JP6143041B2 - 大腸がん検査キット - Google Patents
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Description
[1]
被験者の大腸細胞から特異的に分泌される配列番号17で表されるマイクロRNAの少なくとも一部と相補的な配列を有するDNA分子を固定化したDNAアレイ、および
被験者の大腸細胞から特異的に分泌されるマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬
を含む、大腸がん検査キット。
[2]
被験者の大腸細胞から特異的に分泌される配列番号17で表されるマイクロRNAの少なくとも一部と相補的な配列を有するDNA分子、および
被験者の大腸細胞から特異的に分泌されるマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬
を含む、大腸がん検査キット。
本発明は、以下に示す、配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子からなる大腸がんの検査マーカーに関する。
miR-638:AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU (配列番号1)
miR-1915:CCCCAGGGCGACGCGGCGGG (配列番号2)
miR-630:AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU (配列番号3)
miR-1268:CGGGCGUGGUGGUGGGGG (配列番号4)
miR-1207-5p:UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG (配列番号5)
miR-572:GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA (配列番号6)
miR-1246:AAUGGAUUUUUGGAGCAGG (配列番号7)
miR-483-5p:AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG (配列番号8)
miR-1225-5p:GUGGGUACGGCCCAGUGGGGGG (配列番号9)
miR-575:GAGCCAGUUGGACAGGAGC (配列番号10)
miR-1202:GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG (配列番号11)
miR-765:UGGAGGAGAAGGAAGGUGAUG (配列番号12)
miR-320c:AAAAGCUGGGUUGAGAGGGU (配列番号13)
miR-513a-5p:UUCACAGGGAGGUGUCAU (配列番号14)
miR-494:UGAAACAUACACGGGAAACCUC (配列番号15)
miR-939:UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG (配列番号16)
miR-1290:UGGAUUUUUGGAUCAGGGA (配列番号17)
miR-1275:GUGGGGGAGAGGCUGUC (配列番号18)
miR-671-5p:AGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAG (配列番号19)
miR-223:UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA (配列番号20)
miR-25:CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA (配列番号21)
miR-92a: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU (配列番号22)
miR-1183:CACUGUAGGUGAUGGUGAGAGUGGGCA (配列番号23)
miR-1224-5p:GUGAGGACUCGGGAGGUGG (配列番号24)
miR-188-5p:CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGG (配列番号25)
表1に示す24種類のmiRNAは、前述のように上から順番に配列番号1から24を付して配列表に示される。
本発明は、上記本発明の検査マーカーを用いた大腸がんの検査方法を包含する。本発明の大腸がんの検査方法は、配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも1種のマイクロRNA分子を用いる方法である。上記本発明のマイクロRNA分子は検査マーカーとなり得るものであり、マイクロRNA分子を検査マーカーとして実施できる種々の方法を採用できる。例えば、(a)配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも1種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化したDNAアレイを用いる方法、(b)配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも1種のマイクロRNA分子を鋳型として逆転写反応を行ってDNA分子を合成する工程、得られたDNA分子を増幅する工程、増幅したDNA分子を検出する工程を含む方法、(c)配列番号1〜25のいずれかで表わされる少なくとも1種類のマイクロRNA分子の少なくとも1部と相補的な配列を有する合成核酸を搭載した固相化ビーズまたはビーズに類似する担体を用いた高感度検出法等を挙げることができる。
マイクロRNA分子を鋳型とする逆転写反応は、逆転写酵素および酵素の基質となるヌクレオチド、さらにプライマーの存在下に実施できる。逆転写反応は、配列番号1〜25で表される25種類全てのマイクロRNA分子を鋳型として行える条件下に行うこともできるし、25種類マイクロRNA分子の一部(1種または2種以上)を鋳型として行える条件下に行うこともできる。
得られたDNA分子を増幅する工程は、例えば、PCR法を用いて行うことができる。PCR法も、25種類全てのマイクロRNA分子からの逆転写物を鋳型として用いることができる条件下に行うこともできるし、25種類マイクロRNA分子の一部(1種または2種以上)を鋳型として用いることができる条件下に行うこともできる。
増幅したDNA分子の検出は、DNA分子の増幅の際に増幅に用いるヌクレオチドに蛍光標識を導入しておき、この蛍光標識を用いて適宜実施できる。また、特異的な増幅産物を蛍光検出できるプローブ(たとえば、Applied Biosystems社TaqManプローブ)なども応用できる。
本発明は、前記本発明のDNAアレイと、被験者の大腸組織または大腸細胞に由来するマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬を含む、大腸がん検査キットも包含する。マイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬としては、例えば、血液検体中のRNAを回収するためのバッファーや血液中の不要な抗体などを除去するためのプロテインA及びGを固定化したビーズが含まれる。さらにRNA分子を回収するための、有機溶媒や酸性フェノールなどが含まれる。また、RNA分子のサイズにより分離精製するための樹脂を含有したカラムなどを挙げることができる。また、特異的マイクロRNA(25種類のマイクロRNA)を検出するためのPCRプライマーのセット、並びにPCR反応に必要な酵素類、バッファー、蛍光標識ヌクレオチドなども挙げることができる。
実施例1
<大腸がん細胞株から分泌されるmiRNAの同定>
ヒト大腸がんの早期診断マーカーを単離するため、大腸がん細胞から特異的に分泌されるマイクロRNAを同定した。
細胞株
ヒト胎児大腸由来細胞FHC(正常細胞)及び5種類の大腸がん細胞株(HCT 116, HT-29, RKO, SW48, SW480)を用いた。
各細胞株を48時間培養し、その培養液(培養上清)を回収した。培養上清を500xgで5分間遠心し、その上清を回収した。さらに、高速で遠心(16,500 x g)し不溶性画分を取り除いたのち、0.2μmのフィルターでろ過した。そのろ液を120,000xgで超遠心し、エクソソーム画分を単離した。
エクソソーム画分に含まれる総RNAは、Trizol-LS(Invitrogen)を用いて調製した。RNAの品質は、Agilent2100 Bioanalyzerで確認した。
調製した総RNA100ngを鋳型としてCy3標識した。miRNAの検出は、アジレント(Agilent)社のmiRNAマイクロアレイ(microarray)を用いて行った。このアレイはヒト851種類のマイクロRNAを特異的に検出するオリゴプローブ(oligo probe)が搭載されている。シグナル値の数値化及び統計学的解析は、GeneSpringGX10ソフトウェアーを使用した。
健常者(healthy control)14名及び化学療法前の大腸がん患者(colorectal cancer)10名(40−60歳:表2参照)の血液検体(−20℃保存 血漿試料1ml)より、超遠心法を用いてエクソソーム(exosomes)を回収した。回収したエクソソーム(exosomes)全量よりRNAを抽出し、10μlに調整した一部をアジレントオリゴヌクレオチドマイクロアレイ(Agilent oligonucleotide microarray)/ ヒトmiRNA V3マイクロアレイ(human miRNA V3 microarray) (851 miRNA搭載)のサンプルとした。得られたアレイデータ(シグナル強度)を、RNA量(ng)で割り、算出したものを規格化したシグナル強度(normalized signal intensity(AU))とした。
・ 健常者のデータと比較して有意に高いもの(Student’s t-test two-tailed assay p<0.05)
青・・・健常者
赤・・・大腸がん患者
バ−・・・平均値
縦軸・・・規格化したシグナル強度(normalized signal intensity(AU))
横軸・・・miRNAの種類:左から、大腸がん患者の結果(平均値)の高い順で並んでいる。
健常者(healthy control)20名及び化学療法前の大腸がん患者(colorectal cancer)21名(27−78歳:表4参照)の血液検体(−20度保存 血漿試料1ml)より、超遠心法を用いてexosomesを回収した。以下、図2の説明と同様である。条件1は、14人以上で検出されているものとした(表5 参照)。
2. 健常者のデータと比較して有意に高いもの(Student ‘s t-test two-tailed assay p<0.05)
青・・・健常者
赤・・・大腸がん患者
バ−・・・平均値
縦軸・・・規格化したシグナル強度(normalized signal intensity(AU))
横軸・・・miRNAの種類:左から、大腸がん患者の結果(平均値)の高い順で並んでいる
Claims (2)
- 被験者の大腸細胞から特異的に分泌される配列番号17で表されるマイクロRNAの少なくとも一部と相補的な配列を有するDNA分子を固定化したDNAアレイ、および
被験者の大腸細胞から特異的に分泌されるマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬
を含む、大腸がん検査キット。 - 被験者の大腸細胞から特異的に分泌される配列番号17で表されるマイクロRNAの少なくとも一部と相補的な配列を有するDNA分子、および
被験者の大腸細胞から特異的に分泌されるマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬
を含む、大腸がん検査キット。
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