CN102036689B - 神经肌肉突触维持和再生中涉及的微小rna的鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经肌肉突触维持和损伤或疾病后再生过程中涉及的miRNA的鉴定。调控这些miRNA被提议作为脊髓损伤和神经变性性疾病的治疗。

Description

神经肌肉突触维持和再生中涉及的微小RNA的鉴定

对相关申请的交叉引用

本申请要求2008年3月17日提交的美国临时申请No.61/037,260的权益，通过述及将它完整收入本文。

关于政府资助的声明

本发明是在来自(美国)国家卫生研究院(NIH)的拨款No.HL53351-06的资助下做出的。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明一般地涉及发育生物学，神经生物学，病理学和分子生物学领域。更具体地，它关注损伤或疾病中影响神经肌肉突触维持和再生的，骨骼肌组织中改变的miRNA表达。本发明提供通过施用特定miRNA(例如miR-206和miR-1)的激动剂来治疗患有去神经疾病的受试者的方法。

发明背景

肌萎缩侧索硬化(ALS)，熟悉的称作Lou Gehrig氏疾病，是最常见的成人运动神经元疾病，在美国影响大约30,000人(Bruijn等，2004)。约90％的ALS病例是散发性的，而剩余10％是因遗传突变而发生的(Boillee等，2006)。不管获得ALS的方式，疾病的行进表现出相似症状。症状包括经由运动神经元选择性损失和变性发生的目标骨骼肌去神经，这导致四肢和呼吸肌中的肌萎缩和麻痹。虽然ALS是最常见的运动神经元疾病，但是没有治愈性的或有效的治疗方法能预防运动神经元损失或显著改善诊断后的存活。调节ALS启动和行进的信号传导途径和下游分子的鉴定仍然是搜索新治疗剂中的一项重大挑战(Dunckley等，2007)。

已经完善表征了控制神经肌肉突触装配和维持的转录和翻译后调节网络(Sanes和Lichtman，2001)；然而，转录后机制在调节这种过程中的作用尚无记载。在这点上，微小RNA(miRNA或miR)被公认是许多生物学过程的主要转录后调节物(Bartel，2004；Van Rooij等，2007a)。miRNA是以序列特异性方式调节基因表达，长约18个至约25个核苷酸的小型、非蛋白质编码RNA。miRNA起靶物mRNA的阻抑物的作用，这通过促进它们的降解(当它们的序列完美互补时)或通过抑制翻译(当它们的序列含有错配时)来实现。

miRNA由RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；参见Qi等(2006)Cellular & Molecular Immunology Vol.3：411-419)转录，而且源自称作初级miRNA转录物(pri-miRNA)的初始转录物，它们一般长数千碱基，而且衍生自各miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子、或常常编码多种密切相关miRNA的多顺反子转录物。参见综述Carrington等(2003)。pri-miRNA在细胞核中被RNA酶Drosha加工成约70个至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。转运至细胞质后，发夹pre-miRNA被Dicer进一步加工以生成双链miRNA(Lee等，1993)。然后将成熟miRNA链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，在那里它通过碱基对互补性与它的靶mRNA联合。在相对罕见的、miRNA与mRNA靶物完美碱基配对的情况中，它促进mRNA降解。更常见的是，miRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体，从而影响mRNA稳定性或抑制mRNA翻译。脊椎动物中的功能缺失突变证明了miRNA是多种生物学过程的关键调节物，包括心脏肥大、心脏形态发生、和淋巴细胞发育(Van Rooij等，2007b；Zhao等，2007；Xiao等，2007)。然而，miRNA与神经肌肉突触功能和信号传导的关系仍然有待确立。

发明概述

本发明部分基于下述发现，即miR-206调节神经肌肉接头稳定性和因损伤或神经变性性疾病而发生的去神经后的再生。因而，本发明提供一种治疗患有去神经神经病状态的受试者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用miR-206和/或miR-1的激动剂。在另一个实施方案中，所述激动剂是多核苷酸，其包含miR-206和/或miR-1的成熟序列。在另一个实施方案中，所述激动剂是由表达载体编码的。所述去神经神经病状态可以是脊髓损伤、重症肌无力、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希氏共济失调、脊髓性肌萎缩、或脊髓小脑性共济失调。

本发明还包括一种诊断受试者中的去神经神经病状态(例如脊髓损伤或ALS)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)自所述受试者获得骨骼肌组织样品；(b)评估所述样品中miR-206和/或miR-133b的活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与正常组织样品中miR-206和/或miR-133b的活性或表达比较，其中miR-206和/或miR-133b的活性或表达与正常组织样品中miR-206和/或miR-133b的活性或表达相比升高诊断为去神经神经病状态。评估miR-206和/或miR-133b活性可以包括评估一种或多种受miR-206和/或miR-133b调节的基因的活性。在一个实施方案中，所述一种或多种受miR-206调节的基因选自下组：HDAC4、Dach2、或成肌蛋白(myogenin)。

本发明还提供一种鉴定骨骼肌中miR-206和/或miR-1活性的调控物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)使骨骼肌细胞与候选化合物接触；(b)评估miR-206和/或miR-1活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与没有候选化合物的情况中的活性或表达比较，其中测量得到的活性或表达之间有差异指示所述候选化合物是miR-206和/或miR-1的调控物。可以在体外或在体内使细胞与候选化合物接触。miR-206和/或miR-1的调控物可以是miR-206和/或miR-1的激动剂或miR-206和/或miR-1的抑制剂。

本发明还涵盖一种药物组合物，其包含miR-206和/或miR-1的激动剂和药学可接受载体。在一些实施方案中，所述药物组合物可以与针对去神经神经病状态的第二疗法一起施用。

附图简述

下面的附图构成本说明书的一部分，而且用于进一步演示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并与本文所呈现的具体实施方案的详述组合，可以更好地理解本发明。

图1。去神经肌肉中miR-206的上调。(A)显示成年小鼠组织中成熟miR-206的骨骼肌特异性表达的Northern印迹分析。用U6再探查Northern印迹作为加载对照。(B)坐骨神经横断后10天成年小鼠肌肉组织中miR-1和miR-206表达的Northern印迹分析。使用对侧腿作为对照。用U6再探查Northern印迹作为加载对照。EDL＝趾长伸肌，TA＝胫骨前肌，GP＝腓肠肌/跖肌。(C)通过实时PCR检测去神经10天后TA肌肉中miR-206、miR-133b、miR-1、和miR-133a的转录物(+)。使用对侧肌肉作为对照(-)。

图2。miR-206突变型小鼠的生成。(A)miR-206/133b鼠基因座的示意图。(B)通过用侧翼为loxP位点的新霉素盒替换pre-miR-206序列来自miR-206/133b基因座删除miR-206的打靶策略。显示了用于Southern印迹的5’和3’探针的位置。(C)使用外部5’探针的，来自野生型和杂合小鼠的基因组DNA的Southern印迹分析。用BamHI消化基因组DNA。(D)指定miR-206基因型的腓肠肌/跖肌中成熟miR-206转录物表达的Northern印迹分析。使用U6作为加载对照。(E)对照和去神经后miR-206突变型小鼠比目鱼肌中使用针对pre-miR-206、pre-miR-133b、pre-miR-1-1、和pre-miR-1-2的基因特异性引物的RT-PCR。(F)苏木精和曙红(H&E)及异染性ATP酶染色显示野生型(WT)和miR-206-/-(KO)小鼠比目鱼肌中的骨骼肌构造及I型(深蓝色)和II型(浅蓝色)骨骼肌纤维分布没有差异。

图3。miR-206突变型小鼠中延迟的神经支配恢复。(A)坐骨神经横断后(以周计)，在miR-206-/-(KO)小鼠中观察到与野生型(WT)小鼠相比神经支配恢复的延迟，这通过抗ZNP染色(绿色)与BTX(红色)的重叠来检测。注意，miR-206-/-小鼠中缺乏抗ZNP(绿色)染色。(B)坐骨神经横断后WT和miR-206KO小鼠中神经支配恢复的突触位点的数目定量和时程。(C)使用BTX(红色)和抗ZNP(绿色)的免疫组织化学显示了神经压伤后7和18天后miR-206-/-小鼠中与WT小鼠相比NMJ神经支配恢复的延迟。注意，miR-206-/-小鼠中缺乏抗ZNP(绿色)染色。

图4。miR-206靶向HDAC4。(A)来自数种物种、具有两个预测的miR-206结合位点的序列同源性的Hdac4 3’UTR的示意图。(B)用野生型(WT)或突变型HDAC4 3’UTR-萤光素酶构建物及渐增量的miR-206表达质粒共转染的COS1细胞的萤光素酶活性。3’UTR中预测的miR-206结合位点的突变降低miR-206的抑制活性。数值相对于β-半乳糖苷酶活性标准化。(C)显示去神经后3周自野生型(WT)和miR-206-/-(KO)小鼠分离的肌肉溶胞物中升高的HDAC4表达的Western印迹分析。对照(Ctrl.)指HDAC4mKO蛋白质溶胞物。检测GAPDH蛋白质作为对照。在印迹下面显示与WT相比的相对蛋白质表达。(D)去神经3周后在野生型(WT)和miR-206-/-(KO)肌肉中检测Hdac4转录物。(E)去神经3周后在野生型(WT)和miR-206-/-(KO)肌肉中检测Dach2转录物。(F)去神经3周后在野生型(WT)和miR-206-/-(KO)TA肌肉中检测成肌蛋白转录物。(G)使用BTX(红色)和抗ZNP(绿色)的免疫组织化学显示神经压伤后7天HDAC4 mKO突变型小鼠中与WT小鼠相比神经支配恢复增多。注意，HDAC4 mKO小鼠中抗ZNP(绿色)染色增多。

图5。ALS小鼠中miR-206的上调。(A)野生型(WT)和G93A-SOD1(ALS)小鼠中miRNA的miRNA阵列序型分析的热图。(B)7月龄野生型(WT)和G93A-SOD1(ALS)TA肌肉中miR-1和miR-206表达的Northern印迹分析。用U6再探查Northern印迹作为加载对照。(C)在miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠中ALS发病升高。G93A-SOD1小鼠和miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠的代表性图像。(D)在miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠中肌肉变性增多。野生型(WT)、miR-206突变型、G93A-SOD1、和miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠腓肠肌/跖肌的苏木精和曙红(H&E)染色。

发明详述

本发明部分基于下述发现，即miR-206调节神经肌肉接头稳定性和损伤后再生。miR-206在ALS小鼠模型的骨骼肌中及响应神经横断或压伤后的去神经而上调。另外，相关分子miR-133b以与miR-206相似的方式上调，而miR-1和miR-133a在ALS疾病模型中及响应手术去神经而展现降低的表达。通过创建miR-206无效小鼠，发明人确立了miR-206在调节神经肌肉接头稳定性和损伤后再生中的至关重要作用。这些结果描述了miRNA在调节神经肌肉突触功能中的第一项作用，而且指出miR-206和miR-1是ALS及其它去神经疾病和损伤的发病机制中的关键成分。因而，通过操纵miR-206和/或miR-1的表达水平，本发明为治疗神经变性性疾病和神经损伤提供新的治疗办法。

在脊椎动物中，三对肌肉特异性miRNA，即miR-1-1/133a-2、miR-1-2/133a-1、和miR-206/133b，作为分开的染色体上的双顺反子转录物来转录(Liu等，2007)。miR-1显示出经由遏制转录因子Hand2来调节心肌细胞增殖和心脏形态发生(Zhao等，2005；2007)。在成骨骼肌细胞中，miR-1显示出经由遏制组蛋白脱乙酰基酶4(HDAC4)，即肌形成的一种阻抑物，而促进分化；矛盾的是，miR-133显示出经由遏制血清应答因子(SRF)，肌形成的一种激活物(Chen等，2006)，而遏制分化。miR-1-1与miR-133a-2一起自人染色体20共转录，而miR-1-2与miR-133a-1一起自人染色体18共转录。另外，miR-206，即miR-1 miRNA家族的一个进化上分歧的成员，显示出经由遏制各种靶基因而促进成肌细胞分化，所述靶基因包括DNA聚合酶α的一个亚基(Polal)、连接蛋白43(Cx43)、卵泡抑素样1(Fstll)、和utrophin(Utm)(Kim等，2006；Rosenberg等，2006)。miR-206与miR-133b一起自来自人染色体6上一个基因间区域的双顺反子转录物生成。miR-133b显示出在具有帕金森氏病的患者中降低及调节多巴胺能神经元的成熟(Kim等，2007)。miR-1-1和miR-1-2彼此相同，而且与miR-206相差4个核苷酸。miR-133a-1和miR-133a-2彼此相同，而且与miR-133b相差2个核苷酸。下文显示了miR-206、miR-1、miR-133a、和miR-133b的茎-环和成熟序列：

人miR-206茎-环(SEQ ID NO：1)：

UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAUCCCCAUAUGGAUUACU

UUGCUAUGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG

人成熟miR-206(SEQ ID NO：2)：

UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG

人miR-1茎-环(SEQ ID NO：3)：

ACCUACUCAGAGUACAUACUUCUUUAUGUACCCAUAUGAACAUACA

AUGCUAUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUUUUUGGUAGGC

人成熟miR-1(SEQ ID N O：4)：

UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU

人miR-133a茎-环(SEQ ID NO：5)：

ACAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUC

AAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUAUGCAUUGA

人成熟miR-133a(SEQ ID NO：6)：

UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG

人miR-133b茎-环(SEQ ID NO：7)：

CCUCAGAAGAAAGAUGCCCCCUGCUCUGGCUGGUCAAACGGAACCA

AGUCCGUCUUCCUGAGAGGUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUACAGCA

GGGCUGGCAAUGCCCAGUCCUUGGAGA

人成熟miR-133b(SEQ ID NO：8)：

UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有去神经神经病状态的受试者的方法，包括对所述受试者施用miR-206和/或miR-1的激动剂。“激动剂”可以是提高特定miRNA的活性或表达的任何化合物或分子。例如，在某些实施方案中，miR-206和/或miR-1的激动剂可以是包含成熟miR-206和/或miR-1序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4。在另一个实施方案中，miR-206和/或miR-1的激动剂可以是包含miR-206和/或miR-1之pri-miRNA或pre-miRNA序列的多核苷酸。在这样的一个实施方案中，所述多核苷酸可以包含序列SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：3。包含miR-206和/或miR-1之成熟序列、pre-miRNA序列、或pri-miRNA序列的多核苷酸可以是单链的或双链的。所述多核苷酸可以含有一处或多处化学修饰，诸如锁定核酸、肽核酸、糖修饰(诸如2′-O-烃基(alkyl)(例如2′-O-甲基、2′-O-甲氧乙基)、2′-氟、和4′-硫修饰)、和主链修饰(诸如一个或多个硫代硫酸酯、吗啉代、或膦羧酸酯连接，及其组合。在一个实施方案中，所述包含miR-206和/或miR-1序列的多核苷酸偶联有胆固醇。

在另一个实施方案中，miR-206和/或miR-1的激动剂可以是不同于miR-206和/或miR-1，起提高、补充、或代替miR-206和/或miR-1功能的作用的药剂。例如，MyoD和bHLH蛋白E12，二者都上调miR-206的表达，可以作为miR-206的激动剂。其它上调miR-206和/或miR-1表达的转录因子或信号传导蛋白质同样可以作为miR-206和/或miR-1的激动剂。

在另一个实施方案中，可以在体内自载体表达miR-206和/或miR-1的激动剂。“载体”指可用于将感兴趣核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知众多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子的或两亲性的化合物有关的多核苷酸、质粒、和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、等等。表达构建体能在活细胞中复制，或者它能合成制备。为了本申请，术语“表达构建体”、“表达载体”、和“载体”可互换使用，以一般性的、例示性的意义演示本发明的应用，而且并非意图限制本发明。

在一个实施方案中，用于表达miR-206和/或miR-1的表达载体包含与编码miR-206和/或miR-1的多核苷酸“可操作连接”的启动子。如本文中所使用的，短语“可操作连接”或“在转录控制下”意味着启动子相对于多核苷酸处于正确的定位和取向以控制RNA聚合酶进行的转录的和多核苷酸的表达的启动。编码miR-206和/或miR-1的多核苷酸可编码miR-206和/或miR-1的初级miRNA序列(pri-miRNA)、前体miRNA序列(pre-miRNA)、或成熟miRNA序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：1。在另一个实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：2。在另一个实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：3。在另一个实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：4。所述包含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：4的多核苷酸可以是长约18个至约2000个核苷酸、长约70个至约200个核苷酸、长约20个至约50个核苷酸、或长约18个至约25个核苷酸。

在某些实施方案中，编码基因产物的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”指受到细胞的合成机械、或导入的合成机械识别，启动基因的特异性转录所需要的DNA序列。术语启动子在本文中会用于指在RNA聚合酶I、II、或III的启动位点周围聚簇的一组转录控制模块。

在一些实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(启动子)可用于获得感兴趣多核苷酸序列的高水平表达。还涵盖本领域公知的用于实现感兴趣多核苷酸序列表达的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子的使用，只要表达水平对于给定目的是足够的。在某些实施方案中，可以使用组织特异性启动子，诸如骨骼肌特异性启动子，来获得感兴趣多核苷酸序列的组织特异性表达。

通过采用具有公知特性的启动子，可优化转染或转化后感兴趣蛋白质的表达水平和样式。另外，响应特定生理学信号而受到调节的启动子的选择能容许多核苷酸的诱导型表达。表1和表2列举了在本发明的背景中可采用来调节感兴趣多核苷酸(例如miR-206和/或miR-1的激动剂)表达的数种调节元件。此列表并非意图是穷尽提高基因表达所涉及的所有可能的元件，但是仅仅是它们的例示。

下文是可以在表达构建体中与感兴趣多核苷酸组合使用的病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表(表1和表2)。另外，也可以使用任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)来驱动多核苷酸的表达。如果提供适宜的细菌聚合酶(或是作为递送复合物的一部分或是作为另外的基因表达构建体)的话，真核细胞能支持来自某些细菌启动子的胞质转录。

特别感兴趣的是肌肉特异性启动子，包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz等，1994；Kelly等，1995)、α-肌动蛋白启动子(Moss等，1996)、肌钙蛋白1启动子(Bhavsar等，1996)、Na⁺/Ca²⁺交换器启动子(Barnes等，1997)、抗肌萎缩蛋白启动子(Kimura等，1997)、α7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer，1996)、和肌肉肌酸激酶(MCK)启动子(Jaynes等，1988；Horlick等，1989；Johnson等，1989)。

在想要时，可以包括聚腺苷酸化信号来实现基因转录物的正确聚腺苷酸化。认为聚腺苷酸化信号的本质对于本发明的成功实施不是至关重要的，而且可采用任何此类序列，诸如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。作为表达盒元件还涵盖终止子。这些元件能用来增强信息水平和使自该盒进入其它序列的通读最小化。

在本发明的某些实施方案中，含有本发明核酸构建体的细胞可以在体外或在体内通过在表达构建体中包括标志物来鉴定。此类标志物会赋予细胞以可鉴定的变化，容许容易地鉴定含有表达构建体的细胞。通常，包括药物选择标志物有助于克隆和选择转化体，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志。或者，可采用酶，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。还能采用免疫学标志物。认为所采用的选择标志不是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择标志的其它例子是本领域技术人员公知的。

有多种方式可将表达载体导入细胞中。在本发明的某些实施方案中，表达构建体包含病毒或自病毒基因组衍生的工程改造的构建体。某些病毒经受体介导的胞吞进入细胞、整合入宿主细胞基因组和稳定且高效表达病毒基因的能力使得它们成为将外来基因转移入哺乳动物细胞中的诱人候选(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。

用于体内递送的优选方法之一涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意图包括那些含有足以(a)支持构建体的包装和(b)表达其中克隆的多核苷酸的腺病毒序列的构建体。表达载体包含遗传工程形式的腺病毒。关于腺病毒(一种36kB，线性，双链DNA病毒)的遗传组构的知识容许用长达7kB的外来序列替代大段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒形成对比，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以附加体方式复制，没有潜在的遗传毒性。而且，腺病毒在结构上是稳定的，而且广泛扩增后没有检测到基因组重排。腺病毒能感染实际上所有上皮细胞，不管它们的细胞周期阶段。

腺病毒特别适合于用作基因转移载体，因为它有中等大小的基因组、易于操作、滴度高、靶细胞范围广且感染性高。该病毒基因组的两个末端都含有100-200个碱基对的反向重复(ITR)，它们是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。

在腺病毒载体是复制缺陷的或至少条件性缺陷的要求之外，认为腺病毒载体的本质对于本发明的成功实施不是至关重要的。所述腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚群A-F中的任一种。为了获得供本发明中使用的条件性复制缺陷型腺病毒载体，亚群C的5型腺病毒是优选的起始材料。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，关于它知道极多的生化和遗传信息，而且它在历史上用于大多数采用腺病毒作为载体的构建。

依照本发明的典型载体是复制缺陷的，而且不会具有腺病毒E1区。如此，在消除了E1编码序列的位置导入编码感兴趣基因的多核苷酸会是最方便的。然而，腺病毒序列内插入构建体的位置对于本发明不是至关重要的。也可以将编码感兴趣基因的多核苷酸插入E3置换型载体中，代替被删除的E3区，如Karlsson等(1986)所述，或者在E4区中，在这种情况中辅助细胞系或辅助病毒补足E4缺陷。

腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)。最近，动物研究提示重组腺病毒可用于基因疗法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。对不同组织施用重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，1993)和定向(stereotactic)接种入脑中(Le Gal La Salle等，1993)。

逆转录病毒载体也适合于在细胞中表达miR-206和/或miR-1的激动剂。逆转录病毒是以在受感染细胞中通过逆转录过程将它们的RNA转变成双链DNA的能力为特征的一组单链RNA病毒(Coffin，1990)。然后所得DNA稳定整合入细胞染色体中，作为原病毒，并指导病毒蛋白质的合成。所述整合导致病毒基因序列在受体细胞及其后代中的保持。逆转录病毒基因组含有分别编码壳体蛋白、聚合酶、和包膜成分的三种基因，即gag、pol、和env。在gag基因上游找到的一段序列含有将基因组包装入病毒体中的信号。在病毒基因组的5′和3′末端存在两段长末端重复(LTR)序列。这些含有强启动子和增强子序列，而且还是整合入宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入病毒基因组中，代替某些病毒序列，以生成复制缺陷型病毒。为了生成病毒体，构建含有gag、pol、和env基因但没有LTR和包装构件的包装细胞系(Mann等，1983)。当含有cDNA以及逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒被导入此细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列容许重组质粒的RNA转录物被包装入病毒颗粒中，然后分泌入培养物的培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染极其多种细胞类型。然而，整合和稳定表达要求宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。

可采用其它病毒载体作为本发明中的表达构建体。可采用自诸如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒等病毒衍生的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供数项诱人特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。

为了实现基因构建体的表达，必须将表达构建体递送入细胞中。此递送可以在体外(像用于转化细胞系的实验室规程中)或者在体内或回体(像某些疾病状态的治疗中)实现。一种递送机制是经病毒感染，其中将表达构建体包裹在感染性病毒颗粒的壳体中。

本发明还涵盖用于将表达构建体转移入培养的哺乳动物细胞中的数种非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-右旋糖苷(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接显微注射(Harland和Weintraub，1985)、加载了DNA的脂质体(Nicolau and Sene，1982；Fraley等，1979)和Lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理(Fechheimer等，1987)、使用高速微弹进行的基因轰击(Yang等，1990)、和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术中的一些可成功适应体内或回体使用。

一旦已经将表达构建体递送入细胞中，编码感兴趣基因的核酸可以在不同部位定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可以稳定整合入细胞的基因组中。此整合可以经同源重组而处于相关定位和取向(基因替代)，或者它可以以随机的、非特异性的位置整合(基因增强)。在还有一些实施方案中，核酸可以作为分开的、附加型的DNA区段在细胞中稳定维持。此类核酸区段“附加体”编码足以容许不依赖宿主细胞周期地或与宿主细胞周期同步地维持和复制的序列。如何将表达构建体递送至细胞和核酸在细胞中保持在何处取决于所采用的表达构建体的类型。

在本发明的还有一个实施方案中，表达构建体可以仅仅由裸的重组DNA或质粒组成。所述构建体的转移可以通过上文所述物理或化学透化细胞膜的任何方法来实施。这特别适用于体外转移，但是它也可应用于体内使用。Dubensky等(1984)成功地以磷酸钙沉淀物的形式将多瘤病毒DNA注射入成年和新生小鼠的肝和脾中，展现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明了直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒导致所转染基因的表达。也可以在体内以相似方式转移编码感兴趣基因的DNA并表达基因产物。

在本发明的还有一个实施方案中，将裸的DNA表达构建体转移入细胞中可涉及颗粒轰击。此方法依赖于将DNA包被的微弹加速至高速的能力，所述高速容许微弹穿透细胞膜并进入细胞，但不杀死它们(Klein等，1987)。已经开发了数种用于加速小颗粒的装置。一种这样的装置依赖于高压放电来产生电流，该电流继而提供原动力(Yang等，1990)。所使用的微弹由生物学惰性物质组成，诸如钨或金珠。

已经在体内轰击了大鼠和小鼠的选定器官，包括肝、皮肤、和肌肉组织(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。这可能要求手术暴露组织或细胞，以消除枪与靶器官之间的任何居间组织，即回体处理。再次，编码特定基因的DNA可以经此方法递送，而且仍然收入本发明。

在本发明的又一个实施方案中，可以将表达构建体封装在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有多个由水介质隔开的脂质层。它们在将磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质成分在形成闭合的结构之前经历自我重排并在脂质双层间封装水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还涵盖Lipofectamine-DNA复合物。

在本发明的某些实施方案中，可以将脂质体与血细胞凝集病毒(HVJ)复合。这显示出促进与细胞膜的融和和提升脂质体封装的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其它实施方案中，可以将脂质体与细胞核中非组蛋白的染色体蛋白质(HMG-I)复合或联合采用(Kato等，1991)。在还有一些实施方案中，可以将脂质体与HVJ和HMG-I二者复合或联合采用。由于此类表达构建体已经成功用于体外和体内核酸转移和表达，所以它们适用于本发明。在DNA构建体中采用细菌启动子的情况中，还会希望在脂质体内包括适宜的细菌聚合酶。

其它能采用来将编码特定基因的核酸递送入细胞中的表达构建体是受体介导的递送媒介物。这些利用几乎在所有真核细胞中的受体介导的胞吞对高分子的选择性摄取。因为各种受体的细胞类型特异性分布，所以所述递送会是高度特异性的(Wu和Wu，1993)。

受体介导的基因打靶媒介物一般由两种成分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。数种配体已经用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)和运铁蛋白(Wagner等，1990)。最近，一种合成的拟糖蛋白(neoglycoprotein)(其与ASOR识别相同受体)已经用作基因递送媒介物(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，而且表皮生长因子(EGF)也已经用于将基因递送至鳞癌细胞(Myers，EPO 0273085)。

在其它实施方案中，递送媒介物可包含配体和脂质体。例如，Nicolau等(1987)采用掺入脂质体中的乳糖基-神经酰胺(一种末端为半乳糖的脱唾液酸的神经节苷脂)，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加。如此，可行的是也可以通过多种受体-配体系统在有或无脂质体的情况中将编码特定基因的核酸特异性递送入某细胞类型中。

在一个具体的例子中，可以与阳离子脂质组合地施用寡核苷酸。阳离子脂质的例子包括但不限于Lipofectin、DOTMA、DOPE、和DOTAP。WO/0071096(通过述及明确收入本文)的公开文本记载了不同配制剂，诸如能有效用于基因疗法的DOTAP：胆固醇或胆固醇衍生物配制剂。其它公开文本也讨论了不同脂质或脂质体配制剂，包括纳米颗粒和施用方法；这些包括但不限于美国专利公开文本20030203865，20020150626，20030032615，和20040048787，通过述及明确收入本文，其程度为它们公开了施用和递送核酸的配制剂和其它相关方面。用于形成颗粒的方法还记载于美国专利5,844,107，5,877,302，6,008,336，6,077,835，5,972,901，6,200,801，和5,972,900，那些方面通过述及而收入本文。

在某些实施方案中，可以在回体(ex vivo)条件下更容易地实施基因转移。回体基因疗法指自动物分离细胞，在体外将核酸递送入细胞中，然后将经修饰的细胞返还入动物中。这可涉及自动物手术取出组织/器官或细胞和组织的原代培养。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有去神经神经病状态的受试者的方法。“去神经神经病状态”指其中因疾病或损伤而对一种或多种组织的神经分布(never supply)有损失的状况。去神经神经病状态可源自变性性运动神经元疾病，诸如重症肌无力、脊髓灰质炎、肌萎缩侧索硬化(ALS)、弗里德赖希氏共济失调、脊髓性肌萎缩、或脊髓小脑性共济失调。

在一个实施方案中，本发明提供通过对受试者施用miR-206和/或miR-1的激动剂来治疗患有重症肌无力的受试者的方法。重症肌无力(MG)是一种神经肌肉疾病，导致波动的肌肉虚弱和疲劳。它是一种自身免疫性疾病，其中虚弱是由循环中阻断突触后神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体，从而抑制神经递质乙酰胆碱的刺激效果的抗体引起的。肌无力在医学上用胆碱酯酶抑制剂或免疫抑制剂，及在选定情况中，通过胸腺切除术来治疗。重症肌无力的标志是在活动期期间增加且在休息期之后改善的肌肉虚弱。控制眼和眼睑运动、面部表情、咀嚼、说话、和吞咽的肌肉尤其易感。控制呼吸及颈和四肢活动的肌肉也能受到影响。

在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗有所需要的受试者中的ALS的方法，包括对所述受试者施用miR-206和/或miR-1的激动剂。ALS(也称作Lou Gehrig氏病，或Charcot病(Maladie de Charcot))是一种渐进的，通常致命的，神经变性性疾病，由运动神经元变性引起。作为运动神经元疾病之一，该病症引起全身肌肉虚弱和萎缩，因为上位和下位运动神经元都变性，停止向肌肉发送信息。由于没有能力活动，肌肉逐渐变虚弱，因去神经而形成肌束震颤(颤搐)，及最终由于该去神经而萎缩。患者可最终丧失发动和控制除了眼之外所有随意运动的能力。利鲁唑，FDA批准用于ALS的第一种治疗方法，减缓运动神经元的变性，但是不逆转已经发生的损伤。ALS的其它治疗方法设计用来减轻症状和改善患者的生活质量。

在另一个实施方案中，本发明提供通过施用miR-206和/或miR-1的激动剂来治疗有所需要的受试者中的脊髓性肌萎缩的方法。脊髓性肌萎缩(SMA)是一种常染色体隐性病症，是人类婴儿死亡的首要遗传原因。该疾病的特征为由近及远渐进的肌肉虚弱，下肢比上肢受到更多影响。基于疾病严重程度和发病年龄，已经描述了SMA的三种型。I型影响大约50％的SMA患者，症状在出生后头六个月内出现。通常在头两年内由于呼吸衰竭而发生死亡。II型SMA在年龄六个月和十八个月之间发病，而且存活长度取决于呼吸损伤的严重程度。症状在十八个月和幼童时期之间发作的III型SMA患者通常寿命预期不缩短，只是大多数在他们疾病行进的某个点时束缚于轮椅。SMA的特征为脊髓前角中α-运动神经元损失，这与肌肉麻痹和萎缩有关。当前，没有针对SMA疾病的有效治疗剂。

在还有一个实施方案中，本发明提供一种治疗有所需要的受试者中的弗里德赖希氏共济失调的方法，包括对所述受试者施用miR-206和/或miR-1的激动剂。弗里德赖希氏共济失调是一种常染色体隐性先天性疾病，其对神经系统引起渐进性损伤，导致范围为步态障碍和说话困难至心脏病的症状。弗里德赖希氏共济失调的共济失调源自脊髓中神经组织的变性，特别是对于指导臂和腿的肌肉运动至关重要的感觉神经元(经由与小脑的连接)。脊髓变得更薄，而且神经细胞丧失它们的一些髓鞘。弗里德赖希氏共济失调的症状包括下述各项(但是不必所有)的任何组合：臂和腿的肌肉虚弱，协调障碍，视力损失，听力损失，言语不清，脊柱弯曲(脊柱侧弯)，高足弓，糖尿病，和心脏病(例如心房颤动及所致心动过速，和肥厚性心肌病)。症状是能治疗的，但是此时没有针对弗里德赖希氏共济失调的治疗方法。

在还有一个实施方案中，本发明提供一种治疗有所需要的受试者中的脊髓小脑性共济失调的方法，包括对所述受试者施用miR-206和/或miR-1的激动剂。脊髓小脑性共济失调(SCA)是一种遗传病，特征为缓慢渐进的步态失调，而且常常与手、说话、和眼活动协调差有关。经常发生小脑萎缩。没有脊髓小脑性共济失调这种渐进性疾病的已知治愈病例。与其它形式的共济失调一样，由于缺乏肌肉运动精密协调，SCA导致身体活动不稳和笨拙，以及其它症状。具有这种疾病的人通常会以需要使用轮椅告终，而且他们最终可能需要帮助来实施日常任务。

去神经神经病状态也可源自神经损伤，诸如脊髓或周围神经损伤，其中一条或多条神经被横断或压伤。外伤性脊髓损伤可分成不同的类型。脊髓中央损伤综合征与上肢功能与下肢相比有更大的损失有关。布朗-塞卡尔综合征源自对脊髓一侧的损伤，引起损伤侧的虚弱和本体感受损失及另一侧的疼痛和热感觉损失。脊髓前部损伤综合征(Anterior Spinal syndrome)源自对脊髓前部的损伤，引起虚弱及损伤部位以下疼痛和热感觉损失，但是保留通常在脊髓后部中传送的本体感受。脊髓痨源自对脊髓后部的损伤，通常源自传染病，诸如梅毒，引起触觉和本体感受感觉损失。脊髓圆锥损伤综合征(ConusMedullaris syndrome)源自对位于L1椎骨的脊髓尖端的损伤。马尾综合征是对L1椎骨以下的脊髓根的损伤。外伤性脊髓损伤和其它类型的神经损伤能通过miR-206和/或miR-1的激动剂来治疗，它们促进损伤后骨骼肌的神经支配恢复。

在本发明的另一个实施方案中，与其它治疗形态组合地使用miR-206和/或miR-1的激动剂。如此，在本文所述发明的miRNA激动剂之外，还可以给受试者提供“标准”制药学疗法。此类标准疗法会取决于要治疗的具体去神经神经病状态，但是可以包括利鲁唑、胆碱酯酶抑制剂(例如依酚氯铵(edrophonium chloride)新斯的明(neostigmine)、吡斯的明(pyridostigmine)、毒扁豆碱(physostigmine)、安贝氯铵(ambenonium)、demarcarium、利凡斯的明(rivastigmine)、菲衍生物、加兰他敏(galantamine)、哌啶、多奈哌齐(donepezil)、和他克林(tacrine))和免疫抑制剂(例如泼尼松(prednisone)、环孢霉素、霉酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)和硫唑嘌呤(azathioprine))。

可以如下实现组合，即使骨骼肌细胞接触包括两种药剂的单一组合物或药理学配制剂，或者使细胞同时接触两种不同组合物或配制剂，其中一种组合物包括miR-206和/或miR-1的激动剂，而另一种包括第二药剂。或者，所述使用miRNA激动剂的疗法可以在另一药剂的施用之前或之后，间隔范围为数分钟至数周。在分开对细胞应用另一药剂和miRNA激动剂的实施方案中，一般会确保每次递送的时间之间没有经过显著的一段时间，使得所述药剂和miRNA激动剂会仍然能够有利地对细胞发挥组合效应。在此类情况中，通常会使细胞在相距约12-24小时、更优选在相距约6-12小时内接触两种形态，延迟时间最优选只有约12小时。然而，在一些情况中，可能希望显著延长治疗时间段，其中各施用间经过数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

也想得到的是会希望超过一次地施用miRNA激动剂或另一药剂。在这点上，可以采用各种组合。举例而言，在miRNA激动剂为“A”而另一药剂/疗法为“B”的情况中，下列基于总共3次和4次施用的排列是例示性的：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A

A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

同样涵盖其它组合。

本发明还涵盖用于在治疗后清除或消除miR-206和/或miR-1激动剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用肌肉特异性启动子在骨骼肌细胞中过表达miR-206和/或miR-1的结合位点区。所述结合位点区优选含有miR-206和/或miR-1的种子区，即跨越碱基2-8的miRNA 5’部分的序列。在一些实施方案中，所述结合位点可含有来自miR-206和/或miR-1的一种或多种靶物3′UTR的序列。例如，在一个实施方案中，miR-206和/或miR-1的结合位点含有HDAC4的3’UTR。在另一个实施方案中，可以在miR-206和/或miR-1激动剂之后施用miR-206和/或miR-1抑制剂以削弱或终止微小RNA的功能。此类抑制剂可包括小RNA拮抗剂(antagomir)、反义、或抑制性RNA分子(例如siRNA或shRNA)。

本发明还涵盖包含miR-206和/或miR-1的激动剂和药学可接受载体的药物组合物。在临床应用的情况中，药物组合物会以对于预定应用适宜的形式制备。一般而言，这会需要制备基本上不含热原以及其它对人类或动物会有害的杂质的组合物。

可以使用胶状分散系统(诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束(micelle)、混合胶束、和脂质体)作为本文所述微小RNA功能的激动剂的递送媒介物。对于将本发明的核酸递送至诸如骨骼肌组织等组织合适地商品化脂肪乳剂包括 Nutrilipid、和其它类似的脂质乳剂。一种作为体内递送媒介物使用的优选的胶状系统是脂质体(即人工膜囊泡)。此类系统的制备和使用是本领域公知的。例示性的配制剂还披露于US5,981,505；US 6,217,900；US 6,383,512；US 5,783,565；US 7,202,227；US6,379,965；US 6,127,170；US 5,837,533；US 6,747,014；和WO03/093449，通过述及完整收入本文。

一般会希望采用适宜的盐和缓冲剂来使得递送载体稳定且容许被靶细胞摄取。当将重组细胞导入患者中时，也会采用缓冲液。本发明的水性组合物包含有效量的递送媒介物，其溶解或分散在药学可接受载体或水性介质中。短语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指在对动物或人类施用时不产生不利的、变应性的、或其它不想要的反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等可接受用于配制药物(诸如适合对人施用的药物)的。此类介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容，否则就涵盖它在治疗性组合物中的使用。还可以将补充性活性成分掺入组合物中，只要它们不灭活所述组合物的核酸。

本发明的活性组合物可包括经典的药学制备物。依照本发明的这些组合物的施用可以经由任何常用路径，只要靶组织经由该路径可及。这包括口服、鼻、或含服。或者，施用可以是经过皮内、经皮、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射，或者通过直接注射入骨骼肌组织。此类组合物通常会作为如上所述的药学可接受组合物来施用。

活性化合物也可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备游离碱或药理学可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中及在油中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制备物一般含有防腐剂以防止微生物生长。

对于注射使用合适的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体及用于临场制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。一般而言，这些制备物是无菌的，而且以存在易于注射性的程度流动。制备物在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。适宜的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇、等等)、它们的合适混合物、及植物油。可以通过例如使用涂层(诸如卵磷脂)、通过维持所需粒度(在分散体的情况中)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现对微生物作用的预防，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在许多情况中，会优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂来实现可注射组合物的吸收的延长，例如单硬脂酸铝和明胶。

可如下制备无菌注射液，即以适宜的量将活性化合物掺入根据需要含有任何其它成分(例如上文所列)的溶剂中，接着过滤除菌。一般而言，如下制备分散体，即将各种经灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和想要的其它成分(例如上文所列)的无菌媒介物中。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，它们自先前无菌过滤的溶液产生其活性成分加任何别的想要的成分的粉末。

本发明的组合物一般可配制成中性或盐形式。药学可接受盐包括例如自无机酸(例如盐酸或磷酸)或自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、等等)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)。也可以自无机碱(例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)或自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等)衍生与蛋白质的游离羧基形成的盐。

配制后，优选以与剂型相容的方式和以治疗上有效的量施用溶液。所述配制剂可以容易地以多种剂量形式来施用，诸如注射液、药物释放胶囊等等。例如，为了以水溶液形式胃肠外施用，一般将溶液适当缓冲，并且首先例如用足够的盐或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。此类水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选的是，采用无菌水介质，正如本领域技术人员知道的，特别是根据本公开内容。举例而言，可以将单个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且或是添加至1000ml皮下输液或是在建议的输注部位注射(参见例如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。药理学治疗剂和施用方法、剂量、等是本领域技术人员公知的(参见例如《Physicians Desk Reference》、Klaassen的《ThePharmacological Basis of Therapeutics》、《Remington′s PharmaceuticalSciences》、和《The Merck Index》第11版，通过述及将相关部分收入本文)，而且可以根据本文中的公开内容与本发明组合。合适的剂量包括约20mg/kg至约200mg/kg、约40mg/kg至约160mg/kg、或约80mg/kg至约100mg/kg。取决于所治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况中，负责施用的人会为各受试者决定适宜的剂量，而且此类个体决定在本领域普通技术人员的技术范围内。此外，对于人类施用，制备物应当达到FDA生物制剂标准室要求的无菌度、热原度、一般安全和纯度标准。

本文所述任何组合物可以装在试剂盒中。在一个非限制性的例子中，miR-206和/或miR-1激动剂包括在试剂盒中。所述试剂盒可进一步包括水和杂交缓冲液以便于所述miRNA的两条链的杂交。所述试剂盒还可包括一种或多种转染试剂以便于将多核苷酸激动剂递送至细胞。

试剂盒的成分可以在水介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器手段一般包括至少一个管形瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器手段，其中装有(优选合适地分配的)成分。在试剂盒中有超过一种成分的情况中(标记用试剂和标记物可以包装在一起)，试剂盒一般还会包含第二、第三或其它别的容器，其中可以分开装纳别的成分。然而，可以在管形瓶中装纳各种成分组合。本发明的试剂盒一般还会包括安置核酸的手段，和紧密密封的任何其它试剂容器以供销售。此类容器可包括用于安放所需管形瓶的注射或吹塑成形的塑料容器。

当所述试剂盒的成分在一种和/或多种液体溶液中提供时，所述液体溶液是水溶液，特别优选无菌的水溶液。然而，试剂盒的成分可以以干粉形式提供。当试剂和/或成分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来将所述粉剂重建。所述溶剂也可以在另一容器手段中提供。

容器手段一般会包括至少一个管形瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中装有(优选合适地分配的)核酸配制剂。所述试剂盒还可包含第二容器手段，用于装纳无菌的药学可接受缓冲剂和/或其它稀释剂。

此类试剂盒还可包括保存或维持miRNA/多核苷酸或者保护它们免于降解的成分。此类成分可以不含RNA酶或针对RNA酶提供保护。此类试剂盒一般会以合适的手段为每种单独的试剂或溶液包含独特的容器。

试剂盒还会包括关于采用试剂盒成分以及使用试剂盒中没有包括的任何其它试剂的说明书。说明书可包括能执行的变化形式。试剂盒还可包括通过各种施用路径(诸如胃肠外或肌肉内施用)施用miRNA激动剂的器具或装置。

本发明还包括一种用于诊断受试者中的去神经神经病状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)自所述受试者获得骨骼肌组织样品；(b)评估所述样品中的miR-206和/或miR-133b活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与正常组织样品中的miR-206和/或miR-133b活性或表达比较，其中miR-206和/或miR-133b活性或表达与正常组织样品中的miR-206和/或miR-133b活性或表达相比升高诊断为去神经神经病状态。在另一个实施方案中，所述方法包括(a)自所述受试者获得骨骼肌组织样品；(b)评估所述样品中的miR-1和/或miR-133a活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与正常组织样品中的miR-1和/或miR-133a活性或表达比较，其中miR-1和/或miR-133a活性或表达与正常组织样品中的miR-1和/或miR-133a活性或表达相比降低诊断为去神经神经病状态。去神经神经病状态可包括脊髓损伤、重症肌无力、肌萎缩侧索硬化、弗里德赖希氏共济失调、脊髓性肌萎缩、和脊髓小脑性共济失调。

在一个实施方案中，评估miR-206和/或miR-133b活性包括评估一种或多种受miR-206和/或miR-133b调节的基因的活性。例如，在一些实施方案中，所述一种或多种受miR-206调节的基因是HDAC4、Dach2、或成肌蛋白。在另一个实施方案中，评估miR-1和/或miR-133a活性包括评估一种或多种受miR-1和/或miR-133a调节的基因的活性。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括对所述受试者施用针对所述去神经神经病状态的疗法并再评估miR-206/miR-133b和/或miR-1/miR-133a表达或活性。可以将治疗后获得的miR-206/miR-133b和/或miR-1/miR-133a的表达或活性与正常组织样品或先前(例如在治疗前)自所述受试者获得的组织样品中这些miRNA的表达比较。

本发明进一步包含用于鉴定神经肌肉突触维持和再生的调控物的方法。例如，在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定骨骼肌中miR-206和/或miR-1活性的调控物的方法。鉴定得到的，miR-206和/或miR-1功能的激动剂在去神经神经病状态，诸如ALS或神经损伤的治疗中有用。miR-206和/或miR-1的调控物(例如激动剂)可以包括在药物组合物中，用于依照本发明的方法治疗去神经神经病状态。

这些测定法可包含随机筛选候选物质的大型文库；或者，所述测定法可用于聚焦于特定类别的化合物，它们是以针对认为使得化合物更有可能抑制miR-206和/或miR-1表达和/或功能的结构属性的视角选择的。

为了鉴定miR-206和/或miR-1的调控物，一般会在存在和不存在候选化合物的情况中，任选在神经肌肉突触维持和再生细胞或动物模型的背景中测定miR-206和/或miR-1的功能。例如，所述方法一般包含：(a)使骨骼肌细胞与候选化合物接触；(b)评估miR-206和/或miR-1活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与没有候选化合物的情况中的活性或表达比较，其中测量得到的活性或表达之间有差异指示所述候选化合物是miR-206和/或miR-1的调控物，且因此是神经肌肉突触维持和再生的调控物。也可以在分离的细胞、器官、或活的生物体中进行测定法。

评估miR-206和/或miR-1的活性或表达可包括评估miR-206和/或miR-1的表达水平。本领域技术人员熟悉多种用于评估RNA表达水平的方法，包括例如Northern印迹或RT-PCR。评估miR-206和/或miR-1的活性或表达可包括评估miR-206和/或miR-1的活性。在一些实施方案中，评估miR-206和/或miR-1的活性包括评估神经肌肉接头稳定性。在其它实施方案中，评估miR-206和/或miR-1的活性包括评估受miR-206和/或miR-1调节的基因的表达或活性。受miR-206和/或miR-1调节的基因包括例如HDAC4、Dach2、和成肌蛋白。本领域技术人员熟悉多种用于评估受miR-206和/或miR-1调节的基因的活性或表达的方法。此类方法包括例如Northern印迹、RT-PCR、ELISA、或Western印迹。

当然要理解，本发明的所有筛选方法自身就是有用的，尽管事实上可能没有找到有效的候选物。本发明提供了用于筛选此类候选物的方法，不仅仅是找到它们的方法。

如本文中所使用的，“候选化合物”指任何可潜在调控miR-206和/或miR-1的神经肌肉突触维持和再生功能的分子。通常会从各种商业来源获得认为达到有用药物基本标准的分子文库，从而试图“推动”有用化合物的鉴定。对此类文库(包括通过组合产生的文库)的筛选是对大量相关(和无关)化合物筛选活性的一种快速且有效的方式。通过在有活性但其它方面不合适的化合物的原型上创建第二代、第三代、和第四代化合物，组合法还将它们自身用于潜在药物的快速进化。可依照本发明的方法筛选的候选化合物的非限制性例子是蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。miR-206和/或miR-1的调控物也可以是miR-206和/或miR-1的上游调节物的激动剂或抑制剂。

体外测定法是一种快速、便宜且容易的测定法。此类测定法一般使用分离的分子，能快速且大量运行，由此提高一小段时间里可获得的信息量。可使用多种容器来运行此类测定法，包括试管、板、盘和其它表面，诸如量杆(dipstick)或珠。例如，可以评估寡核苷酸对靶miRNA的杂交。

WO 84/03564中记载了一种用于高通量筛选化合物的技术。可以在固体基底(诸如塑料针或一些其它表面)上合成大量的小化合物。可以对此类分子快速筛选它们与miR-206和/或miR-1杂交的能力。

本发明还涵盖，对化合物筛选它们调控细胞中miR-206和/或miR-1表达和功能的能力。此类筛选测定法可利用各种细胞系，包括自骨骼肌细胞衍生的那些(例如C2C12细胞)，包括专门为此目的而改造的细胞。

体内测定法涉及神经肌肉突触维持和再生的各种动物模型的使用(例如G93A-SOD1转基因小鼠)。由于它们的体型、易于操作、及关于它们生理学和遗传构成的信息，小鼠是一种优选的实施方案，尤其对于转基因的。然而，其它动物也是合适的，包括大鼠、家兔、仓鼠、豚鼠、沙鼠、旱獭、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。可以使用自任何这些物种衍生的动物来进行对调控物的测定法，包括那些经过修饰以提供神经肌肉突触维持和再生模型的。

用测试化合物治疗动物会涉及对动物施用适宜形式的化合物。施用会是任何可用于临床目的的路径。在体内测定化合物的有效性可涉及多种不同标准，包括但不限于突触构造或信号传导的改变。而且，可以以比体外或细胞内测定法更有意义的方式在动物中实施对毒性和剂量响应的测量。

本发明包括一种调节细胞中HDAC4的表达的方法，包括使细胞与miR-206和/或miR-1的调控物接触。在一个实施方案中，细胞中HDAC4的表达在施用miR-206和/或miR-1激动剂后降低。在另一个实施方案中，细胞中HDAC4的表达在施用miR-206和/或miR-1抑制剂后升高。在某些实施方案中，所述细胞是骨骼肌细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供通过向细胞递送miR-206的抑制剂来削弱或消除细胞中miR-206表达或活性的方法。所述细胞可以在体外或在体内。miR-206的抑制剂可以包括反义寡核苷酸、小RNA拮抗剂、和抑制性RNA分子(例如shRNA和siRNA)。反义寡核苷酸可包含与成熟miR-206序列至少部分互补，例如与成熟miR-206序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以与成熟miR-206序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与成熟miR-206序列100％互补的序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸是小RNA拮抗剂。“小RNA拮抗剂”指单链的、经化学修饰的、至少部分与miRNA序列互补的核糖核苷酸。小RNA拮抗剂可包含一个或多个经修饰的核苷酸，诸如2′-O-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，小RNA拮抗剂仅包含经修饰的核苷酸。小RNA拮抗剂也可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，导致部分或完全是硫代磷酸酯的主链。为了促进体内递送和稳定性，可以在其3’端将小RNA拮抗剂连接至胆固醇或其它模块。适合于抑制miRNA的小RNA拮抗剂可以长约15个至约50个核苷酸，更优选长约18个至约30个核苷酸，且最优选长约20个至约25个核苷酸。“部分互补”指某序列与靶多核苷酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。小RNA拮抗剂可以与成熟miR-206序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，小RNA拮抗剂可以与成熟miR-206序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在其它实施方案中，小RNA拮抗剂与成熟miR-206序列100％互补。

用于抑制miR-206的功能的另一种办法是施用具有与miR-206的成熟序列至少部分相同和部分互补的双链区的抑制性RNA分子。所述抑制性RNA分子可以是双链小干扰RNA(siRNA)或包含茎-环结构的短发夹RNA分子(shRNA)。所述抑制性RNA分子的双链区可包含与成熟miR-206序列至少部分相同和部分互补，例如约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同和互补的序列。在一些实施方案中，所述抑制性RNA的双链区包含与成熟miR-206序列至少基本上相同和基本上互补的序列。“基本上相同和基本上互补”指某序列与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％相同和互补。在其它实施方案中，所述抑制性RNA分子的双链区可以含有与miR-206序列的100％同一性和互补性。

包括下列实施例来进一步例示本发明的各个方面。本领域技术人员会领会，下文实施例中公开的技术代表了发明人发现在实施本发明时运转良好且因此能视为构成实施本发明的优选模式的技术和/或组合物。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应领会可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变且仍然获得类似或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。

实施例

实施例1：慢速骨骼肌富含的miR-206在去神经的骨骼肌中上调

miR-206是一种肌肉特异性miRNA，与miR-1在序列上密切相关且共享相同的种子区。与在心脏和骨骼肌中表达的miR-1不同，miR-206仅仅在骨骼肌中表达。对不同骨骼肌的Northern印迹分析揭示了miR-206在含有慢速纤维的肌肉群诸如比目鱼肌中高度富集(图1A)。miR-1在所有肌肉群中以相似的水平表达(图1B)。

比较了来自正常成年小鼠和进行坐骨神经手术切除10天小鼠之下肢的骨骼肌的miRNA表达谱。在所测试的320种miRNA中，16种miRNA的水平响应去神经而显著受到影响(上调或下调＞2倍)。miR-206是在去神经的肌肉中最显著上调的miRNA之一。Northern印迹(图1B)和实时PCR(图1C)确认了miR-206在去神经后上调。上调在主要含有快缩纤维的三种肌肉中是显著的，即趾长伸肌(EDL)、胫骨前肌(TA)和腓肠肌/跖肌(G/P)(图1B)。miR-206水平在神经支配正常的主要含有慢速肌纤维的比目鱼肌中更高，而且去神经后的上调相应地不太惊人。与其来自与miR-206相同启动子的转录一致，miR-133b也在去神经后上调，而miR-1和miR-133a响应去神经而下调大约50％(图1B和1C)。这些结果指示miR-206可能在神经损伤后的肌肉修复中发挥作用。另外，这些数据提示虽然miR-206和miR-1在序列上相似，但是表达样式和对各种刺激的差异应答提示这两种miRNA独特的功能。

实施例2：神经损伤后miR-206敲除小鼠中骨骼肌延迟的神经支配恢复

为了确定miR-206的体内功能，生成了miR-206敲除小鼠。miR-206与miR-133b一起作为双顺反子转录。打靶策略设计成消除miR-206的表达并保留miR-133b的表达(图2A和B)。自129SvEv基因组DNA扩增2.7-kb 5’臂，并用Sac II和Not I消化，并连接入pGKNeo-F2L2DTA打靶载体。用Hind III和EcoRV消化2.1-kb 3’臂，并连接在打靶载体的新霉素抗性和DTA盒之间。用5’和3’外部探针通过Southern印迹来鉴定靶定的ES细胞。将一个具有正确靶定的miR-206等位基因的克隆用于注射入3.5天的C57BL/6胚泡，并将所得嵌合体繁殖成C57BL/6雌性，供种系传递用。

来自野生型和miR-206杂合子的基因组DNA的Southern印迹确认了突变型等位基因正确的打靶和种系传递(图2C)。通过Northern印迹分析确认了突变型小鼠骨骼肌中成熟miR-206的缺失(图2D)。删除miR-206对连锁的pre-miR-133b或紧密相关的miR-1-2或miR-1-2的表达没有影响(图2E)。在miR-206靶向删除方面纯合的小鼠是可存活的，而且没有显示骨骼肌重量、行为、或整体构造或纤维类型分布的总体异常，如通过H&E及异染性ATP酶染色所看到的(图2F)。

自miR-206/133b基因座衍生的一种转录物最初被Merlie及其同事(Velleca等，1994)鉴定为突触相关非编码RNA(称作7H4)。大概7H4由与神经肌肉接头(NMJ)有关的肌细胞核选择性转录，如对于编码神经递质受体基因和突触后装置的其它成分的基因所显示的(Sanes等，1991；Sunesen和Changeux，2003)。虽然报告的7H4序列不包括miR-206，但是RT-PCR证明了miR-206序列包括在此转录物中，而且确认了miR-206，像7H4一样，在肌肉纤维的突触区中富集(数据未显示)。因此，初始的7H4 RNA(Velleca等，1994)表现为代表部分加工的来自miR-206/133b基因座的pri-miRNA。这些结果，与肌肉结构或功能中任何明显表现的缺失一起，将我们的注意力聚焦在NMJ上。检查了新生和成年野生型和miR-206-/-小鼠的TA、EDL、和比目鱼肌中NMJ的构造。使用带荧光标签的结合乙酰胆碱受体(AChR)的银环蛇毒素(BTX)显现了突触后膜。分别用针对神经丝蛋白的抗体和针对突触小泡蛋白即突触结合蛋白2(ZNP)(Fox等，2007)的抗体来检测运动轴突和神经末梢。新生和成年突变型小鼠的NMJ在与年龄匹配的野生型NMJ比较时没有显示明显差异(数据未显示)。如此，miR-206对于NMJ的形成和成熟是可有可无的。

鉴于miR-206在去神经的肌肉中的有力上调，我们接下来问miR-206是否可能调节神经损伤后的神经支配恢复。在股中部切断miR-206-/-和对照野生型同窝小鼠的坐骨神经，并在1-8周后评估TA肌肉的神经支配恢复。去神经后再生轴突优先恢复对初始突触位点的神经支配(Sanes和Lichtman，1999)，所以对神经添附的突触后位点的数目定量。因为突触后AChR在去神经后仍然很大程度保持完整，所以可以通过BTX染色(红色)与ZNP染色(绿色)的重叠来准确评估神经支配恢复。在野生型小鼠中，神经支配恢复在去神经后2和3周之间开始，而且到损伤后5周接近完成(图3A和B)。比较而言，miR-206-/-TA肌肉的神经支配恢复直到损伤后3周还没开始，而且在损伤后5周时仍然延迟(图3A和B)。在神经被压伤而非切断时，神经支配恢复也是延迟的；在这种规程中，没有生成神经中的缺口，而且靶物的再生比神经切断后更快地发生(图3C)。在腓肠肌和EDL肌肉中获得了相似的结果(数据未显示)。如此，在数种肌肉中及在两种类型的神经损伤后，神经支配恢复在没有miR-206的情况中显著延迟，提示miR-206在调节损伤后神经肌肉接头的神经支配恢复中具有至关重要的作用。

神经横断后成功的神经支配恢复涉及一系列步骤。首先，在切断轴突的(axotomized)神经元中触发生长程序，而且它们的轴突经远端残肢再生以到达肌肉。如预期的，这些步骤在突变型动物中不受影响，因为在野生型和miR-206-/-神经中观察到相似数目的神经纤维，尽管在突变型肌肉中形成少数NMJ(数据未显示)。这些结果指示轴突再生本身在miR-206敲除动物中没有受到损伤。

当轴突分支，接触和再占据肌肉纤维时在肌肉内发生另一套步骤，而且最终形成为神经递质释放专门化的新的神经末梢。在没有miR-206的情况中神经支配恢复延长的延迟提示miR-206调节损伤后从肌肉发出的，影响运动神经与NMJ相互作用的信号。与这个结论一致，miR-206-/-肌肉纤维上初始突触位点的神经支配恢复在多个方面是异常的。第一，在突变型小鼠中许多突触位点只是被再生神经部分再占据。第二，miR-206-/-的终端区域中的突触结合蛋白2(ZNP)水平比对照小鼠中的低。相反，在运动轴突的终端前区域中，突变体中的突触结合蛋白2水平比对照中的高。如此，小泡未能在突变体的再生神经末梢中正确聚集。最后，运动轴突常常生长超过(spout beyond)miR-206-/-NMJ，提示可能缺乏从肌肉发出的“终止”信号(数据未显示)。

实施例3：miR-206靶向骨骼肌中的HDAC4

在miR-206的许多计算预测靶物中，组蛋白脱乙酰基酶4(HDAC4)mRNA在最强的之中。小鼠Hdac4 mRNA的3’UTR含有两个进化上保守的序列，与miR-206的种子序列具有完美互补性(图4A)。此外，已经将HDAC4与神经肌肉基因表达的控制联系起来(Cohen等，2005；Tang等，2008)。还有，密切相关的miRNA，即miR-1，在体外显示出抑制HDAC4mRNA翻译(Chen等，2006)。为了测试miR-206是否能够遏制HDAC4翻译，将HDAC4mRNA的3’UTR克隆到在CMV启动子控制下的萤光素酶报告物的下游。转染渐增量的miR-206导致剂量依赖性的萤光素酶活性降低，而且HDAC4 3’UTR中miR-206靶序列的突变防止miR-206的遏制作用(图4B)。HDAC4蛋白质表达在miR-206-/-动物的骨骼肌中与野生型对照相比升高(图4C)。Hdac4 mRNA水平在miR-206-/-小鼠中没有变化，指示miR-206在这种情况中通过翻译抑制而非mRNA失稳起作用(Valencia-Sanchez等，2006)(图4D)。先前的工作证明了HDAC4经由遏制Dach2表达(成肌蛋白的一种阻抑物)来诱导成肌蛋白表达(Cohen等，2007；Tang等，2009)。如预期的，在miR-206-/-小鼠中在去神经后Dach2转录物减少而成肌蛋白转录物增加，与去神经的miR-206-/-小鼠中升高的HDAC4蛋白质表达和增强的HDAC4下游信号传导遏制一致(图4E和F)。

为了测试HDAC4是否介导miR-206在肌肉中的效果，生成了具有条件性Hdac4无效等位基因的小鼠，其中Hdac4基因的外显子6侧翼为loxP位点，而且使用在骨骼肌中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠删除了此组织中的等位基因(HDAC4 mKO)(Potthoff等，2007；Li等，2005)。NMJ在没有HDAC4的情况中正常形成和成熟(数据未显示)。然而，神经压伤或切断后，HDAC4突变型小鼠的肌肉的神经支配恢复比对照更快(图4G)，这种表型与miR-206-/-小鼠相反。类似的，HDAC4突变体中再生神经末梢对突触位点覆盖比对照更好，而删除miR-206妨碍对突触位点的完全占据。这些发现与miR-206的功能是抵消HDAC4对损伤后神经支配恢复的负面影响的结论一致。

实施例4：肌萎缩侧索硬化的小鼠模型中miR-206的上调

在鉴定肌萎缩侧索硬化(ALS)(一种导致肌肉去神经的疾病)的病理行进中涉及的miRNA的努力中，对G93A-SOD1转基因小鼠(ALS的一种公认小鼠模型)(Son等，2007)的GP肌肉实施了miRNA阵列序型分析。半合子G93A-SOD1转基因小鼠到六个月时形成渐进性神经肌肉缺损，此后不久展示一或多肢中的麻痹及到九个月时死亡(Puttaparthi等，2002)。对7月龄G93A-SOD1转基因和野生型小鼠的肌肉实施阵列。在G93A-SOD1小鼠的GP肌肉中上调和下调的许多miRNA中，发现miR-206上调最多(图5A)。Northern印迹分析确认了阵列结果，而且条带定量揭示了在末期ALS小鼠中miR-206表达升高大约9倍及miR-1表达降低2倍(图5B和未显示的数据)。用利鲁唑(一种用于减缓ALS行进的治疗性药物)(McGeer和McGeer，2005)处理C2C12肌肉细胞降低了miR-206的表达且提高了miR-1的表达(数据未显示)。

为了进一步阐明miR-206在肌肉变性中的作用，通过将miR-206突变型动物与G93A-SOD1动物杂交，生成了双重突变型小鼠。ALS发病机制在miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠中升高。图5C描绘了G93A-SOD1小鼠和miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠的代表性图像。注意，双重突变型小鼠中增强的后肢麻痹。肌肉变性在miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠中也升高，如通过野生型、miR-206敲除、G93A-SOD1动物、和miR-206/G93A-SOD1双重突变型小鼠的腓肠肌/跖肌苏木精和曙红(H&E)染色所证明的(图5D)。这些结果指示miR-206的丧失恶化神经肌肉变性，提示操纵miR-206表达可能是治疗神经变性性病症，诸如ALS的可行治疗办法。

已经完善记载了具有ALS的小鼠模型和患者中蛋白质编码基因的失调(Boillee等，2006；Gonzalez de Aguilar等，2007)。然而，迄今为止尚未报告ALS中miRNA的表达谱。我们发现数种miRNA(最值得注意的是miR-1和miR-206)的表达在G93A-SOD1转基因小鼠(ALS的一种公认小鼠模型)的肌肉中有显著变化。虽然看起来需要损伤运动神经元来启动ALS表型，但是其它细胞类型清楚地涉及该疾病的病理行进(Boillee等，2006b)。这些观察结果支持非神经元mRNA；以及miRNA在影响ALS中看到的病理性基因网络中的作用。

已经提议数项机制促成ALS的行进，包括氧化性损伤、谷氨酸兴奋性中毒、和轴突逆向转运缺陷(Dunckley等，2007)。我们的发现证明了miRNA表达的变化也是促成ALS行进的可能机制。虽然在ALS中导致运动神经元变性的精确分子机制仍然模糊，但是清楚的是该疾病的一项共同会聚点和初始病理标志是靶肌肉的去神经。因此，成功的治疗剂应当靶向疾病行进中的这些早期步骤。去神经的肌肉中，以及G93ASOD1小鼠中miR-206表达的有力升高提示操纵miR-206表达代表治疗与ALS和其它具有神经肌肉接头功能障碍的运动神经元疾病有关的临床症状的一种新的潜在治疗靶。

*************

通过述及将本文中所讨论和引用的所有出版物、专利、和专利申请完整收入本文。根据本公开文本，无需过度实验就能做出和执行本文中所公开的和要求保护的所有组合物和方法。虽然已经在优选实施方案方面描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员会显而易见的是，可以对本文所述组合物和方法，及所述方法的各步骤或各步骤的顺序进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体的说，会显而易见的是，在化学和生理学这两方面相关的某些试剂可以替代本文所述药剂，而会实现相同或相似的结果。认为对本领域技术人员显而易见的所有此类相似替代和修改在本发明的精神、范围和概念内，它们由所附权利要求限定。

在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”联合使用时，词语“一个/种”的使用可以表示“一个/种”，但是也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”、和“一个/种或超过一个/种”的含义一致。本文中讨论的任何实施方案可以用本发明的任何方法或组合物来执行，反之亦然。另外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。贯穿本申请，术语“约”用于表示某数值包括用于测定该数值的装置或方法的误差的标准偏差。

权利要求书中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指明指只选一项或各备选项相互排斥，即使公开文本支持只选一项的定义和“和/或”。

如本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(及其任何变形)、“具有”(及其任何变形)、“包括”(及其任何变形)或“含有”(及其任何变形)是包含性/包括性的或开放式的，不排除别的未述及的成分或方法步骤。

参考文献

通过述及明确将下列参考文献收入本文，其程度为它们提供例示性的规程或其它详情来补充本文所列的那些。

U.S.Patent 4,873,191

U.S.Patent 5,604,251

U.S.Patent 5,844,107

U.S.Patent 5,877,302

U.S.Patent 5,972,900

U.S.Patent 5,972,901

U.S.Patent 6,008,336

U.S.Patent 6,077,835

U.S.Patent 6,200,801

U.S.Patent Publn.20020150626

U.S.Patent Publn.20030032615

U.S.Patent Publn.20030203865

U.S.Patent Publn.20040048787

Abraham et al.，Mol.Med，8：750-760，2002.

Ambros，Cell，113(6)：673-676，2003.

Angel et al.，Cell，49：729，1987b.

Angel et al.，Mol.Cell.Biol.，7：2256，1987a.

Atchison and Perry，Cell，46：253，1986.

Atchison and Perry，Cell，48：121，1987.

Babak et al.，RNA 10：1813-1819，2004.

Baichwal and Sugden，In：Gene Transfer，Kucherlapati (Ed.)，Plenum Press，NY，117-148，1986.

Baldwin and Haddad，J.Appl.Physiol.，90：345-357，2001.

Banerji et al.，Cell，27(2Pt 1)：299-308，1981.

Banerji et al.，Cell，33(3)：729-740，1983.

Barad et al.，Genome Res.14：2486-2494，1997.

Barnes et al.，J Biol.Chem.，272(17)：11510-11517，1997.

Bartel，Cell，116：281-297，2004.

Benvenisty and Neshif，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(24)：9551-9555，1986.

Berkhout et al.，Cell，59：273-282，1989.

Bhavsar et al.，Genomics，35(1)：11-23，1996.

Blanar et al.，EMBO J，8：1139，1989.

Bodine and Ley，EMBO J，6：2997，1987.

Boshart et al.，Cell，41：521，1985.

Bosze et al.，EMBO J，5(7)：1615-1623，1986.

Braddock et al.，Cell，58：269，1989.

Brennecke et al.，Cell，113：25-36，2003.

Brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(13)：4438-4442，1985.

Bristow，Cardiology，92：3-6，1999.

Bulla and Siddiqui，J Virol.，62：1437，1986.

Calin et al.，Proc.Natl.Acd.Sci.USA，99：15524-15529，2002.

Campbell and Villarreal，Mol.Cell.Biol.，8：1993，1988.

Campere and Tilghman，Genes and Dev.，3：537，1989.

Campo et al.，Nature，303：77，1983.

Carrington et al.Science，301(5631)：336-338，2003.

Celander and Haseltine，J Virology，61：269，1987.

Celander et al.，J Virology，62：1314，1988.

Chandler et al.，Cell，33：489，1983.

Chang and Karin，Nature，410(6824)：37-40，2001.

Chang et al.，Biochim.Biophys.Acta，1092(2)：153-160，1991.

Chang et al.，Mol.Cell.Biol.，9：2153，1989.

Chang et al.，Nature，430(7001)：785-789，2004.

Chatterjee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9114，1989.

Chen and Okayama，Mol.Cell Biol.，7(8)：2745-2752，1987.

Chen et al.，Mol.Cell Endocrinol.，162：45-55，2000.

Chen et al.，Science，303(5654)：83-86，2004.

Choi et al.，Cell，53：519，1988.

Coffin，In：Virology，Fields et al.(Eds.)，Raven Press，NY，1437-1500，1990.

Cohen et al.，J Cell.Physiol.，5：75，1987.

Costa et al.，Mol.Cell.Biol.，8：81，1988.

Couch et al.，Am.Rev.Resp.Dis.，88：394-403，1963.

Coupar et al.，Gene，68：1-10，1988.

Cripe et al.，EMBO J，6：3745，1987.

Culotta and Harner，Mol.Cell.Biol.，9：1376，1989.

Dandolo et al.，J Virology，47：55-64，1983.

De Villiers et al.，Nature，312(5991)：242-246，1984.

Deschamps et al.，Science，230：1174-1177，1985.

Dubensky et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：7529-7533，1984.

Durand et al.，Ann.Med.，27：311-317，1995.

Edbrooke et al.，Mol.Cell.Biol.，9：1908，1989.

Edgerton and Roy，J Appl.Physiol.，89：1224-1231，2000.

Edlund et al.，Science，230：912-916，1985.

Eichhorn and Bristow，Circulation，94：2285-2296，1996.

EPO 0273085

Fechheimer，et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987.

Feng and Holland，Nature，334：6178，1988.

Ferkol et al.，FASEB J，7：1081-1091，1993.

Firak and Subramanian，Mol.Cell.Biol.，6：3667，1986.

Fitts et al.，J Appl.Physiol.，89：823-839，2000.

Foecking and Hofstetter，Gene，45(1)：101-105，1986.

Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979.

Franz et al.，Cardioscience，5(4)：235-43，1994.

Friedman et al.，Genes Devel.，3：1314，1989.

Fujita et al.，Cell，49：357，1987.

Ghosh and Bachhawat，In：Liver Diseases，Targeted Diagnosis and TherapyUsing Specific Receptors and Ligands，Wu et al.(Eds.)，Marcel Dekker，NY，87-104，1991.

Ghosh-Choudhury et al.，EMBO J，6：1733-1739，1987.

Gilles et al.，Cell，33：717，1983.

Gloss et al.，EMBO J.，6：3735，1987.

Godbout et al.Mol.Cell.Biol.，8：1169，1988.

Gomez-Foix et al.，J Biol.Chem.，267：25129-25134，1992.

Goodbourn and Maniatis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1447，1988.

Goodbourn et al.，Cell，45：601，1986.

Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190，1985.

Gopal-Srivastava et al.，J Mol.Cell.Biol.15(12)：7081-7090，1995.

Graham and Prevec，In：Methods in Molecular Biology：Gene Transfer andExpression Protocol，Murray(Ed.)，Humana Press，Clifton，NJ，7：109-128，1991.

Graham and Van Der Eb，Virology，52：456-467，1973.

Graham et al.，J Gen.Virl.，36(1)：59-74，1977.

Greene et al.，Immunology Today，10：272，1989

Grishok et al.，Cell，106：23-34，2001.

Grosschedl and Baltimore，Cell，41：885，1985.

Grunhaus and Horwitz，Seminar in Virology，3：237-252，1992.

Harland and Weintraub，J Cell Biol.，101(3)：1094-1099，1985.

Haslinger and Karin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：8572，1985.

Hauber and Cullen，J Virology，62：673，1988.

Hen et al.，Nature，321：249，1986.

Hensel et al.，Lymphokine Res.，8：347，1989.

Hermonat and Muzycska，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6466-6470，1984.

Herr and Clarke，Cell，45：461，1986.

Hersdorffer et al.，DNA Cell Biol.，9：713-723，1990.

Herz and Gerard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2812-2816，1993.

Hill et al.，Circulation，101：2863-2869，2000.

Hirochika et al.，J Virol.，61：2599，1987.

Hirsch et al.，Mol.Cell.Biol.，10：1959，1990.

Holbrook et al.，Virology，157：211，1987.

Horlick and Benfield，Mol.Cell.Biol.，9：2396，1989.

Horwich et al.J.Virol.，64：642-650，1990.

Huang et al.，Cell，27：245，1981.

Hug et al.，Mol.Cell.Biol.，8：3065，1988.

Hutvagner et al.，PLoS Biol.，2(4)：E98，2004.

Hwang et al.，Mol.Cell.Biol.，10：585，1990.

Imagawa et al.，Cell，51：251，1987.

Imbra and Karin，Nature，323：555，1986.

Imler et al.，Mol.Cell.Biol.，7：2558，1987.

Imperiale and Nevins，Mol.Cell.Biol.，4：875，1984.

Ito and Roeder，Trends Endocrinol.Metab.，12：127-134，2001.

Jakobovits et al.，Mol.Cell.Biol.，8：2555，1988.

Jameel and Siddiqui，Mol.Cell.Biol.，6：710，1986.

Jaynes et al.，Mol.Cell.Biol.，8：62，1988.

Johnson et al.，Mol.Cell.Biol.，9：3393，1989.

Jones and Shenk，Cell，13：181-188，1978.

Kadesch and Berg，Mol.Cell.Biol.，6：2593，1986.

Kaneda et al.，Science，243：375-378，1989.

Karin et al.，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.

Karin et al.，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.

Karlsson et al.，EMBO J.，5：2377-2385，1986.

Katinka et al.，Cell，20：393，1980.

Katinka et al.，Nature，290：720，1981.

Kato et al.，J.Biol.Chem.，266：3361-3364，1991.

Kawamoto et al.，Mol.Cell.Biol.，8：267，1988.

Kelly et al.，J.Cell Biol.，129(2)：383-396，1995.

Kiledjian et al.，Mol.Cell.Biol.，8：145，1988.

Kimura et al.，Dev.Growth Differ.39(3)：257-265，1997.

Kinugawa et al.，Circ.Res.，89：591-598，2001.

Kinugawa et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.，86：5089-5090，2001.

Kiriazis and Kranias，Annu.Rev.Physiol.，62：321-351，2000.

Klamut et al.，Mol.Cell.Biol.，10：193，1990.

Klein et al.，Nature，327：70-73，1987.

Koch et al.，Mol.Cell.Biol.，9：303，1989.

Krek et al.，Nature Genetics，37：495-500，2005.

Krenz and Robbins，J Am.Coll.Cardiol.，44：2390-2397，2004，

Kriegler and Botchan，In：Eukaryotic Viral Vectors，Gluzman (Ed.)，Cold SpringHarbor：Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1982.

Kriegler and Botchan，Mol.Cell.Biol.，3：325，1983a.

Kriegler et al.，Cell，38：483，1984.

Kriegler et al.，Cell，53：45，1988.

Kriegler et al.，In：Gene Expression，Alan Liss (Ed.)，Hamer and Rosenberg，NewYork，1983b.

Kriitzfeldt et al.，Nature，438：685-689，2005.

Kuhl et al.，Cell，50：1057，1987.

Kunz et al.，Nucl.Acids Res.，17：1121，1989.

Lagos-Quintana et al.，Science，294(5543)：853-858，2001.

LaPointe et al.，Hypertension 27(3 Pt 2)：715-22，1996.

LaPointe et al.，J Biol.Chem.，263(19)：9075-8，1988.

Larsen et al..，Proc Natl.Acad.Sci.USA.，83：8283，1986.

Laspia et al.，Cell，59：283，1989.

Latimer et al.，Mol.Cell.Biol.，10：760，1990.

Lau et al.，Science，294(5543)：858-862，2001.

Le Gal La Salle et al.，Science，259：988-990，1993.

Lee and Ambros，Science，294(5543)：862-864，2001.

Lee et al.，Nature，294：228，1981.

Lee et al.，Nucleic Acids Res.，12：4191-206，1984.

Leung et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：18125-18130，2006.

Levinson et al.，Nature，295：79，1982.

Levrero et al.，Gene，101：195-202，1991.

Lin et al.，Mol.Cell.Biol.，10：850，1990.

Liu et al.，Proc Natl Acad Sci USA 101：9740-9744，2004.

Luria et al.，EMBO J.，6：3307，1987.

Lusky and Botchan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3609，1986.

Lusky et al.，Mol.Cell.Biol.，3：1108，1983.

Macejak and Samow，Nature，353：90-94，1991.

Majors and Varmus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：5866，1983.

Mann et al.，Cell，33：153-159，1983.

Mansen et al.，Mol.Endocrinol.，15：2106-2114，2001.

Markowitz et al.，J Virol.，62：1120-1124，1988.

McNeall et al.，Gene，76：81，1989.

Meister and Tuschl，Nature，431：343-9，2004.

Miksicek et al.，Cell，46：203，1986.

Molkentin et al.，Cell 93：215-228，1998.

Mordacq and Linzer，Genes and Dev.，3：760，1989.

Moreau et al.，Nucl.Acids Res.，9：6047，1981.

Morkin，Microsc.Res.Tech.，50：522-531，2000.

Moss et al.，Biol.Chem.，271(49)：31688-31694，1996.

Muesing et al.，Cell，48：691，1987.

Naya et al.，J Biol Chem.，275(7)：4545-4548，2000.

Ng et al.，Nuc.Acids Res.，17：601，1989.

Nicolas and Rubinstein，In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors andtheir uses，Rodriguez and Denhardt (Eds)，Stoneham：Butterworth，494-513，1988.

Nicolau and Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982.

Nicolau et al.，Methods Enzymol.，149：157-176，1987.

Ojamaa et al.，Endocrinology，141：2139-2144，2000.

Ondek et al.，EMBO J.，6：1017，1987.

Ornitz et al.，Mol.Cell.Biol.，7：3466，1987.

Palmiter et al.，Nature，300：611，1982.

Pantos et al.，Horm.Metab.Res.，38：308-313，2006.

Park et al.，Mol.Cell.，19：643-653，2005.

Paskind et al.，Virology，67：242-248，1975.

Pasquinelli and Ruvkun，Ann.Rev.Cell Dev.Biol.，18：495-513，2002.

Pavri et al.，Mol.Cell.，18：83-96，2005.

PCT Appln.WO 0071096

PCT Appln.WO 84/03564

PCT Appln.WO 98/33791

Pech et al.，Mol.Cell.Biol.，9：396，1989.

Pelletier and Sonenberg，Nature，334(6180)：320-325，1988.

Perales et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：4086-4090，1994.

Perez-Stable and Constantini，Mol.Cell.Biol.，10：1116，1990.

Physicians Desk Reference

Picard and Schaffner，Nature，307：83，1984.

Pinkert et al.，Genes and Dev.，1：268，1987.

Ponta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1020，1985.

Porton et al.，Mol.Cell.Biol.，10：1076，1990.

Potter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：7161-7165，1984.

Queen and Baltimore，Cell，35：741，1983.

Quinn et al.，Mol.Cell.Biol.，9：4713，1989.

Racher et al.，Biotechnology Techniques，9：169-174，1995.

Ragot et al.，Nature，361：647-650，1993.

Redondo et al.，Science，247：1225，1990.

Reisman and Rotter，Mol.Cell.Biol.，9：3571，1989.

Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th ed.，pages 1035-1038 and 1570-1580，Mack Publishing Company，Easton，PA，1980.

Renan，Radiother.Oncol.，19：197-218，1990.

Resendez Jr.et al.，Mol.Cell.Biol.，8：4579，1988.

Rich et al.，Hum.Gene Ther.，4：461-476，1993.

Ridgeway，In：Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Rodriguez et al.(Eds.)，Stoneham：Butterworth，467-492，1988.

Ripe et al.，Mol.Cell.Biol.，9：2224，1989.

Rippe，et al.，Mol.Cell Biol.，10：689-695，1990.

Rittling et al.，Nuc.Acids Res.，17：1619，1989.

Rosen et al.，Cell，41：813，1988.

Rosenfeld et al.，Science，252：431-434，1991.

Rosenfeld，et al.，Cell，68：143-155，1992.

Roux et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9079-9083，1989.

Sakai et al.，Genes and Dev.，2：1144，1988.

Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001.

Satake et al.，J Virology，62：970，1988.

Schaffner et al.，J Mol.Biol.，201：81，1988.

Schuyler and Yarbrough，Basic Res.Cardiol.，85：481-494，1990.

Searle et al.，Mol.Cell.Biol.，5：1480，1985.

Sempere et al.，Genome Biol.，5：R13，2004.

Sharp and Marciniak，Cell，59：229，1989.

Shaul and Ben-Levy，EMBO J，6：1913，1987.

Sherman et al.，Mol.Cell.Biol.，9：50，1989.

Shingara et al.，RNA 11：1461-1470，2005.

Sleigh and Lockett，J EMBO，4：3831，1985.

Spalholz et al.，Cell，42：183，1985.

Spandau and Lee，J Virology，62：427，1988.

Spandidos and Wilkie，EMBO J，2：1193，1983.

Stephens and Hentschel，Biochem.J，248：1，1987.

Stratford-Perricaudet and Perricaudet，In：Human Gene Transfer，Eds，Cohen-Haguenauer and Boiron，John Libbey Eurotext，France，51-61，1991.

Stratford-Perricaudet et al.，Hum.Gene.Ther.，1：241-256，1990.

Stuart et al.，Nature，317：828，1985.

Sullivan and Peterlin，Mol.Cell.Biol.，7：3315，1987.

Swartzendruber and Lehman，J Cell.Physiology，85：179，1975.

Takebe et al.，Mol.Cell.Biol.，8：466，1988.

Tavernier et al.，Nature，301：634，1983.

Taylor and Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：165，1990a.

Taylor and Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：176，1990b.

Taylor et al.，J Biol.Chem.，264：15160，1989.

Temin，In：Gene Transfer，Kucherlapati(Ed.)，NY，Plenum Press，149-188，1986.

The Merck Index，Eleventh Edition

Thiesen et al.，J Virology，62：614，1988，

Top et al.，J Infect.Dis.，124：155-160，1971.

Treisman，Cell，46(4)：567-174，1986.

Tronche et al.，Mol.Biol.Med.，7：173，1990.

Tronche et al.，Mol.Cell Biol.，9(11)：4759-4766，1989.

Trudel and Constantini，Genes and Dev.，6：954，1987.

Tsika et al.，Am.J Physiol.Cell Physiol.，283：C1761-C1775，2002.

Tur-Kaspa et al.，Mol.Cell Biol.，6：716-718，1986.

Tyndell et al.，Nuc.Acids.Res.，9：6231，1981.

Vadaszova et al.，Physiol.Res.53(1)：S57-61，2004.

van Rooij et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103(48)：18255-18260，2006.

Vannice and Levinson，J Virology，62：1305，1988.

Varmus et al.，Cell，25：23-36，1981.

Vasseur et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，77：1068，1980.

Wagner et al.，Proc.Nat！.Acad.Sci.USA 87(9)：3410-3414，1990.

Wang and Calame，Cell，47：241，1986.

Weber et al.，Cell，36：983，1984.

Wei et al.，J Endocrinol.Invest.，28：8-11，2005.

Weinberger et al.Mol.Cell.Biol.，8：988，1984.

Winoto and Baltimore，Cell，59：649，1989.

Wong et al.，Gene，10：87-94，1980.

Wu and Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12：159-167，1993.

Wu and Wu，Biochemistry，27：887-892，1988.

Wu and Wu，J Biol.Chem.，262：4429-4432，1987.

Xu et al.，Curr.Biol.，13：790-795，2003.

Yamauchi-Takihara et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，86(10)：3504-3508，1989.

Yang and Russell，Proc.Natl.Acad Sci.USA，87：4144-4148，1990.

Yao and Eghbali，Circ.Res.71：831-839，1992.

Young et al.，In：Handbook of Applied Therapeutics，7.1-7.12and 9.1-9.10，1989.

Yutzey et al.Mol.Cell.Biol.，9：1397，1989.

Zelenin et al.，FEBS Lett.，287(1-2)：118-120，1991.

Zeng et al.，Cancer Res.，62(13)：3630-3635，2002.

Ziober and Kramer，J Biol.Chem.，271(37)：22915-22，1996.

Claims (10)

1.由SEQ ID NO：1的序列或SEQ ID NO：2的序列组成的多核苷酸用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中治疗去神经神经病状态，其中所述去神经神经病状态是周围神经损伤或肌萎缩侧索硬化。

2.权利要求1的用途，其中所述多核苷酸在脂质递送媒介中配制。

3.权利要求1的用途，其中所述多核苷酸包含在表达载体中。

4.权利要求3的用途，其中所述多核苷酸自肌肉特异性启动子表达。

5.权利要求1的用途，进一步包括对所述受试者施用针对所述去神经神经病状态的第二疗法，其中所述第二疗法选自下组：利鲁唑、胆碱酯酶抑制剂、和免疫抑制剂。

6.权利要求1的用途，其中将所述药物配制成通过口服、经皮、皮下、或静脉内施用路径或直接注射入骨骼肌组织来施用。

7.权利要求1的用途，其中所述多核苷酸是双链的。

8.权利要求1的用途，其中所述多核苷酸与胆固醇偶联。

9.权利要求1的用途，其中向受试者以足以促进所述受试者骨骼肌的神经支配恢复的量施用所述多核苷酸。

10.权利要求1的用途，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO：1的序列组成。