KR20200140793A - 알파-시누클레인을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 세포에서 SNCA mRNA를 (예를 들어, 인트론 엑손 연접부에서) 표적화하여, SNCA 단백질의 감소된 발현을 발생시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. SNCA 단백질 발현의 감소는 특정 의학적 장애, 예를 들어, 신경학적 장애의 치료에 유익하다.

Description

알파-시누클레인을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급

이 출원에서 제출된 전자적으로 제출된 서열 목록 (명칭: 3338_107PC01_SequenceListing_ST25.txt, 크기: 10,458 바이트; 및 생성일: 2019년 1월 10일)의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

개시내용의 분야

본 개시내용은 세포에서 알파-시누클레인 (SNCA) 전사체의 인트론 1 및 엑손 2의 연접부를 표적화하여, 알파-시누클레인 (SNCA) 단백질의 감소된 발현을 발생시키는 안티센스 올리고머성 화합물 (ASO)에 관한 것이다. SNCA 단백질 발현의 감소는 다양한 의학적 장애, 예컨대 다계통 위축증, 파킨슨병, 파킨슨병 치매 (PDD), 및 루이 소체를 갖는 치매에 유익할 수 있다.

시누클레인 단백질 족의 구성원인 알파-시누클레인 (SNCA)은 주로 신경 조직 내에서 발현되는 작은 가용성 단백질이다. 문헌 [Marques O et al., Cell Death Dis. 19: e350 (2012)]을 참조한다. 이는 많은 세포 유형에서 발현되지만, 뉴런의 시냅스전 말단 내에 우세하게 국재된다. 정확한 기능은 아직 완전히 해명되지 않았지만, SNCA는 시냅스 전달의 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었다. 예를 들어, SNCA는 뉴런의 시냅스전 막과의 시냅스 소포의 도킹을 매개하는 SNARE 복합체의 형성에서 분자 샤페론으로서 기능한다. SNCA는 또한 미세관을 안정화시키고, 소포 트래피킹을 조절하는 것을 돕는 미세관-연관된 단백질 타우와 같은 다른 단백질과 상호작용할 수 있다.

시냅스 전달의 조절에 있어서의 SNCA의 역할로 인해, SNCA 발현 및/또는 기능의 변경은 중요한 생물학적 프로세스를 방해할 수 있다. 이러한 방해는 뇌 내의 SNCA 단백질 응집체의 비정상적 축적을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환인 α-시누클레인병증에 기여하는 것으로 생각되었다. 따라서, 미스폴딩되고, 응집되고, 인산화된 SNCA 단백질의 불용성 봉입체는 파킨슨병 (PD), 파킨슨병 치매 (PDD), 루이 소체를 갖는 치매 (DLB), 및 다계통 위축증 (MSA)과 같은 질환에 대한 병리학적 특징이다. 문헌 [Galvin JE et al., Archives of Neurology 58: 186-190 (2001)]; 및 [Valera E et al., J Neurochem 139 Suppl 1: 346-352 (Oct. 2016)]을 참조한다.

α-시누클레인병증, 예컨대 파킨슨병은 특히 노인 중에서 매우 만연한 진행성 신경퇴행성 뇌 장애이다. 문헌 [Recchia A et al., FASEB J. 18: 617-26 (2004)]을 참조한다. 전세계적으로 대략 700만 내지 1000만명의 사람들이 이러한 장애를 갖고 살고 있으며, 미국에서만 매년 약 60,000건의 새로운 사례가 있는 것으로 추정된다. 개별적 사람에 대한 의료 비용은 연간 $2,500을 쉽게 초과할 수 있으며, 치료 수술은 환자 당 $100,000에 육박할 수 있다. 따라서, 보다 강력하고 비용-효과적인 치료 선택안이 크게 필요하다.

개시내용의 간단한 요약

본 개시내용은 AtTcctttacaccACAC (서열식별번호 (SEQ ID NO): 4) (여기서, 대문자는 베타-D-옥시-LNA이고, 소문자는 DNA임)의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, ASO는 포스포디에스테르 연결, 포스포트리에스테르 연결, 메틸포소네이트 연결, 포스포르아미데이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.

일부 실시양태에서, ASO는 OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 여기서, OxyA, OxyT, 및 Oxy MC는 각각 아데닌 베타 D-옥시-LNA, 티민 베타 D-옥시-LNA, 및 메틸 시토신 베타 D-옥시-LNA이고, DNAt, DNAc, 및 DNAa는 각각 티민 DNA, 시토신 DNA, 및 아데닌 DNA이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 C₁₇₁H₂₁₄N₅₆O₉₀P₁₆S₁₆의 분자식 및 도 1b에 나타내어진 바와 같은 구조를 포함하며, M⁺는 반대이온이다. 일부 실시양태에서, 반대이온은 H⁺, Na⁺, NH4⁺, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 반대이온은 Na⁺이다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 ASO를 포함하며, ASO가 적어도 1개의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티에 공유 부착된 것인 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티는 단백질, 지방산 쇄, 당 잔기, 당단백질, 중합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

또한, 본원에 개시된 바와 같은 ASO 또는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 치료제를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료제는 알파-시누클레인 길항제이다. 일부 실시양태에서, 알파-시누클레인 길항제는 항-알파-시누클레인 항체 또는 그의 단편이다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 ASO, 접합체, 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 또한, 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 조성물을 포함하는 진단 키트가 개시된다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 ASO, 접합체, 또는 조성물을 SNCA 단백질을 발현하는 세포에 투여하는 것을 포함하며, 세포에서의 SNCA 단백질 발현이 투여 후에 억제되거나 감소되는 것인, 세포에서 SNCA 단백질 발현을 억제하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, ASO는 투여 후에 세포에서의 SNCA mRNA의 발현을 억제하거나 감소시킨다. 특정 실시양태에서, SNCA mRNA의 발현은 ASO에 노출되지 않은 세포에 비해 투여 후에 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 적어도 약 60％, 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 또는 약 100％ 감소된다. 다른 실시양태에서, ASO는 투여 후에 세포에서의 SNCA 단백질의 발현을 ASO에 노출되지 않은 세포에 비해 적어도 약 60％, 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 또는 적어도 약 90％ 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 뉴런이다.

본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 시누클레인병증을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 시누클레인병증은 파킨슨병, 파킨슨병 치매 (PDD), 다계통 위축증, 루이 소체를 갖는 치매, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한, 의약의 제조를 위한 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 조성물의 용도가 본원에서 제공된다. 본 개시내용은 또한 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 시누클레인병증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 ASO, 접합체, 또는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 조성물은 시누클레인병증의 요법을 필요로 하는 대상체에서 시누클레인병증의 요법에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 조성물은 요법에 사용하기 위한 것이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, ASO, 접합체, 또는 조성물은 경구로, 비경구로, 경막내로, 뇌실내로, 폐로, 국소적으로, 또는 심실내로 투여된다.

도 1a는 ASO-005459의 인접한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. OxyA, OxyT, 및 Oxy MC는 각각 아데닌 베타 D-옥시-LNA, 티민 베타 D-옥시-LNA, 및 메틸 시토신 베타 D-옥시-LNA이고; DNAt, DNAc, 및 DNAa는 각각 티민 DNA, 시토신 DNA, 및 아데닌 DNA이고; s는 포스포로티오에이트 연결이다.
도 1b는 본원에 개시된 바와 같은 ASO-005459의 분자 구조를 나타낸다. 제공된 구조는 C₁₇₁H₂₁₄N₅₆O₉₀P₁₆S₁₆의 분자식을 가지며, M+의 각각은 제약상 허용되는 반대이온, 예컨대 H⁺, Na⁺, 또는 NH₄ ⁺이다.
도 2a 및 2b는 A53T-PAC 트랜스제닉 마우스로부터 단리된 1차 뉴런에서의 SNCA 및 튜불린 (Tub) 단백질 발현에 대한 ASO-005459의 효과를 나타낸다. 뉴런을 ASO-005459의 10-점 적정으로 처리하고, SNCA 및 튜불린 단백질의 양을 측정하였다. α-Syn/Tub 비 (도 2a) 및 Tub 수준 (도 2b)의 퍼센트 억제가 나타내어진다. 각각의 데이터 점은 개별적 반복실험을 나타낸다.
도 3은 인간 뉴런에서 SNCA (원), 단백질 S (알파) (PROS1 (정사각형)), 및 튜불린 (TUBB3 (삼각형)) mRNA의 발현 수준에 대한 ASO-005459의 효과를 나타낸다. 뉴런을 다양한 농도의 ASO-005459로 6일 동안 처리한 후, mRNA 수준을 콴티진 (QUANTIGENE)^® 검정에 의해 측정하였다. mRNA의 발현 수준은 대조군의 퍼센트로서 나타내어진다. 나타내어진 데이터는 중복실험 측정으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 4는 100 μg의 ASO-005459 (비어있는 정사각형) 또는 대조군 비히클 (채워진 원)의 ICV 투여 후 3일에 A53T-PAC 마우스의 해마에서의 SNCA mRNA 발현 수준을 나타낸다. SNCA mRNA 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 측정하고, GAPDH mRNA에 대해 정규화한 후, 비히클 군의 평균 발현 수준에 비해 표현하였다. 수평선은 1의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다. 나타내어진 데이터는 중복실험 측정으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. 나타내어진 통계는 던넷 (Dunnett) 사후-검정을 갖는 1-원 ANOVA에 기초한다. *** p<0.001.
도 5a 및 5b는 ASO-005459로 처리된 마우스의 평균 체중의 비교를 나타낸다. 도 5a에서, A53T-PAC 마우스를 3.13 μg, 12.5 μg, 25 μg, 또는 50 μg의 ASO-005459로 투여하고, 그들의 체중을 처리 후 제0주, 제1주, 및 제2주에 측정하였다. 도 5b에서, C57BL/6 마우스를 100 μg의 ASO-005459로 투여하고, 동물의 체중을 28일의 과정 동안 주 1회 측정하였다. 도 5a 및 5b 둘 다에서, 비히클 대조군을 받은 동물을 대조군으로서 사용하였다. 나타내어진 데이터는 다수의 동물 (n = 5)로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. 나타내어진 통계는 2-원 ANOVA에 기초한다.
도 6a, 6b, 및 6c는 ASO-005459 (3.13 μg, 12.5 μg, 25 μg, 또는 50 μg) 또는 비히클 대조군의 ICV 투여 후 14일에 A53T-PAC 마우스의 해마 (도 6a), 뇌간 (도 6b), 및 선조체 (도 6c)에서의 SNCA mRNA 발현 수준을 나타낸다. SNCA mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 측정하고, GAPDH mRNA에 대해 정규화한 후, 비히클 군의 평균에 비해 표현하였다. 나타내어진 데이터는 다수의 동물 (n = 5)로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. 각각의 원은 개별적 동물을 나타낸다. 수평선은 1의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다. 나타내어진 통계는 던넷 사후-검정을 갖는 1-원 ANOVA에 기초한다. *** p<0.001.
도 7은 ASO-005459 처리 후 14일에 A53T-PAC 마우스의 해마 (흑색), 뇌간 (밝은 회색), 및 선조체 (어두운 회색)에서 검출된 ASO-005459의 수준을 나타낸다. 마우스는 3.13 μg, 12.5 μg, 25 μg, 또는 50 μg의 ASO-005459를 ICV 투여를 통해 받았다. 나타내어진 데이터는 다수의 동물 (n = 5)로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 8a, 8b, 8c, 및 8d는 ASO-005459 처리 후 14일에 A53T-PAC 마우스의 해마 (도 8a), 뇌간 (도 8b), 및 선조체 (도 8c)에서의 ASO-005459 노출 수준 및 SNCA mRNA 발현 사이의 관계를 나타낸다. 도 8d는 해마 (원), 뇌간 (정사각형), 및 선조체 (삼각형)로부터의 데이터를 조합으로 나타낸다. 각각의 데이터 점은 개별적 동물을 나타낸다. 4-파라미터, 비선형 핏은 해마 (도 8a) 및 뇌간 (도 8b)에 대해 나타내어진다.
도 9a 및 9b는 A53T-PAC 마우스에서의 SNCA mRNA 발현 수준에 대한 ASO-005459의 효과의 용량 반응 곡선을 나타낸다. 동물은 (ICV 주사를 통해) 12.5 μg (원), 25 μg (박스), 또는 50 μg (삼각형)의 ASO-005459를 받았고, 투여 후 24시간, 3일, 4주, 8주, 12주, 16주, 및 20주에 희생되었다. 뇌간 (도 9a) 및 선조체 (도 9b) 둘 다에서의 SNCA mRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 평가한 후, 비히클 대조군에 대해 정규화하였다. 평균 데이터가 나타내어진다. 수평선은 100％의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다.
도 10a 및 10b는 ASO-005459 투여 후 4주 후에 A53T-PAC 마우스에서의 SNCA mRNA 발현 수준에 대한 ASO-005459의 효과를 나타낸다. 동물은 비히클 대조군 또는 다양한 농도의 ASO-005459 (12.5, 25, 또는 50 μg) 중 어느 하나를 받았다. 상대적 SNCA mRNA 발현 수준 (비히클 대조군에 대해 정규화됨)이 뇌간 (도 10a) 및 선조체 (도 10b) 둘 다에 대해 나타내어진다. 각각의 데이터 점은 개별적 동물을 나타낸다. 다수의 동물로부터의 평균 ± SD가 또한 나타내어진다. 나타내어진 통계는 다중 비교를 위한 던넷 보정을 갖는 1-원 ANOVA를 사용한 비히클 군과의 비교에 기초한다. 수평선은 1의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 11a 및 11b는 A53T-PAC 마우스의 뇌 조직에서의 SNCA 단백질 발현 수준에 대한 ASO-005459의 효과의 용량 반응 곡선을 나타낸다. 동물은 (ICV 주사를 통해) 12.5 μg (원), 25 μg (박스), 또는 50 μg (삼각형)의 ASO-005459를 받았고, 투여 후 24시간, 3일, 4주, 8주, 12주, 16주, 및 20주에 희생되었다. SNCA 단백질 수준을 ELISA에 의해 뇌간 (도 11a) 및 선조체 (도 11b) 둘 다에서 측정한 후, 비히클 대조군에 대해 정규화하였다. 평균 데이터가 나타내어진다. 수평선은 100％의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다.
도 12a 및 12b는 ASO-005459 투여 후 8주에 A53T-PAC 마우스에서의 SNCA 단백질 발현 수준에 대한 ASO-005459의 효과를 나타낸다. 동물은 비히클 대조군 또는 다양한 농도의 ASO-005459 (12.5, 25, 또는 50 μg) 중 어느 하나를 받았다. 상대적 SNCA 단백질 발현 수준 (비히클 대조군에 대해 정규화됨)이 뇌간 (도 12a) 및 선조체 (도 12b) 둘 다에 대해 나타내어진다. 각각의 데이터 점은 개별적 동물을 나타낸다. 수평선은 100％의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다. 다수의 동물로부터의 평균 ± SD가 또한 나타내어진다. 나타내어진 통계는 다중 비교를 위한 던넷 보정을 갖는 1-원 ANOVA를 사용한 비히클 군과의 비교에 기초한다.
도 13a 및 13b는 ASO-005459 투여 후의 시노몰거스 원숭이에서의 SNCA mRNA 및 SNCA 단백질 발현 수준의 동역학을 나타낸다. 동물 각각은 비히클 대조군 또는 ASO-005459 (8 mg) 중 어느 하나를 받았고, 그 후 투여 후 24시간, 3일, 2주, 4주, 8주, 13주, 또는 20주에 희생되었다. 각각의 시점에서, SNCA mRNA (도 13a) 및 SNCA 단백질 (도 13b)의 발현 수준을 하기 조직에서 평가하였다: 연수 (상부 좌측 패널), 꼬리 조가비핵 (상부 중간 패널), 교뇌 (상부 우측 패널), 소뇌 (하부 좌측 패널), 요추 척수 (하부 중간 패널), 및 전두 피질 (하부 우측 패널). 발현 수준은 비히클 대조군의 백분율로서 나타내어진다. 개별적 동물에 대한 데이터 및 평균 둘 다가 나타내어진다. 수평선은 100％의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다.
도 14a 및 14b는 ASO-005459 투여 후 2주에 시노몰거스 원숭이에서의 SNCA mRNA (도 14a) 및 SNCA 단백질 (도 14b) 둘 다에 대한 상대적 발현 수준 (비히클 대조군의 백분율로서)을 나타낸다. 동물은 비히클 대조군 또는 다양한 농도의 ASO-005459 (2, 4, 또는 8 mg) 중 어느 하나를 받았다. 발현 수준을 하기 조직에서 평가하였다: 연수 (상부 좌측 패널), 꼬리 조가비핵 (상부 중간 패널), 교뇌 (상부 우측 패널), 소뇌 (하부 좌측 패널), 요추 척수 (하부 중간 패널), 및 전두 피질 (하부 우측 패널). 발현 수준은 비히클 대조군의 백분율로서 나타내어진다. 개별적 동물에 대한 데이터 및 평균 둘 다가 나타내어진다. 수평선은 100％의 참조 값 (즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군에서 관찰된 발현 수준과 등가일 값)을 표시한다.

개시내용의 상세한 설명

I. 정의

용어 "단수" 실체는 그 실체의 1개 이상을 지칭함을 유념해야 하며; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

더욱이, 본원에서 사용되는 경우 "및/또는"은 다른 것이 있거나 없는 2개의 구체화된 특색 또는 성분의 각각의 구체적인 개시내용으로서 받아들여져야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 측면의 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

언어 "포함하는"과 함께 본원에 기재된 측면 어디에서나, 다르게는 "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어에서 기재된 유사한 측면이 또한 제공됨이 이해된다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 개시내용이 관련되는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 통상의 기술자에게 이 개시내용에 사용된 용어의 많은 것의 일반적 사전을 제공한다.

단위, 접두사, 및 기호는 그들의 국제 단위계 (Systeme International de Unites) (SI) 허용되는 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 달리 지시되지 않는다면, 뉴클레오티드 서열은 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 배향으로 쓰여진다. 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카르복시 배향으로 쓰여진다. 본원에서 제공된 표제는 전체로서 명세서에 대한 언급에 의해 가져질 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 그의 전체로 명세서를 참조로 보다 완전히 정의된다.

용어 "약"은 대략, 거의, 주위의, 또는 정도를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치 값 위 및 아래의 경계를 연장시킴으로써 그 범위를 변형한다. 일반적으로, 용어 "약"은 예를 들어, 10 퍼센트 위 또는 아래 (초과 또는 미만)의 분산에 의해 언급된 값 위 및 아래의 수치 값을 변형할 수 있다. 예를 들어, "ASO가 ASO의 투여 후에 세포에서 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 60％ 감소시킨다"라고 언급되는 경우, SNCA 수준이 50％ 내지 70％의 범위만큼 감소됨이 암시된다.

용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" (ASO)는 뉴클레오티드간 연결을 통해 서로에 공유 연결된 뉴클레오시드, 예컨대 천연-발생 뉴클레오시드 또는 그의 변형된 형태의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 본 개시내용에 유용한 ASO는 적어도 1개의 비-천연 발생 뉴클레오시드를 포함한다. ASO는 ASO가 표적 핵산 서열에 혼성화하도록, 표적 핵산에 상보적이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "안티센스 ASO", "ASO", 및 "올리고머"는 용어 "ASO"와 상호교환가능하다.

용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 복수의 핵산을 포괄하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 생체내에서의 또는 시험관내에서의 표적 서열, 예를 들어, 프리-mRNA, mRNA, 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어가 표적 서열에서의 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭하는 경우, 핵산 또는 뉴클레오티드는 세포 내의 천연 발생 서열일 수 있다. 다른 실시양태에서, "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 본 개시내용의 ASO에서의 서열을 지칭한다. 상기 용어가 ASO에서의 서열을 지칭하는 경우, 핵산 또는 뉴클레오티드는 천연 발생이 아니며, 즉, 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 제조되거나, 재조합적으로 제조되거나, 이들의 임의의 조합이다. 한 실시양태에서, ASO에서의 핵산 또는 뉴클레오티드는 합성적으로 또는 재조합적으로 제조되지만, 천연 발생 서열 또는 그의 단편이 아니다. 또다른 실시양태에서, ASO에서의 핵산 또는 뉴클레오티드는 이들이 사실상 천연 발생이 아닌 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하기 때문에 천연 발생이 아니다. 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오시드"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 단일 핵산 절편, 예를 들어, DNA, RNA, 또는 그의 유사체를 지칭한다. "핵산" 또는 "뉴클레오시드"는 천연 발생 핵산 또는 비-천연 발생 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 "뉴클레오티드", "단위" 및 "단량체"는 상호교환가능하게 사용된다. 뉴클레오티드 또는 단량체의 서열을 언급하는 경우, 언급되는 것은 염기의 서열, 예컨대 A, T, G, C 또는 U, 및 그의 유사체임이 인식될 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오티드"는 당 모이어티, 염기 모이어티 및 공유 연결된 기 (연결기), 예컨대 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결기를 포함하는 글리코시드를 지칭하며, 천연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 및 변형된 당 및/또는 염기를 포함하는 비-천연 발생 뉴클레오티드 둘 다를 커버한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드 (단위)는 또한 단량체 또는 핵산 단위로 지칭될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레오시드"는 ASO의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오티드간 연결에 의해 공유 연결될 수 있는, 당 모이어티 및 염기 모이어티를 포함하는 글리코시드를 지칭하기 위해 사용된다. 생명공학의 분야에서, 용어 "뉴클레오시드"는 종종 핵산 단량체 또는 단위를 지칭하기 위해 사용된다. ASO의 맥락에서, 용어 "뉴클레오시드"는 염기 단독, 즉, 시토신 (DNA 및 RNA), 구아닌 (DNA 및 RNA), 아데닌 (DNA 및 RNA), 티민 (DNA) 및 우라실 (RNA)을 포함하는 핵염기 서열을 지칭할 수 있으며, 여기서, 당 백본 및 뉴클레오티드간 연결의 존재는 내포된다. 마찬가지로, 특히 뉴클레오티드간 연결기 중 1개 이상이 변형된 올리고뉴클레오티드의 경우, 용어 "뉴클레오티드"는 "뉴클레오시드"를 지칭할 수 있다. 예를 들어 용어 "뉴클레오티드"는, 심지어 뉴클레오시드 사이의 연결의 존재 또는 성질을 특정하는 경우에도 사용될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 것인 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드는 5' 뉴클레오티드간 연결기를 포함하지 않지만, 이는 5' 말단 기를 포함할 수 있다.

뉴클레오티드 서열을 지칭하는 경우 용어 "하류"는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치함을 의미한다. 특정 실시양태에서, 하류 뉴클레오티드 서열은 전사의 시작점에 이어지는 서열과 관련된다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 하류에 위치한다.

달리 지시되지 않는다면, 본원에서 제공된 서열은 5' 말단 (좌측)에서 3' 말단 (우측)으로 열거된다.

용어 "상류"는 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사체"는 DNA의 전사에 의해 합성된 1차 전사체를 지칭할 수 있으며, 프로세싱 후에 전령 RNA (mRNA), 즉, 전구체 전령 RNA (프리-mRNA), 및 프로세싱된 mRNA 자체가 된다. 용어 "전사체"는 "프리-mRNA" 및 "mRNA"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. DNA 가닥이 1차 전사체로 전사된 후, 새롭게 합성된 1차 전사체는 몇몇 방식으로 변형되어 그들의 성숙한 기능적 형태, 예컨대 mRNA, tRNA, rRNA, lncRNA, miRNA 및 기타로 전환된다. 따라서, 용어 "전사체"는 엑손, 인트론, 5' UTR, 및 3' UTR을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 유전자 생성물, 예를 들어, RNA 또는 폴리펩티드를 생성하는 프로세스를 지칭한다. 이는 제한 없이, 폴리뉴클레오티드의 전령 RNA (mRNA)로의 전사 및 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 생성물"을 생성한다. 본원에 사용된 바와 같은 유전자 생성물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생성된 전령 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩티드 중 어느 하나일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 생성물은 전사후 변형, 예를 들어, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들어, 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 또는 단백질분해적 절단을 갖는 폴리펩티드를 더 포함한다.

용어 SNCA 폴리펩티드의 "천연 발생 변이체"는 정의된 분류학적 군, 예컨대 포유동물, 예컨대 마우스, 원숭이, 및 인간 내에 천연적으로 존재하는 SNCA 폴리펩티드 서열 또는 SNCA 핵산 서열 (예를 들어, 전사체)의 변이체를 지칭한다. 전형적으로, SNCA 폴리뉴클레오티드의 "천연 발생 변이체"를 지칭하는 경우, 상기 용어는 또한 염색체 전위 또는 중복에 의해 염색체 위치 17q21에서 발견되는 SNCA-코딩 게놈 DNA의 임의의 대립유전자 변이체, 및 그로부터 유래된 RNA, 예컨대 mRNA를 포괄할 수 있다. "천연 발생 변이체"는 또한 SNCA mRNA의 선택적 스플라이싱으로부터 유래된 변이체를 포함할 수 있다. 구체적인 폴리펩티드 서열이 언급되는 경우, 예를 들어, 상기 용어는 또한 단백질의 천연 발생 형태를 포함하며, 이는 따라서 예를 들어, 번역-동시 또는 번역-후 변형, 예컨대 신호 펩티드 절단, 단백질분해적 절단, 글리코실화 등에 의해 프로세싱될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보체"는 참조 서열에 상보적인 서열을 지시한다. 상보성은 DNA 복제 및 전사의 기본 원리인데, 이는 그것이 2개의 DNA 또는 RNA 서열 사이에 공유되는 특성이어서, 이들이 서로에 대해 역평행하게 정렬되는 경우, 서열에서의 각각의 위치에서의 뉴클레오티드 염기는 거울에서 보고, 물건의 반대를 보는 것과 거의 같이 상보적일 것이기 때문이다. 따라서, 예를 들어, 5' "ATGC" 3'의 서열의 상보체는 3' "TACG" 5' 또는 5' "GCAT" 3'로서 쓰여질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "역 상보체", "역 상보적인" 및 "역 상보성"은 용어 "상보체", "상보적인" 및 "상보성"과 상호교환가능하다. 따라서, 5' attcctttacaccacac 3'(서열식별번호: 4)의 서열은 5' gtgtggtgtaaaggaat 3'와 상보적일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 서열식별번호 (즉, 서열식별번호: 4)에 대한 언급은 특정 핵염기 서열을 포함하지만, 임의의 디자인 또는 전체 화학 구조를 포함하지 않는다. 이 명세서가 구체적인 ASO 번호 (즉, ASO-005459)를 언급하는 경우, 언급은 서열, 구체적인 ASO 디자인, 및 화학 구조를 포함한다.

"효능"은 달리 언급되지 않는다면 통상적으로 μM, nM 또는 pM로 IC₅₀ 또는 EC₅₀ 값으로서 표현된다. 효능은 또한 퍼센트 억제의 용어로 표현될 수 있다. IC₅₀은 치료 분자의 중위 억제 농도이다. EC₅₀은 비히클 또는 대조군 (예를 들어, 염수)에 비한 치료 분자의 중위 유효 농도이다. 기능적 검정에서, IC₅₀은 생물학적 반응, 예를 들어, mRNA의 전사 또는 단백질 발현을 치료 분자에 의해 달성되는 생물학적 반응의 50％만큼 감소시키는 치료 분자의 농도이다. 기능적 검정에서, EC₅₀은 생물학적 반응, 예를 들어, mRNA의 전사 또는 단백질 발현의 50％를 생성하는 치료 분자의 농도이다. IC₅₀ 또는 EC₅₀은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수의 수단에 의해 계산될 수 있다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"이란 진단, 예측, 또는 요법이 바람직한 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 곰 등을 비롯한 인간, 가축, 농장 동물, 경기 동물, 및 동물원 동물을 포함한다.

용어 "제약 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효한 것을 허용하도록 하는 형태이고, 조성물이 투여될 대상체에게 비허용가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균성일 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 ASO의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 경험적으로 및 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.

"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하는 것" 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키는 것"과 같은 용어는 (1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애의 증상을 치유하고/거나, 감속시키고/거나, 줄이고/거나, 그의 진행을 정지시키는 치료적 조치 및 (2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 방지하고/거나 감속시키는 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 것들은 장애를 이미 갖는 것들; 장애를 가질 경향이 있는 것들; 및 장애가 예방되어야 할 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 환자가 예를 들어, 질환 또는 장애와 연관된 증상의 전체적, 부분적, 또는 일시적 경감 또는 제거를 나타내는 경우, 본원에서 제공된 방법에 따라 본원의 다른 곳에 개시된 질환 또는 상태에 대해 성공적으로 "치료된다."

II. ASO-005459

본 개시내용의 ASO (즉, ASO-005459)는 SNCA 전사체, 즉, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 7,604 내지 7,620의 영역의 상보체 (즉, 인트론 1 및 엑손 2 사이의 연접부)에 상응하는, 길이로 17 뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시내용의 ASO는 LDLDDDDDDDDDDLLLL의 ASO 디자인 (즉, AtTcctttacaccACAC)를 갖는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 (즉, attcctttacaccacac)을 가지며, 여기서, L은 잠금된 핵산 뉴클레오시드 (즉, LNA, 예를 들어, 베타-D-옥시-LNA)를 지시하고, D는 데옥시리보핵산 (DNA)을 지시한다. 따라서, ASO-005459의 5' 말단으로부터 제1, 제3, 및 제14 내지 제17 뉴클레오티드는 베타-D-옥시-LNA이고, 다른 뉴클레오티드의 각각은 DNA이다. 본원에 개시된 ASO는 또한 하기 화학 구조를 갖는다: OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC, 여기서, "s"는 포스포로티오에이트 연결을 지시한다. ASO-005459에 대한 구조식은 도 1b에 제공되며, 여기서, M+는 제약상 허용되는 반대이온이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 반대이온"은 생물학적으로 또는 다른 식으로 비바람직하지 않은 전기적 중성을 유지하기 위해 이온 종을 수반하고, 그에 의해, 제약상 허용되는 염 형태의 생성을 허용하는 이온을 지칭한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 반대이온은 H⁺, Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, Li⁺, 또는 1⁺의 전하를 갖는 임의의 다른 양이온일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 반대이온은 H⁺, Na⁺, NH₄ ⁺, 및 이들의 조합이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 염"은 ASO-005459가 그의 염을 제조함으로써 변형된 (예를 들어, 본원에 개시된 양이온의 첨가) ASO-005459의 유도체를 지칭한다. 이러한 염은 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않고 ASO의 바람직한 생물학적 활성을 보유한다. 본 개시내용의 ASO는 임의의 염 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 나트륨 염의 형태이다. 다른 실시양태에서, ASO는 칼륨 염의 형태이다.

ASO-005459는 SNCA mRNA의 인트론1/엑손2 연접부에 결합하고, SNCA mRNA의 번역을 방지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 당 변형 때문에, 본 개시내용의 ASO는 대조군 (예를 들어, 이러한 당 변형을 갖지 않는 ASO)에 비해 적어도 5％, 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 100％ 향상된 표적 RNA 서열에 대한 결합 친화도를 갖는다.

본원에 기재된 ASO의 단량체는 연결기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게는, 각각의 단량체는 연결기를 통해 3' 인접한 단량체에 연결된다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 맥락에서 ASO의 말단에서의 5' 단량체가 5' 연결기를 포함하지 않지만, 이는 5' 말단 기를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있음을 이해할 것이다.

용어 "연결기" 및 "뉴클레오티드간 연결"은 2개의 뉴클레오티드를 함께 공유 커플링할 수 있는 기를 의미하는 것으로 의도된다. 예로는 포스페이트 기 및 포스포로티오에이트 기를 들 수 있다.

뉴클레오티드간 연결의 예로는 포스포디에스테르 연결, 포스포트리에스테르 연결, 메틸포스포네이트 연결, 포스포르아미데이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 이들의 조합을 들 수 있다. 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2007/031091을 참조한다.

본 개시내용의 ASO의 한 측면에서, 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 기에 의해 서로에 연결된다.

특히 뉴클레오티드 사이의 또는 그에 인접한, 다르게는 포스포로티오에이트 ASO 내로의 포스포디에스테르 연결, 예컨대 1 또는 2개의 연결의 포함은 ASO의 생체이용률 및/또는 생체분포를 변형시킬 수 있음이 인식된다 - 본원에 참조로 포함되는 WO2008/113832를 참조한다.

일부 실시양태, 예컨대 상기 언급된 실시양태에서, 적합한 및 구체적으로 지시되지 않는 경우, 모든 잔류의 연결기는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 중 어느 하나, 또는 이들의 혼합물이다.

일부 실시양태에서, 모든 뉴클레오티드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.

"LNA 뉴클레오시드"는 리보스 고리의 형태를 제한하거나 잠그는, 상기 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4'를 연결하는 비라디칼 (biradical) (또한 "2'- 4' 브릿지"로 지칭됨)을 포함하는 2'- 변형된 뉴클레오시드이다. 이들 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 브릿지된 핵산 또는 비시클릭 핵산 (BNA)으로 용어화된다. 리보스의 형태의 잠금은 LNA이 상보적인 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되는 경우 혼성화의 향상된 친화도 (두가닥 안정화)와 연관된다. 이는 통상적으로 올리고뉴클레오티드/상보체 두가닥의 용융 온도를 측정함으로써 결정될 수 있다.

비제한적인 예시적인 LNA 뉴클레오시드는 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 , WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, 문헌 [Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76], [Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81], 및 [Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238], 및 [Wan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667]에 개시되어 있다.

추가로 비제한적인 예시적인 LNA 뉴클레오시드는 반응식 1에 개시되어 있다.

<반응식 1>

특정 실시양태에서, 본 개시내용에 유용한 LNA는 베타-D-옥시-LNA이다.

II.A. 접합체

본원에 사용된 바와 같은 용어 접합체는 비-뉴클레오티드 모이어티에 공유 연결된 ASO-005459를 지칭한다.

1개 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티에의 ASO-005459의 접합은 예를 들어, ASO의 활성, 세포 분포, 세포 흡수 또는 안정성에 영향을 미침으로써 ASO의 약리학을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합체 모이어티는 ASO의 세포 분포, 생체이용률, 대사, 배설, 투과성, 및/또는 세포 흡수를 개선시킴으로써 ASO의 약동학적 특성을 변형시키거나 향상시킨다. 특히, 접합체는 ASO를 특이적 기관, 조직 또는 세포 유형에 표적화하고, 그에 의해 기관, 조직 또는 세포 유형에서 ASO의 유효성을 향상시킬 수 있다. 동시에, 접합체는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서의 ASO의 활성, 예를 들어, 오프 타겟 활성 또는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서의 활성을 감소시키도록 기능할 수 있다. WO 93/07883 및 WO2013/033230은 적합한 접합체 모이어티를 제공한다. 추가의 적합한 접합체 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPr)에 결합할 수 있는 것들이다. 특히, 3가 N-아세틸갈락토스아민 접합체 모이어티는 ASGPr에 결합하는 데 적합하며, 예를 들어 WO 2014/076196, WO 2014/207232, 및 WO 2014/179620을 참조한다.

ASO 접합체 및 그들의 합성은 또한 문헌 [Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001] 및 [Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103]에 의한 포괄적인 검토에서 보고되었다.

일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티 (접합체 모이어티)는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친지질성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소 (예를 들어, 박테리아 독소), 비타민, 바이러스 단백질 (예를 들어, 캡시드), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

II.B. 활성화된 ASO

본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성화된 ASO"는 1개 이상의 접합된 모이어티, 즉, 그들 자체가 핵산 또는 단량체가 아닌 모이어티에의 ASO의 공유 연결을 허용하는 적어도 1개의 기능적 모이어티에 공유 연결되어 (즉, 관능화되어), 본원에 기재된 접합체를 형성하는 본 개시내용의 ASO를 지칭한다. 전형적으로, 기능적 모이어티는 예를 들어, 아데닌 염기의 3'-히드록실 기 또는 엑소시클릭 NH₂ 기, 친수성일 수 있는 스페이서 및 접합된 모이어티에 결합할 수 있는 말단 기 (예를 들어, 아미노, 술프히드릴 또는 히드록실 기)를 통해 ASO에 공유 결합할 수 있는 화학기를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 이 말단 기는 보호되지 않으며, 예를 들어, NH₂ 기이다. 다른 실시양태에서, 말단 기는 예를 들어, 임의의 적합한 보호기, 예컨대 문헌 ["Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)]에 기재된 것들에 의해 보호된다.

일부 실시양태에서, ASO-005459는 ASO의 5' 말단에의 접합된 모이어티의 공유 부착을 허용하기 위해 5' 말단에서 관능화된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 3' 말단에서 관능화될 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 백본을 따라 또는 헤테로시클릭 염기 모이어티 상에서 관능화될 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO는 5' 말단, 3' 말단, 백본, 및 염기로부터 독립적으로 선택되는 1개 초과의 위치에서 관능화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 활성화된 ASO는 합성 동안 기능적 모이어티에 공유 부착되는 1개 이상의 단량체를 혼입시킴으로써 합성된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 활성화된 ASO는 관능화되지 않은 단량체로 합성되며, ASO는 합성의 완결 시 관능화된다.

III. 제약 조성물 및 투여 경로

ASO-005459는 제약 제형 및 조성물에 사용될 수 있다. 적합하게는, 이러한 조성물은 제약상 허용되는 희석제, 담체, 염, 또는 아주반트를 포함한다.

ASO-005459는 치료되는 환자에서 심각한 부작용을 유발하지 않고 치료 유효량을 환자에게 전달하는 데 충분한 양으로 단위 제형에, 예컨대 제약상 허용되는 담체 또는 희석제에 포함될 수 있다. 그러나, 요법의 일부 형태에서, 심각한 부작용은 치료적 치료에 대한 긍정적인 결과를 보장하는 관점에서 허용될 수 있다.

제형화된 약물은 제약상 허용되는 결합제 및 아주반트를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제, 또는 환제는 예를 들어 하기 화합물을 함유할 수 있다: 결합제로서 미세결정질 셀룰로스, 검 또는 젤라틴; 부형제로서 전분 또는 락토스; 윤활제로서 스테아레이트; 다양한 감미제 또는 향미제. 캡슐에 대해, 투여 단위는 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 마찬가지로, 당 또는 장용성 작용제의 코팅은 투여 단위의 일부일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 제형은 또한 활성 제약 성분 및 미셀 에멀젼을 형성하는 지질의 에멀젼일 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 여부에 따라 및 치료되는 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 (a) 경구 (b) 예를 들어, 네불라이저에 의해서를 비롯한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 폐; 기관내, 비내, (c) 표피, 경피, 눈 및 질 및 직장 전달을 비롯한 점막으로를 비롯한 국소; 또는 (d) 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입을 비롯한 비경구; 또는 두개내, 예를 들어, 경막내, 뇌실내, 또는 심실내 투여일 수 있다. 한 실시양태에서, ASO-005459는 IV, IP, 경구로, 국소적으로 또는 볼루스 주사로서 투여되거나, 표적 기관에 직접적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, ASO-005459는 볼루스 주사로서 경막내 또는 뇌실내 투여된다.

국소 투여를 위한 제약 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 액적, 스프레이, 좌제, 액체, 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 제약 담체, 수성, 분말 또는 오일성 베이스, 증점제 등은 필요하거나 바람직할 수 있다. 국소 제형의 예로는 ASO-005459가 국소 전달제, 예컨대 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제, 및 계면활성제와 혼합된 것들을 들 수 있다. 경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 미세입자, 나노입자, 물 또는 비-수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사세, 정제, 또는 미니정제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비경구, 경막내, 뇌실내, 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제형은 또한 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 예컨대 침투 증진제, 담체 화합물, 및 다른 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 (그러나 이에 제한되지는 않음)를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 용액, 에멀젼, 및 리포솜-함유 제형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자기-유화 고체 및 자기-유화 반고체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. 표적 조직에의 약물의 전달은 양이온성 리포솜, 시클로덱스트린, 포르피린 유도체, 분지쇄 덴드리머, 폴리에틸렌이민 중합체, 나노입자 및 미소구를 포함하나 이에 제한되지는 않는 담체-매개된 전달에 의해 향상될 수 있다 (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27).

편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있는 본 개시내용의 제약 제형은 제약 산업에 널리 공지된 통상적인 기법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기법은 활성 성분을 제약 담체(들) 또는 부형제(들)와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하게 및 긴밀하게 회합시킨 후, 필요에 따라, 제품을 성형함으로써 제조된다.

비경구, 피하, 진피내 또는 국소 투여를 위해, 제형은 멸균 희석제, 완충제, 긴장성의 조절제 및 항박테리아제를 포함할 수 있다. 활성 ASO는 제어된 방출 특성을 갖는 삽입물 또는 미세캡슐을 비롯한, 신체로부터 분해 또는 즉각적인 제거에 대해 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 담체는 생리 염수 또는 포스페이트 완충 염수일 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 2007년 3월 22일에 공개된 국제 공개 제WO2007/031091 (A2)호는 또한 적합한 제약상 허용되는 희석제, 담체 및 아주반트를 제공한다.

IV. 진단

이 개시내용은 또한 SNCA 관련된 질환, 예를 들어, 시누클레인병증의 진단 동안 유용한 진단 방법을 제공한다. 시누클레인병증의 비-제한적 예로는 파킨슨병, 파킨슨병 치매 (PDD), 루이 소체를 갖는 치매, 및 다계통 위축증을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

ASO-005459는 개체로부터의 조직 또는 체액에서 SNCA 전사체의 발현을 측정하고, 측정된 발현 수준을 정상 조직 또는 체액에서의 표준 SNCA 전사체 발현 수준과 비교하는 데 사용될 수 있으며, 표준에 비해 발현 수준의 증가는 ASO-005459에 의해 치료가능한 장애를 지시한다.

ASO-005459는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 SNCA 전사체 수준을 검정하는 데 사용될 수 있다. (Touboul et al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38; Stowe et al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91).

"생물학적 샘플"이란 잠재적으로 SNCA 전사체를 발현하는 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 세포의 다른 공급원으로부터 얻어진 임의의 생물학적 샘플로 의도된다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

V. ASO를 포함하는 키트

이 개시내용은 또한 본원에 기재된 ASO-005459를 포함하고, 본원에 기재된 방법을 수행하는 데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 1개 이상의 용기에 적어도 ASO-005459를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지시, 및 결과의 분석 및 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어를 비롯한, 검출 검정을 수행하는 데 필요하고/거나 충분한 성분 모두를 함유한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 ASO-005459가 관련 기술분야에 널리 공지된 확립된 키트 형식 중 하나 내로 용이하게 혼입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.

VI. 사용 방법

ASO-005459는 치료 및 예방에 이용될 수 있다. SNCA는 시냅스 전달을 조절하는 데 있어서 역할을 하는 것으로 생각되는 시냅스전 말단에서의 뉴런에서 우선적으로 발현되는 140 아미노산 단백질이다. 이는 비폴딩된 단량체 및 α-나선의 안정한 사량체 둘 다로서 천연적으로 존재하는 것으로 제안되었으며, 몇몇 번역후 변형을 겪는 것으로 나타났다. 광범위하게 연구된 하나의 변형은 아미노산 세린 129 (S129)에서의 SNCA의 인산화이다. 통상적으로, 단지 작은 백분율의 SNCA는 S129에서 구성적으로 인산화되는 반면 (pS129), 병리학적 세포내 봉입체에서 발견되는 대다수의 SNCA는 pS129 SNCA이다. 이들 병리학적 봉입체는 미스폴딩된 SNCA 단백질의 응집된, 불용성 축적물로 이루어지며, 집합적으로 시누클레인병증 (또는 α-시누클레인병증)으로 공지된 신경퇴행성 질환의 군의 특징적인 특색이다.

시누클레인병증에서, SNCA는 파킨슨병 (PD), 파킨슨병 치매 (PDD), 및 루이 소체를 갖는 치매 (DLB) 모두의 특징인 루이 소체로 공지된 뉴런에서의 병리학적 응집체를 형성할 수 있다. 따라서, ASO-005459는 SNCA 병리학적 응집체의 수를 감소시키거나, SNCA 병리학적 응집체의 형성을 방지할 수 있다. 추가적으로, 아교세포 세포질 봉입체 (GCI)로 지칭되는 비정상적 SNCA-풍부 병변은 희소돌기아교세포에서 발견되며, 다계통 위축증 (MSA)으로 공지된 급속하게 진행하는 치명적인 시누클레인병증의 특징을 나타낸다. 일부 실시양태에서, ASO-005459는 GCI의 수를 감소시키거나, GCI의 형성을 방지한다. 희소돌기아교세포에서의 SNCA mRNA 발현의 비검출가능하거나 낮은 수준 중 어느 하나의 보고는 SNCA의 일부 병리학적 형태가 그것이 고도로 발현되는 뉴런으로부터 희소돌기아교세포로 전파됨을 시사한다. 특정 실시양태에서, ASO-005459는 뉴런으로부터의 SNCA, 예를 들어, SNCA의 병리학적 형태의 전파를 감소시키거나 방지한다.

ASO-005459는 연구에서, 예를 들어, 세포 및 실험 동물에서의 SNCA 단백질의 합성을 특이적으로 억제하고 (전형적으로 mRNA를 분해하거나 억제하고, 그에 의해 단백질 형성을 방지함으로써), 그에 의해 표적의 기능적 분석 또는 치료 개입을 위한 표적으로서의 그의 유용성의 평가를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 또한, 세포 또는 조직을 시험관내에서 또는 생체내에서 본 개시내용의 ASO-005459, 접합체, 또는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 또는 조직에서 SNCA mRNA 및/또는 SNCA 단백질의 발현을 하향-조절하는 방법이 제공된다.

치료를 위해, SNCA 전사체 및/또는 SNCA 단백질의 발현을 조정함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 동물 또는 인간은 이 개시내용에 따른 ASO-005459를 투여함으로써 치료된다. 또한, 본 개시내용의 ASO-005459 또는 조성물의 치료 또는 예방 유효량을 투여함으로써 SNCA 전사체 및/또는 SNCA 단백질의 발현과 연관된 질환 또는 상태를 갖거나 가질 경향이 있는 것으로 의심되는 포유동물을 치료하는, 예컨대 인간을 치료하는 방법이 제공된다. 본 개시내용에 따른 ASO, 접합체, 또는 제약 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ASO 또는 접합체는 요법에 사용된다.

본 개시내용은 또한 본원에 언급된 질환 중 1종 이상, 예컨대 파킨슨병, 파킨슨병 치매 (PDD), 루이 소체를 갖는 치매, 다계통 위축증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 ASO-005459를 제공한다.

본 개시내용은 또한 ASO, 접합체, 또는 그의 제약 조성물의 유효량을 α-시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 동물 (예컨대 α-시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 환자)에게 투여하는 것을 포함하는, α-시누클레인병증을 치료하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 질환, 장애, 또는 상태는 SNCA 유전자 전사체 및/또는 SNCA 단백질의 과발현과 연관된다.

본 개시내용은 또한 세포 또는 조직을 시험관내에서 또는 생체내에서 SNCA 유전자 전사체의 발현의 열화에 영향을 미치는 본 개시내용의 ASO, 접합체, 또는 그의 제약 조성물의 유효량과 접촉시킴으로써, SNCA 단백질을 감소시키는 것을 포함하는, 세포 또는 조직에서 SNCA 유전자 전사체 및/또는 SNCA 단백질의 발현을 억제하는 (예를 들어, 감소시킴으로써) 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, ASO-005459는 뇌의 1개 이상의 섹션, 예를 들어, 해마, 뇌간, 선조체, 또는 이들의 임의의 조합에서 SNCA mRNA의 발현을 감소시키는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, ASO-005459는 예를 들어, 뇌간 및/또는 선조체에서, SNCA mRNA의 발현을 제3일, 제5일, 제7일, 제10일, 제14일, 제15일, 제20일, 제21일, 또는 제25일에, 비히클 (ASO 없음)의 투여 또는 그에의 노출 후의 SNCA mRNA 발현에 비해 70％ 미만, 60％ 미만, 50％ 미만, 40％ 미만, 30％ 미만, 20％ 미만, 10％ 미만, 또는 5％ 미만 감소시킨다. 일부 실시양태에서, SNCA mRNA의 발현은 제28일, 제30일, 제32일, 제35일, 제40일, 제42일, 제45일, 제49일, 제50일, 제56일, 제60일, 제63일, 제70일, 또는 제75일까지, 비히클 (ASO 없음)의 투여 또는 그에의 노출 후의 SNCA mRNA 발현에 비해 70％ 미만, 60％ 미만, 50％ 미만, 40％ 미만, 30％ 미만, 20％ 미만, 10％ 미만, 또는 5％ 미만 유지된다.

다른 실시양태에서, ASO-005459는 연수, 꼬리 조가비핵, 교뇌, 소뇌, 요추 척수, 전두 피질, 및/또는 이들의 임의의 조합에서 SNCA mRNA 및/또는 SNCA 단백질 발현을 감소시킨다.

본 개시내용은 또한 의약의 제조를 위한 기재된 바와 같은 본 개시내용의 ASO-005459 또는 접합체의 용도를 제공한다. 본 개시내용은 또한 본원에 언급된 바와 같은 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 또는 본원에 언급된 바와 같은 장애로서의 치료의 방법을 위한 ASO-005459 또는 그의 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 요법에 사용하기 위한 ASO-005459 또는 접합체를 제공한다. 본 개시내용은 추가적으로 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 ASO-005459 또는 접합체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 세포에서 SNCA 단백질의 억제에 영향을 미치도록 본 개시내용에 따른 ASO-005459 또는 접합체를 세포에 투여하는 것을 포함하는, SNCA를 발현하고 있는 세포에서 SNCA 단백질을 억제하는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 본 개시내용에 따른 ASO-005459 또는 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 신경 과다흥분성의 감소, 개선, 예방, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경 과다흥분성을 감소시키거나, 개선시키거나, 예방하거나, 치료하는 방법을 포함한다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용에 따른 ASO-005459 또는 접합체 및/또는 본 개시내용에 따른 제약 조성물을 본원에 언급된 바와 같은 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에 언급된 바와 같은 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용에 따른 ASO-005459 및 다른 조성물은 SNCA 단백질의 돌연변이된 버전의 과발현 또는 발현과 연관된 상태의 치료에 사용될 수 있다.

본 개시내용은 예컨대 α-시누클레인병증의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 ASO-005459 또는 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, α-시누클레인병증은 파킨슨병, 파킨슨병 치매 (PDD), 루이 소체를 갖는 치매, 다계통 위축증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환이다.

본 개시내용은 또한 본원에 언급된 바와 같은 질환, 장애 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 ASO-005459의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, ASO-005459 또는 그의 접합체는 α-시누클레인병증, 발작 장애, 또는 이들의 조합의 치료를 위한 의약의 제조에 사용된다.

일반적으로 말하면, 본 개시내용의 한 측면은 본원에 기재된 바와 같은 ASO의 치료 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, SNCA의 비정상적 수준과 연관된 상태 (즉, α-시누클레인병증)를 앓고 있거나 그에 감수성인 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본원에 언급된 바와 같은 질환 또는 장애는 일부 실시양태에서, SNCA 유전자 또는 그의 단백질 생성물이 SNCA 단백질과 회합되거나 그와 상호작용하는 유전자에서의 돌연변이와 연관될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 표적 mRNA는 SNCA 서열의 돌연변이된 형태이다.

본 개시내용의 흥미로운 측면은 본원에 언급된 바와 같은 질환, 장애 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에서 정의된 바와 같은 ASO-005459 또는 본원에서 정의된 바와 같은 접합체의 용도에 관한 것이다.

본 개시내용의 방법은 SNCA 단백질의 비정상적 수준에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 또는 예방에 채용될 수 있다. 일부 실시양태에서, SNCA 단백질의 비정상적 수준에 의해 유발되는 질환은 α-시누클레인병증이다. 특정 실시양태에서, α-시누클레인병증은 파킨슨병, 파킨슨병 치매 (PDD), 루이 소체를 갖는 치매, 및 다계통 위축증을 포함한다.

대안적으로 말하면, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 더욱이 본 개시내용의 ASO-005459, 또는 접합체, 또는 본 개시내용의 제약 조성물을 SNCA 단백질의 비정상적 수준의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, SNCA 단백질의 비정상적 수준을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 개시내용은 또한 의약으로서 사용하기 위한 본원에서 정의된 바와 같은 ASO-005459, 조성물 또는 접합체에 관한 것이다.

본 개시내용은 또한 SNCA 단백질의 비정상적 수준 또는 SNCA 단백질의 돌연변이체 형태 (예컨대 대립유전자 변이체, 예컨대 본원에 언급된 질환 중 하나와 연관된 것들)의 발현의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본원에서 정의된 바와 같은 화합물, 조성물, 또는 접합체의 용도에 관한 것이다.

치료를 필요로 하는 환자는 질환 또는 장애를 앓고 있거나 앓을 가능성이 있는 환자이다.

본 개시내용의 실시는 달리 지시되지 않는다면, 관련 기술분야의 기술 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기법을 채용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)]; [D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II]; [Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 물리스 (Mullis) 등 미국 특허 제4,683,195호; 문헌 [Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization]; [Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation]; [Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)]; [Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)]; [Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155]; [Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)]; [Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV]; [Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)]; [Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2^nd Ed. CRC Press (2007)] 및 [Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]을 참조한다.

상기 인용된 모든 참고문헌, 뿐만 아니라 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

하기 실시예는 예시로 제공되며, 제한으로 제공되지 않는다.

실시예

실시예 1: ASO-005459의 구축

본원에 기재된 ASO (즉, ASO-005459)를 SNCA 프리-mRNA의 인트론 1 및 엑손 2 사이의 연접부 (즉, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 7,604 내지 7,620)를 표적화하도록 디자인하였다. ASO-005459는 갭머 (gapmer) (예를 들어, 교대 갭머)이도록 디자인되었으며, 잠금된 핵산 - LNA (대문자), 5' 말단 및 3' 말단에 베타-데옥시 LNA, 및 포스포로티오에이트 백본을 함유한다. 그러나, 백본은 다른 유형의 백본 (예를 들어, 포스포디에스테르 연결, 포스포트리에스테르 연결, 메틸포스포네이트 연결, 포스포르아미데이트 연결, 또는 이들의 조합)일 수 있다.

본 개시내용의 ASO를 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 합성하였다. 이러한 ASO를 제조하는 예시적인 방법은 문헌 [Barciszewski et al., Chapter 10 - " Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.

실시예 2. 1차 뉴런에서 SNCA 단백질의 감소를 측정하기 위한 고 함량 검정

ASO-005459를 1차 마우스 뉴런에서 SNCA 단백질 발현을 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 1차 뉴런 배양물을 마우스 SNCA 넉아웃 배경 상에 A53T 돌연변이를 갖는 전체 인간 SNCA 유전자를 운반하는 PAC-Tg(SNCA ^A53T)^+/+;SNCA ^-/- ("PAC-A53T") 마우스의 전뇌로부터 확립하였다. 문헌 [Kuo Y et al., Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010)]을 참조한다. 마우스가 관여하는 모든 절차는 브리스톨-마이어스 스퀴브 (Bristol-Myers Squibb) 동물 관리 및 사용 위원회 (Animal Care and Use Committee) (ACUC)에 의해 승인된 동물 시험 방법 (Animal Test Methods) (ATM)에 따라 수행하였다. 1차 뉴런을 제조업자의 프로토콜 (워싱톤 바이오케미칼 코포레이션 (Worthington Biochemical Corporation), LK0031050)에 따라 파파인 소화에 의해 생성하였다. 단리된 뉴런을 세척하고, B27 (지브코 (Gibco)), 1.25 μM 글루타맥스 (Glutamax) (지브코), 100 단위/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 및 25 μg/ml 암포테리신 (Amphotericin) B로 보충된 뉴로베이슬 (Neurobasal) 배지 (NBM, 인비트로젠 (Invitrogen))에 재현탁시켰다.

세포를 5,400 세포/cm²로 다중-웰 폴리 D-리신 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다 (예를 들어 384 웰 플레이트에서 25 μl NBM 중 6,000 세포/웰). ASO를 물에 희석하고, DIV01 (즉, 플레이팅 후 1일)에 세포에 첨가하였다. ASO를 배지에 2x 최종 농도로 첨가한 후, 수동으로 세포에 전달하였다. 대안적으로, 물 중 ASO를 랩사이트 (Labcyte) ECHO 음향 분배기를 사용하여 분배하였다. ECHO 분배를 위해, 물 중 250 nl의 ASO를 배지에서 세포에 첨가하고, 이어서 NBM의 새로운 분취액의 동등한 부피 분취액을 첨가하였다. 1차 스크리닝을 위해, ASO를 5 μM, 3.3 μM, 1 μM, 200 nM, 또는 40 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 효능 측정을 위해, ASO의 8 내지 10점 적정물을 0.75 mM 스톡으로부터 제조한 후, 2.7 내지 4000 nM 또는 4.5 내지 10,000 nM의 최종 농도 범위를 위해 배양된 세포에 전달하였다. ASO-000010 (TCTgtcttggctTTG, 서열식별번호: 5) 및 ASO-000838 (AGAaataagtggtAGT, 서열식별번호: 6) (5 μM)은 각각 튜불린 및 SNCA에 대한 참조 대조군 억제제로서 각각의 플레이트에 포함되었다. mRNA의 정상 상태 감소를 달성하기 위해 세포를 ASO와 함께 14일 동안 인큐베이션하였다.

14-일 인큐베이션 후, 세포를 웰 중 4％ 포름알데히드 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker)) 및 4％ 수크로스 (시그마 (Sigma))의 최종 농도로 고정제의 첨가에 의해 고정시켰다. 세포를 15분 동안 고정시킨 후, 고정제를 웰로부터 흡인하였다. 그 후, 세포를 0.3％ 트리톤 (Triton)-X 100 및 3％ 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 3％ 정상 염소 혈청을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 용액으로 20분 동안 투과화하였다. 그 후, 투과화 완충제를 웰로부터 흡인하고, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 그 후, 1차 항체를 0.1％ 트리톤 X-100 및 3％ BSA를 함유하는 PBS에 희석하였다. 1:1000의 토끼 항-SNCA (앱캠 (Abcam)) 및 1:500의 닭 항-튜불린 (앱캠)의 희석물을 사용하였다. 세포를 1차 항체와 함께 2시간 내지 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1차 항체 염색 용액을 흡인하고, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 3％ BSA를 갖는 0.1％ 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중 염소-항-닭 알렉사 (Alexa) 567 항체, 염소 항-토끼-알렉사 488 항체, 및 회히스트 (Hoechst) (10 μg/ml)의 1:500 희석물을 함유하는 2차 염색 용액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 2차 염색 용액을 웰로부터 흡인하고, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 세척한 후, 60 μl의 PBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 영상화까지 PBS에서 저장하였다.

영상화를 위해, 플레이트를 스폿 디텍터 바이오-어플리케이션 (Spot Detector bio-application) (셀로믹스 (Cellomics))을 사용하여 써모-피셔 (Thermo-Fisher) (셀로믹스) CX5 이미저 상에서 스캐닝하여 핵 (회히스트 염색, 채널 1), 튜불린 연장 (알렉사 567, 채널 2) 및 SNCA (알렉사 488, 채널 3)를 정량화하였다. 대상 카운트 (핵)를 모니터링하였지만, 데이터베이스에 공개하지는 않았다. 튜불린에 의해 커버된 총 면적을 특색 스폿토탈에어리어 (SpotTotalArea)Ch2로서 정량화하고, SNCA에 대한 염색의 총 강도를 스폿토탈인텐 (SpotTotalInten)Ch3으로서 정량화하였다. 튜불린 측정은 독성을 모니터링하기 위해 포함되었다. SNCA 단백질의 감소를 측정하기 위해, SNCA 강도 대 튜불린 염색 면적의 비를 계산하고, 결과를 전체로서 비히클 처리된 웰 및 각각 튜불린 또는 SNCA에 대한 최대로 억제된 웰로서 ASO-000010 또는 ASO-000838 웰의 중위값을 사용하여 ％ 억제 중위값으로서 정규화하였다.

실시예 3: 인간 뉴런에서 mRNA 감소를 측정하기 위한 콴티진^® 분석 (96-웰 검정)

인간 SNCA mRNA 및/또는 가능한 인간 오프 타겟 mRNA 종을 감소시키는 ASO-005459의 능력을 콴티진^® 분석에 의해 시험관내에서 측정하였다. 인간 뉴런 (셀룰러 다이나믹스 인크. (Cellular Dynamics Inc.), "아이뉴런 (iNeurons)")을 해동시키고, 플레이팅하고, 제조업자의 명세서에 따라 배양하였다. 이들 아이뉴런은 셀룰러 다이나믹의 등록상표의 분화 및 정제 프로토콜을 사용하여 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 인간 뉴런의 매우 순수한 집단이다.

용해: 세포를 웰 당 50,000 내지 100,000 세포로 (조사되는 오프 타겟의 발현에 따라) 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하고, B27, 글루타맥스, 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 뉴로베이슬 배지에서 유지하였다. ASO를 물에 희석하고, DIV01 (즉, 플레이팅 후 1일)에 세포에 첨가하였다. 단일 점 측정을 위해, 0.5 μM의 최종 ASO 농도를 전형적으로 사용하였다. IC₅₀ 측정을 위해, 뉴런을 IC₅₀을 정의하기 위해 5 μM로서의 최고 농도를 갖는 1:4의 7-점 농도 반응 희석으로 처리하였다. 그 후, 세포를 37℃ 및 5％ CO₂에서 6일 동안 인큐베이션하여 mRNA의 정상 상태 감소를 달성하였다.

인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 DPBS에서 1X 세척하고, 하기와 같이 용해시켰다. 용해물 전령 RNA의 측정을 특이적으로 디자인된 RNA 포획 프로브 세트에 의존하는 분지형 DNA-신호 증폭 방법을 사용하여 RNA를 정량하는 콴티진^® 2.0 리에이전트 시스템 (Reagent System) (아피메트릭스 (AFFYMETRIX)^®)을 사용하여 수행하였다. 작업 세포 용해 완충제 용액을 50 μl 프로테이나제 K를 5ml의 미리-가온된 (37℃) 용해 믹스에 첨가함으로써 제조하고, dH₂O에서 1:4 최종 희석으로 희석하였다. 작업 용해 완충제를 플레이트에 첨가하고 (100 내지 150 μl/ 웰, 조사되는 오프 타겟의 발현에 따라), 10회 분쇄하고, 밀봉하고, 55℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해 후, 웰을 10회 더 분쇄하고, 플레이트를 -80℃에서 저장하거나, 즉시 검정하였다.

검정: 사용되는 특이적 포획 프로브 (즉, SNCA, PROS1, 또는 튜불린)에 따라, 용해물을 용해 믹스에 희석하였다 (또는 희석하지 않았다). 그 후, 용해물을 포획 플레이트 (포획 프로브로 코팅된 96-웰 폴리스티렌 플레이트)에 80 μl/웰의 총 부피로 첨가하였다. 작업 프로브 세트 시약을 뉴클레아제-무함유수 (12.1 μl), 용해 혼합물 (6.6 μl), 차단 시약 (1 μl), 및 특이적 2.0 프로브 세트 (0.3 μl) (인간 SNCA 카탈로그 #SA-50528, 인간 PROS1 카탈로그 #SA-10542, 또는 인간 베타 3 튜불린 카탈로그 #SA-15628)를 제조업자의 지시서 (콴티진^® 2.0 아피메트릭스^®)에 따라 배합함으로써 생성하였다. 다음으로, 20 μl 작업 프로브 세트 시약을 포획 플레이트 상의 80 μl 용해물 희석물 (또는 배경 샘플에 대해 80 μl 용해 믹스)에 첨가하였다. 플레이트를 240g에서 20초 동안 원심분리한 후, 55℃에서 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하여 혼성화시켰다 (표적 RNA 포획).

표적 RNA의 신호 증폭 및 검출을 플레이트를 완충제로 3회 (300 μl/웰) 세척하여 임의의 비결합된 물질을 제거함으로써 시작하였다. 다음으로, 2.0 프리-앰플리파이어 (Pre-Amplifier) 혼성화 시약 (100 μl/웰)을 첨가하고, 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 흡인하고, 세척 완충제를 첨가하고, 3회 흡인하였다. 그 후, 2.0 앰플리파이어 (Amplifier) 혼성화 시약을 기재된 바와 같이 첨가하고 (100 μl/웰), 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 2.0 표지 프로브 (Label Probe) 혼성화 시약을 다음으로 첨가하고 (100 μl/웰), 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 플레이트를 다시 240g에서 20초 동안 원심분리하여 임의의 과량의 세척 완충제를 제거한 후, 2.0 기질 (Substrate)을 플레이트에 첨가하였다 (100 μl/웰). 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 퍼킨엘머 (PerkinElmer) 엔비전 (Envision) 다중표지 판독기 상에서 광도계 모드에서 15분 내에 영상화하였다.

데이터 측정: 관심의 유전자에 대해, 평균 검정 배경 신호를 각각의 기술적 반복실험의 평균 신호로부터 차감하였다. 그 후, 관심의 유전자에 대한 배경-차감된 평균 신호를 하우스키핑 튜불린 RNA에 대한 배경-차감된 평균 신호에 대해 정규화하였다. 처리된 샘플에 대한 퍼센트 억제를 대조군 처리된 샘플 용해물에 비해 계산하였다. ASO로 처리된 세포에 대한 콴티진^® 검정의 결과를 예를 들어, 도 3에 나타낸다.

실시예 4: 라모스 (Ramos) 세포에서 mRNA 감소를 측정하기 위한 콴티진^® 분석 (96-웰 검정)

가능한 인간 오프 타겟 IKZF3 (IKAROS 족 아연 핑거 3) mRNA 감소를 측정하기 위해, 라모스 세포 (인간 림프구 세포주)를 사용하였다. 라모스 세포는 SNCA를 발현하지 않기 때문에, 라모스 세포에서 발현되는 RB1 (RB 전사 공동억제자 1)을 ASO-매개된 넉다운 IKZF3 mRNA 발현을 평가하기 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. 인간 RB1 mRNA 발현에 결합하는 및 이를 넉다운시키는 2개의 ASO를 합성하였다. 베타-2 마이크로글로불린 (β2M)을 하우스키핑 유전자 대조군으로서 사용하였다. 라모스 세포를 FBS, 글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지 중 현탁액에서 성장시켰다.

용해: 세포를 웰 당 20,000개의 세포로 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 96 웰 플레이트 상에 플레이팅하고, B27, 글루타맥스 및 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 뉴로베이슬 배지에서 유지하였다. ASO를 물에 희석하고, 플레이팅 후 1일 (DIV01)에 1 μM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. ASO 처리 후, 세포를 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하여 mRNA의 정상 상태 감소를 달성하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 하기와 같이 용해시켰다. 용해물 전령 RNA의 측정을 특이적으로 디자인된 RNA 포획 프로브 세트에 의존하는 분지형 DNA-신호 증폭 방법을 사용하여 RNA를 정량하는 콴티진^® 2.0 리에이전트 시스템 (아피메트릭스^®)을 사용하여 수행하였다. 용해 믹스 (콴티진^® 2.0 아피메트릭스^®)를 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 미리-가온하였다. 현탁액에서 세포를 용해시키기 위해, 100 μl의 3X 용해 완충제 (10 μl/ml 프로테이나제 K를 가짐)를 현탁액 중 200 μl의 세포에 첨가하였다. 그 후, 세포를 10회 분쇄하여 용해시키고, 플레이트를 밀봉하고, 55℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 용해물을 -80℃에서 저장하거나, 즉시 검정하였다.

검정: 사용된 특이적 포획 프로브 (즉, IKZF3, RB1, 및 β2M)에 따라, 용해물을 용해 믹스에 희석하였다 (또는 희석하지 않았다). 그 후, 용해물을 포획 플레이트 (포획 프로브로 코팅된 96 웰 폴리스티렌 플레이트)에 80 μl/웰의 총 부피로 첨가하였다. 작업 프로브 세트 시약을 뉴클레아제-무함유수 12.1 μl, 용해 혼합물 6.6 μl, 차단 시약 1 μl, 특이적 2.0 프로브 세트 0.3 μl (인간 IKZF3 카탈로그 #SA-17027, 인간 RB1 카탈로그 #SA-10550, 또는 인간 베타-2 마이크로글로불린 카탈로그 #SA-10012)를 제조업자 지시서 (콴티진^® 2.0 아피메트릭스^®)에 따라 배합함으로써 생성하였다. 그 후, 20 μl 작업 프로브 세트 시약을 포획 플레이트 상의 80 μl 용해물 희석물 (또는 배경 샘플에 대해 80 μl 용해 믹스)에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 55℃에서 16 내지 20시간 동안 인큐베이션하여 혼성화시켰다 (표적 RNA 포획). 표적 RNA의 신호 증폭 및 검출을 플레이트를 완충제로 3회 세척하여 (300 μl/웰) 임의의 비결합된 물질을 제거함으로써 시작하였다. 다음으로, 2.0 프리-앰플리파이어 혼성화 시약 (100 μl/웰)을 첨가하고, 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 흡인하고, 세척 완충제를 첨가하고, 3회 흡인하였다. 그 후, 2.0 앰플리파이어 혼성화 시약을 기재된 바와 같이 첨가하고 (100 μl/웰), 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 2.0 표지 프로브 혼성화 시약을 다음으로 첨가하고 (100 μl/웰), 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 단계를 다시 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 플레이트를 다시 240g에서 20초 동안 원심분리하여 임의의 과량의 세척 완충제를 제거한 후, 2.0 기질을 플레이트에 첨가하였다 (100 μl/웰). 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 퍼킨엘머 엔비전 다중표지 판독기 상에서 광도계 모드에서 15분 내에 영상화하였다.

데이터 측정: 관심의 유전자에 대해, 평균 검정 배경 신호 (즉, 용해물 없음, 단지 1X 용해 완충제)를 각각의 기술적 반복실험의 평균 신호로부터 차감하였다. 그 후, 관심의 유전자에 대한 배경-차감된 평균 신호를 하우스키핑 mRNA (라모스 세포에 대해, 이는 베타-2-마이크로글로불린이었음)에 대한 배경-차감된 평균 신호에 대해 정규화하였다. 처리된 샘플에 대한 퍼센트 억제를 비처리된 샘플 용해물의 평균에 비해 계산하였다. ASO-005459로 처리된 세포에 대한 콴티진^® 검정의 결과를 표 4에 나타낸다.

실시예 5: SK-N-BE(2) 세포에서 SNCA mRNA의 감소를 측정하기 위한 qPCR 검정

SNCA를 표적화하는 ASO-005459를 ATCC로부터 획득한 인간 SK-N-BE(2) 신경모세포종 세포 (CRL-2271)에서 SNCA mRNA 발현을 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다.

SK-N-BE(2) 세포를 세포 배양 배지 (10％ 소 태아 혈청 [시그마, 카탈로그 번호 F7524], 1x 글루타맥스TM [시그마, 카탈로그 번호 3050-038] 1x MEM 비-필수 아미노산 용액 [시그마, 카탈로그 번호 M7145] 및 0.025 mg/ml 겐타마이신 [시그마, 카탈로그 번호 G1397]으로 보충된 MEM [시그마, 카탈로그 번호 M2279])에서 성장시켰다. 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS), [시그마 카탈로그 번호 14190-094]로 세척하고, 이어서 0.25％ 트립신-EDTA 용액 (시그마, T3924)을 첨가하고, 37℃에서 2 내지 3분 인큐베이션하고, 분쇄한 후 세포 시딩함으로써 5일마다 트립신처리하였다. 세포를 15 계대 이하 동안 배양에서 유지하였다.

실험 용도를 위해, 웰 당 12,500개의 세포를 100 μL 성장 배지 중 96 웰 플레이트 (눈크 (Nunc) 카탈로그 번호 167008)에서 시딩하였다. 올리고뉴클레오티드를 750 μM 스톡으로부터 제조하였다. PBS에 용해된 ASO를 세포를 단일 점 연구를 위해 25 μM의 최종 농도로 시딩한 후 대략 24시간에 첨가하였다. 세포를 임의의 배지 교환 없이 4일 동안 인큐베이션하였다. 효능 측정을 위해, 8 농도의 ASO를 16 내지 50,000 nM의 최종 농도 범위를 위해 제조하였다. ASO-004316 (CcAAAtcttataataACtAC, 서열식별번호: 7) 및 ASO-002816 (TTCctttacaccACAC, 서열식별번호: 8)이 대조군으로서 포함되었다.

인큐베이션 후, 세포를 배지의 제거, 이어서 125 μL 퓨어링크 (PURELINK)^® 프로 (Pro) 96 용해 완충제 (인비트로젠 12173.001A) 및 125 μL 70％ 에탄올의 첨가에 의해 수확하였다. RNA를 제조의 지시서에 따라 정제하고, 50 μL 물의 최종 부피에서 용리하여 10 내지 20 ng/μl의 RNA 농도를 발생시켰다. RNA를 1-단계 qPCR 반응 전에 물에 10배 희석하였다. 1-단계 qPCR 반응을 위해 qPCR-믹스 (콴타바이오 (QauntaBio)로부터의 큐스크립트 (qScript) TMXLE 1-단계 RT-qPCR 토우믹스 (TOUGHMIX)^® 로우 (Low) ROX, 카탈로그 번호 95134-500)를 2개의 택맨 (Taqman) 프로브와 10:1:1 (qPCR mix: 프로브1:프로브2) 비로 혼합하여 마스터믹스를 생성하였다. 택맨 프로브는 라이프테크놀로지스 (LifeTechnologies)로부터 획득하였다: SNCA: Hs01103383_m1; PROS1: Hs00165590_m1: TBP: 4325803; GAPDH 4325792. 그 후, 마스터믹스 (6 μL) 및 RNA (4 μL, 1 내지 2 ng/μL)를 qPCR 플레이트 (마이크로앰프 (MICROAMP)^® 광학 384 웰, 4309849)에서 혼합하였다. 밀봉 후, 플레이트를 실온에서 1분 동안 신속한 스핀, 1000g를 제공하고, ViiaTM 7 시스템 (어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems), 써모 (Thermo))에 옮기고, 하기 PCR 조건을 사용하였다: 15분 동안 50℃; 3분 동안 95℃; 5초 동안 95℃, 이어서 1.6℃/초의 온도 감소, 이어서 45초 동안 60℃의 40 사이클. 데이터를 콴트스튜디오 (QuantStudio)TM 실시간 PCR 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

실시예 6: 인간 SNCA mRNA의 감소에 대한 ASO-005459의 시험관내 분석

마우스 뉴런에서의 ASO-005459의 효능

실시예 2에서 상기 기재된 방법을 사용하여, ASO-005459를 SNCA mRNA의 감소의 하류 결과로서 SNCA 단백질 발현을 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 간략하게, PAC-A53T 마우스로부터 유래된 1차 뉴런을 ASO-005459 또는 대조군 ASO로 14일 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 고정시키고, SNCA 단백질 및 튜불린 단백질의 수준을 고 함량 영상화에 의해 측정하였다. 튜불린 수준을 측정하여 독성을 모니터링하고, SNCA 단백질 감소를 정규화하였다.

하기 표 1에 나타난 바와 같이, 4 nM의 ASO-005459와의 세포의 인큐베이션은 SNCA 단백질 발현의 21％ 감소를 발생시켰다. 40 nM 및 5 μM의 ASO-005459로, SNCA 단백질 발현은 각각 84％ 및 86％ 감소되었다. 대조적으로, ASO-005459는 튜불린 단백질 발현의 수준에 대한 최소 효과 내지 효과를 갖지 않았다.

<표 1> A53T-PAC 뉴런에서의 ASO-005459 활성

SD = 표준 편차

N = 시험의 횟수

효능을 추가로 평가하기 위해, A53T-PAC 뉴런을 실시예 2A에서 상기 기재된 바와 같이 ASO-005459의 10-점 적정으로 처리하고, SNCA 및 튜불린 단백질에 대한 효과에 대한 IC₅₀을 결정하였다. 도 2a 및 2b, 및 표 2 (하기)에 나타난 바와 같이, α-Syn/튜불린 비의 농도-의존적 감소가 7.4 nM의 평균 IC₅₀으로 관찰되었다. 이 관찰은 표 1 (상기)에 나타내어진 단일 점 활성 데이터와 일치하였다. 더욱이, ASO-005459는 튜불린 수준에 대한 무시가능한 효과를 생성하였다. 함께 취해져 이들 결과는 ASO-005459가 전체 세포 생존력에 대한 최소 효과로 SNCA 단백질 수준을 강력하게 감소시킴을 지시한다.

<표 2> A53T-PAC 뉴런에서의 SNCA 및 튜불린 단백질에 대한 ASO-005459에 대한 효능 및 선택성 추정치

SD = 표준 편차

N = 시험의 횟수

SK-N-BE(2) 세포에서의 ASO-005459의 효력

실시예 5에 기재된 방법을 사용하여, ASO-005459를 4일 처리 후에 SK-N-BE(2)에서 SNCA mRNA를 감소시키는 그의 능력에 대해 시험하였다.

25 μM ASO-005459와의 세포의 인큐베이션은 SK-N-BE(2) 세포에서 SNCA mRNA의 92％ 감소를 발생시켰다.

인간 뉴런에서의 ASO-005459의 효능

SNCA에 대한 ASO-005459 효능을 실시예 3에서 상기 기재된 바와 같이 1차 인간 뉴런을 사용하여 확인하였다. 간략하게, 인간 뉴런은 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포로부터 유래되었다. 세포를 ASO-005459 또는 대조군 ASO로 6일 동안 처리한 후, mRNA 수준을 콴티진^® 검정에 의해 측정하였다. 인간 뉴런은 또한 ASO-005459에 대한 잠재적 오프-타겟인 PROS1을 발현하기 때문에, PROS1 mRNA 수준을 또한 측정하여 오프-타겟 유전자에 대한 ASO-005459의 효과를 평가하였다. 또한, 튜불린 (TUBB) mRNA를 측정하여 독성을 모니터링하였다.

도 3 및 표 3 (하기)에 나타난 바와 같이, ASO-005459는 100 nM의 평균 IC₅₀으로, 인간 뉴런에서 발현된 SNCA의 농도-의존적 감소를 유도하였다. 이 IC₅₀은 PAC-A53T 뉴런에서 SNCA 단백질을 감소시키기 위한 IC₅₀보다 약 13배 더 약하다 (표 2, 상기). 이 효능 이동에 대한 이유는 명확하지 않지만, ASO 흡수, 대사, 또는 SNCA 넉-다운의 동역학의 차이에 기인할 수 있다. ASO-005459는 또한 인간 뉴런에서 PROS1 mRNA의 농도-의존적 감소를 나타낸 반면; IC₅₀은 SNCA에 대한 IC₅₀보다 30 내지 50배 더 약하였다. 이들 결과는 인간 뉴런에서 SNCA에 대한 ASO-005459 활성을 확인시켜 주며, ASO-005459가 PROS1에 비해 SNCA에 대해 30 내지 50배 더 선택적임을 지시한다.

<표 3> 인간 뉴런에서의 SNCA 및 PROS1 mRNA에 대한 ASO-005459의 효능 및 선택성

뱃치 = 사용된 ASO-005459의 특정 로트-번호

라모스 세포에서의 ASO-005459의 효능

IKZF3은 ASO-005459에 대한 또다른 잠재적 오프-타겟이지만, PROS1과는 달리, 이는 인간 뉴런에서 발현되지 않는다. 대신, IKZF3은 인간 림프구 세포주인 라모스 세포에서 왕성하게 발현된다. 라모스 세포를 1 μM ASO-005459로 처리하고, IKZF3 mRNA 발현에 대한 효과를 측정하였다. 독성을 모니터링하기 위해, 베타-2 마이크로글로불린 mRNA를 또한 측정하였다. 라모스 세포는 SNCA를 발현하지 않기 때문에, 또다른 유전자, RB1 (RB 전사 공동억제자 1)을 ASO-매개된 넉다운을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. ASO-006754 (GGTgaggtttggtaGA, 서열식별번호: 9) 및 ASO-006755 (GGTgaggtttggtagaAG, 서열식별번호: 10)는 RB1을 표적화하고, 연구에 포함되었다. 표 4 (하기)에 나타난 바와 같이, 1 μM 농도에서, ASO-005459는 IKZF3 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며, 이는 SNCA에 대한 ASO-005459의 특이성을 입증한다. ASO-005459는 또한 RB1 및 β2M mRNA의 발현에 영향을 미치지 않았으며, 이는 ASO-005459가 라모스 세포에 독성이 아님을 지시한다. 대조적으로, ASO-006754 및 ASO-006755 (대조군 ASO)는 RB1 수준을 각각 87％ 및 83％ 감소시켰으며, 이는 라모스 세포에서의 ASO 활성을 확인시켜 준다.

<표 4> 라모스 세포에서의 IKZF3에 대한 1 μM ASO-005459의 효과

뱃치 = 사용된 ASO의 특정 로트-번호

집합적으로, 여기에 제시된 결과는 ASO-005459가 SNCA mRNA를 감소시키기 위해 강력하고 매우 선택적이며, 이는 다시 SNCA 단백질 수준의 감소를 매개함을 입증한다. 결과는 또한 ASO-005459가 마우스 및 인간 뉴런 둘 다에서 양호하게 내성화됨을 나타낸다. 이들 결과는 시누클레인병증의 치료를 위한 질환-변형 치료제로서의 ASO-005459의 계속된 개발을 뒷받침한다.

실시예 7: 생체내 내약성 및 생체내 SNCA mRNA 감소

ASO가 상이한 동물 모델 (즉, 마우스 및 시노몰거스 원숭이) 내로 주사되는 경우 얼마나 내성화되는 지를 알기 위해 본 개시내용의 ASO의 생체내 내약성을 시험하였다.

마우스

대상체: 마우스 SNCA 넉아웃 배경 상에 A53T 돌연변이를 갖는 전체 인간 SNCA 유전자를 운반하는 수컷 및 암컷 (2 내지 3월령) PAC-Tg(SNCA ^A53T)^+/+;SNCA ^-/- ("PAC-A53T") 마우스를 급성, 장기, 및 PK/PD 생체내 효력 연구에 사용하였다. 일부의 경우, 야생형 (WT) C57B/6 마우스를 장기 (즉, 4주) 건강 평가에 사용하였다. 마우스를 무제한 이용가능한 음식 및 물을 갖는 온도 제어된 하우징 룸에서 4 또는 5개의 군에서 하우징하였다. 마우스가 관여하는 모든 절차는 브리스톨-마이어스 스퀴브 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)에 의해 승인된 동물 시험 방법 (ATM)에 따라 수행되었다.

ASO 투여 용액 제조: 0.2 μm 와트만 (Whatman) 필터 및 뉴클레아제 무함유 원심분리 튜브를 갖춘 멸균 염수 (1 mL) 시린지를 사용하여 투여 용액을 제조하였다. 지시된 부피의 물 또는 염수를 ASO 분말에 첨가하고, 볼텍싱하여 (약 1분) ASO 분말을 용해시켰다. 그 후, 용액을 10분 동안 정치하고, 다시 약 1분 동안 볼텍싱하였다. 튜브를 간단하게 원심분리하여 모든 액체를 튜브의 바닥으로 복귀시킨 후, 용액을 0.2 μm 멸균 필터를 통해 제2 RN아제 무함유 튜브 내로 여과하였다. 1차 스톡의 작은 분취액을 나노드롭 (Nanodrop)을 사용한 농도의 분석을 위해 1 mg/ml로 희석하였다. 분석 샘플을 수동 반전으로 3회 볼텍싱하여 철저하게 혼합하였다. 그 후, 샘플의 UV 흡광도를 나노드롭으로 260 nm에서 2회 측정하였다 (받침대를 세정하고, 샘플을 적용하기 전에 3회 닦았음). 시험 샘플을 분석이 완결되면 버렸다. 샘플은 UV 흡광도가 샘플의 90 내지 110％인 경우 투여를 위해 준비된 것으로 간주되었다. UV 흡광도가 샘플의 110％를 초과한 경우, 2차 희석물을 제조하였고; 흡광도가 90％ 미만인 경우, 샘플을 보다 높은 초기 농도에서 제조하고, 유사한 단계를 상기 기재된 바와 같이 따랐다. 샘플을 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.

프리핸드 뇌실내 (ICV) 주사: ICV 주사를 헤일리 및 맥코믹 (Haley and McCormick)의 방법에 따라 27 또는 30-게이지 바늘을 갖춘 해밀톤 (Hamilton) 마이크로 시린지를 사용하여 수행하였다. 바늘은 뇌 내로의 그의 관통을 제한하기 위해 팁으로부터 2.5 내지 3 mm에 폴리에틸렌 가드를 구비하였다. 마우스를 이소플루란 마취제 (1 내지 4％)를 사용하여 마취시켰다. 충분히 마취되면, 마우스를 한 손의 엄지손가락 및 첫번째 손가락으로 목의 뒤에서 느슨한 피부에 의해 잡았다. 부드럽지만 단단한 압력을 가하면서, 동물의 머리를 그 후 딱딱한 평평한 수준 표면에 대해 가압함으로써 부동화시켰다. 투여를 27 ½ g 바늘을 갖춘 10 μL 해밀톤 시린지를 사용하여 수행하였다. 그 후, 바늘 팁을 정수리점에 대해 약 1 mm 측면 및 1 mm 꼬리 (즉, 중간선의 우측, 눈 선으로부터 측정된 바와 같은 약 3mm 뒤)의 두피 및 두개골을 통해 삽입하였다. 바늘이 위치되면, ASO를 염수 비히클 중 5 μl의 부피로 제공하고, 약 30초에 걸쳐 주사하였다. 바늘을 5 내지 10초 동안 그 자리에 방치한 후, 제거하였다. 마우스를 그들의 홈 케이지로 복귀시키고, 약 2 내지 4분 동안 회복시켰다. 마우스를 투여 직후 30분 동안 계속적으로 약물 및/또는 투여의 유해 행동 효과에 대해 관찰하였다. 이 시간 동안, 3회 초과의 별개의 횟수로 경련한 임의의 마우스를 즉시 안락사시키고, 20의 자동 점수를 제공하였다. 약물 내약성을 투여 후 1시간 ± 15분에 점수화하였다. 비-내성화된 화합물로 투여된 동물 (내약성 점수 > 4)을 1시간 평가 후 즉시 안락사시켰다.

ASO 내약성 평가: ASO로 투여된 동물을 투여 직후 평가하고, 임의의 유해 효과에 대해 2시간 동안 모니터링하였다. 급성 내약성 (AT) 연구를 위해, 마우스를 투여 시에 및 테이크다운, 즉, ASO 주사 후 3일에 다시 평가하였다. 장기 건강 평가를 위해, 마우스를 매주 칭량하고, 실험의 완결까지 임의의 건강 및 행동 문제에 대해 모니터링하였다. 그들의 초기 체중의 15％ 초과의 체중 감소를 갖거나 내약성 문제를 나타낸 마우스를 연구로부터 제거하고, 안락사시켰다. 건강 및 내약성 평가를 하기 차트에 따라 수행하였다:

<표 5> 내약성 점수화 시스템^a

^a 정상은 "0"으로 점수화된다. 동물을 투여 후 연속적 시점에서 개체 기준으로 점수화한다. 관찰은 1시간 ± 15분, 그 후 24시간 ± 2시간, 그 후 7일 (적절할 경우)에서 평가한다. 경련은 이들이 관찰 창 전에 일어난 경우라도, 1시간 시점에 대해 카운팅한다. 총 내약성 점수는 개별적 범주 점수의 합계에 기초하여 계산하며, 최대 가능한 점수는 20이다.

조직 수집: 최종 행동 및 건강 평가 후, 마우스를 단두대 상에서 참수하고, 뇌를 재빨리 제거하였다. 각각의 뇌를 2개의 반구로 분할하고, a) 해마를 3-일 급성 내약성 연구에서 mRNA 측정을 위해 절개하고; b) 하나의 반구로부터의 해마, 뇌간, 및 선조체를 mRNA 측정을 위해 절개한 반면, 동일한 영역을 용량-반응 시간 과정 PK/PD 연구에서 단백질/PK 측정을 위해 제2 반구로부터 절개하였다.

연구의 일부에서, 혈액 및 뇌척수액 (CSF)을 또한 PK (혈액) 및 PK/단백질 (CSF) 측정을 위해 수집하였다. 혈액 및 CSF를 수집하기 위해, 마우스를 이소플루란 (4％)으로 깊게 마취시켰다. 혈액을 23G 바늘을 사용하여 심장 천공을 통해 수집하였다. 제거되면, 혈액을 2 ml BD 마이크로테이너 (Microtainer) (K2EDTA BD #365974) 튜브 내로 옮기고, 프로세싱할 때까지 얼음 상에 정치하였다. 혈액을 프로세싱하기 위해, 튜브를 4500xg에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 그 후, 혈장을 제거하고, 0.5 ml 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브 내로 정치하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. CSF를 수집하기 위해, 흉강을 개방하여 심장을 노출시키고, 최대한의 혈액을 배수하여 CSF의 오염을 회피하였다. CSF 샘플을 마이크로피펫을 사용하여 소뇌숨뇌수조를 통해 수집하고, 로-바인드 단백질 에펜도르프 튜브 내로 정치하였다. 그 후, 튜브를 4500xg에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. CSF를 깨끗한 로-바인드 0.5ml 에펜도르프 튜브로 주의깊게 옮기고, 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

시노몰거스 데이터

대상체: 연구의 시작 시에 중량이 3.5 내지 10.0 kg인 수컷 시노몰거스 원숭이를 사용하였다. 각각을 L3 또는 L4 추골에서 들어가는 경막내 뇌척수액 (CSF) 카테터로 삽입하였다. 폴리우레탄 카테터의 원위 팁은 경막내 공간 내에서 대략 L1 추골로 연장되었다. 근위 말단을 동물의 하부 등 상에 위치한 피하 접근 포트에 연결하였다. 동물을 연구의 시작 전 적어도 2주 동안 치유되게 하였다. 실험실 동물 관리는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 공중 보건국 정책 (Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals) 및 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 지침 (Guide for the Care and use of Laboratory Animals) NRC (2011) (National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health). National Academies Press (US), Washington (DC))에 따랐다. 프로토콜은 브리스톨-마이어스 스퀴브 컴퍼니의 월링포드 동물 관리 및 사용 위원회 (Wallingford Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.

CSF 및 혈액 샘플링: CSF 포트를 무균 기법을 사용하여 피하로 접근시키고, CSF를 영장류 구속 의자에 똑바로 앉아 있는 깨어 있는 동물로부터 샘플링하였다. 대략 0.1 ml의 CSF를 수집의 시작 시에 버려 카테터 및 포트에서 죽은 공간을 청소하였다. CSF를 중력 유동에 의해 샘플 당 최대 0.5 ml CSF로 수집하였다. CSF를 2,000 g에서 4℃에서 10분 동안 회전시켰다. 상청액을 드라이 아이스 상에서 또는 액체 질소에서 동결시키고, 분석될 때까지 -90℃에서 보관하였다.

혈액을 이용가능한 정맥, 전형적으로 복재 정맥으로부터 샘플링하였다. 혈액 샘플을 해당 특정 측정에 따라 다수의 절차로 제조하였다. 혈장에 대해, 혈액을 EDTA-처리된 튜브 내로 수집하였다. 혈청에 대해, 혈액을 혈청-분리기 튜브 내로 수집하고, 원심분리 전 적어도 30분 동안 응고되게 하였다. 응고 및 응고 인자의 측정을 위해, 혈액을 시트레이트화 튜브 내로 수집하고, RNA의 분석을 위해, 혈액을 RNA 레이터 (RNA later)를 함유하는 튜브 내로 수집하였다. 프로세싱 후, 샘플을 드라이 아이스 상에서 또는 액체 질소에서 동결시키고, 분석될 때까지 동결하여 보관하였다.

경막내 투여: 동물을 깨어 있는 동안 및 변형된 시판되는 구속 의자를 사용하여 투여되도록 훈련시키고, 동물을 복와위로 유지하였다. SNCA-표적화된 안티-센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 염수에 용해시키고, 여과에 의해 멸균하고, 0.33 ml/분으로 1.0 ml 부피에서, 이어서 0.5 ml 멸균수 플러시를 투여하였다. 총 주입 시간은 4.5분이었다. 동물은 주입 후 30분 동안 복와위로 남아 있었다.

부검: 시노몰거스 원숭이를 케타민 및/또는 이소플루란으로 마취하면서 적절한 부피의 시판되는 안락사 용액을 투여하였다. 부검 조직을 그 후 바로 얻고, 뇌를 절개를 위해 웨트 아이스에 옮겼다. 관심의 영역을 ASI 시노 브레인 매트릭스 (ASI Cyno Brain Matrix)에서 4 내지 6mm 슬라이스 뿐만 아니라 프리 핸디드 기법을 사용하여 절개하였다. 샘플을 RNA레이터^®에서 신선하게 정치하거나, 나중의 분석을 위해 드라이 아이스 상에서 동결시켰다. CNS 조직을 시노몰거스 원숭이로부터 급속하게 절개하고, 임의의 축 상의 4 mm 이하의 조각을 수집하고, 5mL의 RNA 레이터에 정치하였다. 샘플을 4℃에서 밤새 저장한 후, 분석될 때까지 저장을 위해 -20℃로 옮겼다.

분석된 뇌 영역은 연수, 교뇌, 중뇌, 소뇌, 꼬리-조가비핵 (좌측 및 우측), 해마 (좌측 및 우측), 전두 피질 (좌측 및 우측), 관자 피질 (좌측 및 우측), 두정 피질 (좌측 및 우측), 후두 피질 (좌측 및 우측) 및 피질 백색 물질을 포함하였다. 추가적으로, 척수를 경부, 흉부 및 요부 영역에서 샘플링하였다. 샘플을 또한 간, 신장 및 심장으로부터 수집하였다. 일부의 경우, 삼차 핵, 정강 신경 및 대동맥의 샘플을 그들 영역에서 오프-타겟 약리학을 조사하기 위해 수집하였다.

마우스 또는 원숭이 조직, 혈장, 및 CSF에서의 ASO 농도의 ELISA 정량:

조직을 혈장 및 물로 1:1 비로 균질화하였다. 표준 곡선을 혈장에서 (혈장 및 CSF를 위해) 및 혈장:물에서 (조직 샘플을 위해) 5000 내지 4.9 nM의 2배 계열 희석에 의해 생성한 후, 5X SSCT (750 mM NaCl, 및 75 mM 시트르산나트륨, pH 7.0, 0.05 ％ (v/v) 트윈 (Tween)-20을 함유함) 단독으로 및 35 nM 포획 및 35 nM 검출 시약을 함유하는 5X SSCT에서 총 5000배로 추가로 희석하여 1 내지 1000 pM의 표준 범위를 얻었다. 사용된 희석 인자는 예상된 샘플 농도 범위에 따라 다양하였다. 포획 프로브는 3' 비오틴 (엑시콘 (Exiqon))을 갖는 AAAGGAA이고, 검출 프로브는 5' DigN-이소프로필 18 링커--GTGTGGT (엑시콘)였다.

실험 샘플 및 표준물을 포획 및 검출 완충제로의 희석 전에 및 ELISA 플레이트에 옮기기 전에 정화 용해 완충제 (페노메넥스 (Phenomenex), 카탈로그#AL0-8579)에 1:1 비로 첨가하였다. CSF 샘플을 용해 완충제의 첨가 전에 혈장으로 희석하였다 (2배). 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 (써모 15119)를 5X SSCT 완충제로 3회 세척하였다. 100 μl 샘플을 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 0.05％ 트윈-20을 함유하는 PBS에 1:4000 희석된 검출 프로브, 100 μl 항-Dig-AP Fab 단편 (로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science), 카탈로그 번호 11 093 274 910)을 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 2X SSCT 완충제로 세척한 후, 100 μl 트로픽스 CDP-스타 사파이어 II (Tropix CDP-star Sapphire II) 기질 (어플라이드 바이오시스템스)을 실온에서 30분 동안 첨가하였다. ASO 농도를 발광에 의해 측정하였다 (인스파이어 (Enspire)-퍼킨엘머).

알파-시누클레인 단백질 측정:

뇌 조직 샘플을 10 ml/g 조직으로 RIPA 완충제 (50 mM 트리스 HCl, 150 mM NaCl, 1％ NP-40, 0.5％ 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1％ 나트륨 도데실 술페이트)에서 비드 균질화기 퀴아젠 (Qiagen) 티슈라이저 (Tissuelyser) II를 사용하여 25 사이클/초 동안, 5 mm 스테인리스 스틸 비드로 총 2분 동안 균질화하였다. 균질화된 샘플을 얼음 상에서 30분 인큐베이션하였다. 각각의 샘플의 50 μL 분취액을 PK 분석을 위해 보유하였다. 나머지 샘플을 20,800g에서, 60분 동안, 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 보유하고, 분석에 사용하였다. 총 단백질을 피어스 (Pierce) BCA 단백질 검정 키트 (23227)를 사용하여 측정하였다.

뇌 조직 추출물: SNCA 단백질을 MJFR1+4B12 ELISA를 사용하여 측정하였다. 간략하게, ELISA 플레이트 (코스타 (Costar))를 BupH 카르보네이트-비카르보네이트 완충제, pH 9.4 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))에 희석된 0.1 μg/ml의 농도의 항-SNCA 항체 MJFR1 (앱캠) 100 μl로 4℃에서 밤새 (O/N) 코팅하였다. 다음 날 플레이트를 둘베코 (Dulbecco) PBS (라이프 테크놀로지스)로 4회 세척하고, PBS 중 3％ BSA (소 혈청 알부민, 프로테아제 무함유, 프랙션 V (Fraction V), 로슈 디아그노스틱 (Roche Diagnostic))로 실온 (RT)에서 2 내지 3시간 동안 또는 4℃에서 밤새 차단하였다. 표준물 및 뇌 샘플 둘 다를 로슈 프로테아제 억제제 (로슈 11836145001, 1 펠릿/25 ml) 및 포스파타제 억제제 2&3 (시그마, 1:100)을 함유하는 1％ BSA/0.05％ 트윈/PBS로 희석하였다. SNCA 야생형 (알펩티드 (rPeptide))을 표준물로서 사용하였다. 샘플을 중복으로 로딩하고 (50 μl/웰), 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 실온으로 평형화시키고, 50 μl의 검출 항체 4B12 (바이오레전드 (Biolegend)) (1％ BSA/0.1％ 트윈/DPBS에 1:4000 희석됨)를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 약 2시간 동안 샘플과 공동-인큐베이션하였다. 검출 항체를 알칼리성 포스파타제 (노부스 바이올로지칼스 (Novus Biologicals)로부터의 AP 키트)로 사전-접합시켰다. 그 후, 플레이트를 0.05％ 트윈/PBS로 4회 세척하고, 100 μl의 알칼리성 포스파타제 기질 (사파이어 II를 갖는 사용 준비된 트로픽스 CDP 스타, T-2214, 라이프 테크놀로지스)로 30분 동안 전개시켰다. 발광 카운트를 퍼킨 엘머 엔비전 (2102 다중표지 판독기)으로 측정하였다. 플레이트를 검정 동안 일정하게 진탕하면서 유지하였다 (역가 플레이트 진탕기, 속도 3). 데이터를 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism)을 사용하여 분석하였다. 뇌 조직에서의 총 단백질을 마이크로 단백질 검정 키트 (써모피셔 (Thermofisher) #23235)를 제조업자의 지시서에 따라 사용하여 측정하였다.

뇌척수액 (CSF): SNCA 단백질을 U-PLEX 인간 SNCA 키트: (카탈로그# K151WKK-2, 메소 스케일 디스커버리 (Meso Scale Discovery))를 제조업자의 지시서에 따라 사용하여 측정하였다. CSF 샘플을 10배 희석하였다. 헤모글로빈을 CSF 샘플에서 앱캠 마우스 헤모글로빈 ELISA 키트 (ab157715)를 사용하여 측정하였다. CSF 샘플을 헤모글로빈 측정을 위해 40배 희석하였다.

qRT-PCR에 의한 mRNA 측정

뇌 영역을 수확하고, RNA-레이터, RNA 안정화 용액으로 사전 충전된 1.5 ml RNA-레이터 조직 보호 튜브 (퀴아젠 카탈로그#76514)에 정치하였다. RNA-레이터 용액 중 조직을 4℃에서 1개월 동안, 또는 -20℃ 또는 -80℃에서 무기한으로 저장할 수 있다.

RNA 단리: RN이지 플러스 미니 키트 (RNeasy Plus Mini Kit): 마우스 해마 및 피질로부터의 RNA를 RN이지 플러스 미니 키트 (퀴아젠 카탈로그#74134)를 사용하여 단리하였다. 조직 샘플을 10 μl/ml의 2-머캅토에탄올 및 0.5％ 리에이전트 Dx (Reagent Dx)를 함유하는 600 μL 또는 1200 μL RLT 플러스 완충제의 부피에서 균질화시켰다. 조직 샘플이 20 mg 미만인 경우 600 μL 용해 완충제를 사용하고, 20 mg 초과의 조직 샘플에 대해 1200 μl 용해 완충제를 사용하였다. 균질화를 위해, 조직 샘플을 600 μL RLT 플러스 완충제 (더하기 10 ul/ml의 2-머캅토에탄올 및 0.5％ 리에이전트 Dx)를 함유하는 2.0 mL 둥근-바닥 에펜도르프 세이프-락 (Safe-Lock) 튜브 (에펜도르프 카탈로그#022600044)에 옮기고, 5 mm 스테인리스 스틸 비드 (퀴아젠 카탈로그#69989) 샘플을 퀴아젠의 티슈라이저 II 기기를 사용하여 균질화하였다. 샘플을 20Hz에서 2.0분 동안 프로세싱하고, 샘플을 180° 회전시키고, 20Hz에서 추가의 2.0분 동안 프로세싱하였다. 그 후, 샘플을 30Hz에서 2.0분 동안 프로세싱하고, 샘플을 180° 회전시키고, 30Hz에서 추가의 2.0분 동안 프로세싱하였다. 프로세싱이 완전하지 않은 경우 보다 긴 및/또는 보다 높은 빈도의 균질화를 사용하였다. 그 후, 600 μL의 조직 용해물을 2.0 mL 수집 튜브 중 gDNA 엘리미네이터 (Eliminator) 스핀 컬럼 내로 옮기고, 샘플을 10,000g에서 30초 동안 원심분리하였다. 모든 원심분리 단계를 실온에서 수행하였다. 통과액을 수집하고, 동등한 부피의 70％ 에탄올을 첨가하고, 혼합하였다. 600 μL를 2.0 mL 수집 튜브에 정치된 RN이지 스핀 컬럼에 옮기고, 샘플을 10,000g에서 15초 동안 원심분리하였다. 통과액을 버리고, 잔류의 600 μL 샘플을 스핀 컬럼에 첨가하였다. 스핀 컬럼을 원심분리하고, 통과액을 버렸다. 컬럼을 700 μL의 세척 완충제 RW1로 세척하고, 10,000g에서 15초 동안 원심분리하고, 통과액을 버렸다. 그 후, 컬럼을 키트 프로토콜에 기재된 바와 같이 4 부피의 에탄올을 함유하는 500 μL의 완충제 RPE로 2회 세척하였다. 컬럼을 먼저 제1 세척을 위해 10,000g에서 15초 동안, 그 후 제2 세척을 위해 10,000g에서 2.0분 동안 원심분리하였다. 제2 세척 후, 컬럼을 10,000g에서 1.0분 동안 1회 원심분리하여 막을 건조시켰다. 그 후, 컬럼을 새로운 1.5 mL 수집 튜브에 옮기고, 30 μL의 RN아제-무함유수를 막의 중심에 직접적으로 첨가하였다. 막을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 컬럼을 10,000g에서 1.0분 동안 원심분리하여 RNA를 용리하였다. RNA를 함유하는 용리액을 수집하고, RNA 농도를 나노드롭 분광광도계 (써모)를 사용하여 UV 흡광도에 의해 결정할 수 있을 때까지 얼음 상에서 저장하였다. RNA 샘플을 -80℃에서 저장하였다.

RNA 단리: RN이지^® 플러스 유니버셜 미니 키트 (Plus Universal Mini Kit): 모든 다른 시노몰거스, 마우스, 및 래트 조직 샘플로부터의 RNA를 RN이지^® 플러스 유니버셜 미니 키트 (퀴아젠 카탈로그#73404)를 사용하여 단리하였다. 균질화를 위해, 50 μg 이하의 조직 샘플을 900 μL 퀴아졸 (QIAZOL)^® 용해 시약을 함유하는 2.0mL 둥근-바닥 에펜도르프 세이프-락 튜브 (에펜도르프 카탈로그#022600044)에 옮기고, 5mm 스테인리스 스틸 비드 (퀴아젠 카탈로그#69989) 샘플을 퀴아젠의 티슈라이저 II 기기를 사용하여 균질화하였다. 샘플을 20 Hz에서 2.0분 동안 프로세싱하고, 샘플을 180° 회전시키고, 20 Hz에서 추가의 2.0분 동안 프로세싱하였다. 그 후, 샘플을 30 Hz에서 2.0분 프로세싱하고, 샘플을 180° 회전시키고, 30 Hz에서 추가의 2.0분 동안 프로세싱하였다. 프로세싱이 완전하지 않은 경우 보다 긴 및/또는 보다 높은 빈도 균질화를 사용하였다. 그 후, 균질화된 조직 용해물을 새로운 2.0 mL 둥근-바닥 에펜도르프 세이프-락 튜브 내로 옮기고, 실온에서 5.0분 동안 방치하였다. 100 μL의 gDNA 엘리미네이터 용액을 각각의 튜브에 첨가하고, 튜브를 30초 동안 격렬하게 진탕하였다. 180 μL의 클로로포름 (시그마 카탈로그#496189)을 각각의 튜브에 첨가하고, 튜브를 30초 동안 격렬하게 진탕하였다. 튜브를 실온에서 3분 동안 방치하였다. 튜브를 12,000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상부 수성 상을 새로운 2.0 mL 둥근-바닥 에펜도르프 세이프-락 튜브에 약 500 μL 옮겼다. 동등한 부피의 70％ 에탄올을 첨가하고, 혼합하였다. 모든 향후의 원심분리 단계를 실온에서 수행하였다. 500 μL를 2.0 mL 수집 튜브에 정치된 RN이지 스핀 컬럼에 옮기고, 샘플을 10,000g에서 15초 동안 원심분리하였다. 통과액을 버리고, 잔류의 500 μL 샘플을 스핀 컬럼에 첨가하였다. 스핀 컬럼을 원심분리하고, 통과액을 버리고, 컬럼을 2 부피의 에탄올을 함유하는 700 μL의 세척 완충제 RWT로 세척하였다. 컬럼을 10,000g에서 15초 동안 원심분리하고, 통과액을 버렸다. 그 후, 컬럼을 키트 프로토콜에 기재된 바와 같이 4-부피의 에탄올을 함유하는 500 μL의 완충제 RPE로 2회 세척하였다. 컬럼을 먼저 제1 세척을 위해 10,000 g에서 15초 동안, 그 후 제2 세척을 위해 10,000g에서 2.0분 동안 원심분리하였다. 제2 세척 후, 컬럼을 10,000g에서 1.0분 동안 1회 원심분리하여 막을 건조시켰다. 그 후, 컬럼을 새로운 1.5 mL 수집 튜브에 옮기고, 30 μL의 RN아제-무함유수를 막의 중심에 직접적으로 첨가하였다. 막을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 컬럼을 10,000 g에서 1.0분 동안 원심분리하여 RNA를 용리하였다. RNA를 함유하는 용리액을 수집하고, RNA 농도를 나노드롭 분광광도계 (써모)를 사용하여 UV 흡광도에 의해 결정할 때까지 얼음 상에서 저장하였다. RNA 샘플을 -80℃에서 저장하였다.

역전사에 의한 cDNA 합성: 300 ng의 RNA를 PCR-96-AB-C 마이크로플레이트 (악시젠 (Axygen) 카탈로그#321-65-051)에서 뉴클레아제-무함유수 (인비트로젠 카탈로그#10977-015)를 사용하여 10.8 μL의 최종 부피로 희석하였다. 6.0 μL를 하기를 함유하는 반응 믹스 1의 각각의 웰에 첨가하였다: 2.0 μL의 50 μM 무작위 십량체 (앰비온 (Ambion) 카탈로그#AM5722G) 및 4.0 μL의 1X dNTP 믹스 (인비트로젠 카탈로그#10297-018). 플레이트를 광학 밀봉 테이프 (어플라이드 바이오시스템스 카탈로그# 4360954)로 밀봉하고, 실온에서 1,000 x g에서 1.0분 동안 원심분리하였다. 다음으로, 플레이트를 96-웰 써멀 사이클러 진앰프 PCR 시스템 (Thermal Cycler GeneAmp PCR System) 9700 (어플라이드 바이오시스템스)을 사용하여 70℃에서 3.0분 동안 가열하였다. 그 후, 플레이트를 얼음 상에서 완전히 냉각시켰다. 다음으로, 3.25 μL의 반응 믹스 2 (2 μL의 10X 가닥 완충제, 1.0 μL의 MMLV-RT 200U/μL 리버스 트랜스크립타제 효소 (앰비온 카탈로그#2044), 및 0.25 μL의 RN아제 억제제 40U/μL (앰비온 카탈로그#AM2682)를 함유함)를 웰의 각각에 첨가하였다. 플레이트를 광학 밀봉 테이프로 밀봉하고, 실온에서 1,000 x g에서 1.0분 동안 원심분리하였다. 96-웰 써멀 사이클러를 사용하여, 플레이트를 42℃에서 60분 동안, 그 후 95℃에서 10분 동안 가열하였다. 그 후, 플레이트를 얼음 상에서 냉각시켰다. cDNA 플레이트를 PCR 분석을 위해 사용 준비될 때까지 -20℃에서 저장하였다.

SNCA 및 GAPDH mRNA 발현의 증폭 및 정량화를 위한 qPCR: cDNA를 PCR-96-AB-C 마이크로플레이트에서 뉴클레아제 무함유수에 5배 희석하였다. 하기: 10 μL의 2X 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (Taqman Gene Expression Master Mix) (어플라이드 바이오시스템스 카탈로그#4369016), 1.0 μL의 20X 택맨 프라이머-프로브 세트 (어플라이드 바이오시스템스), 및 5.0 μL의 뉴클레아제-무함유수로 이루어진 16 μL의 마스터 믹스 용액을 384-웰 광학 PCR 플레이트 (어플라이드 바이오시스템스 카탈로그#4483315)의 각각의 웰에 첨가하였다. 4.0 μL의 희석된 cDNA를 384-웰 광학 PCR 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 광학 밀봉 테이프로 밀봉하고, 실온에서 1,000 x g에서 1.0분 동안 원심분리하였다. PCR을 어플라이드 바이오시스템스 700 HT 고속 실시간 PCR 시스템 (Fast Real-Time PCR System) 상에서 하기 파라미터를 사용하여 표준 모드에서 수행하였다: 2.0분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 이어서 15초 동안 95℃ 및 1.0분 동안 60℃의 40 사이클.

qRT-PCR 프라이머-프로브 세트: 어플라이드 바이오시스템스 (써모 피셔)로부터의 프라이머-프로브 세트는 하기를 포함하였다:

1) 인간 알파 시누클레인 (카탈로그#Hs01103383_m1) FAM 표지됨

2) 인간 PROS1 (카탈로그#HS00165590_m1) FAM 표지됨

3) 시노몰거스 알파 시누클레인 (카탈로그#Mf02793033_m1) FAM 표지됨

4) 시노몰거스 GAPDH (카탈로그#Mf04392546_g1) FAM 표지됨

5) 시노몰거스 GAPDH (카탈로그#Mf04392546_g1) VIC 표지됨 프라이머 리미티드

6) 래트 알파 시누클레인 (카탈로그#Rn01425141_m1) FAM 표지됨

7) 래트 GAPDH (카탈로그#Rn01775763-g1) FAM 표지됨

8) 래트 GAPDH (카탈로그#4352338E) VIC 표지됨 프라이머 리미티드

9) 마우스 GAPDH (카탈로그#Mm99999915-g1) FAM 표지됨

10) 마우스 GAPDH (카탈로그#4352339E) VIC 표지됨 프라이머 리미티드.

실시예 8: 마우스에서의 ASO-005459의 생체내 활성 및 내약성의 분석

ASO-005459는 인간 SNCA에 대해 특이적인 LNA-변형된 ASO이다. 시험관내 결과 (상기 기재됨)는 ASO-005459가 1차 뉴런에서 SNCA mRNA를 감소시키기 위해 강력하고 선택적임을 입증한다. 시험관내 결과는 또한 그 ASO-005459가 양호하게 내성화됨을 시사한다.

A53T-PAC 마우스

이들 결과가 또한 생체내에서 사실인지 여부를 평가하기 위해, 100 μg의 ASO-005459를 A53T-PAC 마우스에게 ICV 주사를 통해 투여하고, 해마에서 내약성 및 SNCA mRNA 넉다운 (KD) 둘 다를 실시예 4 (상기)에 기재된 바와 같이, 주사 후 3일에 평가하였다.

표 6 및 7 (하기)에 나타난 바와 같이, ASO-005459는 1의 전체 평균 내약성 점수로 양호하게 내성화되었다. 또한, ASO-005459는 투여 후 3일에 해마에서 SNCA mRNA 수준을 90％ 초과 유의하게 감소시켰다. (도 4).

<표 6>

<표 7> A53T-PAC 마우스에서의 ASO-005459 내약성, 3-일 연구

활성을 생체내에서 평가하기 위해, A53T-PAC 마우스를 ASO-005459로 3.13 μg, 12.5 μg, 25 μg, 또는 50 μg 농도로 ICV 주사를 통해 투여하였다. 내약성을 투여 후 제7일 및 제14일에 체중을 측정함으로써 평가하였다. SNCA mRNA의 발현을, 동물을 희생시키고, 그들의 조직을 수확한 때 투여 후 14일에 평가하였다. SNCA mRNA 넉다운을 3가지 뇌 영역에서 측정하였다: 해마, 뇌간, 및 선조체. 뇌간 및 선조체는 MSA 및 PD 환자의 뇌에서 가장 영향을 받은 2가지의 영역이다. 별개의 연구에서, C57BL/6 마우스를 100 μg의 ASO-005459로 투여하고, 내약성을 투여 후 제7일, 제14일, 제21일, 및 제28일에 동물의 체중을 측정함으로써 평가하였다. 100 μg ASO-005459를 야생형 (WT) C57BL/6 마우스에서 ICV 투여하고, 체중 및 행동을 4-주 기간에 걸쳐 모니터링하였다. ASO-005459는 마우스 SNCA를 표적화하지 않기 때문에, SNCA mRNA 발현의 감소는 이들 동물에서 측정하지 않았다.

도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, ASO-005459 (모든 농도에 대해)로 처리된 마우스 (A53T-PAC 마우스 및 C57BL/6 마우스 둘 다) 및 대조군 비히클로 처리된 것들의 체중의 유의한 차이는 없었다. 동물 (C57BL/6)은 실험의 과정 동안 임의의 비정상적 행동을 나타내지 않았다. 표 8 (하기)을 참조한다. 이러한 결과는 ASO-005459가 양호하게 내성화되었음을 입증한다. 또한, ASO-005459로 처리된 마우스에서, 시험된 모든 3가지 뇌 영역에서 SNCA mRNA 발현의 유의하고 용량-의존적 감소가 있었다. 도 6a 내지 6c를 참조한다. 해마에서, SNCA mRNA 발현은 3.13, 12.5, 25, 및 50 μg ASO-005459에 대해 각각 53％, 73％, 80％, 및 96％ 감소되었다. 유사한 용량-의존적 넉다운은 또한 뇌간에서 관찰되었다. 선조체에서, SNCA mRNA 넉다운은 다른 영역에 비해 보다 가변적이고 덜 왕성하였다 (도 6a 내지 6c): 75％ 및 46％ 넉다운이 50 μg 및 25 μg의 ASO-005459로 각각 관찰되었다. 그러나, 12.5 μg 및 3.13 μg의 ASO-005459로, SNCA mRNA 발현의 유의한 감소는 없었다. 선조체에서 관찰된 보다 낮은 활성에 대한 가능한 설명은 ASO 수준 또는 SNCA mRNA 넉다운의 동역학의 차이에 기인할 수 있다.

<표 8> 28-일 연구에서의 ASO-005459 내약성

ASO-005459 수준을 A53T-PAC 마우스의 모든 3가지 뇌 영역에서 측정하였다. 도 7 및 표 9 (하기)에 나타난 바와 같이, 뇌 노출은 대략 용량 비례적이고, 선조체를 비롯한 모든 3가지 영역에 걸쳐 유사하였다. 상이한 뇌 영역에 대한 ASO-005459 노출-반응 관계를 도 8a 내지 8d에 나타낸다. 유사한 노출-반응 관계가 각각 179 및 206 nM의 추정된 IC₅₀으로 해마 및 뇌간에서 관찰되었다. 그에 비해, 선조체에서의 노출 반응 관계는 상대적으로 급격하였으며, 이는 그 영역에서 SNCA mRNA 감소의 보다 느린 동역학을 시사한다. 도 8c를 참조한다.

<표 9> 14-일 A53T-PAC 연구에서의 ASO-005459 뇌 노출의 요약

보다 광범위한 용량-반응/시간 과정 데이터를 제공하기 위해, ASO-005459를 ICV 프리핸드 주사에 의해 A53T-PAC 마우스의 뇌실 내로 직접적으로 다시 투여하였다 (0, 12.5, 25, 또는 50 μg). 동물을 투여 후 24시간, 3일, 4주, 8주, 12주, 16주, 및 20주에 희생시키고, 뇌간 및 선조체에서의 SNCA mRNA 발현을 평가하였다.

도 9a 및 9b에 나타난 바와 같이 (및 상기 제공된 데이터와 일치하게), A53T-PAC 마우스에의 ASO-005459의 투여는 뇌간 및 선조체 둘 다에서 (비히클 대조군에 비해) SNCA mRNA 발현 수준의 유의한 감소를 발생시켰다. 감소는 시간- 및 용량-의존적 둘 다인 것으로 나타났으며, 피크 감소 (약 90％)는 투여 후 약 4주에 50 μg ASO-005459로 뇌간에서 관찰되었다 (도 9a). 선조체에서, 피크 감소 (약 55％)는 투여 후 약 3일에 50 μg ASO-005459로 관찰되었다 (도 9b). SNCA mRNA 발현 수준은 투여 후 4주에 비히클 대조군에 비해 유의하게 감소되어 잔류하였으며 (도 10a 및 10b), 투여 후 약 16주까지 기준선 대조군으로 복귀하였다 (도 9a 및 9b).

도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이, 동물에의 ASO-005459의 투여는 또한 뇌간 및 선조체 뇌 조직 둘 다에서 SNCA 단백질 수준의 시간- 및 용량-의존적 감소를 발생시켰다. 피크 감소 (약 75％)는 투여 후 8주에 50 μg의 용량을 뇌간에서 관찰되었다 (도 11a). 선조체 뇌 조직에 대해, 피크 감소 (약 75％)는 또한 50 μg 용량으로 그러나 투여 후 4주에 관찰되었다 (도 11b). 투여 후 8주에 개별적 마우스에 대한 발현 수준을 도 12a (뇌간) 및 12b (선조체)에 제공한다. SNCA 단백질 수준은 선조체에서 투여 후 약 12주까지 기준선에 가깝게 복귀한 반면, 발현 수준은 투여 후 16주만큼 멀리 뇌간에서 여전히 유의하게 감소되었다 (약 25％).

실시예 9: 시노몰거스 원숭이에서의 SNCA-표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)의 생체내 활성 및 내약성의 분석

ASO 활성 및 내약성을 생체내에서 추가로 평가하기 위해, 경막내 포트된 시노몰거스 원숭이 모델 (시노 IT)을 개발하였다. 이 모델은 SNCA의 ASO-005459-매개된 넉다운 뿐만 아니라 잠재적 1-염기쌍 미스매치 오프-타겟 PROS1 및 IKZF3의 넉다운의 평가를 가능하게 한다. SNCA, PROS1, 및 IKZF3에서의 ASO-005459 표적 부위는 인간 및 시노몰거스 사이에 완전히 보존된다.

실시예 6에서 상기 기재된 바와 같이, 각각의 동물을 L3 또는 L4 추골에서 들어가는 경막내 뇌척수액 (CSF) 카테터로 삽입하였다. ASO-005459를 염수에 용해시키고, 동물에게 투여하고 (8 mg / 동물), IT 포트를 사용하여 4.5분에 걸쳐 주입하였다 (용량 군 당 2마리의 동물). 그 후, 동물을 투여 후 24시간 및 3일에 안락사시키고, 그 때 조직을 ASO 노출 및 활성의 분석을 위해 수확하였다. 분석된 뇌 영역은 연수 (Med), 교뇌 (V-Pons), 중뇌 (V-MB), 소뇌 (CBL), 꼬리-조가비핵 (좌측 및 우측) (CauP), 해마 (좌측 및 우측) (Hip), 전두 피질 (좌측 및 우측) (FrC), 관자 피질 (좌측 및 우측) (TeC), 두정 피질 (좌측 및 우측) (PaC), 후두 피질 (좌측 및 우측) (Occ), 및 피질 백색 물질 (WM)을 포함하였다. 추가적으로, 척수를 경부 (CSC), 흉부 (TSC), 및 요부 (LSC) 영역에서 샘플링하였다. 샘플을 또한 간, 신장, 심장, 삼차 핵, 정강 신경, 및 대동맥으로부터 수집하여 그들 영역에서 오프-타겟 약리학을 조사하였다.

마우스에서 관찰된 바와 같이, ASO-005459는 관찰된 유해 효과 없이 시노몰거스에서 양호하게 내성화되었다 (데이터는 나타내지 않음). 그리고, 하기 표 10에 나타난 바와 같이, ASO-005459의 투여는 시노몰거스 뇌의 다양한 영역에서 SNCA mRNA의 왕성한 넉다운을 나타내었다.

<표 10> 시노몰거스 뇌에서의 뇌 SNCA mRNA 수준에 대한 ASO-005459의 효과

상기 기재된 SNCA mRNA의 감소를 추가로 특징규명하기 위해, 시노몰거스 원숭이를 ASO-005459로 투여하고 (동물 당 총 8 mg), 투여 후 24시간, 3일, 2주, 4주, 8주, 13주, 또는 20주에 희생시켜 상이한 조직에서의 SNCA mRNA 발현 수준을 평가하였다. 도 13a에 나타난 바와 같이, 피크 감소는 투여 후 2주 내지 13주에 관찰되었다. 70％, 65％, 75％, 35％, 94％ 및 99％의 피크 감소가 각각 연수, 소뇌, 교뇌, 꼬리-조가비핵, 전두 피질 및 요추 척수에서 관찰되었다. 이 SNCA mRNA 발현 수준의 감소는 또한 SNCA 단백질 발현 수준의 시간-의존적 감소와 상관되었다 (도 13b).

다음으로, 시노몰거스 원숭이에서 발현 수준의 감소가 또한 용량에 의존적인지 여부를 평가하기 위해, 동물은 2, 4, 또는 8 mg의 ASO-005459를 받았고, 그 후 투여 후 2주에 희생되었다. 도 14a 및 14b에 나타난 바와 같이, SNCA mRNA 및 SNCA 단백질 발현 수준 둘 다의 감소는 또한 용량에 의존적이었으며, 최대 감소는 8 mg의 ASO-005459로 관찰되었다.

여기에 제시된 결과는 ASO-005459가 SNCA mRNA를 감소시키기 위해 강력하고 선택적이며, ASO-005459가 뉴런에서 및 전임상 종에서 생체내에서 양호하게 내성화됨을 입증한다. 더욱이, A53T-PAC 뉴런으로부터의 결과는 mRNA의 ASO-005459-매개된 감소가 시험관내에서 및 생체내에서 SNCA 단백질 수준의 감소를 발생시킴을 확인시켜 준다. 또한, A53T-PAC 마우스 및 시노몰거스 원숭이에서의 결과는 ASO-005459가 양호하게 내성화된 용량에서 뇌에서 SNCA mRNA 및 SNCA 단백질을 감소시킴을 입증한다. 함께 취해져, 이들 결과는 시누클레인병증의 치료를 위한 질환-변형 치료제로서의 ASO-005459의 계속된 개발을 뒷받침한다.

이 PCT 출원은 2018년 1월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/616,937호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY ROCHE INNOVATION CENTER COPENHAGEN A/S <120> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES TARGETING ALPHA-SYNUCLEIN AND USES THEREOF <130> 3338.107PC01/ELE/C-K/DKC <150> 62/616,937 <151> 2018-01-12 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2400 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagataggga cgaggagcac gctgcaggga aagcagcgag cgccgggaga ggggcgggca 60 gaagcgctga caaatcagcg gtgggggcgg agagccgagg agaaggagaa ggaggaggac 120 taggaggagg aggacggcga cgaccagaag gggcccaaga gagggggcga gcgaccgagc 180 gccgcgacgc ggaagtgagg tgcgtgcggg ctgcagcgca gaccccggcc cggcccctcc 240 gagagcgtcc tgggcgctcc ctcacgcctt gccttcaagc cttctgcctt tccaccctcg 300 tgagcggaga actgggagtg gccattcgac gacaggttag cgggtttgcc tcccactccc 360 ccagcctcgc gtcgccggct cacagcggcc tcctctgggg acagtccccc ccgggtgccg 420 cctccgccct tcctgtgcgc tccttttcct tcttctttcc tattaaatat tatttgggaa 480 ttgtttaaat ttttttttta aaaaaagaga gaggcgggga ggagtcggag ttgtggagaa 540 gcagagggac tcaggtaagt acctgtggat ctaaacgggc gtctttggaa atcctggaga 600 acgccggatg ggagacgaat ggtcgtgggc accgggaggg ggtggtgctg ccatgaggac 660 ccgctgggcc aggtctctgg gaggtgagta cttgtccctt tggggagcct aaggaaagag 720 acttgacctg gctttcgtcc tgcttctgat attcccttct ccacaagggc tgagagatta 780 ggctgcttct ccgggatccg cttttccccg ggaaacgcga ggatgctcca tggagcgtga 840 gcatccaact tttctctcac ataaaatctg tctgcccgct ctcttggttt ttctctgtaa 900 agtaagcaag ctgcgtttgg caaataatga aatggaagtg caaggaggcc aagtcaacag 960 gtggtaacgg gttaacaagt gctggcgcgg ggtccgctag ggtggaggct gagaacgccc 1020 cctcgggtgg ctggcgcggg gttggagacg gcccgcgagt gtgagcggcg cctgctcagg 1080 gtagatagct gagggcgggg gtggatgttg gatggattag aaccatcaca cttgggcctg 1140 ctgtttgcct gagtttgaac cacaccccga gtgagcagtt agttctgttg cctacgcctt 1200 tccaccatca acctgttagc cttcttctgg gattcatgtt aaggataccc ctgaccctaa 1260 gcctccagct tccatgcttc taactcatac tgttaccctt tagaccccgg gaatttaaaa 1320 aaggggttaa tcttttcatg caactccact tctgaaatgc agtaataaca actcagagga 1380 ttcatcctaa tccgtggtta ggtggctaga cttttactag ccaagatgga tgggagatgc 1440 taaattttta atgccagagc taaaaatgtc tgctttgtcc aatggttaaa tgagtgtaca 1500 cttaaaagag tctcacactt tggagggttt ctcatgattt ttcagtgttt tttgtttatt 1560 tttccccgaa agttctcatt caaagtgtat tttatgtttt ccagtgtggt gtaaaggaat 1620 tcattagcca tggatgtatt catgaaagga ctttcaaagg ccaaggaggg agttgtggct 1680 gctgctgaga aaaccaaaca gggtgtggca gaagcagcag gaaagacaaa agagggtgtt 1740 ctctatgtag gtaggtaaac cccaaatgtc agtttggtgc ttgttcatga gtgatgggtt 1800 aggataatca atactctaaa tgctggtagt tctctctctt gattcatttt tgcatcattg 1860 cttgtcaaaa aggtggactg agtcagaggt atgtgtaggt aggtgaatgt gaacgtgtgt 1920 atttgagcta atagtaaaaa atgcgactgt ttgcttttcc agatttttaa ttttgcccta 1980 atatttatga ctttttaaaa atgaatgttt ctgtacctac ataattctat ttcagagaac 2040 agttttaaaa actcatagtc ttttaaaaaa taatcaagaa tattcttaag aatcaaaatc 2100 attgatggat ctgtgatttc ttttaccatc atgaaaaatg tttgtcaatt ttaatccatt 2160 ctgattttta aaatatgact ttgatatgcc cctgtgatgt gtataaagag acctatttgt 2220 ggccctaaaa tggaaagaac agattagtct ttgatagagt tacttcatgt gatcatttgg 2280 tctctgtgaa cactgaggac agagaaaagt gcttgagggc tgctactaat ctctcagaaa 2340 catttgtata gttcatccat caaatgacac acatactaaa agaataaaga aattgatgct 2400 <210> 2 <211> 3215 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aggagaagga gaaggaggag gactaggagg aggaggacgg cgacgaccag aaggggccca 60 agagaggggg cgagcgaccg agcgccgcga cgcggaagtg aggtgcgtgc gggctgcagc 120 gcagaccccg gcccggcccc tccgagagcg tcctgggcgc tccctcacgc cttgccttca 180 agccttctgc ctttccaccc tcgtgagcgg agaactggga gtggccattc gacgacagtg 240 tggtgtaaag gaattcatta gccatggatg tattcatgaa aggactttca aaggccaagg 300 agggagttgt ggctgctgct gagaaaacca aacagggtgt ggcagaagca gcaggaaaga 360 caaaagaggg tgttctctat gtaggctcca aaaccaagga gggagtggtg catggtgtgg 420 caacagtggc tgagaagacc aaagagcaag tgacaaatgt tggaggagca gtggtgacgg 480 gtgtgacagc agtagcccag aagacagtgg agggagcagg gagcattgca gcagccactg 540 gctttgtcaa aaaggaccag ttgggcaaga atgaagaagg agccccacag gaaggaattc 600 tggaagatat gcctgtggat cctgacaatg aggcttatga aatgccttct gaggaagggt 660 atcaagacta 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ggcgctggtg aggaaggaag gaggaatgag tgactataag 2400 gatggttacc atagaaactt ccttttttac ctaattgaag agagactact acagagtgct 2460 aagctgcatg tgtcatctta cactagagag aaatggtaag tttcttgttt tatttaagtt 2520 atgtttaagc aaggaaagga tttgttattg aacagtatat ttcaggaagg ttagaaagtg 2580 gcggttagga tatattttaa atctacctaa agcagcatat tttaaaaatt taaaagtatt 2640 ggtattaaat taagaaatag aggacagaac tagactgata gcagtgacct agaacaattt 2700 gagattagga aagttgtgac catgaattta aggatttatg tggatacaaa ttctccttta 2760 aagtgtttct tcccttaata tttatctgac ggtaattttt gagcagtgaa ttactttata 2820 tatcttaata gtttatttgg gaccaaacac ttaaacaaaa agttctttaa gtcatataag 2880 ccttttcagg aagcttgtct catattcact cccgagacat tcacctgcca agtggcctga 2940 ggatcaatcc agtcctaggt ttattttgca gacttacatt ctcccaagtt attcagcctc 3000 atatgactcc acggtcggct ttaccaaaac agttcagagt gcactttggc acacaattgg 3060 gaacagaaca atctaatgtg tggtttggta ttccaagtgg ggtctttttc agaatctctg 3120 cactagtgtg agatgcaaac atgtttcctc atctttctgg cttatccagt atgtagctat 3180 ttgtgacata ataaatatat acatatatga aaata 3215 <210> 3 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotides <400> 4 attcctttac accacac 17 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotides <400> 5 tctgtcttgg ctttg 15 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotides <400> 6 agaaataagt ggtagt 16 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotides <400> 7 ccaaatctta taataactac 20 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotides <400> 8 ttcctttaca ccacac 16 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotides <400> 9 ggtgaggttt ggtaga 16 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotides <400> 10 ggtgaggttt ggtagaag 18

Claims (27)

1. AtTcctttacaccACAC (서열식별번호 (SEQ ID NO): 4)의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 여기서 대문자는 베타-D-옥시-LNA이고, 소문자는 DNA인 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO).
2. 제1항에 있어서, 포스포디에스테르 연결, 포스포트리에스테르 연결, 메틸포소네이트 연결, 포스포르아미데이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 ASO.
3. 제2항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결인 ASO.
4. 제1항에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC이고, 여기서 OxyA, OxyT, 및 Oxy MC가 각각 아데닌 베타 D-옥시-LNA, 티민 베타 D-옥시-LNA, 및 메틸 시토신 베타 D-옥시-LNA이고, DNAt, DNAc, 및 DNAa가 각각 티민 DNA, 시토신 DNA, 및 아데닌 DNA이고, s가 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결인 ASO.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, C₁₇₁H₂₁₄N₅₆O₉₀P₁₆S₁₆의 분자식 및 도 1b에 나타내어진 바와 같은 구조를 포함하며, 여기서 M⁺가 반대이온인 ASO.
6. 제5항에 있어서, 반대이온이 H⁺, Na⁺, NH4⁺, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ASO.
7. 제6항에 있어서, 반대이온이 Na⁺인 ASO.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO를 포함하며, 여기서 ASO가 적어도 1개의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티에 공유 부착된 것인 접합체.
9. 제8항에 있어서, 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티가 단백질, 지방산 쇄, 당 잔기, 당단백질, 중합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 접합체.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO 또는 제8항 또는 제9항의 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
11. 제10항에 있어서, 치료제를 더 포함하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 치료제가 알파-시누클레인 길항제인 조성물.
13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO, 제8항 또는 제9항의 접합체, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물, 및 사용을 위한 지시서를 포함하는 키트.
14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO, 제8항 또는 제9항의 접합체, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물, 및 사용을 위한 지시서를 포함하는 진단 키트.
15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO, 제8항 또는 제9항의 접합체, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 SNCA 단백질을 발현하는 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포에서의 SNCA 단백질 발현이 투여 후에 억제되거나 감소되는 것인, 세포에서 SNCA 단백질 발현을 억제하거나 감소시키는 방법.
16. 제15항에 있어서, ASO가 투여 후에 세포에서의 SNCA mRNA의 발현을 억제하거나 감소시키는 것인 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, SNCA mRNA의 발현이 ASO에 노출되지 않은 세포에 비해 투여 후에 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 적어도 약 60％, 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 또는 약 100％ 감소되는 것인 방법.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ASO가 투여 후에 세포에서의 SNCA 단백질의 발현을 ASO에 노출되지 않은 세포에 비해 적어도 약 60％, 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 또는 적어도 약 90％ 감소시키는 것인 방법.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 뉴런인 방법.
20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO, 제8항 또는 제9항의 접합체, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 시누클레인병증을 치료하는 방법.
21. 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO, 제8항 또는 제9항의 접합체, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
22. 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 시누클레인병증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 ASO, 제8항 또는 제9항의 접합체, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 ASO, 접합체 또는 조성물.
24. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 시누클레인병증의 요법을 필요로 하는 대상체에서의 시누클레인병증의 요법에 사용하기 위한 ASO, 접합체 또는 조성물.
25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 시누클레인병증이 파킨슨병, 파킨슨병 치매 (PDD), 다계통 위축증, 루이 소체를 갖는 치매, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법, 용도 또는 사용하기 위한 ASO.
26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법, 용도 또는 사용하기 위한 ASO.
27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, ASO, 접합체, 또는 조성물이 경구로, 비경구로, 경막내로, 뇌실내로, 폐로, 국소적으로, 또는 심실내로 투여되는 것인 방법, 용도 또는 사용하기 위한 ASO.

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