 1538 ATCGCAAA 2475 TCGCAAA 3412
hsa-miR450b-3p
UUGGGAUCAUUUUGCAUCCAUA 602 ATGATCCCA 1539 TGATCCCA 2476 GATCCCA 3413
hsa-miR450b-5p
UUUUGCAAUAUGUUCCUGAAUA 603 TATTGCAAA 1540 ATTGCAAA 2477 TTGCAAA 3414
hsa-miR451
AAACCGUUACCAUUACUGAGUU 604 GTAACGGTT 1541 TAACGGTT 2478 AACGGTT 3415
hsa-miR452
AACUGUUUGCAGAGGAAACUGA 605 GCAAACAGT 1542 CAAACAGT 2479 AAACAGT 3416
hsa-miR452*
CUCAUCUGCAAAGAAGUAAGUG 606 TGCAGATGA 1543 GCAGATGA 2480 CAGATGA 3417
hsa-miR453
AGGUUGUCCGUGGUGAGUUCGCA 607 CGGACAACC 1544 GGACAACC 2481 GACAACC 3418
hsa-miR454
UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGU 608 TATTGCACT 1545 ATTGCACT 2482 TTGCACT 3419
hsa-miR454*
ACCCUAUCAAUAUUGUCUCUGC 609 TTGATAGGG 1546 TGATAGGG 2483 GATAGGG 3420
hsa-miR455-3p
GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC 610 CATGGACTG 1547 ATGGACTG 2484 TGGACTG 3421
hsa-miR455-5p
UAUGUGCCUUUGGACUACAUCG 611 AAGGCACAT 1548 AGGCACAT 2485 GGCACAT 3422
hsa-miR483-3p
UCACUCCUCUCCUCCCGUCUU 612 AGAGGAGTG 1549 GAGGAGTG 2486 AGGAGTG 3423
hsa-miR483-5p
AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG 613 CTCCCGTCT 1550 TCCCGTCT 2487 CCCGTCT 3424
hsa-miR484
UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 614 CTGAGCCTG 1551 TGAGCCTG 2488 GAGCCTG 3425
hsa-miR485-3p
GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU 615 CGTGTATGA 1552 GTGTATGA 2489 TGTATGA 3426
hsa-miR485-5p
AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC 616 GCCAGCCTC 1553 CCAGCCTC 2490 CAGCCTC 3427
hsa-miR486-3p
CGGGGCAGCUCAGUACAGGAU 617 AGCTGCCCC 1554 GCTGCCCC 2491 CTGCCCC 3428
hsa-miR486-5p
UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG 618 CAGTACAGG 1555 AGTACAGG 2492 GTACAGG 3429
hsa-miR487a
AAUCAUACAGGGACAUCCAGUU 619 CTGTATGAT 1556 TGTATGAT 2493 GTATGAT 3430
hsa-miR487b
AAUCGUACAGGGUCAUCCACUU 620 CTGTACGAT 1557 TGTACGAT 2494 GTACGAT 3431
hsa-miR488
UUGAAAGGCUAUUUCUUGGUC 621 AGCCTTTCA 1558 GCCTTTCA 2495 CCTTTCA 3432
hsa-miR488*
CCCAGAUAAUGGCACUCUCAA 622 ATTATCTGG 1559 TTATCTGG 2496 TATCTGG 3433
hsa-miR489
GUGACAUCACAUAUACGGCAGC 623 GTGATGTCA 1560 TGATGTCA 2497 GATGTCA 3434
hsa-miR490-3p
CAACCUGGAGGACUCCAUGCUG 624 CTCCAGGTT 1561 TCCAGGTT 2498 CCAGGTT 3435
hsa-miR490-5p
CCAUGGAUCUCCAGGUGGGU 625 AGATCCATG 1562 GATCCATG 2499 ATCCATG 3436
hsa-miR491-3p
CUUAUGCAAGAUUCCCUUCUAC 626 CTTGCATAA 1563 TTGCATAA 2500 TGCATAA 3437
hsa-miR491-5p
AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG 627 GTTCCCCAC 1564 TTCCCCAC 2501 TCCCCAC 3438
hsa-miR492
AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU 628 CGCAGGTCC 1565 GCAGGTCC 2502 CAGGTCC 3439
hsa-miR493
UGAAGGUCUACUGUGUGCCAGG 629 TAGACCTTC 1566 AGACCTTC 2503 GACCTTC 3440
hsa-miR493*
UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU 630 CCATGTACA 1567 CATGTACA 2504 ATGTACA 3441
hsa-miR494
UGAAACAUACACGGGAAACCUC 631 GTATGTTTC 1568 TATGTTTC 2505 ATGTTTC 3442
hsa-miR495
AAACAAACAUGGUGCACUUCUU 632 ATGTTTGTT 1569 TGTTTGTT 2506 GTTTGTT 3443
hsa-miR496
UGAGUAUUACAUGGCCAAUCUC 633 GTAATACTC 1570 TAATACTC 2507 AATACTC 3444
hsa-miR497
CAGCAGCACACUGUGGUUUGU 634 TGTGCTGCT 1571 GTGCTGCT 2508 TGCTGCT 3445
hsa-miR497*
CAAACCACACUGUGGUGUUAGA 635 GTGTGGTTT 1572 TGTGGTTT 2509 GTGGTTT 3446
hsa-miR498
UUUCAAGCCAGGGGGCGUUUUUC 636 TGGCTTGAA 1573 GGCTTGAA 2510 GCTTGAA 3447
hsa-miR499-3p
AACAUCACAGCAAGUCUGUGCU 637 CTGTGATGT 1574 TGTGATGT 2511 GTGATGT 3448
hsa-miR499-5p
UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU 638 CAAGTCTTA 1575 AAGTCTTA 2512 AGTCTTA 3449
hsa-miR500
UAAUCCUUGCUACCUGGGUGAGA 639 GCAAGGATT 1576 CAAGGATT 2513 AAGGATT 3450
hsa-miR500*
AUGCACCUGGGCAAGGAUUCUG 640 CCAGGTGCA 1577 CAGGTGCA 2514 AGGTGCA 3451
hsa-miR501-3p
AAUGCACCCGGGCAAGGAUUCU 641 CGGGTGCAT 1578 GGGTGCAT 2515 GGTGCAT 3452
hsa-miR501-5p
AAUCCUUUGUCCCUGGGUGAGA 642 ACAAAGGAT 1579 CAAAGGAT 2516 AAAGGAT 3453
hsa-miR502-3p
AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA 643 CAGGTGCAT 1580 AGGTGCAT 2517 GGTGCAT 3454
hsa-miR502-5p
AUCCUUGCUAUCUGGGUGCUA 644 TAGCAAGGA 1581 AGCAAGGA 2518 GCAAGGA 3455
hsa-miR503
UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG 645 CCCGCTGCT 1582 CCGCTGCT 2519 CGCTGCT 3456
hsa-miR504
AGACCCUGGUCUGCACUCUAUC 646 ACCAGGGTC 1583 CCAGGGTC 2520 CAGGGTC 3457
hsa-miR505
CGUCAACACUUGCUGGUUUCCU 647 AGTGTTGAC 1584 GTGTTGAC 2521 TGTTGAC 3458
hsa-miR505*
GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU 648 CCTGGCTCC 1585 CTGGCTCC 2522 TGGCTCC 3459
hsa-miR506
UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA 649 GGGTGCCTT 1586 GGTGCCTT 2523 GTGCCTT 3460
hsa-miR507
UUUUGCACCUUUUGGAGUGAA 650 AGGTGCAAA 1587 GGTGCAAA 2524 GTGCAAA 3461
hsa-miR508-3p
UGAUUGUAGCCUUUUGGAGUAGA 651 GCTACAATC 1588 CTACAATC 2525 TACAATC 3462
hsa-miR508-5p
UACUCCAGAGGGCGUCACUCAUG 652 CTCTGGAGT 1589 TCTGGAGT 2526 CTGGAGT 3463
hsa-miR509-3-5p
UACUGCAGACGUGGCAAUCAUG 653 GTCTGCAGT 1590 TCTGCAGT 2527 CTGCAGT 3464
hsa-miR509-3p
UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAG 654 GTACCAATC 1591 TACCAATC 2528 ACCAATC 3465
hsa-miR509-5p
UACUGCAGACAGUGGCAAUCA 655 GTCTGCAGT 1592 TCTGCAGT 2529 CTGCAGT 3466
hsa-miR510
UACUCAGGAGAGUGGCAAUCAC 656 CTCCTGAGT 1593 TCCTGAGT 2530 CCTGAGT 3467
hsa-miR511
GUGUCUUUUGCUCUGCAGUCA 657 CAAAAGACA 1594 AAAAGACA 2531 AAAGACA 3468
hsa-miR512-3p
AAGUGCUGUCAUAGCUGAGGUC 658 GACAGCACT 1595 ACAGCACT 2532 CAGCACT 3469
hsa-miR512-5p
CACUCAGCCUUGAGGGCACUUUC 659 AGGCTGAGT 1596 GGCTGAGT 2533 GCTGAGT 3470
hsa-miR513a-3p
UAAAUUUCACCUUUCUGAGAAGG 660 GTGAAATTT 1597 TGAAATTT 2534 GAAATTT 3471
hsa-miR513a-5p
UUCACAGGGAGGUGUCAU 661 TCCCTGTGA 1598 CCCTGTGA 2535 CCTGTGA 3472
hsa-miR513b
UUCACAAGGAGGUGUCAUUUAU 662 TCCTTGTGA 1599 CCTTGTGA 2536 CTTGTGA 3473
hsa-miR513c
UUCUCAAGGAGGUGUCGUUUAU 663 TCCTTGAGA 1600 CCTTGAGA 2537 CTTGAGA 3474
hsa-miR514
AUUGACACUUCUGUGAGUAGA 664 AAGTGTCAA 1601 AGTGTCAA 2538 GTGTCAA 3475
hsa-miR515-3p
GAGUGCCUUCUUUUGGAGCGUU 665 GAAGGCACT 1602 AAGGCACT 2539 AGGCACT 3476
hsa-miR515-5p
UUCUCCAAAAGAAAGCACUUUCUG 666 TTTTGGAGA 1603 TTTGGAGA 2540 TTGGAGA 3477
hsa-miR516a-3p
UGCUUCCUUUCAGAGGGU 667 AAAGGAAGC 1604 AAGGAAGC 2541 AGGAAGC 3478
hsa-miR516a-5p
UUCUCGAGGAAAGAAGCACUUUC 668 TCCTCGAGA 1605 CCTCGAGA 2542 CTCGAGA 3479
hsa-miR516b
AUCUGGAGGUAAGAAGCACUUU 669 ACCTCCAGA 1606 CCTCCAGA 2543 CTCCAGA 3480
hsa-miR517*
CCUCUAGAUGGAAGCACUGUCU 670 CATCTAGAG 1607 ATCTAGAG 2544 TCTAGAG 3481
hsa-miR517a
AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU 671 GATGCACGA 1608 ATGCACGA 2545 TGCACGA 3482
hsa-miR517b
UCGUGCAUCCCUUUAGAGUGUU 672 GGATGCACG 1609 GATGCACG 2546 ATGCACG 3483
hsa-miR517c
AUCGUGCAUCCUUUUAGAGUGU 673 GATGCACGA 1610 ATGCACGA 2547 TGCACGA 3484
hsa-miR518a-3p
GAAAGCGCUUCCCUUUGCUGGA 674 AAGCGCTTT 1611 AGCGCTTT 2548 GCGCTTT 3485
hsa-miR518b
CAAAGCGCUCCCCUUUAGAGGU 675 GAGCGCTTT 1612 AGCGCTTT 2549 GCGCTTT 3486
hsa-miR518c
CAAAGCGCUUCUCUUUAGAGUGU 676 AAGCGCTTT 1613 AGCGCTTT 2550 GCGCTTT 3487
hsa-miR518c*
UCUCUGGAGGGAAGCACUUUCUG 677 CCTCCAGAG 1614 CTCCAGAG 2551 TCCAGAG 3488
hsa-miR518d-3p
CAAAGCGCUUCCCUUUGGAGC 678 AAGCGCTTT 1615 AGCGCTTT 2552 GCGCTTT 3489
hsa-miR518d-5p
CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUG 679 CCCTCTAGA 1616 CCTCTAGA 2553 CTCTAGA 3490
hsa-miR518e
AAAGCGCUUCCCUUCAGAGUG 680 GAAGCGCTT 1617 AAGCGCTT 2554 AGCGCTT 3491
hsa-miR518f
GAAAGCGCUUCUCUUUAGAGG 681 AAGCGCTTT 1618 AGCGCTTT 2555 GCGCTTT 3492
hsa-miR518f*
CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC 682 CCCTCTAGA 1619 CCTCTAGA 2556 CTCTAGA 3493
hsa-miR519a
AAAGUGCAUCCUUUUAGAGUGU 683 GATGCACTT 1620 ATGCACTT 2557 TGCACTT 3494
hsa-miR519a*
CUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUG 684 CCCTCTAGA 1621 CCTCTAGA 2558 CTCTAGA 3495
hsa-miR519b-3p
AAAGUGCAUCCUUUUAGAGGUU 685 GATGCACTT 1622 ATGCACTT 2559 TGCACTT 3496
hsa-miR519c-3p
AAAGUGCAUCUUUUUAGAGGAU 686 GATGCACTT 1623 ATGCACTT 2560 TGCACTT 3497
hsa-miR519d
CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG 687 AGGCACTTT 1624 GGCACTTT 2561 GCACTTT 3498
hsa-miR519e
AAGUGCCUCCUUUUAGAGUGUU 688 GGAGGCACT 1625 GAGGCACT 2562 AGGCACT 3499
hsa-miR519e*
UUCUCCAAAAGGGAGCACUUUC 689 TTTTGGAGA 1626 TTTGGAGA 2563 TTGGAGA 3500
hsa-miR520a-3p
AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU 690 GAAGCACTT 1627 AAGCACTT 2564 AGCACTT 3501
hsa-miR520a-5p
CUCCAGAGGGAAGUACUUUCU 691 CCCTCTGGA 1628 CCTCTGGA 2565 CTCTGGA 3502
hsa-miR520b
AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG 692 GAAGCACTT 1629 AAGCACTT 2566 AGCACTT 3503
hsa-miR520c-3p
AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGGU 693 GAAGCACTT 1630 AAGCACTT 2567 AGCACTT 3504
hsa-miR520d-3p
AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGU 694 GAAGCACTT 1631 AAGCACTT 2568 AGCACTT 3505
hsa-miR520d-5p
CUACAAAGGGAAGCCCUUUC 695 CCCTTTGTA 1632 CCTTTGTA 2569 CTTTGTA 3506
hsa-miR520e
AAAGUGCUUCCUUUUUGAGGG 696 GAAGCACTT 1633 AAGCACTT 2570 AGCACTT 3507
hsa-miR520f
AAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU 697 GGAAGCACT 1634 GAAGCACT 2571 AAGCACT 3508
hsa-miR520g
ACAAAGUGCUUCCCUUUAGAGUGU 698 AGCACTTTG 1635 GCACTTTG 2572 CACTTTG 3509
hsa-miR520h
ACAAAGUGCUUCCCUUUAGAGU 699 AGCACTTTG 1636 GCACTTTG 2573 CACTTTG 3510
hsa-miR521
AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU 700 GAAGTGCGT 1637 AAGTGCGT 2574 AGTGCGT 3511
hsa-miR522
AAAAUGGUUCCCUUUAGAGUGU 701 GAACCATTT 1638 AACCATTT 2575 ACCATTT 3512
hsa-miR523
GAACGCGCUUCCCUAUAGAGGGU 702 AAGCGCGTT 1639 AGCGCGTT 2576 GCGCGTT 3513
hsa-miR524-3p
GAAGGCGCUUCCCUUUGGAGU 703 AAGCGCCTT 1640 AGCGCCTT 2577 GCGCCTT 3514
hsa-miR524-5p
CUACAAAGGGAAGCACUUUCUC 704 CCCTTTGTA 1641 CCTTTGTA 2578 CTTTGTA 3515
hsa-miR525-3p
GAAGGCGCUUCCCUUUAGAGCG 705 AAGCGCCTT 1642 AGCGCCTT 2579 GCGCCTT 3516
hsa-miR525-5p
CUCCAGAGGGAUGCACUUUCU 706 CCCTCTGGA 1643 CCTCTGGA 2580 CTCTGGA 3517
hsa-miR526b
CUCUUGAGGGAAGCACUUUCUGU 707 CCCTCAAGA 1644 CCTCAAGA 2581 CTCAAGA 3518
hsa-miR526b*
GAAAGUGCUUCCUUUUAGAGGC 708 AAGCACTTT 1645 AGCACTTT 2582 GCACTTT 3519
hsa-miR527
CUGCAAAGGGAAGCCCUUUC 709 CCCTTTGCA 1646 CCTTTGCA 2583 CTTTGCA 3520
hsa-miR532-3p
CCUCCCACACCCAAGGCUUGCA 710 GTGTGGGAG 1647 TGTGGGAG 2584 GTGGGAG 3521
hsa-miR532-5p
CAUGCCUUGAGUGUAGGACCGU 711 TCAAGGCAT 1648 CAAGGCAT 2585 AAGGCAT 3522
hsa-miR539
GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU 712 TAATTTCTC 1649 AATTTCTC 2586 ATTTCTC 3523
hsa-miR541
UGGUGGGCACAGAAUCUGGACU 713 GTGCCCACC 1650 TGCCCACC 2587 GCCCACC 3524
hsa-miR541*
AAAGGAUUCUGCUGUCGGUCCCACU 714 AGAATCCTT 1651 GAATCCTT 2588 AATCCTT 3525
hsa-miR542-3p
UGUGACAGAUUGAUAACUGAAA 715 ATCTGTCAC 1652 TCTGTCAC 2589 CTGTCAC 3526
hsa-miR542-5p
UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA 716 TGATCCCCG 1653 GATCCCCG 2590 ATCCCCG 3527
hsa-miR543
AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU 717 GCGAATGTT 1654 CGAATGTT 2591 GAATGTT 3528
hsa-miR544
AUUCUGCAUUUUUAGCAAGUUC 718 AATGCAGAA 1655 ATGCAGAA 2592 TGCAGAA 3529
hsa-miR545
UCAGCAAACAUUUAUUGUGUGC 719 TGTTTGCTG 1656 GTTTGCTG 2593 TTTGCTG 3530
hsa-miR545*
UCAGUAAAUGUUUAUUAGAUGA 720 CATTTACTG 1657 ATTTACTG 2594 TTTACTG 3531
hsa-miR548a-3p
CAAAACUGGCAAUUACUUUUGC 721 GCCAGTTTT 1658 CCAGTTTT 2595 CAGTTTT 3532
hsa-miR548a-5p
AAAAGUAAUUGCGAGUUUUACC 722 AATTACTTT 1659 ATTACTTT 2596 TTACTTT 3533
hsa-miR548b-3p
CAAGAACCUCAGUUGCUUUUGU 723 GAGGTTCTT 1660 AGGTTCTT 2597 GGTTCTT 3534
hsa-miR548b-5p
AAAAGUAAUUGUGGUUUUGGCC 724 AATTACTTT 1661 ATTACTTT 2598 TTACTTT 3535
hsa-miR548c-3p
CAAAAAUCUCAAUUACUUUUGC 725 GAGATTTTT 1662 AGATTTTT 2599 GATTTTT 3536
hsa-miR548c-5p
AAAAGUAAUUGCGGUUUUUGCC 726 AATTACTTT 1663 ATTACTTT 2600 TTACTTT 3537
hsa-miR548d-3p
CAAAAACCACAGUUUCUUUUGC 727 GTGGTTTTT 1664 TGGTTTTT 2601 GGTTTTT 3538
hsa-miR548d-5p
AAAAGUAAUUGUGGUUUUUGCC 728 AATTACTTT 1665 ATTACTTT 2602 TTACTTT 3539
hsa-miR548e
AAAAACUGAGACUACUUUUGCA 729 CTCAGTTTT 1666 TCAGTTTT 2603 CAGTTTT 3540
hsa-miR548f
AAAAACUGUAAUUACUUUU 730 TACAGTTTT 1667 ACAGTTTT 2604 CAGTTTT 3541
hsa-miR548g
AAAACUGUAAUUACUUUUGUAC 731 TTACAGTTT 1668 TACAGTTT 2605 ACAGTTT 3542
hsa-miR548h
AAAAGUAAUCGCGGUUUUUGUC 732 GATTACTTT 1669 ATTACTTT 2606 TTACTTT 3543
hsa-miR548i
AAAAGUAAUUGCGGAUUUUGCC 733 AATTACTTT 1670 ATTACTTT 2607 TTACTTT 3544
hsa-miR548j
AAAAGUAAUUGCGGUCUUUGGU 734 AATTACTTT 1671 ATTACTTT 2608 TTACTTT 3545
hsa-miR548k
AAAAGUACUUGCGGAUUUUGCU 735 AAGTACTTT 1672 AGTACTTT 2609 GTACTTT 3546
hsa-miR5481
AAAAGUAUUUGCGGGUUUUGUC 736 AAATACTTT 1673 AATACTTT 2610 ATACTTT 3547
hsa-miR548m
CAAAGGUAUUUGUGGUUUUUG 737 AATACCTTT 1674 ATACCTTT 2611 TACCTTT 3548
hsa-miR548n
CAAAAGUAAUUGUGGAUUUUGU 738 ATTACTTTT 1675 TTACTTTT 2612 TACTTTT 3549
hsa-miR548o
CCAAAACUGCAGUUACUUUUGC 739 GCAGTTTTG 1676 CAGTTTTG 2613 AGTTTTG 3550
hsa-miR548p
UAGCAAAAACUGCAGUUACUUU 740 GTTTTTGCT 1677 TTTTTGCT 2614 TTTTGCT 3551
hsa-miR549
UGACAACUAUGGAUGAGCUCU 741 ATAGTTGTC 1678 TAGTTGTC 2615 AGTTGTC 3552
hsa-miR550
AGUGCCUGAGGGAGUAAGAGCCC 742 CTCAGGCAC 1679 TCAGGCAC 2616 CAGGCAC 3553
hsa-miR550*
UGUCUUACUCCCUCAGGCACAU 743 GAGTAAGAC 1680 AGTAAGAC 2617 GTAAGAC 3554
hsa-miR551a
GCGACCCACUCUUGGUUUCCA 744 AGTGGGTCG 1681 GTGGGTCG 2618 TGGGTCG 3555
hsa-miR551b
GCGACCCAUACUUGGUUUCAG 745 TATGGGTCG 1682 ATGGGTCG 2619 TGGGTCG 3556
hsa-miR551b*
GAAAUCAAGCGUGGGUGAGACC 746 GCTTGATTT 1683 CTTGATTT 2620 TTGATTT 3557
hsa-miR552
AACAGGUGACUGGUUAGACAA 747 GTCACCTGT 1684 TCACCTGT 2621 CACCTGT 3558
hsa-miR553
AAAACGGUGAGAUUUUGUUUU 748 TCACCGTTT 1685 CACCGTTT 2622 ACCGTTT 3559
hsa-miR554
GCUAGUCCUGACUCAGCCAGU 749 CAGGACTAG 1686 AGGACTAG 2623 GGACTAG 3560
hsa-miR555
AGGGUAAGCUGAACCUCUGAU 750 AGCTTACCC 1687 GCTTACCC 2624 CTTACCC 3561
hsa-miR556-3p
AUAUUACCAUUAGCUCAUCUUU 751 ATGGTAATA 1688 TGGTAATA 2625 GGTAATA 3562
hsa-miR556-5p
GAUGAGCUCAUUGUAAUAUGAG 752 TGAGCTCAT 1689 GAGCTCAT 2626 AGCTCAT 3563
hsa-miR557
GUUUGCACGGGUGGGCCUUGUCU 753 CCGTGCAAA 1690 CGTGCAAA 2627 GTGCAAA 3564
hsa-miR558
UGAGCUGCUGUACCAAAAU 754 CAGCAGCTC 1691 AGCAGCTC 2628 GCAGCTC 3565
hsa-miR559
UAAAGUAAAUAUGCACCAAAA 755 ATTTACTTT 1692 TTTACTTT 2629 TTACTTT 3566
hsa-miR561
CAAAGUUUAAGAUCCUUGAAGU 756 TTAAACTTT 1693 TAAACTTT 2630 AAACTTT 3567
hsa-miR562
AAAGUAGCUGUACCAUUUGC 757 CAGCTACTT 1694 AGCTACTT 2631 GCTACTT 3568
hsa-miR563
AGGUUGACAUACGUUUCCC 758 ATGTCAACC 1695 TGTCAACC 2632 GTCAACC 3569
hsa-miR564
AGGCACGGUGUCAGCAGGC 759 CACCGTGCC 1696 ACCGTGCC 2633 CCGTGCC 3570
hsa-miR566
GGGCGCCUGUGAUCCCAAC 760 ACAGGCGCC 1697 CAGGCGCC 2634 AGGCGCC 3571
hsa-miR567
AGUAUGUUCUUCCAGGACAGAAC 761 AGAACATAC 1698 GAACATAC 2635 AACATAC 3572
hsa-miR568
AUGUAUAAAUGUAUACACAC 762 ATTTATACA 1699 TTTATACA 2636 TTATACA 3573
hsa-miR569
AGUUAAUGAAUCCUGGAAAGU 763 TTCATTAAC 1700 TCATTAAC 2637 CATTAAC 3574
hsa-miR570
CGAAAACAGCAAUUACCUUUGC 769 GCTGTTTTC 1701 CTGTTTTC 2638 TGTTTTC 3575
hsa-miR571
UGAGUUGGCCAUCUGAGUGAG 765 GGCCAACTC 1702 GCCAACTC 2639 CCAACTC 3576
hsa-miR572
GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA 766 CCGAGCGGA 1703 CGAGCGGA 2640 GAGCGGA 3577
hsa-miR573
CUGAAGUGAUGUGUAACUGAUCAG 767 ATCACTTCA 1704 TCACTTCA 2641 CACTTCA 3578
hsa-miR574-3p
CACGCUCAUGCACACACCCACA 768 CATGAGCGT 1705 ATGAGCGT 2642 TGAGCGT 3579
hsa-miR574-5p
UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU 769 CACACACTC 1706 ACACACTC 2643 CACACTC 3580
hsa-miR575
GAGCCAGUUGGACAGGAGC 770 CAACTGGCT 1707 AACTGGCT 2644 ACTGGCT 3581
hsa-miR576-3p
AAGAUGUGGAAAAAUUGGAAUC 771 TCCACATCT 1708 CCACATCT 2645 CACATCT 3582
hsa-miR576-5p
AUUCUAAUUUCUCCACGUCUUU 772 AAATTAGAA 1709 AATTAGAA 2646 ATTAGAA 3583
hsa-miR577
UAGAUAAAAUAUUGGUACCUG 773 ATTTTATCT 1710 TTTTATCT 2647 TTTATCT 3584
hsa-miR578
CUUCUUGUGCUCUAGGAUUGU 774 GCACAAGAA 1711 CACAAGAA 2648 ACAAGAA 3585
hsa-miR579
UUCAUUUGGUAUAAACCGCGAUU 775 ACCAAATGA 1712 CCAAATGA 2649 CAAATGA 3586
hsa-miR580
UUGAGAAUGAUGAAUCAUUAGG 776 TCATTCTCA 1713 CATTCTCA 2650 ATTCTCA 3587
hsa-miR581
UCUUGUGUUCUCUAGAUCAGU 777 GAACACAAG 1714 AACACAAG 2651 ACACAAG 3588
hsa-miR582-3p
UAACUGGUUGAACAACUGAACC 778 CAACCAGTT 1715 AACCAGTT 2652 ACCAGTT 3589
hsa-miR582-5p
UUACAGUUGUUCAACCAGUUACU 779 ACAACTGTA 1716 CAACTGTA 2653 AACTGTA 3590
hsa-miR583
CAAAGAGGAAGGUCCCAUUAC 780 TTCCTCTTT 1717 TCCTCTTT 2654 CCTCTTT 3591
hsa-miR584
UUAUGGUUUGCCUGGGACUGAG 781 CAAACCATA 1718 AAACCATA 2655 AACCATA 3592
hsa-miR585
UGGGCGUAUCUGUAUGCUA 782 GATACGCCC 1719 ATACGCCC 2656 TACGCCC 3593
hsa-miR586
UAUGCAUUGUAUUUUUAGGUCC 783 ACAATGCAT 1720 CAATGCAT 2657 AATGCAT 3594
hsa-miR587
UUUCCAUAGGUGAUGAGUCAC 784 CCTATGGAA 1721 CTATGGAA 2658 TATGGAA 3595
hsa-miR588
UUGGCCACAAUGGGUUAGAAC 785 TTGTGGCCA 1722 TGTGGCCA 2659 GTGGCCA 3596
hsa-miR589
UGAGAACCACGUCUGCUCUGAG 786 GTGGTTCTC 1723 TGGTTCTC 2660 GGTTCTC 3597
hsa-miR589*
UCAGAACAAAUGCCGGUUCCCAGA 787 TTTGTTCTG 1724 TTGTTCTG 2661 TGTTCTG 3598
hsa-miR590-3p
UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU 788 CATAAAATT 1725 ATAAAATT 2662 TAAAATT 3599
hsa-miR590-5p
GAGCUUAUUCAUAAAAGUGCAG 789 GAATAAGCT 1726 AATAAGCT 2663 ATAAGCT 3600
hsa-miR591
AGACCAUGGGUUCUCAUUGU 790 CCCATGGTC 1727 CCATGGTC 2664 CATGGTC 3601
hsa-miR592
UUGUGUCAAUAUGCGAUGAUGU 791 ATTGACACA 1728 TTGACACA 2665 TGACACA 3602
hsa-miR593
UGUCUCUGCUGGGGUUUCU 792 AGCAGAGAC 1729 GCAGAGAC 2666 CAGAGAC 3603
hsa-miR593*
AGGCACCAGCCAGGCAUUGCUCAGC 793 GCTGGTGCC 1730 CTGGTGCC 2667 TGGTGCC 3604
hsa-miR595
GAAGUGUGCCGUGGUGUGUCU 794 GGCACACTT 1731 GCACACTT 2668 CACACTT 3605
hsa-miR596
AAGCCUGCCCGGCUCCUCGGG 795 GGGCAGGCT 1732 GGCAGGCT 2669 GCAGGCT 3606
hsa-miR597
UGUGUCACUCGAUGACCACUGU 796 GAGTGACAC 1733 AGTGACAC 2670 GTGACAC 3607
hsa-miR598
UACGUCAUCGUUGUCAUCGUCA 797 CGATGACGT 1734 GATGACGT 2671 ATGACGT 3608
hsa-miR599
GUUGUGUCAGUUUAUCAAAC 798 CTGACACAA 1735 TGACACAA 2672 GACACAA 3609
hsa-miR600
ACUUACAGACAAGAGCCUUGCUC 799 GTCTGTAAG 1736 TCTGTAAG 2673 CTGTAAG 3610
hsa-miR601
UGGUCUAGGAUUGUUGGAGGAG 800 TCCTAGACC 1737 CCTAGACC 2674 CTAGACC 3611
hsa-miR602
GACACGGGCGACAGCUGCGGCCC 801 CGCCCGTGT 1738 GCCCGTGT 2675 CCCGTGT 3612
hsa-miR603
CACACACUGCAAUUACUUUUGC 802 GCAGTGTGT 1739 CAGTGTGT 2676 AGTGTGT 3613
hsa-miR604
AGGCUGCGGAAUUCAGGAC 803 TCCGCAGCC 1740 CCGCAGCC 2677 CGCAGCC 3614
hsa-miR605
UAAAUCCCAUGGUGCCUUCUCCU 804 ATGGGATTT 1741 TGGGATTT 2678 GGGATTT 3615
hsa-miR606
AAACUACUGAAAAUCAAAGAU 805 TCAGTAGTT 1742 CAGTAGTT 2679 AGTAGTT 3616
hsa-miR607
GUUCAAAUCCAGAUCUAUAAC 806 GGATTTGAA 1743 GATTTGAA 2680 ATTTGAA 3617
hsa-miR608
AGGGGUGGUGUUGGGACAGCUCCGU 807 CACCACCCC 1744 ACCACCCC 2681 CCACCCC 3618
hsa-miR609
AGGGUGUUUCUCUCAUCUCU 808 GAAACACCC 1745 AAACACCC 2682 AACACCC 3619
hsa-miR610
UGAGCUAAAUGUGUGCUGGGA 809 ATTTAGCTC 1746 TTTAGCTC 2683 TTAGCTC 3620
hsa-miR611
GCGAGGACCCCUCGGGGUCUGAC 810 GGGTCCTCG 1747 GGTCCTCG 2684 GTCCTCG 3621
hsa-miR612
GCUGGGCAGGGCUUCUGAGCUCCUU 811 CCTGCCCAG 1748 CTGCCCAG 2685 TGCCCAG 3622
hsa-miR613
AGGAAUGUUCCUUCUUUGCC 812 GAACATTCC 1749 AACATTCC 2686 ACATTCC 3623
hsa-miR614
GAACGCCUGUUCUUGCCAGGUGG 813 ACAGGCGTT 1750 CAGGCGTT 2687 AGGCGTT 3624
hsa-miR615-3p
UCCGAGCCUGGGUCUCCCUCUU 814 CAGGCTCGG 1751 AGGCTCGG 2688 GGCTCGG 3625
hsa-miR615-5p
GGGGGUCCCCGGUGCUCGGAUC 815 GGGGACCCC 1752 GGGACCCC 2689 GGACCCC 3626
hsa-miR616
AGUCAUUGGAGGGUUUGAGCAG 816 TCCAATGAC 1753 CCAATGAC 2690 CAATGAC 3627
hsa-miR616*
ACUCAAAACCCUUCAGUGACUU 817 GGTTTTGAG 1754 GTTTTGAG 2691 TTTTGAG 3628
hsa-miR617
AGACUUCCCAUUUGAAGGUGGC 818 TGGGAAGTC 1755 GGGAAGTC 2692 GGAAGTC 3629
hsa-miR618
AAACUCUACUUGUCCUUCUGAGU 819 AGTAGAGTT 1756 GTAGAGTT 2693 TAGAGTT 3630
hsa-miR619
GACCUGGACAUGUUUGUGCCCAGU 820 TGTCCAGGT 1757 GTCCAGGT 2694 TCCAGGT 3631
hsa-miR620
AUGGAGAUAGAUAUAGAAAU 821 CTATCTCCA 1758 TATCTCCA 2695 ATCTCCA 3632
hsa-miR621
GGCUAGCAACAGCGCUUACCU 822 GTTGCTAGC 1759 TTGCTAGC 2696 TGCTAGC 3633
hsa-miR622
ACAGUCUGCUGAGGUUGGAGC 823 AGCAGACTG 1760 GCAGACTG 2697 CAGACTG 3634
hsa-miR623
AUCCCUUGCAGGGGCUGUUGGGU 824 TGCAAGGGA 1761 GCAAGGGA 2698 CAAGGGA 3635
hsa-miR624
CACAAGGUAUUGGUAUUACCU 825 ATACCTTGT 1762 TACCTTGT 2699 ACCTTGT 3636
hsa-miR624*
UAGUACCAGUACCUUGUGUUCA 826 ACTGGTACT 1763 CTGGTACT 2700 TGGTACT 3637
hsa-miR625
AGGGGGAAAGUUCUAUAGUCC 827 CTTTCCCCC 1764 TTTCCCCC 2701 TTCCCCC 3638
hsa-miR625*
GACUAUAGAACUUUCCCCCUCA 828 TTCTATAGT 1765 TCTATAGT 2702 CTATAGT 3639
hsa-miR626
AGCUGUCUGAAAAUGUCUU 829 TCAGACAGC 1766 CAGACAGC 2703 AGACAGC 3640
hsa-miR627
GUGAGUCUCUAAGAAAAGAGGA 830 AGAGACTCA 1767 GAGACTCA 2704 AGACTCA 3641
hsa-miR628-3p
UCUAGUAAGAGUGGCAGUCGA 831 TCTTACTAG 1768 CTTACTAG 2705 TTACTAG 3642
hsa-miR628-Sp
AUGCUGACAUAUUUACUAGAGG 832 ATGTCAGCA 1769 TGTCAGCA 2706 GTCAGCA 3643
hsa-miR629
UGGGUUUACGUUGGGAGAACU 833 CGTAAACCC 1770 GTAAACCC 2707 TAAACCC 3644
hsa-miR629*
GUUCUCCCAACGUAAGCCCAGC 834 TTGGGAGAA 1771 TGGGAGAA 2708 GGGAGAA 3645
hsa-miR630
AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU 835 ACAGAATAC 1772 CAGAATAC 2709 AGAATAC 3646
hsa-miR631
AGACCUGGCCCAGACCUCAGC 836 GGCCAGGTC 1773 GCCAGGTC 2710 CCAGGTC 3647
hsa-miR632
GUGUCUGCUUCCUGUGGGA 837 AAGCAGACA 1774 AGCAGACA 2711 GCAGACA 3648
hsa-miR633
CUAAUAGUAUCUACCACAAUAAA 838 ATACTATTA 1775 TACTATTA 2712 ACTATTA 3649
hsa-miR634
AACCAGCACCCCAACUUUGGAC 839 GGTGCTGGT 1776 GTGCTGGT 2713 TGCTGGT 3650
hsa-miR635
ACUUGGGCACUGAAACAAUGUCC 840 GTGCCCAAG 1777 TGCCCAAG 2714 GCCCAAG 3651
hsa-miR636
UGUGCUUGCUCGUCCCGCCCGCA 841 AGCAAGCAC 1778 GCAAGCAC 2715 CAAGCAC 3652
hsa-miR637
ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU 842 AGCCCCCAG 1779 GCCCCCAG 2716 CCCCCAG 3653
hsa-miR638
AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU 843 CGCGATCCC 1780 GCGATCCC 2717 CGATCCC 3654
hsa-miR639
AUCGCUGCGGUUGCGAGCGCUGU 844 CCGCAGCGA 1781 CGCAGCGA 2718 GCAGCGA 3655
hsa-miR640
AUGAUCCAGGAACCUGCCUCU 845 CCTGGATCA 1782 CTGGATCA 2719 TGGATCA 3656
hsa-miR641
AAAGACAUAGGAUAGAGUCACCUC 846 CTATGTCTT 1783 TATGTCTT 2720 ATGTCTT 3657
hsa-miR642
GUCCCUCUCCAAAUGUGUCUUG 847 GGAGAGGGA 1784 GAGAGGGA 2721 AGAGGGA 3658
hsa-miR643
ACUUGUAUGCUAGCUCAGGUAG 848 GCATACAAG 1785 CATACAAG 2722 ATACAAG 3659
hsa-miR644
AGUGUGGCUUUCUUAGAGC 849 AAGCCACAC 1786 AGCCACAC 2723 GCCACAC 3660
hsa-miR645
UCUAGGCUGGUACUGCUGA 850 CCAGCCTAG 1787 CAGCCTAG 2724 AGCCTAG 3661
hsa-miR646
AAGCAGCUGCCUCUGAGGC 851 GCAGCTGCT 1788 CAGCTGCT 2725 AGCTGCT 3662
hsa-miR697
GUGGCUGCACUCACUUCCUUC 852 GTGCAGCCA 1789 TGCAGCCA 2726 GCAGCCA 3663
hsa-miR648
AAGUGUGCAGGGCACUGGU 853 CTGCACACT 1790 TGCACACT 2727 GCACACT 3664
hsa-miR649
AAACCUGUGUUGUUCAAGAGUC 854 ACACAGGTT , 1791 CACAGGTT 2728 ACAGGTT 3665
hsa-miR650
AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC 855 GCTGCCTCC 1792 CTGCCTCC 2729 TGCCTCC 3666
hsa-miR651
UUUAGGAUAAGCUUGACUUUUG 856 TTATCCTAA , 1793 TATCCTAA 2730 ATCCTAA 3667
hsa-miR652
AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG 857 TGGCGCCAT , 1794 GGCGCCAT 2731 GCGCCAT 3668
hsa-miR653
GUGUUGAAACAAUCUCUACUG 858 GTTTCAACA , 1795 TTTCAACA 2732 TTCAACA 3669
hsa-miR654-3p
UAUGUCUGCUGACCAUCACCUU 859 AGCAGACAT 1796 GCAGACAT 2733 CAGACAT 3670
hsa-miR654-5p
UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC 860 CGGCCCACC 1797 GGCCCACC 2734 GCCCACC 3671
hsa-miR655
AUAAUACAUGGUUAACCUCUUU 861 CATGTATTA 1798 ATGTATTA 2735 TGTATTA 3672
hsa-miR656
AAUAUUAUACAGUCAACCUCU 862 GTATAATAT 1799 TATAATAT 2736 ATAATAT 3673
hsa-miR657
GGCAGGUUCUCACCCUCUCUAGG 863 AGAACCTGC 1800 GAACCTGC 2737 AACCTGC 3674
hsa-miR658
GGCGGAGGGAAGUAGGUCCGUUGGU 864 TCCCTCCGC 1801 CCCTCCGC 2738 CCTCCGC 3675
hsa-miR659
CUUGGUUCAGGGAGGGUCCCCA 865 CTGAACCAA 1802 TGAACCAA 2739 GAACCAA 3676
hsa-miR660
UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG 866 GCAATGGGT 1803 CAATGGGT 2740 AATGGGT 3677
hsa-miR661
UGCCUGGGUCUCUGGCCUGCGCGU 867 GACCCAGGC 1804 ACCCAGGC 2741 CCCAGGC 3678
hsa-miR662
UCCCACGUUGUGGCCCAGCAG 868 CAACGTGGG 1805 AACGTGGG 2742 ACGTGGG 3679
hsa-miR663
AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC 869 CGCCCCGCC 1806 GCCCCGCC 2743 CCCCGCC 3680
hsa-miR663b
GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG 870 CCGGGCCAC 1807 CGGGCCAC 2744 GGGCCAC 3681
hsa-miR664
UAUUCAUUUAUCCCCAGCCUACA 871 TAAATGAAT 1808 AAATGAAT 2745 AATGAAT 3682
hsa-miR664*
ACUGGCUAGGGAAAAUGAUUGGAU 872 CCTAGCCAG 1809 CTAGCCAG 2746 TAGCCAG 3683
hsa-miR665
ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU 873 GCCTCCTGG 1810 CCTCCTGG 2747 CTCCTGG 3684
hsa-miR668
UGUCACUCGGCUCGGCCCACUAC 874 CCGAGTGAC 1811 CGAGTGAC 2748 GAGTGAC 3685
hsa-miR671-3p
UCCGGUUCUCAGGGCUCCACC 875 GAGAACCGG 1812 AGAACCGG 2749 GAACCGG 3686
hsa-miR671-5p
AGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAG 876 AGGGCTTCC 1813 GGGCTTCC 2750 GGCTTCC 3687
hsa-miR675
UGGUGCGGAGAGGGCCCACAGUG 877 CTCCGCACC 1814 TCCGCACC 2751 CCGCACC 3688
hsa-miR675b
CUGUAUGCCCUCACCGCUCA 878 GGGCATACA 1815 GGCATACA 2752 GCATACA 3689
hsa-miR-7
UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU 879 TAGTCTTCC 1816 AGTCTTCC 2753 GTCTTCC 3690
hsa-miR-71*
CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA 880 TGATTTGTT 1817 GATTTGTT 2754 ATTTGTT 3691
hsa-miR-72*
CAACAAAUCCCAGUCUACCUAA 881 GGATTTGTT 1818 GATTTGTT 2755 ATTTGTT 3692
hsa-miR708
AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG 882 TAAGCTCCT 1819 AAGCTCCT 2756 AGCTCCT 3693
hsa-miR708*
CAACUAGACUGUGAGCUUCUAG 883 AGTCTAGTT 1820 GTCTAGTT 2757 TCTAGTT 3694
hsa-miR720
UCUCGCUGGGGCCUCCA 884 CCCAGCGAG 1821 CCAGCGAG 2758 CAGCGAG 3695
hsa-miR744
UGCGGGGCUAGGGCUAACAGCA 885 TAGCCCCGC 1822 AGCCCCGC 2759 GCCCCGC 3696
hsa-miR744*
CUGUUGCCACUAACCUCAACCU 886 GTGGCAACA 1823 TGGCAACA 2760 GGCAACA 3697
hsa-miR758
UUUGUGACCUGGUCCACUAACC 887 AGGTCACAA 1824 GGTCACAA 2761 GTCACAA 3698
hsa-miR760
CGGCUCUGGGUCUGUGGGGA 888 CCCAGAGCC 1825 CCAGAGCC 2762 CAGAGCC 3699
hsa-miR765
UGGAGGAGAAGGAAGGUGAUG 889 TTCTCCTCC 1826 TCTCCTCC 2763 CTCCTCC 3700
hsa-miR766
ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC 890 GGGCTGGAG 1827 GGCTGGAG 2764 GCTGGAG 3701
hsa-miR767-3p
UCUGCUCAUACCCCAUGGUUUCU 891 TATGAGCAG 1828 ATGAGCAG 2765 TGAGCAG 3702
hsa-miR767-5p
UGCACCAUGGUUGUCUGAGCAUG 892 CCATGGTGC 1829 CATGGTGC 2766 ATGGTGC 3703
hsa-miR769-3p
CUGGGAUCUCCGGGGUCUUGGUU 893 GAGATCCCA 1830 AGATCCCA 2767 GATCCCA 3704
hsa-miR769-5p
UGAGACCUCUGGGUUCUGAGCU 894 AGAGGTCTC 1831 GAGGTCTC 2768 AGGTCTC 3705
hsa-miR770-5p
UCCAGUACCACGUGUCAGGGCCA 895 TGGTACTGG 1832 GGTACTGG 2769 GTACTGG 3706
hsa-miR802
CAGUAACAAAGAUUCAUCCUUGU 896 TTTGTTACT 1833 TTGTTACT 2770 TGTTACT 3707
hsa-miR873
GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU 897 AAGTTCCTG 1834 AGTTCCTG 2771 GTTCCTG 3708
hsa-miR874
CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA 898 GCCAGGGCA 1835 CCAGGGCA 2772 CAGGGCA 3709
hsa-miR875-3p
CCUGGAAACACUGAGGUUGUG 899 TGTTTCCAG 1836 GTTTCCAG 2773 TTTCCAG 3710
hsa-miR875-5p
UAUACCUCAGUUUUAUCAGGUG 900 CTGAGGTAT 1837 TGAGGTAT 2774 GAGGTAT 3711
hsa-miR876-3p
UGGUGGUUUACAAAGUAAUUCA 901 TAAACCACC 1838 AAACCACC 2775 AACCACC 3712
hsa-miR876-5p
UGGAUUUCUUUGUGAAUCACCA 902 AAGAAATCC 1839 AGAAATCC 2776 GAAATCC 3713
hsa-miR877
GUAGAGGAGAUGGCGCAGGG 903 TCTCCTCTA 1840 CTCCTCTA 2777 TCCTCTA 3714
hsa-miR877*
UCCUCUUCUCCCUCCUCCCAG 904 GAGAAGAGG 1841 AGAAGAGG 2778 GAAGAGG 3715
hsa-miR885-3p
AGGCAGCGGGGUGUAGUGGAUA 905 CCCGCTGCC 1842 CCGCTGCC 2779 CGCTGCC 3716
hsa-miR885-5p
UCCAUUACACUACCCUGCCUCU 906 GTGTAATGG 1843 TGTAATGG 2780 GTAATGG 3717
hsa-miR886-3p
CGCGGGUGCUUACUGACCCUU 907 AGCACCCGC 1844 GCACCCGC 2781 CACCCGC 3718
hsa-miR886-5p
CGGGUCGGAGUUAGCUCAAGCGG 908 CTCCGACCC 1845 TCCGACCC 2782 CCGACCC 3719
hsa-miR887
GUGAACGGGCGCCAUCCCGAGG 909 GCCCGTTCA 1846 CCCGTTCA 2783 CCGTTCA 3720
hsa-miR888
UACUCAAAAAGCUGUCAGUCA 910 TTTTTGAGT 1847 TTTTGAGT 2784 TTTGAGT 3721
hsa-miR888*
GACUGACACCUCUUUGGGUGAA 911 GGTGTCAGT 1848 GTGTCAGT 2785 TGTCAGT 3722
hsa-miR889
UUAAUAUCGGACAACCAUUGU 912 CCGATATTA 1849 CGATATTA 2786 GATATTA 3723
hsa-miR890
UACUUGGAAAGGCAUCAGUUG 913 TTTCCAAGT 1850 TTCCAAGT 2787 TCCAAGT 3724
hsa-miR891a
UGCAACGAACCUGAGCCACUGA 914 GTTCGTTGC 1851 TTCGTTGC 2788 TCGTTGC 3725
hsa-miR891b
UGCAACUUACCUGAGUCAUUGA 915 GTAAGTTGC 1852 TAAGTTGC 2789 AAGTTGC 3726
hsa-miR892a
CACUGUGUCCUUUCUGCGUAG 916 GGACACAGT 1853 GACACAGT 2790 ACACAGT 3727
hsa-miR892b
CACUGGCUCCUUUCUGGGUAGA 917 GGAGCCAGT 1854 GAGCCAGT 2791 AGCCAGT 3728
hsa-miR-9
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 918 TAACCAAAG 1855 AACCAAAG 2792 ACCAAAG 3729
hsa-miR-9*
AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU 919 CTAGCTTTA 1856 TAGCTTTA 2793 AGCTTTA 3730
hsa-miR920
GGGGAGCUGUGGAAGCAGUA 920 ACAGCTCCC 1857 CAGCTCCC 2794 AGCTCCC 3731
hsa-miR921
CUAGUGAGGGACAGAACCAGGAUUC 921 CCCTCACTA 1858 CCTCACTA 2795 CTCACTA 3732
hsa-miR922
GCAGCAGAGAAUAGGACUACGUC 922 TCTCTGCTG 1859 CTCTGCTG 2796 TCTGCTG 3733
hsa-miR923
GUCAGCGGAGGAAAAGAAACU 923 CTCCGCTGA 1860 TCCGCTGA 2797 CCGCTGA 3734
hsa-miR924
AGAGUCUUGUGAUGUCUUGC 924 ACAAGACTC 1861 CAAGACTC 2798 AAGACTC 3735
hsa-miR92a
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 925 AAGTGCAAT 1862 AGTGCAAT 2799 GTGCAAT 3736
hsa-miR92a-1*
AGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCU 926 ATCCCAACC 1863 TCCCAACC 2800 CCCAACC 3737
hsa-miR92a-2*
GGGUGGGGAUUUGUUGCAUUAC 927 ATCCCCACC 1864 TCCCCACC 2801 CCCCACC 3738
hsa-miR92b
UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 928 GAGTGCAAT 1865 AGTGCAAT 2802 GTGCAAT 3739
hsa-miR92b*
AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG 929 TCCCGTCCC 1866 CCCGTCCC 2803 CCGTCCC 3740
hsa-miR93
CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG 930 CAGCACTTT 1867 AGCACTTT 2804 GCACTTT 3741
hsa-miR93*
ACUGCUGAGCUAGCACUUCCCG 931 GCTCAGCAG 1868 CTCAGCAG 2805 TCAGCAG 3742
hsa-miR933
UGUGCGCAGGGAGACCUCUCCC 932 CCTGCGCAC 1869 CTGCGCAC 2806 TGCGCAC 3743
hsa-miR934
UGUCUACUACUGGAGACACUGG 933 GTAGTAGAC 1870 TAGTAGAC 2807 AGTAGAC 3744
hsa-miR935
CCAGUUACCGCUUCCGCUACCGC 934 CGGTAACTG 1871 GGTAACTG 2808 GTAACTG 3745
hsa-miR936
ACAGUAGAGGGAGGAAUCGCAG 935 CCTCTACTG 1872 CTCTACTG 2809 TCTACTG 3746
hsa-miR937
AUCCGCGCUCUGACUCUCUGCC 936 GAGCGCGGA 1873 AGCGCGGA 2810 GCGCGGA 3747
hsa-miR938
UGCCCUUAAAGGUGAACCCAGU 937 TTTAAGGGC 1874 TTAAGGGC 2811 TAAGGGC 3748
hsa-miR939
UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG 938 CAGCTCCCC 1875 AGCTCCCC 2812 GCTCCCC 3749
hsa-miR940
AAGGCAGGGCCCCCGCUCCCC 939 GCCCTGCCT 1876 CCCTGCCT 2813 CCTGCCT 3750
hsa-miR941
CACCCGGCUGUGUGCACAUGUGC 940 CAGCCGGGT 1877 AGCCGGGT 2814 GCCGGGT 3751
hsa-miR942
UCUUCUCUGUUUUGGCCAUGUG 941 ACAGAGAAG 1878 CAGAGAAG 2815 AGAGAAG 3752
hsa-miR943
CUGACUGUUGCCGUCCUCCAG 942 CAACAGTCA 1879 AACAGTCA 2816 ACAGTCA 3753
hsa-miR944
AAAUUAUUGUACAUCGGAUGAG 943 ACAATAATT 1880 CAATAATT 2817 AATAATT 3754
hsa-miR95
UUCAACGGGUAUUUAUUGAGCA 944 ACCCGTTGA 1881 CCCGTTGA 2818 CCGTTGA 3755
hsa-miR96
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU 945 TAGTGCCAA 1882 AGTGCCAA 2819 GTGCCAA 3756
hsa-miR96*
AAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG 946 GCACATGAT 1883 CACATGAT 2820 ACATGAT 3757
hsa-miR98
UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU 947 TACTACCTC 1884 ACTACCTC 2821 CTACCTC 3758
hsa-miR99a
AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 948 TCTACGGGT 1885 CTACGGGT 2822 TACGGGT 3759
hsa-miR99a*
CAAGCUCGCUUCUAUGGGUCUG 949 AGCGAGCTT 1886 GCGAGCTT 2823 CGAGCTT 3760
hsa-miR99b
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 950 TCTACGGGT 1887 CTACGGGT 2824 TACGGGT 3761
hsa-miR99b*
CAAGCUCGUGUCUGUGGGUCCG 951 CACGAGCTT 1888 ACGAGCTT 2825 CGAGCTT 3762
hsv1-miR-H1
UGGAAGGACGGGAAGUGGAAG 952 CGTCCTTCC 1889 GTCCTTCC 2826 TCCTTCC 3763
hsvl-miRH2-3p
CCUGAGCCAGGGACGAGUGCGACU 953 CTGGCTCAG 1890 TGGCTCAG 2827 GGCTCAG 3764
hsvl-miRH2-5p
UCGCACGCGCCCGGCACAGACU 954 GCGCGTGCG 1891 CGCGTGCG 2828 GCGTGCG 3765
hsv1-miR-H3
CUGGGACUGUGCGGUUGGGA 955 ACAGTCCCA 1892 CAGTCCCA 2829 AGTCCCA 3766
hsv1-miRH4-3p
CUUGCCUGUCUAACUCGCUAGU 956 GACAGGCAA 1893 ACAGGCAA 2830 CAGGCAA 3767
hsv1-miRH4-5p
GGUAGAGUUUGACAGGCAAGCA 957 AAACTCTAC 1894 AACTCTAC 2831 ACTCTAC 3768
hsvl-miR-H5
GUCAGAGAUCCAAACCCUCCGG 958 GATCTCTGA 1895 ATCTCTGA 2832 TCTCTGA 3769
hsv1-miR-H6
CACUUCCCGUCCUUCCAUCCC 959 ACGGGAAGT 1896 CGGGAAGT 2833 GGGAAGT 3770
kshv-miRK12-1
AUUACAGGAAACUGGGUGUAAGC 960 TTCCTGTAA 1897 TCCTGTAA 2834 CCTGTAA 3771
kshv-miRK12-10a
UAGUGUUGUCCCCCCGAGUGGC 961 GACAACACT 1898 ACAACACT 2835 CAACACT 3772
kshv-miRK12-10b
UGGUGUUGUCCCCCCGAGUGGC 962 GACAACACC 1899 ACAACACC 2836 CAACACC 3773
kshv-miRK12-11
UUAAUGCUUAGCCUGUGUCCGA 963 TAAGCATTA 1900 AAGCATTA 2837 AGCATTA 3774
kshv-miRK12-12
ACCAGGCCACCAUUCCUCUCCG 964 GTGGCCTGG 1901 TGGCCTGG 2838 GGCCTGG 3775
kshv-miRK12-2
AACUGUAGUCCGGGUCGAUCUG 965 GACTACAGT 1902 ACTACAGT 2839 CTACAGT 3776
kshv-miRK12-3
UCACAUUCUGAGGACGGCAGCGA 966 CAGAATGTG 1903 AGAATGTG 2840 GAATGTG 3777
kshv-miRK12-3*
UCGCGGUCACAGAAUGUGACA 967 GTGACCGCG 1904 TGACCGCG 2841 GACCGCG 3778
kshv-miRK12-9-3p '
UAGAAUACUGAGGCCUAGCUGA 968 CAGTATTCT 1905 AGTATTCT 2842 GTATTCT 3779
kshv-miRK12-4-5p
AGCUAAACCGCAGUACUCUAGG 969 CGGTTTAGC 1906 GGTTTAGC 2843 GTTTAGC 3780
kshv-miRK12-5
UAGGAUGCCUGGAACUUGCCGG 970 AGGCATCCT 1907 GGCATCCT 2844 GCATCCT 3781
kshv-miRK12-6-3p
UGAUGGUUUUCGGGCUGUUGAG 971 AAAACCATC 1908 AAACCATC 2845 AACCATC 3782
kshv-miRK12-6-5p
CCAGCAGCACCUAAUCCAUCGG 972 GTGCTGCTG 1909 TGCTGCTG 2846 GCTGCTG 3783
kshv-miRK12-7
UGAUCCCAUGUUGCUGGCGCU 973 CATGGGATC 1910 ATGGGATC 2847 TGGGATC 3784
kshv-miRK12-8
UAGGCGCGACUGAGAGAGCACG 974 GTCGCGCCT 1911 TCGCGCCT 2848 CGCGCCT 3785
kshv-miRK12-9
CUGGGUAUACGCAGCUGCGUAA 975 GTATACCCA 1912 TATACCCA 2849 ATACCCA 3786
kshv-miRK12-9*
ACCCAGCUGCGUAAACCCCGCU 976 GCAGCTGGG 1913 CAGCTGGG 2850 AGCTGGG 3787
Listado de secuencias
<110> Santaris Pharma A/S
<120> Micromirs
<130> 1051WO
<150> US 60/977497
<151> 2007-10-04
<150> US 60/979217
<151> 2007-10-11
<150> US 61/028062
<151> 2008-02-12
<150> EP08104780.5
<151> 2008-07-17
<160> 976
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Seedmero. opcionalmente fosforotioato de LNA completo
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Enlaces fosforotioato, LNA en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14 y 15, de lo conrario Nt de ADN.
<400> 1 tcagtctgat aagct 15
<210> 2
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 2 gataagct 8
<210> 3
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Phosphorothioate linkages, LNAs at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14 & 15 otherwise ADNnts.
<400> 3 tcacaattag catta 15
<210> 4
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 4 tagcatta 8
<210> 5
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Phosphorothioate linkages, LNAs at positions 1, 3, 6, 7, 8, 10, 12, 14 & 15 otherwise ADNnts.
<400> 5 ccattgtcac actcc 15
<210> 6
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 6 cacactcc 8
<210> 7
<211> 6
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 7 taagct 6
<210> 8
<211> 7
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 8 ataagct 7
<210> 9
<211> 9
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 9 tgataagct 9
<210> 10
<211> 10
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 10 ctgataagct 10
<210> 11
<211> 12
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 11 gtctgataag ct 12
<210> 12
<211> 14
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 12 cagtctgata agct 14
<210> 13
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 13 tctgataa 8
<210> 14
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 14 atcagtct 8
<210> 15
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 15 tcaacatc 8
<210> 16
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 16 ggtaaact 8
<210> 17
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 17 cgtaatga 8
<210> 18
<211> 16
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> LNA gapmer 3LNA- 9ADN-3LNA-1ADN, 5' FAM label, phosphorothioate linkages.
<400> 18 tcagtctgat aagcta 16
<210> 19
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Full LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 19 agcacttt 8
<210> 20
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Full LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 20 atttgcac 8
<210> 21
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 21
agcagacaat gtagc 15
<210> 22 <211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 22 gtagccagat gtagc 15
<210> 23
<211> 7
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> Full LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 23 atgtagc 7
<210> 24
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 24 acaacctact acctc 15
<210> 25
<211> 8
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> Full LNA & Phosphorothioate linkages
<400> 25 actacctc 8
<210> 26
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 26 cactgtcagc acttt 15
<210> 27
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 27 tgcatagatt tgcac 15
<210> 28
<211> 7
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(7)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato
<400> 28 gtagact 7
<210> 29
<211> 6
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato
<400> 29 tacctc 6
<210> 30
<211> 7
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato
<400> 30 ctacctc 7
<210> 31
<211> 9
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato, N = Base universal
<400> 31 tnctacctc 9
<210> 32
<211> 9
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato, N = Base universal
<400> 32 tnctacctc 9
<210> 33
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 33 gcaacctact acctc 15
<210> 34
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 34 acaacctcct acctc 15
<210> 35
<211> 15
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<400> 35 acaaactact acctc 15
<210> 36
<211> 7
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 36 ctacctc 7
<210> 37
<211> 7
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 37 ctaactc 7
<210> 38
<211> 9
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 38 ttagcatta 9
<210> 39
<211> 9
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 39 ttagcatta 9
<210> 40
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 40 uagcaccgcu auccacuaug uc 22
<210> 41
<211> 24
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 41 ucuuagugga agugacgugc ugug 24
<210> 42
<211> 23
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 42 uacauaacca uggaguuggc ugu 23
<210> 43
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 43 gccaccucuu ugguucugua ca 22
<210> 44
<211> 21
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 44 21 acgcacacca ggcugacugc c 21
<210> 45
<211> 24
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 45 ucagacaguu uggugcgcua guug 24
<210> 46
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 46 uccuguggug uuuggugugg uu 22
<210> 47
<211> 23
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 47 uguaacuugc cagggacggc uga 23
<210> 48
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 48 aaccggcucg uggcucguac ag 22
<210> 49
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 49 uaaaugcugc aguaguaggg au 22
<210> 50
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 50 uacccuacgc ugccgauuua ca 22
<210> 51
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 51 gucagugguu uuguuuccuu ga 22
<210> 52
<211> 24
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 52 uuagauagag ugggugugug cucu 24
<210> 53
<211> 23
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 53 uguaugccug guguccccuu agu 23
<210> 54
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 54 uaagaggacg caggcauaca ag 22
<210> 55
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 55 uaucggaagu uugggcuucg uc 22
<210> 56
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 56 ucaaguucgc acuuccuaua ca 22
<210> 57
<211> 21
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
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<211> 23
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 58 acauuccccg caaacaugac aug 23
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<211> 24
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 59 aaggagcgau uuggagaaaa uaaa 24
<210> 60
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 60 22 uauuuucugc auucgcccuu gc 22
<210> 61
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 61 caugaaggca cagccuguua cc 22
<210> 62
<211> 21
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 62 uagcaggcau gucuucauuc c 21
<210> 63
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 63 cgcaccacua gucaccaggu gu 22
<210> 64
<211> 21
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 64 accuaguguu aguguugugc u 21
<210> 65
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 65 gaccugaugc ugcuggugug cu 22
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<211> 24
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
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<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
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<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
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<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
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<211> 22
<212> ARN ,
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 70 ccuggaccuu gacuaugaaa ca 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
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<211> 23
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 72 gucacaaucu auggggucgu aga 23
<210> 73
<211> 23
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 73 uaacacuuca ugggucccgu agu 23
<210> 74
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 74 uacuggaccc ugaauuggaa ac 22
<210> 75
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 75 uaaccugauc agccccggag uu 22
<210> 76
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 76 uaucuuuugc ggcagaaauu ga 22
<210> 77
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 77 aaauucuguu gcagcagaua gc 22
<210> 78
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus de Epstein Barr
<400> 78 uaacgggaag uguguaagca ca 22
<210> 79
<211> 22
<212> ARN
<213> Human cytomegalovirus
<400> 79 aagugacggu gagauccagg cu 22
<210> 80
<211> 21
<212> ARN
<213> Human cytomegalovirus
<400> 80 ucguccuccc cuucuucacc g 21
<210> 81
<211> 20
<212> ARN
<213> Human cytomegalovirus
<400> 81 uaacuagccu ucccgugaga 20
<210> 82
<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
<400> 82 ucaccagaau gcuaguuugu ag 22
<210> 83
<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
<400> 83 ucguugaaga caccuggaaa ga 22
<210> 84
<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
<400> 84 uuuccaggug uuuucaacgu gc 22
<210> 85
<211> 20
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<210> 86
<211> 21
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<210> 87
<211> 21
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<210> 89
<211> 23
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<210> 90
<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
<400> 90 agcggucugu ucagguggau ga 22
<210> 91
<211> 20
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
<400> 92 gauugugccc ggaccguggg cg 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<211> 21
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
<400> 94 ugacaagccu gacgagagcg u 21
<210> 95
<211> 22
<212> ARN
<213> Citomegalovirus humano
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 100 ugagguagua gguuguaugg uu 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 102
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 102 agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 103
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 103 cuauacgacc ugcugccuuu cu 22
<210> 104
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 106 ugagguagua gauuguauag uu 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 107 cuauacaauc uauugccuuc cc 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 108 cuauacaguc uacugucuuu cc 22
<210> 109
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 110
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 111
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 111 ugagguagua guuugugcug uu 22
<210> 112
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 112 cugcgcaagc uacugccuug cu 22
<210> 113
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 113 22 uggaauguaa agaaguaugu au 22
<210> 114
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 115
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 116 21 uacaguacug ugauaacuga a 21
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 118
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 118 23 agcagcauug uacagggcua uga 23
<210> 119
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 119 23 ucauagcccu guacaaugcu gcu 23
<210> 120
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 120 ucaaaugcuc agacuccugu ggu 23
<210> 121
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 121 acggauguuu gagcaugugc ua 22
<210> 122
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 122 aaaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 123
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 123 cugcaaugua agcacuucuu ac 22
<210> 124
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 124 uaaagugcug acagugcaga u 21
<210> 125
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 125 ccgcacugug gguacuugcu gc 22
<210> 126
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 126 agcagcauug uacagggcua uca 23
<210> 127
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 127 uacccuguag auccgaauuu gug 23
<210> 128
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 128 caaauucgua ucuaggggaa ua 22
<210> 129
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 129 uacccuguag aaccgaauuu gug 23
<210> 130
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 130 acagauucga uucuagggga au 22
<210> 131
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 132
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 132 aagcauucuu ucauugguug g 21
<210> 133
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 133 uuuccggcuc gcgugggugu gu 22
<210> 134
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 27
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 137
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 137 ccugcagcga cuugauggcu ucc 23
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 139
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 140
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 140 cuccugagcc auucugagcc uc 22
<210> 141
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 141 agccugauua aacacaugcu cuga 24
<210> 142
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 143
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 144
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 145
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 145 ucugcagggu uugcuuugag 20
<210> 146
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 146 uguucaugua gauguuuaag c 21
<210> 147
<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 149
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 149 ucacuguuca gacaggcgga 20
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 150 uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 151
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 151 aacgccauua ucacacuaaa ua 22
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 152 ccccaccucc ucucuccuca g 21
<210> 153
<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 153 gugaggacuc gggaggugg 19
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 154 ugagccccug ugccgccccc ag 22
<210> 155
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 155 guggguacgg cccagugggg gg 22
<210> 156
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 156 ucaccagccc uguguucccu ag 22
<210> 157
<211> 26
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 157 gugagggcau gcaggccugg augggg 26
<210> 158
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 158 cgugccaccc uuuuccccag 20
<210> 159
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 159 ucacaccugc cucgcccccc 20
<210> 160
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 160 gugggcgggg gcaggugugu g 21
<210> 161
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 162 gugucugggc ggacagcugc 20
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<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 164
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 165
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 165 ccucuucccc uugucucucc ag 22
<210> 166
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 168
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 177
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 178
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 184
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 186
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 187
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 188
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 189
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 190 ucccugagac ccuaacuugu ga 22
<210> 191
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 192
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 193
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 198
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 201
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 207
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 209
<211> 26
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 210
<211> 25
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 210 gggcgacaaa gcaagacucu uucuu 25
<210> 211
<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 212
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 212 ucccuguucg ggcgcca 17
<210> 213
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 213 gugggggaga ggcuguc 17
<210> 214
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 214 uaaagagccc uguggagaca 20
<210> 215
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 215 22 uacguagaua uauauguauu uu 22
<210> 216
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 216 uaguacugug cauaucaucu au 22
<210> 217
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 217 17 ucauauugcu ucuuucu 17
<210> 218
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 218 21 ucacagugaa ccggucucuu u 21
<210> 219
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 219 17 ucccaccgcu gccaccc 17
<210> 220
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 220 17 ucgccuccuc cucuccc 17
<210> 221
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 221 20 ucguuugccu uuuucugcuu 20
<210> 222
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 222 ucuacaaagg aaagcgcuuu cu 22
<210> 223
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 223 ucuauacaga cccuggcuuu uc 22
<210> 224
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 224 ucugggcaac aaagugagac cu 22
<210> 225
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 225 ugcaggacca agaugagccc u 21
<210> 226
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 226 ugcuggauca gugguucgag uc 22
<210> 227
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 227 uggacugccc ugaucuggag a 21
<210> 228
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 228 uggaguccag gaaucugcau uuu 23
<210> 229
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 229 aagcccuuac cccaaaaagu au 22
<210> 230
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 230 aagcccuuac cccaaaaagc au 22
<210> 231
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 231 cuuuuugcgg ucugggcuug c 21
<210> 232
<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 232 uggauuuuug gaucaggga 19
<210> 233
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 233 uggcccugac ugaagaccag cagu 24
<210> 234
<211> 25
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 234 ugggaacggg uuccggcaga cgcug 25
<210> 235
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 235 uggguggucu ggagauuugu gc 22
<210> 236
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 236 ugugagguug gcauuguugu cu 22
<210> 237
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 237 uuaggccgca gaucugggug a 21
<210> 238
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 238 uuagggcccu ggcuccaucu cc 22
<210> 239
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 240
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 240 uucauucggc uguccagaug ua 22
<210> 241
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 241 uucuggaauu cugugugagg ga 22
<210> 242
<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 242 uugagaagga ggcugcug 18
<210> 243
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 243 uugcagcugc cugggaguga cuuc 24
<210> 244
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 244 uugggacaua cuuaugcuaa a 21
<210> 245
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 245 uuuagagacg gggucuugcu cu 22
<210> 246
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 246 uuugaggcua cagugagaug ug 22
<210> 247
<211>
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 247 uuuucaacuc uaaugggaga ga 22
<210> 248
<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 248 acguuggcuc ugguggug 18
<210> 249
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 249 acucggcgug gcgucggucg ug 22
<210> 250
<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 250 gcaugggugg uucagugg 18
<210> 251
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 251 cagugcaaug uuaaaagggc au 22
<210> 252
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 252 uucacauugu gcuacugucu gc 22
<210> 253
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 253 cagugcaaug augaaagggc au 22
<210> 254
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 254 acucuuuccc uguugcacua c 21
<210> 255
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 255 uaacagucua cagccauggu cg 22
<210> 256
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 256 accguggcuu ucgauuguua cu 22
<210> 257
<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 257 18 cagggaggug aaugugau
<210> 258
<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 259
<211>
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 259 ucaaaacuga ggggcauuuu cu 22
<210> 260
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 260 ccagacagaa uucuaugcac uuuc 24
<210> 261
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 261 uuuggucccc uucaaccagc ug 22
<210> 262
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 262 uuuggucccc uucaaccagc ua 22
<210> 263
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 263 ugugacuggu ugaccagagg gg 22
<210> 264
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 264 uauggcuuuu uauuccuaug uga 23
<210> 265
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 265 uauagggauu ggagccgugg cg 22
<210> 266
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 266 uauggcuuuu cauuccuaug uga 23
<210> 267
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 267 auguagggcu aaaagccaug gg 22
<210> 268
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 268 acuccauuug uuuugaugau gga 23
<210> 269
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 269 caucaucguc ucaaaugagu cu 22
<210> 270
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 270 uuauugcuua agaauacgcg uag 23
<210> 271
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 271 agcugguguu gugaaucagg ccg 23
<210> 272
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 272 gcuacuucac aacaccaggg cc 22
<210> 273
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 273 gcuauuucac gacaccaggg uu 22
<210> 274
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 275
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 275 ucuacagugc acgugucucc ag 22
<210> 276
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 276 uaccacaggg uagaaccacg g 21
<210> 277
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 278
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 279
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 280
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 281
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 282
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 282 ugagaugaag cacuguagcu c 21
<210> 283
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 283 ggugcagugc ugcaucucug gu 22
<210> 284
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 284 uacaguauag augauguacu 20
<210> 285
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 286
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 286 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23
<210> 287
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 21
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 418 uaaucucagc uggcaacugu ga 22
<210> 419
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 419 22 aaaucucugc aggcaaaugu ga 22
<210> 420
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 420 uacugcauca ggaacugauu gga 23
<210> 421
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 421 uugugcuuga ucuaaccaug u 21
<210> 422
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 422 augguuccgu caagcaccau gg 22
<210> 423
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 423 caugguucug ucaagcaccg cg 22
<210> 424
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 424 agaguugagu cuggacgucc cg 22
<210> 425
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 425 agaauugugg cuggacaucu gu 22
<210> 426
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 426 ugauugucca aacgcaauuc u 21
<210> 427
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 427 aagcugccag uugaagaacu gu 22
<210> 428
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 428 aguucuucag uggcaagcuu ua 22
<210> 429
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 429 ccacaccgua ucugacacuu u 21
<210> 430
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 430 ccaccaccgu gucugacacu u 21
<210> 431
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 431 acacagggcu guugugaaga cu 22
<210> 432
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 432 agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 433
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 433 accuggcaua caauguagau uu 22
<210> 434
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 434 agcuacaucu ggcuacuggg u 21
<210> 435
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 435 cucaguagcc aguguagauc cu 22
<210> 436
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 436 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22
<210> 437
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 437 cguguauuug acaagcugag uu 22
<210> 438
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 438 caagucacua gugguuccgu u 21
<210> 439
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 439 aucacauugc cagggauuuc c 21
<210> 440
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 440 gggguuccug gggaugggau uu 22
<210> 441
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 441 aucacauugc cagggauuac c 21
<210> 442
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 442 22 uggguuccug gcaugcugau uu 22
<210> 443
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 443 uggcucaguu cagcaggaac ag 22
<210> 444
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 444 ugccuacuga gcugauauca gu 22
<210> 445
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 445 ugccuacuga gcugaaacac ag 22
<210> 446
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 446 cauugcacuu gucucggucu ga 22
<210> 447
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 447 aggcggagac uugggcaauu g 21
<210> 448
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 448 uucaaguaau ccaggauagg cu 22
<210> 449
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 449 ccuauucuug guuacuugca cg 22
<210> 450
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 450 ccuauucuug auuacuuguu uc 22
<210> 451
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 451 uucaaguaau ucaggauagg u 21
<210> 452
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 452 ccuguucucc auuacuuggc uc 22
<210> 453
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 453 uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 454
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 454 agggcuuagc ugcuugugag ca 22
<210> 455
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 455 uucacagugg cuaaguucug c 21
<210> 456
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 456 agagcuuagc ugauugguga ac 22
<210> 457
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 457 cacuagauug ugagcuccug ga 22
<210> 458
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 458 aaggagcuca cagucuauug ag 22
<210> 459
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 459 gaggguuggg uggaggcucu cc 22
<210> 460
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 460 agggcccccc cucaauccug u 21
<210> 461
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 461 auguaugugu gcaugugcau g 21
<210> 462
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 462 agcagaagca gggagguucu ccca 24
<210> 463
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 463 uaugugggau gguaaaccgc uu 22
<210> 464
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 464 ugguuuaccg ucccacauac au 22
<210> 465
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 465 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 466
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 466 acugauuucu uuugguguuc ag 22
<210> 467
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 467 23 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 468
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 468 gcugguuuca uauggugguu uaga 24
<210> 469
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 469 cugguuucac augguggcuu ag 22
<210> 470
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 470 uagcaccauu ugaaaucggu ua 22
<210> 471
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 471 ugaccgauuu cuccuggugu uc 22
<210> 472
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 472 uauacaaggg cagacucucu cu 22
<210> 473
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 473 cagugcaaua guauugucaa agc 23
<210> 474
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 474 cagugcaaug auauugucaa agc 23
<210> 475
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 475 uaagugcuuc cauguuuugg uga 23
<210> 476
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 476 acuuaaacgu ggauguacuu gcu 23
<210> 477
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 477 uaagugcuuc cauguuuuag uag 23
<210> 478
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 478 acuuuaacau ggaagugcuu uc 22
<210> 479
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 479 uaagugcuuc cauguuucag ugg 23
<210> 480
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 480 uuuaacaugg ggguaccugc ug 22
<210> 481
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 481 uaagugcuuc cauguuugag ugu 23
<210> 482
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 482 acuuuaacau ggaggcacuu gc 22
<210> 483
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 483 uaagugcuuc caugcuu 17
<210> 484
<211> 17
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 484 uaauugcuuc cauguuu 17
<210> 485
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 485 uguaaacauc cucgacugga ag 22
<210> 486
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 486 cuuucagucg gauguuugca gc 22
<210> 487
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 487 uguaaacauc cuacacucag cu 22
<210> 488
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 488 22 cugggaggug gauguuuacu uc 22
<210> 489
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 489 uguaaacauc cuacacucuc agc 23
<210> 490
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 490 cugggagagg guuguuuacu cc 22
<210> 491
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 491 cugggagaag gcuguuuacu cu 22
<210> 492
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 492 uguaaacauc cccgacugga ag 22
<210> 493
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 493 cuuucaguca gauguuugcu gc 22
<210> 494
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 494 uguaaacauc cuugacugga ag 22
<210> 495
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 495 cuuucagucg gauguuuaca gc 22
<210> 496
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 496 aggcaagaug cuggcauagc u 21
<210> 497
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 497 ugcuaugcca acauauugcc au 22
<210> 498
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 498 uauugcacau uacuaaguug ca 22
<210> 499
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 499 caauuuagug ugugugauau uu 22
<210> 500
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 500 aaaagcuggg uugagagggc ga 22
<210> 501
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 501 aaaagcuggg uugagagggc aa 22
<210> 502
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 502 aaaagcuggg uugagagggu 20
<210> 503
<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 503 aaaagcuggg uugagagga 19
<210> 504
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 504 cacauuacac ggucgaccuc u 21
<210> 505
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 505 aggugguccg uggcgcguuc gc 22
<210> 506
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 506 acugccccag gugcugcugg 20
<210> 507
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 507 cgcauccccu agggcauugg ugu 23
<210> 508
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 508 ccuaguaggu guccaguaag ugu 23
<210> 509
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 509 ccucugggcc cuuccuccag 20
<210> 510
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 510 cuggcccucu cugcccuucc gu 22
<210> 511
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 511 aacacaccug guuaaccucu uu 22
<210> 512
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 512 gcaaagcaca cggccugcag aga 23
<210> 513
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 513 22 ucucugggcc ugugucuuag gc 22
<210> 514
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 514 gccccugggc cuauccuaga a 21
<210> 515
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 515 cuagguaugg ucccagggau cc 22
<210> 516
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 516 ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23
<210> 517
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 517 22 uuuuucauua uugcuccuga cc 22
<210> 518
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 518 cuccuauaug augccuuucu uc 22
<210> 519
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 519 gaacggcuuc auacaggagu u 21
<210> 520
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 520 uccagcauca gugauuuugu ug 22
<210> 521
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 521 aacaauaucc uggugcugag ug 22
<210> 522
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 522 ugagcgccuc gacgacagag ccg 23
<210> 523
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 523 ucccuguccu ccaggagcuc acg 23
<210> 524
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 524 gugcauugua guugcauugc a 21
<210> 525
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 525 caauguuucc acagugcauc ac 22
<210> 526
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 526 gugcauugcu guugcauugc 20
<210> 527
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 527 cagugccucg gcagugcagc cc 22
<210> 528
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 528 uuauaaagca augagacuga uu 22
<210> 529
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 529 uccgucucag uuacuuuaua gc 22
<210> 530
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 530 ucucacacag aaaucgcacc cgu 23
<210> 531
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 531 aggggugcua ucugugauug a 21
<210> 532
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 532 gcugacuccu aguccagggc uc 22
<210> 533
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 533 ugucugcccg caugccugcc ucu 23
<210> 534
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 534 uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 535
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 535 caaucagcaa guauacugcc cu 22
<210> 536
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 536 caaucacuaa cuccacugcc au 22
<210> 537
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 537 uaggcagugu cauuagcuga uug 23
<210> 538
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 538 aaucacuaac cacacggcca gg 22
<210> 539
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 539 aggcagugua guuagcugau ugc 23
<210> 540
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 540 ucccccaggu gugauucuga uuu 23
<210> 541
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 541 uuaucagaau cuccaggggu ac 22
<210> 542
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 542 aacacaccua uucaaggauu ca 22
<210> 543
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 543 aauccuugga accuaggugu gagu 24
<210> 544
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 544 aauugcacgg uauccaucug ua 22
<210> 545
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 545 cggguggauc acgaugcaau uu 22
<210> 546
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 546 uaaugccccu aaaaauccuu au 22
<210> 547
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 547 aauugcacuu uagcaauggu ga 22
<210> 548
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 548 acuguugcua auaugcaacu cu 22
<210> 549
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 549 aauaauacau gguugaucuu u 21
<210> 550
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 550 agaucgaccg uguuauauuc gc 22
<210> 551
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 551 gccugcuggg guggaaccug gu 22
<210> 552
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 552 aagugccgcc aucuuuugag ugu 23
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<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 555 gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23
<210> 556
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 556 acucaaaaug ggggcgcuuu cc 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 560 cuuagcaggu uguauuauca uu 22
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<211> 22
<212> ARN
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<211> 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
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<211> 21
<212> ARN
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 575
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 577
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 578
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 581
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 581 uaguagaccg uauagcguac g 21
<210> 582
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 582 uauguaacac gguccacuaa cc 22
<210> 583
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 610
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 611
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 611 uaugugccuu uggacuacau cg 22
<210> 612
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 613
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 614 ucaggcucag uccccucccg au 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 616
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 619 aaucauacag ggacauccag uu 22
<210> 620
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 620 aaucguacag ggucauccac uu 22
<210> 621
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 621 uugaaaggcu auuucuuggu c 21
<210> 622
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 622 cccagauaau ggcacucuca a 21
<210> 623
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 623 gugacaucac auauacggca gc 22
<210> 624
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 624 caaccuggag gacuccaugc ug 22
<210> 625
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 627
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 630
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 631
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 633
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 634
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 635
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 636
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 638
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 639
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 640
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 641
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 641 aaugcacccg ggcaaggauu cu 22
<210> 642
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 643
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 647
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 648
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 651
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 652
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 653
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 653 uacugcagac guggcaauca ug 22
<210> 654
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 655
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 655 uacugcagac aguggcaauc a 21
<210> 656
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 657
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 658
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 659
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 660
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 662
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 663
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 663 uucucaagga ggugucguuu au 22
<210> 664
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 665
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 666
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 18
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<210> 671
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 25
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 812 aggaauguuc cuucuuugcc 20
<210> 813
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 813 gaacgccugu ucuugccagg ugg 23
<210> 814
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 814 uccgagccug ggucucccuc uu 22
<210> 815
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 816
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 818
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 822
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 841
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 25
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 19
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<211> 21
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
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<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<210> 941
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 941 ucuucucugu uuuggccaug ug 22
<210> 942
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 942 cugacuguug ccguccucca g 21
<210> 943
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 943 aaauuauugu acaucggaug ag 22
<210> 944
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 944 uucaacgggu auuuauugag ca 22
<210> 945
<211> 23
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 945 uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 946
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
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<210> 947
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 947 ugagguagua aguuguauug uu 22
<210> 948
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 948 aacccguaga uccgaucuug ug 22
<210> 949
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 949 caagcucgcu ucuauggguc ug 22
<210> 950
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 950 cacccguaga accgaccuug cg 22
<210> 951
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 951 caagcucgug ucuguggguc cg 22
<210> 952
<211> 21
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 952 uggaaggacg ggaaguggaa g 21
<210> 953
<211> 24
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 953 ccugagccag ggacgagugc gacu 24
<210> 954
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 954 ucgcacgcgc ccggcacaga cu 22
<210> 955
<211> 20
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 955 cugggacugu gcgguuggga 20
<210> 956
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 956 cuugccuguc uaacucgcua gu 22
<210> 957
<211> 22
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 957 gguagaguuu gacaggcaag ca 22
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<211> 22
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 958 gucagagauc caaacccucc gg 22
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<211> 21
<212> ARN
<213> Virus del herpes simple 1
<400> 959 cacuucccgu ccuuccaucc c 21
<210> 960
<211> 23
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 960 auuacaggaa acugggugua agc 23
<210> 961
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 961 uaguguuguc cccccgagug gc 22
<210> 962
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 962 ugguguuguc cccccgagug gc 22
<210> 963
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 963 uuaaugcuua gccugugucc ga 22
<210> 964
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 964 accaggccac cauuccucuc cg 22
<210> 965
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 965 aacuguaguc cgggucgauc ug 22
<210> 966
<211> 23
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 966 ucacauucug aggacggcag cga 23
<210> 967
<211> 21
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 967 ucgcggucac agaaugugac a 21
<210> 968
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 968 uagaauacug aggccuagcu ga 22
<210> 969
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 969 agcuaaaccg caguacucua gg 22
<210> 970
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 970 uaggaugccu ggaacuugcc gg 22
<210> 971
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 971 ugaugguuuu cgggcuguug ag 22
<210> 972
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 972 ccagcagcac cuaauccauc gg 22
<210> 973
<211> 21
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 973 ugaucccaug uugcuggcgc u 21
<210> 974
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 974 uaggcgcgac ugagagagca cg 22
<210> 975
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 975 cuggguauac gcagcugcgu aa 22
<210> 976
<211> 22
<212> ARN
<213> Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi
<400> 976 acccagcugc guaaaccccg cu 22
<210> 977
<211> 14
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 977 cacgattagc atta 14
<210> 978
<211> 6
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 978 gcatta 6
<210> 979
<211> 7
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 979 agcatta 7
<210> 980
<211> 10
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Oligómero de LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> LNA completo y enlaces fosforotioato,
<400> 980 attagcatta 10

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un oligómero de una longitud de 7-10 bases nucleotídicas, que comprende una secuencia de bases nucleotídicas contigua de 7-10 bases nucleotídicas, en el que al menos el 70 % de las unidades de bases nucleotídicas del oligómero son unidades de bases nucleotídicas de ácido nucleico bloqueado (LNA) y en el que el oligómero comprende al menos un enlace fosforotioato y en el que el oligómero es para uso en la reducción de la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula u organismo.
  2. 2.
    El oligómero de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos el 75 % de los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de bases nucleotídicas de la secuencia de bases nucleotídicas contigua son enlaces internucleosídicos fosforotioato.
  3. 3.
    El oligómero de acuerdo con la reivindicación 1, en el que todos los enlaces internucleosídicos presentes entre las unidades de bases nucleotídicas de la secuencia de bases nucleotídicas contigua son enlaces internucleosídicos fosforotioato.
  4. 4.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende una unidad de LNA en el
    extremo 3’ y una unidad de LNA en el extremo 5’.
  5. 5.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que todas las unidades de bases nucleotídicas de la secuencia de bases nucleotídicas contigua son unidades de bases nucleotídicas de LNA.
  6. 6.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la secuencia de bases nucleotídicas contigua comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia semilla de una secuencia de microARN de mamífero, humano o viral.
  7. 7.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el oligómero consiste en una secuencia de bases nucleotídicas contigua de 7 bases nucleotídicas de LNA, en el que todos los enlaces internucleosídicos son fosforotioato.
  8. 8.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el oligómero consiste en una secuencia de bases nucleotídicas contigua de 8 bases nucleotídicas de LNA, en el que todos los enlaces internucleosídicos son fosforotioato.
  9. 9.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el oligómero consiste en una secuencia de bases nucleotídicas contigua de 9 bases nucleotídicas de LNA, en el que todos los enlaces internucleosídicos son fosforotioato.
  10. 10.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el oligómero consiste en una secuencia de bases nucleotídicas contigua de 10 bases nucleotídicas de LNA, en el que todos los enlaces internucleosídicos son fosforotioato.
  11. 11.
    El oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso como medicamento.
  12. 12.
    Un procedimiento in vitro para reducir la cantidad eficaz de un microARN diana en una célula, que comprende administrar una composición que comprende el oligómero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 110 para reducir la cantidad eficaz del microARN en la célula.
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