KR20230143157A - Psd95, 시냅토파이신 및 카스파제-3 발현을 조절하기 위한 mirna-485 억제제의 용도 - Google Patents

Psd95, 시냅토파이신 및 카스파제-3 발현을 조절하기 위한 mirna-485 억제제의 용도 Download PDF

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류진협
이효진
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Abstract

본 개시내용은 감소된 수준의 PSD95 및/또는 시냅토파이신 및/또는 증가된 수준의 카스파제 3와 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 miRNA 억제제의 용도를 포함한다(예를 들면, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독). 본 개시내용에 유용한 miRNA 억제제는 miR-485 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있으며, 이는 결국 PSD95 및/또는 시냅토파이신 유전자 발현의 단백질 수준을 증가시키고 카스파제 3 단백질 또는 유전자 발현의 수준을 감소시킬 수 있다.

Description

PSD95, 시냅토파이신 및 카스파제-3 발현을 조절하기 위한 MIRNA-485 억제제의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 출원은 2021년 2월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/146,513의 출원일의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록 참조
본원과 함께 제출된 ASCⅡ 텍스트 파일 (명칭: 4366_042PC01_Seqlisting_ST25.txt; 크기: 41,798 바이트; 및 작성일: 2022년 2월 4일) 형태의 전자적으로 제출된 서열의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 비정상적인 수준의 PSD95, 시냅토파이신, 및/또는 카스파제 3과 연관된 질환 및 장애의 치료를 위한 miR-485 억제제 (예를 들면, 적어도 하나의 miR-485 결합 부위를 포함하는 뉴클레오티드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 용도를 제공한다.
단백질, 예컨대 PSD95, 시냅토파이신, 카스파제-3는 다양한 생물학적 기능에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, PSD95는 많은 수용체, 채널 및 신호 단백질의 시냅스 국소화를 조절하는 스캐폴딩 단백질이다. 시냅토파이신은 중추 뉴런에서 시냅스 소포 세포내이입의 동역학을 조절한다. 그리고 카스파제-3는 많은 주요 세포 단백질의 특정 절단에 관여한다. 따라서, 이들 단백질의 비정상적인 발현 및/또는 활성은 질환 또는 병태, 예컨대 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독을 초래하는 다양한 생물학적 손상을 초래할 수 있다. 그러므로, 그러한 단백질(및/또는 단백질을 암호화하는 유전자)의 활성을 조정함으로써, 이들 단백질의 비정상적인 발현 및/또는 활성을 갖는 질환 또는 병태를 치료하는 것이 가능할 수 있다.
본원에서는 miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 필요로 하는 대상체에서의 근긴장이상을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 근긴장이상은 안검경련, 경부 근긴장이상(연축사경), 도파-반응성 근긴장이상, 약물 유도 근긴장이상(지발성 운동이상증), 기능성 근긴장이상, 전신 근긴장이상, 손 근긴장이상(서경), 하지 근긴장이상, 음악가 근긴장이상, 근간대 근긴장이상, 신경학적 또는 대사성 장애와 연관된 근긴장이상, 경구하악 근긴장이상(두개골 근긴장이상), 두개경수 근긴장이상, 상완 근긴장이상, 발작성 운동이상증, 소아 근긴장이상, 경련성 발성장애(후두 근긴장이상), 급속 발병성 근긴장이상-파킨슨증, 독소 유도 근긴장이상, 외상 유도 근긴장이상, x-연관 근긴장이상-파킨슨증, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서는 또한 miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 필요로 하는 대상체에서의 신경정신 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 신경정신 질환은 조현병, 우울증, 자폐증, 발작, 주의력 결핍/과잉 행동 장애, 뚜렛 장애, 인지 결핍 장애, 중풍, 제어되지 않는 분노, 편두통, 섭식 장애(예를 들면, 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증), 우울증, 불안 장애(예를 들면, 외상 후 스트레스 장애) 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시내용은 miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 필요로 하는 대상체에서의 지적 장애를 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 양태에서, 지적 장애는 X 결함증후군, 다운 증후군, 프래더-윌리 증후군(PWS), 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD) 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서는 miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 필요로 하는 대상체에서의 중독을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 중독은 화학적 중독, 행동 중독, 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 양태에서, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독은 비정상적인 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관이 있다. 특정 양태에서, miRNA 억제제는 대상체에서 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 수준을 증가시킨다. 일부 양태에서, 대상체에서 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 수준은 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배 이상으로 증가된다.
일부 양태에서, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독은 비정상적인 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 대상체에서 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 수준을 증가시킨다. 특정 양태에서, 대상체에서 시냅토피신 단백질 및/또는 시냅토피신 유전자의 수준은 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배 이상으로 증가한다.
일부 양태에서, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독은 비정상적인 수준의 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자와 연관이 있다. 특정 양태에서, miRNA 억제제는 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 수준을 감소시킨다. 특정 양태에서, 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 수준은 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)과 비교하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소된다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 miR485-3p를 억제한다. 일부 양태에서, miR485-3p는 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU-3' (서열번호: 1)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, miRNA 억제제는 길이가 약 6 내지 약 30 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열의 5'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열의 3'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (서열번호: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (서열번호: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (서열번호: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 14), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 15); 5'-UGUAUGAC-3' (서열번호: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (서열번호: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (서열번호: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29), 및 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC (서열번호: 30)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-TGTATGA-3' (서열번호: 62), 5'-GTGTATGA-3' (서열번호: 63), 5'-CGTGTATGA-3' (서열번호: 64), 5'-CCGTGTATGA-3' (서열번호: 65), 5'-GCCGTGTATGA-3' (서열번호: 66), 5'-AGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 67), 5'-GAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 68), 5'-AGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 69), 5'-GAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 70), 5'-GGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 71), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 72), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 73), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 74), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 75); 5'-TGTATGAC-3' (서열번호: 76), 5'-GTGTATGAC-3' (서열번호: 77), 5'-CGTGTATGAC-3' (서열번호: 78), 5'-CCGTGTATGAC-3' (서열번호: 79), 5'-GCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 80), 5'-AGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 81), 5'-GAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 82), 5'-AGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 83), 5'-GAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 84), 5'-GGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 85), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 86), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 87), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 89), 및 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
일부 양태에서, miRNA 억제제의 서열은 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성이다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 90% 유사성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 1개 치환 또는 2개 치환을 갖는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30)를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA), 비잠금 핵산 (UNA), 아라비노 핵산 (ABA), 브릿징된 핵산 (BNA), 및/또는 펩티드 핵산 (PNA)이다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 백본 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 백본 변형은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO) 및/또는 포스포로티오에이트 (PS) 변형이다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 전달 제제로 전달된다. 일부 양태에서, 전달 제제는 미셀, 엑소좀, 리피도이드, 리포좀, 리포플렉스, 지질 나노입자, 세포외 소포, 합성 소포, 중합체성 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브, 접합체, 바이러스 벡터, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 전달 제제는 하기를 포함하는 양이온성 담체 단위체를 포함한다.
[WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (화학식 I)
또는
[WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (화학식 II)
여기서
WP는 수용성 생체고분자 모이어티이고;
CC는 양이온성 담체 모이어티이고;
AM은 보조제 모이어티이고;
L1 및 L2는 독립적으로 임의적 링커이다.
일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체 및 단리된 폴리뉴클레오티드는 함께 혼합될 때 미셀을 형성하도록 서로 연관될 수 있다. 일부 양태에서, 연관은 공유 결합을 통한 것이다. 특정 양태에서, 연관은 비-공유 결합을 통한 것이다. 일부 양태에서, 비-공유 결합은 이온성 결합을 포함한다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린 ("POZ") 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리글리세롤, 또는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG")을 포함한다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 하기를 포함한다:
, (화학식 I),
여기서 n은 1-1000이다.
일부 양태에서, n은 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 또는 적어도 약 141이다. 일부 양태에서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 140 내지 약 150, 또는 약 150 내지 약 160이다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 선형, 분지형, 또는 수지상이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 하나 이상의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 26, 적어도 약 27, 적어도 약 28, 적어도 약 29, 적어도 약 30, 적어도 약 31, 적어도 약 32, 적어도 약 33, 적어도 약 34, 적어도 약 35, 적어도 약 36, 적어도 약 37, 적어도 약 38, 적어도 약 39, 적어도 약 40, 적어도 약 41, 적어도 약 42, 적어도 약 43, 적어도 약 44, 적어도 약 45, 적어도 약 46, 적어도 약 47, 적어도 약 48, 적어도 약 49, 또는 적어도 약 50개의 염기성 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 30 내지 약 50개의 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 양태에서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 40개의 라이신 단량체를 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 면역 반응, 염증성 반응, 및/또는 조직을 조정할 수 있다. 특정 양태에서, 보조제 모이어티는 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 하기를 포함한다:
, (화학식 II),
여기서 G1 및 G2 각각은 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬이거나, G1 및 G2는 함께 방향족 고리를 형성하고, 여기서 n은 1-10이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 니트로이미다졸을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 하기를 포함한다.
(화학식 III),
여기서 Ar은 또는 이고,
여기서 Z1 및 Z2의 각각은 H 또는 OH이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 비타민을 포함한다. 일부 양태에서, 비타민은 환식 고리 또는 환식 헤테로 원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함한다. 일부 양태에서, 비타민은 하기를 포함한다:
(화학식 IV),
여기서 Y1 및 Y2의 각각은 C, N, O, 또는 S이고, n은 1 또는 2이다.
일부 양태에서, 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 M, 비타민 H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 양태에서, 비타민은 비타민 B3이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개 비타민 B3을 포함한다. 특정 양태에서, 보조제 모이어티는 약 10개 비타민 B3을 포함한다.
일부 양태에서, 전달 제제는 약 120 내지 약 130 PEG 단위체를 가진 수용성 생체고분자 모이어티, 약 30 내지 약 40개 라이신을 가진 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10개 비타민 B3를 가진 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체는 miRNA 억제제를 효소적 분해로부터 보호할 수 있다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 비경구, 근육내, 피하, 눈, 정맥내, 복강내, 피내, 안와내, 뇌내, 두개내, 뇌실내, 척수내, 심실내, 척수강내, 수조내, 피막내, 종양내, 국소, 또는 이들의 임의의 조합으로 투여된다.
일부 양태에서, 전달 제제는 미셀이다. 특정 양태에서, 미셀은 (i) 약 100 내지 약 200개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 30 내지 약 40개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 15 내지 약 20개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 30 내지 약 40개 라이신을 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 (i) 약 120 내지 약 130개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 32개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 16개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 32개 라이신을 포함한다.
일부 양태에서, 표적화 모이어티가 PEG 단위체에 추가로 연결된다. 특정 양태에서, 표적화 모이어티는 LAT 1 표적화 리간드이다. 일부 양태에서, 표적화 모이어티는 페닐알라닌이다.
도 1은 본 개시내용의 담체 단위체의 예시적 구성을 도시한다. 제시된 예는 양이온성 담체 모이어티를 포함하고, 이는 음이온성 페이로드, 예를 들면, 핵산 예컨대 유전자,예를 들면, miRNA (항-miR)를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 정전기적으로 상호작용할 수 있다. 일부 양태에서, AM은 WP와 CC 사이 위치될 수 있다. CC 및 AM 구성요소는 단순성을 위하여 선형 배열로 묘사된다. 하지만, 본원에서 설명된 대로, 일부 양태에서, CC 및 AM은 스캐폴드 방식으로 배열될 수 있다.
도 2a는 마우스 일차 뉴런 배양, 렌티-바이러스-miR485-3p 형질도입 및 세포 수확의 도식적 개요를 제공한다. 도 2b는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 처리된 뉴런(가장 오른쪽 패널), PSD95 염색(중간 패널) 및 각각의 병합된 이미지(왼쪽 패널)의 면역세포화학을 도시한다. 도 2c는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 처리된 뉴런(가장 오른쪽 패널), 시냅토파이신 염색(중간 패널) 및 병합된 이미지(왼쪽 패널)의 면역세포화학을 도시한다. 도 2d는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 처리된 뉴런에서 도 2b에 도시된 PSD95 염색의 강화된 면역세포화학 이미지를 제공한다. 도 2d의 오른쪽의 막대 그래프는 면역조직화학 이미지에 제공된 결과의 정량적 비교를 제공한다. 도 2e는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 처리된 뉴런에서 도 2c에 도시된 시냅토파이신 염색의 강화된 면역세포화학 이미지를 제공한다. 도 2e의 오른쪽의 막대 그래프는 면역조직화학 이미지에서 제공된 결과의 정량적 비교를 제공한다.
도 3은 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 처리된 뉴런(가장 오른쪽 패널) 및 절단된 카스파제 3(중간 패널) 및 각각의 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)의 면역세포화학을 도시한다.
도 4a는 미세아교세포/성상세포 배양, 렌티-바이러스-miR-485-3p 형질도입 및 세포 수확의 도식적 개요를 도시한다. 출생 후의 마우스의 전뇌를 성상세포와 미세아교세포로 분리하여 배양하고 렌티-대조군 또는 렌티-miR-485-3p로 처리하고 면역세포화학을 수행하였다. 도 4b는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 처리된 마우스 일차 미세아교세포의 면역세포화학을 도시한다. miR-485-3p 발현(가장 오른쪽 패널), 미세아교세포 특이적 마커 Iba1(가운데 패널) 및 각각의 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)가 도시된다. 도 4c는 바이러스 발현(가장 오른쪽 패널) 및 절단된 카스파제 3 염색(중간 패널) 및 병합된 이미지(가장 오른쪽 패널)를 도시한다.
도 5a는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 처리된 마우스 일차 성상세포(가장 오른쪽 패널) 및 성상세포 특이적 마커 염색, GFAP(중간 패널) 및 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)의 면역세포화학을 도시한다. 도 5b는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 바이러스 발현(가장 오른쪽 패널) 및 절단된 카스파제 3 염색(중간 패널) 및 각각의 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)를 도시한다.
도 6a는 인간 미세아교세포 및 인간 성상세포 배양, 렌티-miR-485-3p 형질도입 및 수확의 도식적 개요를 도시한다. 도 6b는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 바이러스 발현(가장 오른쪽 패널) 및 미세아교세포 마커(Iba1) 염색(중간 패널) 및 각각의 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)를 도시한다. 도 6c는 바이러스 발현(가장 오른쪽 패널) 및 절단된 카스파제 3 염색(중간 패널) 및 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)를 도시한다.
도 7a는 인간 성상세포(가장 오른쪽 패널) 및 성상세포 마커(GFAP)(중간 패널) 및 각각의 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)에서의 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 바이러스 발현을 도시한다. 도 7b는 렌티-대조군 및 렌티-miR-485-3p 바이러스 발현(가장 오른쪽 패널) 및 절단된 카스파제 3(중간 패널) 및 각각의 병합된 이미지(가장 왼쪽 패널)를 도시한다.
I. 용어
본 개시내용이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에서 사용된 대로, 본원에 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 다음 용어들의 각각은 하기 제시된 의미를 가질 수 있다. 추가의 정의는 본원 전체에 제시된다.
용어 "한" 또는 "하나" 독립체가 그 독립체의 하나 이상을 지칭함이 유의되어야 하고; 예를 들어, "한 뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한" (또는 "하나"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다. 청구항이 어느 임의적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음이 추가로 유의된다. 이와 같이, 본 진술은 청구항 요소의 인용, 또는 부정적인 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 및 기타 등등 같은 배타적 용어의 사용에 대하여 선행 근거의 역할을 하기 위한 것이다.
게다가, 본원에 사용된 경우 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 특정된 속성 또는 구성요소 각각의 특정 개시내용으로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에 어구 예컨대 "A 및/또는 B"에서 사용된 경우 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, 어구 예컨대 "A, B, 및/또는 C"에서 사용된 경우 용어 "및/또는"은 다음 양태들의 각각: A, B, 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)를 포괄하기 위한 것이다.
양태가 본원에 언어 "포함하는"으로 기재되는 곳마다, "으로 이루어지는" 및/또는 "으로 본질적으로 이루어지는"의 관점에서 기재된 달리 유사한 양태가 또한 제공됨이 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련되는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 본 개시내용에서 사용된 많은 용어의 일반 사전을 숙련자에게 제공한다.
단위, 접두사, 및 기호는 그들의 국제단위계 (Systeme International de Unites (SI)) 허용된 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 인용되는 경우, 그 범위의 인용된 상한 및 하한 사이, 각각의 중간 정수 값, 및 이들의 각 분수가 또한 그러한 값들 사이의 각 하위범위와 함께, 구체적으로 개시되는 것이 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있고, 어느 하나, 둘 다 포함되지 않거나 둘 다 포함되는 각 범위는 또한 본 개시내용 내에 포괄된다. 그래서, 본원에 인용된 범위는, 인용된 종점을 포함하는, 범위 이내 모든 값에 대하여 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 이루어지는 군으로부터 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
값이 명시적으로 인용되는 경우, 인용된 값과 거의 동일한 정량 또는 양인 값이 또한 본 개시내용의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소들의 각 하위조합은 또한 구체적으로 개시되고 본 개시내용의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소들의 군이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합은 또한 개시된다. 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각 대안이 단독으로 또는 기타 대안과 임의의 조합으로 배제되는 그 개시내용의 예는 또한 이에 의해 개시되고; 개시내용의 하나 초과의 요소는 그러한 배제를 가질 수 있고, 그러한 배제를 갖는 요소들의 모든 조합은 이에 의해 개시된다.
뉴클레오티드는 그들의 일반적으로 허용된 단일-문자 코드에 의해 지칭된다. 달리 지시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 배향으로 쓰여진다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장된 그들의 일반적으로 알려진 1-문자 기호로 본원에 지칭된다. 그러므로 'a'는 아데닌을 나타내고, 'c'는 시토신을 나타내고, 'g'는 구아닌을 나타내고, 't'는 티민을 나타내고, 'u'는 우라실을 나타낸다.
아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카르복시 배향으로 쓰여진다. 아미노산은 그들의 일반적으로 알려진 3 문자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장된 1-문자 기호 중 하나에 의해 본원에서 지칭된다.
용어 "약"은 대략, 대략적으로, 쯤, 또는 의 영역에서를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 제시된 수치 값의 위아래 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 예를 들면, 10 퍼센트, 위 또는 아래 (더 높거나 더 낮음)의 변동에 의해 명시된 값 위아래로 수치 값을 수정할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "아데노-연관된 바이러스" (AAV)는, 비제한적으로, AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3 (유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAVrh.74, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, AAV 혈청형 그리고 Gao 등 (J. Virol. 78:6381 (2004)) 및 Moris 등 (Virol. 33:375 (2004))에 의해 개시된 분기군, 그리고 지금 알려지거나 나중에 발견된 임의의 기타 AAV를 포함한다. 예를 들면, FIELDS 등 VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers), 참조. 일부 양태에서, "AAV"는 알려진 AAV의 유도체를 포함한다. 일부 양태에서, "AAV"는 변형된 또는 인공 AAV를 포함한다.
용어 "투여", "투여하기", 및 이의 문법적 별형은 조성물, 예컨대 본 개시내용의 miRNA 억제제를, 대상체에게 약학적으로 허용가능한 루트를 통해 도입하는 것을 지칭한다. 조성물, 예컨대 본 개시내용의 miRNA 억제제를 포함하는 미셀의 대상체에의 도입은 종양내, 구강내, 폐내, 비강내, 비경구 (정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하), 직장, 림프내, 척추강내, 안구주위 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 루트에 의한 것이다. 투여는 자가-투여 그리고 타인에 의한 투여를 포함한다. 투여의 적합한 루트는 조성물 또는 제제가 이의 의도된 기능을 수행하도록 한다. 예를 들어, 적합한 루트가 정맥내이면, 조성물은 조성물 또는 제제를 대상체의 정맥에 도입함으로써 투여된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "과 연관된"은 둘 이상의 실체 또는 특성 사이 밀접한 관계를 지칭한다. 가령, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 질환 또는 병태 (예를 들면, 비정상 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관된 질환 또는 병태)를 기재하는데 사용된 경우, 용어 "과 연관된"은 대상체가 단백질 및/또는 유전자의 비정상 발현을 나타내는 때 대상체가 질환 또는 병태를 앓는 증가된 가능성을 지칭한다. 일부 양태에서, 단백질 및/또는 유전자의 비정상 발현은 질환 또는 병태를 야기시킨다. 일부 양태에서, 비정상 발현은 질환 또는 병태를 반드시 야기시키지 않지만 이와 연관된다. 대상체가 질환 또는 병태와 연관된 단백질 및/또는 유전자의 비정상 발현을 나타내는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 적합한 방법의 비-제한 예는 본 개시내용에서 다른 곳에 제공된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "대략"은, 관심의 하나 이상의 값에 적용된 경우, 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 양태에서, 용어 "대략"은 달리 명시되지 않거나 달리 문맥에서 명백하지 않은 한 명시된 참조 값의 어느 한쪽 방향으로 (초과 또는 미만) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하 내에 상응하는하는 값의 범위를 지칭한다 (그러한 수가 가능한 값의 100%를 초과할 경우 제외).
본원에 사용된 경우에, 용어 "보존된"은 비교되는 둘 이상의 서열의 동일 위치에서 교대되지 않은 채 발생하는 것들인 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기, 각각을 지칭한다. 비교적 보존되는 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열에서 다른 곳에 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더욱 관련된 서열 중에서 보존되는 것들이다.
일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 100% 동일하면 "완전히 보존된" 또는 "동일한"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 또는 적어도 95% 동일하면 "고도로 보존된"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일하면 "고도로 보존된"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 적어도 30% 동일, 적어도 40% 동일, 적어도 50% 동일, 적어도 60% 동일, 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 또는 적어도 95% 동일하면 "보존된"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 약 30% 동일, 약 40% 동일, 약 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일, 또는 약 99% 동일하면 "보존된"이라고 한다. 서열의 보존은 폴리펩티드의 전체 길이 또는 폴리뉴클레오티드에 적용할 수 있거나 이의 부문, 영역 또는 속성에 적용할 수 있다.
용어 "에서 유래된"은, 본원에 사용된 경우에, 특정된 분자 또는 유기체, 또는 특정된 분자 또는 유기체로부터의 정보 (예를 들면, 아미노산 또는 핵산 서열)에서 단리되거나 상기를 사용하여 만들어지는 구성요소를 지칭한다. 예를 들어, 제2 핵산 서열로부터 유래되는 핵산 서열은 제2 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 경우에, 유래된 종은, 예를 들어, 자연 발생 돌연변이유발, 인공 지시된 돌연변이유발 또는 인공 무작위 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 유래하는데 사용된 돌연변이유발은 의도적으로 지시되거나 의도적으로 무작위이거나, 각각의 혼합물일 수 있다. 최초에서 유래된 상이한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 생성하기 위한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 돌연변이유발은 (예를 들면, 폴리머라제 불충실에 의해 야기된) 무작위 이벤트일 수 있고 유래된 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 식별은, 예를 들면, 본원에 논의된 대로, 적절한 스크리닝 방법으로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서 유래되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열, 각각에 대한 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다.
본원에 사용된 경우에, "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역가능한 코돈으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 한 부문이다. "정지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)이 아미노산으로 전형적으로 번역되지 않아도, 코딩 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있지만, 임의의 측접하는 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사적 종결자, 인트론, 및 기타 등등은 코딩 영역의 부분이 아니다. 코딩 영역의 경계는, 생성된 폴리펩티드의 아미노 말단을 암호화하는, 5' 말단에서 시작 코돈, 및 생성된 폴리펩티드의 카르복시 말단을 암호화하는, 3' 말단에서 번역 정지 코돈에 의해 전형적으로 결정된다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 왓슨-크릭 염기-짝짓기 규칙에 의해 서로 관련되는 둘 이상의 올리고머 (즉, 핵염기 서열을 각각 포함함), 또는 올리고머와 표적 유전자 사이를 지칭한다. 예를 들어, 핵염기 서열 "T-G-A (5'→3')"는 핵염기 서열 "A-C-T (3'→5')"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있고, 여기에서 주어진 핵염기 서열의 모든 핵염기보다 적은 수가 염기쌍 형성 규칙에 따라 다른 핵염기 서열에 매칭된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 주어진 핵염기 서열과 다른 핵염기 서열 사이 상보성은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%일 수 있다. 그러므로, 특정 양태에서, 용어 "상보적"은 표적 핵산 서열 (예를 들면, miR-485 핵산 서열)에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 매치 또는 상보성을 지칭한다. 또는, 예시를 계속하기 위해 주어진 핵염기 서열과 다른 핵염기 서열 사이 "완전한" 또는 "완벽한" (100%) 상보성이 있을 수 있다. 일부 양태에서, 핵염기 서열 사이 상보성의 정도는 서열 사이 하이브리드화의 효율 및 강도에 있어 상당한 영향을 갖는다.
용어 "다운스트림"은 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 3' 위치되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 양태에서, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 시작점을 따르는 서열에 관련한다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 다운스트림 위치된다.
용어 "부형제" 및 "담체"는 교환가능하게 사용되고 화합물, 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제의 투여를 추가로 촉진시키기 위해 약학적 조성물에 첨가된 불활성 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은, 본원에 사용된 경우에, 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들면, RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 공정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 마이크로 RNA 결합 부위, 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 또는 임의의 기타 RNA 산물로의 전사를 제한 없이 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 메신저 RNA (mRNA)로의 전사, 및 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을, 제한 없이, 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에 사용된 경우에, 유전자 산물은, 예를 들면, 핵산, 예컨대 유전자의 전사에 의해 생산된 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 유전자 산물은 유전자의 전사에 의해 생산된 핵산, RNA 또는 miRNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드 중 어느 하나일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물은 전사후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 가진 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들면, 인산화, 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 아단위체와의 연관, 또는 단백질분해 절단을 가진 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "상동성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들면 핵산 분자 사이 전반적 관련성을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "상동성"은 2개 분자 사이 진화적 관계를 암시한다. 그래서, 상동인 2개 분자는 공통 진화적 조상을 가질 것이다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 상동성은 동일성 및 유사성 모두를 포괄한다.
일부 양태에서, 중합체성 분자는 분자에서 단량체의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 동일하거나 (정확하게 동일 단량체) 유사 (보존적 치환)하면 서로에 "상동"인 것으로 간주된다. 용어 "상동"은 반드시 적어도 2개 서열 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열) 사이 비교를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 치환은 (이들이 아미노산 치환으로서 지칭되는 경우조차) 핵산 수준에서 실행되는데, 즉, 아미노산 잔기를 대안적 아미노산 잔기로 치환하는 것은 제1 아미노산을 암호화하는 코돈을 제2 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환시킴으로써 실행된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "동일성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 분자 사이 전반적 단량체 보존을 지칭한다. 임의의 추가의 수식어 없이 용어 "동일한"은, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 A는 폴리뉴클레오티드 B와 동일하다는 폴리뉴클레오티드 서열이 100% 동일함 (100% 서열 동일성)을 암시한다. 예를 들면, "70% 동일한"으로서 2개 서열 기재하기는 이들을, 예를 들면, "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로서 기재하는 것에 상응한다.
2개 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은, 예를 들어, 최적 비교 목적으로 2개 서열을 정렬시킴으로써 수행될 수 있다 (예를 들면, 갭은 최적 정렬을 위하여 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 한쪽 또는 양쪽에 도입될 수 있고 비-동일한 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 특정 양태에서, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 상응하는하는 아미노산 위치에 아미노산, 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에 염기는 그 다음 비교된다.
제1 서열에서 한 위치가 제2 서열에서 상응하는하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에 동일하다. 2개 서열 사이 퍼센트 동일성은, 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는, 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 그리고 2개 서열 사이 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취될 수 있다.
상이한 서열 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열)을 정렬하는데 사용될 수 있는 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 출처로부터 이용가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용가능한 BLAST 프로그램 제품군의 부분인, bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘 중 하나를 사용하는 2개 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되는 한편 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들면, EMBOSS 생물정보학 프로그램 제품군의 부분인 Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher이고 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보학 연구소 (European Bioinformatics Institute (EBI))로부터 또한 이용가능하다.
서열 정렬은 당업계에서 알려진 방법, 예컨대 MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE, 등을 사용하여 실행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬하는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내에서 상이한 영역은 그들의 자체 퍼센트 서열 동일성을 각각 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값이 가장 가까운 10분의 1로 반올림됨을 유의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반내림되고 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 또한 길이 값이 항상 정수인 것을 유의한다.
특정 양태에서, 제2 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 제1 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)의 백분율 동일성 (%ID) 또는 은 %ID = 100 x (Y/Z)로서 계산되고, 여기서 Y는 (시각 검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬된 경우에) 제1 및 제2 서열의 정렬에서 동일한 매치로서 채점된 아미노산 잔기 (또는 핵염기)의 수이고 Z는 제2 서열에서 잔기의 총수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 더 길면, 제2 서열에 대한 제1 서열의 퍼센트 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 퍼센트 동일성보다 더 높을 것이다.
당업자는 퍼센트 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 일차 서열 데이터에 의해 독점적으로 구동된 이진 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 서열 정렬이 서열 데이터를 이종 출처, 예컨대 구조적 데이터 (예를 들면, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터 (예를 들면, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생적 데이터로부터의 데이터와 통합함으로써 생성될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 이종 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 worldwideweb.tcoffee.org에서 이용가능한, 그리고, 예를 들면, EBI로부터 대안적으로 이용가능한 T-Coffee이다. 퍼센트 서열 동일성을 계산하는데 사용된 최종 정렬이 자동 또는 수동 중 어느 하나로 큐레이션될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "단리된", "정제된", "추출된", 및 이의 문법적 별형은 교환가능하게 사용되고 하나 이상의 정제 공정을 겪은 본 개시내용의 원하는 조성물, 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제의 제조물의 상태를 지칭한다. 일부 양태에서, 본원에 사용된 경우에 단리하기 또는 정제하기는 오염물을 함유하는 샘플로부터 본 개시내용의 조성물의 (예를 들면, 분획), 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제를 부분적으로 제거하는, 제거 공정이다.
일부 양태에서, 단리된 조성물은 검출가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나, 대안적으로, 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양은 허용가능한 수준 또는 양 이하이다. 다른 양태에서, 단리된 조성물은 허용가능한 양 및/또는 농도 및/또는 활성 이상에서, 본 개시내용의 원하는 조성물의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 단리된 조성물은 조성물이 수득되는 시작 물질과 비교된 경우에 농축된다. 이 농축은 시작 물질과 비교된 경우에 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%, 또는 99.9999% 초과만큼일 수 있다.
일부 양태에서, 단리된 제조물은 잔류 생물학적 산물이 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 단리된 제조물은 임의의 오염 생물학적 물질이 100% 없거나, 적어도 약 99% 없거나, 적어도 약 98% 없거나, 적어도 약 97% 없거나, 적어도 약 96% 없거나, 적어도 약 95% 없거나, 적어도 약 94% 없거나, 적어도 약 93% 없거나, 적어도 약 92% 없거나, 적어도 약 91% 없거나, 적어도 약 90% 없다. 잔류 생물학적 산물은 비생물적 물질 (화학물질 포함) 또는 원치않는 핵산, 단백질, 지질, 또는 대사산물을 포함할 수 있다.
용어 "결합된"은 본원에 사용된 경우에 제2 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 각각에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 제1 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 직접적으로 연결 또는 병치될 수 있거나 대안적으로 중간 서열은 제1 서열을 제2 서열에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 용어 "결합된"은 5'-말단 또는 3'-말단에서 제2 폴리뉴클레오티드 서열에서 제1 폴리뉴클레오티드 서열의 융합을 의미하고, 뿐만 아니라 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (또는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 각각)에서 임의의 2개 뉴클레오티드로의 전체 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열)의 삽입을 포함한다. 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 결합될 수 있다. 링커는, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
"miRNA 억제제"는, 본원에 사용된 경우에, miRNA 발현, 기능, 및/또는 활성을 감소, 변경, 및/또는 조정할 수 있는 화합물을 지칭한다. miRNA 억제제는, miRNA 억제제가 표적 miRNA 서열에 하이브리드화하도록, 표적 miRNA 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 가령, 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, miR-485 억제제가 miR-485 서열에 하이브리드화하도록, 표적 miR-485 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가적인 양태에서, miR-485 서열에 대한 miR-485의 하이브리드화는 miR-485의 발현, 기능, 및/또는 활성을 감소, 변경, 및/또는 조정한다 (예를 들면, 하이브리드화는 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 발현 증가: 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현 증가; 및/또는 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자의 발현 감소를 초래한다).
용어 "miRNA", "miR", 및 "마이크로RNA"는 교환가능하게 사용되고 RNA-기반 유전자 조절에 관여되는 진핵생물에서 발견된 마이크로RNA 분자를 지칭한다. 본 용어는 전구체로부터 가공된 단일-가닥 RNA 분자를 지칭하는데 사용될 것이다. 일부 양태에서, 용어 "안티센스 올리고머"는 본 개시내용의 마이크로RNA 분자를 기재하는데 또한 사용될 수 있다. 본 개시내용에 관련된 miRNA의 명칭 및 그들의 서열은 본원에 제공된다. 마이크로RNA는 표적 mRNA의 탈안정화 또는 번역적 억제로 이어지는 불완전 염기쌍 형성을 통해서 표적 mRNA에 결합하고 인식하며 이에 의해 표적 유전자 발현을 하향조절한다. 반대로, miRNA 결합 부위를 포함하는 분자 (일반적으로 miRNA의 씨드 영역에 상보적인 서열을 포함하는 분자)를 통해 miRNA 표적화 하는 것은 표적 유전자의 상향조절을 초래하는 miRNA-유도 번역적 억제를 감소 또는 억제시킬 수 있다.
용어 "미스매치" 또는 "미스매치들"은 염기쌍 형성 규칙에 따라 표적 핵산 서열 (예를 들면, miR-485)에 매칭되지 않는 올리고머 핵염기 서열 (예를 들면, miR-485 억제제)에서 (인접 또는 분리되든) 하나 이상의 핵염기를 지칭한다. 완벽한 상보성이 종종 요구되지만, 일부 양태에서, 하나 이상 (예를 들면, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 미스매치들)은 표적 핵산 서열과 관련하여 발생할 수 있다. 올리고머 내에서 임의의 위치에 변이가 포함된다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 안티센스 올리고머 (예를 들면, miR-485 억제제)는 말단 근처 핵염기 서열에서의 변이, 내부에서의 변이를 포함하고, 존재하는 경우 전형적으로 5' 및/또는 3' 말단의 약 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아단위체 이내이다. 일부 양태에서, 1, 2, 또는 3개 핵염기는 제거될 수 있고 여전히 표적내 결합을 제공할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "조정하다", "변형하다", 및 이의 문법적 변형은, 일반적으로 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동에 적용된 경우, 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동을 증가시킴 또는 감소시킴, 예를 들면, 직접적으로 또는 간접적으로 촉진시킴/자극시킴/상향조절시킴 또는 방해함/억제시킴/하향조절시킴으로써 변경시키는 능력, 예컨대, 예를 들면, 길항제 또는 작용제로서 작용하는 능력을 지칭한다. 일부 경우에, 조정자는 대조군에 비해, 또는 일반적으로 예상되는 활성의 평균 수준에 비해 또는 대조군 활성 수준에 비해 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miRNA 억제제, 예를 들면, miR-485 억제제는 miR-485 발현, 기능, 및/또는 활성을 조정 (예를 들면, 감소, 변경, 또는 폐지)할 수 있고, 이에 의해, PSD95, 시냅토파이신 및/또는 카스파제 3 단백질 또는 유전자 발현 및/또는 활성을 조정할 수 있다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", 및 이의 문법적 변형은 교환가능하게 사용되고 리보뉴클레오시드 (아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체성 형태, 또는 이들의 임의의 포스포에스테르 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를, 단일 가닥 형태, 또는 이중-가닥 나선중 어느 하나로 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열은 단일-가닥 DNA (ssDNA) 또는 단일-가닥 RNA (ssRNA)를 지칭하다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선은 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 일차 및 이차 구조만을 지칭하고, 임의의 특정한 삼차 형태로 제한하지 않는다. 그래서, 이 용어는, 특히, 선형 또는 원형 DNA 분자 (예를 들면, 제한 단편), 플라스미드, 초나선 DNA 및 염색체에서 발견된 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정한 이중-가닥 DNA 분자의 구조 논의에서, 서열은 DNA의 비-전사된 가닥 (즉, mRNA에 상동인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로 서열만을 제공하는 정상 관례에 따라 본원에 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 겪은 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈성 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA, 및 절반-합성 DNA를 비제한적으로 포함한다. 개시내용의 "핵산 조성물"은 하나 이상의 핵산을 본원에 설명된 대로 포함한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체", "약학적으로 허용가능한 부형제", 및 이의 문법적 변형은 인간을 포함하는 동물에 사용을 위하여 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전에서 열거된 제제 중 임의의 것, 뿐만 아니라 대상체에 조성물의 투여를 금지하고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생산을 야기시키지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포괄한다. 약학적 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고, 비-독성이고, 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "약학적 조성물"은, 하나 이상의 다른 화학적 구성요소, 예컨대 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 혼합되거나 섞인, 또는 상기에 현탁된, 본원에 기재된 화합물 중 하나 이상, 예컨대, 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제를 지칭한다. 약학적 조성물의 하나의 목적은 대상체에게 본 개시내용의 miRNA 억제제를 포함하는 제조물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는, 본원에 사용된 경우에, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다.
일부 양태에서, 용어는 분자의 일차 구조를 지칭한다. 따라서, 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산 ("DNA"), 뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산 ("RNA")을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 예를 들어 알킬화에 의해, 및/또는 캡핑에 의해 변형된, 그리고 미변형된 형태를 또한 포함한다.
일부 양태에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 스플라이싱되든 스플라이싱되지 않든, tRNA, rRNA, shRNA, siRNA, miRNA 및 mRNA를 포함하는, 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 노르무클레오티딕 백본을 함유하는 기타 중합체, 예를 들어, 폴리아미드 (예를 들면, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모르폴리노 중합체, 그리고 중합체가 염기쌍 형성 및 염기 스태킹을 허용하는, 예컨대 DNA 및 RNA에서 발견되는 구성으로 핵염기를 함유함을 제공하는 기타 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 양태에서, RNA는 합성 RNA이다. 일부 양태에서, 합성 RNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 양태에서, 특정 부류의 모든 핵염기는 비천연 핵염기로 대체되었다 (예를 들면, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 모든 우리딘은 비천연 핵염기, 예를 들면, 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있다).
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은, 예를 들면, PSD95, 시냅토파이신 및/또는 카스파제 3 유전자에 의해 암호화되는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에 교환가능하게 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 구성요소와의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 예컨대 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산, 및 크레아틴 포함)를 함유하는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형이 본 정의 내에 또한 포함된다. 용어 "폴리펩티드"는, 본원에 사용된 경우에, 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다.
폴리펩티드는 유전자 산물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 동족체, 동원체, 이원체, 단편 및 기타 등가물, 변이체, 및 전술한 것들의 유사체를 포함한다.
폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나 다분자성 복합체 예컨대 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 이들은 단일쇄 또는 다중쇄 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있다. 가장 일반적인 디술피드 연결은 다중쇄 폴리펩티드에서 발견되다. 용어 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 또한 적용할 수 있다. 일부 양태에서, "펩티드"는 약 50개 아미노산 길이 이하, 예를 들면, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개 아미노산 길이일 수 있다.
용어 "예방하다", "예방하기", 및 이의 이형은 본원에 사용된 경우에, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 특정한 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 속성, 또는 임상 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 특정한 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 속성, 또는 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 특정한 질환, 장애, 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태와 연관된 병리 발달의 위험을 감소시킴을 지칭한다. 일부 양태에서, 결과 예방하기는 예방성 치료를 통해서 달성된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "프로모터" 및 "프로모터 서열"은 교환가능하고 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3' 위치된다. 프로모터는 본연 유전자로부터 그들의 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터에서 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달의 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 경우에 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로서 지칭된다. 특정 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로서 지칭된다. 발달 또는 세포 분화의 특정 단계에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "발달적으로-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로서 지칭된다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 광, 또는 기타 등등으로 세포를 노출 또는 처리한 다음 유도되고 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절가능한 프로모터"로서 지칭된다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.
프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 전형적으로 결합되고 업스트림 (5' 방향) 연장하여 배경 위 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함한다. 프로모터 서열 내에서 (예를 들어, 뉴클레아제 S1과의 맵핑에 의해 편리하게 정의된) 전사 개시 부위, 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (공통 서열)이 발견될 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용과 사용될 수 있는 프로모터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, "예방성"은 질환 또는 병태의 발병을 예방하기 위해, 또는 질환 또는 병태와 연관된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 사용된 치료적 또는 작용 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, "예방"은 건강을 유지하고 질환 또는 병태의 발병을 예방하기 위해, 질환 또는 병태와 연관된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 취해진 조치를 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"은 코딩 영역의 업스트림 (5' 비-코딩 서열), 이내에, 다운스트림 (3' 비-코딩 서열) 위치된 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 이는 연관된 코딩 영역의 전사, RNA 처리, 안정성, 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 효과기 결합 부위, 또는 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현을 위하여 의도되면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 코딩 서열에 대해 3' 위치될 것이다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 (예를 들면, 하나 이상의 miR-485 결합 부위를 포함하는 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)는 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 연관된 프로모터 및/또는 기타 발현 (예를 들면, 전사) 대조군 요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 연관에서 유전자 산물을 위한 코딩 영역은 유전자 산물의 발현을 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 배치하는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 연관된다. 예를 들어, 코딩 영역 및 프로모터는 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 암호화된 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 초래하면, 그리고 프로모터와 코딩 영역 사이 연결의 성격이 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않으면 "작동가능하게 연관된"다. 프로모터 외에, 다른 발현 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호는 유전자 산물 발현을 지시하기 위해 코딩 영역과 작동가능하게 또한 연관될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "유사성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들면 폴리뉴클레오티드 분자 (예를 들면 miRNA 분자) 사이 전반적 관련성을 지칭한다. 서로에 대한 중합체성 분자의 퍼센트 유사성의 계산은, 퍼센트 유사성의 계산이 당업계에서 이해되는 대로 보존적 치환을 고려하는 것을 제외하고, 퍼센트 동일성의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 유사성의 백분율이 사용된 비교 척도, 즉, 예를 들면, 그들의 진화적 근접성, 전하, 부피, 유연성, 극성, 소수성, 방향성, 등전점, 항원성, 또는 이들의 조합에 따라 핵산이 비교되는 여부에 의존적임이 이해된다.
용어 "대상체", "환자", "개체", 및 "숙주", 및 이들의 변형은 본원에 교환가능하게 사용되고 제한 없이, 인간, 가축 (예를 들면, 개, 고양이 및 기타 등등), 농장 동물 (예를 들면, 소, 양, 돼지, 말 및 기타 등등), 및 진단, 치료, 또는 요법이 요구되는 실험실 동물 (예를 들면, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 기니 피그 및 기타 등등)을 포함하는 임의의 포유류 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 본원에 기재된 방법은 인간 요법 및 수의학적 응용에 모두 적용가능하다.
본원에 사용된 경우에, 어구 "치료를 필요로 하는 대상체"는, 예를 들면, PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 수준을 증가시키기 위해; 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 수준을 증가시키기 위해; 및/또는 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자의 수준을 감소시키기 위해 본 개시내용의 miRNA 억제제 (예를 들면, miR-485 억제제)의 투여로부터 이익을 얻을 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "치료적 유효량"은 치료를 필요로 하는 대상체에서 원하는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생산하는데 충분한 본 개시내용의 miRNA 억제제를 포함하는 시약 또는 약학적 화합물의 양이다. 치료적 유효량은 예방이 요법으로 간주될 수 있기 때문에 "예방성 유효량"일 수 있다.
용어 "치료하다", "치료", 또는 "치료하기"는, 본원에 사용된 경우에, 예를 들면, 질환 또는 병태의 중증도에서의 저감; 질환 과정의 지속기간에서의 저감; 질환 또는 병태 (예를 들면, 당뇨병)와 연관된 하나 이상의 증상의 호전 또는 제거; 질환 또는 병태를 반드시 치유하지 않고, 질환 또는 병태를 가진 대상체에게 유익한 효과의 제공을 지칭한다. 용어는 또한 이들의 질환 또는 병태 또는 이들의 증상의 예방 또는 방지를 포함한다.
용어 "업스트림"은 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 5' 위치되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
"벡터"는 숙주 세포에 핵산의 클로닝 및/또는 전달을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 또 다른 핵산 세그먼트가 부착될 세그먼트의 복제를 일으키기 위해 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체내 자율 복제 단위체로서 기능하는, 즉, 이의 자체 제어 하에서 복제할 수 있는 임의의 유전적 요소 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에 핵산을 도입하기 위하여 바이러스성 및 비바이러스성 비히클을 모두 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스, 또는 변형된 박테리아성 바이러스를 포함하는 다수의 벡터는 알려지고 당업계에서 사용된다. 적합한 벡터에 폴리뉴클레오티드의 삽입은 상보적 응집 말단을 갖는 선정된 벡터에 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 결찰시킴으로써 성취될 수 있다.
벡터는 벡터를 포함한 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택가능한 마커 또는 리포터를 암호화하도록 조작될 수 있다. 선택가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에서 함유된 기타 코딩 영역을 포함 및 발현시키는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 허용한다. 당업계에서 알려지고 사용된 선택가능한 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 바이알라포스 제초제, 술폰아미드, 및 기타 등등에 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자, 및 기타 등등을 포함한다. 당업계에서 알려지고 사용된 리포터의 예는 루시퍼라제 (Luc), 녹색 형광성 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), β-갈락토시다제 (LacZ), β-글루쿠로니다제 (Gus), 및 기타 등등을 포함한다. 선택가능한 마커는 리포터인 것으로 또한 간주될 수 있다.
용어 "근긴장이상"은 사람의 근육이 제어할 수 없이 수축하는 운동 장애 또는 그 증상을 지칭한다. 수축은 영향을 받은 신체 부위가 비자발적으로 뒤틀리게 하고 반복적인 움직임이나 비정상적인 자세를 초래하고 이는 하나의 근육, 하나 이상의 근육군 또는 전신에 영향을 미칠 수 있다. 본원에서 지칭되는 근긴장이상은 특발성 근긴장이상, 유전적으로 연관된 근긴장이상 및/또는 후천성 근긴장이상을 포함할 수 있다. 본원에서 지칭되는 근긴장이상은 전신 근긴장이상(예를 들면, 신체의 대부분 또는 전부에 영향을 미침), 국소 근긴장이상(예를 들면, 신체의 특정 부분에 국한됨), 다발성 근긴장이상(예를 들면, 2개 이상의 관련되지 않은 신체 부위를 포함함), 분절성 근긴장이상(예를 들면, 신체의 2개 이상의 인접한 부분에 영향을 미침), 및/또는 반근긴장이상(예를 들면, 신체의 같은 쪽에 있는 팔과 다리에 영향을 미침)을 포함한다. 근긴장이상증의 비제한적 예는 안검경련, 경부 근긴장이상(연축사경), 도파-반응성 근긴장이상, 약물 유도 근긴장이상(지발성 운동이상증), 기능성 근긴장이상, 전신 근긴장이상, 손 근긴장이상(서경), 하지 근긴장이상, 음악가 근긴장이상, 근간대 근긴장이상, 신경학적 또는 대사성 장애와 연관된 근긴장이상, 경구하악 근긴장이상(두개골 근긴장이상), 두개경수 근긴장이상, 상완 근긴장이상, 발작성 운동이상증, 소아 근긴장이상, 경련성 발성장애(후두 근긴장이상), 급속 발병성 근긴장이상-파킨슨증, 독소 유도 근긴장이상, 외상 유도 근긴장이상, x-연관 근긴장이상-파킨슨증을 포함한다.
용어 "신경정신 질환"은 기분, 인지, 행동, 사고 변화, 감각 변화(예를 들면, 특히 후각 변화) 및/또는 수면 장애에 영향을 미치는 하나 이상의 장애 또는 이의 증상을 지칭한다. 신경정신 질환의 비제한적 예는 조현병, 우울증, 자폐증, 발작, 주의력 결핍/과잉 행동 장애, 뚜렛 장애, 인지 결핍 장애, 중풍, 제어되지 않는 분노, 편두통, 섭식 장애(예를 들면, 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증), 우울증, 불안 장애(예를 들면, 외상 후 스트레스 장애) 또는 이들의 조합을 포함한다. 이의 증상의 비제한적 예는 뇌 기능, 감정, 기분, 집중 및/또는 학습 문제, 슬픔, 짜증, 기억력 문제, 기분 문제 및/또는 우울증에 영향을 미치는 증상을 포함한다.
용어 "지적 장애"는 많은 일상적인 사회적 및 실용적인 기술을 포함하는 지적 기능과 적응 행동 모두에서 유의미한 제한을 특징으로 하는 장애 또는 이의 증상을 지칭한다. 지적 기능의 유의미한 제한에는 학습, 추론 및/또는 문제 해결을 위한 감소된 일반적인 정신 능력이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 적응 행동의 유의미한 제한에는 개념적 기술(예를 들면, 언어 및 문해력, 돈, 시간, 숫자 개념 및 자기 지시), 사회적 기술(예를 들면, 대인 관계 기술, 사회적 책임, 자존감, 잘 속기 쉬움, 순진함, 사회적 문제 해결, 규칙/법을 준수하고 피해를 입지 않는 능력) 및/또는 실용적인 기술(예를 들면, 일상 생활 활동, 직업 기술, 건강 관리, 일정/일과, 안전)에 대한 감소된 능력이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 지적 장애의 비제한적 예는 X 결함증후군, 다운 증후군, 프래더-윌리 증후군(PWS), 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD) 및 이들의 조합을 포함한다.
용어 "중독"은 부정적인 결과에도 불구하고 하나 이상의 물질의 강박적인 사용을 지칭한다. 중독은 종종 뇌 회로, 유전학, 환경 및 개체의 삶의 경험 간의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 중독은 물질 남용 또는 강박적인 행동에 참여하는 것으로 나타날 수 있으며 유해한 결과에도 불구하고 종종 지속된다. 중독은 화학적이거나 행동적일 수 있다. 가장 일반적으로 중독성 물질에는 알코올, 오피오이드, 대마초, 니코틴, 암페타민, 코카인 및 메탐페타민이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
II. 사용 방법
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성을 조절함으로써 치료 효과(예를 들면, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독을 앓고 있는 대상체에서)를 발휘할 수 있다. 본원에서 설명된 대로, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD95, 시냅토파이신, 카스파제-3 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유전자의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있다.
PSD95 조절
일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제하는 화합물(즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성을 억제하는 것은 대상체에서 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 발현을 증가시킨다.
시냅스 후 밀도 단백질 95 (PSD95)은 인간에서 DLG4 유전자(Disks large homolog 4)에 의해 암호화되는 단백질이다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "PSD95 유전자" 및 "DLG4 유전자"는 본원에서 교환가능하게 사용된다. DLG4 유전자는 인간의 염색체 17에 위치한다(GenBank Accession Number NC_000017.11의 뉴클레오티드 7,187,180 내지 7,220,050, 마이너스 가닥 배향). PSD95 유전자의 동의어 및 이의 암호화된 단백질은 공지되어 있으며 "디스크 라지 MAGUK 스캐폴드 단백질 4", "DLG4", "MRD62", "시냅스-연관 단백질 90", "SAP90", "SAP-90", "텍스 상호작용 단백질 15", "디스크 라지 동족체 4" 및 "PSD-95"를 포함한다.
인간 PSD95(예를 들면, DLG4) 단백질의 적어도 세 가지 알려진 이소형이 있으며, 대체 스플라이싱으로 이내 발생한다. PSD95 이소형 1(유니프로트 식별자: P78352-1; PSD95-알파로도 알려짐)은 724개의 아미노산으로 구성되며 표준 서열(서열번호: 116)로 선택되었다. PSD95 이소형 2("PSD95-베타"로도 알려짐)(유니프로트 식별자: P78352-2)는 767개의 아미노산으로 구성되며 다음과 같은 표준 서열과 상이하다: 1-10: MDCLCIVTTK　→ MSQRPRAPRSALWLLAPPLLRWAPPLLTVLHSDLFQALLDILDYYEASLSESQ (서열번호: 117). PSD95 이소형 3(유니프로트 식별자: P78352-3)은 721개의 아미노산으로 구성되며 다음과 같이 표준 서열과 상이하다: 51-53: 누락(서열번호: 118). 하기 표 1은 3개의 PSD95 이소형에 대한 서열을 제공한다.
표 1. PSD95 단백질 이소형
본원에 사용된 경우에, 용어 "PSD95"는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 PSD95의 임의의 변이체 또는 이소형을 포함한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD95 이소형 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD95 이소형 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD95 이소형 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD95 이소형 1 및 PSD95 이소형 2 및/또는 PSD95 이소형 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 이소형 1, 이소형 2 및 이소형 3은 본원에서 집합적으로 "PSD95"로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 발현을 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체의 수준)과 비교하여 적어도 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배 이상 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 저감시킴으로써 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 발현을 증가시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 저감시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 miR-485-3p 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 만큼 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 miR-485-5p 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 만큼 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 miR-485-3p 및 miR-485-5p 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 만큼 miR-485-3p 및 miR-485-5p 모두의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다. 일부 양태에서, miR-485-3p 및/또는 miR-485-5p의 발현은 miR-485 억제제의 투여 후 완전히 억제된다.
본원에서 설명된 대로, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 대상체에게 투여될 때 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 필요로 하는 대상체에서 비정상적인(예를 들면, 저감된) 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 방법은 miR-485 활성을 억제하는 화합물(즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 miR-485 억제제는 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 수준을 증가시킨다.
시냅토파이신 조절
본원에 제공된 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애(예를 들면, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애, 및/또는 중독)을 앓고 있는 대상체에서 시냅토파이신의 발현을 추가로 조절 할 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제하는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성을 억제하는 것은 대상체에서 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 증가시킨다.
시냅토파이신은 인간에서 SYP 유전자(본원에서 "시냅토파이신 유전자" 라고도 지칭됨)에 의해 암호화되는 단백질이다. SYP 유전자는 인간의 염색체 X에 위치한다(뉴클레오타이드 49,187,804 내지 49,200,259, 마이너스 가닥 배향). SYP 유전자의 동의어 및 이의 암호화된 단백질은 공지되어 있으며 "주요 시냅스 소포 단백질 p38", "SYPH", "MRX96" 및 "MRXSYP"를 포함한다.
인간 시냅토파이신 단백질의 알려진 이소형은 적어도 두 가지가 있으며, 대체 스플라이싱의 결과이다. 시냅토파이신 이소형 1(유니프로트 식별자: P08247-1)은 313개의 아미노산으로 구성되며 표준 서열(서열번호: 119)로 선택되었다. 시냅토파이신 이소형 2(유니프로트 식별자: P08247-2)는 195개의 아미노산으로 구성되며 다음과 같이 표준 서열과 상이하다: 1-118 누락(서열번호: 120). 하기 표 2는 2개의 시냅토파이신 이소형에 대한 서열을 제공한다.
표 2. 시냅토파이신 이소형
본원에 사용된 경우에, 용어 "시냅토파이신"은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 시냅토파이신의 임의의 변이체 또는 이소형을 포함한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 시냅토파이신 이소형 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 시냅토파이신 이소형 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 시냅토파이신 이소형 1 및 이소형 2 모두의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 이소형 1 및 이소형 2 모두 본원에서 집합적으로 "시냅토파이신"으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)과 비교하여 적어도 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배 이상으로 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면 , miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 저감시킴으로써 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 증가시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR- 485 억제제는 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 저감시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 참조(예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 miR-485-3p 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100% 감소시킨다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 참조(예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 miR-485-5p 발현)를 기준으로 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100% 감소시킨다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485-3p 및 miR-485-5p 모두의 발현 및/또는 활성을 참조를 기준으로 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100% 감소시킨다(예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 miR-485-3p 및 miR-485-5p 발현). 일부 양태에서, miR-485-3p 및/또는 miR-485-5p의 발현은 miR-485 억제제의 투여 후에 완전히 억제된다.
본원에서 설명된 대로, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 대상체에게 투여될 때 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 필요로 하는 대상체에서 비정상적인(예를 들면, 저감된) 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관된 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 방법은 miR-485 활성을 억제하는 화합물(즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 miR-485 억제제는 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 수준을 증가시킨다.
카스파제 3 조절
본원에 제공된 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가 또한, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서의 절단된 카스파제 3의 발현을 조절할 수 있음을 입증한다 (예를 들면, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독). 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제하는 화합물(즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 절단된 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성을 억제하는 것은 대상체에서 카스파제 3 단백질(예를 들면, 절단된 카스파제 3) 및/또는 카스파제 3 유전자의 발현을 감소시킨다.
카스파제 3는 인간에서 CASP3 유전자(본원에서 "카스파제 3" 유전자 라고도 지칭됨)에 의해 암호화되는 단백질이다. CASP3 유전자는 염색체 4(GeneBank Accession Number NC_00004.12의 뉴클레오티드 184,627,696 내지 184,649,509, 마이너스 가닥 배향)에 위치한다. CASP3 유전자의 동의어 및 이의 암호화된 단백질은 공지되어 있으며 "카스파제-3", "아포파인", "SREBP 절단 활성 1", "시스테인 프로테아제 CPP32", "단백질 YAMA", "프로카스파제 3", "PART 절단 프로테아제", "CPP32", "SCA-1" 및 "CPP32B"를 포함한다.
277개의 아미노산(서열번호: 121)으로 구성된 인간 카스파제 3(유니프로트 식별자: P42574-1)의 알려진 하나의 이소형이 있다. 하기 표 3은 카스파제 3의 서열을 제공한다.
표 3. 카스파제 3 단백질
본원에 사용된 경우에, 용어 "카스파제 3"은 세포에의해 자연적으로 발현되는 카스파제 3의 임의의 변이체 또는 이소형(예를 들면, 절단된 카스파제 3)을 포함한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 카스파제 3의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 카스파제 3 발현을 감소시킬 수 있고, 따라서 절단된 카스파제 3의 양을 감소시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자 및/또는 절단된 카스파제 3의 수준을 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)에 비하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 감소시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485의 발현 및/또는 활성을 저감시킴으로써 카스파제 3 단백질 및 또는 카스파제 3 유전자의 발현을 감소시킨다. miR-485에는 miR-485-3p 및 miR-485-5p의 두 가지 성숙한 형태가 알려져 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 저감시킬 수 있다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 저감시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485-3p 및 miR-485-5p 모두의 발현 및/또는 활성을 저감시킬 수 있다.
본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 다음 중 하나 이상의 비정상적인 수준과 연관된 임의의 질환 또는 병태를 본 개시내용으로 치료할 수 있다: PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자, 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자, 또는 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자. 본원에 사용된 경우에, 용어 "비정상적인 수준"은 본원에 기재된 질환 또는 병태(예를 들면, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독)를 앓지 않는 참조 대상체와 상이한(예를 들면, 증가된 또는 감소된) 수준 (발현 및/또는 활성)을 지칭한다. 일부 양태에서, 비정상적인 수준(예를 들면, PSD95 또는 시냅토파이신)은 참조 대상체의 상응하는 수준과 비교하여 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 95%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 감소된 수준을 지칭한다(예를 들어, 본원에 기재된 질병 또는 병태를 앓지 않는 대상체). 일부 양태에서, 비정상적인 수준(예를 들면, 카스파제-3)은 참조 대상체(예를 들면, 본원에 기재된 질환 또는 병태를 앓지 않는 대상체)의 상응하는 수준과 비교하여 적어도 약 0.1배, 적어도 약 0.2배, 적어도 약 0.3배, 적어도 약 0.4배, 적어도 약 0.5배, 적어도 약 0.6배, 적어도 약 0.7배, 적어도 약 0.8배, 적어도 약 0.9배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 적어도 약 750배 또는 적어도 약 1000배 이상으로 증가된 수준을 지칭한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 비정상적인(예를 들면, 저감된) 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자과 연관된 임의의 질환 또는 병태를 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 비정상적인(예를 들면, 저감된) 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관된 임의의 질환 또는 병태를 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 비정상적인(예를 들면, 증가된) 수준의 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자와 연관된 임의의 질환 또는 병태를 치료하는데 유용할 수 있다.
일부 양태에서, 비정상적인 수준의 이러한 단백질 및/또는 유전자와 연관된 질환 또는 병태는 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독을 포함한다. 특정 양태에서, 질환 또는 병태는 근긴장이상을 포함한다. 일부 양태에서, 근긴장이상은 저감된 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 근긴장이상은 저감된 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 근긴장이상은 증가된 수준의 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3과 연관이 있다. 이러한 장애의 비제한적 예는 안검경련, 경부 근긴장이상(연축사경), 도파-반응성 근긴장이상, 약물 유도 근긴장이상(지발성 운동이상증), 기능성 근긴장이상, 전신 근긴장이상, 손 근긴장이상(서경), 하지 근긴장이상, 음악가 근긴장이상, 근간대 근긴장이상, 신경학적 또는 대사성 장애와 연관된 근긴장이상, 경구하악 근긴장이상(두개골 근긴장이상), 두개경수 근긴장이상, 상완 근긴장이상, 발작성 운동이상증, 소아 근긴장이상, 경련성 발성장애(후두 근긴장이상), 급속 발병성 근긴장이상-파킨슨증, 독소 유도 근긴장이상, 외상 유도 근긴장이상, x-연관 근긴장이상-파킨슨증, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 질환 또는 병태는 신경정신 질환을 포함한다. 특정 양태에서, 신경정신 질환은 저감된 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 신경정신 질환은 저감된 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 신경정신 질환은 증가된 수준의 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자와 연관이 있다. 그러한 질환 또는 병태의 비제한적 예는 조현병, 우울증, 자폐증, 발작, 주의력 결핍/과잉 행동 장애, 뚜렛 장애, 인지 결핍 장애, 중풍, 제어되지 않는 분노, 편두통, 섭식 장애(예를 들면, 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증), 우울증, 불안 장애(예를 들면, 외상 후 스트레스 장애) 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 질환 또는 병태는 지적 장애를 포함한다. 특정 양태에서, 지적 장애는 저감된 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 지적 장애는 저감된 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 지적 장애는 증가된 수준의 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자와 연관이 있다. 본 개시내용의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 일부 양태에서 지적 장애는 지적 기능 및/또는 적응 행동 둘 모두에서의 장애를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 질환 또는 병태는 중독을 포함한다. 특정 양태에서, 중독은 저감된 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 중독은 저감된 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관이 있다. 일부 양태에서, 중독은 증가된 수준의 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자와 연관이 있다. 특정 양태에서, 중독은 화학적 중독(예를 들면, 물질 남용)을 포함한다. 일부 양태에서, 중독은 행동 중독을 포함한다. 추가 양태에서, 중독은 화학적 중독 및 행동 중독 모두를 포함한다.
그러므로, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제를 투여하는 것은 비정상적인(예를 들면, 저감된) 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제를 투여하는 것은 비정상적인(예를 들면, 저감된) 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제를 투여하는 것은 비정상적인(예를 들면, 증가된) 수준의 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자와 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제를 투여하는 것은 대상체에서 근긴장이상의 하나 이상의 증상을 참조(예를 들면, miR-485 억제제를 투여를 받지 않은 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 치료한다. 근긴장이상과 연관된 증상의 비제한적 예는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제를 투여하는 것은 대상체에서 신경정신 질환의 하나 이상의 증상을 참조(예를 들면, miR-485 억제제를 투여를 받지 않은 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 치료한다. 신경정신 질환과 연관된 증상의 비제한적 예는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제를 투여하는 것은 대상체에서 지적 장애의 하나 이상의 증상을 참조(예를 들면, miR-485 억제제를 투여를 받지 않은 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 치료한다. 지적 장애와 연관된 증상의 비제한적 예는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제를 투여하는 것은 대상체에서 중독의 하나 이상의 증상을 참조(예를 들면, miR-485 억제제를 투여를 받지 않은 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 치료한다. 일부 양태에서, 중독은 화학적 첨가, 행동 중독 또는 둘 모두이다. 중독과 연관된 증상의 비제한적 예는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 당업계에 공지된 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 비경구, 근육내, 피하, 눈, 정맥내, 복강내, 피내, 안와내, 뇌내, 두개내, 뇌실내, 척수내, 심실내, 척수강내, 수조내, 피막내, 종양내 또는 이들의 임의의 조합으로 투여된다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 뇌실내(ICV) 투여된다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 정맥내 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 추가 치료제 및 miR-485 억제제는 동시에 투여된다. 특정 양태에서, 추가 치료제 및 miR-485 억제제는 순차적으로 투여된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제의 투여는 어떠한 부작용도 초래하지 않는다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 대상체에게 투여될 때 체중에 불리하게 영향을 미치지 않는다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 대상체에게 투여될 때 증가된 사망률을 초래하지 않거나 병리학적 이상을 유발하지 않는다.
III. 본 개시내용에 유용한 miRNA-485 억제제
miR-485 활성을 억제시킬 수 있는 화합물 (miR-485 억제제)이 본원에 개시된다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 적어도 하나의 miR-485 결합 부위를 포함하는 뉴클레오티드 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 분자는 단백질을 암호화하지 않는다. 본원에 기재된 경우에, 일부 양태에서, miR-485 결합 부위는 표적 miRNA 핵산 서열 (즉, miR-485)에 적어도 부분적으로 상보적이어서, miR-485 억제제는 miR-485 핵산 서열에 하이브리드화한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR 억제제의 miR-485 결합 부위는 miR-485의 핵산 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 상보성을 갖는다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485의 핵산 서열에 완전히 상보적이다.
miR-485 헤어핀 전구체는 miR-485-5p 및 miR-485-3p 모두를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 "miR-485"는 달리 특정되지 않는 한 miR-485-5p 및 miR-485-3p 모두를 포괄한다. 인간 성숙한 miR-485-3p는 서열 5'- GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU-3' (서열번호: 1; miRBase 수탁 번호 MIMAT0002176)를 갖는다. miR-485-3p 5'-UCAUACA-3' (서열번호: 49)의 5' 말단 하위서열은 씨드 서열이다. 인간 성숙한 miR-485-5p는 서열 5'-AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC-3' (서열번호: 33; miRBase 수탁 번호 MIMAT0002175)를 갖는다. miR-485-5p 5'-GAGGCUG-3' (서열번호: 50)의 5' 말단 하위서열은 씨드 서열이다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 인간 성숙한 miR-485-3p는 다른 종의 것에 유의미한 서열 유사성을 갖는다. 가령, 마우스 성숙한 miR-485-3p는 5'- 및 3'- 말단의 각각에서 단일 아미노산에 의해 인간 성숙한 miR-485-3p와 상이하다 (즉, 5'-말단에서 잉여 "A" 및 3'-말단에서 누락 "C"를 갖는다). 마우스 성숙한 miR-485-3p는 다음의 서열: 5'-AGUCAUACACGGCUCUCCUCUC-3' (서열번호: 34; miRBase 수탁 번호 MIMAT0003129; 밑줄친 부문은 인간 성숙한 miR-485-3p와 중복에 상응하는함)을 갖는다. 마우스 성숙한 miR-485-5p에 대한 서열은 인간의 것과 동일하다: 5'-agaggcuggccgugaugaauuc-3' (서열번호: 33; miRBase 수탁 번호 MIMAT0003128). 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 인간 및 마우스로부터 miR-485-3p 및/또는 miR-485-5p 모두에 결합할 수 있다.
일부 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485-3p의 서열 (또는 이의 하위서열)에 상보적 (예를 들면, 완전히 상보적)인 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 양태에서, miR-485-3p 하위서열은 씨드 서열을 포함한다. 그러므로, 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 49에서 제시된 핵산 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 상보성을 갖는다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 미스매치들을 제외하고 miR-485-3p에 상보적이다. 추가 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 1에서 제시된 핵산 서열에 완전히 상보적이다.
일부 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485-5p의 서열 (또는 이의 하위서열)에 상보적 (예를 들면, 완전히 상보적)인 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 양태에서, miR-485-5p 하위서열은 씨드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 50에서 제시된 핵산 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 상보성을 갖는다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 미스매치들을 제외하고 miR-485-5p에 상보적이다. 추가 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 35에서 제시된 핵산 서열에 완전히 상보적이다.
miRNA의 씨드 영역은 표적 mRNA와 단단한 이중체를 형성한다. 대부분의 miRNA는 표적 mRNA의 3' 미번역된 영역 (UTR)과 불완전하게 염기-짝짓기하고, miRNA의 5' 근위 "씨드" 영역은 대부분의 짝짓기 특이성을 제공한다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, (씨드 서열을 포괄하는) 처음 9개 miRNA 뉴클레오티드가 더 큰 특이성을 제공하는 반면 이 영역의 miRNA 리보뉴클레오티드 3'이 더 낮은 서열 특이성을 허용하고 그래서 더 높은 정도의 미스매칭된 염기쌍 형성을 용인한다고 믿어지고, 위치 2-7이 가장 중요하다. 그러므로, 본 개시내용의 특이적 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485의 씨드 서열의 전체 길이에 걸쳐 완전히 상보적 (즉, 100% 상보적)인 하위서열을 포함한다.
본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 miRNA 서열 및 miRNA 결합 서열은, 비제한적으로, 본원에 제공된 서열 목록에서 서열들의 전부 또는 한 부문, 뿐만 아니라 miRNA 전구체 서열, 또는 이들 miRNA의 하나 이상의 상보체를 포함한다. 이름으로 특정 miRNA 또는 miRNA 결합 부위를 포함하는 본 개시내용의 임의의 양태는 특정된 miRNA 서열 또는 이의 상보적 서열의 성숙한 서열에 적어도 약 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열이 동일한 miRNA 또는 이의 상보적 서열을 포함하도록 또한 고려된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA 결합 서열은, 변형된 서열이 miR-485에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 한, 본원에 제공된 서열 목록에서 그들 서열의 5', 3', 또는 5' 및 3' 말단 모두에서 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA 결합 서열은, 변형된 서열이 miR-485에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 한, 제공된 서열 목록에서 그들 서열에 관하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 뉴클레오티드에서 상이할 수 있다.
miRNA 결합 분자 또는 miRNA에 관하여 본원에 논의된 임의의 방법 및 조성물이 합성 miRNA 결합 분자에 관하여 구현될 수 있음이 또한 구체적으로 고려된다. 본 개시내용에서 RNA 서열에 관련된 본 개시내용이 상응하는 DNA 서열에 동일하게 적용 가능함이 또한 이해된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA-485 억제제는 뉴클레오티드 서열의 5'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA-485 억제제는 뉴클레오티드 서열의 3'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 약 6 내지 약 30 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 7 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 8 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 9 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 길이가 10 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 11 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 12 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 13 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 14 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 15 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 16 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 길이가 17 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 18 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 19 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 20 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 길이가 21 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 22 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 서열번호: 2 내지 30으로부터 선택된 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 서열번호: 2 내지 30으로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 미스매치들을 임의로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (서열번호: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (서열번호: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (서열번호: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 14) 또는 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 15)를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGAC-3' (서열번호: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (서열번호: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (서열번호: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28) 또는 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29)를 갖는다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-TGTATGA-3' (서열번호: 62), 5'-GTGTATGA-3' (서열번호: 63), 5'-CGTGTATGA-3' (서열번호: 64), 5'-CCGTGTATGA-3' (서열번호: 65), 5'-GCCGTGTATGA-3' (서열번호: 66), 5'-AGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 67), 5'-GAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 68), 5'-AGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 69), 5'-GAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 70), 5'-GGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 71), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 72), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 73), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 74), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 75); 5'-TGTATGAC-3' (서열번호: 76), 5'-GTGTATGAC-3' (서열번호: 77), 5'-CGTGTATGAC-3' (서열번호: 78), 5'-CCGTGTATGAC-3' (서열번호: 79), 5'-GCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 80), 5'-AGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 81), 5'-GAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 82), 5'-AGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 83), 5'-GAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 84), 5'-GGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 85), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 86), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 87), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 89); 및 AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC (서열번호: 90)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제)는 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 90% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 1개 치환 또는 2개 치환을 가진 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함한다. 특정 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'- AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30)를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 적어도 5개 추가의 핵산, C 말단에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개 추가의 핵산, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 1개 추가의 핵산 및/또는 C 말단에서 1개 추가의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 1 또는 2개 추가의 핵산 및/또는 C 말단에서 1 또는 2개 추가의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 1 내지 3개 추가의 핵산 및/또는 C 말단에서 1 내지 3개 추가의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29)를 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 1개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 적어도 2개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 3개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 4개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 5개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 6개 이상의 miR-485 결합 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 동일하다. 일부 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 상이하다. 일부 양태에서, miR-485 결합 부위 중 적어도 하나는 상이하다. 일부 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 miR-485-3p 결합 부위이다. 다른 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 miR-485-5p 결합 부위이다. 추가 양태에서, miR-485 억제제는 적어도 하나의 miR-485-3p 결합 부위 및 적어도 하나의 miR-485-5p 결합 부위를 포함한다.
III.a. 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드가 화학적으로 변형되는 경우 폴리뉴클레오티드는 "변형된 폴리뉴클레오티드"로서 지칭될 수 있다.
"뉴클레오시드"는 유기 염기 (예를 들면, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 이의 유도체 (본원에 "핵염기"로서 또한 지칭됨)와 조합으로 당 분자 (예를 들면, 펜토스 또는 리보스) 또는 이의 유도체를 함유하는 화합물을 지칭한다. "뉴클레오티드"는 포스페이트 기를 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 비-천연 뉴클레오시드를 포함하기 위해 임의의 유용한 방법으로, 예컨대, 예를 들어, 화학적으로, 효소적으로, 또는 재조합으로 합성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 결합된 뉴클레오시드의 한 영역 또는 영역들을 포함할 수 있다. 그러한 영역은 가변 백본 연결을 가질 수 있다. 연결은 표준 포스포디에스테르 연결일 수 있고, 이 경우에 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 영역을 포함할 것이다.
본원에 개시된 변형된 폴리뉴클레오티드는 다양한 별개 변형을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는 1, 2개, 또는 그 이상의 (임의로 상이한) 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 변형을 함유한다. 일부 양태에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는, 미변형된 폴리뉴클레오티드에 비교된 경우, 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들면, 개선된 열적 또는 화학적 안정성, 저감된 면역원성, 저감된 분해, 표적 마이크로RNA에 대한 증가된 결합, 다른 마이크로RNA 또는 다른 분자에 대한 저감된 비-특이적 결합을 나타낼 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 화학적으로 변형된다. 본원에 사용된 경우에, 폴리뉴클레오티드에 관하여, 용어 "화학적 변형" 또는, 적절한 경우, "화학적으로 변형된"은, 비제한적으로, 이의 핵염기, 당, 백본, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그들의 위치, 패턴, 퍼센트 또는 집단 중 하나 이상에서 아데노신 (A), 구아노신 (G), 우리딘 (U), 티미딘 (T) 또는 시티딘 (C) 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오시드에 관한 변형을 지칭한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 동일한 뉴클레오시드 유형의 전부 또는 임의의 것의 균일한 화학적 변형 또는 동일한 뉴클레오시드 유형의 전부 또는 임의의 것에서 동일한 시작 변형의 하향 적정에 의해 생산된 변형의 집단, 또는 무작위 편입만을 가진 동일한 뉴클레오시드 유형의 모든 임의의 것의 화학적 변형의 측정된 퍼센트를 가질 수 있다 추가 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 전체 폴리뉴클레오티드에 걸쳐 동일한 뉴클레오시드 유형의 2, 3, 또는 4개의 균일한 화학적 변형을 가질 수 있다 (예컨대 모든 우리딘 및/또는 모든 시티딘, 등은 동일한 식으로 변형된다).
변형된 뉴클레오티드 염기쌍 형성은 표준 아데닌-티민, 아데닌-우라실, 또는 구아닌-시토신 염기 쌍, 뿐만 아니라 비-표준 또는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드 사이 형성된 염기 쌍을 포괄하고, 여기서 수소 결합 주개 및 수소 결합 받개의 배열은 비-표준 염기와 표준 염기 사이 또는 2개의 상보적 비-표준 염기 구조 사이 수소 결합을 허용한다. 그러한 비-표준 염기쌍 형성의 하나의 예는 변형된 핵염기 이노신과 아데닌, 시토신 또는 우라실 사이 염기 염기쌍 형성이다. 염기/당 또는 링커의 임의의 조합은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드에 편입될 수 있다.
숙련된 기술자는, 달리 언급되는 경우를 제외하고, 본원에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열이 대표적 DNA 서열에서 "T"를 인용할 것이지만 서열이 RNA를 나타내는 경우, "T"가 "U"에 대하여 치환될 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 TD는 RNA로서, DNA로서, 또는 RNA 및 DNA 단위체 모두를 포함하는 하이브리드 분자로서 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 적어도 2개 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 20개 또는 그 이상) 변형된 핵염기의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드에서 핵염기, 당, 백본 연결, 또는 이들의 임의의 조합은 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 변형된다.
(i) 염기 변형
특정 양태에서, 화학적 변형은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)에서 핵염기에 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 변형된 우리딘 (예를 들면, 슈도우리딘 (ψ), 2-티오우리딘 (s2U), 1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ), 1-에틸-슈도우리딘 (e1ψ), 또는 5-메톡시-우리딘 (mo5U)), 변형된 시토신 (예를 들면, 5-메틸-시티딘 (m5C)) 변형된 아데노신 (예를 들면, 1-메틸-아데노신 (m1A), N6-메틸-아데노신 (m6A), 또는 2-메틸-아데닌 (m2A)), 변형된 구아노신 (예를 들면, 7-메틸-구아노신 (m7G) 또는 1-메틸-구아노신 (m1G)), 또는 이들의 조합이다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 특정한 변형에 대하여 균일하게 변형된다 (예를 들면, 완전히 변형됨, 전체 서열에 걸쳐 변형됨). 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 서열에서 모든 시토신 잔기가 5-메틸-시티딘 (m5C)으로 대체되는 것을 의미하는, 동일한 유형의 염기 변형, 예를 들면, 5-메틸-시티딘 (m5C)으로 균일하게 변형될 수 있다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드 예컨대 상기 제시된 것들의 임의의 것으로 대체에 의해 서열에서 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대하여 균일하게 변형될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 적어도 2개 (예를 들면, 2, 3, 4개 또는 그 이상)의 변형된 핵염기의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)에서 핵염기의 한 유형의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 변형된 핵염기이다.
(ii) 백본 변형
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)는 뉴클레오시드 사이 임의의 유용한 연결을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물에서 유용한, 백본 변형을 포함하는, 그러한 연결은, 비제한적으로 다음을 포함한다: 3'-알킬렌 포스포네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 알켄 함유 백본, 아미노알킬포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르, 보라노포스페이트, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-, -CH2-NH-CH2-, 키랄 포스포네이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 (메틸이미노), 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본, 모르폴리노 연결, -N(CH3)-CH2-CH2-, 헤테로원자 인터뉴클레오시드 연결을 가진 올리고뉴클레오시드, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 연결, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, PNA, 실록산 백본, 술파메이트 백본, 술피드 술폭시드 및 술폰 백본, 술포네이트 및 술폰아미드 백본, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 티오노포스포르아미데이트.
일부 양태에서, 상기 개시된 백본 연결의 존재는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)의 분해에 대한 안정성 및 내성을 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 백본 연결의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 변형된다 (예를 들면, 이들의 전부는 포스포로티오에이트이다).
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 포함될 수 있는 백본 변형은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO) 및/또는 포스포로티오에이트 (PS) 변형을 포함한다.
(iii) 당 변형
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에 편입될 수 있는 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 핵산의 당에서 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 당 변형은 miR-485 핵산 서열에 miR-485 억제제의 결합의 친화성을 증가시킨다. miR-485 억제제에서 친화성-강화 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 또는 2'-치환된 당을 편입하는 것은 miR-485 억제제의 길이 및/또는 크기를 저감되게 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 뉴클레오티드의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 당 변형 (예를 들면, LNA)을 함유한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 뉴클레오티드 단위체는 당 변형된다 (예를 들면, LNA).
일반적으로, RNA는 당 그룹 리보스를 포함하고, 이는 산소를 갖는 5-원 고리이다. 예시적, 비-제한 변형된 뉴클레오티드는 리보스 내 산소의 대체 (예를 들면, S, Se, 또는 알킬렌, 예컨대 메틸렌 또는 에틸렌을 가진); 이중 결합의 첨가 (예를 들면, 리보스를 사이클로펜틸 또는 사이클로헥세닐로 대체하기 위한); 리보스의 고리 수축 (예를 들면, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리를 형성하기 위한); 리보스의 고리 확장 (예를 들면, 추가의 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6- 또는 7-원 고리를 형성하기 위해, 예컨대 포스포르아미데이트 백본을 또한 갖는 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 모르폴리노에 대하여); 다환형 형태 (예를 들면, 트리사이클로; 및 "비잠금" 형태, 예컨대 글리콜 핵산 (GNA) (예를 들면, R-GNA 또는 S-GNA, 리보스가 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위체에 의해 대체되는 경우), 트레오스 핵산 (TNA, 리보스가 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체되는 경우), 및 펩티드 핵산 (PNA, 2-아미노-에틸-글리신 연결이 리보스 및 포스포디에스테르 백본을 대체하는 경우)을 포함한다. 당 그룹은 리보스내 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학적 구성을 소유하는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있다. 그래서, 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들면, 아라비노스를 당으로서 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
리보스의 2' 하이드록실기 (OH)는 다수의 상이한 치환체로 변형 또는 대체될 수 있다. 2'-위치에서 예시적 치환은, 비제한적으로, H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬; 임의로 치환된 C1-6 알콕시; 임의로 치환된 C6-10 아릴옥시; 임의로 치환된 C3-8 사이클로알킬; 임의로 치환된 C3-8 사이클로알콕시; 임의로 치환된 C6-10 아릴옥시; 임의로 치환된 C6-10 아릴-C1-6 알콕시, 임의로 치환된 C1-12 (헤테로사이클릴)옥시; 당 (예를 들면, 리보스, 펜토스, 또는 본원에 기재된 임의의 것); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, 여기서 R은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고, n은 0 내지 20 (예를 들면, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수임; 예시적 브릿지가 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 아미노 브릿지, 아미노알킬, 아미노알콕시, 아미노, 및 아미노산을 포함하는, 2'-하이드록실이 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4'-탄소에 연결된 "잠금" 핵산 (LNA)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, mir-485 억제제)에서 존재하는 뉴클레오티드 유사체는, 예를 들면, 2'-O-알킬-RNA 단위체, 2'-OMe-RNA 단위체, 2'-O-알킬-SNA, 2'-아미노-DNA 단위체, 2'-플루오로-DNA 단위체, LNA 단위체, 아라비노 핵산 (ANA) 단위체, 2'-플루오로-ANA 단위체, HNA 단위체, INA (인터칼레이팅 핵산) 단위체, 2'MOE 단위체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, LNA는, 예를 들면, 옥시-LNA (예컨대 베타-D-옥시-LNA, 또는 알파-L-옥시-LNA), 아미노-LNA (예컨대 베타-D-아미노-LNA 또는 알파-L-아미노-LNA), 티오-LNA (예컨대 베타-D-티오0-LNA 또는 알파-L-티오-LNA), ENA (그와 같은 베타-D-ENA 또는 알파-L-ENA), 또는 이들의 임의의 조합이다. 추가 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 포함될 수 있는 뉴클레오티드 유사체는 잠금 핵산 (LNA), 비잠금 핵산 (UNA), 아라비노 핵산 (ABA), 브릿징된 핵산 (BNA), 및/또는 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)는 변형된 RNA 뉴클레오티드 유사체 (예를 들면, LNA) 및 DNA 단위체 모두를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 갭머이다. 예를 들면, 미국 특허 번호 8,404,649; 8,580,756; 8,163,708; 9,034,837, 참조한다; 이들의 모두는 그 전체가 참조로 본원에 편입된다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 마이크로미르이다. 미국 특허 출원 공개 번호 US20180201928 참조한다, 이 전체가 참조로 본원에 편입된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)는 엔도- 및 엑소-뉴클레아제에 의한 신속한 분해를 예방하기 위해 변형을 포함할 수 있다. 변형은, 비제한적으로, 예를 들어, (a) 말단 변형, 예를 들면, 5' 말단 변형 (인산화, 탈인산화, 접합, 역위 연결, 등), 3' 말단 변형 (접합, DNA 뉴클레오티드, 역위 연결, 등), (b) 염기 변형, 예를 들면, 변형된 염기, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 형성하는 염기, 또는 접합된 염기로의 대체, (c) 당 변형 (예를 들면, 2' 위치 또는 4' 위치에서) 또는 당의 대체, 뿐만 아니라 (d) 포스포디에스테르 연결의 변형 또는 대체를 포함하는, 인터뉴클레오시드 연결 변형을 포함한다.
IV. 벡터 및 전달 시스템
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, 예를 들면, 당업계에서 알려진 임의의 관련한 전달 시스템을 사용하여, 비정상적인 (예를 들면, 저감된) 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, 예를 들면, 당업계에서 알려진 임의의 관련한 전달 시스템을 사용하여, 비정상적인 (예를 들면, 저감된) 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, 예를 들면, 당업계에서 알려진 임의의 관련한 전달 시스템을 사용하여, 비정상적인 (예를 들면, 증가된) 수준의 카스파제 3 단백질 및/또는 카스파제 3 유전자와 연관된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 전달 시스템은 벡터이다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터다. 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 이들의 임의의 조합의 혈청형을 갖는 AAV이다. 일부 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 3세대 아데노바이러스 벡터다. ADEASY™은 아데노바이러스 벡터 작제물의 단연 가장 대중적 창출 방법이다. 시스템은 2개 유형의 플라스미드: 셔틀 (또는 전달) 벡터 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진다. 관심있는 이식유전자는 셔틀 벡터에 클로닝되고, 검증되고, 제한 효소 PmeI로 선형화된다. 이 작제물은 그 다음, PADEASY™을 함유하는 BJ5183 E. 콜리 세포인, ADEASIER-1 세포로 형질전환된다. PADEASY™은 바이러스 생산에 필요한 아데노바이러스성 유전자를 함유하는 ~33Kb 아데노바이러스성 플라스미드이다. 셔틀 벡터 및 아데노바이러스성 플라스미드는 아데노바이러스성 플라스미드로의 이식유전자의 상동 재조합을 촉진하는 매칭 좌우 상동성 아암을 갖는다. 초나선 PADEASY™ 및 셔틀 벡터로 표준 BJ5183을 또한 공-형질전환시킬 수 있지만, 이 방법은 비-재조합 아데노바이러스성 플라스미드의 더 높은 배경을 초래한다. 재조합 아데노바이러스성 플라스미드는 그 다음 크기 및 적절한 제한 소화 패턴에 대하여 검증되어 이식유전자가 아데노바이러스성 플라스미드에 삽입되고 재조합의 다른 패턴이 발생하지 않았음을 결정한다. 일단 검증되면, 재조합 플라스미드는 PacI로 선형화되어 ITR에 의해 측접된 선형 dsDNA 작제물을 창출한다. 293개 또는 911개 세포는 선형화된 작제물로 형질감염되고, 바이러스는 약 7-10 일 후에 수확될 수 있다. 이 방법 이외에도, 본 출원이 제출된 당시에 당업계에서 알려진 아데노바이러스 벡터 작제물을 창출하는 다른 방법은 본원에 개시된 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에서,바이러스 벡터는 레트로바이러스성 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스성 벡터 (예를 들면, 3세대 또는 4세대 렌티바이러스성 벡터)이다. 렌티바이러스성 벡터는 세포주가 3개 별도 플라스미드 발현 시스템으로 형질감염되는 일시적 형질감염 시스템에서 보통 창출된다. 이들은 전달 벡터 플라스미드 (HIV 프로바이러스의 부문들), 패키징 플라스미드 또는 작제물, 및 상이한 바이러스의 이종 엔벨로프 유전자 (env)를 가진 플라스미드를 포함한다. 벡터의 3개 플라스미드 구성요소는 패키징 세포에 넣어지고 이는 그 다음 HIV 껍질에 삽입된다. 벡터의 바이러스 부문은 바이러스가 세포 시스템 내부에서 복제할 수 없도록 삽입 서열을 함유한다. 현행 3세대 렌티바이러스성 벡터는 9개 HIV-1 단백질 중 단 3개 (Gag, Pol, Rev)를 암호화하고, 이는 별도 플라스미드로부터 발현되어 복제-유능 바이러스의 재조합-매개된 생성을 회피한다. 4세대 렌티바이러스성 벡터에서, 레트로바이러스성 게놈은 추가로 저감되었다 (예를 들면, TAKARA® LENTI-X™ 4세대 패키징 시스템 참조).
당업계에서 알려진 임의의 AAV 벡터는 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. AAV 벡터는 알려진 벡터를 포함할 수 있거나 변이체, 단편, 또는 이의 융합체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV 유형 1 (AAV1), AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 솟과 AAV, 새우 AAV, 뱀 AAV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AAV, 뱀 AAV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 AAV 벡터에서 유래된다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AAV, 뱀 AAV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 2개 AAV 벡터에서 유래된 키메라 벡터이다.
특정 양태에서, AAV 벡터는 당업계에서 알려진 적어도 2개 상이한 AAV 벡터의 영역을 포함한다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 제1 AAV (예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AAV, 뱀 AAV, 또는 이들의 임의의 유도체)로부터 역위 말단 반복부 및 제2 AAV (예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AAV, 뱀 AAV, 또는 이들의 임의의 유도체)로부터 제2 역위 말단 반복부를 포함한다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AAV, 뱀 AAV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 AAV 벡터의 한 부문을 포함한다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV2를 포함한다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 스플라이스 수용자 부위를 포함한다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 프로모터를 포함한다. 당업계에서 알려진 임의의 프로모터는 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터는 RNA Pol III 프로모터이다. 일부 양태에서, RNA Pol III 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, 7SK 프로모터, 5S 프로모터, 아데노바이러스 2 (Ad2) VAI 프로모터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터는 거대세포바이러스 최초 유전자 (CMV) 프로모터, EF1a 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 프로모터, Ubc 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, TEF 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, 또는 Ubi 프로모터이다. 특적 양태에서, 프로모터는 U6 프로모터를 포함한다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 구성적으로 활성 프로모터 (구성적 프로모터)를 포함한다. 일부 양태에서, 구성적 프로모터는 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터, 거대세포바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 (예를 들면, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 라우스 육종 바이러스, 레트로바이러스 긴 말단 반복부 (LTR), 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 양태에서, 유도성 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 특정 양태에서, 조직 특이적 프로모터는 뉴런, 아교 세포, 또는 양쪽 뉴런 및 아교 세포에서 AAV 벡터의 코딩 영역의 전사를 구동시킨다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인핸서는 본원에 개시된 프로모터와 함께 또는 AAV 단독으로 존재한다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 전달 제제와 투여된다. 사용될 수 있는 전달 제제의 비제한적 예는 리피도이드, 리포솜, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체성 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브, 미셀, 또는 접합체를 포함한다.
그래서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제) 및 전달 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 전달 제제는 하기를 포함하는 양이온성 담체 단위체를 포함한다.
[WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (화학식 I)
또는
[WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (화학식 II)
여기서
WP는 수용성 생체고분자 모이어티이고;
CC는 양으로 하전된 담체 모이어티이고;
AM은 보조제 모이어티이고;
L1 및 L2는 독립적으로 임의적 링커이고,
여기서 약 1:1의 이온성 비로 핵산과 혼합된 경우, 양이온성 담체 단위체는 미셀을 형성한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제)를 포함하는 조성물은 이온성 결합을 통해 양이온성 담체 단위체와 상호작용한다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린 ("POZ") 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리글리세롤, 또는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG")을 포함한다. 일부 양태에서, 수용성 중합체는 다음을 포함한다:
, (화학식 III),
여기서 n은 1-1000이다.
일부 양태에서, n은 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 또는 적어도 약 141이다. 일부 양태에서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160이다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 선형, 분지형, 또는 수지상이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 하나 이상의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 또는 적어도 50개의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 30 내지 약 50개 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 40개의 라이신 단량체를 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 면역 반응, 염증성 반응, 및/또는 조직 미세환경을 조정할 수 있다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 하기를 포함한다:
, (화학식 IV),
여기서 G1 및 G2의 각각은 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬이거나, G1 및 G2는 함께 방향족 고리를 형성하고, n은 1-10이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 니트로이미다졸을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 아미노산을 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 하기를 포함한다
(화학식 V),
여기서 Ar은 또는 이고,
여기서 Z1 및 Z2의 각각은 H 또는 OH이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 비타민을 포함한다. 일부 양태에서, 비타민은 환식 고리 또는 환식 헤테로 원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함한다. 일부 양태에서, 비타민은 하기를 포함한다:
(화학식 VI),
여기서 Y1 및 Y2의 각각은 C, N, O, 또는 S이고, n은 1 또는 2이다.
일부 양태에서, 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 M, 비타민 H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 비타민은 비타민 B3이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개의 비타민 B3을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 약 10개의 비타민 B3을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 약 120 내지 약 130개의 PEG 단위체를 가진 수용성 생체고분자 모이어티, 약 30 내지 약 40개의 라이신을 가진 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10개의 비타민 B3을 가진 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 (i) 약 100 내지 약 200개의 PEG 단위체를 가진 수용성 생체고분자 모이어티, (ii) 아민기를 가진 약 30 내지 약 40개 라이신 (예를 들면, 약 32개의 라이신), (iii) 티올기를 각각 갖는 약 15 내지 20개의 라이신 (예를 들면, 티올기를 각각 가진 약 16개의 라이신), 및 (iv) 비타민 B3에 융합된 약 30 내지 40개의 라이신 (예를 들면, 비타민 B3에 각각 융합된 약 32개의 라이신)을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 추가로 수용성 중합체에 결합된 표적화 모이어티, 예를 들면, LAT1 표적화 리간드, 예를 들면, 페닐알라닌을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물에서 티올기는 디술피드 결합을 형성한다.
일부 양태에서, 조성물은 (1) (i) 약 100 내지 약 200개의 PEG 단위체, (ii) 아민기를 가진 약 30 내지 약 40개의 라이신 (예를 들면, 약 32개의 라이신), (iii) 티올기를 각각 갖는 약 15 내지 20개의 라이신 (예를 들면, 티올기를 각각 가진 약 16개의 라이신), 및 (iv) 비타민 B3에 융합된 약 30 내지 40개의 라이신 (예를 들면, 비타민 B3에 각각 융합된 약 32개의 라이신)을 포함하는 미셀, 및 (2) miR-485 억제제 (예를 들면, 서열번호: 30)를 포함하고, 여기서 miR-485 억제제는 미셀 내에서 캡슐화된다. 일부 양태에서, 조성물은 추가로 PEG 단위체에 결합된 표적화 모이어티, 예를 들면, LAT1 표적화 리간드, 예를 들면, 페닐알라닌을 포함한다. 일부 양태에서, 미셀에서 티올기는 디술피드 결합을 형성한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제, 예를 들면, 서열번호: 30)를 포함하는 미셀을 제공하고 여기서 miRNA 억제제 및 전달 제제는 서로 연관된다.
일부 양태에서, 연관은 공유 결합, 비-공유 결합, 또는 이온성 결합이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체의 양이온성 담체 모이어티의 양전하는 용액에서 본원에 개시된 miR-485 억제제와 혼합된 경우 미셀을 형성하는데 충분하고, 여기서 용액에서 양이온성 담체 단위체의 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 miR-485 억제제 (또는 억제제를 포함하는 벡터)의 음전하의 전반적 이온성 비는 약 1: 1이다.
일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체의 양전하, 특히 양이온성 담체 모이어티의 전하는 용액에서 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산)와 혼합될 때 미셀을 형성하기에 충분하며, 여기서 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 20:1, 약 19:1, 약 18:1, 약 17:1, 약 16:1, 약 15:1, 약 14:1, 약 13:1, 약 12:1, 약 11:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1, 또는 약 1:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 1:20, 약 1:19, 약 1:18, 약 1:17, 약 1:16, 약 1:15, 약 1:14, 약 1:13, 약 1:12, 약 1:11, 약 1:10, 약 1:9, 약 1:8, 약 1:7, 약 1:6, 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 또는 약 1:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 2:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 3:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 4:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 5:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 6:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 7:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 8:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 9:1이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체, 특히 그의 양이온성 담체 모이어티와 음전하 페이로드(예를 들면, 핵산) 사이의 전반적 이온성 비는 약 10:1이다.
미셀은 하나 이상의 양친매성 분자로 구성된 수용성 또는 콜로이드 구조 또는 응집체이다. 양친매성 분자는 적어도 하나의 친수성(극성) 모이어티와 적어도 하나의 소수성(비극성) 모이어티를 함유하는 분자이다. "전형적인 미셀"은 친수성 층 또는 "쉘"로 둘러싸인 단일, 중앙 및 주로 소수성 영역 또는 "코어"를 가지고 있다. 수용액에서 미셀은 주변 용매와 접촉하는 양친매성 분자의 친수성 "헤드" 영역과 응집체를 형성하여 미셀 코어에서 양친매성 분자의 소수성 단일 꼬리 영역을 격리한다. 미셀은 모양이 대략 구형이다. 다른 모양, 예를 들면, 타원체, 실린더, 막대형 구조 또는 폴리머좀도 가능하다. 따라서, 개시된 미셀의 모양 및 크기, 로딩 용량은 수용성 생체고분자 (예를 들면, PEG) 및 양이온성 담체(예를 들면, 폴리 라이신) 사이의 비를 변경하여 변형할 수 있다. 비에 따라 담체 단위체는 작은 입자, 작은 미셀, 미셀, 막대형 구조 또는 폴리머좀으로 구성될 수 있다. 따라서, 용어 "본 개시내용의 미셀"은 전형적인 미셀뿐만 아니라 작은 입자, 작은 미셀, 미셀, 막대형 구조 또는 폴리머좀을 포괄한다.
본 개시내용의 미셀은 극성(즉, 수성) 용액에서 소수성 및 친수성 모이어티를 함유하는 단일 단분자 중합체 또는 임계 미셀 농도(CMC)에서 또는 초과에서 형성된 많은 양친매성(즉, 계면활성제) 분자를 함유하는 집합체 혼합물로 구성될 수 있다. 미셀은 모이어티가 주로 소수성인 내부 코어와 주로 친수성인 외부를 제공하도록 배향된 하나 이상의 양친매성 분자로부터 자가 조립된다.
본 개시내용의 미셀은 크기가 5 내지 약 2000 나노미터 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 미셀의 직경은 약 10nm 내지 약 200nm이다. 일부 양태에서, 미셀의 직경은 약 1nm 내지 약 100nm 사이, 약 10nm 내지 약 100nm 사이, 약 10nm 내지 약 90nm 사이, 약 10nm 내지 약 80nm 사이, 약 10nm 내지 약 70nm 사이, 약 20nm 내지 약 100nm 사이, 약 20nm 내지 약 90nm 사이, 약 20nm 내지 약 80nm 사이, 약 20nm 내지 약 70nm 사이, 약 30nm 내지 약 100nm 사이, 약 30nm 내지 약 90nm 사이, 약 30nm 내지 약 80nm 사이, 약 30nm 내지 약 70nm 사이, 약 40nm 내지 약 100nm 사이, 약 40nm 내지 약 90nm 사이, 약 40nm 내지 약 80nm 사이 또는 약 40nm 내지 약 70nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 30nm 내지 약 60nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 90nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 80nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 70nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 60nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 50nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 20nm 내지 약 60nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 20nm 내지 약 50nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 20nm 내지 약 40nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 25nm 내지 약 35nm 사이이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 32nm이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 약 100 nm 및 약 200nm이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 약 40nm 및 약 50nm이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 약 50nm 및 약 60nm이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 약 60nm 및 약 70nm이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 약 70nm 및 약 80nm이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 약 80nm 및 약 90nm이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 약 90nm 및 약 100nm이다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀은 단일 유형의 양이온성 담체 단위체를 포함한다. 다른 양태에서, 본 개시내용의 미셀은 하나 초과 유형의 양이온성 담체 단위체를 포함한다(예를 들면, 표적 세포의 표면 상의 상이한 수용체를 표적화함). 일부 양태에서, 본 개시내용의 미셀은 상이한 표적화 모이어티, 상이한 양이온성 담체 모이어티(예를 들면, 상이한 페이로드를 수용하기 위해), 및/또는 상이한 소수성 및/또는 가교 단위체를 갖는 양이온성 담체 단위체를 포함할 수 있다.
페이로드(예를 들면, miR-485 억제제)를 갖는 미셀을 형성하기 위해, 상이한 유형의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체가 함께 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미셀은 혈액 뇌 장벽을 표적으로 하기 위해 표적화 모이어티에 결합된 양이온성(또는 음이온성) 담체 단위체 및 표적화 모이어티에 결합되지 않은 양이온성(또는 음이온성) 담체 단위체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 미셀은 약 50 내지 약 200개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 다른 양태에서, 미셀은 약 50 내지 약 150, 약 50 내지 약 140, 약 50 내지 약 130, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 110 또는 약 50 내지 약 100개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 약 60 내지 약 200개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 양태에서, 미셀은 약 60 내지 약 150, 약 60 내지 약 140, 약 60 내지 약 130, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 80, 또는 약 60 내지 약 70개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 약 70 내지 약 200개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 다른 양태에서, 미셀은 약 70 내지 약 150, 약 70 내지 약 140, 약 70 내지 약 130, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 또는 약 70 내지 약 80개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 약 80 내지 약 200개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 다른 양태에서, 미셀은 약 80 내지 약 150, 약 80 내지 약 140, 약 80 내지 약 130, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 100 또는 약 80 내지 약 90개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 약 90 내지 약 200개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 다른 양태에서, 미셀은 약 90 내지 약 150, 약 90 내지 약 140, 약 90 내지 약 130, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 110, 또는 약 90 내지 약 100개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 약 100 내지 약 200개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다. 다른 양태에서, 미셀은 약 100 내지 약 150, 약 100 내지 약 140, 약 100 내지 약 130, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 110, 또는 약 100 내지 약 100개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위체를 포함한다.
또한, 본 개시내용은 (i) 뉴클레오티드 서열(예를 들어, miR-485 억제제) 및 (ii) 본원에 기재된 양이온성 담체 단위체를 포함하는 미셀을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 (i) 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, miR-485 억제제), 및 (ii) 본원에 기재된 약 80 내지 약 120개(예를 들면, 약 85 내지 약 115개, 약 90 내지 약 110개, 약 95 내지 약 105개)의 양이온성 담체 단위체를 포함하는 미셀에 대한 것이다. 일부 양태에서, 미셀은 (i) 뉴클레오티드 서열(예를 들면, miR-485 억제제) 및 (ii) 약 80 내지 약 120개(예를 들면, 약 80개, 약 85개, 약 90개, 약 95개, 약 100개, 약 105개 또는 약 110개)의 본원에 기재된 양이온성 담체 단위체를 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 (i) 뉴클레오티드 서열(예를 들면, miR-485 억제제), 및 (ii) 약 60 내지 약 110개, 예를 들면, 약 80개의 양이온성 담체 단위체를 포함하고, 여기서 (a) 약 45 내지 약 90개, 예를 들면, 약 80개의 양이온성 담체 단위체는 [WP]-L1-[CC]-L2-[AM]을 포함하고 (b) 약 45 내지 약 55개, 예를 들면, 약 50개의 양이온성 담체 단위체는 [WP]-L1-[AM]-L2-[CC]를 포함하며, 여기서 WP는 (PEG)5000이고, CC는 약 40 내지 약 50개의 라이신, 예를 들면, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 또는 약 50개의 라이신이고, 여기서 각각 약 5 내지 약 15개의 라이신, 약 5개의 리신은 비타민 B3(니코틴아미드)에 융합된다. 일부 양태에서, 조성물은 수용성 중합체 모이어티[WP]에 결합된 표적 모이어티, 예를 들면, LAT1 표적화 리간드, 예를 들면, 페닐알라닌을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체는 본 개시내용의 miRNA 억제제(즉, miR-485 억제제)를 효소 분해로부터 보호할 수 있다. 2020년 12월 30일에 공개된 PCT 공개 번호 WO2020/261227을 참조하고, 그 전체가 참조로 본원에 통합된다.
V. 약학적 조성물
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 대상체에게 투여에 적합한 본원에 개시된 miR-485 억제제 (예를 들면, miR-485 억제제를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 일반적으로 대상체에게 투여에 적합한 형태로 본원에 기재된 miR-485 억제제 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터) 및 약학적으로-허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 투여되는 중인 특정한 조성물에 의해, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용된 특정한 방법에 의해 부분적으로 결정된다.
그러므로, 본 개시내용의 miR-485 억제제를 포함하는 약학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 있다. (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990), 참조). 약학적 조성물은 일반적으로 멸균 제형화되고 미국 식품의약국의 모든 우수 의약품 제조관리 기준 (GMP) 규정을 완전히 준수한다.
VI. 키트
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 miRNA 억제제 (예를 들면, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 약학적 조성물) 및 임의로 사용 지침, 예를 들면, 본원에 개시된 방법에 따른 사용 지침을 포함하는 키트 또는 제조 제품을 제공한다. 일부 양태에서, 키트 또는 제조 제품은 하나 이상의 용기에서 miR-485 억제제 (예를 들면, 벡터, 예를 들면, 본 개시내용의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약학적 조성물)를 포함한다. 일부 양태에서, 키트 또는 제조 제품은 miR-485 억제제 (예를 들면, 벡터, 예를 들면, 본 개시내용의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약학적 조성물) 및 브로셔를 포함한다. 당업자는 본원에 개시된 miR-485 억제제 (예를 들면, 본 개시내용의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 및 약학적 조성물, 또는 이들의 조합)가 당업계에서 잘 알려지는 확립된 키트 형식 중 하나로 용이하게 편입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
다음 실시예는 제한의 방식이 아닌 예시의 방식으로 제공된다.
실시예
실시예 1: miR-485 억제제의 제조
(a) 알킨 변형된 티로신의 합성: 알킨 변형된 티로신은 BBB에서 LAT1 수송체로 본 개시내용의 미셀을 유도하기 위해 양이온성 담체 단위체의 조직 특이적 표적화 모이어티 (TM, 도 1 참조)의 합성을 위한 중간체로서 생성되었다.
아세토니트릴 (4.0 ml)내 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-티로신 메틸 에스테르 (Boc-Tyr-OMe) (0.5g, 1.69 mmol) 및 K2CO3 (1.5 당량, 2.54 mmol)의 혼합물은 프로파르길 브로마이드 (1.2 당량, 2.03 mmol)에 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 60 ℃에서 밤새 가열되었다. 반응 후, 반응 혼합물은 물:에틸 아세테이트 (EA)를 사용하여 추출되었다. 그 다음, 유기 층은 염수 용액을 사용하여 세정되었다. 조 물질은 플래시 컬럼 (헥산 10%내 EA)에 의해 정제되었다. 다음에, 생성된 생성물은 1,4-디옥산 (1.0 ml) 및 6.0 M HCl (1.0 ml)에 용해되었다. 반응 혼합물은 100 ℃에서 밤새 가열되었다. 다음에, 디옥산은 제거되었고 EA에 의해 추출되었다. 수성 NaOH (0.5 M) 용액은 pH 값이 7이 되는 때까지 혼합물에 첨가되었다. 반응물은 증발기에 의해 농축되었고 0℃에 12,000 rpm으로 원심분리되었다. 침전물은 탈이온수로 세정되었고 동결건조되었다.
(b) 폴리(에틸렌 글리콜)- b -폴리(L-라이신) (PEG-PLL)의 합성: 이 합성 단계는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체의 수용성 생체고분자 (WP) 및 양이온성 담체 (CC)를 생성하였다 (도 1 참조).
폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신)은 거대개시제로서 모노메톡시 PEG (MeO-PEG)와 Lys(TFA)-NCA의 개환 중합에 의해 합성되었다. 간략하게, MeO-PEG (600 mg, 0.12 mmol) 및 Lys(TFA)-NCA (2574 mg, 9.6 mmol)는 1M 티오우레아 및 DMF(또는 NMP)를 함유하는 DMF에 별도로 용해되었다. Lys(TFA)-NCA 용액은 마이크로 주사기에 의해 MeO-PEG 용액에 적하되었고 반응 혼합물은 37 ℃에서 4 일 동안 교반되었다. 반응 병은 아르곤 및 진공으로 퍼징되었다. 모든 반응은 아르곤 대기에서 수행되었다. 반응 후, 혼합물은 과량의 디에틸 에테르에 침전되었다. 침전물은 메탄올에 재-용해되었고 차가운 디에틸 에테르에 재차 침전되었다. 그 다음 여과되었고 백색 분말은 진공에서 건조 후 수득되었다. PEG-PLL(TFA)내 TFA 기의 탈보호를 위하여, 다음 단계로 이어졌다.
MeO-PEG-PLL(TFA) (500 mg)은 메탄올 (60 mL)에 용해되었고 1N NaOH (6 mL)는 교반하면서 중합체 용액에 적하되었다. 혼합물은 37℃에서 교반하면서 1 일 동안 유지되었다. 반응 혼합물은 10 mM HEPES에 대해 4회 동안 그리고 증류수에 대해 투석되었다. PEG-PLL의 백색 분말은 동결건조 후 수득되었다.
(b) 아지도-폴리(에틸렌 글리콜)- b -폴리(L-라이신) (N 3 -PEG-PLL)의 합성: 이 합성 단계는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체의 수용성 생체고분자 (WP) 및 양이온성 담체 (CC)를 생성하였다 (도 1 참조).
아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신)은 아지도- PEG (N3-PEG)와 Lys(TFA)-NCA의 개환 중합에 의해 합성되었다. 간략하게, N3-PEG (300 mg, 0.06 mmol) 및 Lys(TFA)-NCA (1287 mg, 4.8 mmol)는 1M 티오우레아 및 DMF(또는 NMP)를 함유하는 DMF에 별도로 용해되었다. Lys(TFA)-NCA 용액은 마이크로 주사기에 의해 N3-PEG 용액에 적하되었고 반응 혼합물은 37 ℃에서 4 일 동안 교반되었다. 반응 병은 아르곤 및 진공으로 퍼징되었다. 모든 반응은 아르곤 대기에서 수행되었다. 반응 후, 혼합물은 과량의 디에틸 에테르에 침전되었다. 침전물은 메탄올에 재-용해되었고 차가운 디에틸 에테르에 재차 침전되었다. 그 다음 여과되었고 백색 분말은 진공에서 건조 후 수득되었다. PEG-PLL(TFA)내 TFA 기의 탈보호를 위하여, 다음 단계가 이어졌다.
N3-PEG-PLL (500 mg)은 메탄올 (60 mL)에 용해되었고 1N NaOH (6 mL)는 교반하면서 중합체 용액에 적하되었다. 혼합물은 37℃에서 교반하면서 1 일 동안 유지되었다. 반응 혼합물은 10 mM HEPES에 대해 4회 동안 그리고 증류수에 대해 투석되었다. N3-PEG-PLL의 백색 분말은 동결건조 후 수득되었다.
(c) (메톡시 또는) 아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드) (N 3 -PEG-PLL(Nic/SH))의 합성: 이 단계에서, 조직-특이적 보조제 모이어티 (AM, 도 1 참조)는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체의 WP-CC 구성요소에 부착되었다. 양이온성 담체 단위체에서 사용된 조직-특이적 보조제 모이어티 (AM)는 니코틴아미드 (비타민 B3)이었다. 이 단계는 도 1에 묘사된 양이온성 담체 단위체의 WP-CC-AM 구성요소를 산출할 것이다.
아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드) (N 3 -PEG-PLL(Nic/SH))는 EDC/NHS의 존재 하에서 N3-PEG-PLL 및 니코틴산의 화학적 변형에 의해 합성되었다. N3-PEG-PLL (372 mg, 25.8 μmol) 및 니코틴산 (556.7 mg, PEG-PLL의 NH2에 대해 1.02 당량)은 탈이온수 및 메탄올 (1:1)의 혼합물에 별도로 용해되었다. EDC·HCl (556.7 mg, N3-PEG-PLL의 NH2에 대해 1.5 당량)은 니코틴산 용액에 첨가되었고 NHS (334.2 mg, PEG-PLL의 NH2에 대해 1.5 당량)는 혼합물에 적가되었다.
반응 혼합물은 N3-PEG-PLL 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 교반하면서 16 시간 동안 37 ℃에서 유지되었다. 16 시간 후, 3,3'-디티오디프로폰산 (36.8 mg, 0.1 당량)은 메탄올에 용해되었고, EDC·HCl (40.3 mg, 0.15 당량), 및 NHS (24.2 mg, 0.15 당량)는 탈이온수에 각각 용해되었다. 그 다음, NHS 및 EDC·HCl은 3,3'-디티오디프로폰산 용액에 순차적으로 첨가되었다. 혼합물 용액은 조 N3-PEG-PLL(Nic) 용액을 첨가한 후 37 ℃에서 4 시간 동안 교반되었다.
정제를 위하여, 혼합물은 2 시간 동안 메탄올에 대해 투석되었고, DL-디티오트레이톨 (DTT, 40.6 mg, 0.15 당량) 첨가되었고, 그 다음 30 분 동안 활성화되었다.
DTT를 제거하기 위하여, 혼합물은 메탄올, 탈이온수내 50 % 메탄올, 탈이온수 순차적으로 투석되었다.
d) 페닐 알라닌-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드) (Phe-PEG-PLL(Nic/SH))의 합성: 이 단계에서, 조직-특이적 표적화 모이어티 (TM)는 이전의 단계에서 합성된 WP-CC-AM 구성요소에 부착되었다. TM 구성요소 (페닐 알라닌)은 단계 (c)의 생성물과 단계 (a)에서 생성된 중간체의 반응에 의해 생성되었다.
혈관내 뇌 내피 조직을 표적하기 위해, LAT1 표적화 아미노산으로서, 페닐 알라닌은 구리 촉매 존재 하에서 N3-PEG-PLL(Nic/SH) 및 알킨 변형된 티로신 사이 클릭 반응에 의해 도입되었다 간략하게, N3-PEG-PLL(Nic/SH) (130 mg, 6.5 μmol) 및 알킨 변형된 페닐 알라닌 (5.7 mg, 4.0 당량)은 탈이온수 (또는 50 mM 인산나트륨 완충액)에 용해되었다. 그 다음, CuSO4·H2O (0.4 mg, 25 mol%) 및 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (THPTA, 3.4 mg, 1.2 당량)은 탈이온수가 용해되었고 N3-PEG-PLL(Nic/SH) 용액이 첨가되었다. 그 다음, 아스코르브산나트륨 (3.2 mg, 2.5 당량)은 혼합물 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 16 시간 동안 교반하면서 유지되었다. 반응 후, 혼합물은 투석 막 (MWCO = 7,000)으로 전달되었고 탈이온수에 대해 1 일 동안 투석되었다. 최종 생성물은 동결건조 후 수득되었다.
(e) 다중이온 복합체 (PIC) 미셀 제조 - 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체가 상기 기재된 대로 생성되었다면, 미셀은 생산되었다. 본 예에서 기재된 미셀은 안티센스 올리고뉴클레오티드 페이로드와 조합된 양이온성 담체 단위체를 포함하였다.
나노 크기조정된 PIC 미셀은 MeO- 또는 Phe-PEG-PLL(Nic) 및 miRNA를 혼합시킴으로써 제조되었다. PEG-PLL(Nic)은 0.5 mg/mL 농도로 HEPES 완충액 (10 mM)에 용해되었다. 그 다음 RNAse 없는 물내 miRNA 용액 (22.5 μM)은 miRNA 억제제 (서열번호: 2-30) (예를 들면, AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC; 서열번호: 30) 대 중합체의 2:1 (v/v) 비로 중합체 용액과 혼합되었다.
중합체 대 항-miRNA의 혼합 비는 미셀 형성 조건, 즉, 중합체 (본 개시내용의 담체)내 아민 대 항-miRNA (페이로드)내 포스페이트 사이 비를 최적화함으로써 결정되었다. 중합체 (담체) 및 항-miRNA (페이로드)의 혼합물은 3000 rpm으로 다중-와동에 의해 90 초 동안 격렬하게 혼합되었고, 실온에서 30 분 동안 유지되어 미셀을 안정화시켰다.
미셀 (10 μM의 항-miRNA 농도)는 사용에 앞서 4 ℃에서 보관되었다. MeO- 또는 Phe- 미셀은 동일한 방법을 사용하여 제조되었고, 상이한 양의 Phe-함유 미셀 (25% ~75%)은 미셀 제조 동안 중합체 모두를 혼합시킴으로써 또한 제조되었다.
실시예 2. miR-485-3p 과발현은 시냅스 생성을 손상시키고 신경세포 사멸을 유도한다
miR-485-3p 발현이 신경 시냅스 생성에 미치는 영향을 이해하기 위해 배아 18.5일차 마우스에서 일차 마우스 뉴런을 배양하고 렌티-바이러스 대조군 벡터 또는 렌티-miR-485-3p중 하나로 감염시켰고, 둘 다 녹색 형광 단백질을 발현한다(GFP). 일차 마우스 뉴런을 분리하기 위해, 동물의 피질 및 해마를 해부하고 얼음처럼 차가운 HBSS(Welgene, LB003-02) 용액에서 인큐베이션하고 37℃에서 15분 동안 accumax(Sigma, Cat#A7089)에서 해리시켰다. 그런 다음 배양액을 HBSS에서 두 번 헹구었다. 마우스 뉴런을 2% B27(Gibco, Cat#17504), 1% 피루브산나트륨 및 1% P/S를 함유하는 신경기저 배지(Gibco, Cat#21103049)에 재현탁시켰다. 세포를 70 μM 세포 스트레이너(SPL, 93070)를 통해 여과하고 배양 플레이트에 도말하고 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 유지했다. 배지는 3일마다 교체하였고 시험관내에서 8일 후에 세포를 실험에 사용하였다. 뉴런을 감염시키기 위해 폴리브렌(8 μg/μL), 렌티-대조군 바이러스 및/또는 렌티-miR485-3p 바이러스를 일차 뉴런에 형질도입 하였다. 30시간 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 그런 다음 면역세포화학을 사용하여 PSD-95, 시냅토파이신 및 절단된 카스파제-3 단백질 발현을 분석하였다.
도 2a(가장 오른쪽 패널)에 도시된 바와 같이, miR-485-3p는 GFP 신호를 기반으로 렌티-miR-485-3p 감염된 뉴런에서 과발현되었다. PSD95는 뉴런의 시냅스 후 밀도에 거의 독점적으로 위치하며 시냅스 단백질 고정에 관여하므로 시냅스를 대신한다. 도 2a (중간 패널)에 도시된 바와 같이, miR-485-3p를 과발현하는 뉴런에서 PSD95 염색이 감소하여 miR-485-3p 과발현이 시냅스 생성을 손상시킨다는 것을 시사한다. 도 2a(가장 왼쪽 패널)는 병합된 이미지를 도시한다.
시냅토파이신에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다. 도 2b(중간 패널)에 도시된 바와 같이, 렌티-miR485-3p로 감염된 일차 뉴런은 렌티-대조군으로 감염된 뉴런과 비교하여 시냅토파이신 발현이 유의미하게 저감되었다. 이 결과는 miR-485-3p 과발현이 또한 시냅스 생성을 손상시킨다는 것을 시사한다.
miR-485-3p 과발현이 시냅스 생성을 손상시켰기 때문에, miR-485-3p 과발현과 신경세포 사멸 사이의 관계를 절단된 카스파제-3 발현에 대한 염색으로 평가하였다. 도 3 (중간 패널)에 도시된 바와 같이, 절단된 카스파제-3은 렌티-대조군 처리된 뉴런과 비교하여 렌티-miR-485-3p 처리된 뉴런에서 시각적으로만 검출되었다. 종합하면, 이러한 결과는 뉴런에서 miR-485-3p의 과발현이 시냅스 생성을 손상시키고 신경세포 사멸을 유도함을 시사한다.
실시예 3. miR-485-3p 과발현은 마우스 및 인간 일차 미세아교세포에서 활성화된 카스파제-3 수준의 증가를 야기한다.
일차 미세아교세포에서 miR-485-3p 과발현이 활성화된 카스파아제-3 수준을 증가시키는지 확인하기 위해, 마우스 뇌 조직을 0일차에 수확하고 미세아교세포를 배양하였다. 14일차에, 세포를 렌티-miR-485-3p 또는 렌티-대조군으로 처리하였다. 15일차에 미세아교세포를 수확하고 면역세포화학을 수행하였다(도 4a). 세포를 Iba1(예를 들면, 활성화된 미세아교세포 마커)(도 4b, 중간 패널) 및 절단된 카스파제-3(도 4c, 중간 패널)에 대해 염색하였다. 이전에 마우스 일차 뉴런에서 관찰된 바와 같이, miR-485-3p 과발현은 또한 마우스 일차 미세아교세포에서 활성화된 카스파제-3 수준을 증가시켰다.
miR-485-3p 과발현이 마우스 일차 미세아교세포에서 활성화된 카스파제-3 수준을 증가시켰기 때문에, 일차 인간 미세아교세포는 유사한 효과에 대해 평가되었다. 일차 인간 미세아교세포를 0일부터 배양하고, 1일차에 렌티-miR-485-3p 또는 렌티-대조군으로 처리하고, 2일차에 수확하였다(도 6a). 면역세포화학을 수행하고 인간 미세아교세포를 Iba1 및 절단된 카스파제-3에 대해 염색하였다(도 6b 및 6c). miR-485-3p 과발현은 또한 인간 일차 미세아교세포에서 렌티-대조군과 비교하여 절단된 카스파제-3 염색을 증가시켰다.
상기 결과는 miR-485-3p의 과발현이 마우스와 인간 미세아교세포 모두에서 세포 사멸을 야기할 수 있음을 확인한다.
실시예 4. miR-485-3p 과발현은 마우스 및 인간 일차 성상세포에서 활성화된 카스파아제-3 수준을 증가를 야기한다.
일차 성상세포에서 miR-485-3p 과발현이 활성화된 카스파제-3 수준을 증가시키는지 확인하기 위해 마우스 뇌를 0일차에 수확하고 성상세포를 배양하였다. 14일차에, 세포를 렌티-miR-485-3p 또는 렌티-대조군으로 처리하였다. 15일차에 성상세포를 수확하고 면역세포화학을 수행하였다(도 5a 및 5b). 세포를 GFAP(예를 들면, 활성화된 성상세포 마커)(도 5a, 중간 패널) 및 절단된 카스파제-3(도 5b, 중간 패널)에 대해 염색하였다. miR-485-3p 과발현은 마우스 일차 성상세포에서 활성화된 카스파제-3 수준을 증가시켰다.
miR-485-3p 과발현이 마우스 일차 성상세포에서 활성화된 카스파아제-3 수준을 증가시켰기 때문에 일차 인간 성상세포를 유사한 효과에 대해 평가하였다. 일차 인간 성상세포를 0일부터 배양하고, 1일차에 렌티-miR-485-3p 또는 렌티-대조군으로 처리하고, 2일차에 수확하였다(도 6a). 면역세포화학을 수행하고 인간 성상세포를 GFAP 및 절단된 카스파제-3에 대해 염색하였다(도 7a 및 7b). miR-485-3p 과발현은 렌티-대조군에 비해 절단된 카스파제-3 염색을 증가시켰다.
집합적으로, 실시예 2-4에 제공된 결과는 miR-485-3p가 시냅스 생성을 손상시키고 적절한 신경 기능에 관여하는 다양한 세포의 사멸을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 5: 근긴장이상에 대한 miR-485 억제제의 치료 효과 분석
본원에 기재된 miR-485 억제제가 생체내에서 치료 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 근긴장이상의 동물 모델을 사용할 것이다. 동물은 PBS 또는 miR-485 억제제로 처리될 것이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 다양한 투여량, 투여 간격 및/또는 투여 경로로 동물에게 투여될 것이다. miR-485 억제제의 치료 효과는 예를 들면, 근긴장이상과 연관된 다양한 임상 징후 및/또는 병리학에 대한 동물의 다양한 속성을 측정함으로써 평가될 것이다. 일부 양태에서, PSD95, 시냅토파이신, 및/또는 카스파제 3 단백질 및/또는 유전자의 발현이 또한 동물에서 평가될 것이다.
실시예 6: 신경정신 질환에 대한 miR-485 억제제의 치료 효과 분석
본원에 기재된 miR-485 억제제가 생체내에서 치료 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 신경정신 질환의 동물 모델을 사용할 것이다. 동물은 PBS 또는 miR-485 억제제로 처리될 것이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 다양한 투여량, 투여 간격 및/또는 투여 경로로 동물에게 투여될 것이다. miR-485 억제제의 치료 효과는 예를 들면, 신경정신 질환과 연관된 다양한 임상 징후 및/또는 병리학에 대한 동물의 다양한 속성을 측정함으로써 평가될 것이다. 일부 양태에서, PSD95, 시냅토파이신, 및/또는 카스파제 3 단백질 및/또는 유전자의 발현이 또한 동물에서 평가될 것이다.
실시예 7: 지적 장애에 대한 miR-485 억제제의 치료 효과 분석
본원에 기재된 miR-485 억제제가 생체내에서 치료 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 지적 장애의 동물 모델을 사용할 것이다. 동물은 PBS 또는 miR-485 억제제로 처리될 것이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 다양한 투여량, 투여 간격 및/또는 투여 경로로 동물에게 투여될 것이다. miR-485 억제제의 치료 효과는 예를 들면, 지적 장애와 연관된 다양한 임상 징후 및/또는 병리학에 대한 동물의 다양한 속성을 측정함으로써 평가될 것이다. 일부 양태에서, PSD95, 시냅토파이신, 및/또는 카스파제 3 단백질 및/또는 유전자의 발현이 또한 동물에서 평가될 것이다.
실시예 8: 중독에 대한 miR-485 억제제의 치료 효과 분석
본원에 기재된 miR-485 억제제가 생체내에서 치료 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 중독의 동물 모델을 사용할 것이다. 동물은 PBS 또는 miR-485 억제제로 처리될 것이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 다양한 투여량, 투여 간격 및/또는 투여 경로로 동물에게 투여될 것이다. miR-485 억제제의 치료 효과는 예를 들면, 중독과 연관된 다양한 임상 징후 및/또는 병리학에 대한 동물의 다양한 속성을 측정함으로써 평가될 것이다. 일부 양태에서, PSD95, 시냅토파이신, 및/또는 카스파제 3 단백질 및/또는 유전자의 발현이 또한 동물에서 평가될 것이다.
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개요 및 요약 섹션이 아니라, 상세한 설명 섹션이 청구항을 해석하는데 사용되기 위한 것임이 이해되어야 한다. 개요 및 요약 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려된 대로 본 개시내용의 모든 예시적 양태가 아닌 하나 이상을 설명할 수 있고, 그래서, 본 개시내용 및 첨부된 청구항을 어떤 식으로든 제한하기 위한 것은 아니다.
본 개시내용은 특정된 기능 및 이들의 관계의 구현을 예시하는 기능적 구축 블록의 도움으로 상기 기재되었다. 이들 기능적 구축 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에 임의적으로 정의되었다. 대안적 경계는 특정된 기능 및 이들의 관계가 적절하게 수행되는 한 정의될 수 있다.
특이적 양태의 전술한 설명은 다른 이들이, 과도한 실험작업 없이, 본 개시내용의 일반 개념을 벗어나지 않으면서, 당업계의 기술 내에서 지식을 적용함으로써, 다양한 적용에 대하여 그러한 특이적 양태를 용이하게 수정 및/또는 적응할 수 있는 본 개시내용의 일반 성격을 매우 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 그러한 적응 및 변형은, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기반하여, 개시된 양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있기 위한 것이다. 본원에 술어 또는 전문용어가 제한이 아닌 설명의 목적을 위한 것이어서, 본 명세서의 전문용어 또는 술어가 교시 및 지침에 비추어 숙련된 기술자에 의해 해석되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.
본 개시내용의 폭 및 범위는 상기-기재된 예시적 양태 중 임의의 것에 의해 제한되지 않아야 하지만, 하기 청구항 및 그들의 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용된 참고문헌 (참조문헌, 특허, 특허 출원, 및 웹사이트 포함)의 내용은, 그안에 인용된 참조문헌이 그러하듯, 임의의 목적을 위하여 그들 전체가 참조로 이로써 명시적으로 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> BIORCHESTRA CO., LTD. <120> USE OF MIRNA-485 INHIBITOR TO REGULATE PSD95, SYNAPTOPHYSIN, AND CASPASE-3 EXPRESSION <130> 4366.042PC01 <150> US 63/146,513 <151> 2021-02-05 <160> 121 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-485-3p <400> 1 gucauacacg gcucuccucu cu 22 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 2 uguauga 7 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 3 guguauga 8 <210> 4 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 4 cguguauga 9 <210> 5 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 5 ccguguauga 10 <210> 6 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 6 gccguguaug a 11 <210> 7 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 7 agccguguau ga 12 <210> 8 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial 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Arg Pro Lys Arg Glu Tyr Glu Ile Asp Gly Arg Asp Tyr His 610 615 620 Phe Val Ser Ser Arg Glu Lys Met Glu Lys Asp Ile Gln Ala His Lys 625 630 635 640 Phe Ile Glu Ala Gly Gln Tyr Asn Ser His Leu Tyr Gly Thr Ser Val 645 650 655 Gln Ser Val Arg Glu Val Ala Glu Gln Gly Lys His Cys Ile Leu Asp 660 665 670 Val Ser Ala Asn Ala Val Arg Arg Leu Gln Ala Ala His Leu His Pro 675 680 685 Ile Ala Ile Phe Ile Arg Pro Arg Ser Leu Glu Asn Val Leu Glu Ile 690 695 700 Asn Lys Arg Ile Thr Glu Glu Gln Ala Arg Lys Ala Phe Asp Arg Ala 705 710 715 720 Thr Lys Leu Glu Gln Glu Phe Thr Glu Cys Phe Ser Ala Ile Val Glu 725 730 735 Gly Asp Ser Phe Glu Glu Ile Tyr His Lys Val Lys Arg Val Ile Glu 740 745 750 Asp Leu Ser Gly Pro Tyr Ile Trp Val Pro Ala Arg Glu Arg Leu 755 760 765 <210> 118 <211> 720 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSD-95 isoform 3 <400> 118 Met Asp Cys Leu Cys Ile Val Thr Thr Lys Lys Tyr Arg Tyr Gln Asp 1 5 10 15 Glu Asp Thr Pro Pro Leu Glu His Ser Pro Ala His Leu Pro Asn Gln 20 25 30 Ala Asn Ser Pro Pro Val Ile Val Asn Thr Asp Thr Leu Glu Ala Pro 35 40 45 Gly Tyr Val Asn Gly Thr Glu Gly Glu Met Glu Tyr Glu Glu Ile Thr 50 55 60 Leu Glu Arg Gly Asn Ser Gly Leu Gly Phe Ser Ile Ala Gly Gly Thr 65 70 75 80 Asp Asn Pro His Ile Gly Asp Asp Pro Ser Ile Phe Ile Thr Lys Ile 85 90 95 Ile Pro Gly Gly Ala Ala Ala Gln Asp Gly Arg Leu Arg Val Asn Asp 100 105 110 Ser Ile Leu Phe Val Asn Glu Val Asp Val Arg Glu Val Thr His Ser 115 120 125 Ala Ala Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser Ile Val Arg Leu Tyr 130 135 140 Val Met Arg Arg Lys Pro Pro Ala Glu Lys Val Met Glu Ile Lys Leu 145 150 155 160 Ile Lys Gly Pro Lys Gly Leu Gly Phe Ser Ile Ala Gly Gly Val Gly 165 170 175 Asn Gln His Ile Pro Gly Asp Asn Ser Ile Tyr Val Thr Lys Ile Ile 180 185 190 Glu Gly Gly Ala Ala His Lys Asp Gly Arg Leu Gln Ile Gly Asp Lys 195 200 205 Ile Leu Ala Val Asn Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Met His Glu Asp 210 215 220 Ala Val Ala Ala Leu Lys Asn Thr Tyr Asp Val Val Tyr Leu Lys Val 225 230 235 240 Ala Lys Pro Ser Asn Ala Tyr Leu Ser Asp Ser Tyr Ala Pro Pro Asp 245 250 255 Ile Thr Thr Ser Tyr Ser Gln His Leu Asp Asn Glu Ile Ser His Ser 260 265 270 Ser Tyr Leu Gly Thr Asp Tyr Pro Thr Ala Met Thr Pro Thr Ser Pro 275 280 285 Arg Arg Tyr Ser Pro Val Ala Lys Asp Leu Leu Gly Glu Glu Asp Ile 290 295 300 Pro Arg Glu Pro Arg Arg Ile Val Ile His Arg Gly Ser Thr Gly Leu 305 310 315 320 Gly Phe Asn Ile Val Gly Gly Glu Asp Gly Glu Gly Ile Phe Ile Ser 325 330 335 Phe Ile Leu Ala Gly Gly Pro Ala Asp Leu Ser Gly Glu Leu Arg Lys 340 345 350 Gly Asp Gln Ile Leu Ser Val Asn Gly Val Asp Leu Arg Asn Ala Ser 355 360 365 His Glu Gln Ala Ala Ile Ala Leu Lys Asn Ala Gly Gln Thr Val Thr 370 375 380 Ile Ile Ala Gln Tyr Lys Pro Glu Glu Tyr Ser Arg Phe Glu Ala Lys 385 390 395 400 Ile His Asp Leu Arg Glu Gln Leu Met Asn Ser Ser Leu Gly Ser Gly 405 410 415 Thr Ala Ser Leu Arg Ser Asn Pro Lys Arg Gly Phe Tyr Ile Arg Ala 420 425 430 Leu Phe Asp Tyr Asp Lys Thr Lys Asp Cys Gly Phe Leu Ser Gln Ala 435 440 445 Leu Ser Phe Arg Phe Gly Asp Val Leu His Val Ile Asp Ala Ser Asp 450 455 460 Glu Glu Trp Trp Gln Ala Arg Arg Val His Ser Asp Ser Glu Thr Asp 465 470 475 480 Asp Ile Gly Phe Ile Pro Ser Lys Arg Arg Val Glu Arg Arg Glu Trp 485 490 495 Ser Arg Leu Lys Ala Lys Asp Trp Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gln Gly 500 505 510 Arg Glu Asp Ser Val Leu Ser Tyr Glu Thr Val Thr Gln Met Glu Val 515 520 525 His Tyr Ala Arg Pro Ile Ile Ile Leu Gly Pro Thr Lys Asp Arg Ala 530 535 540 Asn Asp Asp Leu Leu Ser Glu Phe Pro Asp Lys Phe Gly Ser Cys Val 545 550 555 560 Pro His Thr Thr Arg Pro Lys Arg Glu Tyr Glu Ile Asp Gly Arg Asp 565 570 575 Tyr His Phe Val Ser Ser Arg Glu Lys Met Glu Lys Asp Ile Gln Ala 580 585 590 His Lys Phe Ile Glu Ala Gly Gln Tyr Asn Ser His Leu Tyr Gly Thr 595 600 605 Ser Val Gln Ser Val Arg Glu Val Ala Glu Gln Gly Lys His Cys Ile 610 615 620 Leu Asp Val Ser Ala Asn Ala Val Arg Arg Leu Gln Ala Ala His Leu 625 630 635 640 His Pro Ile Ala Ile Phe Ile Arg Pro Arg Ser Leu Glu Asn Val Leu 645 650 655 Glu Ile Asn Lys Arg Ile Thr Glu Glu Gln Ala Arg Lys Ala Phe Asp 660 665 670 Arg Ala Thr Lys Leu Glu Gln Glu Phe Thr Glu Cys Phe Ser Ala Ile 675 680 685 Val Glu Gly Asp Ser Phe Glu Glu Ile Tyr His Lys Val Lys Arg Val 690 695 700 Ile Glu Asp Leu Ser Gly Pro Tyr Ile Trp Val Pro Ala Arg Glu Arg 705 710 715 720 <210> 119 <211> 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synaptophysin isoform 1 <400> 119 Met Leu Leu Leu Ala Asp Met Asp Val Val Asn Gln Leu Val Ala Gly 1 5 10 15 Gly Gln Phe Arg Val Val Lys Glu Pro Leu Gly Phe Val Lys Val Leu 20 25 30 Gln Trp Val Phe Ala Ile Phe Ala Phe Ala Thr Cys Gly Ser Tyr Ser 35 40 45 Gly Glu Leu Gln Leu Ser Val Asp Cys Ala Asn Lys Thr Glu Ser Asp 50 55 60 Leu Ser Ile Glu Val Glu Phe Glu Tyr Pro Phe Arg Leu His Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Asp Ala Pro Thr Cys Arg Gly Gly Thr Thr Lys Val Phe Leu 85 90 95 Val Gly Asp Tyr Ser Ser Ser Ala Glu Phe Phe Val Thr Val Ala Val 100 105 110 Phe Ala Phe Leu Tyr Ser Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Phe Leu 115 120 125 Gln Asn Lys Tyr Arg Glu Asn Asn Lys Gly Pro Met Leu Asp Phe Leu 130 135 140 Ala Thr Ala Val Phe Ala Phe Met Trp Leu Val Ser Ser Ser Ala Trp 145 150 155 160 Ala Lys Gly Leu Ser Asp Val Lys Met Ala Thr Asp Pro Glu Asn Ile 165 170 175 Ile Lys Glu Met Pro Val Cys Arg Gln Thr Gly Asn Thr Cys Lys Glu 180 185 190 Leu Arg Asp Pro Val Thr Ser Gly Leu Asn Thr Ser Val Val Phe Gly 195 200 205 Phe Leu Asn Leu Val Leu Trp Val Gly Asn Leu Trp Phe Val Phe Lys 210 215 220 Glu Thr Gly Trp Ala Ala Pro Phe Leu Arg Ala Pro Pro Gly Ala Pro 225 230 235 240 Glu Lys Gln Pro Ala Pro Gly Asp Ala Tyr Gly Asp Ala Gly Tyr Gly 245 250 255 Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gln Asp Ser Tyr Gly Pro Gln Gly 260 265 270 Gly Tyr Gln Pro Asp Tyr Gly Gln Pro Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Tyr Gly Pro Gln Gly Asp Tyr Gly Gln Gln Gly Tyr Gly Pro Gln Gly 290 295 300 Ala Pro Thr Ser Phe Ser Asn Gln Met 305 310 <210> 120 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synaptophysin isoform 2 <400> 120 Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ile Phe Leu Gln Asn Lys Tyr Arg Glu 1 5 10 15 Asn Asn Lys Gly Pro Met Leu Asp Phe Leu Ala Thr Ala Val Phe Ala 20 25 30 Phe Met Trp Leu Val Ser Ser Ser Ala Trp Ala Lys Gly Leu Ser Asp 35 40 45 Val Lys Met Ala Thr Asp Pro Glu Asn Ile Ile Lys Glu Met Pro Val 50 55 60 Cys Arg Gln Thr Gly Asn Thr Cys Lys Glu Leu Arg Asp Pro Val Thr 65 70 75 80 Ser Gly Leu Asn Thr Ser Val Val Phe Gly Phe Leu Asn Leu Val Leu 85 90 95 Trp Val Gly Asn Leu Trp Phe Val Phe Lys Glu Thr Gly Trp Ala Ala 100 105 110 Pro Phe Leu Arg Ala Pro Pro Gly Ala Pro Glu Lys Gln Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Asp Ala Tyr Gly Asp Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Pro Gly Gly Tyr 130 135 140 Gly Pro Gln Asp Ser Tyr Gly Pro Gln Gly Gly Tyr Gln Pro Asp Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Pro Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Gly Pro Gln Gly Asp 165 170 175 Tyr Gly Gln Gln Gly Tyr Gly Pro Gln Gly Ala Pro Thr Ser Phe Ser 180 185 190 Asn Gln Met 195 <210> 121 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase-3 <400> 121 Met Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu 1 5 10 15 Glu Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile 35 40 45 Ile Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn 65 70 75 80 Leu Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile 85 90 95 Val Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser 100 105 110 Ser Phe Val Cys Val Leu Leu Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe 115 120 125 Gly Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg 130 135 140 Gly Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile 145 150 155 160 Gln Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Asp Ser 165 170 175 Gly Val Asp Asp Asp Met Ala Cys His Lys Ile Pro Val Glu Ala Asp 180 185 190 Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn 195 200 205 Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu Cys Ala Met Leu Lys 210 215 220 Gln Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Phe Met His Ile Leu Thr Arg Val Asn 225 230 235 240 Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser Phe Asp Ala Thr Phe 245 250 255 His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys Glu 260 265 270 Leu Tyr Phe Tyr His 275

Claims (74)

  1. 필요로 하는 대상체에서의 근긴장이상을 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 근긴장이상은 안검경련, 경부 근긴장이상(연축사경), 도파-반응성 근긴장이상, 약물 유도 근긴장이상(지발성 운동이상증), 기능성 근긴장이상, 전신 근긴장이상, 손 근긴장이상(서경), 하지 근긴장이상, 음악가 근긴장이상, 근간대 근긴장이상, 신경학적 또는 대사성 장애와 연관된 근긴장이상, 경구하악 근긴장이상(두개골 근긴장이상), 두개경수 근긴장이상, 상완 근긴장이상, 발작성 운동이상증, 소아 근긴장이상, 경련성 발성장애(후두 근긴장이상), 급속 발병성 근긴장이상-파킨슨증, 독소 유도 근긴장이상, 외상 유도 근긴장이상, x-연관 근긴장이상-파킨슨증, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  3. 필요로 하는 대상체에서의 신경정신 질환을 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 신경정신 질환은 조현병, 우울증, 자폐증, 발작, 주의력 결핍/과잉 행동 장애, 뚜렛 장애, 인지 결핍 장애, 중풍, 제어되지 않는 분노, 편두통, 섭식 장애(예를 들면, 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증), 우울증, 불안 장애(예를 들면, 외상 후 스트레스 장애) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  5. 필요로 하는 대상체에서의 지적 장애를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 지적 장애는 X 결함증후군, 다운 증후군, 프래더-윌리 증후군(PWS), 태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  7. 필요로 하는 대상체에서의 중독을 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제하는 화합물(miRNA 억제제)을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 중독은 화학적 중독, 행동 중독, 또는 둘 모두를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독은 비정상적인 수준의 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자와 연관이 있는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, miRNA 억제제는 대상체에서 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 대상체에서 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 수준은 PSD95 단백질 및/또는 PSD95 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배 이상으로 증가되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독은 비정상적인 수준의 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자와 연관이 있는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, miRNA 억제제는 대상체에서 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 대상체에서 시냅토피신 단백질 및/또는 시냅토피신 유전자의 수준은 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)과 비교하여 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배 이상으로 증가되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 근긴장이상, 신경정신 질환, 지적 장애 및/또는 중독은 비정상적인 수준의 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자와 연관이 있는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, miRNA 억제제는 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 수준을 감소시키는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 수준은 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 참조 수준(예를 들면, 투여 전 대상체에서 상응하는 수준 및/또는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체에서 수준)과 비교하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 감소되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 miR485-3p를 억제하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, miR485-3p는 5'-gucauacacggcucuccucucu-3' (서열번호: 1)를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서 miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, miRNA 억제제는 길이가 약 6 내지 약 30 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열의 5'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열의 3'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (서열번호: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (서열번호: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (서열번호: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 14), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 15); 5'-UGUAUGAC-3' (서열번호: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (서열번호: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (서열번호: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29), 및 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC (서열번호: 30)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 5'-TGTATGA-3' (서열번호: 62), 5'-GTGTATGA-3' (서열번호: 63), 5'-CGTGTATGA-3' (서열번호: 64), 5'-CCGTGTATGA-3' (서열번호: 65), 5'-GCCGTGTATGA-3' (서열번호: 66), 5'-AGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 67), 5'-GAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 68), 5'-AGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 69), 5'-GAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 70), 5'-GGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 71), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 72), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 73), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 74), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 75); 5'-TGTATGAC-3' (서열번호: 76), 5'-GTGTATGAC-3' (서열번호: 77), 5'-CGTGTATGAC-3' (서열번호: 78), 5'-CCGTGTATGAC-3' (서열번호: 79), 5'-GCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 80), 5'-AGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 81), 5'-GAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 82), 5'-AGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 83), 5'-GAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 84), 5'-GGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 85), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 86), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 87), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 89), 및 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제의 서열은 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, miRNA 억제제는 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 90% 유사성을 갖는 서열을 갖는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 1개 치환 또는 2개 치환을 갖는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30)를 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA), 비잠금 핵산 (UNA), 아라비노 핵산 (ABA), 브릿징된 핵산 (BNA), 및/또는 펩티드 핵산 (PNA)인, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 백본 변형을 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 백본 변형은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO) 및/또는 포스포로티오에이트 (PS) 변형이다.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 전달 제제로 전달되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 전달 제제는 미셀, 엑소좀, 리피도이드, 리포좀, 리포플렉스, 지질 나노입자, 세포외 소포, 합성 소포, 중합체성 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브, 접합체, 바이러스 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 전달 제제는 하기를 포함하는 양이온성 담체 단위체를 포함하는, 방법:
    [WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (화학식 I)
    또는
    [WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (화학식 II)
    여기서
    WP는 수용성 생체고분자 모이어티이고;
    CC는 양이온성 담체 모이어티이고;
    AM은 보조제 모이어티이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 임의적 링커이다.
  37. 제36항에 있어서, 양이온성 담체 단위체 및 단리된 폴리뉴클레오티드는 함께 혼합될 때 미셀을 형성하도록 서로 연관될 수 있는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 연관은 공유 결합을 통한 것인, 방법.
  39. 제37항에 있어서, 연관은 비-공유 결합을 통한 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 비-공유 결합은 이온성 결합을 포함하는, 방법.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린 ("POZ") 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리글리세롤, 또는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG")을 포함하는, 방법.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 하기를 포함하는, 방법:
    , (화학식 I),
    여기서 n은 1-1000이다.
  44. 제43항에 있어서, n은 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 또는 적어도 약 141인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 140 내지 약 150, 또는 약 150 내지 약 160인, 방법.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 선형, 분지형, 또는 수지상인, 방법.
  47. 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 담체 모이어티는 하나 이상의 염기성 아미노산을 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 양이온성 담체 모이어티는 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 26, 적어도 약 27, 적어도 약 28, 적어도 약 29, 적어도 약 30, 적어도 약 31, 적어도 약 32, 적어도 약 33, 적어도 약 34, 적어도 약 35, 적어도 약 36, 적어도 약 37, 적어도 약 38, 적어도 약 39, 적어도 약 40, 적어도 약 41, 적어도 약 42, 적어도 약 43, 적어도 약 44, 적어도 약 45, 적어도 약 46, 적어도 약 47, 적어도 약 48, 적어도 약 49, 또는 적어도 약 50개의 염기성 아미노산을 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 양이온성 담체 모이어티는 약 30 내지 약 50개의 염기성 아미노산을 포함하는, 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  51. 제36항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 담체 모이어티는 약 40개의 라이신 단량체를 포함하는, 방법.
  52. 제36항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제 모이어티는 면역 반응, 염증성 반응, 및/또는 조직을 조정할 수 있는, 방법.
  53. 제36항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제 모이어티는 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 보조제 모이어티는 하기를 포함하는, 방법:
    , (화학식 II),
    여기서 G1 및 G2 각각은 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬이거나, G1 및 G2는 함께 방향족 고리를 형성하고, 여기서 n은 1-10이다.
  55. 제53항에 있어서, 보조제 모이어티는 니트로이미다졸을 포함하는, 방법.
  56. 제53항에 있어서, 보조제 모이어티는 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  57. 제36항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제 모이어티는 아미노산을 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 보조제 모이어티는 하기를 포함하는, 방법:
    (화학식 III),
    여기서 Ar은 또는 이고,
    여기서 Z1 및 Z2의 각각은 H 또는 OH이다.
  59. 제36항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제 모이어티는 비타민을 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 비타민은 환식 고리 또는 환식 헤테로 원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함하는, 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 비타민은 하기를 포함하는, 방법:
    (화학식 IV),
    여기서 Y1 및 Y2의 각각은 C, N, O, 또는 S이고, n은 1 또는 2이다.
  62. 제53항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 M, 비타민 H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 비타민은 비타민 B3인, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 보조제 모이어티는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개 비타민 B3을 포함하는, 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제 모이어티는 약 10개 비타민 B3을 포함하는, 방법.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 제제는 약 120 내지 약 130 PEG 단위체를 가진 수용성 생체고분자 모이어티, 약 30 내지 약 40개 라이신을 가진 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10개 비타민 B3를 가진 보조제 모이어티를 포함하는, 방법.
  67. 제36항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 담체 단위체는 miRNA 억제제를 효소적 분해로부터 보호할 수 있는, 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA 억제제는 비경구, 근육내, 피하, 눈, 정맥내, 복강내, 피내, 안와내, 뇌내, 두개내, 뇌실내, 척수내, 심실내, 척수강내, 수조내, 피막내, 종양내, 국소, 또는 이들의 임의의 조합으로 투여되는, 방법.
  69. 제35항에 있어서, 전달 제제는 미셀인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 미셀은 (i) 약 100 내지 약 200개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 30 내지 약 40개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 15 내지 약 20개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 30 내지 약 40개 라이신을 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 미셀은 (i) 약 120 내지 약 130개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 32개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 16개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 32개 라이신을 포함하는, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 표적화 모이어티가 PEG 단위체에 추가로 연결되는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 표적화 모이어티는 LAT1 표적화 리간드인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 표적화 모이어티는 페닐알라닌인, 방법.
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