CN102399852A - 用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒 - Google Patents

用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学和医学领域。本发明提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱，该miRNA谱包括SEQIDNO1-10中一个或多个miRNA。同时提供了相应的、高效、低廉的试剂盒和检测芯片以及检测方法。本发明检测血浆、血清中miRNA水平，适合应用于临床判断干扰素治疗的有效性。与其他已知与疗效相关因素相比，此表达谱是一个独立的预测因素。此表达谱与HBV耐药突变分析结合将有助于个体化治疗方案的开展，最终降低治疗费用并提高完全应答的比例。

Description

用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒
技术领域
　　本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及血浆miRNA表达水平预测干扰素治疗慢性乙肝疗效。本发明还涉及检测miRNA水平的方法和试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒（HBV）感染能引起慢性肝脏疾病并显著增加罹患肝细胞癌的风险。虽然已广泛使用乙肝表面抗原重组抗原疫苗预防感染，HBV感染仍然是世界各国的重要健康问题。干扰素α与核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等是HBV感染的主要治疗药物。干扰素治疗通常只能在有限的病人中获得完全应答，中止治疗后容易复发。近年来应用聚乙二醇化干扰素(又称长效干扰素，主要有PEG-IFNα2a, PEG-IFNα2b两种)显著提高了e抗原血清转换(PEG-IFNα2a 32% ， PEG-IFNα2b 36%) 和一小部分病人表面抗原血清转换(2.9%， PEG-IFNα2a)。然而，长效干扰素容易引发如流感样症状、抑郁、性格改变等副作用。核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等，是乙肝逆转录聚合酶的有效抑制剂，能阻断病毒基因组复制。但是，这类药物治疗不能获得较高的血清转换率，且有很大一部分病人在停止用药后复发。另外，长期使用容易引起耐药突变的形成。
尽管近些年在慢性乙肝的治疗手段、病毒血清转换率和病毒学应答方面都有了显著提高， 慢性乙肝的治疗效果仍不够理想。特别是长效干扰素对于发展中国家的低收入家庭非常昂贵。因此，目前急需能够在治疗前预测干扰素治疗效果的方法，从而为个人化治疗提供解决方案。
目前已知的与治疗预后相关的因素有： 1. 治疗前ALT水平， 2. 治疗前HBV DNA, 3. 性别， 4. 肝脏组织学状态， 5. 治疗过程中HBsAg低度变化动态。 然而，目前的指标的预测能力有限，急需一种能在血液中中检测的，有较高预测准确度的分子标记。
发明内容
本发明要解决的技术问题是确定一种能在血液中中检测的，有较高预测准确度的分子标记。
近年来的研究显示小非编码RNA（约22和核苷酸），又称小RNA（microRNA,miRNA）。小RNA存在于各类组织中，能通过与靶mRNA3’未翻译末端核苷酸配对促进其降解或抑制翻译。miRNA是由长前体RNA进行转录产生，并被Drosha（一种核酸酶）预处理后通过exportin-5介导的出核过程转运到细胞浆。miRNA进一步被DICER酶剪切，最后形成17-24个核苷酸的成熟miRNA，并与RISC复合体结合，执行基因沉默功能。小RNA是一类在血浆中存在的短核苷酸，已有报道证明可以作为肝脏损伤和妊娠的非常敏感的分子标记。
本发明经过大量研究，确定了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱，该miRNA谱包括SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA。
并且，根据该miRNA谱提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的试剂盒，该试剂盒含有针对SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。
同时，提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的芯片，该芯片含有针对SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。最好的，该芯片含有针对SEQ ID NO 1-10的miRNA特异性探针核苷酸。
本发明还提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的方法，即检测SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA在使用干扰素前血浆、血清样品中表达水平，对样品中表达水平与标准水平差异利用统计方法分析预测干扰素疗效。
所述miRNA中至少一种的表达水平高于或者低于已知的标准水平。
具体的，该方法包括步骤：（1） 血浆、血清样本小RNA的抽提， （2）   核酸样本与具有如SEQ ID No.1-10中一个或多个miRNA特异性探针的芯片进行杂交， （3） 对杂交信号与对照样本的杂交结果进行比较。
所述的统计方法是分析样品中表达水平与标准水平差异的显著性。
所述的统计方法包括： miRNA表达谱通过最大关联度最小冗余度分析对每个miRNA评分；利用近邻分类算法作为预测引擎进行类别判断；特征值递增分析法和留一法交叉验证优化入选miRNA的数量。
本发明中，乙肝病人治疗前部分miRNA的表达谱能够预测干扰素α治疗效果，并据此公开了相关miRNA的检测方法、预测模型建立的方法及检测试剂盒。
本发明提供了一个独特的能够区分HBV患者是否对长效干扰素或普通干扰素治疗应答（初期病毒学应答，治疗12周大于2log HBVDNA 降低）的miRNA表达谱。此表达谱由hsa-miR-1268 SEQID NO.1/10， has-miR-150* SEQID NO.2/10, has-miR-22 SEQID NO3/10, has-miR-197 SEQID NO4/10, hsa-miR-26a SEQID NO5/10, has-miR-188-5p SEQID NO6/10, has-miR-1471 SEQID NO7/10, has-miR-484 SEQID NO8/10, has-miR-1181 SEQID NO9/10, has-miR-194 SEQID NO10/10组成。本发明提供了血清miRNA表达谱的检测方法， 具体而言，该方法包括步骤， （1）抽提血浆总RNA， （2） 利用微阵列结束检测总RNA中特定miRNA的表达谱。 可以按照本领域的常规方法操作。
所述的统计方法包括下列各项中的一个或者几个：（1）miRNA表达谱通过最大关联度最小冗余度分析(mRMR)对每个miRNA评分， （2）利用近邻分类算法(NN)作为预测引擎进行类别判断， （3）特征值递增分析法（IFS）和留一法交叉验证优化入选miRNA的数量。
利用本发明的miRNA表达谱分析了66例接受长效干扰素治疗的HBV患者样本，其敏感度为63.33%和特异度69.44%。 此miRNA谱由10个特异的核苷酸序列组成，其表达在无应答和快速应答组中有显著差异。
本发明进一步在28例接受普通干扰素治疗的HBV患者中验证了此预测模型，并取得了60.7%的准确度。 
本发明提供了一种miRNA表达谱,能够以较高准确度预测预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效。与其他已知与疗效相关因素相比，此表达谱是一个独立的预测因素。此表达谱与HBV耐药突变分析结合将有助于个体化治疗方案的开展，最终降低治疗费用并提高完全应答的比例。相应的检测方法方便、快速，成本较低。本发明同时还提供了高效、低廉的相应的检测试剂盒和芯片。
附图说明
图1. 优化能够预测干扰素疗效的miRNA谱流程图。
图2. 十个miRNA表达谱在快速应答与无应答组的热图显示。绿色：小于 平均值-标准差， 黑色： 在平均值-标准差与平均值+标准差之间， 红色： 大于平均值+标准差。十个miRNA依次为：hsa-miR-1268 SEQID NO.1/10， has-miR-150* SEQID NO.2/10, has-miR-22 SEQID NO3/10, has-miR-197 SEQID NO4/10, hsa-miR-26a SEQID NO5/10, has-miR-188-5p SEQID NO6/10, has-miR-1471 SEQID NO7/10, has-miR-484 SEQID NO8/10, has-miR-1181 SEQID NO9/10, has-miR-194 SEQID NO10/10。
图3. 干扰素疗效预测的IFS（递增特征值）曲线图。 X轴， 特征值的数量， Y轴， 去一交互检验准确度。在选取10个特征值时到达准确度达到最高。 
图4. 肝脏-血浆miRNA表达谱的相关性分析。
具体实施方式
实施例1：miRNA表达谱的检测
一.        实验材料：
本发明从94例接受长效干扰素和普通干扰素的慢性乙肝患者中获得血浆和血清样本。本研究通过了伦理委员会的审核，所有病人都签署了知情同意书。训练集包括66例接受EG-IFN α2a (180μg/周) 或 PEG-IFN α2b (100μg/周)的HBV患者，测试集中包括28例接受普通干扰素(IFN-α2b 或IFN-α1b， 3-5MU/qod)的HBV患者。入组病人的基本临床数据表1所示，其中81.9%为e抗原阳性，平均病毒载量为7.05 log10 拷贝/毫升。入组排除标准： 入组的HBV患者在开始治疗前6个月未接受核苷类似物或干扰素治疗， 病毒载量在5×104 拷贝/ml以上， 肝脏谷丙转氨酶不正常 (>1.0 ULN). 排除标准包括HIV或HCV共感染。 所有病人都检测了HBV表面抗原， e抗原 （雅培 AXSYM HBsAg (正常值: 0–2S/N) and HBe 2.0 MEIA Kit (正常值: 0–1.0S/CO)， 病毒载量通过定量PCR检测（匹基生物）。快速应答定义为在治疗开始后12周HBVDNA有大于2log的降低， 小于2log的降低定义为无应答。
二.        实验方法
RNA抽提和miRNA芯片
使用mirVana                                                
Figure 512615DEST_PATH_IMAGE002
PARIS
Figure 202354DEST_PATH_IMAGE002
  (Ambion, Austin, TX)试剂盒，从400μl血浆样本中抽取总RNA。 RNA浓度通过NanoDrop 1000光谱仪定量(NanoDrop Technologies, Waltham, MA)。从福尔马林固定石蜡包埋标本（FFPE）中抽提RNA使用Qiagen RNAeasy FFPE试剂盒。简要操作步骤如下：用手术刀将FFPE标本从载玻片上刮下， 并用二甲苯脱蜡，离心去除二甲苯后，加入100%乙醇去除残留二甲苯。 经全速离心和空气干燥后， FFPE标本通过的蛋白酶K分别在55℃ 消化15分钟， 80℃消化15分钟。经过gDNA离心柱去除基因组DNA后，样本再经过RNeasy柱，洗涤两遍后用无核酸酶水洗脱。
miRNA芯片检测
本发明使用人miRNA芯片(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)比较了94份血浆标本和13份FFPE标本. 此芯片包含Sanger 数据库V12.0 851种人类miRNA。 将样本总RNA通过Cy3标记，并与芯片杂交，经洗涤后芯片通过G2505C((Agilent Technologies, Santa Clara, CA)扫描仪进行扫描。 标记和杂交过程都按照agilent miRNA芯片系统标准操作进行。 芯片图像信息通过扫描软件Rev. 5.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)进行分析，转化为强度信息。 通过背景去除，芯片信号导出到GeneSpring GX10软件(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)进行标准化再进行进一步分析。
定量RT-PCR： 
使用mirVANA miRNA 抽提试剂盒从100-200μl血浆标本中获取小RNA，具体步骤按产品说明书所述。 洗脱的RNA通过Labconco冷冻干燥系统进行浓缩，使用megaplex RT引物库和与扩增引物库（ABI）将RNA进行逆转录和与扩增。获得的cDNA使用Taqman miRNA检测试剂盒对单个miRNA进行定量。
三.        实验结果
对94例接受干扰素治疗的HBV病人进行了miRNA表达谱检测。 
本发明区分不同初始病毒学应答的策略如图1所示。一共66例信息充分的病例入组为训练组，通过将miRNA表达谱经训练后模型在28例的测试病例中进行验证。两组病人的基本临床水平相似（表1）， 两组的初始应答率分别为45.5% 和 35.7% (p 值 0.4948, Fisher’s exact test)。
表1.病人的临床基本数据。
Figure 713232DEST_PATH_IMAGE003
注： a括号中为百分数. b Fisher’s exact test. c非配对t检验. d 只统计了基因型B与C. 
实施例2：统计分析及预测模型的建立
一.        试验方法：
最大关联度最小冗余度分析（mRMR）
最大关联度最小冗余度分析最早由Peng等发展起来。 为了评价和分析特征值，我们用(mRMR)方法评价每个MiRNA对于病人疗效的相关性和对其他miRNA的冗余度。一个有较高相关性较低冗余度的miRNA可以认为是一个好的miRNA特征值。为了度量相关性和冗余度， 使用了交互信息（MI）。最后每个miRNA根据其关联性得到一个Maxrel评分值。
近邻分类算法(NN)
本发明中使用了近邻分类算法（NN）作为预测算法。NN算法是一种简单但非常有效的机器学习方法，被广泛用于各种分类问题。它通过计算待检测数值矢量与训练集中每个矢量的距离作出决策。询问矢量将被与之矢量距离最接近的一类归为一类。
本发明使用了留一交叉检验法来评价预测模型的表现。在此方法中，每个数据依次被去除作为其他数据的测试数据，通过多次检测来训练预测引擎。最后的总预测准确度的计算方法如下：
  
Figure 920878DEST_PATH_IMAGE004
TP为真阳性, TN为真阴性, FP假阳性，FN 假阴性
特征值递增分析法（IFS）
mRMR分析之后得到了每个特征值对于预测相关度的评分。下一步为了选取最优的特征值数量，我们使用了IFS方法。通过使用不同数量的特征值，我们建立了不同的NNA预测模型。 留一法交叉检验进一步对不同的预测模型进行测试评价。通过计算每个模型的总体预测准确度，我们得到了IFS曲线，当IFS曲线达到最高时就获得了最优的特征值数量。
其他分析
相关性分析使用了R软件的lowess和lm函数。我们使用单因素和多因素logistic回归分析来评价已知的疗效相关因素和miRNA预测模型的优势比。miRNA靶基因的预测使用了miRanda, RNAhybrid 和 TargetScan网上预测服务。
二.        结果
寻找干扰素治疗效果相关miRNA谱
本发明首先在66例HBV病人治疗前miRNA表达谱进行预处理，除去在超过50%的样本中都检测不到的miRNA，这样可以富集表达量相对较高的基因进行深入分析。本发明运用了mRMR分析法评价得到与疗效最相关的评分（Maxrel评分，表2）， 评分居前的miRNA进一步通过Fisher test比较快速应答和无应答病人在三个miRNA表达水平的分布情况。（1）小于平均值-标准差，（2）在平均值-标准差与平均值+标准差之间，（3）大于平均值+标准差。 图2显示了这些miRNA的表达模式。
接着，本发明使用近邻分类算法（NN）进行预测，留一法交叉验证进一步验证预测表现。为了确定纳入预测引擎的最优的MiRNA数量，IFS曲线分析评价了不同特征数量的预测准确度（图3）。 最高的预测准确度在10个miRNA纳入计算是达到最高（表2）。miR-1268, miR-150*, miR-22 and miR-197是最显著的疗效相关基因（p<0.01, 表2）。 十个miRNA组成的模型得到总体预测准确率为66.7%。
表2. 所选miRNA的Maxrel得分和fisher 检验结果。
Figure 995144DEST_PATH_IMAGE005
* Fisher 检验的p值是通过比较RR/NR 病人在三个miRNA表达水平（1.小于均值-标准差， 2. 在均值-标准差与均值+标准差之间， 3. 大于均值+标准差）的分布情况计算得到。 
实施例3 对28例接受了普通干扰素治疗样本的预测
本发明进一步测试了这十个miRNA的预测模型是否能在一个28例病人组成的测试集中有效区分初始病毒学应答。 如表1所示，测试集和训练集的基本临床数据是相似的，只是测试集病人接受了普通干扰素治疗。由于不同干扰素制备会引起体内有效药物浓度的差异，这有可能会影响预测的表现。尽管如此，在训练集中我们仍然得到了60.7%的总体预测准确率。
miRNA预测模型与已知疗效相关因素的比较
本发明进一步进行了单因素和多因素Logistic回归分析来评价miRNA模型是否是与疗效相关的独立预测因子。
单因素回归分析显示， miRNA模型的优势比达到3.27（p=0.007）,是一个显著的独立相关因素。此分析也发现ALT是一个显著的因素（优势比1.47， p=0.002），而女性（p=0.127），HBVDNA(<5×107 与 ≥5×107相比, p=0.078)和基因型（B型 与C型相比, p=0.290）都没有获得显著性。进一步多因素回归显示miRNA与ALT都是与疗效独立相关的因素，优势比为2.98 （p=0.022，表3) 
表3. 与病毒学应答相关因素的单变量和多变量Logistic回归分析。
a 此分析在整个队列中进行分析 (n=94).
肝脏与血浆miRNA表达谱具有高度相关性
血浆中存在的miRNA被认为是有各种器官分泌得到的产物。肝脏是人体内负责代谢的重要器官，已有报道证明在急性药物引发的肝损伤中能释放miRNA到外周血。我们检测了13例此研究中入组病例的福尔马林固定甲醛包埋肝活检标本（FFPE）的miRNA谱。我们首先确认了FFPE标本中能检测到133中miRNA在所有样本中都存在，210中miRNA在13例样本中至少有11例有表达。我们进一步分析，血浆miRNA是否在一定程度上反映了肝脏MiRNA的表达情况。确实，我们发现肝脏和血浆中miRNA表达谱在每个个体中有很高的相关性(r=0.22-0.64 p= 0.013-4.7×10-15, pearson correlation， 图4A)，在总体分析中相关系数0.42， p<10-250图4B。 当只考虑十个入选MiRNA时， 仍然具有显著的相关性(r=0.25, p= 0.003)。 以上数据提示，肝脏是血浆中miRNA的主要提供者，血浆miRNA谱可部分提示肝脏中的表达变化。
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<110>  复旦大学
 
 
<120>  用于预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒
 
 
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uguaacagca acuccaugug ga                                              22

Claims (9)

1.一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的miRNA谱，其特征在于，该miRNA谱包括SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA。
2.一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有针对SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。
3.一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的芯片，其特征在于，该芯片含有针对SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。
4.如权利要求3所述的芯片，其特征在于，该芯片含有针对SEQ ID NO 1-10的miRNA特异性探针核苷酸。
5.一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的方法，其特征在于，在使用干扰素前，检测血浆、血清样品中SEQ ID NO 1-10中一个或多个miRNA的表达水平，对样品中上述miRNA表达水平与其标准水平的差异利用统计方法分析，预测干扰素疗效。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述miRNA中至少一种的表达水平高于或者低于已知的标准水平。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法包括步骤：（1） 血浆、血清样本小RNA的抽提， （2）    核酸样本与具有如SEQ ID No.1-10中一个或多个miRNA特异性探针的芯片进行杂交， （3） 对杂交信号与对照样本的杂交结果进行比较。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用统计方法分析样品中表达水平与标准水平差异的显著性。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的统计方法包括： miRNA表达谱通过最大关联度最小冗余度分析对每个miRNA评分；利用近邻分类算法作为预测引擎进行类别判断；特征值递增分析法和留一法交叉验证优化入选miRNA的数量。
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