CN111836624A

CN111836624A - 靶向α-突触核蛋白的反义寡核苷酸及其用途

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Publication number: CN111836624A
Application number: CN201980018031.0A
Authority: CN
Inventors: R·E·奥尔森; A·M·卡拉斯; 小杰雷·E·梅雷迪思; N·迪韦齐斯; J·K·洛伊; C·J·巴尔迪克; A·潘德里; I·M·麦克唐纳; P·哈格多恩; M·L·詹森
Original assignee: Roche Innovation Center Copenhagen AS; Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Roche Innovation Center Copenhagen AS; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2020-10-27
Also published as: JP2024037914A; SG11202006526YA; CO2020008425A2; MX2020007433A; US11359197B2; CA3088112A1; EP3737387A1; AU2019208006A1; KR20200140793A; BR112020013994A2; US20210180065A1; IL275902A; US11447775B2; JP2021510512A; JP7455746B2; WO2019140231A1; PE20201501A1; EA202091695A1; US20200354720A1; US20230193260A1

Abstract

本公开涉及反义寡核苷酸，其靶向细胞中的SNCA mRNA(例如，内含子外显子连接处)，从而导致SNCA蛋白的表达降低。SNCA蛋白的表达降低对于某些医学疾病例如神经障碍的治疗是有益的。

Description

靶向α-突触核蛋白的反义寡核苷酸及其用途

对以电子方式提交的序列表的引用

在本申请中提交的2019年电子提交序列表(名称：3338_107PC01_SequenceListing_ST25.txt，大小：10,458字节；创建日期：2019年1月10日)的内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开涉及靶向细胞中α-突触核蛋白(SNCA)转录物的内含子1与外显子2的连接处，导致α-突触核蛋白(SNCA)蛋白表达降低的反义寡聚化合物(ASO)。SNCA蛋白表达的降低能够对大量医学疾病例如多系统萎缩症、帕金森氏病、帕金森氏病痴呆症(PDD)和路易体痴呆有益。

背景技术

α-突触核蛋白(SNCA)是突触核蛋白家族的成员，是一种主要在神经组织内表达的一种小的可溶性蛋白。参见Marques O等人，Cell Death Dis.19:e350(2012)。它在许多细胞类型中表达，但主要位于神经元的突触前末端。尽管尚未完全阐明其精确功能，但已显示SNCA在突触传递的调节中起重要作用。例如，SNCA在SNARE复合物的形成中充当分子伴侣，其介导突触小泡与神经元的突触前膜的对接。SNCA还可以与其他蛋白质相互作用(例如与微管相关的蛋白tau)，它有助于稳定微管并调节囊泡运输。

由于SNCA在突触传递的调节中的作用，SNCA表达和/或功能的改变可破坏关键的生物学过程。人们认为这种破坏会导致α-共核蛋白病，这是特征在于SNCA蛋白聚集体在脑内异常积聚的神经退行性疾病。因此，错误折叠、聚集和磷酸化的SNCA蛋白的不溶性内含物是诸如帕金森氏病(PD)、帕金森氏病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)和多系统萎缩症(MSA)等疾病的病理标志。参见Galvin JE等人，Archives of Neurology 58:186-190(2001)；和Valera E等人,J Neurochem 139Suppl 1:346-352(2016年10月)。

α-共核蛋白病，例如帕金森氏病，是高度流行的进行性神经退行性脑疾病，特别是在老年人中。参见Recchia A等人，FASEB J.18:617-26(2004)。据估计，全世界大约有七百万至一千万人患有这种疾病，仅在美国每年就有约60,000例新病例。一个人的药物治疗费用很容易超过每年2500美元，每位患者的治疗性手术费用高达100,000美元。因此，迫切需要更有力和更具成本效益的治疗选择。

发明内容

本公开涉及反义寡核苷酸(ASO)，其包含AtTcctttacaccACAC(SEQ ID NO:4)的连续核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中大写字母是β-D-氧基-LNA并且小写字母是DNA。在其它实施方案中，ASO包含选自以下的核苷酸间连接：磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基磷酸酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键及其组合。在某些实施方案中，核苷酸间连接为硫代磷酸酯键。

在一些实施方案中，ASO包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：OxyAs DNAtsOxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAsOxyMCs OxyAs OxyMC，其中OxyA、OxyT和Oxy MC分别是腺嘌呤β-D-氧基-LNA、胸腺嘧啶βD-氧基-LNA和甲基胞嘧啶βD-氧基-LNA，且其中DNAt、DNAc和DNAa分别是胸腺嘧啶DNA、胞嘧啶DNA和腺嘌呤DNA。在一些实施方案中，本公开的ASO包含分子式C₁₇₁H₂₁₄N₅₆O₉₀P₁₆S₁₆和如图1B所示的结构，其中M⁺是抗衡离子。在一些实施方案中，抗衡离子选自H⁺、N^a+、NH4⁺以及它们的任何组合。在某些实施方案中，抗衡离子是Na⁺。

本公开还提供了包含本文所公开的ASO的缀合物，其中所述ASO共价附接到至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。在一些实施方案中，非核苷酸或非多核苷酸部分包含蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其任何组合。

本文还提供了药物组合物，其包含本文公开的ASO或缀合物以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，该组合物还包含治疗剂。在某些实施方案中，治疗剂是α-突触核蛋白拮抗剂。在一些实施方案中，α-突触核蛋白拮抗剂是抗α-突触核蛋白抗体或其片段。

本公开进一步提供了试剂盒，其包含本文所公开的ASO、缀合物或组合物。还公开了一种诊断试剂盒，其包含本公开的ASO、缀合物或组合物。

本公开还涉及抑制或降低细胞中SNCA蛋白表达的方法，该方法包括将本文所公开的ASO、缀合物或组合物施用至表达SNCA蛋白的细胞，其中细胞中SNCA蛋白的表达在施用后被抑制或降低。在一些实施方案中，ASO在施用后抑制或降低细胞中SNCA mRNA的表达。在某些实施方案中，与未暴露于ASO的细胞相比，SNCA mRNA的表达在施用后降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。在其他实施方案中，与未暴露于ASO的细胞相比，ASO在施用后使细胞中SNCA蛋白的表达降低至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一些实施方案中，细胞是神经元。

本文提供了在有此需要的受试者中治疗突触核蛋白病的方法，其包括施用有效量的本公开的ASO、缀合物或组合物。在一些实施方案中，突触核蛋白病选自帕金森氏病、帕金森氏病痴呆症(PDD)、多系统萎缩症、路易体痴呆症及其任何组合。

本文还提供了本公开的ASO、缀合物或组合物在制备药物中的用途。本公开还提供了ASO、缀合物或组合物在制备用于治疗有此需要的受试者中的突触核蛋白病的药物中的用途。在一些实施方案中，本公开的ASO、缀合物或组合物用于治疗有此需要的受试者中的突触核蛋白病。在其他实施方案中，本公开的ASO、缀合物或组合物用于治疗。

在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方案中，ASO、缀合物或组合物经口服、肠胃外、鞘内、脑室内、肺、局部或心室内施用。

附图说明

图1A示出了ASO-005459的连续核苷酸序列。OxyA、OxyT和Oxy MC分别是腺嘌呤βD-氧基-LNA、胸腺嘧啶βD-氧基-LNA和甲基胞嘧啶βD-氧基-LNA；DNAt、DNAc和DNAa分别是胸腺嘧啶DNA、胞嘧啶DNA和腺嘌呤DNA；并且s是硫代磷酸酯键。

图1B示出了本文公开的ASO-005459的分子结构。所提供的结构具有分子式C₁₇₁H₂₁₄N₅₆O₉₀P₁₆S₁₆，并且每个M+是药学上可接受的抗衡离子诸如H⁺、Na⁺或NH₄ ⁺。

图2A和2B显示了ASO-005459对分离自A53T-PAC转基因小鼠的原代神经元中的SNCA和微管蛋白(Tub)蛋白表达的影响。用10点滴定的ASO-005459处理神经元，并测量SNCA和微管蛋白的量。显示了α-Syn/Tub比率的抑制百分比(图2A)和Tub水平的抑制百分比(图2B)。每个数据点代表一个单独的重复。

图3显示了ASO-005459对人神经元中SNCA(圆圈)、蛋白S(α)(PROS1(正方形))和微管蛋白(TUBB3(三角形))mRNA的表达水平的影响。用各种浓度的ASO-005459处理神经元6天，然后通过

测定法测量mRNA水平。mRNA的表达水平显示为对照的百分比。所示数据代表重复测定的平均值±SD。

图4显示了在ICV施用100μg的ASO-005459(空心正方形)或对照媒介物(实心圆)后三天，A53T-PAC小鼠海马体中的SNCA mRNA表达水平。通过qRT-PCR测量SNCA mRNA表达水平，将其归一化为GAPDH mRNA，然后表达为相对于媒介物组的平均表达水平表达。水平线将参考值标记为1(即在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介物对照组中观察到的表达水平相等)。所示数据代表重复测定的平均值±SD。显示的统计数据基于带有Dunnett的事后检验的单因素ANOVA。***p＜0.001。

图5A和5B显示了用ASO-005459处理的小鼠的平均体重的比较。在图5A中，给A53T-PAC小鼠施用3.13μg、12.5μg、25μg或50μg的ASO-005459，并在处理后的第0、1和2周测量其体重。在图5B，给C57BL/6小鼠给药100μg ASO-005459，并在28天的过程中每周测量一次动物体重。在图5A和5B两个图中，将接受媒介物对照的动物用作对照。显示的数据代表多只动物的平均值±SD(n＝5)。显示的统计数据基于双因素方差分析。

图6A、6B和6C显示了ICV施用ASO-005459(3.13μg、12.5μg、25μg或50μg)或媒介物对照后14天，A53T-PAC小鼠的海马体(图11A)、脑干(图11B)和纹状体(图11C)中的SNCAmRNA表达水平。通过qRT-PCR测量SNCA mRNA水平，将其归一化至GAPDH mRNA，然后表达为相对于媒介物组的平均值的量。显示的数据代表来自多只动物(n＝5)的平均±SD。每个圆圈代表一只动物。水平线将参考值标记为1(即在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介物对照组中观察到的表达水平相等)。显示的统计数据基于带有Dunnett事后检验的单因素ANOVA。***p＜0.001。

图7显示了在ASO-005459处理后14天，在A53T-PAC小鼠的海马体(黑色)、脑干(浅灰色)和纹状体(深灰色)中检测到的ASO-005459水平。通过ICV施用，小鼠接受了3.13μg、12.5μg、25μg或50μg的ASO-005459。显示的数据代表多只动物(n＝5)的平均值±SD。

图8A、8B、8C和8D显示了ASO-005459暴露水平与ASO-005459处理后14天A53T-PAC小鼠的海马体(图8A)、脑干(图8B)和纹状体(图8C)中的SNCA mRNA表达之间的关系。图8D显示了来自海马体(圆形)、脑干(正方形)和纹状体(三角形)组合的数据。每个数据点代表一只动物。显示了海马体(图8A)和脑干(图8B)的四参数非线性拟合。

图9A和9B显示了ASO-005459对A53T-PAC小鼠中SNCA mRNA表达水平的作用的剂量响应曲线。动物(通过ICV注射)接受12.5μg(圆形)、25μg(盒)或50μg(三角形)的ASO-005459，并在给药后24小时、3天、4、8、12、16和20周处死。通过qRT-PCR评估脑干(图9A)和纹状体(图9B)中的SNCA mRNA表达水平，然后将其归一化至媒介物对照。显示了平均数据。水平线将参考值标记为100％(即在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介对照组中观察到的表达水平相等)。

图10A和10B显示了在ASO-005459对ASO-005459施用4周后A53T-PAC小鼠中SNCAmRNA表达水平的影响。动物接受了媒介物对照或不同浓度的ASO-005459(12.5、25或50μg)。显示了脑干(图15A)和纹状体(图10B)的相对SNCA mRNA表达水平(归一化至媒介物对照)。每个数据点代表一只动物。还显示了来自多只动物的平均值±SD。显示的统计数据基于采用用于多次比较的具有Dunnett校正的单因素ANOVA的与媒介物组的比较。水平线将参考值标记为1(即在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介物对照组中观察到的表达水平相等)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。

图11A和11B显示了ASO-005459对A53T-PAC小鼠的脑组织中SNCA蛋白表达水平的作用的剂量响应曲线。动物(通过ICV注射)接受12.5μg(圆形)、25μg(盒)或50μg(三角形)的ASO-005459，并在给药后24小时、3天、4、8、12、16和20周处死。通过ELISA测量了脑干(图11A)和纹状体(图11B)中的SNCA蛋白水平，然后将其归一化至媒介物对照。显示了平均数据。水平线将参考值标记为100％(在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介物对照组中观察到的表达水平相等)。

图12A和12B显示了在ASO-005459施用后8周，ASO-005459对A53T-PAC小鼠中SNCA蛋白表达水平的影响。动物接受了媒介物对照或不同浓度的ASO-005459(12.5、25或50μg)。显示了脑干(图12A)和纹状体(图12B)的相对SNCA蛋白表达水平(归一化至媒介物对照)。每个数据点代表一只动物。水平线将参考值标记为100％(即在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介物对照组中观察到的表达水平相等)。还显示了来自多只动物的平均值±SD。显示的统计数据基于使用用于多次比较的带有Dunnett校正的单因素ANOVA的与媒介物组的比较。

图13A和13B显示了在施用ASO-005459后的食蟹猴中SNCA mRNA和SNCA蛋白表达水平的动力学。每只动物接受媒介物对照或ASO-005459(8mg)，然后在给药后24小时、3天、2、4、8、13或20周处死。在每个时间点，在以下组织中评估SNCA mRNA(图13A)和SNCA蛋白(图13B)的表达水平：髓质(左上图)、尾状核(上中图)、脑桥(右上图)、小脑(左下方)、腰椎脊髓(中下方)和额皮质(右下方)。表达水平显示为媒介物对照的百分比。显示了单个动物的数据和平均值。水平线将参考值标记为100％(即在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介物对照组中观察到的表达水平相等)。

图14A和14B显示了在ASO-005459施用后2周，食蟹猴中SNCA mRNA(图14A)和SNCA蛋白(图14B)两者的相对表达水平(作为媒介物对照的百分比)。动物接受媒介物对照或不同浓度的ASO-005459(2、4或8mg)。在以下组织中评估表达水平：髓质(左上图)、尾状核(上中图)、脑桥(右上图)、小脑(左下图)、腰椎脊髓(中下图)和额皮质(右下图)。表达水平显示为媒介物对照的百分比。显示了单个动物的数据和平均值。水平线将参考值标记为100％(即在该值处的SNCA mRNA表达与在媒介物对照组中观察到的表达水平相等)。

发明详述

I.定义

应注意，术语“一个(a)”或“一个(an)”实体是指一个或多个该实体；例如，“核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。同样地，术语“一个(a)”(或“一个(an)”)，“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。

此外，在此使用的“和/或”应被视为两个指定的特征或部件中的每个与另一个一起或不与另一个一起的具体公开。因此，在本文中诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；(单独)；和C(单独)。

应当理解，无论在何处在本文中用语言“包含”来描述方面，都还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”措辞描述的其它方面。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关的领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，《生物医学和分子生物学简明词典》，Juo，Pei-Show，第二版，2002，CRC出版社；《细胞和分子生物学词典》，第三版，1999年，学术出版社；和《牛津生物化学和分子生物学词典》，修订版，2000，牛津大学出版社，向普通技术人员提供了在该公开内容中使用的许多术语的综合词典。

单元、前缀和符号以其Système International de Unites(SI)接受的形式表示。数字范围包括限定范围的数字。除非另有说明，否则核苷酸序列以5'至3'的方向从左至右书写。氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，本公开的各个方面可以通过整体参考说明书来获得。相应地，通过参考整个说明书更完整地定义了下面直接定义的术语。

术语“约”在本文中用于意指近似、大致、大约或在其区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展在所述数值的上方和下方的边界来修改该范围。通常，术语“约”可以将所述值之上和之下的数值修改向上或向下(更高或更低)例如10％的变化。例如，如果说“施用ASO后ASO使细胞中SNCA蛋白的表达降低至少约60％”，则暗示SNCA水平降低了50％至70％的范围。

术语“反义寡核苷酸”(ASO)是指核苷的寡聚物或多聚物，例如天然存在的核苷或其修饰形式，其通过核苷酸间连接彼此共价连接。可用于本公开的ASO包括至少一种非天然存在的核苷。ASO与靶核酸互补，使得ASO与靶核酸序列杂交。本文所用的术语“反义ASO”、“ASO”和“寡聚物”可与术语“ASO”互换。

术语“核酸”或“核苷酸”旨在涵盖多种核酸。在一些实施方案中，术语“核酸”或“核苷酸”是指体内或体外的靶序列，例如前mRNA、mRNA或DNA。当该术语指靶序列中的核酸或核苷酸时，核酸或核苷酸可以是细胞内天然存在的序列。在其他实施方案中，“核酸”或“核苷酸”是指本公开的ASO中的序列。当该术语是指ASO中的序列时，核酸或核苷酸不是天然存在的，即化学合成的、酶促产生的、重组产生的或其任意组合。在一个实施方案中，ASO中的核酸或核苷酸是合成或重组产生的，但不是天然存在的序列或其片段。在另一个实施方案中，ASO中的核酸或核苷酸不是天然存在的，因为它们包含至少一个不是在自然中天然存在的核苷酸类似物。术语“核酸”或“核苷”是指存在于多核苷酸中的单个核酸区段，例如DNA、RNA或其类似物。“核酸”或“核苷”包括天然存在的核酸或非天然存在的核酸。在一些实施方案中，术语“核苷酸”、“单元”和“单体”可互换使用。将会认识到，当提及核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基的序列，例如A、T、G、C或U及其类似物。

如本文所用，术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接基团(连接基团)，例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团的糖苷，并且涵盖天然存在的核苷酸例如DNA或RNA以及非天然存在的包含修饰的糖和/或碱基的核苷酸。在本文中，单核苷酸(单元)可以被称为单体或核酸单元。

如本文所用，术语“核苷”用于指包含糖部分和碱基部分的糖苷，其可以通过ASO的核苷之间的核苷酸间连接共价连接。在生物技术领域中，术语“核苷”通常用于指核酸单体或单元。在ASO的上下文中，术语“核苷”可仅指碱基，即包含胞嘧啶(DNA和RNA)、鸟嘌呤(DNA和RNA)、腺嘌呤(DNA和RNA)、胸腺嘧啶(DNA)和尿嘧啶(RNA)的核碱基序列，其中糖主链和核苷酸间连接的存在是隐含的。同样，特别是在寡核苷酸中一个或多个核苷酸间连接基团被修饰的情况下，术语“核苷酸”可以指“核苷”。例如，甚至当指定了核苷之间键的存在或性质，也可以使用术语“核苷酸”。

如本领域普通技术人员将认识到的，尽管寡核苷酸的5'末端核苷酸可以包含5'末端基团，但其不包含5'核苷酸间连接基团。

当提及核苷酸序列时，术语“下游”是指核酸或核苷酸序列位于参考核苷酸序列的3'。在某些实施方案中，下游核苷酸序列涉及在转录起始位点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。

除非另有说明，否则本文提供的序列从5'端(左)至3'端(右)列出。

术语“上游”是指位于参考核苷酸序列5'的核苷酸序列。

如本文所用，术语“转录物”可以指通过DNA的转录合成的并且在加工后成为信使RNA(mRNA)的初级转录物，即前体信使RNA(前mRNA)，以及且经加工的mRNA本身。术语“转录物”可以与“前mRNA”和“mRNA”互换使用。将DNA链转录成初级转录物后，可以若干方式修饰新合成的初级转录物，使其转化为其成熟的功能形式，例如mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA等。因此，术语“转录物”可以包括外显子、内含子、5'UTR和3'UTR。

如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物例如RNA或多肽的过程。它包括但不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)和mRNA翻译成多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸例如通过基因转录产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化或剪接)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质的添加、与其他蛋白质亚基缔合或蛋白水解切割)的多肽。

术语SNCA多肽的“天然存在的变体”是指天然存在于限定的分类学组(例如哺乳动物，例如小鼠、猴和人)内的SNCA多肽序列或SNCA核酸序列(例如，转录物)变体。通常，当提及SNCA多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还可以涵盖通过染色体易位或复制在染色体位置17q21处发现的编码SNCA的基因组DNA的任何等位基因变体，以及RNA，例如由其衍生的mRNA。“天然存在的变体”还可以包括源自SNCA mRNA的选择性剪接的变体。当提及特定的多肽序列时，例如，该术语还包括该蛋白质的天然存在形式，因此其可以例如通过共翻译或翻译后修饰(例如信号肽切割、蛋白水解切割、糖基化等)被加工。

如本文所用，术语“互补序列”表示与参考序列互补的序列。众所周知，互补性是DNA复制和转录的基本原理，因为互补性是两个DNA或RNA序列之间共有的一种特性，因此当它们相互反平行比对时，序列中每个位置处的核苷酸碱基都是互补的，就像照镜子一样，看到事物的反向。因此，例如，序列5'“ATGC”3'的互补序列可以写为3'“TACG”5'或5'“GCAT3'。本文所用的术语“反向互补序列”、“反向互补的”和“反向互补性”可与术语“互补序列”、“互补的”和“互补性”互换。因此，5'attcctttacaccacac 3'(SEQ ID NO:4)的序列可以与5'gtgtggtgtaaaggaat 3'互补。

如本文所使用的，提及SEQ ID号(即SEQ ID NO:4)包括特定核碱基序列，但是不包括任何设计或完整化学结构。当本说明书提及特定ASO号(即ASO-005459)时，该提及包括序列、特定ASO设计以及化学结构。

除非另有说明，否则“效力”通常表示为以μM、nM或pM计的IC₅₀或EC₅₀值。效力也可以用抑制百分比表示。IC₅₀是治疗性分子的中值抑制浓度。EC₅₀是相对于媒介物或对照(例如盐水)的治疗性分子的中值有效浓度。在功能测定中，IC₅₀是将生物学响应(例如，mRNA转录或蛋白质表达)降低了该治疗分子所达到的生物学响应的50％的治疗分子的浓度。在功能测定中，EC₅₀是产生50％的生物学响应(例如mRNA转录或蛋白质表达)的治疗分子的浓度。IC₅₀或EC₅₀可以通过本领域已知的许多手段来计算。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家养动物、农场动物、运动动物和动物园动物，包括例如人类、非人类灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。

术语“药物组合物”是指这样的制剂，其形式为允许活性成分的生物活性有效，并且不包含对将被施用组合物的受试者产生不可接受的毒性的额外组分。这样的组合物可以是无菌的。

本文所公开的ASO的“有效量”是足以执行明确规定的目的的量。相对于所述规定目的，可以凭经验并以常规方式确定“有效量”。

诸如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“以治疗(to treat)”或“减轻(alleviating)”或“以减轻(to alleviate)”之类的术语是指(1)治愈、减慢确诊病理状况或病症、减轻确诊的病理状况或病症的症状和/或停止确诊病理状况或病症的进展的治疗措施；和(2)预防和/或减缓目标病理状况或病症的进展的预防性(prophylactic)和/或预防(preventative)措施。因此，需要治疗的那些包括已经患有该疾病的那些；有患病倾向的那些；以及其病症待被预防的那些。在某些实施方案中，如果患者显示例如与疾病或病症相关的症状的全部、部分或暂时的减轻或消除，则根据本文提供的方法成功地“治疗”了受试者的对本文其他处所公开的疾病或病症。

II.ASO-005459

本公开的ASO(即ASO-005459)包含长度为17个核苷酸的连续核苷酸序列，其对应于SNCA转录物的区域(即内含子1和外显子2之间的连接处)(即SEQ ID NO:1的第7,604-7,620位核苷酸)的互补序列。本公开的ASO具有SEQ ID NO:4中列出的核苷酸序列(即attcctttacaccacacac)，其ASO设计为LDLDDDDDDDDDDLLLL(即AtTcctttacaccACAC)，其中，L表示锁核酸核苷(即LNA，例如β-D-氧基-LNA)，D表示脱氧核糖核酸(DNA)。因此，从ASO-005459的5'端开始的第1个、第3个和第14-17个核苷酸是β-D-氧基-LNA，其他每个核苷酸都是DNA。本文公开的ASO还具有以下化学结构：OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAtsDNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC，其中“s”表示硫代磷酸酯键。在图1B中提供了ASO-005459的结构式，其中M+是药学上可接受的抗衡离子。如本文所用，术语“药学上可接受的抗衡离子”是指伴随离子种类的离子，以维持生物学或其他方面不合需要的电中性，从而允许产生药学上可接受的盐形式。因此，在一些实施方案中，药学上可接受的抗衡离子可以是H⁺、Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Li⁺或任何其他带1⁺电荷的阳离子。在一些实施方案中，药学上可接受的抗衡离子是H⁺、Na⁺、NH₄ ⁺及其组合。

如本文所使用的术语“药学上可接受的盐”是指ASO-005459的衍生物，其中ASO-005459通过制作其盐而对ASO-005459进行修饰(例如添加本文所公开的阳离子)。这样的盐保留ASO的所需生物学活性而不会赋予不需要的毒理学作用。本公开的ASO可以为任何盐形式。在一些实施方案中，本公开的ASO为钠盐形式。在其它实施方案中，ASO为钾盐形式。

ASO-005459可以结合到SNCA mRNA的内含子1/外显子2连接处并阻止SNCA mRNA的翻译。在一些实施方案中，由于糖修饰，本公开的ASO具有下列的与靶RNA序列的结合亲和力，所述结合亲和力与对照(不具有这样的糖修饰的ASO)相比增强了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

本文所述的ASO的单体通过连接基团偶联在一起。适当地，每个单体通过连接基团与3'相邻单体连接。

本领域普通技术人员将理解，在本公开的上下文中，在ASO末端的5'单体不包含5'连接基团，尽管其可以包含或可以不包含5'末端基团。

术语“连接基团”和“核苷酸间连接”旨在表示能够将两个核苷酸共价偶联在一起的基团。实例包括磷酸基团和硫代磷酸基团。

核苷酸间连接的实例包括磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键及其组合。还参见通过引用以其整体并入本文的WO2007/031091。

在本公开的ASO的一方面，核苷酸通过硫代磷酸酯基团彼此连接。

认识到磷酸二酯键例如一个或两个键包含在另外的硫代磷酸酯ASO中，特别是在核苷酸之间或附近，可以改变ASO的生物利用度和/或生物分布——参见通过引用并入本文的WO2008/113832。

在一些实施方式中，例如上述实施方案，在适当且未特别指出的情况下，所有剩余的连接基团为磷酸二酯或硫代磷酸酯或其混合物。

在一些实施方案中，所有核苷酸间连接基团均为硫代磷酸酯。

“LNA核苷”是2'-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2'和C4'的二基连接(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交(双链体稳定化)的亲和力增强相关。这可以通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度常规确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76、Seth等人J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81以及Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238以及Wan和Seth,J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667。

在方案1中公开了其他非限制性的示例性LNA核苷。

方案1

在一个特定实施方案，用于本公开的LNA是β-D-氧基-LNA。

II.A.缀合物

本文所用的术语缀合物是指与非核苷酸部分共价连接的ASO-005459。

ASO-005459与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以改善ASO的药理学，例如，通过影响ASO的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性。在一些实施方案中，缀合部分通过改善ASO的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄取来修饰或增强ASO的药代动力学性质。具体地，缀合物可将ASO靶向特定的器官、组织或细胞类型，从而增强ASO在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低ASO在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。WO93/07883和WO2013/033230提供了合适的缀合部分。其他合适的缀合部分是能够结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)的那些部分。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合部分适于结合至ASGPr，参见例如WO2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620。

ASO缀合物及其合成也已经在Manoharan in Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103的全面综述中报道。

在一些实施方案中，非核苷酸部分(缀合部分)选自糖类、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)及其组合。

II.B.活化的ASO

如本文所用，术语“活化的ASO”是指与至少一个允许将ASO共价连接至一个或多个缀合部分的功能性部分共价连接(即，官能化)的本公开的ASO，一个或多个缀合部分即形成本文所述的缀合物的本身不是核酸或单体的部分。通常，功能部分将包含能够通过例如腺嘌呤碱基的3'-羟基或环外NH₂基团与ASO共价键合的化学基团，可以是能够结合至缀合部分的亲水末端基团的间隔区(例如，氨基，巯基或羟基)。在一些实施方案中，该末端基团不受保护，例如是NH₂基团。在其他实施方案中，末端基团受到保护，例如被任何合适的保护基团保护，保护基团例如Theodora W Greene和Peter G M Wuts的“Protective Groups inOrganic Synthesis”，第三版(John Wiley&Sons，1999)中描述的那些。

在一些实施方案中，ASO-005459在5'端被官能化以允许将缀合部分共价附接于ASO的5'端。在其他实施方案中，本公开的ASO可以在3'端被官能化。在其他实施方案中，本公开的ASO可以沿着主链或在杂环碱基部分上被官能化。在其他实施方案中，本公开的ASO可以在一个以上独立地选自5'端、3'端、主链和碱基的位置处被官能化。

在一些实施方案中，本公开的活化的ASO是通过在合成过程中掺入共价附接到功能部分的一种或多种单体来合成的。在其他实施方案中，本公开的活化的ASO是使用尚未被官能化的单体合成的，并且ASO在合成完成时被官能化。

III.药物组合物和施用途径

ASO-005459可以用于药物制剂和组合物中。合适地，这样的组合物包含药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。

ASO-005459可以以足以向患者递送治疗有效量而不在所治疗的患者中引起严重副作用的量包含在单位制剂中，例如包含在药学上可接受的载体或稀释剂中。然而，在某些形式的治疗中，从确保治疗性治疗的积极结果的角度，严重的副作用是可以接受的。

配制的药物可以包含药学上可接受的结合剂和佐剂。胶囊、片剂或丸剂可包含例如以下化合物：微晶纤维素、树胶或明胶作为粘合剂；淀粉或乳糖作为赋形剂；硬脂酸盐作为润滑剂；多种甜味剂或调味剂。对于胶囊剂，剂量单位可包含液体载体，例如脂肪油。同样，糖或肠溶剂的包衣可以是剂量单位的一部分。寡核苷酸制剂也可以是活性药物成分与形成微囊乳剂的脂质的乳剂。

本公开的药物组合物可以以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及要治疗的区域。施用可以是(a)口服(b)肺部施用，例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内，(c)局部给药，包括表皮、经皮、眼科和至粘膜，包括阴道和直肠递送；或(d)肠胃外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内施用，例如鞘内、脑室内或心室内给药。在一个实施方案中，ASO-005459经静脉内、腹膜内、口服、局部或以推注注射或直接施用于靶器官中。在一些实施方案中，将ASO-005459鞘内或脑室内以推注注射施用。

用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体和粉剂。常规药物载体，水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的。局部用制剂的实例包括其中ASO-005459与局部用递送剂例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些制剂。口服施用的组合物和制剂包括但不限于粉末或颗粒、微粒，纳米微粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液，胶囊、凝胶胶囊、小药囊、片剂或小片。用于肠胃外、鞘内、脑室内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。

本公开的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分产生，这些组分包括但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。可以通过载体介导的递送来增强药物向靶组织的递送，所述载体介导的递送包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树状聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒和微球(Dass CR.J Pharm Pharmacol 2002；54(1):3-27)。

可以方便地以单位剂型存在的本公开的药物制剂，可以根据制药工业中众所周知的常规技术来制备。这样的技术包括使活性成分与一种或多种药物载体或一种或多种赋形剂缔合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地缔合在一起，然后，如果需要，将产品成型来制备制剂。

对于肠胃外、皮下、皮内或局部施用，制剂可以包括无菌稀释剂、缓冲剂、张力调节剂和抗菌剂。可以用可防止降解或立即从体内清除的载体制备活性ASO，包括具有控释特性的植入物或微胶囊。对于静脉内施用，载体可以是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水。通过引用并入本文的2007年3月22日公开的国际公开号WO2007/031091(A2)还提供了合适的药学上可接受的稀释剂、载体和佐剂。

IV.诊断程序

本公开进一步提供了在诊断与SNCA有关的疾病例如突触核蛋白病期间有用的诊断方法。突触核蛋白病的非限制性实例包括但不限于帕金森氏病、帕金森氏病痴呆症(PDD)、路易体痴呆和多系统萎缩。

ASO-005459可以用于测量来自个体的组织或体液中的SNCA转录物的表达，并将测量的表达水平与正常组织或体液中的标准SNCA转录物表达水平进行比较，从而与标准相比表达水平增加指示可通过ASO-005459治疗的病症。

使用本领域技术人员已知的任何方法，ASO-005459可以用于测定生物样品中的SNCA转录物水平。(Touboul等人,Anticancer Res.(2002)22(6A):3349-56；Verjout等人,Mutat.Res.(2000)640:127-38)；Stowe等人.,J.Virol.Methods(1998)75(1):93-91)。

“生物样品”意指从可能表达SNCA转录物的个体、细胞系、组织培养物或细胞的其它来源获得的任何生物样品。从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域众所周知的。

V.包含ASO的试剂盒

本公开进一步提供了试剂盒，其包含本文描述的ASO-005459并且可以用于执行本文描述的方法。在某些实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中至少包含ASO-005459。在一些实施方案中，试剂盒包含进行检测测定所必需和/或足以进行检测测定的所有组分，包括所有对照、进行测定的说明书以及用于分析和呈现结果的任何必要软件。本领域技术人员将容易认识到，ASO-005459可以容易地并入本领域公知的已建立的试剂盒形式之一中。

VI.使用方法

ASO-005459可以用于治疗和预防。SNCA是在神经元中前突触末端处优先表达的140个氨基酸的蛋白质，据认为它在调节突触传递中起作用。已经提出其以未折叠的单体和稳定的α-螺旋的四聚体天然存在，并且已显示其经历了若干翻译后修饰。已经广泛研究的一种修饰是SNCA在氨基酸丝氨酸129(S129)处的磷酸化。通常，只有一小部分SNCA在S129处被组成型磷酸化(pS129)，而在病理性细胞内内含物中发现的绝大多数SNCA是pS129 SNCA。这些病理性内含物由错误折叠的SNCA蛋白的聚集的、不可溶的堆积物组成，并且是一组统称为突触核蛋白病(或α-突触核蛋白病)的神经退行性疾病的特征性特征。

在突触核蛋白病中，SNCA可以在称为路易体的神经元中形成病理性聚集体，这是帕金森氏病(PD)、帕金森氏病痴呆症(PDD)和路易体痴呆(DLB)的特征。因此，ASO-005459可以减少SNCA病理性聚集体的数量或防止SNCA病理性聚集体的形成。此外，在少突胶质细胞中发现了富含异常SNCA的病变，称为神经胶质细胞质内含物(GCI)，其代表了快速发展的致命性突触核蛋白病(称为多系统萎缩症(MSA))的标志。在一些实施方案中，ASO-005459减少了GCI的数量或防止了GCI的形成。少突胶质细胞中SNCA mRNA表达检测不到或水平低的报道表明，从高度表达SNCA的神经元至少突胶质细胞增殖SNCA的某些病理形式。在某些实施方案中，ASO-005459减少或防止SNCA例如病理形式的SNCA从神经元的繁殖。

ASO-005459可以用于研究中，例如用于特异性抑制细胞和实验动物中SNCA蛋白的合成(通常通过降解或抑制mRNA从而防止蛋白形成)，从而有利于靶标的功能分析或评估其作为治疗干预目标的有用性。还提供了下调细胞或组织中的SNCA mRNA和/或SNCA蛋白的表达的方法，包括使细胞或组织在体外或体内与有效量的本公开的ASO-005459、缀合物或组合物接触。

对于治疗剂，通过施用根据本公开的ASO-005459来治疗疑似患有疾病或病症的动物或人类，该疾病或病症可以通过调节SNCA转录物和/或SNCA蛋白的表达来治疗。还提供了通过施用治疗或预防有效量的本公开的ASO-005459或组合物，来治疗疑似患有或易患与SNCA转录物和/或SNCA蛋白的表达有关的疾病或病状的哺乳动物(例如治疗人类)的方法。根据本公开的ASO、缀合物或药物组合物通常以有效量施用。在一些实施方案中，本公开的ASO或缀合物用于治疗。

本公开还提供了ASO-005459，其用于治疗一种或多种本文所提及的疾病，例如选自帕金森氏病、帕金森氏病痴呆(PDD)、疾病路易体痴呆、多系统萎缩及其任何组合的疾病。

本公开进一步提供了用于治疗α-突触核蛋白病的方法，该方法包括向有此需要的动物(例如有此需要的患者)施用有效量的ASO、缀合物或其药物组合物。

在某些实施方案中，所述疾病、病症或病状与SNCA基因转录物和/或SNCA蛋白的过表达有关。

本公开还提供了抑制(例如，通过降低)细胞或组织中的SNCA基因转录物和/或SNCA蛋白的表达的方法，该方法包括使细胞或组织在体外或体内与有效量的本公开的ASO、缀合物或其药物组合物接触，以影响SNCA基因转录物表达的降解从而减少SNCA蛋白。

在某些实施方案中，ASO-005459用于降低在脑的一个或多个部分例如海马、脑干、纹状体或其任何组合中SNCA mRNA的表达。在其他实施方案中，ASO-005459降低SNCA mRNA的表达，例如例如在脑干和/或纹状体中的SNCA mRNA的表达，在第3天、第5天、第7天、第10天、第14天、第15天、第20天、第21天或第25天，与施用或暴露于媒介物(无ASO)后的SNCAmRNA表达相比，小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施方案中，直至第28天、第30天、第32天、第35天、第40天、第42天、第45天、第49天、第50天、第56天、第60天、第63天、第70天或第75天，SNCA mRNA的表达与施用或暴露于媒介物(无ASO)之后的SCNA mRNA表达相比维持在70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下或5％以下。

在其他实施方案中，ASO-005459降低了髓质、尾状壳、脑桥小脑、腰椎脊髓、额皮质和/或其任何组合中的SNCA mRNA和/或SNCA蛋白的表达。

本公开还提供了如所描述的本公开的ASO-005459或缀合物在制备药物中的用途。本公开还提供了包含ASO-005459或其缀合物的组合物，其用于治疗本文所提及的疾病，或用于治疗本文所提及的病症的方法。本公开还提供了用于治疗的ASO-005459或缀合物。本公开另外提供了用于治疗突触核蛋白病的ASO-005459或缀合物。

本公开还提供了一种在表达SNCA的细胞中抑制SNCA蛋白的方法，该方法包括向该细胞施用根据本公开的ASO-005459或缀合物，以影响该细胞中SNCA蛋白的抑制。

本公开包括在有此需要的受试者中减少、改善、预防或治疗神经元过度兴奋性的方法，其包括施用根据本公开的ASO-005459或缀合物。

本公开还提供了一种用于治疗本文所提及的病症的方法，该方法包括向有此需要的患者施用本文所描述的根据本公开的ASO-005459或缀合物和/或根据本公开的药物组合物。

根据本公开的ASO-005459和其他组合物可以用于治疗与SNCA蛋白的过表达或突变形式的表达有关的病症。

本公开提供了根据本公开的ASO-005459或缀合物，其用作药物，例如用于治疗α-突触核蛋白病。在一些实施方案中，α-突触核蛋白病是选自由帕金森氏病、帕金森氏病痴呆(PDD)、路易体痴呆、多系统萎缩及其任何组合的疾病。

本公开进一步提供了ASO-005459在制备用于治疗本文所提及的疾病、病症或病状的药物中的用途。在一些实施方案中，ASO-005459或其缀合物用于制备用于治疗α-突触核蛋白病、癫痫发作或其组合的药物。

概括地说，本公开的一个方面涉及一种治疗患有或易患与SNCA异常水平有关的病状(即α-突触核蛋白病)的哺乳动物的方法，该方法包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的ASO。

在一些实施方案中，本文所提及的疾病或病症可以与SNCA基因或以下基因中的突变相关，该基因的蛋白质产物与SNCA蛋白质相关或相互作用。因此，在一些实施方案中，靶mRNA是SNCA序列的突变形式。

本公开的有趣的方面涉及本文定义的ASO-005459或本文定义的缀合物在制备用于治疗本文所提及的疾病、病症或病状的药物中的用途。

本公开的方法可以用于治疗或预防由异常水平的SNCA蛋白引起的疾病。在一些实施方案中，由SNCA蛋白的异常水平引起的疾病是α-突触核蛋白病。在某些实施方案中，α-突触核蛋白病包括帕金森氏病、帕金森氏病痴呆(PDD)、路易体痴呆和多系统萎缩。

可选地，在一些实施方案中，本公开还涉及用于治疗异常水平的SNCA蛋白的方法，该方法包括向有此需要的患者施用ASO-005459、本公开的缀合物或本公开的药物组合物。

本公开还涉及本文限定的ASO-005459、组合物或缀合物用作药物。

本公开还涉及本文限定的化合物、组合物或缀合物在制备用于治疗SNCA蛋白的异常水平或SNCA蛋白的突变形式的表达(例如等位基因变体，诸如与本文所提及的疾病之一相关的等位基因变体)的药物中的用途。

需要治疗的患者是患有或可能患有该疾病或病症的患者。

除非另有说明，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook等人编写(1989)Molecular Cloning ALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编写(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover编写,(1985)DNA Cloning,Volumes I and II；Gait编写(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人U.S.Pat.No.4,683,195；Hames和Higgins编写(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编写(1984)Transcription AndTranslation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical GuideTo Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编写(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(ColdSpring Harbor Laboratory)；Wu等人编写Methods In Enzymology,Vols.154and 155；Mayer和Walker编写(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编写(1986)Handbook Of ExperimentalImmunology,Volumes I-IV；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；)；Crooke,Antisense drugTechnology:Principles,Strategies and Applications,第2版.CRC Press(2007)以及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。

上文引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献均通过引用以其整体并入本文。

通过示例而非限制的方式提供以下实施例。

实施例

实施例1：ASO-005459的构建

本文描述的ASO(即ASO-005459)被设计成靶向SNCA前mRNA的内含子1与外显子2之间的连接处(即SEQ ID NO:1的核苷酸7,604-7,620)。ASO-005459被设计成gapmer(例如交替的gapmer)并且在5’端和3’端含有锁核酸-LNA(大写字母)、β-脱氧基LNA，以及硫代磷酸酯主链。但是主链可以是其它类型的主链(例如磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键或其组合)。

使用本领域众所周知的方法合成本公开的ASO。制备此类ASO的示例性方法在Barciszewski等人的Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methods and Protocols第535卷Gunter Mayer(编写)(2009)的第10章“Locked Nucleic Acid Aptamers”中描述，其全部内容借此通过引用的方式明确并入本文。

实施例2：高含量测定以测量原代神经元中SNCA蛋白的减少

在原代小鼠神经元中测试了ASO-005459的降低SNCA蛋白表达的能力。从PAC-Tg(SNCA^A53T)^+/+；SNCA^-/-("PAC-A53T")小鼠的前脑建立原代神经元培养物，该小鼠在小鼠SNCA敲除背景下携带具有A53T突变的完整人SNCA基因。参见Kuo Y等人，Hum Mol Genet.,19:1633-50(2010)。根据百时美施贵宝动物护理和使用委员会(ACUC)批准的动物测试方法(ATM)进行涉及小鼠的所有程序。根据制造商的方案(Worthington BiochemicalCorporation，LK0031050)，通过木瓜蛋白酶消化产生原代神经元。洗涤分离的神经元并将其重悬于补充有B27(Gibco)、1.25μM Glutamax(Gibco)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和25μg/ml两性霉素B的Neurobasal培养基(NBM，Invitrogen)中。

将细胞以5,400个细胞/cm²(例如在384孔板中在25μl NBM中以6,000个细胞/孔)铺板在多孔聚D-赖氨酸包被的板上。将ASO在水中稀释并将其在DIV01(即，铺板后1天)添加至细胞。添加ASO至在培养基中的2x终浓度，然后手动递送至细胞。或者，使用Labcyte ECHO声学分配器分配水中的ASO。对于ECHO分配，将250nl的ASO水溶液添加到培养基中的细胞，然后添加等体积的NBM新鲜等分试样。为了进行原代筛选，添加ASO至终浓度为5μM、3.3μM、1μM、200nM或40nM。为了确定效力，从0.75mM储备液中制备了8-10点滴定的ASO，然后将其递送到培养的细胞，最终浓度范围为2.7-4000nM或4.5-10,000nM。每个板中分别包括ASO-000010(TCTgtcttggctTTG，SEQ ID NO:5)和ASO-000838(AGAaataagtggtAGT，SEQ ID NO:6)(5μM)作为微管蛋白和SNCA的参考对照抑制剂。将细胞与ASO孵育14天，以实现稳态的mRNA降低。

孵育14天后，通过在孔中添加固定剂至终浓度为4％甲醛(J.T.Baker)和4％蔗糖(Sigma)来固定细胞。将细胞固定15分钟，然后从孔中吸出固定剂。然后，将细胞用含0.3％Triton-X 100和3％牛血清白蛋白(BSA)或3％正常山羊血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液渗透20分钟。之后，从孔中吸出渗透缓冲液，并用PBS洗涤细胞一次。然后将第一抗体稀释在含0.1％Triton X-100和3％BSA的PBS中。使用了1:1000的兔抗SNCA(Abcam)和1:500的鸡抗微管蛋白(Abcam)的稀释液。将细胞与第一抗体孵育2小时至过夜。孵育后，吸出第一抗体染色溶液，并用PBS洗涤细胞两次。将含有在含有0.1％Triton X-100和3％BSA的PBS中以1:500稀释的山羊抗鸡Alexa 567抗体、山羊抗兔Alexa 488抗体和Hoechst(10μg/ml)的第二染色溶液加入孔中，并将板孵育1小时。之后，从孔中吸出第二染色溶液，并用PBS洗涤细胞3次。洗涤细胞后，将60μl的PBS加入每个孔中。然后将板储存在PBS中直至成像。

为了成像，使用斑点检测器生物应用(Cellomics)在Thermo-Fisher(Cellomics)CX5成像仪上扫描板以定量核(Hoechst染色，通道1)、微管蛋白延伸(Alexa 567，通道2)和SNCA(Alexa 488，通道3)。监测了对象计数(核)，但未发布到数据库。微管蛋白覆盖的总面积定量为特征SpotTotalAreaCh2，SNCA染色总强度定量为SpotTotalIntenCh3。包括微管蛋白测量以监测毒性。为了确定SNCA蛋白的减少，计算SNCA强度与微管蛋白染色面积的比值，并将结果归一化为抑制中值的百分比，使用媒介物处理过的孔的中值作为总数，而ASO-000010或ASO-000838的孔分别作为微管蛋白或SNCA的最大抑制孔。

实施例3：

分析用于测量人神经元中mRNA减少(96孔测定)

通过

分析在体外测量了ASO-005459降低人SNCA mRNA和/或可能的人脱靶mRNA种类的能力。根据制造商的说明书将人神经元(Cellular DynamicsInc.,"iNeurons")解冻、铺板并进行培养。这些iNeuron是使用Cellular Dynamic专有的分化和纯化方案衍生自诱导的多能干(iPS)细胞的高纯度人神经元群体。

裂解：将细胞以每孔50,000至100,000个细胞(取决于所研究的脱靶表达)铺板在聚L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的96孔板上，并维持在补充有B27、glutamax和青霉素-链霉素的Neurobasal培养基中。将ASO在水中稀释并在DIV01(即，铺板后1天)添加至细胞。对于单点测量，通常使用的最终ASO浓度为0.5μM。对于IC₅₀的测定，将神经元用1:4的七点浓度响应稀释处理，最高浓度为5μM，以定义IC₅₀。然后将细胞在37℃和5％CO₂下孵育6天，以实现mRNA的稳定状态减少。

孵育后，除去培养基，并在DPBS中将细胞洗涤1次并如下裂解。使用

2.0试剂系统

进行裂解物信使RNA的测量，该试剂系统使用支链DNA信号扩增方法对RNA进行定量，该方法依赖于专门设计的RNA捕获探针组。通过将50μl蛋白酶K加入5ml预热的(37℃)裂解混合物中并用dH₂O稀释至1:4最终稀释率来制备工作细胞裂解缓冲液。将工作裂解缓冲液添加至平板中(100至150μl/孔，取决于所研究的脱靶表达)，研磨10次，密封并在55℃下孵育30分钟。裂解后，将孔再研磨10次，并将板保存在-80℃或立即测定。

测定：根据所用的特异性捕获探针(即，SNCA、PROS1或微管蛋白)，将裂解物在裂解混合物中稀释(或不稀释)。然后，将裂解物以80μl/孔的总体积添加到捕获板(用捕获探针包被的96孔聚苯乙烯板)中。按照制造商的说明

通过合并无核酸酶的水(12.1μl)、裂解混合物(6.6μl)、封闭试剂(1μl)和特定的2.0探针组(0.3μl)(人SNCA目录号SA-50528，人PROS1目录号SA-10542或人β3微管蛋白目录号SA-15628)，生成工作探针组试剂。接下来，将20μl工作探针组试剂添加到捕获板上的80μl裂解物稀释液(或用于背景样品的80μl裂解混合物)中。将板以240g离心20秒，然后在55℃下孵育16-20小时以杂交(靶RNA捕获)。

通过用缓冲液洗涤板3次(300μl/孔)以去除任何未结合的物质，开始信号扩增和靶RNA的检测。接下来，添加2.0Pre-Amplifier杂交试剂(100μl/孔)，在55℃孵育1小时，然后吸出，并添加洗涤缓冲液并吸出3次。然后按所述方法(100μl/孔)加入2.0Amplifier杂交试剂，在55℃下孵育1小时，并按以前所描述的重复洗涤步骤。接下来添加2.0Label Probe杂交试剂(100μl/孔)，在50℃下孵育1小时，并按照先前描述的重复洗涤步骤。再次将板以240g离心20秒以去除任何多余的洗涤缓冲液，然后将2.0底物(100μl/孔)添加到板中。将板在室温下孵育5分钟，然后将板在PerkinElmer Envision多标记读取器上以发光计模式在15分钟内成像。

数据确定：对于感兴趣的基因，从每个技术重复的平均信号中减去平均测定背景信号。然后将感兴趣的基因的已经减去背景的平均信号归一化化至持家微管蛋白RNA的已经减去背景的平均信号。相对于对照处理的样品裂解物，计算处理的样品的抑制百分数。用ASO处理的细胞的

测定结果显示在例如图3中。

实施例4：

分析(96孔测定)以测量Ramos细胞中mRNA减少

为了测量可能的人脱靶IKZF3(IKAROS家族锌指3)mRNA的减少，使用了Ramos细胞(人淋巴细胞系)。由于Ramos细胞不表达SNCA，因此在Ramos细胞中表达的RB1(RB转录辅阻遏物1)被用作评估ASO介导的敲低IKZF3 mRNA表达的阳性对照。合成了两个ASO以结合并敲低人RB1 mRNA表达。β-2微球蛋白(β2M)被用作持家基因对照。将Ramos细胞在补充有FBS、谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI培养基中悬浮培养。

裂解：将细胞以每孔20,000个细胞铺板在聚L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的96孔板上，并保持在含有B27、谷氨酰胺(glutamax)和青霉素-链霉素的Neurobasal培养基中。将ASO用水稀释，并在铺板后1天(DIV01)添加至细胞，使其终浓度为1μM。ASO处理后，将细胞在37℃下孵育4天，以实现mRNA的稳定状态减少。孵育后，除去培养基，并如下裂解细胞。使用

2.0试剂系统

进行裂解物信使RNA的测量，该试剂系统使用支链DNA信号扩增方法对RNA进行定量，该方法依赖于特定设计的RNA捕获探针组。将裂解混合物

在37℃的培养箱中预热30分钟。为了裂解悬浮液中的细胞，将100μl 3X裂解缓冲液(含10μl/ml蛋白酶K)添加至200μl的悬浮液中的细胞。然后将细胞研磨10次以裂解，密封板并在55℃孵育30分钟。之后，将裂解物储存在-80℃或立即测定。

测定：根据所用的特异性捕获探针(即IKZF3、RB1和β2M)，将裂解物在裂解混合物中稀释(或不稀释)。然后，将裂解物以80μl/孔的总体积添加到捕获板(包被有捕获探针的96孔聚苯乙烯板)。根据制造商的说明书

通过合并无核酸酶的水12.1μl、裂解混合物6.6μl、封闭试剂1μl、特定的2.0探针组0.3μl(人IKZF3目录号SA-17027，人RB1目录号SA-10550或人β2微球蛋白目录号SA-10012，产生工作探针组试剂。然后将20μl工作探针组试剂添加到捕获板上的80μl裂解物稀释液(或用于背景样品的80μl裂解混合物)中。然后将平板在55℃下孵育16-20小时以杂交(捕获靶标RNA)。通过用缓冲液洗涤板3次(300μl/孔)以去除任何未结合的物质，开始信号扩增和靶标RNA的检测。接着，加入2.0Pre-Amplifier杂交试剂(100μl/孔)，在55℃下孵育1小时，然后吸出，并加入洗涤缓冲液并吸出3次。然后如所描述的添加2.0Amplifier杂交试剂(100μl/孔)，在55℃下孵育1小时，并如以前所描述的重复洗涤步骤。接下来，加入2.0Label Probe杂交试剂(100μl/孔)，在50℃下孵育1小时，并再次如前所述重复洗涤步骤。再次将板以240g离心20秒以去除任何多余的洗涤缓冲液，然后将2.0底物(100μl/孔)添加到板中。将板在室温下孵育5分钟，然后将板在PerkinElmer Envision多标记读取器上以光度计模式在15分钟内成像。

数据确定：对于感兴趣的基因，从每个技术重复的平均信号中减去平均测定背景信号(即无裂解物，只有1X裂解缓冲液)。然后将目标基因的已经减去背景的平均信号归一化至持家mRNA(对于Ramos细胞，其是β-2-微球蛋白)的已经减去背景的平均信号。相对于未处理的样品裂解物的平均值，计算处理的样品的抑制百分数。表4显示了经ASO-005459处理的细胞的

测定的结果。

实施例5：qPCR测定法用于测量SK-N-BE(2)细胞中SNCA mRNA的减少

测试了靶向SNCA的ASO-005459减少从ATCC(CRL-2271)获得的人SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞中SNCA mRNA表达的能力。

SK-N-BE(2)细胞在补充有10％胎牛血清[Sigma目录号F7524]、1x GlutamaxTM[Sigma目录号3050]、1x MEM非必需氨基酸溶液[Sigma，目录号M7145]和0.025mg/ml庆大霉素[Sigma目录号G1397])的细胞培养基(MEM[Sigma目录号2279])中生长。

每5天用胰蛋白酶消化细胞一次，方法是用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，[Sigma目录号14190-094]洗涤，然后加入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma，T3924)，在37℃孵育2-3分钟，研磨，随后细胞接种。将细胞保持培养最多达15代。

为了实验使用，将每孔12,500个细胞接种在96孔板(Nunc目录号167008)中的100μL生长培养基中。寡核苷酸是从750μM储备物中制备的。将细胞接种到最终浓度为25μM进行单点研究后约24小时，加入溶于PBS的ASO。将细胞孵育4天，而无需改变培养基。为了确定效价，制备了8种浓度的ASO，最终浓度范围为16-50,000nM。包括ASO-004316(CcAAAtcttataataACtAC，SEQ ID NO:7)和ASO-002816(TTCctttacaccACAC，SEQ ID NO:8)作为对照。

孵育后，通过除去培养基，然后添加125μL

Pro 96裂解缓冲液(Invitrogen 12173.001A)和125μL 70％乙醇来收获细胞。按照制造商的说明书纯化RNA，并在最终体积为50μL的水中洗脱，得到的RNA浓度为10-20ng/μl。在一步式qPCR反应之前，将RNA在水中稀释10倍。对于一步式qPCR反应，将qPCR混合物(来自QauntaBio的qScriptTMXLE 1-step RT-qPCR

Low ROX，目录号95134-500)与两个Taqman探针以10:1:1的比例混合(qPCR混合物:探针1:探针2)以生成mastermix。Taqman探针购自LifeTechnologies：SNCA:Hs01103383_m1；PROS1:Hs00165590_m1:TBP:4325803；GAPDH4325792。然后将Mastermix(6μL)和RNA(4μL，1-2ng/μL)在qPCR板(

Optical384孔，4309849)中混合。密封后，将板快速旋转，在室温下1000g旋转1分钟，并转移至ViiaTM 7系统(Applied Biosystems，Thermo)，并使用以下PCR条件：50℃持续15分钟；95℃3分钟；40个循环：95℃持续5秒钟，然后以1.6℃/秒降低温度，接着60℃持续45秒。使用QuantStudioTM实时PCR软件分析数据。

实施例6：ASO-005459降低人SNCA mRNA的体外分析

ASO-005459在小鼠神经元中的效力

使用上述实施例2中描述的方法，测试了ASO-005459降低SNCA蛋白表达的能力作为降低SNCA mRNA的下游结果。简而言之，将衍生自PAC-A53T小鼠的原代神经元用ASO-005459或对照ASO处理14天。然后固定细胞，并通过高含量成像测量SNCA蛋白和微管蛋白的水平。测量微管蛋白水平以监测毒性并归一化SNCA蛋白降低。

如下表1所示，将细胞与4nM的ASO-005459一起孵育导致SNCA蛋白表达降低21％。使用40nM和5μM的ASO-005459，SNCA蛋白表达分别降低了84％和86％。相反，ASO-005459对微管蛋白表达水平的影响很小至无影响。

表1：A53T-PAC神经元中ASO-005459的活性

SD＝标准偏差

N＝测试数量

为了进一步评估效力，如上文实施例2A中所述，用ASO-005459的10点滴定处理A53T-PAC神经元，并测定对SNCA和微管蛋白的作用的IC₅₀。如图2A和2B以及表2(下文)中所示，观察到α-突触核蛋白/微管蛋白比率的浓度依赖性降低，平均IC₅₀为7.4nM。该观察结果与表1(上文)所示的单点活性数据一致。此外，ASO-005459对微管蛋白水平的影响可忽略不计。这些结果加在一起表明，ASO-005459有效降低SNCA蛋白水平，而对整体细胞活力的影响却最小。

表2：ASO-005459对A53T-PAC神经元中SNCA和微管蛋白蛋白的效力和选择性评估

SD＝标准偏差

N＝测试数量

ASO-005459在SK-N-BE(2)细胞中的功效

使用实施例5中所述的方法，测试ASO-005459在4天处理后减少SK-N-BE(2)中SNCAmRNA的能力。

用25μM ASO-005459孵育细胞导致SK-N-BE(2)细胞中SNCA mRNA降低92％。

ASO-005459在人神经元中的效力

如上文实施例3中所述，使用原代人神经元确认了ASO-005459对SNCA的效力。简而言之，人类神经元衍生自诱导的多能干(iPS)细胞。用ASO-005459或对照ASO处理细胞6天，然后通过

测定测量mRNA水平。由于人神经元还表达PROS1(一种潜在的ASO-005459脱靶基因)，因此还测量了PROS1 mRNA水平以评估ASO-005459对脱靶基因的作用。此外，测量微管蛋白(TUBB)mRNA以监测毒性。

如图3和表3(下文)所示，ASO-005459诱导了在人神经元中表达的SNCA的浓度依赖性降低，平均IC₅₀为100nM。该IC₅₀比减少PAC-A53T神经元中SNCA蛋白的IC₅₀(以上表2)弱约13倍。这种功效变化的原因尚不清楚，但可能是由于ASO摄取、代谢或SNCA敲低动力学的差异。ASO-005459在人神经元中还表现出浓度依赖性的PROS1 mRNA降低；IC₅₀比SNCA的IC₅₀弱30-50倍。这些结果证实了ASO-005459对人神经元中SNCA的活性，并表明ASO-005459对SNCA的选择性比PROS1高30-50倍。

表3：ASO-005459对人神经元中SNCA和PROS1 mRNA的效力和选择性

批次＝使用的ASO-005459的特定批号

ASO-005459在Ramos细胞中的效力

IKZF3是ASO-005459的另一个潜在脱靶，但与PROS1不同，它不在人神经元中表达。取而代之的是，IKZF3在Ramos细胞(一种人类淋巴细胞系)中强烈表达。用1μM ASO-005459处理Ramos细胞，并测量其对IKZF3 mRNA表达的影响。为了监测毒性，还测量了β-2微球蛋白mRNA。由于Ramos细胞不表达SNCA，因此将另一个基因RB1(RB辅阻遏物1)用作ASO介导的基因敲低的阳性对照。ASO-006754(GGTgaggtttggtaGA，SEQ ID NO:9)和ASO-006755(GGTgaggtttggtagaAG，SEQ ID NO:10)靶向RB1，并已纳入研究范围。如表4(下文)所示，在1μM的浓度下，ASO-005459不会影响IKZF3 mRNA的表达，证明了ASO-005459对SNCA的特异性。ASO-005459也不影响RB1和β2M mRNA的表达，表明ASO-005459对Ramos细胞没有毒性。相反，ASO-006754和ASO-006755(对照ASO)分别使RB1水平降低了87％和83％，从而证实了Ramos细胞中的ASO活性。

表4：1μM ASO-005459对Ramos细胞中IKZF3的作用

批次＝使用的ASO的特定批号

总体而言，此处呈现的结果证明ASO-005459对降低SNCA mRNA具有强效和高度选择性，而SNCA mRNA则介导SNCA蛋白水平的降低。结果还表明，ASO-005459在小鼠和人类神经元中均具有良好的耐受性。这些发现支持了ASO-005459作为用于治疗突触核蛋白病的疾病修饰疗法的持续发展。

实施例7：体内耐受性和体内SNCA mRNA减少

测试了本公开的ASO的体内耐受性，以观察将ASO注射到不同的动物模型(即小鼠和食蟹猴)中后ASO如何被耐受：

小鼠

受试者：雄性和雌性(2-3月龄)PAC-Tg(SNCA^A53T)^+/+；SNCA^-/-("PAC-A53T")小鼠，其携带基于小鼠SNCA敲除背景下的具有A53T突变的完整人类SNCA基因。在一些情况下，使用野生型(WT)C57B/6小鼠进行长期(即4周)健康评估。将小鼠以4或5只一组的形式饲养在温度受控的饲养室中，食物和水是随意可得的。根据百时美施贵宝动物护理和使用委员会(ACUC)批准的动物测试方法(ATM)进行涉及小鼠的所有程序。

ASO给药溶液的制备：使用装有0.2μm Whatman过滤器和无核酸酶的离心管的无菌盐水(1mL)注射器制备给药溶液。将指示体积的水或盐水添加到ASO粉末中，并涡旋(约1分钟)以溶解ASO粉末。然后将溶液静置10分钟，并再次涡旋约1分钟。将管短暂离心以使所有液体返回管底部，然后将溶液通过0.2μm无菌过滤器过滤至第2个无RNA酶的管中。将一小等分试样的原储存液稀释至1mg/ml，用于使用Nanodrop分析浓度。将分析样品涡旋三次，同时手动颠倒以彻底混合。然后，使用Nanodrop在260nm处两次测量样品的紫外线吸收率(在施加样品之前，将基座冲洗并擦拭3次)。分析完成后，将测试样品丢弃。如果紫外线吸收率在样品的90％至110％之间，则认为该样品已准备就绪用于给药。如果紫外线吸收率超过样品的110％，则应进行二次稀释；如果吸光率<90％，则以较高的初始浓度制备样品，并按照上述类似步骤进行操作。样品储存在4℃直到使用。

徒手脑室内(ICV)注射：根据Haley和McCormick的方法，使用装有27或30号针头的Hamilton微型注射器进行ICV注射。针头在距针尖2.5-3mm处装有聚乙烯保护套，以限制其穿透到大脑中。使用异氟烷麻醉剂(1-4％)麻醉小鼠。充分麻醉后，用一只手的拇指和食指握住小鼠的脖子后部的松弛皮肤。施加轻微但牢固的压力，然后将动物的头部压在牢固的平坦表面上，使其固定。使用装有27¹/₂g针头的10μL Hamilton注射器进行给药。然后将针尖穿过头皮和颅骨，约在前卤的侧向1mm和尾部1mm(即，中线的右侧，从眼线测得的向后约3mm)。定位好针头后，将ASO以5μl的体积加入生理盐水中，并在约30秒内注射。取出前，将针头留在原位5-10秒。将小鼠放回他们的家笼中，使其恢复约2-4分钟。给药后立即连续观察小鼠30分钟，以观察药物和/或给药的不良行为影响。在这段时间内，将痉挛超过3次的任何小鼠立即安乐死，并给予自动得分20。给药后1小时±15分钟对药物耐受性进行评分。评估1小时后，立即对给药了非耐受性化合物(耐受性得分>4)的动物实施安乐死。

ASO耐受性评估：给药后立即评估给药ASO的动物，并监测2小时以观察任何不良作用。对于急性耐受性(AT)研究，在给药时和拆卸(takedown)时再次(即ASO注射后3天)评估小鼠。为了进行长期健康评估，每周对小鼠称重并监测任何健康和行为问题，直到实验完成。体重减轻超过其初始体重的15％或表现出耐受性问题的小鼠从研究中被移除并实施安乐死。根据下表进行健康和耐受性评估：

表5：耐受性评分系统^a

^a正常的得分为“0”。在给药后的连续时间点对动物进行个体评分。观察评级在1小时±15分钟，然后在24小时±2小时，然后7天(如果适用)。即使抽搐发生在观察窗口之前，抽搐也会计数为1小时的时间点。基于各个类别得分的总和来计算总的耐受性得分，最大可能得分为20。

组织收集：在进行最终的行为和健康评估之后，在断头台上将小鼠断头并迅速取出大脑。将每个大脑分成两个半球，a)在3天的急性耐受性研究中解剖海马体以进行mRNA测量；b)在剂量-反应时间过程PK/PD研究中，将一个半球的海马体、脑干和纹状体解剖以进行mRNA测量，而从第二个半球解剖相同区域以进行蛋白质/PK测量。

在一些研究中，还收集了血液和脑脊液(CSF)用于PK(血液)和PK/蛋白质(CSF)测量。为了收集血液和CSF，用异氟烷(4％)深度麻醉小鼠。使用23G针头通过心脏穿刺收集血液。取出后，将血液转移到2ml BD Microtainer(K2EDTA BD#365974)管中，置于冰上直至处理。为了处理血液，将管在4℃下以4500xg离心10分钟。然后，将血浆移出并放入0.5mlEppendorf管中，并保存在-80℃直至使用。为了收集CSF，打开胸腔暴露心脏，并抽出大量血液以避免对脑脊液的污染。使用微量移液管通过Cisterna magna收集CSF样品，并将其放入低结合蛋白Eppendorf管中。然后，将管在4℃下以4500xg离心15分钟。将CSF小心地转移到干净的低结合的0.5ml Eppendorf管中，并保存在-80℃直至进一步使用。

食蟹猴数据

受试者：在研究开始时使用重量为3.5-10.0kg的雄性食蟹猴。每个都在L3或L4椎骨处植入鞘内脑脊液(CSF)导管。聚氨酯导管的远端在鞘内空间内延伸至大约L1椎骨。近端连接到位于动物下背部的皮下进入口。在研究开始之前，让动物愈合至少两周。实验室动物的护理是根据关于实验室动物的人道护理和使用的公共卫生服务政策以及实验室动物的护理和使用指南(2011)(国家研究委员会:实验室动物的护理和使用指南)(国家研究院保藏中心(The National Academies Collection):由国家卫生研究院资助的报告)(美国国家科学院出版社，华盛顿(DC))。该方案已由百时美施贵宝公司沃灵福德动物护理和使用委员会批准。

CSF&血液采样：使用无菌技术通过皮下进入CSF端口，并从端正坐在在灵长类动物约束椅中的清醒动物中采样CSF。在收集开始时将约0.1ml的CSF丢弃，以清除导管和端口中的死角。通过重力流收集CSF，每个样品最多收集0.5ml CSF。将CSF在4℃以2,000g旋转10分钟。将上清液在干冰上或液氮中冷冻，并保持在-90℃直至分析。

从可用的静脉(通常是隐静脉)采样血液。根据所考虑的特定测量，通过许多程序制备血液样品。对于血浆，将血液收集到EDTA处理的管中。对于血清，将血液收集到血清分离管中，并在离心之前凝结至少30分钟。为了测量凝血和凝血因子，将血液收集到柠檬酸化的管中，并且为了分析RNA，稍后将血液收集到包含RNA的管中。处理后，将样品在干冰上或液氮中冷冻，并保持冷冻直至分析。

鞘内给药：训练动物在清醒时进行给药，并使用改良的市售约束椅，将动物保持在卧位。将SNCA靶向的反义寡核苷酸(ASO)溶解在盐水中，通过过滤灭菌，以0.33ml/min的速度以1.0ml的体积给药，然后用0.5ml的无菌水冲洗。总输注时间为4.5分钟。输注后，动物保持卧位30分钟。

尸检：食蟹猴用氯胺酮和/或异氟烷麻醉时，被施用适当体积的市售安乐死溶液。此后立即获得尸检组织，并将脑转移至湿冰用于解剖。使用ASI Cyno Brain Matrix中的4-6mm切片以及徒手技术解剖感兴趣的区域。将样品新鲜放置在RNAlater中，或在干冰上冷冻用于以后的分析。从食蟹猴中快速解剖CNS组织，并收集在任何轴上不超过4mm的切片，然后置于5mL RNA中。样品在4℃下储存过夜，然后转移到-20℃进行储存直至分析。

分析的脑区域包括髓质、脑桥、中脑、小脑、尾状核(左和右)，海马体(左和右)、额皮质(左和右)、颞叶皮层(左和右)、顶叶皮层(左和右))、枕叶皮层(左和右)和皮质白质。另外，在颈、胸和腰区域取样脊髓。还从肝、肾和心脏收集样品。在某些情况下，收集三叉神经核、胫神经和主动脉的样本，以检查这些区域的脱靶药理学。

小鼠或猴组织、血浆和脑脊液中ASO浓度的ELISA定量：

将组织用1:1比率的血浆和水均质化。通过在血浆中(对于血浆和CSF)和血浆:水(对于组织样品)从5000到4.9nM进行2倍系列稀释，然后再用仅5X SSCT(750mM NaCl、以及含0.05％(v/v)Tween-20的75mM柠檬酸钠pH 7.0)和含35nM捕获剂和35nM检测试剂的5XSSCT中进一步稀释至总共5000倍，以获得标准范围为1-1000pM。使用的稀释系数根据预期的样品浓度范围而变化。捕获探针是带有3'生物素(Exiqon)的AAAGGAA，检测探针是5'DigN-异丙基18接头-GTGTGGT(Exiqon)。

实验样品和标准品以1:1的比例添加到Clarity裂解缓冲液(Phenomenex，目录号AL0-8579)中，然后用捕获和检测缓冲液稀释，然后转移到ELISA板中。在添加裂解缓冲液之前，用血浆稀释CSF样品(2倍)。用5X SSCT缓冲液将链霉亲和素包被的板(Thermo 15119)洗涤3次。添加100μl样品并在室温下孵育60分钟。加入检测探针，即在含0.05％Tween-20的PBS中以1:4000稀释的100μl抗Dig-AP Fab片段(Roche Applied Science,目录号11 093274 910)，并在室温下孵育60分钟。用2X SSCT缓冲液洗涤板后，在室温下添加100μlTropix CDP-star Sapphire II底物(Applied Biosystems)。通过发光测量ASO浓度(Enspire-PerkinElmer)。

α-突触核蛋白蛋白质测量：

使用珠均质器Qiagen Tissuelyser II，将脑组织样品在RIPA缓冲液(50mM TrisHCl、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠)中以10ml/g组织用5毫米的不锈钢珠均质化，每秒25个循环，共持续2分钟。将均质的样品在冰上孵育30分钟。每个样品保留50μL等分试样用于PK分析。将剩余的样品在4℃，20,800g下离心60分钟。保留上清液，并用于分析。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(23227)测量总蛋白。

脑组织提取物：使用MJFR1+4B12 ELISA测量SNCA蛋白。简而言之，将ELISA板(Costar)用在BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH 9.4(Thermo Scientific)中稀释的浓度为0.1μg/ml的100μl抗SNCA抗体MJFR1(Abcam)包被过夜(O/N)。第二天，将板用Dulbecco氏PBS(Life Technologies)洗涤4次，并用PBS中的3％BSA(牛血清白蛋白、无蛋白酶、级分V，Roche Diagnostic)在室温下(RT)封闭2-3h或在4℃下过夜。标准品和大脑样品均用含Roche蛋白酶抑制剂(Roche 11836145001，1片/25ml)和磷酸酶抑制剂2&3(Sigma，1:100)的1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释。SNCA野生型(rPeptide)用作标准品。样品一式两份上样(50μl/孔)并在4℃孵育O/N。将板平衡至室温后，将50μl检测抗体4B12(Biolegend)(在1％BSA/0.1％Tween/DPBS中以1:4000稀释)添加到每个孔中，并与样品在室温共孵育约2小时。将检测抗体与碱性磷酸酶(Novus Biologicals的AP试剂盒)预缀合。然后将板用0.05％Tween/PBS洗涤4次，并用100μl碱性磷酸酶底物(Sapphire II,T-2214,Life Technologies的Tropix CDP Star即用型)显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102 MultilabelReader)测量发光计数。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇动器，速度3)。使用GraphPad Prism分析数据。根据制造商的说明书，使用微蛋白测定试剂盒(Thermofisher#23235)测量脑组织中的总蛋白。

脑脊液(CSF)：使用U-PLEX Human SNCA试剂盒(目录号K151WKK-2，Meso ScaleDiscovery)根据制造商的说明测量SNCA蛋白。将CSF样品稀释10倍。使用Abcam小鼠血红蛋白ELISA试剂盒(ab157715)在CSF样品中测量血红蛋白。将CSF样品稀释40倍以进行血红蛋白测量。

通过qRT-PCR测量mRNA

收获脑区域，并将其置于预装有RNA-later(一种RNA稳定溶液)的1.5ml RNA-later组织保护管(Qiagen目录号76514)中。RNA-later溶液中的组织可以在4℃下保存1个月，或者在-20℃或-80℃下无限期保存。

RNA分离：RNeasy Plus Mini试剂盒：来自小鼠海马体和皮质的RNA，并使用RNeasyPlus Mini Kit(Qiagen目录号74134)分离。将组织样品在含有10μl/ml 2-巯基乙醇和0.5％试剂Dx的600μL或1200μL RLT Plus缓冲液中均质化。如果组织样品<20mg，则使用600μL裂解缓冲液；对于组织样品>20mg，则使用1200μl裂解缓冲液。为了进行均质化，将组织样品转移到2.0mL圆底的Eppendorf Safe-Lock管(Eppendorf目录号022600044)中，该管中含有600μL RLT Plus缓冲液(加10ul/ml的2-巯基乙醇和0.5％试剂Dx)和5mm不锈钢珠(Qiagen目录号69989)。使用Qiagen的TissueLyser II仪器均质化样品。将样品在20Hz下处理2.0分钟，将样品旋转180°，然后在20Hz下再处理2.0分钟。然后将样品在30Hz下处理2.0分钟，将样品旋转180°，然后在30Hz下再处理2.0分钟。如果处理不完全，则使用更长和/或更高频率的均质化。然后将600μL组织裂解物转移到2.0mL收集管中的gDNA Eliminator旋转柱中，并以10,000g离心30秒。所有离心步骤均在RT下进行。收集流过物，加入等体积的70％乙醇并混合。将600μL转移到置于2.0mL收集管中的RNeasy离心柱中，并以10,000g离心样品15秒。丢弃流过液，将剩余的600μL样品添加到离心柱中。离心离心柱，并丢弃流过液。用700μL洗涤缓冲液RW1洗涤柱，以10,000g离心15秒，弃去流过液。然后按照试剂盒操作说明，用500μL含4个体积乙醇的缓冲液RPE洗涤柱2次。首先将柱在10,000g下第一次离心15秒钟进行第一次洗涤，然后在10,000g下离心2.0分钟以进行第二次洗涤。第二次洗涤后，将柱在10,000g下进行1.0分钟离心一次以干燥膜。然后将柱转移到新的1.5mL收集管中，并将30μL无RNA酶的水直接添加到膜的中心。将膜在室温下孵育10分钟。然后，将柱以10,000g离心1.0分钟以洗脱RNA。收集含有RNA的洗脱液并将其保存在冰上，直到可以使用NanoDrop分光光度计(Thermo)通过UV吸光率确定RNA浓度为止。RNA样品储存在-80℃。

RNA分离：

Plus通用微型试剂盒：使用

Plus通用微型试剂盒(Qiagen目录号73404)分离来自所有其他食蟹猴、小鼠和大鼠组织样品的RNA。为了进行均质化，将50μg或更少的组织样品转移到含有900μL

裂解试剂和5mm不锈钢珠(Qiagen目录号69989)的2.0mL圆底Eppendorf Safe-Lock管(Eppendorf目录号022600044)中。使用Qiagen的TissueLyser II仪器将样品均质化。将样品在20Hz下处理2.0分钟，将样品旋转180°，然后在20Hz下再处理2.0分钟。然后将样品在30Hz下处理2.0分钟，将样品旋转180°，然后在30Hz下再处理2.0分钟。如果处理不完全，则使用更长和/或更高频率的均质化。然后将均质化的组织裂解物转移到新的2.0mL圆底Eppendorf Safe-Lock管中，在室温放置5.0分钟。向每支管中加入100μL gDNA消除剂溶液，并剧烈摇动管30秒钟。将180μL氯仿(Sigma目录号496189)添加到每个管中，并剧烈摇动管30秒钟。将管在室温放置3分钟。在4℃下以12,000g离心管15分钟。离心后，将上层水相转移至新的2.0mL圆底Eppendorf Safe-Lock管中(约500μL)。加入等体积的70％乙醇并混合。所有进一步的离心步骤均在室温进行。将500μL转移至置于2.0mL收集管中的RNeasy离心柱中，并以10,000g将样品离心15秒。丢弃流过液，将剩余的500μL样品添加到离心柱中。离心离心柱，弃去流过液，用700μL含2个体积乙醇的洗涤缓冲液RWT洗涤柱。将柱以10,000g离心15秒钟，弃去流过液。然后按照试剂盒操作说明，用500μL含4个体积乙醇的缓冲液RPE洗涤两次。首先将柱在10,000g下离心15秒钟进行第一次洗涤，然后在10,000g下离心2.0分钟进行第二次洗涤。第二次洗涤后，将柱在10,000g下离心1.0分钟一次以干燥膜。然后将柱转移到新的1.5mL收集管中，并将30μL无RNA酶的水直接添加到膜的中心。将膜在室温下孵育10分钟。将柱以10,000g离心1.0分钟以洗脱RNA。收集含有RNA的洗脱液并将其保存在冰上，直到使用NanoDrop分光光度计(Thermo)通过UV吸光率测定RNA浓度为止。RNA样品储存在-80℃。

通过逆转录合成cDNA：在PCR-96-AB-C微孔板(Axygen目录号321)中，使用无核酸酶的水(Invitrogen目录号10977-015)将300ng RNA稀释至最终体积为10.8μL。向每个孔中添加6.0μL的包含以下成分的反应混合物1:2.0μL50μM随机十聚体(Ambion目录号AM5722G)和4.0μL 1X dNTP混合物(Invitrogen目录号10297-018)。用光密封带(AppliedBiosystems目录号4360954)密封该板，并在室温以1,000x g离心1.0分钟。接下来，使用96孔热循环仪GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)在70℃下将板加热3.0分钟。然后将板在冰上完全冷却。接下来，向每个孔中加入3.25μL反应混合物2(包含2μL 10X链缓冲液，1.0μL MMLV-RT 200U/μL逆转录酶(Ambion目录号2044)和0.25μL RNA酶抑制剂40U/μL(Ambion目录号AM2682))。用光密封带密封板，并在室温下以1,000x g离心1.0分钟。使用96孔热循环仪，将板在42℃加热60分钟，然后在95℃加热10分钟。然后，将板在冰上冷却。将cDNA板保存在-20℃，直到准备用于PCR分析为止。

用于扩增和定量SNCA和GAPDH mRNA表达的qPCR：在PCR-96-AB-C微板中，在无核酸酶的水中将cDNA稀释5倍。将16μL的Master Mix溶液(由以下成分组成：10μL的2X Taqman基因表达Master Mix(Applied Biosystems目录号4369016)、1.0μL的20X Taqman引物探针组(Applied Biosystems)和5.0μL的无核酸酶的水)添加到384孔光学PCR板(AppliedBiosystems目录号4483315)的每个孔中。将4.0μL稀释的cDNA加入384孔光学PCR板的每个孔中。用光密封带密封板，并在室温下以1,000x g离心1.0分钟。在标准模式下使用以下参数在Applied Biosystems 700 HT快速实时PCR系统上进行PCR：50℃持续2.0分钟，95℃持续10分钟，然后40个循环：95℃持续15秒和60℃持续1.0分钟。

qRT-PCR引物-探针组：来自Applied Biosystems(Thermo Fisher)的引物-探针组包括以下：

1)人类α突触核蛋白(目录号Hs01103383_m1)FAM标记的

2)人类PROS1(目录号HS00165590_m1)FAM标记的

3)食蟹猴α突触核蛋白(目录号Mf02793033_m1)FAM标记的

4)食蟹猴GAPDH(目录号Mf04392546_g1)FAM标记的

5)食蟹猴GAPDH(目录号Mf04392546_g1)VIC标记的引物限制的

6)大鼠α突触核蛋白(目录号Rn01425141_m1)FAM标记的

7)大鼠GAPDH(目录号Rn01775763-g1)FAM标记的

8)大鼠GAPDH(目录号4352338E)VIC标记的引物限制的

9)小鼠GAPDH(目录号Mm99999915-g1)FAM标记的

10)小鼠GAPDH(目录号4352339E)VIC标记的引物限制的实施例8：ASO-005459在小鼠中的体内活性和耐受性分析

ASO-005459是对人SNCA特异的经LNA修饰的ASO。体外结果(如上所述)证明ASO-005459对降低原代神经元中的SNCA mRNA是有效的，且具有选择性。体外结果还表明，ASO-005459具有良好地耐受性。

A53T-PAC小鼠

为了评估这些结果是否在体内也是正确的，通过ICV注射向A53T-PAC小鼠施用了100μg ASO-005459，在注射后3天评估海马体中的耐受性和SNCA mRNA敲低(KD)，如实施例4所述(上文)。

如表6和表7所示(下文)，ASO-005459被良好地耐受，总体平均耐受性得分为1。此外，施用后3天，ASO-005459将海马体中的SNCA mRNA水平显著降低>90％。(图4)。

表6

表7：A53T-PAC小鼠3天研究中ASO-005459耐受性

为了评估体内活性，通过ICV注射向A53T-PAC小鼠给药ASO-005459，其浓度为3.13μg、12.5μg、25μg或50μg。通过在给药后第7天和第14天测量体重来评估耐受性。给药后14天，当处死动物并收获其组织时，评估SNCA mRNA的表达。在三个脑区域(海马体、脑干和纹状体)中测量了SNCA mRNA的敲低。脑干和纹状体是MSA和PD患者脑中受影响最大的两个区域。在单独的研究中，向C57BL/6小鼠给药了100μg ASO-005459，并通过在给药后第7、14、21和28天测量动物的体重来评估其耐受性。在野生型(WT)C57BL/6小鼠中ICV给药100μg ASO-005459，并在4周内监测体重和行为。由于ASO-005459并未靶向小鼠SNCA，因此在这些动物中未测量SNCA mRNA表达的降低。

如图5A和5B所示，用ASO-005459(所有浓度)处理的小鼠(A53T-PAC小鼠和C57BL/6小鼠)和用对照媒介物处理的小鼠的体重没有显著差异。在实验过程中，动物(C57BL/6)没有表现出任何异常行为。参见表8(下文)。这样的结果表明，ASO-005459具有良好地耐受性。同样，在用ASO-005459处理的小鼠中，在所有测试的三个脑区域中，SNCA mRNA表达均出现了显著且剂量依赖性的降低。参见图6A-6C。在海马体中，对于3.13、12.5、25和50μg ASO-005459，SNCA mRNA表达分别降低了53％、73％、80％和96％。在脑干中也观察到类似的剂量依赖性的敲低。在纹状体中，与其他区域相比，SNCA mRNA的敲低变化更大且更不稳健(图6A-6C)：在50μg和25μg的ASO-005459的情况下分别观察到75％和46％的敲低。但是，在12.5μg和3.13μg的ASO-005459的情况下，SNCA mRNA表达没有明显降低。纹状体中观察到的较低活性的可能解释可以是由于ASO水平的差异或SNCA mRNA敲低的动力学。

表8：28天研究中ASO-005459耐受性

表8：28天研究中ASO-005459耐受性

在A53T-PAC小鼠的所有三种脑区域中测量ASO-005459水平。如图7和表9(下文)所示，在包括纹状体在内的所有三个区域中，脑暴露量近似呈剂量比例，并且相似。不同脑区域的ASO-005459暴露-响应关系在图8A-8D中显示。在海马体和脑干中观察到相似的暴露-响应关系，估计IC₅₀分别为179和206nM。相比之下，纹状体中的暴露响应关系相对较陡，表明该区域SNCA mRNA减少的动力学较慢。参见图8C。

表9：在14天A53T-PAC研究中ASO-005459脑暴露的总结

为了提供更广泛的剂量-响应/时间进程数据，再次通过ICV徒手注射将ASO-005459直接施用(0、12.5、25或50μg)到A53T-PAC小鼠的脑室中。在给药后24小时、3天、4、8、12、16和20周处死动物，并评估脑干和纹状体中的SNCA mRNA表达。

如图9A和9B所示(并与以上提供的数据一致)，向A53T-PAC小鼠施用ASO-005459导致脑干和纹状体中的SNCA mRNA表达水平(相对于媒介物对照)显著降低。降低似乎是时间依赖性的和剂量依赖性的，在50μg ASO-005459情况下在给药后约4周在脑干中观察到峰值降低(约90％)(图9A)。在纹状体中，在给药后约3天在50μg ASO-005459的情况下观察到峰值降低(约55％)(图9B)。与媒介物对照相比，在给药后4周，SNCA mRNA表达水平保持显著降低(图10A和10B)，并且在给药后约16周恢复到基线对照(图9A和9B)。

如图11A和11B所示，向动物施用ASO-005459还导致脑干和纹状体脑组织中SNCA蛋白水平的时间依赖性降低和剂量依赖性降低。给药后8周，在50μg剂量的情况下在脑干中观察到峰值降低(约75％)(图11A)。对于纹状体脑组织，在50μg剂量的情况下但在给药后4周也观察到峰值降低(约75％)(图11B)。在图12A(脑干)和12B(纹状体)中提供了给药后8周时各小鼠的表达水平。尽管给药后约12周，在纹状体中SNCA蛋白水平恢复到接近基线水平，但直到长达给药后16周，脑干中的表达水平仍显著降低(约25％)。

实施例9：食蟹猴中SNCA靶向的反义寡核苷酸(ASO)的体内活性和耐受性分析

为了进一步评估体内的ASO活性和耐受性，开发了鞘内移植食蟹猴模型(CynoIT)。该模型能够评估ASO-005459介导的SNCA敲低以及潜在的1个碱基对错配脱靶PROS1和IKZF3的敲低。SNCA、PROS1和IKZF3中的ASO-005459靶位点在人与食蟹猴之间是完全保守的。

如上文实施例6中所述，每只动物均植入进入L3或L4椎骨的鞘内脑脊液(CSF)导管。将ASO-005459溶解在盐水中并施用于动物(8mg/动物)，使用IT口输入4.5分钟(每剂量组2只动物)。然后在给药后24小时和3天对动物实施安乐死，收获组织用于分析ASO暴露和活性。分析的脑区域包括髓质(Med)、脑桥(V-Pons)、中脑(V-MB)、小脑(CBL)、尾状核(左和右)(CauP)、海马体(左和右)(Hip)、额皮质(左和右)(FrC)、颞叶皮层(左和右)(TeC)、顶叶皮层(左和右)(PaC)、枕叶皮层(左和右)(Occ)和皮层白质(WM)。另外，在颈(CSC)、胸(TSC)和腰(LSC)区域取样脊髓。还从肝、肾、心脏、三叉神经核、胫神经和主动脉收集了样本，以检查这些区域的脱靶药理学。

如在小鼠中观察到的，食蟹猴对ASO-005459的耐受性良好，未观察到不良作用(数据未显示)。并且如下表10所示，施用ASO-005459在食蟹猴脑的多个区域中表现出强大的SNCA mRNA敲低。

表10：ASO-005459对食蟹猴脑中脑SNCA mRNA水平的影响

为了进一步表征上文描述的SNCA mRNA的降低，向食蟹猴给药ASO-005459(每只动物总共8mg)，并在给药后24小时、3天、2、4、8、13或20周处死以评估不同组织中SNCA mRNA的表达水平。如图13A所示，在给药后2周至13周之间观察到峰值降低。在髓质、小脑、脑桥、尾状壳核、额皮质和腰椎脊髓中分别观察到峰值降低了70％、65％、75％、35％、94％和99％。SNCA mRNA表达水平的这种降低也与SNCA蛋白表达水平的时间依赖性降低相关(图13B)。

接下来，为了评估食蟹猴中表达水平的降低是否也取决于剂量，动物接受了2、4或8mg ASO-005459，然后在给药后2周处死。如图14A和14B所示，SNCA mRNA和SNCA蛋白表达水平的降低也依赖于剂量，其中在8mg ASO-005459的情况下观察到最大的降低。

本文给出的结果证明，ASO-005459对于降低SNCA mRNA是有效的和选择性的，并且ASO-005459在神经元中和体内临床前物种中被很好地耐受。此外，来自A53T-PAC神经元的结果证实，ASO-005459介导的mRNA降低导致体外和体内SNCA蛋白水平降低。此外，A53T-PAC小鼠和食蟹猴中的结果表明，ASO-005459以良好的耐受剂量降低了脑中的SNCA mRNA和SNCA蛋白。综上所述，这些发现支持了ASO-005459作为用于治疗突触核蛋白病的疾病修饰疗法的持续发展。

该PCT申请要求2018年1月12日提交的美国临时申请号62/616,937的优先权，其通过引用以其整体并入本文。

序列表

<110> 百时美施贵宝公司

哥本哈根罗氏创新中心

<120> 靶向α-突触核蛋白的反义寡核苷酸及其用途

<130> 3338.107PC01/ELE/C-K/DKC

<150> 62/616,937

<151> 2018-01-12

<160> 10

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 2400

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gagataggga cgaggagcac gctgcaggga aagcagcgag cgccgggaga ggggcgggca 60

gaagcgctga caaatcagcg gtgggggcgg agagccgagg agaaggagaa ggaggaggac 120

taggaggagg aggacggcga cgaccagaag gggcccaaga gagggggcga gcgaccgagc 180

gccgcgacgc ggaagtgagg tgcgtgcggg ctgcagcgca gaccccggcc cggcccctcc 240

gagagcgtcc tgggcgctcc ctcacgcctt gccttcaagc cttctgcctt tccaccctcg 300

tgagcggaga actgggagtg gccattcgac gacaggttag cgggtttgcc tcccactccc 360

ccagcctcgc gtcgccggct cacagcggcc tcctctgggg acagtccccc ccgggtgccg 420

cctccgccct tcctgtgcgc tccttttcct tcttctttcc tattaaatat tatttgggaa 480

ttgtttaaat ttttttttta aaaaaagaga gaggcgggga ggagtcggag ttgtggagaa 540

gcagagggac tcaggtaagt acctgtggat ctaaacgggc gtctttggaa atcctggaga 600

acgccggatg ggagacgaat ggtcgtgggc accgggaggg ggtggtgctg ccatgaggac 660

ccgctgggcc aggtctctgg gaggtgagta cttgtccctt tggggagcct aaggaaagag 720

acttgacctg gctttcgtcc tgcttctgat attcccttct ccacaagggc tgagagatta 780

ggctgcttct ccgggatccg cttttccccg ggaaacgcga ggatgctcca tggagcgtga 840

gcatccaact tttctctcac ataaaatctg tctgcccgct ctcttggttt ttctctgtaa 900

agtaagcaag ctgcgtttgg caaataatga aatggaagtg caaggaggcc aagtcaacag 960

gtggtaacgg gttaacaagt gctggcgcgg ggtccgctag ggtggaggct gagaacgccc 1020

cctcgggtgg ctggcgcggg gttggagacg gcccgcgagt gtgagcggcg cctgctcagg 1080

gtagatagct gagggcgggg gtggatgttg gatggattag aaccatcaca cttgggcctg 1140

ctgtttgcct gagtttgaac cacaccccga gtgagcagtt agttctgttg cctacgcctt 1200

tccaccatca acctgttagc cttcttctgg gattcatgtt aaggataccc ctgaccctaa 1260

gcctccagct tccatgcttc taactcatac tgttaccctt tagaccccgg gaatttaaaa 1320

aaggggttaa tcttttcatg caactccact tctgaaatgc agtaataaca actcagagga 1380

ttcatcctaa tccgtggtta ggtggctaga cttttactag ccaagatgga tgggagatgc 1440

taaattttta atgccagagc taaaaatgtc tgctttgtcc aatggttaaa tgagtgtaca 1500

cttaaaagag tctcacactt tggagggttt ctcatgattt ttcagtgttt tttgtttatt 1560

tttccccgaa agttctcatt caaagtgtat tttatgtttt ccagtgtggt gtaaaggaat 1620

tcattagcca tggatgtatt catgaaagga ctttcaaagg ccaaggaggg agttgtggct 1680

gctgctgaga aaaccaaaca gggtgtggca gaagcagcag gaaagacaaa agagggtgtt 1740

ctctatgtag gtaggtaaac cccaaatgtc agtttggtgc ttgttcatga gtgatgggtt 1800

aggataatca atactctaaa tgctggtagt tctctctctt gattcatttt tgcatcattg 1860

cttgtcaaaa aggtggactg agtcagaggt atgtgtaggt aggtgaatgt gaacgtgtgt 1920

atttgagcta atagtaaaaa atgcgactgt ttgcttttcc agatttttaa ttttgcccta 1980

atatttatga ctttttaaaa atgaatgttt ctgtacctac ataattctat ttcagagaac 2040

agttttaaaa actcatagtc ttttaaaaaa taatcaagaa tattcttaag aatcaaaatc 2100

attgatggat ctgtgatttc ttttaccatc atgaaaaatg tttgtcaatt ttaatccatt 2160

ctgattttta aaatatgact ttgatatgcc cctgtgatgt gtataaagag acctatttgt 2220

ggccctaaaa tggaaagaac agattagtct ttgatagagt tacttcatgt gatcatttgg 2280

tctctgtgaa cactgaggac agagaaaagt gcttgagggc tgctactaat ctctcagaaa 2340

catttgtata gttcatccat caaatgacac acatactaaa agaataaaga aattgatgct 2400

<210> 2

<211> 3215

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

aggagaagga gaaggaggag gactaggagg aggaggacgg cgacgaccag aaggggccca 60

agagaggggg cgagcgaccg agcgccgcga cgcggaagtg aggtgcgtgc gggctgcagc 120

gcagaccccg gcccggcccc tccgagagcg tcctgggcgc tccctcacgc cttgccttca 180

agccttctgc ctttccaccc tcgtgagcgg agaactggga gtggccattc gacgacagtg 240

tggtgtaaag gaattcatta gccatggatg tattcatgaa aggactttca aaggccaagg 300

agggagttgt ggctgctgct gagaaaacca aacagggtgt ggcagaagca gcaggaaaga 360

caaaagaggg tgttctctat gtaggctcca aaaccaagga gggagtggtg catggtgtgg 420

caacagtggc tgagaagacc aaagagcaag tgacaaatgt tggaggagca gtggtgacgg 480

gtgtgacagc agtagcccag aagacagtgg agggagcagg gagcattgca gcagccactg 540

gctttgtcaa aaaggaccag ttgggcaaga atgaagaagg agccccacag gaaggaattc 600

tggaagatat gcctgtggat cctgacaatg aggcttatga aatgccttct gaggaagggt 660

atcaagacta cgaacctgaa gcctaagaaa tatctttgct cccagtttct tgagatctgc 720

tgacagatgt tccatcctgt acaagtgctc agttccaatg tgcccagtca tgacatttct 780

caaagttttt acagtgtatc tcgaagtctt ccatcagcag tgattgaagt atctgtacct 840

gcccccactc agcatttcgg tgcttccctt tcactgaagt gaatacatgg tagcagggtc 900

tttgtgtgct gtggattttg tggcttcaat ctacgatgtt aaaacaaatt aaaaacacct 960

aagtgactac cacttatttc taaatcctca ctattttttt gttgctgttg ttcagaagtt 1020

gttagtgatt tgctatcata tattataaga tttttaggtg tcttttaatg atactgtcta 1080

agaataatga cgtattgtga aatttgttaa tatatataat acttaaaaat atgtgagcat 1140

gaaactatgc acctataaat actaaatatg aaattttacc attttgcgat gtgttttatt 1200

cacttgtgtt tgtatataaa tggtgagaat taaaataaaa cgttatctca ttgcaaaaat 1260

attttatttt tatcccatct cactttaata ataaaaatca tgcttataag caacatgaat 1320

taagaactga cacaaaggac aaaaatataa agttattaat agccatttga agaaggagga 1380

attttagaag aggtagagaa aatggaacat taaccctaca ctcggaattc cctgaagcaa 1440

cactgccaga agtgtgtttt ggtatgcact ggttccttaa gtggctgtga ttaattattg 1500

aaagtggggt gttgaagacc ccaactacta ttgtagagtg gtctatttct cccttcaatc 1560

ctgtcaatgt ttgctttacg tattttgggg aactgttgtt tgatgtgtat gtgtttataa 1620

ttgttataca tttttaattg agccttttat taacatatat tgttattttt gtctcgaaat 1680

aattttttag ttaaaatcta ttttgtctga tattggtgtg aatgctgtac ctttctgaca 1740

ataaataata ttcgaccatg aataaaaaaa aaaaaaaagt gggttcccgg gaactaagca 1800

gtgtagaaga tgattttgac tacaccctcc ttagagagcc ataagacaca ttagcacata 1860

ttagcacatt caaggctctg agagaatgtg gttaactttg tttaactcag cattcctcac 1920

tttttttttt taatcatcag aaattctctc tctctctctc tctttttctc tcgctctctt 1980

tttttttttt tttttacagg aaatgccttt aaacatcgtt ggaactacca gagtcacctt 2040

aaaggagatc aattctctag actgataaaa atttcatggc ctcctttaaa tgttgccaaa 2100

tatatgaatt ctaggatttt tccttaggaa aggtttttct ctttcaggga agatctatta 2160

actccccatg ggtgctgaaa ataaacttga tggtgaaaaa ctctgtataa attaatttaa 2220

aaattatttg gtttctcttt ttaattattc tggggcatag tcatttctaa aagtcactag 2280

tagaaagtat aatttcaaga cagaatattc tagacatgct agcagtttat atgtattcat 2340

gagtaatgtg atatatattg ggcgctggtg aggaaggaag gaggaatgag tgactataag 2400

gatggttacc atagaaactt ccttttttac ctaattgaag agagactact acagagtgct 2460

aagctgcatg tgtcatctta cactagagag aaatggtaag tttcttgttt tatttaagtt 2520

atgtttaagc aaggaaagga tttgttattg aacagtatat ttcaggaagg ttagaaagtg 2580

gcggttagga tatattttaa atctacctaa agcagcatat tttaaaaatt taaaagtatt 2640

ggtattaaat taagaaatag aggacagaac tagactgata gcagtgacct agaacaattt 2700

gagattagga aagttgtgac catgaattta aggatttatg tggatacaaa ttctccttta 2760

aagtgtttct tcccttaata tttatctgac ggtaattttt gagcagtgaa ttactttata 2820

tatcttaata gtttatttgg gaccaaacac ttaaacaaaa agttctttaa gtcatataag 2880

ccttttcagg aagcttgtct catattcact cccgagacat tcacctgcca agtggcctga 2940

ggatcaatcc agtcctaggt ttattttgca gacttacatt ctcccaagtt attcagcctc 3000

atatgactcc acggtcggct ttaccaaaac agttcagagt gcactttggc acacaattgg 3060

gaacagaaca atctaatgtg tggtttggta ttccaagtgg ggtctttttc agaatctctg 3120

cactagtgtg agatgcaaac atgtttcctc atctttctgg cttatccagt atgtagctat 3180

ttgtgacata ataaatatat acatatatga aaata 3215

<210> 3

<211> 140

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 4

attcctttac accacac 17

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 5

tctgtcttgg ctttg 15

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 6

agaaataagt ggtagt 16

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 7

ccaaatctta taataactac 20

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 8

ttcctttaca ccacac 16

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 9

ggtgaggttt ggtaga 16

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 10

ggtgaggttt ggtagaag 18

Claims

1.一种反义寡核苷酸(ASO)，其包含AtTcctttacaccACAC(SEQ ID NO:4)的连续核苷酸序列、基本上由AtTcctttacaccACAC(SEQ ID NO:4)的连续核苷酸序列组成或由AtTcctttacaccACAC(SEQ ID NO:4)的连续核苷酸序列组成，其中大写字母为β-D-氧基-LNA，并且小写字母为DNA。

2.根据权利要求1所述的ASO，其包含选自以下的核苷酸间连接：磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键及其组合。

3.根据权利要求2所述的ASO，其中所述核苷酸间连接为硫代磷酸酯键。

4.根据权利要求1所述的ASO，其中所述连续核苷酸序列是OxyAs DNAts OxyTs DNAcsDNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAsOxyMC，其中OxyA、OxyT和Oxy MC分别是腺嘌呤β-D-氧基-LNA、胸腺嘧啶βD-氧基-LNA和甲基胞嘧啶βD-氧基-LNA，其中DNAt、DNAc和DNAa分别是胸腺嘧啶DNA、胞嘧啶DNA和腺嘌呤DNA，并且其中s是两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的ASO，其包含分子式C₁₇₁H₂₁₄N₅₆O₉₀P₁₆S₁₆和如图1B所示的结构，其中M⁺是抗衡离子。

6.根据权利要求5所述的ASO，其中所述抗衡离子选自H⁺、Na⁺、NH4⁺及其任何组合。

7.根据权利要求6所述的ASO，其中所述抗衡离子是Na⁺。

8.一种缀合物，其包含权利要求1至7中任一项所述的ASO，其中所述ASO共价附接到至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。

9.根据权利要求8所述的缀合物，其中所述非核苷酸或非多核苷酸部分包含蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其任何组合。

10.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的ASO或根据权利要求8或9所述的缀合物和药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的组合物，其进一步包含治疗剂。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述治疗剂是α-突触核蛋白拮抗剂。

13.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的ASO、根据权利要求8或9所述的缀合物、或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物以及使用说明书。

14.一种诊断试剂盒，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的ASO、根据权利要求8或9所述的缀合物、或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物以及使用说明书。

15.一种抑制或降低细胞中SNCA蛋白表达的方法，所述方法包括向表达SNCA蛋白的细胞施用根据权利要求1至7中任一项所述的ASO、根据权利要求8或9所述的缀合物、或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中在施用后所述细胞中的SNCA蛋白表达被抑制或降低。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述ASO在施用后抑制或降低所述细胞中SNCAmRNA的表达。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中与未暴露于所述ASO的细胞相比，SNCA mRNA的表达在施用后降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中与未暴露于所述ASO的细胞相比，所述ASO在施用后将所述细胞中的SNCA蛋白的表达降低至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经元。

20.一种在有此需要的受试者中治疗突触核蛋白病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸、根据权利要求8或9所述的缀合物、或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物。

21.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸、根据权利要求8或9所述的缀合物或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物在制备药物中的用途。

22.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸、根据权利要求8或9所述的缀合物或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物在制备用于治疗有此需要的受试者的突触核蛋白病的药物中的用途。

23.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸、根据权利要求8或9所述的缀合物或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物用于在治疗中使用。

24.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸、根据权利要求8或9所述的缀合物或根据权利要求10至12中任一项所述的组合物用于在治疗有此需要的受试者中的突触核蛋白病中使用。

25.根据权利要求20所述的方法、根据权利要求21或22所述的用途，或根据权利要求23或24所述的用于使用的ASO，其中所述突触核蛋白病选自帕金森氏病、帕金森氏病痴呆(PDD)、多系统萎缩、路易体痴呆症及其任何组合。

26.根据权利要求20或25所述的方法、根据权利要求21、22和25中任一项所述的用途、或根据权利要求23至25中任一项所述的用于使用的ASO，其中所述受试者是人。

27.根据权利要求20、25和26中任一项所述的方法、根据权利要求21、22、25和26中任一项所述的用途或根据权利要求23至26中任一项所述的用于使用的ASO，其中所述ASO、缀合物或组合物经口服、肠胃外、鞘内、脑室内、肺、局部或心室内施用。