KR20210053303A - 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 rip 키나제의 억제 - Google Patents

신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 rip 키나제의 억제 Download PDF

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KR20210053303A
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슬기 이
한석 고
테드 엠. 도슨
마틴 지. 폼퍼
동훈 김
유민 오
승환 권
용주 박
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

RIPK2 억제제를 포함하는 조성물 및 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해 RIPK2 억제제를 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 또한 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 유용한 치료제를 스크리닝하거나 확인하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 RIP 키나제의 억제
연방 지원 연구 및 개발에 관한 진술
미국 정부는 본 발명에 대하여 지불된 라이센스를 보유하고 있으며, 제한된 상황에서 특허 소유자가 국립보건원(National Institutes of Health)에서 인정하는 R01NS107404의 조건에 따라 합리적인 조건으로 다른 사람들에게 라이센스를 부여하도록 요구할 수 있는 권리를 갖는다.
본 발명의 개발 동안 수행된 작업의 일부는 미국 정부 자금을 이용하였다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명의 구현예는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료를 위한 수용체 상호작용 단백질(RIP; Receptor-Interacting Protein) 키나제(kinases)와 관련된다.
신경계는 두 부분으로 나누어진다: 뇌 및 척수를 포함하는 중추 신경계(CNS), 및 뇌와 척수 외부의 신경 및 신경절을 포함하는 말초 신경계. 말초 신경계는 복구 및 재생(regeneration)이 가능하지만, CNS는 자가 복구(self-repair) 및 재생을 할 수 없다.
신경퇴행은 뉴런의 기능 또는 구조의 진행성 손실을 지칭한다. 신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 근위축 측삭 경화증(ALS), 다발성 경화증(MS), 치매, 및 헌팅턴병은 신경퇴행성 진행의 결과이고 전세계적으로 수백만 사람에게 영향을 미친다. CNS에 대한 이들 연령 관련 손상은 뉴런의 구조 및 기능의 점진적인 악화, 축색돌기의 손실을 야기하고, 뉴런 연결을 방해하며, 궁극적으로 영구적 실명, 마비, 및 인지, 운동, 및 감각 기능의 다른 손실을 초래한다. 치료 옵션은 현재 매우 제한적이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 적어도 부분적으로, 중추신경계에 대한 신경보호 및 질환 변경 효과를 갖는 RIPK2 억제제의 개발 및 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 적어도 부분적으로, 중추신경계에 대한 신경보호 및 질환 변경 효과를 갖는 RIPK2 억제제의 개발 및 용도에 기초한다.
본 발명의 구현예는 특히 RIP 키나제 2(RIPK2) 및 선택적으로 다른 RIP 키나제를 억제함으로써 신경퇴행성 질환 또는 장애(disorder)의 예방 및 치료를 위한 조성물과 관련된다. 본 발명의 구현예는 또한 신경퇴행성 질환 또는 장애의 치료 방법에 관련되고, 본 방법은 대상체에게 적어도 하나의 RIPK2 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게, 적어도 하나의 RIPK2 억제제 또는 적어도 하나의 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 RIPK2 억제제는 RIPK2의 활성 및/또는 발현을 억제한다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 예컨대 RIPK1 및/또는 RIPK3와 같은 다른 RIP 키나제보다 예를 들어, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 또는 그 초과의 선택도로 선택적이다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 실질적으로 다른 RIP 키나제에 대하여 활성을 갖지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 이중 또는 다중 RIP 키나제 억제제, 또는 범-RIP 키나제 억제제일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용는, 적어도 부분적으로, 신경염증 및 신경독성 경로의 케스케이드의 촉발을 중단시키기 위해 신경퇴행성 질환의 진행에 관여하는 주요 세포인 미세아교세포(microglia)의 활성화 및 반응성 성상세포(reactive astrocytes)의 형성을 차단하거나 역전시키기 위한 조성물 및 방법의 확인에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 뇌에서 과발현되고 인산화된 RIPK2의 표적화를 통해, 신경교증(gliosis)(미세아교세포 및/또는 성상세포의 활성화)을 차단하고 활성화된 미세아교세포 및/또는 반응성 성상세포로부터 독성 분자를 방출함으로써 신경 세포를 보호하는 방법을 제공한다.
다양한 RIPK2 억제제는 본원의 조성물 및 방법에 적합하다. 특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 소분자, siRNA, shRNA, 마이크로 RNA, 항체, 압타머, DNAzymse, 효소, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 무기 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 유기 화합물, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 리보자임, 또는 합성 화합물을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 특정 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 분자는 RIPK2 발현을 인코딩하거나 조절하는 핵산에 혼성화될 수 있는 핵산 서열 또는 분자이다. 본 발명의 맥락에서 적합한 예시적인 핵산 서열은 RNA 억제(RNAi) 분자, 안티센스 분자, 및 리보자임을 포함하며, 이로 제한되지 않는다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 RNAi는 번역 억제(translational repression) 또는 전사체 분해(transcript degradation)를 유발하기 위해 표적 유전자 전사체의 상보적 부위에 결합함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 짧은 RNA 서열을 말한다.
일부 구현예에서, RIPK2 유전자 발현은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%까지 하향조절된다. 특정 다른 구현예에서, 부분적인 하향-조절이 바람직하다. 발현억제(하향조절 또는 침묵화) 올리고뉴클레오타이드의 예는 본원에서 상술된 바와 같은 안티센스 분자, RNA 간섭 분자(RNAi), 및 효소적 핵산 분자이다.
특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 RIPK2 단백질의 활성을 억제할 수 있는 소분자(small molecule)이다. 이러한 활성을 갖는 것으로 알려진 임의의 소분자는 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있다. 추가의 전형적인 구현예에 따르면, 소분자는 약제학적 조성물 내에 제형화될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 소분자는 혈액 뇌 장벽(BBB)를 통과할 수 있거나 BBB를 통과하도록 제형화된다. 예를 들어, 미국 특허 제8,629,114호, 제8,497,246호, 및 제7,981,864호에 개시된 바와 같이 BBB를 통해 화합물을 전달하기 위한 몇 개의 수단이 있다. 예를 들어, RIPK2 억제제 화합물은 당업계에서 설명되는 바와 같이 BBB 전달 화합물에 융합되거나 접합될 수 있다.
특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 다음의 활성 중 하나 이상을 선택적으로 억제한다: NFκB의 NOD1-의존적 활성화, NF-kB의 NOD2-의존적 활성화, 아밀로이드-β 응집체에 의해 유도된 미세아교세포의 활성화, 알파-시누클레인 응집체에 의해 유도된(alpha synuclein aggregates-induced) 미세아교세포의 활성화, 및/또는 A1 성상세포 형성.
특정 구현예에서, RIPK2 활성을 억제함으로써, 뇌에서의 TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, C1q, 및/또는 활성화된 미세아교세포 및 반응성 성상세포의 수준이 적절한(appropriate) 대조군과 비교하여 대상체(subject)에서 정상 수준으로 감소되거나, 유지되거나, 회복된다.
특정 구현예에서, RIPK2 활성을 억제함으로써, 뇌 단백질 예컨대 α-시누클레인(루이체; Lewy body), 아밀로이드 플라크, 및/또는 타우의 비정상적인 침착 수준이 적절한 대조군과 비교하여 대상체에서 정상 수준으로 감소되거나, 유지되거나, 회복된다.
특정 구현예에서, RIPK2 활성을 억제함으로써, 치료는 적절한 대조군과 비교하여 대상체의 운동 결손(motor deficit)을 완화시키거나 회복시키고, 기억 기능을 개선하고/거나 수명을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 본원의 방법은 대상체에게 적어도 하나의 추가적인 치료적 활성 화합물, 예를 들어, 추가적인 항-파킨슨병 또는 항-알츠하이머병 제제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료적 활성 화합물은 또한 다른 RIP 키나제, 예컨대 RIPK1, RIPK3, RIPK4, 또는 RIPK5의 억제제일 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 각각의 질환 또는 장애에 대해 대상체에게 투여된 유일한 활성 화합물일 수 있다.
다양한 구현예에서, RIPK2 억제제 및/또는 추가적인 치료적 활성 화합물은 정맥내로, 피하로, 동맥내로, 복강내로, 안과적으로, 근육내로, 협측으로, 직장으로, 질로, 안와내로, 뇌내로, 진피내로, 두개내로, 척수내로, 심실내로, 척추강내로, 갑골내로(intracisternally), 낭내로(intracapsularly), 폐내로, 비강내로, 경점막으로, 경피로, 흡입, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 경구로 또는 비경구로 투여된다.
다양한 신경퇴행성 질환 또는 장애는 본원에 방법에 의해 치료하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(ALS; amyotropic lateral sclerosis/루게릭병), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 폴리글루타민(polyQ) 질환, 뇌졸중(stroke), 파르병(Fahr disease), 멘케스병(Menke's disease), 윌슨병(Wilson's), 뇌 허혈(cerebral ischemia), 프리온 장애(prion disorder), 치매(dementia), 피질기저 퇴행증(corticobasal degeneration), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 선천성 경직성 반신부전마비(hereditary spastic paraparesis), 척수소뇌 위축증(spinocerebellar atrophies), 뇌 손상(brain injury), 또는 척수 부상(cord injury)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 또한 신경퇴행성 질환 또는 장애를 위한 치료제를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RIPK2를 발현시키는 세포 또는 조직을 후보 치료제와 접촉시키는 단계; RIPK2 활성 또는 발현에 대해 검정하는 단계; 및 대조군과 비교하여 RIPK2 발현 또는 활성의 억제를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 후보 치료제의 존재 하에서 CNS 상주(resident) 선천적 면역 세포(예를 들어, 미세아교세포 및/또는 성상세포)를 면역 세포의 활성화를 유도하는 제제(예를 들어, 비정상적으로 응집된 단백질)와 접촉시키는 단계; 후보 치료제의 존재 하에서 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 측정하는 단계; 및 대조군과 비교하여 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제하는 치료제를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 후보 치료제는 RIPK2 억제제이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 RIPK2 억제제의 치료 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 개시내용은 신경퇴행성 질환 또는 장애의 치료를 위한 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 키트는 적어도 하나의 RIPK2 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 적어도 하나의 추가적인 치료적 활성 화합물(예를 들어, 본원에 기재된 것)을 추가로 포함한다.
다른 양태는 아래에 기재되어 있다.
본 발명의 RIPK2 억제제를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법은 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 유용하다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 그려진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 이 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 요금의 지불 시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a 내지 1h는 인간 PD 사후 조직(PD postmortem tissues)에서 RIPK2 발현과 관련된 그래프 및 사진을 제공한다. 도 1a는 PD 사후 조직에서 미세아교세포 활성화를 보여주는 사진을 제공한다. 도 1b는 PD 사후 조직에서 p-RIPK2 활성화를 보여주는 사진을 제공한다. p-RIPK2 양성 신호가 정량화되었고 도 1b에서 막대 그래프로 제시되었다. 도 1c는 항-p-RIPK2(녹색) 및 미세아교세포 마커 항-cd-11b(적색)를 갖는 대표적인 공초점(confocal) 이미지를 도시한다. 도 1d는 인간 PD 사후 조직의 SNpc 영역에서 Nod2 및 Ripk2의 mRNA 발현 수준을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 1e는 웨스턴 블랏팅에 의해 평가된 인간 사후의 SNpc에서 NOD2, p-RIPK2, 및 RIPK2 발현 수준을 도시한다. NOD2 발현 수준이 정량화되고 도 1f에서 막대 그래프로 제시되었다. p-RIPK2 및 RIPK2 발현 수준이 정량화되고 도 1g에서 막대 그래프로 제시되었다. 도 1h는 인간 사후 조직의 SNpc에서 NOD2와 α-시누클레인 응집체 사이의 상호작용을 보여주는 근접 결찰 검정(proximity ligation assay)의 결과를 보여주는 사진을 제공한다.
도 2는 3시간 동안 α-시누클레인 PFF로 활성화된 마우스 일차(primary) 미세아교세포의 RIPK2, NOD1 및 NOD2의 발현을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. RIPK2, NOD1 및 NOD2의 유전자 발현은 실시간 PCR로 측정되었다.
도 3a 내지 3c는 실시간 RT-PCR을 사용하여, PFF 유도된 미세아교세포에서 측정된 A1 반응성 성상세포 유도 인자 예컨대 C1q, TNFα, 및 IL-1α의 mRNA 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 도 3d는 PFF 유도된 WT, NOD2-/-, 및 RIPK2-/- 일차 배양된 미세아교 세포로부터 정제된 미세아교세포 조건부 배지(MCM; mycroglia conditional medium)의 처리 24시간 후, 일차 배양된 성상세포에서 측정된 PAN-반응성, A1-특이적, 및 A2-특이적 전사체의 수준을 도시한다. 도 3e 및 3f는 AlamarBlue 및 LDH 검정을 사용하여 측정된 MCM-활성화(activated) 성상세포 조건부 배지(ACM; astrocyte conditional medium) 처리된 일차 배양된 마우스 피질 뉴런(cortical neuron)의 세포독성을 보여주는 막대 그래프이다. 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ± S.E.M.이다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 4a 및 4b는 α-시누클레인 PFF 처리(n=3, 각 그룹) 12시간 후 야생형(WT), NOD2 녹아웃(NOD2-/-), 및 RIPK2 녹아웃(RIPK2-/-) 마우스로부터 일차 배양된 미세아교세포의 형태적 상관관계를 보여주는 현미경사진 및 막대 그래프를 제공한다. 도 4c, 4d, 및 4e는 실시간 RT-PCR을 사용하여 측정된 IL-1베타, iNOS, 및 케모카인 Cxcl1의 mRNA 발현을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 4f는 이동 검정(migration assay)의 개략도를 도시한다. 일차 배양된 미세아교세포를 배양 접시의 상부 챔버 및 바닥에 플레이팅하였다. 도 4g는 Iba-1 항체로 염색된, 챔버의 바닥면 상의 이동된 세포를 갖는, α-시누클레인 PFF 처리 12시간 후의 결과를 보여주는 이미지를 제공한다. 도 4h는 PBS 대조군에 대해 Iba-1 양성 PFF-유도된 이동된 미세아교 세포의 수 사이의 비를 통해 계산된 이동 지수(migration index)를 보여주는 막대 그래프를 제공한다(n=3, 각 그룹). 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ± S.E.M.이다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 5a 내지 5c는 실시간 RT-PCR을 사용하여 PFF-유도된 미세아교세포에서 측정된 A1 반응성 성상세포 유도 인자 예컨대 C1q, TNFα, 및 IL-1α의 mRNA 수준을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 5d는 RIPK2 억제제인 게피티닙(Gefitinib) 및 GSK583를 가지는 PFF 유도된 일차 미세아교세포로부터 정제된 α-시누클레인 PFF-활성화 미세아교세포 조건부 배지(MCM)의 처리 후 24시간에, 일차 배양된 성상세포에서 측정된 PAN-반응성, A1-특이적, 및 A2-특이적 전사체의 수준을 도시한다. 도 5e 및 5f는 AlamarBlue 및 LDH 검정을 사용하여 측정된, MCM-활성화된 ACM으로 처리된 일차 배양된 마우스 피질 뉴런의 세포독성을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ± S.E.M.이다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 6a 및 6b는 pS129-α-시누클레인 또는 항-Iba-1 항체로 염색되고 정량화된, PFF 주사된 야생형(WT), NOD2 녹아웃(NOD2-/-), 및 RIPK2 녹아웃(RIPK2-/-) 마우스의 복측 중죄 조직(ventral midbrain tissue)을 보여주는 사진 및 막대 그래프를 제공한다.
도 7a-7c는 면역 패닝 방법(immune-panning method)에 의해, WT, RIPK2 녹아웃 및 NOD2 녹아웃 마우스로부터 정제된 미세아교세포를 사용하여 측정된 A1 반응성 성상세포 유도 인자 예컨대 C1q, TNFα, 및 IL-1α의 mRNA 수준을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. mRNA 수준은 실시간 RT-PCR에 의해 측정되었고 막대 그래프로 제시되었다. 도 7d는 면역 패닝 방법에 의해 복측 중뇌 영역으로부터 정제된 성상세포에서 측정된 PAN-반응성, A1-특이적, 및 A2-특이적 전사체의 mRNA 수준을 도시한다. 7e는 복측 중뇌에서 Iba-1, GFAP, 및 β-액틴의 대표적인 면역블랏을 도시한다. 도 7f 및 7g는 β-액틴으로 정규화된(normalized) Iba-1, GFAP 단백질 수준을 정량화한 것을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 오차 막대는 평균 ± S.E.M, 를 나타낸다(n = 4 마우스/그룹). 원-웨이 ANOVA가 통계적 분석을 위해 사용되었고, 이후 다수의 그룹 비교를 위한 사후 본페로니 테스트(post-hoc Bonferroni test)가 뒤따랐다. 비히클을 갖는 PBS 정위 주사된 마우스(PBS stereotaxic injected mice with vehicle) 또는 비히클을 갖는 α-시누클레인 PFF 정위 주사된 마우스에 대하여 *P < 0.05, ***P < 0.001 . n.s.: 유의하지 않음.
도 8a는 TH 면역반응성에 대해 염색된 선조체 절편(striatal section)의 대표적인 광현미경사진을 도시한다. 선조체에서 TH 섬유 밀도의 고출력도(하부 패널). 스케일바는 각각 100 ㎛(상부 패널) 및 50 ㎛(하부 패널)을 나타낸다. 도 8b는 Image J 소프트웨어를 사용하여 선조체에서 도파민성 섬유 밀도의 정량화를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 8c는 정위 기기를 사용하여 PBS 및 α-시누클레인 PFF가 선조체내 주사된 마우스에서 TH 양성 뉴런을 함유하는 관상 중뇌 절편(coronal mesencephalon sections)의 대표적인 광현미경사진을 도시한다. 스케일바는 500 ㎛를 나타낸다. 도 8d는 복측(ventral) 중뇌에서 TH, DAT, 및 β-액틴의 대표적인 면역블랏을 도시한다. 도 8e는 TH의 입체 카운트(stereology count)를 보여주는 막대 그래프를 제공하고, 도 8e는 SNpc 영역 내의 Nissl-양성 뉴런을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 비편향된 입체 카운팅이 SNpc 영역에서 수행되었다. 오차 막대는 평균 ± S.E.M, 그룹 당 n = 5 마우스를 나타낸다. 도 8g 및 8h는 β-액틴으로 정규화된(normalized) TH 및 DAT 단백질 수준의 정량화를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 오차 막대는 평균 ± S.E.M, 그룹 당 n = 4 마우스를 나타낸다. PBS 또는 α-syn PFF를 정위 선조체내 주사 후 6개월에, 행동 시험을 수행하였다. 폴(pole) 상의 마우스(도 8i) 및 그립 강도(도 8j) 시험의 결과. 오차 막대는 평균 ±S.E.M을 나타낸다(n=12 내지 16). 통계적 분석을 위해 원-웨이 ANOVA가 사용되었고, 이후 다수의 그룹 비교를 위한 사후 본페로니 테스트가 뒤따랐다. 비히클을 갖는 PBS 정위 주사된 마우스 또는 비히클을 갖는 α-syn PFF 정위 주사된 마우스에 대하여 **P < 0.01, ***P < 0.001. 폴을 내려 가기 위한 최대 시간은 60초로 제한되었다.
도 9a 및 9b는 RIPK2 억제제인 게피티닙(Gefitinib)을 갖는 PFF 주사된 동물에서, pS129-α-시누클레인 또는 항-Iba-1 항체로 염색되고 정량화된 복측 중뇌 조직의 이미지를 도시한다.
도 10a는 항-p-RIPK2 항체를 사용한 면역조직화학에 의해 AD 사후의 인간 해마 영역에서 평가된 p-REPK2 발현을 보여준다(화살표촉은 p- RIPK1 양성 신호를 나타냄). 도 10b는 ImageJ에 의해 측정된 해마의 CA1 영역에서의 p-RIPK2 신호의 밀도를 보여주는 막대 그래프이다(n=3, 각 그룹).
도 11은 Aβ-활성화 BV-2 미세아교 세포에서 p-RIP2K 발현 및 NOD2의 결합을 입증하는 대표적인 웨스턴 블랏을 도시한다.
도 12a는 행동 실험 절차를 도시한다. 마우스에 AβO1-42(총 5 μmol, 양측 i.c.v.)를 주사하였고, 모리스(Morris) 수중 미로 테스트(MWMT)를 실시하였다. 도 12b 및 12c는 각각 모리스 수중 미로 테스트에서 탈출 지연 시간(escpae latency time) 및 프로브 시험 세션(probe trial session)의 데이터를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 12d 및 12e는 각각 MWMT의 프로브 시험(probe trial) 세션에서 이동한 총 거리 및 수영 속도의 데이터를 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 프로브 시험 세션은 60초 동안 수행되었다. 도 12f는 프로브 시험 5일째에서 MWMT의 각 그룹의 마우스의 대표적인 수영 경로를 도시한다. 그 후, 마우스에게 15분의 시험간 간격으로, 연속 4일 동안 매일 2회의 시험 세션을 부여하였고, 탈출 지연기(escape latencies)를 기록하였다. 이 파라미터를 시험의 각 세션 및 각 마우스에 대해 평균하였다. 오차 막대는 평균 ± S.E.M.을 나타낸다. 모든 행동 테스트는 원-웨이 ANOVA로 분석하였고, 이후 다수의 그룹 비교를 위한 사후 본페로니 테스트를 하였다. 그룹 당 n=9 내지 13. 비히클을 갖는 PBS 정위 주사된 마우스 또는 비히클을 갖는 AβO1-42 정위 i.c.v. 주사된 마우스에 대하여 *P < 0.05, **P < 0.01, 및 ***P < 0.001. n.s.: 유의하지 않음.
정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 목적이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 또한, 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함하는(including)", "포함한다(include)", "갖는(having)", "갖는다(has)", "갖는(with)" 또는 이의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄하는 것으로 의도된다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값(value)에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, "약"은 당업계의 실시에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 5배 이내, 및 또한 2배 이내의 크기 정도 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 본원 및 청구범위에서 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내의 용어 "약"을 의미하는 것으로 가정해야 한다
본원에서 사용된 바와 같이, 화합물의 "투여(administration)", 화합물을 "투여하는" 이라는 어구, 또는 이의 다른 변형은 화합물 또는 화합물의 전구약물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 것을 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오타이드" 또는 "안티센스 화합물"이란 또 다른 RNA 또는 DNA(표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 예를 들어, RNA 올리고뉴클레오타이드이면, 이는 RNA-RNA 상호작용에 의해 다른 RNA 표적에 결합하고 표적 RNA의 활성을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 기능을 상향조절하거나 하향조절할 수 있다. 이정의는 치료제, 진단, 또는 다른 관점에서 유용한 임의의 외래 RNA 또는 DNA 분자를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 분자는, 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자, 간섭(interference) RNA(RNAi), 마이크로 RNA, 유인(decoy) RNA 분자, siRNA, 효소적(enzymatic) RNA, 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA), 치료 편집(therapeutic editing) RNA 및 작용제 및 길항제 RNA, 안티센스 올리고머성 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, 대체 스플라이서, 프라이머, 프로브, 및 표적 핵산의 적어도 일부분에 혼성화되는 다른 올리고머성 화합물를 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머성(circular oligomeric) 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 대한 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상 기능을 방해하여 기능 및/또는 활성의 조절을 야기할 때 "특이적으로 혼성화가능(specifically hybridizable)"하고, 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉 생체내 검정 또는 치료적 처치의 경우 생리학적 조건 하에 및 시험관내 검정의 경우 검정이 수행되는 조건 하에 비-표적 핵산 서열에 대한 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
공-투여되는(co-administered) 활성제는 동시에 또는 순차적으로 개체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항목(item), 조성물, 장치, 방법, 프로세스, 시스템 대하여 정의되거나 설명된 요소와 관련하여, "포함하는(comprising)", "포함한다(comprise)" 또는 "포함된(comprised)"의 용어 및 이의 변형은 추가의 요소를 허용하여 포괄적이거나 제한을 두지 않는 것을 의미하고, 이에 의해, 정의되거나 기술된 항목, 조성물, 장치, 프로세스, 시스템 등은 이들 특정 요소 - 또는 적절한 경우 이들의 등가물 -를 포함하고, 다른 요소가 포함될 수 있고, 여전히 정의된 항목, 조성물, 장치, 방법, 프로세스, 시스템 등의 범위/정의 내에 있음을 나타낸다.
용어 "대조군(control)"은 테스트 샘플에서 발현 생성물에 대한 비교를 제공하는 데 적합한 임의의 참조 표준(reference standard)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대조군은 발현 생성물 수준이 검출되고 테스트 샘플로부터 발현 생성물 수준과 비교된 "대조군 샘플"을 수득하는 것을 포함한다. 이러한 대조군 샘플은 알려진 결과를 갖는 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애(이는 저장된 샘플 또는 이전의 샘플 측정일 수 있음)을 가지고 있는 대조군 환자의 샘플을 포함한 다음에 기재된 임의의 적합한 샘플을 포함할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다; 대상체, 예컨대 정상 환자 또는 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 가지고 있는 환자로부터 단리된 정상 조직 또는 세포, 대상체 예컨대 정상 대상체 또는 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 가지고 있는 환자로부터 단리된 배양된 일차 세포/조직, 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 가지고 있는 환자의 동일한 기관 또는 신체 위치로부터 수득된 인접한 정상 세포/조직, 정상 대상체에서 단리된 조직 또는 세포 샘플, 또는 보관소로부터 얻은 일차 세포/조직. 다른 구현예에서, 대조군은 하우스키핑 유전자, 정상 조직(또는 다른 이전에 분석된 대조군 샘플)으로부터의 발현 생성물 수준 범위, 환자의 군 또는 특정 결과(예를 들어, 1, 2, 3, 4년 동안 생존 등)를 갖는 환자의 세트 또는 특정 치료(예를 들어, 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는 환자에 대한 표준 치료 요법)를 받는 환자의 세트로부터의 테스트 샘플 내의 이전에 결정된 발현 생성물 수준의 범위를 포함하는 임의의 적합한 공급원으로부터의 기준 표준 발현 생성물 수준(reference standard expression product level)을 포함할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 당업자는 이러한 대조군 샘플 및 참조 표준 발현 생성물 수준이 본 발명의 방법에서 대조군으로서 조합되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 대조군은 정상 세포/조직 샘플을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 대조군은 환자 세트, 예컨대 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는 환자 세트에 대한, 또는 특정 치료를 받는 특정 신경퇴행성 질병 또는 장애를 가진 환자 세트에 대한, 또는 하나의 결과 대 또 다른 결과를 갖는 환자의 세트에 대한 발현 수준을 포함할 수 있다. 전자의 경우, 각 환자의 특정 발현 산물 수준, 예를 들어, RIPK2 발현은 백분위수 발현 수준으로 할당될 수 있거나, 또는 기준 표준 발현 수준의 평균(mean) 또는 산술평균(average) 보다 높거나 낮은 것으로 표현될 수 있다. 다른 구현예에서, 대조군은 정상 세포 또는 RIP 키나제 등의 억제제로 치료(treat)된 환자로부터의 세포를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 대조군은 또한 측정된 값, 예를 들어 동일한 집단에서의 하우스키핑 유전자의 발현 수준과 비교하여 집단에서의 RIP 키나제 유전자의 발현의 평균 수준을 포함할 수 있다. 이러한 집단은 정상 대상체, 임의의 치료를 겪지 않은(즉, 치료 미접촉 treatment naive) 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는 환자, 또는 표준 치료 요법을 받고 있는 특정 신경퇴행성 질환 또는 질환을 갖는 환자를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 대조군은, 비제한적으로, 테스트 샘플 중 2개의 유전자의 발현 생성물 수준의 비를 결정하고 이를 참조 표준에서 동일한 2개의 유전자의 임의의 적합한 비와 비교하는 것; 테스트 샘플 내 2개 이상의 유전자의 발현 생성물의 수준을 결정하고 임의의 적합한 대조군에서 발현 생성물의 수준의 차이를 결정하는 것; 및 테스트 샘플 내의 2개 이상 유전자의 발현 생성 수준을 결정하고, 이의 발현을 테스트 샘플에서 하우스키핑 유전자의 발현으로 정규화(normalizing)하고, 임의의 적합한 대조와 비교하는 것을 포함하는, 발현 생성 수준의 비 변환(ratio transformation)을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군은 테스트 샘플과 동일한 계통 및/또는 유형의 대조군 샘플을 포함한다. 다른 구현예에서, 대조군은 환자 샘플 세트, 예컨대 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는 모든 환자 내의 또는 그에 기초한 백분위수로서 그룹화된 발현 생성물 수준을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 대조군 발현 산물 수준은, 예를 들어, 특정 백분위수에 비해 발현 산물의 더 높거나 더 낮은 수준이 결과를 예측하기 위한 기초로서 사용되는 것으로 확립된다. 다른 구현예에서, 대조군 발현 생성물 수준은 공지된 결과를 갖는 특정 신경퇴행성 질환 또는 장애를 갖는 대조군 환자로부터의 발현 생성물 수준을 사용하여 확립되고, 테스트 샘플로부터의 발현 생성물의 수준은 결과를 예측하기 위한 기준으로 대조군 발현 생성물의 수준과 비교된다. 아래의 데이터에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명의 방법은 대조군에 대한 테스트 샘플에서 발현 생성물의 수준을 비교함에 있어서 특정 절단점(cut-point)의 사용에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유효량(effective amount)", "치료 유효량(therapeutically effective amount", 또는 "효과적인 용량(effective dose)"은 대상체에서 적어도 하나의 원하는 치료 효과, 예컨대 표적 병태(target condition)의 예방 또는 치료, 또는 상기 병태와 연관된 증상의 이로운 완화를 생성하는 조성물(예를 들어, 치료적 조성물 또는 제제)의 양이다.
"포유동물"은 전형적으로 의료 보호 하에 있는 온혈 포유동물(예를 들어, 인간 및 비인간, 예컨대 사육된 동물)을 포함한다. 그 예는 고양이, 갯과, 말과, 소, 및 인간을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 이의 모방체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 또한 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 이의 치환된 및 알파-아노머성 형태, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금(locked) 핵산(LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 등을 포함하여 천연 및/또는 변형된 단량체 또는 연결기의 선형 또는 원형 올리고머를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 단량체-대-단량체 상호작용, 예컨대 왓슨-크릭(Watson-Crick) 유형의 염기 쌍형성, 휴그스틴 또는 리버스(reverse) 휴그스틴 유형의 염기 쌍형성, 등의 규칙적 패턴을 통해 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있다.
"선택적인(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하고, 상기 설명은 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는(or)"은 일반적으로 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용된다.
"환자(patient)", "대상체(subject)", 및 "개체(individual)"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고 인간 또는 비인간 동물을 지칭할 수 있다. 이들 용어는 포유동물 예컨대 인간, 영장류, 가축 동물(예를 들어, 소과, 돼지), 반려 동물(예를 들어, 갯과, 고양이) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "shRNA"는 상보적인 서열의 제1 및 제2 영역을 포함하는, 스템-루프 구조를 갖는 RNA 작용제를 지칭하고, 영역의 상보성 및 배향의 정도는 영역들 사이에서 염기 쌍형성이 일어나도록 충분하고, 제1 영역과 제2 영역은 루프 영역에 의해 결합되고, 루프는 루프 영역 내의 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체) 사이의 염기 쌍형성의 결여로부터 초래된다. shRNA는 효소 다이서(Dicer)에 대한 기질일 수 있고, 다이서 절단(Dicer cleavage)의 생성물은 RNAi에 참여할 수 있다. shRNA는 shRNA를 인코딩하는 내인성 유전자의 전사로부터 유래될 수 있거나, 또는 벡터, 예를 들어, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 상에서 세포 또는 유기체 내로 도입된 외인성 유전자의 전사로부터 유도될 수 있다. shRNA를 인코딩하는 외인성 유전자는 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 리포펙션, 뉴클레오펙션 등을 사용하여 세포 또는 유기체 내로 추가로 도입될 수 있다.
"치료적" 처리("therapeutic" treatment)는 병리의 징후를 나타내는 대상체에게 이들 징후를 감소시키거나 제거할 목적으로 투여되는 치료이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "치료한다(treat)", "치료하는", "치료" 등은 예컨대 질환 또는 장애(disorder)의 증상이 환자에 의해 경험되는 빈도를 감소시키는 것과 같이, 질환(disease) 또는 병태(condition), 및/또는 이와 연관된 증상을 제거하거나, 감소시키거나, 개선하는 것을 지칭한다. 질환 또는 병태의 치료는 질환, 병태, 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거될 것을 요구하지 않으며, 그러나 이를 배제하지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료한다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 "예방적 치료"를 포함할 수 있으며, 이는 질환 또는 병태를 가지고 있지 않으나, 질환 또는 병태의 재발(redevelop) 또는 질환 또는 병태의 재발(recurrence)할 위험이 있거나 또는 재발할 수 있는 대상체에서, 질환 또는 병태의 재발(redevelop), 또는 이전에-조절된 질환 또는 병태의 재발(recurrence)의 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다. 용어 "치료하다" 및 그의 동의어는 치료 유효량의 본원에 기재된 화합물, 예를 들어 본원에 기재된 RIPK2 억제제를 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 고려한다.
용어 "억제", "억제하는", "억제한다", 또는 "억제제"는 특정 생물학적 과정의 활성(예를 들어, 비히클 대조군에 대한 RIPK2의 활성)을 감소(reduce), 느리게(slow), 정지(halt) 또는 예방(prevent)하는 화합물의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용된 어구 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"은 질환의 증상을 완화시키는 것을 포함하여, 상기 질환 또는 병태를 예방 또는 치료(상기 질환의 발병을 지연 또는 예방, 상기 질환의 진행을 예방, 억제, 감소 또는 역전)하기에 충분하거나 효과적인 양을 지칭한다.
본원에 개시된 모든 유전자, 유전자 명칭 및 유전자 생성물은 본원에 개시된 조성물 및 방법이 적용가능한 임의의 종으로부터의 상동체에 상응하도록 의도된다. 따라서, 상기 용어는, 비제한적으로, 인간 및 마우스로부터의 유전자 및 유전자 생성물을 포함한다. 특정 종으로부터의 유전자 또는 유전자 생성물이 개시되는 경우, 본 개시내용은 단지 예시적인 것으로 의도되며, 명백하게 나타나는 문맥이 지시하지 않는 한 제한으로서 해석되어서는 안 되는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 일부 구현예에서 포유동물의 핵산 및 아미노산 서열에 관한 본원에 개시된 유전자 또는 유전자 생성물의 경우, 다른 포유동물, 어류, 양서류, 파충류 및 조류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 동물로부터의 상동성 및/또는 이종상동성 유전자 및 유전자 생성물을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 유전자, 핵산 서열, 아미노산 서열, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 인간의 것이다.
RIPK2
미세아교세포는 중추신경계(CNS)의 상주성(resident) 대식세포이다. 전신 염증 또는 신경퇴행에 반응하여, 미세아교세포는 종종 M1-유사 전염증성(proinflammatory) 상태로 지칭되는 활성화 상태가 되고, 미세아교세포의 만성 활성화는 잠재적으로 신경독성을 유발하고 신경퇴행성 질환 진행을 촉진할 수 있다. 미세아교세포의 활성화는 파킨슨병(PD) 및 알츠하이머병(AD)을 포함하는 다양한 신경퇴행성 질환에서 휴지기 성상세포의 반응성(A1) 성상세포로의 전환을 유도한다(Liddelow, S. A. 등 Nature 541, 481-487, doi:10.1038/nature21029 (2017)). α-시누클레인 및 아밀로이드-β의 비정상적인 미스폴딩 및 응집은 PD 및 AD 각각의 뉴런에서 독성 효과를 유도한다. 따라서, M1-유사 미세아교세포 및 반응성 성상세포(reactive astrocytes)의 형성을 억제할 수 있는 제제의 개발은 PD 및 AD를 포함하는 신경퇴행성 장애에 대한 보편적인 신경보호 약물로서 개발될 수 있다.
본 발명의 구현예는, 부분적으로, α-시누클레인 및 아밀로이드-β 응집체가 미세아교세포 활성화를 유도하고, TNFα, IL-1α, IL-1β, C1q 및 IL-6를 포함하는 신경독성 사이토카인을 분비함으로써 A1 성상세포 형성을 촉진한다는 발견을 기초로 한다. 결과적으로, 활성화 미세아교세포 또는 반응성 성상세포로부터 방출된 이러한 염증성 매개체는 신경 손상을 유발하고 신경퇴행성 질환의 진행에 기여한다. 따라서, 활성화된 미세아교세포 및 반응성 성상세포는 신경퇴행성 질환에서 주요 상류 활성(upstream activities)으로서 설명될 수 있다. 미세아교세포의 활성화 및 반응성 성상세포 형성의 억제는 신경퇴행 과정을 예방, 정지 및/또는 역전시키는 논리적 전략이다. 그러나, 미세아교세포 활성화를 특이적으로 표적화하기 위한 번역 방법(translational method)의 결여는 이러한 전략을 방해한다.
본원의 구현예는 미세아교세포의 활성화 및 반응성 성상세포의 형성 및 활성화된 상주 선천성 면역 세포로부터의 염증성 및 신경독성 분자의 방출을 표적화 및 차단하고; 따라서 신경퇴행성 질환의 진행을 예방, 정지 및/또는 개선하는 독특한 전략을 기재한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 또한 선택적일 수 있으며, 예를 들어 독성을 유발하도록 CNS 내의 다른 세포, 예컨대 뉴런의 정상 기능을 실질적으로 억제하지 않을 수 있다.
본원에서 상술된 바와 같이, RNA-서열분석(sequencing) 분석이 수행되었고, α-시누클레인 및 아밀로이드-β 응집체-활성화-미세아교세포가 RIPK2(수용체 상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 2)를 유의하게 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이는 인간에서 RIPK2 유전자(Silke J 등, Nat Immunol. 16(7):689-97(2015)) 및 NOD1(뉴클레오타이드 결합 올리고머화 도메인 함유 단백질 1) 뿐만 아니라 NOD2에 의해 인코딩되는 효소이다. 놀랍게도, 미세아교세포에서 RIPK2 및 NOD2의 고갈은 미세아교 세포의 활성화 및 신경독성 시토카인의 방출을 유의하게 억제하였고: 따라서 A1 성상세포의 형성을 억제하고 뉴런을 보호하는 것으로 밝혀졌다.
중요하게는, NOD2, RIPK2 및 인산화된 RIPK2(p-RIPK2) 수준이, 정상 대상체의 수준과 비교하여 PD 및 AD를 가지고 있는 환자로부터의 인간 사후 뇌 조직에서 상당히 증가됨이 밝혀졌다. 또한, 면역조직화학에 의해 명백한 바와 같이, 증가된 p-RIPK2 신호는 PD 및 AD 환자로부터의 뇌 조직에서 미세아교세포와 고도로 공-국소화된다(co-localized). 이는 RIPK2 활성화가 PD 및 AD를 포함하는 신경퇴행성 질환의 발병기전에서 중추적(pivotal) 역할을 하고, 임상적으로 적절한 치료 표적일 수 있음을 시사한다.
또한, NOD2 및 RIPK2 녹아웃(KO) 마우스에 α-시누클레인 사전형성된 원섬유(α-시누클레인 PFF)의 정위 주사로 PD를 유도했을 때, NOD2 및 RIPK2 KO 마우스는 α-시누클레인 PFF-유도된 PD 마우스와 비교하여 LB/LN-유사 병리, 마우스 뇌에서의 도파민성 변성, 및 운동 기능장애가 유의하게 개선되었을 뿐만 아니라 미세아교세포의 활성화 및 보호된 뉴런을 갖는 A1 성상세포의 형성을 감소시킨다는 것이 입증되었다.
유사하게, 아밀로이드-β 응집체의 뇌심실내 주사에 의해 AD를 유도한 NOD2 및 RIPK2 KO 마우스는 정상 아밀로이드-β-유도된 AD 마우스와 비교하여 명백하게 기억 기능이 개선되고 인지 결핍이 개선된다는 것이 입증되었다.
또한, 경구적으로 활성인 다양한 소분자 기반 RIPK2 억제제에 의한 RIPK2 활성의 억제는 (1) α-시누클레인 PFF-유도된 또는 아밀로이드-β 응집체-유도된 미세아교세포의 활성화를 억제하고, (2) 반응성 성상세포 형성을 차단하고, (3) 최종적으로 뉴런을 보호(secure)하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 기재된 본 발명 이전에, 미세아교세포의 활성화 및 반응성 성상세포의 형성에서의 RIPK2의 역할 및 RIPK2 억제제의 효과는 알려지지 않았다.
마지막으로, α-시누클레인 PFF-유도된 PD 마우스에서 공지된 RIPK2 억제제인 게피티닙의 경구 투여가 생체 내에서 미세아교세포 및 성상세포 활성화를 억제하면서 마우스에서 알파-시뉴클레인 PFF 유도된 병리를 유의하게 구제(rescue)한다는 것이 확인되었다. 전체적으로, 이러한 발견은 RIPK2가 PD 및 AD를 포함하는 신경퇴행성 장애에 대한 실행가능한 치료 표적이라는 증거를 명확하게 제공한다.
따라서, 특정 구현예에서, RIPK2 및 NOD2를 표적화함으로써 미세아교세포의 활성화 및/또는 반응성 성상세포의 형성을 억제하는 제제는 질환-변형(disease-modifying) 요법으로서 PD 및 AD에 대한 상당한 치료 잠재력을 가질 것이다.
수용체 상호작용 단백질(RIP) 키나제
수용체 상호작용 단백질(RIP; Receptor-interacting protein) 키나제는 비교적 보존된 키나제 도메인을 갖지만 별개의 비-키나제 영역을 갖는 트레오닌/세린 단백질 키나제의 군이다. 인간에서, 5개의 상이한 RIP 키나제 형태가 알려져 있으며, 이는 RIPl, RIP2, RIP3, RIR4, 및 RIP5로 명명된다. 다수의 상이한 도메인 구조, 예컨대 사멸 도메인 및 카스파제 활성화 및 동원 도메인(CARD; caspase activation and recruitment domain)이 상이한 RIP 패밀리 구성원에서 발견되었고, 이들 도메인은 각각의 RIP 키나제의 특이적 기능을 결정하는데 중요한 특징으로 간주되었다. RIP 키나제는 선천적 면역을 비롯한 상이한 생물학적 과정에 관여하지만, 그의 다운스트림 기질은 대부분 알려지지 않은 것으로 알려져 있다. 최근의 증거는 괴사의 프로그래밍된 형태인 괴사의 신호전달 경로가 사멸 수용체 유도에 반응하는 RIP1 및 RIP3의 활성화에 의존한다는 것을 보여준다. 카스파제에 의한 RIPs의 직접 절단(direct cleavage)은 괴사성 세포사를 방지하고, 이는 아폽토시스성 세포 사멸과 관련된다. 최근, RIP1 및 RIP3이 괴사에서의 이들의 역할 이외에, 수지상 세포에서 NLRP3 인플라마좀(inflammasome)의 활성화에 의해 염증에 기여하는 것으로 나타났다(Kang, T. B. 등, Immunity; 38:27-40; 2013).
수용체 상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 2(수탁 번호 NP_003812; NCBI/단백질 수탁 번호 NP_003812.1; 유전자 수탁 번호 NM_003821)는 생산적인 염증 반응을 촉진하기 위해 세포내 펩티도글리칸 센서 NOD1 및 NOD2의 다운스트림 신호전달을 변환한다. 그러나, 과도한 NOD2 신호전달은 염증성 장 질환(IBD), 유육종증(sarcoidosis), 및 염증성 관절염을 포함하는 수많은 질환과 관련되어 왔다.
뉴클레오타이드 결합 올리고머화 도메인 함유 단백질 NOD1 및 NOD2는 병원성 박테리아를 검출하기 위해 선천적 면역계에서 기능하는 세포질 Nod-유사 수용체(NLR) 계열 단백질이다(Philpott 등 Nat. Rev. Immunol., 14(2014), pp. 9-23, 2014). NOD1은 디아미노피멜산(DAP)을 함유하는 박테리아 펩티도글리칸 단편에 결합시 활성화되는 반면, NOD2는 뮤라밀 디펩타이드(MDP) 구성성분을 인식한다(Chamaillard 등, Nat. Immunol., 4(2003), pp. 702-707; Girardin 등, Science, 300(2003), pp. 1584-1587; Girardin 등, J. Biol. Chem., 278(2003), pp. 8869-8872; Inohara 등, J. Biol. Chem., 278(2003), pp. 5509-5512). NOD 활성화는 수용체 상호작용 단백질 키나제 2(RIPPK2, RIP2 또는 RICK로도 공지됨)에 의한 전염증성 신호전달을 유도하며, 이는 NOD-의존성이지만 톨(Toll) 유사 수용체 반응이 아닌 활성화에서 필수적(obligatory)이고 특이적(specifid)인 역할을 한다(Park 등, J. Immunol., 178(2007), pp. 2380-2386).
RIPK2에 의한 신호전달은 Ser/Thr 및 Tyr 이중 키나제 활성을 갖는 N-말단 키나제 도메인((Dorsch 등 Cell. Signal., 18(2006), pp. 2223-2229; Tigno-Aranjuez 등, Genes Dev., 24(2010), pp. 2666-2677), 뿐만 아니라 활성화된 NOD로 CARD-CARD 도메인 어셈블리를 매개하는 C-말단 카스파제 활성화 및 동원 도메인(CARD) (Inohara 등, J. Biol. Chem., 274(1999), pp. 14560-14567; Ogura 등, J. Biol. Chem., 276(2001), pp. 4812-4818)에 의존적이다. 일단 관여되면, RIPK2는 자가인산화(Dorsch 등, 2006)에 의해 활성화되고 비-분해적 폴리유비퀴틴화를 위해 XIAP(아폽토시스의 X-연결된 억제제) 및 다른 E3 리가제에 의해 추가로 표적화된다(Bertrand 등, PLoS One, 6(2011), p. e22356; Damgaard 등, Mol. Cell, 46(2012), pp. 746-758; Tao 등, Curr. Biol., 19(2009), pp. 1255-1263; Tigno-Aranjuez 등, Mol. Cell. Biol., 33(2013), pp. 146-158; Yang 등, J. Biol. Chem., 282(2007), pp. 36223-36229; Yang 등, Nat. Immunol., 14(2013), pp. 927-936). 유비퀴틴-접합된 단백질은 후속으로 TAK1 및 IKK 키나제를 활성화하고, 미토겐-활성화 단백질 키나제 및 핵 인자 κB(NF-κB) 신호전달 경로 둘 모두의 상향조절로 이어진다(Kim 등, J. Biol. Chem., 283(2008), pp. 137-144; Park 등, J. Immunol., 178(2007), pp. 2380-2386). 또한, RIPK2는 NOD과 자가포식 인자 ATG16L1 사이의 신호전달에 의해 항균 오토파아지 반응을 유도한다(Cooney 등, Nat. Med., 16(2010), pp. 90-97; Homer 등, J. Biol. Chem., 287(2012), pp. 25565-25576).
RIPK2 억제제
RIPK2 활성의 억제는 전형적으로 다음 중 적어도 하나 이상에 의해 매개된다: RIPK2의 발현을 감소시키거나, 억제하거나, 예방하고, RIPK2의 기능성을 상쇄시키고, 그리고 RIPK2 분해를 유도한다. 특정 구현예에 따르면, RIPK2 활성의 억제는 RIPK2의 발현을 감소, 억제 또는 예방함으로써 매개된다. RIPK2 활성의 억제는 RIPK2 단백질, 유전자 또는 mRNA와 상호작용함으로써 직접적으로 또는 RIP-매개 활성 또는 발현과 관련된 단백질, 유전자 또는 mRNA와의 상호작용에 의해 간접적으로 매개될 수 있다.
상이한 종류(categories)의 RIPK2 억제제가 본 조성물 및 방법에 적합하며, 이는 소분자, 항체, 핵산 분자(DNA, RNA, 예컨대 shRNA, siRNA, 안티센스 분자 등) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 이는 RIPK2의 발현, 프로세싱, 번역후 변형, 또는 활성, 또는 RIPK2를 수반하는 생물학적 경로에서의 분자를 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 RIPK2의 발현, 프로세싱, 번역후 변형, 또는 활성을 억제(예를 들어, 특이적으로 억제)할 수 있다. 다른 구현예에서, RIPK2 억제제는 스플라이싱되지 않은 RIPK2 유전자의 발현, 프로세싱, 번역후 변형, 또는 활성을 억제(예를 들어, 특이적으로 억제)할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RIPK2 억제제는, 예를 들어, RIPK2의 발현, 프로세싱, 번역후 변형, 또는 활성, 또는 RIPK2를 수반하는 생물학적 경로에서의 분자를 특이적으로 또는 직접적으로 억제하도록 작용하는 세포내 결합 분자일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "세포내 결합 분자"는 단백질 또는 단백질을 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA 분자)에 결합함으로써 단백질의 프로세싱 발현 또는 활성을 억제하도록 세포내 작용하는 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 하기에 더욱 상세히 기재된 세포내 결합 분자의 예는 안티센스 핵산, 세포내 항체, RIPK2 또는 RIPK2를 수반하는 생물학적 경로에서의 분자의 상호작용을 억제하는 펩타이드 화합물 및 RIPK2 활성 또는 RIPK2를 수반하는 생물학적 경로에서 분자의 활성을 특이적으로 또는 직접적으로 억제하는 화학 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 효소적(enzymatic) 핵산일 수 있다. 주어진 유전자의 발현은 효소적 핵산에 의해 억제될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "효소적 핵산"은 유전자의 인접 핵산 서열에 대해 상보성을 가지며 유전자를 특이적으로 절단할 수 있는 기질 결합 영역을 포함하는 핵산을 지칭한다. 효소적 핵산 기질 결합 영역은 유전자의 인접 핵산 서열에 대해 예를 들어, 50-100% 상보적, 75-100% 상보적, 90-100% 상보적, 또는 95-100% 상보적일 수 있다. 효소적 핵산은 또한 염기, 당, 및/또는 포스페이트 기에서의 변형을 포함할 수 있다. 본 방법에 사용하기 위한 예시적인 효소적 핵산은 리보자임이다. 용어 효소적 핵산은 예를 들어, 리보자임, 촉매 RNA, 효소적 RNA, 촉매 DNA, 압타자임 또는 압타머 결합 리보자임, 촉매 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오자임, DNAzyme, 및 RNAzyme과 상호교환적으로 사용된다.
소분자(small molecules): 특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 RIPK2를 억제하는(예를 들어, 선택적으로 억제하는) 하나 이상의 소분자를 포함할 수 있다. 적합한 소분자 RIPK2 억제제는 당해 분야에서 알려진 것 중 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 소분자는 게피티닙(IRESSATM, AstraZeneca), SB203580 (Gretchen M. Argast 등, Mol. Cell. Biochem. Vol. 268, 129-140(2005)), OD36, OD38 (J. T. Tigno-Aranjuez 등, J. Biol Chem. Vol. 289 No. 43, 29651-29664(2014)), 포나티닙, 소라페닙, 레고라페닙 또는 GSK583(Pamela A Haile 등, J. Med. Chem. Vol 59 N. 10, 4867-4880(2016)), 및 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 시험관내 RIPK2 키나제 검정에서 게피티닙에 대해 관찰된 IC50 값과 유사(5배 이내)하거나 더 우수한 IC50 값을 갖는다.
비제한적인 유용한 소분자 RIPK2 억제제는 또한 다음의 미국 또는 PCT 출원 공개에 기재된 것들 중 임의의 것을 포함한다: US20160024114A1; WO2011106168A1; US2013/0251702A1; US20180118733A1; WO2016042087A1; WO2018052773A1; WO2018052772A1; WO2011112588A2; WO2011120025A1; WO2011120026A1; WO2011123609A1; WO2011140442A1; WO2012021580A1; WO2012122011A2; WO2013025958A1; WO2014043437A1; WO2014043446A1; WO2014128622A1; WO2016172134A2; WO2017046036A1; WO2017182418A1; WO2012003544A1; 이들 각각의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
비제한적인 적합한 소분자 RIPK2 억제제는 또한 다음에 기재된 것들 중 임의의 것을 포함할 수 있다: Cruz J. V., 등 "Identification of Novel protein kinase receptor type 2 inhibitors using pharmacophore and structure-based virtual screening," Molecules 23, 453, 페이지 1-25(2018); Sala M., 등, "Identification and characterization of novel receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 inhibitors using structural similarity analysis, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 365:354-367(2018); He X, 등, "Identification of potent and selective RIPK2 inhibitors for the treatment of inflammatory diseases," ACS Med Chem Lett 8:1048-1053(2017); 이들 각각의 내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 CSLP 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다:
Figure pct00001
상기 식에서:
X는 메틸 또는 NH2이고,
R1은 수소, F, 또는 메톡시이고,
R2는 수소, 하이드록실, 또는 메톡시이고, 그리고
R3은 -NHSO2(n-프로필)이다. RIPK2 억제제로서 CSLP 분자의 예는 기재되었고, 예를 들어, Hrdinka M. 등, The EMBO Journal, e99372, 페이지 1-16(2018)를 참고하며, 이들의 내용은 전체적으로 참조로 본원에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 CSLP 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있고, 여기서 X는 NH2이고, R1은 메톡시이고, R2는 메톡시이고, 그리고 R3은 -NHSO2(n-프로필)이다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 CSLP 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있고, 여기서 X는 NH2이고, R1은 F이고, R2는 메톡시이고, 그리고 R3은 -NHSO2(n-프로필)이다.
본원에 기재된 구현예 중 임의의 것에서, RIPK2 억제제는 또한 게피티닙, 소라페닙, 레고라페닙, 포나티닙, SB203580, OD36(6-클로로-10,11,14,17-테트라하이드로-13H-1,16-에테노-4,8-메테노-1H-피라졸로[3,4-g][1,14,4,6]디옥사디아자사이클로헥사데신), OD38([4,5,8,9-테트라하이드로-7H-2,17-에테노-10,14-메테노-1H-이미다조[1,5-g][1,4,6,7,12,14]옥사펜타아자사이클로헥사데신]), WEHI-435(N-(2-(4-아미노-3-(p-톨릴)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일)-2-메틸프로필)이소니코틴아미드), 또는 GSK583(6-(tert-부틸설포닐)-N-(5-플루오로-1H-인다졸-3-일)퀴놀린-4-아민) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 일부 특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 게피티닙 또는 GSK583 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
특정 구현예에서, 소분자 RIPK2 억제제는 RIP 키나제가 관여하는 하나 이상의 경로를 억제할 수 있다. 예를 들어, RIPK2 키나제는 다운스트림 NF-κB, MAPK, 및 자가포식 경로의 개시를 포함하는 NOD2 활성화에 필수적이다(J. T. Tigno-Aranjuez 등, J. Biol Chem. Vol. 289 No. 43, 29651-29664(2014); Kobayashi K., 등, Nature 416, 194-199(2002); Park J. H., 등, J. Immunol. 178, 2380-2386(2007); Homer C. R., 등, J. Biol. Chem. 287, 25565-25576 18-20(2012)). 유용한 소분자 RIPK2 억제제는 아래에 예시된 바와 같이 하나 이상의 검정에 의해 확인될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드: 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 RIPK2를 인코딩하는 유전자 또는 RIP 키나제를 수반하는 경로의 분자(예를 들어, RIPK2와 상호작용하는 분자), 또는 이러한 유전자의 일부, 또는 안티센스 핵산 분자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터에 대해 상보적인 안티센스 핵산 분자이다. RIPK2 안티센스의 일부 예는 미국 특허 제6,426,221호에 기재되어 있고, 이들의 내용은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다. 세포의 특정 단백질의 발현을 하향조절하기 위한 안티센스 핵산의 사용은 당해 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Weintraub, H., 등 1986. Reviews--Trends in Genetics, Vol. 1(1); Askari, F. K., 등 1996. N. Eng. Med. 334, 316-318; Bennett, M. R., 등 1995. Circulation 92, 1981-1993; Mercola, D., 등 1995. Cancer Gene Mer. 2, 47-59; Rossi, J. J., 1995. Br. Med. Bull. 51, 217-225; Wagner. R. W., 1994. Nature 372, 333-335를 참고하라). 안티센스 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자(예를 들어, mRNA 서열)의 코딩 가닥에 대해 상보적이고 따라서 다른 핵산 분자의 코딩 가닥에 수소결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. mRNA의 서열에 상보적인 안티센스 서열은 mRNA의 코딩 영역, mRNA의 5' 또는 3' 비번역 영역, 또는 코딩 영역과 비번역 영역을 브릿징하는 영역(예를 들어, 5' 비번역 영역과 코딩 영역의 접합부에서)에서 발견되는 서열에 상보적일 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 mRNA를 인코딩하는 유전자의 조절 영역, 예를 들어 전사 개시 서열 또는 조절 인자에 대한 서열에 상보적일 수 있다. 일 구현예에서, 안티센스 핵산은 코딩 가닥 상의 또는 mRNA의 3' 비번역 영역 내의 개시 코돈에 선행하거나 이에 걸치는 영역에 대해 상보적이도록 설계된다. RIP 키나제 유전자의 코딩 가닥에 대한 공지된 뉴클레오타이드 서열 및 따라서 RIP 키나아제 mRNA의 공지된 서열이 주어지면, 본 발명의 안티센스 핵산은 Watson 및 Crick 염기 쌍형성의 규칙에 따라 설계될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RIP 키나제의 번역 개시 부위를 둘러싸는 영역에 대해 상보적일 수 있고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에서 알려진 절차를 사용하는 화학적 합성 및 효소적 결찰 반응을 사용하여 구축될 수 있다. 세포에서의 발현을 억제하기 위해, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다.
대안적으로, 안티-센스 핵산은 cDNA의 전부 또는 일부가 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 핵산은 관심 표적 핵산에 대해 안티센스 배향일 것이다). 안티센스 발현 벡터는 예를 들어, 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약화된 바이러스의 형태일 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 표준 형질감염 기법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전형적으로 대상체에 투여되거나, 또는 단백질을 인코딩하는 세포성 mRNA 및/또는 게놈 DNA와 혼성화하거나 또는 이에 결합하여, 예를 들어 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 단백질의 발현을 억제하도록 in situ로 생성된다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예는 조직 부위에 직접적으로 주사하는 것을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포를 표적으로 하도록 변형되고, 그 다음 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여를 위해, 안티센스 분자는, 예를 들어 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 항체에 연결시킴으로써, 선택된 세포 표면 상에서 발현된 수용체 또는 항원과 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 본원에 기재된 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머성(anomeric) 핵산 분자이다. α-아노머성 핵산 분자는, β-단위와는 반대로, 가닥이 서로에 대해서 평행을 이루는 상보성 RNA과의 특이적 이중-가닥 하이브리드를 형성한다(Gautier, C., 등 1987. Nucleic Acids. Res. 15, 6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-O-메틸리보뉴클레오타이드(Inoue, H., 등 1987. Nucleic Acids Res. 15, 6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue, H., 등 1987. FEBS Lett. 215, 327-330)를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 리보자임(ribozyme)이다. 리보자임은 상보성 영역을 갖는 단일-가닥 핵산, 예컨대 mRNA를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예를 들어, 헤머헤드 리보자임(Haselhoff, J., 등 1988. Nature 334, 585-591에 기재됨))는 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단하는 데 사용될 수 있어서, mRNA의 번역을 억제한다. 대안적으로, 유전자 발현은 표적 세포에서 유전자의 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성하기 위해 유전자의 조절 영역(예를 들어, RIP 키나제 프로모터 및/또는 인핸서)에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 표적으로 함으로써 억제될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Helene, C., 1991. Anticancer Drug Des. 6(6), 569-84; Helene, C., et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; 및 Maher, L. J., 1992. Bioassays 14(12), 807-15]을 참조한다.
다른 구현예에서, RNAi를 촉진하는 화합물이 RIP 키나제를 수반하는 생물학적 경로에서 임의의 하나 이상의 RIP 키나제 또는 분자의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "RNA 간섭(interference)" 또는 "RNAi"는, 일반적으로 표적 분자(예를 들어, 표적 유전자, 단백질 또는 RNA)가 하향조절되는 서열-특이적 또는 선택적 과정을 지칭한다. 특정 구현예에서, "RNA 간섭" 또는 "RNAi"의 과정은 RNA 분자, 예를 들어 세포 내의 RNA 분자의 분해를 특징으로 하며, 상기 분해는 RNA 작용제에 의해 촉발된다. 분해는 효소적, RNA-유도된 침묵 복합체(RISC; RNA-induced silencing complex)에 의해 촉매된다. RNAi는 자연적으로 세포에서 발생하여 외래 RNA(예를 들어, 바이러스 RNA)를 제거한다. 천연 RNAi는 분해 메카니즘을 다른 유사한 RNA 서열로 유도하는 유리 dsRNA로부터 절단된 단편을 통해 진행된다. 대안적으로, RNAi는 예를 들어 표적 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 사람의 손에 의해 개시될 수 있다. RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 사용하여 dsRNA와 동일한 서열을 함유하는 메신저 RNA(mRNA)을 분해하는 전사후, 표적화된 유전자-침묵 기술이다(Sharp, P. A., et al. 2000. Science 287, 5462:2431-3; Zamore, P. D., et al. 2000. Cell 101, 25-33. Tuschl, T., et al. 1999. Genes Dev. 13, 3191-3197; Cottrell T. R., et al., 2003. Trends Microbiol. 11, 37-43; Bushman F., 2003. Mol. Therapy 7, 9-10; McManus M. T., et al. 2002. Nat Rev Genet 3, 737-47). 상기 과정은 내인성 리보뉴클레아제가 더 긴 dsRNA를 더 짧은, 예를 들어, 작은 간섭 RNA 또는 siRNA로 지칭되는 21-23개의 뉴클레오타이드 길이의 RNA로 절단할 때 일어난다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작은 간섭 RNA"("siRNA") (또한 당업계에서 "짧은 간섭 RNA"로도 지칭됨)는 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드 길이(뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 용어 "뉴클레오타이드"), 예를 들어 약 15 내지 25개 뉴클레오타이드의 길이, 또는 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 작용제와 같은 RNA 작용제를 지칭하고, 가닥은 RNA 간섭을 지시하거나 매개할 수 있는 예를 들어 1, 2 또는 3개의 오버행 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함하는 오버행 말단을 임의로 갖는다. 자연 발생 siRNA는 세포의 RNAi 기구(예를 들어, 다이서(Dicer) 또는 그의 동족체)에 의해 더 긴 dsRNA 분자(예를 들면, 25개 초과의 뉴클레오타이드 길이)로부터 생성된다. 이어서, 더 작은 RNA 절편은 표적 mRNA의 분해를 매개한다. RNAi의 합성을 위한 키트는 예를 들어 New England Biolabsor Ambion으로부터 상업적으로 입수가능하다. 일부 구현예에서, 안티센스 RNA에 사용하기 위한 상기 기재된 화학물질 중 하나 이상은 RNAi를 매개하는 분자에 사용될 수 있다.
대안적으로, RNAi를 촉진하는 화합물은 세포, 예를 들어, 대상체에서 세포에서 발현되어 RIP 키나제 또는 RIP 키나아제를 포함하는 생물학적 경로에서의 분자의 발현을 억제할 수 있다. siRNA와 대조적으로, shRNA는 마이크로 RNA(miRNA)의 천연 전구체를 모방하고 유전자 침묵화 경로의 최상부에 들어간다. 이러한 이유로, shRNA는 전체 천연 유전자 침묵 경로를 통해 공급됨으로써 유전자 침묵을 더욱 효율적으로 매개하는 것으로 여겨진다. shRNA 분자의 필수 요소는 이중체 또는 이중가닥 줄기 부분(double-stranded stem portion)을 형성하기 위해 어닐링 또는 혼성화하기에 충분한 상보성을 갖는 제1 부분 및 제2 부분을 포함한다. 두 부분은 완전히 또는 완벽하게 상보적일 필요는 없다. 제 1 및 제 2 "줄기" 부분은 shRNA의 다른 부분에 어닐링 또는 혼성화하기에 불충분한 서열 상보성을 갖는 서열을 갖는 부분에 의해 연결된다. 이러한 후자 부분은 shRNA 분자에서 "루프" 부분으로 지칭된다. shRNA 분자는 siRNA를 생성하도록 처리된다. shRNA는 또한 하나 이상의 벌지(bulge), 즉, 줄기의 일부에 작은 뉴클레오타이드 "루프"를 생성하는 여분의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1-, 2- 또는 3-뉴클레오티드 루프를 포함할 수 있다. 줄기 부분은 동일한 길이일 수 있거나, 또는 한 부분은 예를 들어 1-5 뉴클레오티드의 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 shRNA는 상기 기재된 원하는 siRNA 분자의 서열을 포함한다. 이러한 구현예에서, shRNA 전구체는 생체 내에서 생산되기를 원하는 siRNA의 21 내지 23개 정도의 뉴클레오타이드 서열을 이중 줄기(duplex stem)에서 포함한다.
생체내 세포로의 효율적인 전달은 세포외 환경, 특히 혈청 단백질로부터의 특이적 표적화 및 실질적인 보호를 필요로 한다. 특이적 표적화를 달성하는 한 방법은 표적화 모이어티(targeting moiety)를 iRNA 작용제(agent)에 접합시키는 것이다. 표적화 모이어티는 iRNA 작용제를 요구되는 표적 부위에 표적화하는 것을 돕는다. 표적화 모이어티가 전달(delivery)을 개선할 수 있는 한 방법은 수용체 매개된 세포내이입(endocytotic) 활성에 의한 것이다. 이러한 흡수 메커니즘은 막 구조의 함입(invagination)을 통해 또는 전달 시스템과 세포막과의 융합에 의해 막으로 둘러싸인 영역의 내부로 막 수용체에 결합된 iRNA 작용제의 이동을 포함한다. 이 과정은 수용체에 대한 특이적 리간드의 결합 후 세포-표면 또는 막 수용체의 활성화를 통해 개시된다. 당류 예컨대 갈락토스, 만노스, 만노스-6-포스페이트, 펩타이드 및 단백질 예컨대 트랜스페린, 아시알로당단백질, 비타민 B12, 인슐린 및 표피 성장 인자(EGF)를 인식하는 시스템을 포함하여 많은 수용체 매개된 세포내이입 시스템이 알려져 있으며 연구되었다. 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R)는 간세포에 매우 풍부한 고용량(high capacity) 수용체이다. ASGP-R는 D-Gal보다 N-아세틸-D-갈락토실아민(GalNAc)에 대해 50배 더 높은 친화도를 보여준다. 이전의 연구는 nM 친화도를 달성하기 위해 다원자가(multivalency)가 요구되는 반면, 당 사이의 간격이 또한 중요하다는 것을 나타내었다.
D-만노스에 대한 고친화성를 갖는 만노스 수용체는 또 다른 중요한 탄수화물 기반 리간드-수용체 쌍을 나타낸다. 만노스 수용체는 예컨대 대식세포 및 아마도 수지상 세포와 같은 특정 세포 유형에서 고도로 발현된다. 만노스 콘주게이트뿐만 아니라 만노실화된 약물 담체가 약물 분자를 해당 세포에 표적화하는데 성공적으로 사용되었다. 예를 들어, Biessen 등(1996) J. Biol. Chem. 271, 28024-28030; Kinzel 등(2003) J. Peptide Sci. 9, 375-385; Barratt 등(1986) Biochim. Biophys. Acta 862, 153-64; Diebold 등(2002) Somat. Cell Mol. Genetics 27, 65-74를 참고하라.
친유성 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 또는 지방산은, 고친수성 분자 예컨대 핵산에 부착될 때, 실질적으로 혈장 단백질 결합 및 결과적으로 순환 반감기를 향상시킬 수 있다. 또한, 특정 혈장 단백질, 예컨대 지질단백질에 대한 결합은, 상응하는 지질단백질 수용체(예를 들어, LDL-수용체, HDL-수용체 또는 포착제 수용체 SR-B1)를 발현시키는 특정 조직에서 흡수를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, Bijsterbosch, M. K., Rump, E. T. 등(2000) Nucleic Acids Res. 28, 2717-25; Wolfrum, C., Shi, S. 등(2007) 25, 1149-57을 참고하라. 친유성 콘주게이트는 또한 표적화된 전달 접근법(targeted delivery approach)의 세포내 이동조절을 개선하기 위해 표적화 리간드와 조합하여 사용될 수 있다.
PULMOZYMETM은 네뷸라이저 시스템에서 즉시 사용가능한 액체 단백질 제형으로서 제공된다. 네뷸라이저 시스템에 더하여, 약물 및 다른 의약품의 폐 투여가 계량 투여 흡입기로서 공지된 적합한 액체 기반 흡입기에 의한 흡입을 위해 제형화된 흡입성 용액 또는 건조 분말 흡입기(DPI)로서 공지된 적절한 흡입기에 의한 흡입을 위한 건조 분말 제형의 제공에 의해 달성될 수 있다.
세포내 항체: RIP 키나제 또는 RIP 키나아제를 수반하는 생물학적 경로의 분자의 발현 및/또는 활성을 억제하는데 사용될 수 있는 또 다른 유형의 억제 화합물 은 상기 단백질에 특이적인 세포내 항체이다. 세포에서 단백질 기능을 억제하기 위한 세포내 항체의 사용은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Carlson, J. R., 1988. Mol. Cell. Biol. 8, 2638-2646; Biocca, S., 등 1990. EMBO. J. 9, 101-108; Werge, T. M., 등 1990. FEBS Letters 274, 193-198; Carlson, J. R., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7427-7428; Marasco, W.A., 등, 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893; Biocca, S., 등 1994. BioTechnology 12, 396-399; Chen, S. Y., 등 1994. Human Gene Therapy 5, 595-601; Duan, L., 등 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5075-5079; Chen, S. Y., 등 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5932-5936; Beerli, R. R., 등 1994. J. Biol. Chem. 269, 23931-23936; Beerli, R. R., 등 1994. Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, 666-672; Mhashilkar, A. M., 등 1995. EMBO J. 14, 1542-1551; Richardson, J. H., 등 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3137-3141; PCT Publication No. WO 94/02610(Marasco 등); 및 PCT Publication No. WO 95/03832(Duan 등)을 참고하라).
세포내 항체를 사용하여 단백질 활성을 억제하기 위해, 벡터를 세포 내로 도입시, 항체 사슬이 세포의 세포내 구획에서 기능적 항체로서 발현되도록 하는 형태로 항체 사슬을 인코딩하는 재조합 발현 벡터를 제조한다. 본 발명의 방법에 따른 RIP 키나제 활성의 억제를 위해, 단백질에 특이적으로 결합하는 세포내 항체가 세포의 핵 내에서 발현된다. 세포내 항체의 핵 발현은 항체 경쇄 및 중쇄 유전자로부터 N-말단 소수성 선도 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제거하고, 경쇄 및 중쇄 유전자의 N- 또는 C-말단에서 핵 국소화 신호를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 부가하여 달성될 수 있다(예를 들어, Biocca. S., 등 1990. EMBO J. 9, 101-108; Mhashilkar, A. M., 등 1995. EMBO. J. 14, 1542-1551를 참고하라). 세포내 항체 사슬의 핵 표적화에 사용될 수 있는 핵 국소화 신호는 SV40 Large T 항원의 핵 국소화 신호이다(Biocca, S., 등 1990. EMBO J. 9, 101-108; Mhashilkar, A. M., 등 1995. EMBO J. 14, 1542-1551을 참고하라).
유전자 편집 작용제(Gene Editing Agent): 특정 구현예에서, 억제제는 유전자 편집 작용제이다. 유전자 편집 작용제는 전사 및 번역을 억제하거나 방지하기 위해 전체 유전자 또는 이의 부분을 불활성화하거나 제거할 수 있다. 예를 들어, 엔도뉴클레아제, 군집화된 균일 간격 짧은 회문성 반복(CRISPR) 뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 다른 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 또는 이들의 조합의 아르고노트 계열(Argonaute family)을 포함하는 임의의 적합한 뉴클레아제 시스템이 사용될 수 있다. 그 전체가 본원에 포함되어 있는 문헌[Schiffer, 2012, J. Virol. 88(17):8920-8936]을 참고한다.
특정 구현예에서, 유전자 편집 작용제는 CRISPR-관련된 엔도뉴클레아제/Cas(CRISPR/Cas)이다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 CRISPR/Cas 단백질, 변형된 CRISPR/Cas 단백질, 또는 야생형 또는 변형된 CRISPR/Cas 단백질의 단편일 수 있다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 핵산 결합 친화도 및/또는 특이성을 증가시키고, 효소적 활성을 변경시키고/거나 단백질의 또 다른 특성을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas-유사 단백질의 뉴클레아제(즉, DNase, RNase) 도메인은 변형되거나, 결실되거나 불활성화될 수 있다. 대안적으로, CRISPR/Cas-유사 단백질은 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 절단될 수 있다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 또한 단백질의 효과기 도메인의 활성을 최적화하기 위해 절단되거나 변형될 수 있다. 일반적으로, CRISPR/Cas 단백질은 적어도 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 가이드 RNA와 상호작용한다. CRISPR/Cas 단백질은 또한 뉴클레아제 도메인(즉, DNase 또는 RNase 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, RNAse 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 뿐만 아니라 다른 도메인을 포함할 수 있다.
구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III 시스템일 수 있다. 적합한 CRISPR/Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(또는 CasA), Cse2(또는 CasB), Cse3(또는 CasE), Cse4(또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Cas 시스템에서 유래된다. 다른 구현예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질에서 유래된다.
특정 구현예에서, 상기 시스템은 아르고노트 뉴클레아제 시스템이다. 아르고노트는 표적을 절단하기 위한 가이드로서 5' 인산화된 짧은 단일-가닥 핵산을 사용하는 엔도뉴클레아제의 패밀리이다(Swarts, D.C. 등 The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743-753(2014)). Cas9와 유사하게, 아르고노트는 유전자 발현 억제 및 외래 핵산에 대한 방어에서 중요한 역할을 한다(Swarts, D.C. 등 Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743-753(2014); Makarova, K.S., 등 Biol. Direct 4, 29(2009). Molloy, S. Nat. Rev. Microbiol. 11, 743(2013); Vogel, J. Science 344, 972-973(2014). Swarts, D.C. 등 Nature 507, 258-261(2014); Olovnikov, I., 등 Mol. Cell 51, 594-605(2013)). 그러나, 아르고노트는 많은 방식으로 Cas9와 상이하다(Swarts, D.C. 등 Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743-753(2014)). Cas9는 원핵생물에만 존재하는 반면, 아르고노트는 진화를 통해 보존되고 실질적으로 모든 유기체에 존재하고; 대부분의 아르고나트는 단일-가닥(ss) RNA와 회합되고 RNA 침묵화에서 중추적 역할을 갖지만, 일부 아르고나트는 ssDNA에 결합하고 표적 DNA를 절단한다(Swarts, D.C. 등 Nature 507, 258-261(2014); Swarts, D.C. 등 Nucleic Acids Res. 43, 5120-5129(2015)). 가이드 RNA는 정확한 Cas9 결합을 위한 3' RNA-RNA 혼성화 구조를 가져야 하는 반면, 가이드의 특정 공통(consensus) 이차 구조는 아르고노트 결합에 필요하지 않으며; Cas9는 PAM의 상류의 표적만을 절단할 수 있는 반면, 아르고노트에는 표적에 특정 서열이 요구되지 않는다. 일단 아르고노트 및 가이드가 결합하면, 이들은 서로의 물리화학적 특성에 영향을 미치고, 핵산-결합 단백질의 보다 전형적인 동력학적 특성을 갖는 전체로서 작용한다(Salomon, W.E., 등 Cell 162, 84-95(2015)).
아르고노트 단백질은 전형적으로 ~100 kDa의 분자량을 가지며, 피위-아르고노트-즈윌(Piwi-Argonaute-Zwille; PAZ) 도메인 및 PIWI 도메인을 특징으로 한다. 고세균(archaeal) 및 박테리아 아르고노트 단백질의 결정학적 연구는 다이서 효소에 공통인 PAZ 도메인이 회합되는 작은 RNA의 3'-돌출 말단에 대한 특이적 결합 포켓을 형성함을 밝혀냈다(Jinek 및 Doudna, (2009) Nature 457, 405-412)). PIWI 도메인의 구조는 박테리아 RNAse H의 구조와 유사하며, 이는 RNA-DNA 하이브리드의 RNA 가닥을 절단하는 것으로 나타났다(Jinek 및 Doudna, (2009) Nature 457, 405-412)). 더욱 최근에, 슬라이서(Slicer) 활성으로도 지칭되는 miRNA 효과기 복합체의 촉매 활성이 아르고노트 단백질 자체에 존재한다는 것이 발견되었다.
AGO1, AGO2, AGO3 및 AG04로 구성되는 인간 Ago 서브패밀리의 구성원은 편재하여 발현되고 miRNA 및 siRNA와 회합된다. Ago 단백질은 종 전체에 걸쳐 보존되며, 많은 유기체는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)에서 1개, 드로소필라(Drosophila)에서 5개, 인간에서 8개, 아라비돕시스(Arabidopsis)에서 10개 내지 C. 엘레간스(C. elegans)에서 27개 범위의 다수의 패밀리 구성원을 발현한다(Tolia 및 Joshua-Tor, (2007) Nat. Chem. Biol. 3, 36-43). 아르고노트 단백질은 또한 사카로마이세스 카스텔리를 포함하는 일부 종의 출아 효모에 존재한다. S. 카스텔리(S. castellii)는 동물, 식물 및 다른 진균에서 발견되는 정규(canonical) 다이서 단백질과 상이한 다이서 단백질에 의해 생성되는 siRNA를 발현하는 것으로 밝혀졌다(Drinnenberg 등, (2009) Science 326, 544-550).
구조적 연구는 가이드 가닥 단독 또는 가이드 DNA 가닥 및 표적 RNA 이중체와의 복합체에서 테르무스 써모필루스(Thermus thermophiles) 아르고노트로 확장되었다. 이 분석은, 복합체의 구조가 2개의 엽(lobe)으로 분할되는 것을 나타내었다. 하나의 엽은 링커 영역 L1을 통해 N-말단 도메인에 연결된 PAZ 도메인을 함유한다. 제2 엽은 중간(MID) 도메인(PAZ와 PIWI 도메인 사이에 위치됨) 및 PIW1 도메인으로 구성된다. 아르고노트가 결합하는 작은 RNA의 5' 포스페이트는 MID 도메인의 특이적 결합 포켓에 위치한다(Jinek 및 Doudna, (2009) Nature 457, 405-412). 아르고노트 단백질과 가이드 DNA 또는 RNA 분자 사이의 접촉은 작은 RNA 또는 DNA의 당-포스페이트 골격과의 상호작용에 의해 지배되고; 따라서, RNA 또는 RNA 가이드 가닥의 염기는 상보적인 표적 RNA와의 염기쌍 형성에 자유롭다. 상기 구조는, 표적 mRNA 염기가 가이드 DNA 가닥과 쌍을 이루지만, 단백질과 접촉하지 않음을 나타낸다(Wang 등, (2008a) Nature 456, 921-926; Wang, Y. 등, (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1259-1266; Wang 등, (2008b) Nature 456, 209-213).
게놈 편집을 위한 아르고노트 엔도뉴클레아제, 예를 들어 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트(NgAgo)의 유용한 특징은 하기를 포함한다: (i) NgAgo는 가이드-표적 미스매치에 대한 낮은 내성(tolerance)을 가지며; (ii) 5' 인산화된 짧은 ssDNA는 포유동물 세포에서 희귀하며, 이는 세포 올리고뉴클레오타이드 미스가이딩 NgAgo의 가능성을 최소화하고; 그리고 (iii) NgAgo는 "1-가이드-페이스풀(one-guide-faithful)" 법칙을 따르고, 즉, 가이드는 NgAgo 단백질이 발현 과정에 있을 때만 로딩될 수 있고, 일단 로딩되면, NgAgo는 37℃에서 그의 gDNA를 다른 유리 ssDNA와 교환할 수 없다.
따라서, 특정 구현예에서, 아르고노트 엔도뉴클레아제는 단일 가닥 RNA(ssRNA) 또는 단일 가닥 DNA(ssDNA)와 회합하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 아르고노트는 나트로노박테리움 그레고리에서 유래된다. 다른 구현예에서, 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트(NgAgo)는 야생형 NgAgo, 변형된 NgAgo, 또는 야생형 또는 변형된 NgAgo의 단편이다. NgAgo는 핵산 결합 친화도 및/또는 특이성을 증가시키고, 효소 활성을 변경하고/거나 단백질의 다른 특성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, NgAgo의 뉴클레아제(예를 들어, DNase) 도메인은 변형되거나, 결실되거나 불활성화될 수 있다.
RIP 키나제 또는 RIP 키나제를 수반하는 생물학적 경로의 분자의 활성을 특이적으로 억제하는데 사용될 수 있는 다른 억제제는 예를 들어, RIP키나제-2의 발현, 프로세싱, 번역후 변형, 및/또는 활성을 직접적으로 억제하는 화학적 화합물이다. 이러한 화합물은, 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 화합물을 선택하는 스크리닝 분석법을 사용하거나 다른 기술 인식 기법을 사용하여 확인될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 기재된 억제성 화합물 중 하나 이상은 치료 용도의 약제학적 조성물을 생성하기 위해 표준 약제학적 프로토콜에 따라 제형화된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그것의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다.
스크리닝 검정(Screening Assays)
특정 양태에서, 본 발명은 RIP 키나제를 억제하는 데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 억제제는 RIPK2의 억제제이다. 스크리닝 검정의 예는, 비제한적으로 유전자 발현 검정, 전사 검정, 키나제 검정, 면역 검정, 등을 포함한다.
RIP 키나제의 억제제로서 스크리닝하기 위한 소분자는, 상업적으로 입수가능한 라이브러리, 예를 들어, NANOCYCLIX®(Oncodesign)로부터 수득될 수 있다. 화합물 라이브러리의 스크리닝은 세포, 예컨대 곤충 세포에서 발현되는 재조합적으로 정제된 RIPK2를 키나제로서 사용하고 RBER-CHKtide를 기질로서 사용하는 시험관내 방사선측정 키나제 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 억제제의 다양한 농도가 50 ㎕ 반응 당 약 50 ng의 재조합 RIPK2 및 2 ㎍의 재조합 RBER-CHKtide 기질을 사용하여 3 × 10-6 m 내지 9 × 10-11 m의 범위에서 시험될 수 있다. 이어서, 100 nm 미만의 시험관내 IC50 값을 나타내는 화합물을, RIPK2 활성(티로신 자가인산화)이 NOD2와 RIPK2의 공동-발현에 의해 유도되는 세포 검정에서 시험하고, 키나제 활성의 억제를 RIPK2 억제제로 처리시 티로신 자가인산화의 손실에 의해 평가한다. 세포 검정에서 RIPK2 티로신 인산화의 억제를 낮은, 예를 들어 약 250 nm 용량으로 유지하는 화합물을 추가의 시험관내 및 생체내 검정에 사용한다. 키나제 특이성(specificity)은 공지된 기질을 사용하여 시험관내 키나제 검정을 수행하기 전에 다양한 용량의 억제제로 재조합 키나제를 예비인큐베이션함으로써 시험될 수 있다. 30분 후, 반응을 정지시키고, 포스페이트 혼입을 측정한다.
따라서, 예시적인 양태에서 본 발명은 RIP 키나제의 인산화 활성을 억제하는 데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다. 이것은 RIP 키나제의 전사, 번역, 유전자 발현, 활성 등의 억제를 포함할 수 있다. 예시적인 양태에서, 방법은 정제된 재조합 RIP 키나제 및 기질을 포함하는 인디케이터 조성물을 제공하는 단계; 인디케이터 조성물을 시험 화합물의 라이브러리의 각 구성원과 접촉시키는 단계; 및 시험 화합물의 라이브러리로부터 키나제 활성을 감소시키는 관심 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 스크리닝 검정은 하기에 대한 억제제의 효과를 측정한다: (1) 염증에서 중대한 역할을 하는 NF-kB의 NOD1 및 NOD2-의존적 활성화, (2) 아밀로이드-베타 및 알파-시누클레인 응집체에 의해 유도된 미세아교세포의 활성화 및 A1 성상세포 형성의 차단 및 (3) 뉴런의 유지.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시험 화합물(test compound)"은 시험되는 활성의 조절제로서 이전에 확인되지 않았거나, 또는 그러한 조절제인 것으로 인식되지 않은 화합물을 지칭한다. 용어 "시험 화합물의 라이브러리"는 다수의 시험 화합물을 포함하는 패널을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지시제 조성물"은 관심 단백질(예를 들어, RIPK2 또는 RIPK2를 수반하는 생물학적 경로 내의 분자, 예를 들어 NOD1, NOD2), 예를 들면, 단백질을 천연적으로 발현시키는 세포, 단백질(들)을 인코딩하는 발현 벡터 중 하나 이상을 세포에 도입함으로써 단백질을 발현하도록 조작된 세포, 또는 단백질(예를 들면, 정제된 천연 발생 단백질 또는 재조합-조작된 단백질)을 함유하는 무세포 조성물을 포함하는 조성물을 지칭한다. 용어 "세포"는 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 박테리아 세포이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 세포는 진균 세포, 예컨대 효모 세포이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 세포는 척추동물 세포, 예를 들어, 조류 또는 포유류 세포이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 세포는 쥣과 또는 인간 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, (조작된 세포에서와 같이) 용어 "조작된(engineered)"은 예를 들어, RIP 키나제(예를 들어, 스플라이싱된 및/또는 스플라이싱되지 않은 형태)를 인코딩하는 핵산 분자가 도입된 세포를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한, 신경퇴행성 질환 또는 장애(예를 들어, 중추신경계(CNS)의 하나 이상의 영역에서 상향조절된 NOD2, 인산화된 RIPK2, 및/또는 RIPK2와 관련된 것들)를 위한 치료제를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 후보 치료제의 존재 하에서 CNS 상주 선천적 면역 세포를 면역 세포의 활성화(예를 들어, 비정상적으로 응집된 단백질)를 유도하는 제제와 접촉시키는 단계; 후보 치료제의 존재 하에서 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 측정하는 단계; 및 대조군과 비교하여 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제하는 치료제를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 후보 치료제는, 예를 들어, 본원의 스크리닝 검정에 의해 확인된 RIPK2 억제제이다. 일부 구현예에서, CNS 상주 선천적 면역 세포를 제제와 접촉시키는 단계는 NOD2, 인산화된 RIPK2, 및/또는 RIPK2의 상향조절을 유도한다. 일부 구현예에서, CNS 상주 선천적 면역 세포는 미세아교세포 및/또는 성상세포다. 일부 구현예에서, CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 유도하는 제제는 비정상적으로 응집된 단백질 예컨대 α-시누클레인, 아밀로이드-β, 및/또는 타우이다. 일부 구현예에서, 측정은 NOD2, 인산화된 RIPK2, 및/또는 RIPK2의 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 측정은 인자 iNOS, Cxcl1, 및/또는 IL-1β의 발현 수준의 측정을 포함한다. 일부 구현예에서, 측정은 CNS 면역 세포의 화학주성의 측정을 포함한다. 임의의 이러한 구현예에서, 본 방법은 RIPK2 활성 및/또는 발현을 억제하고, 예를 들어, 다른 RIP 키나제보다 RIPK2 활성 및/또는 발현을 선택적으로 억제하고; NF-kB의 NOD2-의존적 활성화를 억제하고/거나; 아밀로이드-β 응집체 유도 미세아교세포의 활성화, 알파-시누클레인 응집체 유도 미세아교세포의 활성화 및/또는 A1 성상세포 형성을 억제하는 치료제를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(ALS/루게릭병), 파킨슨병, 당뇨병성 신경병증, 폴리글루타민(polyQ) 질환, 뇌졸중, 파르병, 다발성 경화증, 멘케스병, 윌슨병, 뇌 허혈, 프리온 장애, 치매, 피질기저 퇴행증, 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 선천성 경직성 반신부전마비(hereditary spastic paraparesis), 척수소뇌 위축증, 뇌 손상, 및/또는 척수 부상일 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 알츠하이머병 또는 파킨슨병일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 또한 본원의 임의의 스크리닝 방법으로 확인된 치료제에 관한 것이다.
약제학적 조성물
추가적인 양태는 활성제로서 RIPK2 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본원에 기재된 RIPK2 억제제 중 임의의 것이 적합하다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 약제학적 조성물 중 유일한 활성 성분이다. 일부 구현예에서, RIPK2 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분(예를 들어, 본원에 기재된 것)이 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
RIPK2 억제제는 투여 경로에 따라 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 하기를 포함하는 투여 경로를 통해 투여된다: 정맥내로, 피하로, 동맥내로, 복강내로, 안과적으로, 근육내로, 협측으로(buccally), 직장으로, 질로, 안와내로, 뇌내로, 진피내로, 두개내로, 척수내로, 심실내로, 척추강내로, 갑골내로(intracisternally), 낭내로(intracapsularly), 폐내로, 비강내로, 경점막으로, 경피로, 흡입, 또는 이들의 임의의 조합.
특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 경구로 또는 비경구로 투여된다.
본 발명의 특정 구현예에서, RIPK2 억제제(들) 치료제(들)는 전신 흡수를 허용하는 투여 형태로 투여되어, 치료제(들)는 신경 세포에 대한 효과를 발휘하도록 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다. 예를 들어, 사용되는 비경구/주사가능에 적합한 치료제(들)의 약제학적 제형은 일반적으로 멸균 수용액(수용성인 경우), 또는 멸균 주사가능 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균이어야 하고 용이한 주사능이 존재할 정도로 유체이어야 한다. 제조 및 보관의 조건 하에 안정해야 하고 미생물 예컨대 박테리아 및 진균류의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 등), 이들의 적합한 혼합물, 또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 예컨대 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 요구된 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 벤질 알코올, 소르브산, 등에 의해 가져올 수 있다. 많은 사례에서, 등장제, 예를 들어, 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 합리적일 것이다. 주사가능 조성물의 장시간 흡수는 조성물에서 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴의 사용에 의해 가져올 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요한 양의 치료제(들)를 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후, 필터 또는 최종 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산매 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 기술을 포함하며, 이는 활성 성분의 분말 및 그의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 산출한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 전형적으로 주사 또는 주입에 적합한 액체 제형이다. 예를 들어, 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사가능 용액을 위한액체 담체로서 이용될 수 있다.
정맥내 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 전형적으로 담체 예컨대 생리 식염수, 정균수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ), 에탄올, 또는 폴리올을 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 용이한 주사성을 위해 멸균되고 유체이어야 한다. 적절한 유동성은 종종 레시틴 또는 계면활성제을 사용하여 수득될 수 있다. 조성물은 또한 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 한다. 미생물의 방지는 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살, 등으로 달성될 수 있다. 많은 사례에서, 등장제(당), 폴리알코올(만니톨 및 소르비톨), 또는 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주입 부위의 통증을 완화하기 위해 국소 마취제 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 활성제의 양을 표시하는 용접 밀봉된 용기 예컨대 앰풀 또는 샤세트에 예를 들어, 건조 동결건조된 파우더 또는 무수 농축물로서 단위 투여 형태로 별도로 또는 함께 혼합하여 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약품 등급의 물 또는 염수(saline)를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀은, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
경구 조성물은 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 조성물은 젤라틴으로 둘러싸일 수 있거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 투여를 위해, 활성제는 부형제와 함께 혼입되고 정제, 트로키, 또는 캡슐에 배치될 수 있다. 약제학적으로 양립가능한 결합제 또는 아쥬반트 물질이 조성물에 포함될 수 있다. 정제, 트로키, 및 캡슐은 선택적으로 결합제 예컨대 미세결정성 셀룰로오스, 트라가칸쓰검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘; 활택제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 또는 감미제 또는 풍미제를 함유할 수 있다.
조성물은 또한 경점막 또는 경피 경로에 의해 투여될 수 있다. 경점막 투여는 로젠지, 비강 스프레이, 흡입기, 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여는 또한 당업계에서 알려진 연고, 고약, 겔, 또는 크림을 함유하는 조성물의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투할 장벽에 적당한 침투제가 사용될 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체 예컨대 트리글리세라이드와 함께 좌약으로서 제형화될 수 있다.
진피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 전형적으로 다음의 구성요소 중 적어도 하나를 포함한다: 멸균 희석제 예컨대 물, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글라이콜, 글리세린, 프로필렌 글라이콜, 또는 다른 합성 용매; 항균제 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 산화방지제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트; 및 등장제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 그와 같은 제제는 앰풀, 일회용 주사기, 또는 복수 용량 바이알 내에 봉입될 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 활성제는 신체로부터의 신속한 제거에 대해 폴리펩타이드를 보호하기 위해 담제와 함께 제조된다. 생분해성 중합체(예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글라이콜 산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산)가 종종 사용된다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에 의해 알려져 있다. 리포좀 현탁액은 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 리포좀은 당해 분야에서 알려진 확립된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호).
본 발명의 방법에서 RIPK2 억제제의 투여 용량은 치료가 필요한 대상체의 다양한 상태, 예를 들어, 증상의 중증도, 대상체의 일반적인 건강 상태, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식이, 투여 시기 및 빈도, 병용되는 의약, 치료에 대한 반응성, 및 치료 순응도를 고려하여 결정될 수 있다.
치료 방법
다양한 구현예에서, 본 발명은 또한, 신경퇴행성 질환 또는 장애 예컨대 파킨슨병 또는 알츠하이머병를 예방하거나 치료하는 방법을 제공하고, 본 방법은 치료 또는 예방이 필요한 대상체(예를 들어, 인간)에게, 수용체 상호작용 단백질(RIP) 키나제 2(RIPK2) 억제제 또는 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. RIPK2 억제제 및 본원에서 기재된 바와 같은 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유용한 RIPK2 억제제는 RIPK2의 활성 및/또는 그것의 발현을 억제할 수 있는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 다른 RIP 키나제 예컨대 RIPK1 및/또는 RIPK3에 비해 예를 들어, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 또는 그 초과의 선택도로 선택적 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 다른 RIP 키나제에 대항하는 활성을 실질적으로 갖지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 이중 또는 다중 RIP 키나제 억제제, 또는 범-RIP 키나제 억제제일 수 있다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 중추신경계(CNS)의 하나 이상의 영역에서 상향조절된 NOD2, 인산화된 RIPK2, 및/또는 RIPK2와 관련된다. CNS의 상향조절된 NOD2, 인산화된 RIPK2, 및/또는 RIPK2와 관련된 다양한 질환 또는 장애는 본원의 방법으로 치료될 수 있다. 비-제한적인 예는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(ALS/루게릭병), 파킨슨병, 당뇨병성 신경병증, 폴리글루타민(polyQ) 질환, 뇌졸중, 파르병, 멘케스병, 윌슨병, 뇌 허혈, 프리온 장애, 치매, 피질기저 퇴행증, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 선천성 경직성 반신부전마비, 척수소뇌 위축증, 뇌 손상, 또는 척수 부상을 포함한다.
일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화와 관련된다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 예를 들어, 하나 이상의 비정상 단백질, 예컨대 비정상 응집된 단백질에 의해 매개된 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화와 관련된다. 일부 구현예에서, CNS 상주 선천적 면역 세포는 미세아교세포 및/또는 성상세포다. 일부 구현예에서, 비정상 단백질은 α-시누클레인, 아밀로이드-β, 및/또는 타우를 포함한다. 일부 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 파킨슨병 또는 알츠하이머병이다. 그와 같은 구현예에서, RIPK2 억제제는 전형적으로 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제하는 데 효과적인 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 신경-염증 및 뉴런 손상을 유도하는 활성화된 상주 선천적 면역 세포로부터 분비된 하나 이상의 염증성 또는 신경독성 매개체(예컨대 TNFα, IL-1α, IL-1β, C1q, 및/또는 IL-6)의 수준을 감소하는 데 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
특정 구현예는 파킨슨병을 치료하거나 예방하는 방법과 관련되고, 본 방법은 그의 치료 또는 예방이 필요한 대상체(예를 들어, 인간)에게 RIPK2 억제제 또는 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. RIPK2 억제제 및 본원에서 기재된 바와 같은 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유용한 RIPK2 억제제는 RIPK2의 활성 및/또는 그것의 발현을 억제할 수 있는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 예를 들어, 약 2배, 약 4배, 약 10배, 또는 그 초과의 선택도로 다른 RIP 키나제 예컨대 RIPK1 및/또는 RIPK3에 비해 선택적 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 다른 RIP 키나제에 대항하는 활성을 실질적으로 갖지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 이중 또는 다중 RIP 키나제 억제제, 또는 범-RIP 키나제 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 본원에 기재된 소분자 RIPK2 억제제이다.
특정 구현예는 또한 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 방법과 관련되고, 본 방법은 치료 또는 예방이 필요한 대상체(예를 들어, 인간)에게 RIPK2 억제제 또는 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. RIPK2 억제제 및 본원에서 기재된 바와 같은 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유용한 RIPK2 억제제는 RIPK2의 활성 및/또는 그것의 발현을 억제할 수 있는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 예를 들어, 약 2배, 약 4배, 약 10배, 또는 그 초과의 선택도로 다른 RIP 키나제 예컨대 RIPK1 및/또는 RIPK3에 비해 선택적 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 다른 RIP 키나제에 대항하는 활성을 실질적으로 갖지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 이중 또는 다중 RIP 키나제 억제제, 또는 범-RIP 키나제 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 본원에 기재된 소분자 RIPK2 억제제이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한, 대상체에서 신경 세포를 보호하는 방법을 제공하고, 본 방법은 대상체에게 RIPK2 억제제 또는 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 예를 들어, 비정상 단백질 예컨대 α-시누클레인, 아밀로이드-β, 및/또는 타우에 의해 매개된 신경교증(미세아교세포 및/또는 성상세포의 활성화)으로부터의 신경염증 및/또는 독성으로부터 신경 세포를 보호한다. 일부 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 신경퇴행성 질환 또는 장애(예를 들어, 본원에서 기재된 것들 중 임의의 것), 예를 들어, 파킨슨병 또는 알츠하이머병을 앓고 있다. RIPK2 억제제 및 본원에서 기재된 바와 같은 RIPK2 억제제를 포함하는 약제학적 조성물 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유용한 RIPK2 억제제는 RIPK2의 활성 및/또는 그것의 발현을 억제할 수 있는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 예를 들어, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 또는 그 초과의 선택도로 다른 RIP 키나제 예컨대 RIPK1 및/또는 RIPK3에 비해 선택적 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 다른 RIP 키나제에 대항하는 활성을 실질적으로 갖지 않는다. 그러나, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 또한 이중 또는 다중 RIP 키나제 억제제, 또는 범-RIP 키나제 억제제일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 본원에 기재된 소분자 RIPK2 억제제이다.
본원에서 기재된 방법 중 임의의 것에서, RIPK2 억제제는 투여용으로 제형화될 수 있고/거나 의도된 투여 경로를 통해 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 정맥내로, 피하로, 동맥내로, 복강내로, 안과적으로, 근육내로, 협측으로, 직장으로, 질로, 안와내로, 뇌내로, 진피내로, 두개내로, 척수내로, 심실내로, 척추강내로, 갑골내로(intracisternally), 낭내로(intracapsularly), 관절내로, 폐내로, 비강내로, 경점막으로, 경피로, 및/또는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, RIPK2 억제제는 경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 비경구 투여(예를 들어, 주사 예컨대 정맥내 주사)를 통해 투여될 수 있다. 전형적으로, RIPK2 억제제는 NFκB의 NOD1-의존적 활성화, NF-kB의 NOD2-의존적 활성화, 미세아교세포의 활성화, 및 반응성 성상세포의 형성으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 억제하는 데 효과적인 양으로 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 RIPK2 억제제(예를 들어, 소분자 억제제)는 적어도 하나의 다른 치료적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 둘 이상의 제제는 공-투여되고, 공-제형화되고, 별도로 투여되거나, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 방법은 파킨슨병을 치료하기 위한 것이고 RIPK2 억제제는 레보도파, 카보도파 또는 이들의 조합, 프라미펙솔, 로피니롤, 로티고틴, 셀레길린, 라사길린, 엔타카폰, 톨카폰, 벤즈트로핀, 트리헥시페니딜, 또는 아만타딘, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 알츠하이머병을 치료하기 위한 것이고 RIPK2 억제제는 도네페질, 갈란타민, 메만틴, 리바스티그민, 항-Abeta(아밀로이드 베타) 요법(아두카누맙, 크레네주맙, 솔라네주맙, 및 간테네루맙을 포함), BACE1의 소분자 억제제(베루베세스타트, AZD3293(LY3314814), 엘렌베세스타트(E2609), LY2886721, PF-05297909, JNJ-54861911, TAK-070, VTP-37948, HPP854, CTS-21166를 포함), 또는 항-타우 요법을 예컨대 LMTM(류코-메틸티오니늄-비스(하이드로메탄설포네이트)), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 다른 RIP 키나제, 예컨대 RIPK1, RIPK3, RIPK4, 및/또는 RIPK5의 억제제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제는 RIPK1 억제제와 함께 투여될 수 있다. 적합한 RIPK1 억제제는 당해 분야에서 알려진 것들, 예를 들어, 미국 특허 제9,896,458호 및 제WO2017/096301호 기재된 것들을 포함하고, 이들의 내용은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다.
특정 구현예는 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 면역 세포를 유효량의 RIPK2 억제제(예를 들어, 본원에 기재된 것)과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 비정상 단백질, 예컨대 비정상적으로 응집된 단백질, 예를 들어, α-시누클레인, 아밀로이드-β, 및/또는 타우에 의해 매개된 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제한다. 일부 구현예에서, 접촉은 생체내일 수 있다. 일부 구현예에서, 필요할 때, 생체내 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화 또는 그의 억제는 다양한 이미지화 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, Dipont A.C. 등은 신경퇴행성 질환에서 활성화 미세아교세포를 검출하기 위해 전이체 단백질-18 kDa(TSPO) 양전자 방출 단층촬영(PET) 이미지화 방법을 기재하였다. Intl. J. Mol. Sci., 18(4):785(2017). 예를 들어, 일부 구현예에서, 접촉은 하나 이상의 신경퇴행성 질환(예를 들어, 본원에서 기재된 것들 중 임의의 것, 예컨대 파킨슨병 또는 알츠하이머병)을 가지고 있는 대상체의 CNS에서 일어난다. 일부 구현예에서, 접촉은 시험관내일 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉은 또한 생체외일 수 있다. 일부 구현예에서, RIPK2 억제제의 양은 대조군(예를 들어, RIPK2 억제제 없이 위약으로 치료되고/위약과 접촉된 실질적으로 동일한 세포)과 비교하여 CNS 상주 선천적 면역 세포에 의해 분비된 하나 이상의 염증성 또는 신경독성 매개체의 수준을 감소시키는 데 효과적이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RIPK2 억제제와의 접촉은 대조군과 비교하여 TNFα, IL-1α, IL-1β, C1q, IL-6, 또는 이들의 조합의 수준을 감소시키는 데 효과적일 수 있다.
키트
특정 구현예에서, 신경퇴행성 질환 또는 이의 장애의 치료를 위한 키트는 적어도 하나의 RIPK2 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 치료 방법 또는 투여에 대한 설명서를 갖는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는(예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같은) 적어도 하나의 추가적인 치료적 활성 화합물을 추가로 포함한다.
RIPK2의 2개 이상의 억제제가 키트에 포함될 수 있고, 이는 소분자, siRNA, shRNA, 마이크로 RNA, 항체, 압타머, 효소, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 무기 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 유기 화합물, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 또는 합성 화합물을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: p-RIPK2는 인간 PD 사후 조직의 SNpc에서 상승된다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 PD 환자의 사후 인간 뇌 조직에서 인산화된 RIPK2(p-RIPK2), RIPK2 및 NOD2의 발현을 조사하고 패턴 인식 수용체인 NOD2가 PD의 미세아교세포에서 α-시누클레인 응집체에 대한 수용체가 될 수 있는 지를 조사하는 것이었다. 정상의 신경학적으로 손상되지 않은 대상체(n=4) 및 PD를 갖는 대상체(n=7)로부터의 인간 사후 조직 샘플(흑질, SN)을 존스홉킨스대학의 Division of Neuropathology, Department of Pathology로부터 얻었다. PD의 진단은 병리학적 및 임상적 기준에 의해 확인되었다. p-RIPK2, RIPK2 및 NOD2 수준을 면역염색, PLA, 실시간 PCR 및 웨스턴 블랏 분석에 의해 PD 환자 및 대조군으로부터의 인간 사후 흑질(SN) 뇌 조직에서 모니터링하였다.
방법
PD 사후 뇌에 대한 면역조직화학(IHC): 10 ㎛ 두께의 포르말린-고정 파라핀-포매된 인간 사후 SN 조직을 갖는 슬라이드를 존스홉킨스대학의 Division of Neuropathology, Department of Pathology로부터 얻었다. 조직 절편을 탈파라핀화시키고 재수화시킨 후, 시트레이트-기반 항원 언마스킹 용액(Vector Laboratories)으로 열 유도된 에피토프 회수를 수행하였다. 이어서, 슬라이드를 토끼 다클론성 p-RIPK2 또는 Iba-1 항체로 염색하였다. 모든 절편을 H&E로 염색하였다.
인시투 근접 결찰 검정(PLA): 조직 절편을 제조자의 지침에 따른 인시투(in situ) 근접 결찰 검정(Sigma)에 사용하였다. 간략하게, 절편을 제공된 차단 완충액으로 차단하고 4℃에서 12시간 동안 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 마이너스(Minus) 또는 플러스 프로브(Plus probe) 접합된 이차 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 결찰 혼합물을 각각의 커버슬립에 첨가하고, 37℃에서 또 다른 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 신호를 증폭-중합효소 함유 반응 용액의 첨가에 의해 증폭시켰다. 헤마톡실린 카운터 염색 후에 커버슬립을 장착하였다.
실시간 RT-PCR(qPCR): RNeasy® Plus Micro Kit(Qiagen)를 사용하여 인간 SN 사후 조직 및 마우스 복측 중뇌 조직으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 제1-가닥 cDNA를 SuperScript® IV First-Strand Synthesis System(Invitrogen)로 합성하였다. ViiATM 7 실시간 PCR 시스템에 의해 SYBR Green 시약으로 실시간 PCR을 수행하였다. 2-ΔΔ C T 방법(Livak and Schmittgen, Methods 25:402-8(2001))을 사용하여 값을 계산하였다. 모든 ΔCT 값은 GAPDH로 정규화(normalized)되었다.
웨스턴 블랏 분석: 인간 SN의 사후 조직 조직을 앞서 기재된 바와 같은 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM 트리스-HCl pH 7.4, Nonidet P-40, 10mM Na-β-글리세로포스페이트, 완전 프로테아제 억제제 칵테일(Roche), 및 포스파타제 억제제 칵테일 I 및 II(Sigma-Aldrich)를 함유하는 조직 용해 완충액에서 균질화하였다(Ko 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:16691-6(2010)). 이어서, 용해물을 사용하여 2X Laemmli 완충액(Bio-Rad)에서 희석하였다. 20 ㎍의 단백질을 8 내지 16% 구배 SDS-PAGE 겔로 분리(resolve)하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. RT에서 1시간 동안 트리스-완충 염수를 함유하는 0.1% Tween-20에서 5% 탈지분유로 니트로셀룰로오스 막을 차단하였다. 이어서, 막을 밤새 4℃에서 다음과 같은 1차 항체와 인큐베이션하였다: 항-NOD2, 항-RIPK2, 및 항-pRIPK2 항체. 3회 세척 후, 막을 HRP-접합된 토끼 또는 마우스 이차 항체(GE Healthcare)와 함께 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 신호를 화학발광 시약(Thermo Scientific)에 의해 가시화하는 이용하였다. 이어서, 막을 HRP-접합된 β-액틴 항체(Sigma)로 재-프로빙(re-probe)하였다.
결과: 우리의 데이터는, 강력한 미세아교세포 활성화 및 루이체(LB) 병리를 갖는 PD 환자 샘플(도 1a)의 SN에서 p-RIPK2 면역반응성이 상당히 증가되며(도 1b), 면역조직화학에 의해 평가된 바와 같이 p-RIPK2 신호가 PD 환자 샘플의 SN에서 cd-11b 양성 미세아교세포와 주로 공-국소화됨을 나타낸다(도1c). NOD2 및 RIPK2 mRNA 수준은 qPCR 분석에 의해 평가된 바와 같이 PD 환자 샘플로부터의 SN에서 상당히 증가된다(도 1d). 또한, NOD2, RIPK2 및 p-RIPK2 단백질 수준은 웨스턴 블랏 분석에 의해 평가된 바와 같이 PD 환자 샘플로부터의 SN에서 상당히 증가된다(도 1e 내지 g). 종합하면, 이들 데이터는 RIPK2의 활성화 부위가 PD 뇌에서 주로 미세아교세포이고, 과도한 RIPK2 활성화가 PD의 발병기전에서 중추적인 역할을 한다는 것을 나타낸다.
패턴 인식 수용체인 NOD2가 PD의 미세아교세포에서 α-시누클레인 응집체에 대한 수용체일 수 있는 지를 확인하기 위해, 시험관내 및 생체내에서 단백질-단백질 상호작용과 같은 단일 단백질 사건을 검출할 수 있는 강력한 기술인 인시투 듀오링크(Duolink) 근접 결찰 검정(PLA)을 수행하였다. 본 발명자들은 PD 사후의 SN에서 α-시누클레인 응집체 및 NOD2에 대한 특이적 항체의 존재 하에 다수의 강한 양성 신호(도 1h)를 관찰하였고, 이는 미세아교세포에서 α-시누클레인 응집체와 NOD2 사이의 상호작용을 시사한다(도 1h). 이 데이터는 α-시누클레인이 NOD2 수용체에 대한 리간드임을 나타낸다.
(도 1d와 관련된) NOD2 및 RIPK2의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± S.E.M., n=5이다. (*P < 0.05, *** P < 0. 001).
mRNA 대조군 PD
NOD2 1 ± 0.12 2.90 ± 0.83*
RIPK2 1 ± 0.11 3.98 ± 0.49***
(도 1f와 관련된) NOD2의 상대적 단백질 수준. 값은 평균 ± S.E.M., n=4(대조군), n=7(PD)이다. (*P < 0.05).
단백질 대조군 PD
NOD2 1.00 ± 0.16 1.63 ± 0.15*
(도 1g와 관련된) p-RIPK2 및 RIPK2의 상대적 단백질 수준. 값은 평균 ± S.E.M., n=4(대조군), n=7(PD)이다. (**P < 0.01, *** P < 0. 001).
단백질 대조군 PD
p-RIPK2 1 ± 0.19 5.02 ± 0.79***
RIPK2 1 ± 0.23 2.77 ± 0.37**
실시예 2: α-시누클레인 PFF-활성화된 미세아교세포는 시험관내에서 RIPK2, NOD1 및 NOD2를 유도한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 qPCR 분석에 의해, α-시누클레인 PFF가 일차 미세아교세포에서 RIPK2, NOD1 및 NOD2의 mRNA 발현을 유도하는 지를 조사하는 것이었다.
방법
비교 qPCR: 배양된 세포로부터의 총 RNA를 회사에 의해 제공된 지침에 따라 RNA 단리 키트(Qiagen, CA)로 추출하였다. RNA 농도를 NanoDrop 2000(Biotek, Winooski, VT)을 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 1 내지 2 ㎍의 총 RNA를 고-수용력 cDNA 역전사 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 비교 qPCR은 고속 SYBR Green Master Mix(Life Technologies) 및 ViiA 7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 각각의 샘플에 대해 두번 또는 세번 수행하였다. 표적화된 유전자의 발현 수준을 β-액틴의 발현으로 정규화하고, 비교 주기 역치 Ct 방법(2-ΔΔCt)에 기초하여 계산하였다.
결과: 본 발명자들은 무내독소 α-시누클레인 PFF로 처리된 일차 미세아교 세포를 사용하여 RNAseq 분석으로부터 총 600개 초과의 상이하게 발현된 유전자를 얻었다. 이들 중에서, NOD2 및 RIPK2는 최상위였다. 본 발명자들은 RIPK2 및 NOD2의 mRNA 수준이 α-시누클레인 PFF-활성화된 미세아교세포에서 상당히 증가되어, 뇌에서 활성화된 미세아교세포와 연관된 신경퇴행성 장애에 대한 치료적 표적일 수 있음을 확인하였다.
정상(PBS) 및 α-시누클레인 PFF 활성화 마우스 일차 미세아교세포에서 RIIPK2, NOD1 및 NOD2의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (**P < 0.01, *** P < 0. 001).
mRNA PBS α-시누클레인 PFF
RIPK2 1 ± 0.14 38.75 ± 2.81***
NOD1 1 ± 0.16 2.56 ± 0.27**
NOD2 1 ± 0.13 19.33 ± 1.82***
실시예 3. NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 α-시누클레인 PFF 유도된 미세아교 세포 활성화 및 A1 반응성 성상세포를 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 1) α-시누클레인 PFF로 활성화된 일차 미세아교세포에 의한 사이토카인 생산 예컨대 TNFα, IL-1α 및 보체 C1q(A1 성상세포 유도인자)에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 평가하고, 2) 활성화된 미세아교세포에 의해 유도된 신경독성 및 반응성 A1 성상세포의 분화에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 조사하고, 3) 반응성 A1 성상세포 유도된 뉴런 독성에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 조사하는 것이었다. 이를 위해, qPCR 및 뉴런 독성 검정을 이용하였다.
방법
α-시누클레인 정제 및 α-시누클레인 PFF 제조: 재조합 마우스 α-시누클레인 단백질을 IPTG-독립 유도성 pRK172 벡터 시스템으로 앞서 기재된 바와 같이 정제하였다(Nat. Protoc. 9:2135-46(2014)). 내독소는 ToxinEraser 내독소 제거 키트(Genscript, NJ, USA)에 의해 고갈시켰다. α-시누클레인 PFF(5 mg ml-1)을 자기 교반기(37℃에서 1,000 rpm)로 교반하면서 PBS 중에서 제조하였다. α-시누클레인 단백질의 인큐베이션 1주 후, 응집체를 PBS로 0.1 mg ml-1로 희석하고, 10% 진폭으로 30초(0.5초 펄스 온/오프) 동안 초음파처리하였다(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA). α-시누클레인 PFF를 원자력 현미경검사 및 투과 전자 현미경검사를 사용하여 입증하였고, 포스포-세린 129α-시뉴클레인(p-α-synSer129)을 유도하는 능력을 면역염색을 사용하여 확인하였다. α-시누클레인 PFF를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
일차 뉴런, 미세아교세포 및 성상세포 배양물, 및 α-시누클레인 PFF 처리: NOD2 또는 RIPK2 녹아웃 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)로부터 얻었다. 일차 피질 뉴런을 배아 15.5일째 새끼로부터 제조하고, 폴리-L-라이신으로 코팅된 조직-배양판 상에서 B-27, 0.5 mM L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)으로 보충된 Neurobasal 배지(Gibco)에서 배양하였다. 뉴런은 3 내지 4일마다 배지를 변경함으로써 유지되었다. 일차 미세아교세포 및 성상세포 배양을 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(PMID: 26157004). 출생후 1일째(P1)에 마우스 새끼로부터의 뇌 전체를 얻었다. 수막 제거 후, 뇌를 10% 열 불활성화 FBS, 50 U ml-1 페니실린, 50 ㎍ ml-1 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 100 μM 비-필수 아미노산 및 2 mM 나트륨 피루베이트(DMEM/F12 완전 배지)로 보충된 DMEM/F12(Gibco)에서 3회 세척하였다. 뇌를 0.25% 트립신-EDTA로 옮긴 후 10분 동안 부드럽게 진탕하였다. DMEM/F12 완전 배지를 사용하여 트립신화를 정지시켰다. 뇌를 이 배지에서 다시 3회 세척하였다. 분쇄에 의해 단세포 현탁액을 얻었다. 단세포 현탁액을 100 ㎛ 나일론 메쉬에 통과시킴으로써 세포 잔해 및 응집체를 제거하였다. 이렇게 달성된 최종 단세포 현탁액을 6일째에 완전한 배지 변경하고 T75 플라스크에서 13일 동안 배양하였다. 혼합된 신경교 세포 집단을 EasySep 마우스 CD11b 양성 선택 키트(StemCell)를 사용하여 성상세포-풍부 및 미세아교세포-풍부 분획으로 분리하였다. 미세아교세포를 함유하는 자기적으로(magnetically) 분리된 분획 및 성상세포를 함유하는 유출 분획을 별도로 배양하였다.
야생형(WT), NOD2 녹아웃(KO), RIPK2 KO 마우스로부터 제조된 미세아교세포를 30분 동안 α-시누클레인 PFF(최종 농도 1 ㎍/㎖)로 처리한 후 qPCR 검정하였다.
α-시누클레인 PFF로 처리된 일차 야생형 미세아교세포(WT PFFs-MCM), NOD2 녹아웃 미세아교세포(NOD2-/- PFF-MCM), 또는 RIPK2 넉아웃 미세아교세포(RIPK2-/- PFFs-MCM)로부터의 조건화 배지(conditioned medium)를 수집하고, 24시간 동안 일차 성상세포에 적용하였다. 1) α-syn PFF-ACM으로 정의되는 WT PFFs-MCM, 2) NOD2-/- PFFs-ACM으로 정의되는 NOD2-/- PFFs-MCM, 3) RIPK2-/- PFFs-ACM로 정의되는 RIPK2-/- PFFs-MCM에 의한 활성화 성상세포로부터의 조건 배지는 완전 미니 EDTA 없는 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma)로 수집되고, 대략 50배 농축될 때까지 Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛(10 kDa 컷오프)(밀리포어)로 농축되었다. 총 단백질 농도를 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하고, 15 또는 50 ㎍ ml-1의 총 단백질을 뉴런 세포사 분석을 위해 마우스 일차 뉴런에 첨가하였다.
비교(comparative) qPCR: 배양된 세포로부터의 총 RNA를 회사에 의해 제공된 지침에 따라 RNA 단리 키트(Qiagen, CA)로 추출하였다. RNA 농도를 NanoDrop 2000(Biotek, Winooski, VT)을 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 1-2 ㎍의 총 RNA를 고-수용력 cDNA 역전사 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 비교 qPCR은 고속 SYBR Green Master Mix(Life Technologies) 및 ViiA 7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 각각의 샘플에 대해 두번 또는 세번 수행하였다. 표적화된 유전자의 발현 수준을 β-액틴의 발현으로 정규화하고 비교 주기 역치 Ct 방법(2-ΔΔCt)에 기초하여 계산하였다.
LDH 및 알라마르(Alamar) 블루 검정에 의한 세포 생존력: 일차 배양된 피질 뉴런을 24시간 동안 PFF-ACM 또는 NOD2-/--PFF-ACM 또는 RIPK2-/--PFF-ACM으로 처리하였다. 세포 생존력은 두 가지 방법에 의해 결정되었다: AlamarBlue(Invitrogen) 및 LDH 검정(Sigma). 세포사는 제조자의 프로토콜에 따라 AlamarBlue 검정을 통해 평가하였다. 상대적인 세포 생존력 및 막 완전성을 나타내는, 배양 배지에서의 LDH 활성을, 제조자의 지침에 따라, 분광광도법으로 LDH 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 각각의 조건에 대해 웰을 세번 분석하였다.
결과: 우리의 데이터는 α-시누클레인 PFF가 반응성 A1 성상세포 유도인자로 알려진 TNFα, IL-1α, 및 C1q를 미세아교세포(도 3a, 3b, 및 3c) 및 은밀한(covert) A1 성상세포(도 3d)에서 유도할 수 있음을 나타낸다. 중요하게는, 미세아교세포에서 NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 미세아교세포로부터 A1 성상세포 유도인자의 방출(도 3a, 3b, 및 3c) 및 후속적인 A1 성상세포 전환(도 3d)을 억제한다. α-시누클레인 PFF-유도된 A1 성상세포-조건화 배지(PFF-ACM)는 일차 피질 뉴런에 대해 독성인 반면, NOD2-/- 또는 RIPK2-/-- PFF-ACM은 의미있게 덜 독성이다(도 3e 및 3f). 이 결과는 RIPK2 및/또는 NOD2 활성의 억제가 미세아교세포의 활성화 및 신경독성 A1 성상세포 형성을 차단하고; 따라서 뉴런을 보호한다는 것을 명확하게 나타낸다.
(도 3a와 관련된) C1q의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
mRNA 대조군 PFF
WT 1 ± 0.02 2.91 ± 0.55***
NOD2-/- 1 ± 0.03 1.10 ± 0.02NS
RIPK2-/- 1 ± 0.01 1.37 ± 0.10NS
(도 3b와 관련된) TNFα의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
mRNA 대조군 PFF
WT 1 ± 0.21 483.69 ± 23.85***
NOD2-/- 1 ± 0.18 247.68 ± 27.12***
RIPK2-/- 1 ± 0.14 326.05 ± 10.45***
(도 3c와 관련된) IL-1α의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
mRNA 대조군 PFF
WT 1 ± 0.13 1831.49 ± 137.34***
NOD2-/- 1 ± 0.18 1097.87 ± 25.48***
RIPK2-/- 1 ± 0.15 473.40 ± 20.25***
형광 강도(대조군의 %; 도 3e와 관련됨). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (**P < 0. 01, ***P < 0. 001).
강도 PBS 대조군 PFF
WT 100.00 ± 1.16 43.33 ± 1.45***
NOD2-/- 97.67 ± 0.88 89.04 ± 3.61NS
RIPK2-/- 98.67 ± 1.45 85.67 ± 1.48**
LDH 방출 (양성 대조군의 %; 도 3f와 관련됨). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (*P < 0. 05, ***P < 0. 001).
양성 대조군의 % PBS 대조군 PFF
WT 13.02 ± 0.58 64..33 ± 2.03***
NOD2-/- 12.66 ± 2.23 25.67 ± 4.81 NS
RIPK2-/- 12.32 ± 1.20 31.14 ± 5.51*
실시예 4. NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 α-시누클레인 PFF 유도된 미세아교 세포 형태적 변화 및 이동을 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 1) α-시누클레인 PFF에 의해 유도된 형태적 변화 및 이동에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 평가하는 것이었다. 이를 탐구하기 위해, 형태 검정, qPCR 및 이동 검정을 이용하였다.
방법
형태적 검정: 일차 배양된 미세아교세포를 폴리-D-리신-코팅된 12 웰-플레이트 상에 플레이팅하였다. 12시간의 α-시누클레인 PFF 처리 후, 미세아교세포의 형태학적으로 변화된 아메바상 형태를 계수하였다. 세포를 DAPI로 대조염색하였다.
비교 정량적 실시간 PCR(qPCR): 배양된 세포로부터의 총 RNA를 회사에 의해 제공된 지침에 따라 RNA 단리 키트(Qiagen, CA)로 추출하였다. RNA 농도를 NanoDrop 2000(Biotek, Winooski, VT)을 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 1 내지 2 ㎍의 총 RNA를 고-수용력 cDNA 역전사 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 비교 qPCR은 고속 SYBR Green Master Mix(Life Technologies) 및 ViiA 7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 각각의 샘플에 대해 두번 또는 세번 수행하였다. 표적화된 유전자의 발현 수준을 β-액틴의 발현으로 정규화하고 비교 주기 역치 Ct 방법(2-ΔΔCt)에 기초하여 계산하였다.
이동 검정: 시험관내 세포 이동 검정을 위해, 일차 배양된 미세아교세포를 폴리-D-리신-코팅된 12-웰 폴리카르보네이트 세포 배양 삽입물 및 배양 접시의 바닥에 씨딩하였다. 배양 접시에서 12시간의 α-syn PFF 처리 후, 삽입물의 하부 측면 상의 이동된 미세아교세포를 Iba-1 항체로 염색하였다. 이어서, PBS 대조군에 대한 Iba-1 양성 이동된 미세아교세포의 수 사이의 비를 통해 이동 지수를 계산하였다.
결과: 우리의 데이터는 α-시누클레인 PFF가 미세아교세포 형태학적 변화를 유의하게 유도함을 나타낸다. 미세아교세포에서 NOD2 또는 RIPK2의 결실은 미세아교세포의 아메바상 형태를 억제한다(도 4a 및 4b). IL-1α 및 iNOS와 같은 PFF-유도된 전-염증성 유전자의 mRNA 발현은 NOD2-/- 또는 RIPK2-/- 미세아교세포에서 극적으로 감소되었다(도 4c 및 4d). 이동 능력 및 케모카인 Cxcl1 발현 또한 NOD2-/- 및 RIPK2-/- 미세아교세포에서 감소하였다(도 4e, 4f, 4g, 및 4h).
형태적 변화된 미세아교세포(변화된 미세아교세포의 수; 도 4b와 관련됨). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (*P < 0. 05, ***P < 0. 001).
변화된 세포의 # PBS 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.13 18.97 ± 3.82**
NOD2-/- 0.93 ± 0.15 3.14 ± 0.97*
RIPK2-/- 0.97 ± 0.11 6.52 ± 1.71*
(도4c 와 관련된) IL-1α의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (**P < 0. 01, ***P < 0. 001).
양성 대조군의 % PBS 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.14 1750.70 ± 62.83***
NOD2-/- 1.00 ± 0.16 527.69 ± 81.76***
RIPK2-/- 1.00 ± 0.32 267.74 ± 10.08**
(도 4d와 관련된) iNOS 의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (**P < 0. 01, ***P < 0. 001).
양성 대조군의 % PBS 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.19 2219.47 ± 178.31***
NOD2-/- 1.00 ± 0.13 1279.06 ± 70.83**
RIPK2-/- 1.00 ± 0.42 1144.39 ± 339.95**
(도 4e 와 관련된) Cxcl1 의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (*P < 0. 05, **P < 0. 01).
양성 대조군의 % PBS 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.18 170.03 ± 22.86**
NOD2-/- 1.00 ± 0.09 3.55 ± 0.77*
RIPK2-/- 1.00 ± 0.08 4.58 ± 0.74*
(도 4c 와 관련된) 미세아교세포의 이동 지수. 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (*P < 0. 05, **P < 0. 01).
이동 지수 PBS 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.11 11.04 ± 1.72***
NOD2-/- 0.97 ± 0.14 3.41 ± 0.59NS
RIPK2-/- 0.98 ± 0.16 3.97 ± 0.22*
실시예 5: RIPK2의 억제제는 시험관내 α-시누클레인 PFF 유도된 미세아교 세포 활성화 및 A1 반응성 성상세포를 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 1) α-시누클레인 PFF로 활성화된 일차 미세아교세포에 의해 사이토카인 생산 예컨대 TNFα, IL-1α 및 보체 C1q(반응성 A1 성상세포 유도인자)에 대한 RIPK2 억제제의 효과를 평가하고, 2) 활성화된 미세아교세포에 의해 유도된 A1 신경독성 성상세포의 형성에 대한 RIPK2 억제제의 효과를 조사하고, 3) 반응성 A1 성상세포 유도된 뉴런 독성에 대한 RIPK2 억제제의 효과를 조사하는 것이었다. 이를 위해, qPCR 및 뉴런 독성 검정을 이용하였다.
방법
α-시누클레인 정제 및 α-시누클레인 PFF 제조: 재조합 마우스 α-시누클레인 단백질을 IPTG-독립 유도성 pRK172 벡터 시스템으로 앞서 기재된 바와 같이 정제하였다(Nat. Protoc. 9:2135-46(2014)). 내독소는 ToxinEraser 내독소 제거 키트(Genscript, NJ, USA)에 의해 고갈되었다. α-시누클레인 PFF(5 mg ml-1)을 자기 교반기(37℃에서 1,000 rpm)로 교반하면서 PBS 중에서 제조하였다. α-시누클레인 단백질의 인큐베이션 1주 후, 응집체를 PBS로 0.1 mg ml-1로 희석하고, 10% 진폭으로 30초(0.5초 펄스 온/오프) 동안 초음파처리하였다(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA). α-시누클레인 PFF를 원자력 현미경검사 및 투과 전자 현미경검사를 사용하여 입증하였고, 포스포-세린 129α-시뉴클레인(p-α-synSer129)을 유도하는 능력을 면역염색을 사용하여 확인하였다. α-시누클레인 PFF를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
일차 뉴런, 미세아교세포 및 성상세포 배양물, 및 α-시누클레인 PFF 처리: NOD2 또는 RIPK2 녹아웃 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)로부터 얻었다. 일차 피질 뉴런을 배아 15.5일째 새끼로부터 제조하고, 폴리-L-라이신으로 코팅된 조직-배양판 상에서 B-27, 0.5 mM L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)으로 보충된 Neurobasal 배지(Gibco)에서 배양하였다. 뉴런은 3 내지 4일마다 배지를 변경함으로써 유지되었다. 일차 미세아교세포 및 성상세포 배양을 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(PMID: 26157004). 출생후 1일째(P1)에 마우스 새끼로부터의 뇌 전체를 얻었다. 수막 제거 후, 뇌를 10% 열 불활성화 FBS, 50 U ml-1 페니실린, 50 ㎍ ml-1 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 100 μM 비-필수 아미노산 및 2 mM 나트륨 피루베이트(DMEM/F12 완전 배지)로 보충된 DMEM/F12(Gibco)에서 3회 세척하였다. 뇌를 0.25% 트립신-EDTA로 옮긴 후 10분 동안 부드럽게 진탕하였다. DMEM/F12 완전 배지를 사용하여 트립신화를 정지시켰다. 뇌를 이 배지에서 다시 3회 세척하였다. 분쇄에 의해 단세포 현탁액을 얻었다. 단세포 현탁액을 100 ㎛ 나일론 메쉬에 통과시킴으로써 세포 잔해 및 응집체를 제거하였다. 이렇게 달성된 최종 단세포 현탁액을 6일째에 완전한 배지 변경하고 T75 플라스크에서 13일 동안 배양하였다. 혼합된 신경교 세포 집단을 EasySep 마우스 CD11b 양성 선택 키트(StemCell)를 사용하여 성상세포-풍부 및 미세아교세포-풍부 분획으로 분리하였다. 미세아교세포를 함유하는 자기적으로 분리된 분획 및 성상세포를 함유하는 유출 분획을 별도로 배양하였다.
게피티닙 또는 GSK583(10 μM)을 WT, NOD2 KO, 또는 RIPK2 KO로부터 제조된 미세아교세포에 30분 동안 첨가하고, α-시누클레인 PFF(최종 농도 1 ㎍/mL)를 4시간 동안 추가로 인큐베이션한 후 qPCR을 수행하였다.
α-시누클레인 PFF로 처리된 일차 야생형 미세아교세포(PFF-MCM), 게피티닙 처리된 미세아교세포(PFF-게피티닙-MCM), 또는 GSK583 처리된 미세아교세포(PFF-GSK583-MCM)로부터의 조건화 배지를 수집하고, 24시간 동안 일차 성상세포에 적용하였다. 1) PFF-ACM으로 정의된 PFF-MCM, 2) PFF-게피티닙-ACM으로 정의된 PFF-게피티닙-MCM, 3) PFF-GSK583-ACM으로 정의된 PFF-GSK583-MCM에 의해 활성화된 성상세포로부터의 조건 배지(conditioned medium)는 완전 미니 EDTA 없는 프로테아제 억제제 칵테일(complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail)(Sigma)로 수집되고, 대략 50배 농축될 때까지 Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛(10 kDa 컷오프)(밀리포어)로 농축되었다. 총 단백질 농도를 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하고, 15 또는 50 ㎍ ml-1의 총 단백질을 뉴런 세포사 분석을 위해 마우스 일차 뉴런에 첨가하였다.
비교 qPCR: 배양된 세포로부터의 총 RNA를 회사에 의해 제공된 지침에 따라 RNA 단리 키트(Qiagen, CA)로 추출하였다. RNA 농도를 NanoDrop 2000(Biotek, Winooski, VT)을 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 1 내지 2 ㎍의 총 RNA를 고-수용력 cDNA 역전사 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 비교 qPCR은 고속 SYBR Green Master Mix(Life Technologies) 및 ViiA 7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 각각의 샘플에 대해 두번 또는 세번 수행하였다. 표적화된 유전자의 발현 수준을 β-액틴의 발현으로 정규화하고 비교 주기 역치 Ct 방법(2-ΔΔCt)에 기초하여 계산하였다.
LDH 및 알라마르 블루 검정에 의한 세포 생존력: 일차 배양된 피질 뉴런을 24시간 동안 PFF-ACM, PFF-게피티닙-MCM 또는 PFF-GSK583-ACM으로 처리하였다. 세포 생존력은 두 가지 방법에 의해 결정되었다: AlamarBlue(Invitrogen) 및 LDH 검정(Sigma). 세포사는 제조자의 프로토콜에 따라 AlamarBlue 검정을 통해 평가하였다. 상대적인 세포 생존력 및 막 완전성을 나타내는, 배양 배지에서의 LDH 활성을, 제조자의 지침에 따라, 분광광도법으로 LDH 검정 키트를 사용하여 측정하였다. 각각의 조건에 대해 세번씩(triplicate) 분석하였다.
결과: 우리의 데이터는 α-시누클레인 PFF가 미세아교세포에서 TNFα, IL-1α, 및 C1q(도 5a, 5b, 및 5c) 및 은밀한 반응성, 신경독성 A1 성상세포(도 5d)를 유도한다는 것을 나타낸다. 미세아교세포에서 게피티닙 또는 GSK583과 같은 RIPK2 억제제의 치료(treatment)는 미세아교세포로부터 A1 성상세포 유도인자(도 5a, 5b, 및 5c)의 방출 및 후속 A1 성상세포 전환(도 5d)을 상당히 억제한다. α-시누클레인 PFF-유도된 A1 성상세포-조건화 배지(PFF-ACM)는 일차 피질 뉴런에 독성인 반면, 게피티닙 또는 GSK583의 치료는 신경독성 성상세포에 의해 주로 유도된 뉴런 세포 사멸을 상당히 예방하였다(도 5e 및 5f).
(5a와 관련된) C1q의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
mRNA 대조군 PFF
WT 1 ± 0.02 2.91 ± 0.55***
NOD2-/- 1 ± 0.03 1.58 ± 0.29***
RIPK2-/- 1 ± 0.02 1.44 ± 0.11***
(도 5b와 관련된) TNFα의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
mRNA 대조군 PFF
WT 1 ± 0.21 483.69 ± 23.85***
NOD2-/- 1 ± 0.14 366.45 ± 6.70***
RIPK2-/- 1 ± 0.19 340.23 ± 16.65***
(도5c와 관련된) IL-1α의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
mRNA 대조군 PFF
WT 1 ± 0.13 1831.49 ± 137.34***
NOD2-/- 1 ± 0.12 504.48 ± 14.87***
RIPK2-/- 1 ± 0.31 452.113 ± 14.334***
형광 강도(대조군의 %; 도 5e와 관련됨). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
강도 PBS 대조군 PFF
WT 100.00 ± 1.16 43.33 ± 1.45***
NOD2-/- 95.67 ± 1.20 83.67 ± 6.57 NS
RIPK2-/- 94.33 ± 1.67 83.33 ± 4.63 NS
LDH 방출 (양성 대조군의 %; 도 5f와 관련됨). 값은 평균 ± 표준오차, n=3이다. (***P < 0. 001).
양성 대조군의 % PBS 대조군 PFF
WT 12.31 ± 0.88 63.33 ± 3.18***
NOD2-/- 11.38 ± 1.45 19.07 ± 3.01 NS
RIPK2-/- 12.32 ± 3.48 29.33 ± 7.22 NS
실시예 6: NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 루이체(LB) 병리를 상당히 개선시키고 α-시누클레인 PFF-유도된 PD 동물 모델에서 미세아교세포의 활성화를 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 α-시누클레인 PFF 모델 PD에서 NOD2 또는 RIPK2 고갈의 항-PD 효능을 조사하여 NOD2 또는 RIPK2가 PD에 대한 실행가능한 치료 표적이 될 수 있는 지를 입증하는 것이었다.
방법
정위 α-시누클레인 PFF 주사를 위한 마우스 strain: NOD2 또는 RIPK2 녹아웃 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 얻었다. 모든 하우징, 번식 및 절차는 실험 동물의 케어 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었고, Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다.
α-시누클레인 단백질 정제 및 PFF 제조: 재조합 마우스 α-시누클레인 단백질을 IPTG-독립적 유도성 pRK172 벡터 시스템으로 이전에 기재된 바와 같이 정제하였다. 내독소는 ToxinEraser 내독소 제거 키트(Genscript, NJ, USA)에 의해 고갈되었다. α-시누클레인 PFF(5 mg ml-1)을 자기 교반기로 교반(37℃에서 1,000 rpm)하면서 PBS 중에서 제조하였다. α-시누클레인 단백질의 인큐베이션 1주 후, 응집체를 PBS로 0.1 mg ml-1로 희석하고 10% 진폭으로 30초(0.5초 펄스 온/오프) 동안 초음파처리하였다(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA). α-시누클레인 PFF는 원자력 현미경검사 및 투과 전자 현미경검사를 사용하여 확인되었고, 포스포-세린 129α-시뉴클레인(p-α-synSer129)을 유도하는 능력은 면역염색을 사용하여 확인되었다. α-시누클레인 PFF를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
정위 α-시누클레인 PFF 주사 및 면역조직화학(IHC): α-시누클레인 PFF의 정위 주사를 위해, 3개월령의 NOD2 KO 또는 RIPK2 KO 수컷 및 암컷 마우스를 자일라젠 및 케타민으로 마취시켰다. 주사 캐뉼러(26.5 게이지)를 선조체(STR)(중외측, 정수리점으로부터 2.0 mm; 전후, 0.2 mm; 배복, 2.6 mm) 내로 한쪽으로 우측 반구 내로 정위적으로 적용하였다. 2 μL의 α-시누클레인 PFF(PBS 중 2.5 ㎍/mL) 또는 동일한 부피의 PBS의 주입을 분당 0.2 μL의 속도로 수행하였다. 최종 용량 후, 주사 캐뉼라를 α-시누클레인 PFF 또는 PBS의 완전한 흡수를 위해 추가의 5분 동안 STR에서 유지시킨 다음, 마우스 뇌로부터 서서히 제거하였다. 머리 피부를 봉합에 의해 폐쇄하고 상처 치유 및 회복을 수술 후 모니터링하였다. IHC 분석을 위해, 선조체 α-시누클레인 PFF 주사 후 3개월에 동물을 빙냉 PBS로, 다음엔 4% 파라포름알데히드를 심장내로 관류시키고 고정시켰다. 뇌를 제거하고 면역조직화학을 진행하였다. pS129-α-시누클레인 또는 Iba-1에 대한 IHC가 편측성 선조체 α-시누클레인 PFF 주사 후 3개월에 수행되었다.
결과: NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 루이체(LB) 병리을 유의하게 개선시키고(도 7a), IHC에 의해 평가된 바와 같이 α 시누클레인 PFF-유도된 PD 마우스 모델의 배쪽 중간뇌에서 미세아교세포의 활성화를 억제한다(도 7b). 이들 결과는 NOD2 및/또는 RIPK2 활성의 억제가 PD에 대한 실행가능한 치료 표적일 수 있음을 명확하게 나타낸다.
(도　6a와 관련된) SN에서 p-αSyn 및 미세아교 세포 밀도의 양성 신호. 값은 평균 ± 표준오차, n=5이다. (*P < 0. 05, **P < 0. 01, ***P < 0. 001).
WT+PFF RIPK2 -/- +PFF NOD2 -/- +PFF
p-αSyn+ 신호의 # 32.67 ± 13.58 13.67 ± 4.163** 7.67 ± 2.08***
미세아교 세포의 # 1138.72 ± 91.48 683.24 ± 71.52* 561.82 ± 52.73**
실시예 7: NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 PD 마우스에서 미세아교세포의 활성화 및 반응성 성상세포 형성을 상당히 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 1) α-시누클레인 PFF 유도된 PD 마우스 모델에서 사이토카인 생산 예컨대 TNFα, IL-1α 및 보체 C1q(A1 유도인자)에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 평가하고, 2) α-시누클레인 PFF 유도된 PD 마우스 모델에서 A1 신경독성 성상세포의 분화에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 조사하고, 3) α-시누클레인 PFF 유도된 PD 마우스 모델에서 신경교증(gliosis)에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 조사하는 것이었다. 이를 탐구하기 위해, qPCR 검정 및 웨스턴 블랏 분석을 이용하였다.
방법
조직 용해물 제조: 총 용해물을 RIPA 완충제 [50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% SDS, 0.5% 나트륨-데옥시콜레이트, 포스파타제 억제제 칵테일 II 및 III(Sigma-Aldrich), 및 완전한 프로테아제 억제제 혼합물(Sigma-Aldrich)]에서 조직의 균질화에 의해 제조하였다. 균질화 후, 샘플을 완전 용해를 위해 4℃에서 30분 동안 회전시키고, 균질물을 22,000 x g에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 단백질 수준을 BSA 표준과 함께 BCA 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하고 면역블롯에 의해 분석하였다.
비교 정량적 실시간 PCR(qPCR): α-시누클레인 PFF 주사를 하거나 하지 않은 WT, NOD2 KO, 또는 RIPK2 KO 마우스의 복부(ventral) 중간 뇌로부터 단리된 미세아교세포 또는 성상세포로부터의 총 RNA를 회사에 의해 제공된 지침에 따라 RNA 단리 키트(Qiagen, CA)로 추출하였다. RNA 농도를 NanoDrop 2000(Biotek, Winooski, VT)을 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 1 내지 2 ㎍의 총 RNA를 고-수용력 cDNA 역전사 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 비교 qPCR은 고속 SYBR Green Master Mix(Life Technologies) 및 ViiA 7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 각각의 샘플에 대해 두번 또는 세번 수행하였다. 표적화된 유전자의 발현 수준을 β-액틴의 발현으로 정규화하고 비교 주기 역치 Ct 방법(2-ΔΔCt)에 기초하여 계산하였다.
면역블랏 분석: 8 내지 16% 및 4 내지 20% 구배 SDS-PAGE 겔 상에서의 전기영동을 수행하여 마우스 뇌 조직으로부터 수득된 10 내지 20 ㎍의 단백질을 분석하였다. 이어서, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 차단 용액(5% 탈지분유 및 0.1% Tween-20을 갖는 트리스-완충 식염수)으로 1시간 동안 차단하고, 항-Iba-1(Abcam) 및 항-GFAP(EMD Millipore) 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 마우스 이차 항체(1: 50,000, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)의 HRP-접합 토끼를 RT에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 밴드는 향상된 화학발광(Thermo Scientific, IL, USA)에 의해 가시화되었다. 마지막으로, 막을 스트리핑한 후 HRP-접합된 β-액틴 항체(1:40,000, Sigma-Aldrich)로 재-프로빙하였다.
결과: 시험관내 일차 미세아교세포 결과와 일치하게, α-시누클레인 PFF의 선조체내 주사는 복측 중뇌의 미세아교세포에서 TNFα, IL-1α 및 반응성 A1 성상세포 유도인자로 알려진 보체 C1q의 mRNA 발현을 유도한다. 이러한 유도는 NOD2 또는 RIPK2의 고갈에 의해 상당히 차단된다(도 7a, 7b, 및 7c). 일반적인 성상세포 반응성, A1- 및 A2-특이적 mRNA 수준을 또한 복측 중뇌로부터 단리된 일차 성상세포에서 qPCR에 의해 평가하였다. α-시누클레인 PFF의 선조체내 주사는 주로 A1-특이적 전사체를 유도하였고, 이는 NOD2 또는 RIPK2의 고갈에 의해 예방된다(도 7d). α-시누클레인 PFF의 선조체내 주사는 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되는 바와 같이 NOD2 또는 RIPK2의 고갈에 의해 차단되는, Iba-1, 활성화된 미세아교세포 마커, 및 활성화 성상세포 마커인 GFAP, 복측 중뇌에서의 발현을 유도한다(7e, 7f, 및 7g). 이들 결과는 NOD2 및/또는 RIPK2의 억제가 미세아교세포 및 성상세포 모두의 활성화를 억제하고, 따라서 뇌에서 뉴런을 보호한다는 것을 입증한다.
(도7a와 관련된) IL-1α의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=4이다.
mRNA 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.03 8.32 ± 2.38
NOD2-/- 0.92 ± 0.13 2.80 ± 1.12
RIPK2-/- 0.96 ± 0.22 3.61 ± 1.42
(도 7b와 관련된) TNFα의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=4이다.
mRNA 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.21 12.48 ± 1.36
NOD2-/- 0.89 ± 0.16 3.69 ± 1.48
RIPK2-/- 1.03 ± 0.17 4.92 ± 1.31
(도 7c와 관련된) C1q의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± 표준오차, n=4이다.
mRNA 대조군 PFF
WT 1.00 ± 0.14 3.25 ± 0.41
NOD2-/- 0.96 ± 0.15 1.34 ± 0.23
RIPK2-/- 1.05 ± 0.12 1.52 ± 0.21
복측 중뇌에서의 단백질 발현. n=4. (*P < 0. 05, **P < 0. 01, ***P < 0. 001).
단백질 WT
PBS 		WT
PFF 		RIPK2 -/- PBS RIPK2 -/- PFF NOD2 -/- PBS NOD2 -/- PFF
Iba-1 1 ± 0.19 4.86 ± 0.21*** 0.30 ± 0.10 1.06 ± 0.12*** 0.72 ± 0.17 2.22 ± 0.28***
GFAP 1 ± 0.10 2.27 ± 0.26*** 0.84 ± 0.12 0.77 ± 0.09*** 0.77 ± 0.06 0.64 ± 0.04***
실시예 8: NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 생체내 α-시누클레인 PFF-유도된 도파민성 신경퇴행 및 도파민성 말단 손실을 구제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 α-시누클레인 PFF 유도 PD 마우스 모델에서 NOD2 또는 RIPK2 고갈의 항-PD 효능을 조사하는 것이었다. 이를 위해, α-시누클레인 PFF를 NOD2 KO 또는 RIPK2 KO 마우스의 선조체 내로 주사하였다. α-syn PFF 주사 후 6개월에 동물을 다양한 신경병리학적 및 신경행동 평가에 사용하였다.
방법
정위 α-시누클레인 PFF 주사를 위한 마우스 stsrain: NOD2 KO 또는 RIPK2 KO 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 얻었다. 모든 하우징, 번식 및 절차는 실험 동물의 케어 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었고, Johns HHopkins University Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다.
α-시누클레인 단백질 정제 및 PFF 제조: 재조합 마우스 α-시누클레인 단백질을 IPTG-독립적 유도성 pRK172 벡터 시스템으로 이전에 기재된 바와 같이 정제하였다. 내독소는 ToxinEraser 내독소 제거 키트(Genscript, NJ, USA)에 의해 고갈되었다. α-시누클레인 PFF(5 mg ml-1)을 자기 교반기로 교반(37℃에서 1,000 rpm)하면서 PBS 중에서 제조하였다. α-시누클레인 단백질의 인큐베이션 1주 후, 응집체를 PBS로 0.1 mg ml-1로 희석하고 10% 진폭으로 30초(0.5초 펄스 온/오프) 동안 초음파처리하였다(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA). α-시누클레인 PFF는 원자력 현미경검사 및 투과 전자 현미경검사를 사용하여 확인되었고, 포스포-세린 129α-시뉴클레인(p-α-synSer129)을 유도하는 능력은 면역염색을 사용하여 확인되었다. α-시누클레인 PFF를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
정위 α-시누클레인 PFF 주사: α-시누클레인 PFF의 정위 주사(stereotaxic injection)를 위해, 3개월령의 NOD2 또는 RIPK2 KO 수컷 및 암컷 마우스를 자일라젠 및 케타민으로 마취시켰다. 주사 캐뉼러(26.5 게이지)를 선조체(STR)(중외측, 정수리점으로부터 2.0 mm; 전후, 0.2 mm; 배복, 2.6 mm) 내로 한쪽으로 우측 반구 내로 정위적으로 적용하였다. 2 μL의 α-시누클레인 PFF(PBS 중 2.5 ㎍/mL) 또는 동일한 부피의 PBS의 주입을 분당 0.2 μL의 속도로 수행하였다. 최종 용량 후, 주사 캐뉼라를 α-시누클레인 PFF 또는 PBS의 완전한 흡수를 위해 추가의 5분 동안 STR에서 유지시킨 다음, 마우스 뇌로부터 서서히 제거하였다. 머리 피부를 봉합에 의해 폐쇄하고 상처 치유 및 회복을 수술 후 모니터링하였다. 입체논리적 분석을 위해, 선조체 α-시누클레인 PFF 주사 후 6개월에 동물을 빙냉 PBS 그리고 다음 4% 파라포름알데히드를 심장내로 관류시키고 고정시켰다. 뇌를 제거하고 면역조직화학 또는 면역형광을 위해 처리하였다. 행동 테스트는 편측성 선조체 α-시누클레인 PFF 주사 후 6개월에 수행되었다.
티로신 하이드록실라제(TH) 면역조직화학 및 정량 분석: 마우스를 빙냉 PBS로 관류시킨 후 4% 파라포름알데히드/PBS(pH 7.4)로 고정시켰다. 뇌를 수집하고, 4% 파라포름알데히드에서 밤새 후-고정시키고, 30% 수크로오스/PBS(pH 7.4) 용액에서 인큐베이션하였다. 뇌를 OCT 완충액에서 냉동시키고, 30 μm 연속 관상 절편을 마이크로톰으로 절단하였다. 자유-부유 30 μm 절편을 4% 염소 또는 말 혈청/PBS + 0.2% Triton X-100으로 차단하고, TH에 대한 항체(Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)와 함께 인큐베이션한 후, 바이오틴-접합된 항-토끼 항체(Vectastain Elite ABC Kit, Vector laboratories, Burlingame, CA, 미국)와 인큐베이션하였다. 시그마패트스 DAB 과산화효소 기질(Sigma-Aldrich)을 사용하여 전개(develop) 후, 절편을 Nissl(0.09% 티오닌)로 대조염색(counterstain)하였다. SNc 영역으로부터의 TH-양성 및 Nissl 양성 DA 뉴런을 광학 분별기를 통해 계수하였고, 비편향적 세포 계수 방법은 컴퓨터 제어식 전동 스테이지(Ludl Electronics), Hitachi HV C20 카메라, 및 Stereo Investigator 소프트웨어(MicroBright-Field)가 장착된 Axiophot 사진용현미경(Carl Zeiss Vision)로 이루어진 컴퓨터 보조 이미지 분석 시스템을 사용하였다. 선조체 내의 섬유 밀도는 ImageJ 소프트웨어(NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 광학 밀도(OD) 측정에 의해 분석되었다.
면역블랏 분석: 마우스 뇌 조직을 균질화하고, Diax 900 균질기(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여, 용해 완충액 [(10 mM 트리스-HCL, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 10 mM Na-β-글리세로포스페이트, 포스페이트 억제제 혼합물 I 및 II(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 및 완전한 프로테아제 억제제 혼합물(Roche)에서 제조하였다. 균질화 후, 샘플을 완전 용해를 위해 4℃에서 30분 동안 회전시키고, 균질물을 15,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 단백질 수준을 BSA 표준과 함께 BCA 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하고, 면역블랏팅에 의해 분석하였다. 8 내지 16% 및 4 내지 20% 구배 SDS-PAGE 겔 상에서의 전기영동을 수행하여 마우스 뇌 조직으로부터 수득된 10-20 ㎍의 단백질을 분석하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 차단 용액(5% 탈지분유 및 0.1% Tween-20를 갖는 트리스-완충 식염수)으로 1시간 동안 차단하고 항-TH(1:2000, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), 항-DAT로 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 마우스 이차 항체의 HRP-접합된 토끼(1: 50000, GE Healthcare) 및 당나귀 이차 항체의 HRP -접합된 마우스(1:10000, Ghe Healscare.)로 1시간 실온에서 인큐베이션하였다. 밴드는 향상된 화학발광(Thermo Scientific)에 의해 가시화되었다. 마지막으로, 막을 스트리핑한 후 HRP-접합 β-액틴 항체(1:50,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 재탐침하였다.
폴(Pole) 테스트: 마우스를 행동 절차 룸에서 30분 동안 순응시켰다. 폴은 9 mm의 직경에서 75 cm의 금속 막대로 제조되었다. 마우스를 헤드업을 향하는 폴의 최상부(폴의 최상부로부터 7.5 cm)에 배치하였다. 폴의 베이스에 도달하는데 걸리는 총 시간을 기록하였다. 실제 테스트 전에, 마우스를 연속 2일 동안 훈련시켰다. 각각의 훈련 세션은 3번의 테스트 시도로 구성되었다. 테스트 일에, 마우스를 3개의 세션에서 평가하고 총 시간을 기록하였다. 테스트 및 기록을 정지하기 위한 최대 컷오프 시간은 60초였다. 턴 다운, 하강 및 총 시간(초 단위)에 대한 결과를 기록하였다.
그립 강도 테스트: Bioseb 그립 강도 시험기(BIO-GS3, Bioseb, FL USA)를 사용하여 신경 근육 강도 테스트를 수행하였다. 마우스의 성과를 3회 평가하였다. 그립 강도를 평가하기 위해, 마우스를 그들의 앞다리 또는 앞다리와 뒷다리 모두에 의해 금속 그리드를 잡도록 하였다. 꼬리를 부드럽게 당기고, 마우스가 그리드 상에서 파지를 해제하였을 때 힘 변환기에 의해 최대 유지력을 기록하였다. 피크 유지 강도를 디지털 방식으로 기록하고 그램 단위의 힘으로 표시하였고, 그립 강도를 그램(g) 단위로서 점수화하였다.
결과: 선조체 티로신 히드록실라제 면역반응성의 α-시누클레인 PFF-유도된 감소는 NOD2 또는 RIPK2의 고갈에 의해 구제된다(도 8a 및 8b). 웨스턴 블랏 분석은 티로신 히드록실라제 및 도파민 수송체(DAT) 면역반응성의 α-시누클레인 PFF-매개된 감소가 복측 중간뇌에서 NOD2 또는 RIPK2의 고갈에 의해 회복됨을 나타낸다(도 8d). α-시누클레인 PFF 주사는 SNpc에서 티로신 히드록실라제- 및 Nissl-양성 뉴런의 상당한 손실을 유도하며, 이는 NOD2 또는 RIPK2의 고갈에 의해 예방된다(도 8c, 8e, 및 8f). NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 또한 그립 강도(도 8g) 및 폴(pole) 테스트(도 8h)에 의해 측정된 바와 같이 α-시누클레인 PFF 주사에 의해 유발된 행동 결핍을 유의하게 감소시킨다. 이들 결과는 NOD2 및/또는 RIPK2 활성의 억제가 뉴런을 보호하고 생체내에서 PD를 개선한다는 것을 명백하게 나타낸다.
[표 25]
TH 양성 섬유의 광학 밀도, 도파민성 뉴런의 수, 단백질 발현, 및 행동 결핍(도 8b, 8e, 8f, 8g, 8h, 8I, 및 8j와 관련됨). n=5. (*P < 0. 05, **P < 0. 01, ***P < 0. 001).
Figure pct00002
실시예 9: 경구로 투여된 RIPK2 억제제는 LB 병리를 개선하고 α-시누클레인 PFF-유도된 PD 동물 모델에서 미세아교세포의 활성화를 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 α-시누클레인 PFF 모델 PD에서 게피티닙 RIPK2 억제제의 항-PD 효능을 조사하는 것이었다. 이를 위해, α-시누클레인 PFF를 NOD2 KO 또는 RIPK2 KO의 선조체 내로 주사하였다. α-시누클레인 PFF-유도된 PD 마우스를 선조체 α-시뉴클레인 PFF 주사 1개월 후, 게피티닙(Gef)(30 mg/kg, 1일 1회)으로 5개월 동안 경구로 처리하고 조직을 분석하였다.
방법
정위 α-시누클레인 PFF 주사를 위한 마우스 strain: NOD2 또는 RIPK2 녹아웃 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)로부터 얻었다. 모든 하우징, 번식 및 절차는 실험 동물의 케어 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었고, Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다.
α-시누클레인 단백질 정제 및 PFF 제조: 재조합 마우스 α-시누클레인 단백질을 IPTG-독립 유도성 pRK172 벡터 시스템으로 앞서 기재된 바와 같이 정제하였다. 내독소는 ToxinEraser 내독소 제거 키트(Genscript, NJ, USA)에 의해 고갈되었다. α-시누클레인 PFF(5 mg ml-1)을 자기 교반기(37℃에서 1,000 rpm)로 교반하면서 PBS 중에서 제조하였다. α-시누클레인 단백질의 인큐베이션 1주 후, 응집체를 PBS로 0.1 mg ml-1로 희석하고, 10% 진폭으로 30초(0.5초 펄스 온/오프) 동안 초음파처리하였다(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA). α-시누클레인 PFF를 원자력 현미경검사 및 투과 전자 현미경검사를 사용하여 입증하였고, 포스포-세린 129α-시뉴클레인(p-α-synSer129)을 유도하는 능력을 면역염색을 사용하여 확인하였다. α-시누클레인 PFF를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
정위 α-시누클레인 PFF 주사 및 면역조직화학(IHC): α-시누클레인 PFF의 정위 주사를 위해, 3개월령의 NOD2 KO 또는 RIPK2 KO 수컷 및 암컷 마우스를 자일라젠 및 케타민으로 마취시켰다. 주사 캐뉼러(26.5 게이지)를 선조체(STR)(중외측, 정수리점으로부터 2.0 mm; 전후, 0.2 mm; 배복, 2.6 mm) 내로 한쪽으로 우측 반구 내로 정위적으로 적용하였다. 2 μL의 α-시누클레인 PFF(PBS 중 2.5 ㎍/mL) 또는 동일한 부피의 PBS의 주입을 분당 0.2 μL의 속도로 수행하였다. 최종 용량 후, 주사 캐뉼라를 α-시누클레인 PFF 또는 PBS의 완전한 흡수를 위해 추가의 5분 동안 STR에서 유지시킨 다음, 마우스 뇌로부터 서서히 제거하였다. 머리 피부를 봉합에 의해 폐쇄하고 상처 치유 및 회복을 수술 후 모니터링하였다. IHC 분석을 위해, 선조체 α-시누클레인 PFF 주사 후 3개월에 동물을 빙냉 PBS 그리고 다음 4% 파라포름알데히드를 심장내로 관류시키고 고정시켰다. 뇌를 제거하고 면역조직화학을 위해 처리하였다. pS129-α-시누클레인 면역반응성에 대한 IHC는 편측성 선조체 α-시뉴클레인 PFF 주사 후 3개월에 수행되었다. 게피티닙의 치료(treatment)는 편측성 선조체 α-시누클레인 PFF 주사 1개월 후에, 1일 1회 달성되었다.
결과: 게피티닙 치료는 감소된 pS129-α-시누클레인 면역반응성에 의해 증명되는 바와 같이 LB 병리를 상당히 개선시키고(도 9a), IHC에 의해 평가된 바와 같이 치료되지 않은 PD 마우스와 비교하여 대뇌 중뇌에서 미세아교세포의 활성화를 억제한다(도 9b). 이들 결과는 RIPK2 억제제가 PD와 같은 미세아교세포의 활성화와 관련된 신경퇴행성 장애에 대한 잠재적인 약물임을 입증한다.
(도 9a와 관련된) SN에서 p-αSyn 및 미세아교세포의 양성 신호. 값은 평균±표준오차, n=5.(*P<0.05)
Veh+PFF 게피티닙+PFF
p-αSyn 양성 신호의 # 32.14 ± 1.93 16.49 ± 2.01*
미세아교 세포의 # 1138.72 ± 91.48 409.15 ± 94.27*
실시예 10: 인간 AD 사후의 해마에서 p-RIPK2가 상승된다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 AD 환자의 사후 인간 뇌조직에서 인산화된 RIPK2(p-RIPK2)의 발현을 조사하는 것이다. 이를 위하여, IHC가 사용되었다.
방법
AD 사후 뇌에 대한 IHC: 포르말린 고정되고, 파라핀에 내장된 인간 사후 해마 조직(대조군 및 AD 각군당 n=3)를 존스홉킨스대학교의 Division of Neuropathology, Department of Pathology로부터 얻었다. 조직 절편을 탈파라핀화하고 재수화하였으며, 다음 시트레이드-기반 항원 언마스킹용액(Vector Laboratories)으로 열-유도 에피토프 회수(retrieval)을 실시하였다. 다음, 슬라이드를 토기 다클론성 pRIPK2 항체로 염색하였다. 모든 섹션을 헤마톡실린으로 염색하였다.
결과: 우리의 데이터는, IHC에 의하여 검정된 바와 같이, AD 환자 샘플로부터의 해마에서 p-RIPK2의 면역활성이 상당하게 증가한다는 것을 나타낸다(도 10a, 10b). 이는 과도한 RIPK2 활성이 AD의 병리발생에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 이러한 결과는 RIPK2 및/또는 p-RIPK2 활성을 표적으로 하는 것이 AD를 포함한 신경퇴행성 장애에 대한 성공가능한 치료 표적이 될 수 있다는 것을 나타낸다.
(도　10a와 관련된) AD 사후의 해마에서의 p-RIPK2의 강도. 값은 평균 ± 표준오차, n=9이다. (***P < 0. 001).
상대 강도 대조군 AD
p-RIPK2 1.00 ± 0.08 5.76 ± 0.46***
실시예 11: 아밀로이드-β(Aβ 또는 Abeta) 응집체-활성화된 미세아교세포는 mRNA RIPK2 및 염증성 사이토카인을 유도한다.
연구 근거 및 목적 : 본 연구의 목적은 Abeta 응집체에 의해 활성화된 미세아교세포가 염증성 사이토카인과 함께 mRNA RIP2K를 유도함을 확인하는 것이었다.
방법
합성 Abeta1-42 올리고머는 전술한 바와 같이 생성되었다(PMID:27834631). 하이드록시플루로이소프로판올(HFIP)-처리된 합성 Abeta1-42 펩타이드(rPeptide, Bogart, GA, USA)를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 포스페이트-완충 식염수(PBS)에 추가로 희석하여 250 μM 스톡 용액을 수득하였다. 스톡 용액을 4℃에서 적어도 24시간 동안 인큐베이션하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 사용 전에, 용액을 12,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 올리고머 Aβ로서 사용하였다.
BV-2 미세아교세포를 DMEM 배지에서 배양하였다. 6 웰 플레이트 중의 106의 BV-2 미세아교세포를 2.5 μM의 Abeta로 4시간 동안 처리하였다. 배양된 세포로부터의 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 RNA 단리 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)로 추출하였다. RNA 농도를 NanoDrop 2000(Thermo scientific)을 사용하여 분광광도법으로 측정하였다. 이어서, 고-수용력 cDNA 역전사 시스템(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 2㎍의 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 비교 qPCR은 고속 SYBR Green Master Mix(Life Technologies) 및 단계적 실시간 pcr 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 표적 유전자의 발현 수준을 GAPDH의 발현으로 정규화하고 비교 주기 역치 Ct 방법 -ΔΔ(2 )Ct에 기초하여 계산하였다(n=3).
결과: 미세아교세포에서 RIPK2의 잠재적인 작용 기전을 결정하기 위해, RIPK2의 발현을 BV-2 미세아교세포에서 평가하였다. RIPK2의 mRNA 발현은 BV-2 미세아교세포가 Aβ올리고머(AβO)에 의해 활성화될 때 상당히 증가되었다. AβO는 미세아교세포에서 RIPK2 mRNA 발현을 거의 10배 증가시킨다. RIPK2의 발현과 함께, 다수의 염증성 매개체를 측정하였다. AβO는 M1 미세아교세포의 전형적인 마커인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 포함하는 사이토카인의 서브세트의 수준을 증가시켰다.
Abeta-활성화 미세아교세포는 RIPK2 및 염증성 사이토카인을 유도한다.
mRNA PBS AβO
RIPK2 1 9.5 ± 2.6
TNFα 1 19.6 ± 6.2
IL-1α 1 41.48 ± 16.8
IL-6 1 22.6 ± 7.3
실시예 12: 아밀로이드-β(Aβ) 응집체-활성화된 미세아교세포는 RIPK2의 인산화를 유도한다.
연구 근거 및 목적 : 이것의 목적은 Abeta 응집체에 의해 활성화된 미세아교 세포가 인산화된 RIPK2(p-RIPK2) 및 NOD2를 유도함을 확인하는 것이었다.
방법
6 웰 플레이트에서 2x106의 BV-2 미세아교세포를 5 μM의 Aβ로 15, 60, 120, 240 또는 360분 동안 처리하였다. 이어서, 세포 용해물을 RIPA 완충액에 의해 완전, 미니, EDTA 없는 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma)로 30분 동안 용해시키고, 항-RIPK2 항체와 함께 밤새 인큐베이션한 후, 단백질 A/G 인큐베이션을 3시간 동안 실시한 다음, 항-포스포-특이적 RIP2K 또는 NOD2 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.
결과: 도 11에서 나타낸 바와 같이, p-RIPK2는 60분에서의 피크와 함께 Aβ 처리 후 15분에 나타났다. RIPK2 인산화와 일치하여, 미세아교세포를 AβO로 처리할 때 NOD2의 결합은 인산화와 함께 증가하였다. 이 결과는 RIPK2에 결합하는 NOD2의 연쇄 반응에 이어, AD의 미세아교세포에서 AβO-유도된 활성화에 대한 인산화를 나타내었다.
실시예 13. NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 AβO-유도된 미세아교세포의 활성화를 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 1) AβO에 의해 활성화된 미세아교세포에서 사이토카인 생산 예컨대 TNFα 및 IL-6(A1 유도인자)에 대한 NOD2 또는 RIPK2의 고갈 효과를 평가하는 것이었다. 이를 탐구하기 위해, qPCR 검정을 이용하였다.
방법
본 연구에서, 야생형(WT), NOD2 녹아웃(B6.129S1-Nod2tm1Flv/J, NOD2-/-), 및 RIPK2 녹아웃(B6.129S1-Nod2tm1Flv/J, RIPK2-/-) 마우스는 The Jackson Laboratory로부터 이용하였다. 일차 미세아교세포 배양을 위해, 출생후 2일째(P2)에 마우스 새끼의 전체 뇌를 얻었다. 수막 제거 후, 10% 열 불활성화 FBS, 50U ml-1 페니실린, 50㎍ ml-1 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Cellgro)에서 뇌를 세척하였다. 뇌를 0.25% 트립신-EDTA로 옮기고 10분 동안 인큐베이션하였다. DMEM 완전 배지를 사용하여 트립신을 중화시켰다. 단일-세포 현탁액을 피펫팅으로 수득하였다. 단일-세포 현탁액을 70 μm 나일론 메쉬에 통과시켜 세포 잔해 및 응집체를 제거하였다. 이렇게 얻은 최종 단일-세포 현탁액을 7일째에 완전 배지 변경을 하고 T175 플라스크에서 2주 동안 배양하였다. EasySep 마우스 CD11b 양성 선택 키트(StemCell)를 사용하여 혼합된 신경교 세포 집단을 성상세포-풍부 및 미세아교세포-풍부 분획으로 분리하였다. 미세아교세포의 자기적으로 분리된 분획을 배양하였다. 야생형(WT), NOD2 녹아웃(NOD2-/-), 및 RIPK2 녹아웃(RIPK2-/-) 마우스로부터의 일차 배양된 미세아교세포를 5 μM의 AβO로 4시간 동안 활성화하였다. TNFα 및 IL-6의 유전자 발현을 실시간 RT-PCR로 측정하였다. 값은 4개의 독립적인 실험의 평균 ± SD이다.
결과: AD에서 NOD2-RIP2K 경로의 표적 신호전달을 입증하기 위해, 일차 미세아교세포를 AβO로 활성화한 다음, TNFα 및 IL-6에 대한 실시간 PCR에 의해 접근하였다. 활성화된 미세아교세포인 Aβ 42 올리고머(AβO)는 WT 한배새끼로부터의 미세아교세포에서 TNFα 및 IL-6의 mRNA 수준을 상향조절하였다. NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 AβO로 활성화된 일차 미세아교세포에서 전-염증 사이토카인의 수준을 상당히 감소시켰다. 이 결과는 NOD2-RIPK2 신호전달의 억제가 전염증성의 방출을 중단시키고, 독성 매개체가 AβO-유도된 독성을 유도함을 나타낸다.
WT, RIP2, 또는 NOD2 녹아웃 마우스의 정상(PBS) 및 A*?* 활성화 마우스 일차 미세아교세포에서 TNF-a 및 IL-6의 mRNA 수준(상대적 배수). 값은 평균 ± SD, n=2 내지 4이다. (*P < 0.05 대 PBS).
WT RIP2K KO NOD2 KO
PBS AβO PBS AβO PBS AβO
TNF-α 1±0.18 1.82±0.48* 1±0.11 0.8±0.13 1±0.30 1.08±0.19
IL-6 1±0.09 1.76±0.16* 1±0.018 1.15±0.50 1±0.33 0.28±0.11*
실시예 14: RIPK2의 억제제는 AβO-유도된 미세아교세포의 활성화를 억제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 1) Aβ 응집체로 활성화된 일차 미세아교세포에 의한 사이토카인 생산 예컨대 TNFα, IL-6 및 보체 C1q(반응성 A1 성상세포 유도인자)에 대한 RIPK2 억제제의 효과를 평가하는 것이었다. 이를 위해, qPCR 검정을 이용하였다.
방법
RIPK2 억제의 효과를 조사하기 위해, 6 웰 플레이트에 있는 106개의 BV-2 미세아교세포를 DMSO, GSK583(1 μM, Medchemexpress), OD361(1 μM, Calbiochem), 또는 소라페닙(1 μM)으로 1시간 동안 사전인큐베이션하였다. mRNA 분석을 위해, 5 μM의 AβO를 4시간 동안 추가로 처리하였다.
결과: 비정상적으로 응집된 단백질, 예를 들어 AβO에 의해 활성화된 BV-2 미세아교세포에서 RIPK2 억제의 항-염증성 효능을 확인하기 위해, TNFα, IL-6, 및 Clq에 대한 실시간 PCR에 접근하였다. 활성화된 미세아교세포인 Aβ 42 올리고머(AβO)는 Clq, IL-6 및 TNF-a의 mRNA 수준을 상향조절하였다. 중요하게는, 미세아교 세포가 RIPK2 억제제, GSK583(1 μM), OD36(1 μM) 또는 소라페닙(1 μM)로 전처리된 후, AβO(5 μM)는 미세아교세포의 활성화를 차단했고, Clq, IL-6 및 TNFα를 포함하는 다수의 염증성 매개체의 방출을 상당히 감소시켰다. ELISA의 연구 결과와 일치하여, RIPK2 억제제 처리된 AβO 활성화된 미세아교세포는 표 30에서 요약된 바와 같이 전-염증 마커의 발현이 상당히 감소됨을 보였다. 이 결과는 RIPK2 억제제에 의한 RIPK2 활성의 억제가 PD 및 AD를 포함하는 신경퇴행성 장애에서 반응성 A1 반응성 성상세포의 형성 및 뉴런 손상을 유도할 수 있는 미세아교세포의 활성화를 차단함을 나타낸다.
Aβ 활성화된 미세아교세포에서 RIPK2 억제제의 효과. BV-2 미세아교세포에서 C1q, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 수준을 실시간 PCR으로 분석하였다. ± SD, 그룹당 n=2 내지 4. (대조군에 대하여, ** P < 0.01, *** P < 0.001, Aβ에 대하여, # P < 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001).
PBS Abeta
PBS PBS GSK583 OD36 소라페닙
C1q 1±0.13 3.7±0.06 0.87±0.14 0.85±0.12 3.3±0.09
IL-6 1±0.08 12.53±0.59 4.89±0.23 7.64±0.48 7.13±0.71
TNFα 1±0.16 16.19±3.21 3.23±0.27 5.85±0.03 9.69±0.47
실시예 15: 5x-FAD AD 형질전환 마우스의 뇌에서 RIPK2가 상승된다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 PD 마우스 모델에서 나타낸 바와 같이 형질전환 AD 마우스 모델에서 상승된 RIPK2를 확인하는 것이었다.
방법
동물: 5X FAD(Tg6799,B6SJL-Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L* L286V) 6799Vas/Mmjax) 마우스를 Jackson Lab로부터 수득하였다. 이들 널리 사용된 마우스는 5가지 돌연변이를 함유하며, 2개의 FAD 돌연변이인, M146L 및 L286V를 잠복시키는 인간 PS1과 함께 스웨덴(K670N, M671L), 플로리다(I716V), 및 런던(V717I) 가족성 AD 돌연변이를 갖는 돌연변이체 인간 APP(695)를 과발현시킨다. 5XFAD 마우스는 AD 아밀로이드 병리의 주요 특징을 재현하고, 신경내 Abeta-42 유도 신경퇴행 및 아밀로이드 플라크 형성의 유용한 모델로서 공지되어 있다. Aβ 침착은 진행성이며, 4개월령 중 3개월만에 세포내에서 나타나고, 세포외 침착은 전두 피질에서 6개월까지 나타나고, 12개월까지 더욱 광범위해진다. 본 연구에서, 6 개월령 수컷 5XFAD AD 마우스를 사용하였다.
RIP-키나제의 발현: 6 개월령 야생형 또는 5XFAD 마우스의 해마에서 총 RNA를 단리하고 RIPK1, RIPK2, RIPK3 및 NOD2를 포함하는 차등 유전자 발현을 실시간 PCR을 사용하여 평가하였다. mRNA의 수준은 하우스키핑 유전자 18S rRNA로 정규화되었다. RIP-키나제의 단백질 발현 수준은 7 개월령 야생형(WT) 또는 5XFAD 마우스의 피질 영역에서 웨스턴 블랏팅으로 접근하였다.
결과: 5XFAD 마우스에서 RIPK1, RIPK2, RIPK3 및 NOD2의 mRNA 발현을 WT 한배새끼(littermate) 마우스와 비교하였다. RIPK1 및 RIPK2는 WT 한배새끼의 것과 비교하여 5XFAD에서 상당히 증가하고, 이는 RIP 키나제가 AD 및 PD를 포함하는 신경퇴행성 질환에 대한 실행가능한 치료 표적임을 나타낸다. RIPK 단백질 발현의 변화를 평가하기 위해, 7 개월의 5XFAD의 피질 영역을 분석하였다. RIPK2의 단백질 발현은 RIPK1 또는 RIPK2의 것과 비교하여 5XFAD에서 상당히 증가하였다.
실시예 16: NOD2 또는 RIPK2의 고갈은 AβO-유도된 AD 마우스에서 인지 손상을 구제한다.
연구 근거 및 목적: 본 연구의 목적은 AβO-유도된 AD 마우스 모델에서 NOD2 또는 RIPK2 고갈의 항-AD 효능을 조사하는 것이었다. 이를 위해, AβO를 대조군, NOD2 KO 또는 RIPK2 KO 마우스의 선조체에 주사하였다. AβO 주사 후 2주에 동물을 다양한 신경 행동 평가에 사용하였다.
방법
Abeta 1-42 올리고머의 제조: 합성 Abeta1-42 올리고머(AbetaO1-42)를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다. 하이드록시플루로이소프로판올(HFIP)-처리된 합성 Abeta1-42 펩타이드 (rPeptide, Bogart, GA, USA)를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 포스페이트-완충 염수(PBS)에 추가로 희석하여 250 μM 스톡 용액을 수득하였다. 스톡 용액을 4℃에서 적어도 24시간 이상 동안 인큐베이션하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 사용 전에, 용액을 12,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 올리고머 Aβ로서 사용하였다.
정위 AbetaO 1-42 i.c.v. 주사: AbetaO1-42의 정위 주사를 위해, 3개월령 NOD2 또는 RIPK2 KO 수컷 및 암컷 마우스를 자일라젠 및 케타민으로 마취시켰다. 주사 캐뉼러(26.5 게이지)를 뇌심실내(i.c.v.) 공간, 즉 정수리점으로부터 0.2 mm 후측 및 1.0 mm 측면 좌표 및 두개골 표면으로부터 2.5 mm 복부 좌표를 갖는 공간에 정위적으로 적용하였다(Paxinos and Franklin, The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2nd Ed., Academic Press, San Diego(2001)). 5 μL AbetaO1-42(0.5 μmol) 또는 동일한 부피의 PBS의 주입을 분당 0.2 μl의 속도로 수행하였다. 최종 용량 후, 주사 캐뉼라를 AbetaO1-42 또는 PBS의 완전한 흡수를 위해 추가로 5분 동안 i.c.v에서 유지시킨 후, 마우스 뇌로부터 서서히 제거하였다. 머리 피부를 봉합에 의해 폐쇄하고 상처 치유 및 회복을 수술 후 모니터링하였다. 행동 테스트는 양측 i.c.v. AbetaO1-42 주사(총 5 μmol) 후 7일에 수행되었다.
모리스 수중 미로 테스트(MWMT): MWMT는 이전의 보고서에 기재된 바와 같이 수행되었다(Vorhees 및 Williams, Nat. Protoc. 1:848-58(2006)). MWM은 표면 상에 4개의 상이한 내부 큐(cue)를 갖는 백색 원형 풀(150 cm 직경 및 50 cm 높이)이다. 원형 풀을 물 및 비독성 수용성 백색 염료로 채우고(20±1℃), 플랫폼을 물의 표면 아래로 1cm 침지시켜 수위에서 보이지 않게 하였다. 풀을 동일한 면적의 4개의 사분면으로 분할하였다. 블랙 플랫폼(직경 9 cm 및 높이 15 cm)을 풀의 4개의 사분면 중 하나의 중심에 두었다. 각각의 수영하는 마우스의 위치는 시작 위치로부터 플랫폼까지의 비디오 추적 시스템(ANY-maze, Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA)에 의해 디지털화되었다. 실험 전날은 플랫폼의 부재 하에 60초 동안 수영 훈련에 소비하였다. 그 후, 마우스에게 15분의 시험간 간격으로, 연속 4일 동안 매일 2회의 시험 세션을 부여하였고, 탈출 지연기(escape latencies)를 기록하였다. 이 파라미터를 시험의 각 세션 및 각 마우스에 대해 평균하였다. 일단 마우스가 플랫폼에 위치하면, 10초 동안 플랫폼 상에 남아있는 것이 허용된다. 마우스가 60초 내에 플랫폼에 위치하지 못한다면, 10초 동안 플랫폼 상에 놓은 다음 실험자에 의해 케이지로 복귀시켰다. 6일째에, 프로브 시험 테스트는 풀(pool)로부터 플랫폼을 제거하는 것을 수반하였고, 마우스는 60초의 컷오프 시간을 허용하였다.
결과: 본 발명자들은 AβO1-42 또는 PBS 주입 7일 후에 모리스 수중 미로 과제에 의해 공간 학습 및 기억을 평가하였다. 모리스 수중 미로에 대한 노출의 첫날에, AβO1-42 또는 PBS 주입된 야생형, RIPK2 -/- 또는 NOD2 -/- 마우스 사이에 플랫폼을 발견하는데 차이가 없다(도 12b). 모리스 수중 미로에 대한 노출 3일째 및 4일째에, AβO1-42 주사된 야생형 마우스는 PBS 처리된 야생형 마우스에 비해 상당히 증가된 탈출 지연 시간을 나타내었다(도 12b). 대조적으로, AβO1-42 주입된 RIPK2 -/- 및 NOD2 -/- 마우스는 모두 PBS 야생형 마우스의 것에 필적하는 탈출 지연 시간을 나타내었다. 시험 세션의 마지막 날(5일째) 후에, AβO1-42 주입된 RIPK2 -/- 및 NOD2 -/- 마우스 둘 다는 플랫폼이 제거된 후 표적 사분면에서 상당히 증가된 수영 시간 및 경로를 입증하였으며, 이는 AβO1-42 주입 야생형 마우스와 비교하여 PBS 주입 야생형 마우스의 수영 시간 및 경로와 유사하다(도 12c 및 12f). 수영 속도 및 총 이동 거리는 모든 실험 그룹들 사이에서 상당한 차이를 보이지 않았다(도 12d 및 12e). 이들 결과는 RIPK2 및/또는 NOD2 활성의 억제가 기억 기능을 개선하고 AD 모델에서 인지 손상을 구제(rescue)한다는 것을 명확하게 나타낸다.
본 발명은 명시된 기능 및 그 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 위에서 기재되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본 명세서에서 임의로 정의되었다. 명시된 기능 및 그 관계가 적절하게 수행되는 한, 대안적인 경계가 정의될 수 있다.
속(genus)으로서 기재된 본 발명의 양태와 관련하여, 모든 개별 종(species)은 개별적으로 본 발명의 별도의 양태로 간주된다. 본 발명의 양태가 특징을 "포함하는" 것으로 기재되는 경우, 구현예는 또한 특징을 "구성하는" 또는 "본질적으로 구성되는" 것으로 고려된다.
특정 구현예에 대한 상기 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 드러낼 것이며, 다른 것은, 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 과도한 실험 없이, 이러한 특정 구현예를 다양한 적용에 대해 용이하게 수정 및/또는 적응시킬 수 있다. 따라서, 이러한 적응 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 안내에 기초하여, 개시된 구현예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본 명세서의 어구 또는 전문용어는 설명을 위한 것이지 한정을 위한 것이 아니며, 따라서 본 발명의 용어 또는 어구는 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 전술한 예시적인 구현예 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안되며, 다음의 청구항 및 이들의 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본원에서 설명된 다양한 양태, 구현예, 및 옵션 모두는 임의의 및 모든 변형에서 조합될 수 있다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 본 문서에서 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참조에 의해 통합된 문서에서 동일한 용어의 임의 의미 또는 정의된 것과 상충되는 한, 본 문서에서의 그 용어에 할당된 의미 또는 정의가 우선할 것이다.

Claims (39)

  1. 신경퇴행성 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는 방법으로서, 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 수용체 상호작용 단백질(RIP) 키나제 2(RIPK2) 억제제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하되, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 중추신경계(CNS)의 하나 이상의 영역에서 상향조절된 NOD2, 인산화된 RIPK2, 및/또는 RIPK2와 관련되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, RIPK2 억제제는 RIPK2 활성 및/또는 발현을 억제하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, RIPK2 억제제는 RIP 키나제 1 및/또는 RIP 키나제 3보다 선택적인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RIPK2 억제제는 NFκB의 NOD1-의존적 활성화, NF-kB의 NOD2-의존적 활성화, 미세아교세포의 활성화, 및/또는 반응성 성상세포의 형성으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 억제하는 데 효과적인 양으로 투여되는, 방법.
  5. 비정상적으로 응집된 단백질에 의한 중추신경계(CNS) 상주 선천적 면역 세포의 활성화와 관련된 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 수용체 상호작용 단백질(RIP) 키나제 2(RIPK2) 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, RIPK2 억제제는 비정상적으로 응집된 단백질에 의한 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제하는 데 효과적인 양으로 투여되는, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, RIPK2 억제제의 투여는 신경-염증 및 뉴런 손상을 유도하는 활성화된 선천적 면역 세포로부터 분비된 하나 이상의 염증성 또는 신경독성 매개체의 수준을 감소시키는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 염증성 또는 신경독성 매개체는 TNFα, IL-1α, IL-1β, C1q, IL-6, 및/또는 이들의 조합인, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상주 선천적 면역 세포는 미세아교세포 및/또는 성상세포인, 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비정상적으로 응집된 단백질은 α-시누클레인, 아밀로이드-β, 및/또는 타우인, 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 파킨슨병 또는 알츠하이머병인, 방법.
  12. 비정상적으로 응집된 단백질에 의한 중추신경계(CNS) 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제하는 방법으로서, CNS 상주 선천적 면역 세포를 수용체 상호작용 단백질(RIP) 키나제 2(RIPK2) 억제제의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, CNS 상주 선천적 면역 세포는 미세아교세포 및/또는 성상세포인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 비정상적으로 응집된 단백질은 α-시누클레인, 아밀로이드-β, 및/또는 타우인, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 시험관내, 생체내, 또는 생체외인, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RIPK2 억제제의 양은 대조군과 비교하여 CNS 상주 선천적 면역 세포에 의해 분비된 하나 이상의 염증성 또는 신경독성 매개체의 수준을 감소시키는 데 효과적이고, 하나 이상의 염증성 또는 신경독성 매개체는 TNFα, IL-1α, IL-1β, C1q, IL-6, 및/또는 이들의 조합인, 방법.
  17. 치료를 필요로 하는 대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 RIPK2 억제제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, RIPK2 억제제는 경구로 또는 비경구로 대상체에게 투여되는, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, RIPK2 억제제는 RIP 키나제 1 및/또는 RIP 키나제 3보다 선택적인, 방법.
  20. 치료를 필요로 하는 대상체에서 알츠하이머병을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 RIPK2 억제제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, RIPK2 억제제는 경구로 또는 비경구로 대상체에게 투여되는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, RIPK2 억제제는 RIP 키나제 1 및/또는 3보다 선택적인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, RIPK2 억제제는 게피티닙, 소라페닙, 레고라페닙, 포나티닙, SB203580, OD36(6-클로로-10,11,14,17-테트라하이드로-13H-1,16-에테노-4,8-메테노-1H-피라졸로[3,4-g][1,14,4,6]디옥사디아자사이클로헥사데신), OD38([4,5,8,9-테트라하이드로-7H-2,17-에테노-10,14-메테노-1H-이미다조[1,5-g][1,4,6,7,12,14] 옥사펜타아자사이클로헥사데신]), WEHI-435(N-(2-(4-아미노-3-(p-톨릴)-1H-피라졸로[3,4-d] 피리미딘-1-일)-2-메틸프로필)이소니코틴아미드), GSK583(6-(tert-부틸설포닐)-N-(5-플루오로-1H-인다졸-3-일)퀴놀린-4-아민), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, RIPK2 억제제는 게피티닙, GSK583, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 적어도 하나의 추가적인 치료적 활성 화합물의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotropic lateral sclerosis, ALS/루게릭병), 파킨슨병(Parkinson's disease), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 폴리글루타민(polyQ) 질환, 뇌졸중, 파르병(Fahr disease), 멘케스병(Menke's disease), 윌슨병(Wilson's disease), 뇌 허혈(cerebral ischemia), 프리온 장애(prion disorder), 치매(dementia), 피질기저 퇴행증(corticobasal degeneration), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 선천성 경직성 반신부전마비(hereditary spastic paraparesis), 척수소뇌 위축증(spinocerebellar atrophies), 뇌 손상(brain injury) 또는 척수 부상(spinal cord injury)을 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, RIPK2 억제제는 정맥내로, 피하로, 동맥내로, 복강내로, 안과적으로, 근육내로, 협측으로, 직장으로, 질로, 안와내로, 뇌내로, 진피내로, 두개내로, 척수내로, 심실내로, 척추강내로(intrathecally), 갑골내로(intracisternally), 낭내로(intracapsularly), 폐내로, 비강내로, 경점막으로, 경피로, 및/또는 흡입을 통해 투여되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, RIPK2 억제제는 경구로 또는 비경구로 투여되는, 방법.
  29. 신경퇴행성 질환 또는 장애를 위한 치료제를 확인하는 방법으로서,
    (a) 후보 치료제의 존재 하에서 CNS 상주 선천적 면역 세포를 비정상적으로 응집된 단백질과 접촉시키는 단계;
    (b) 후보 치료제의 존재 하에서 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군과 비교하여 CNS 상주 선천적 면역 세포의 활성화를 억제하는 치료제를 확인하는 단계를 포함하되,
    후보 치료제는 RIPK2 억제제인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, CNS 상주 선천적 면역 세포는 미세아교세포 및/또는 성상세포인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 비정상적으로 응집된 단백질은 α-시누클레인, 아밀로이드-β, 및/또는 타우인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 측정은 NOD2, 인산화된 RIPK2, 및/또는 RIPK2의 발현 수준의 측정을 포함하는, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 측정은 인자 C1q, TNFα, 및/또는 IL-1α의 발현 수준의 측정을 포함하는, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 측정은 인자 iNOS, Cxcl1, 및/또는 IL-1β의 발현 수준의 측정; 및/또는 CNS 상주 선천적 면역 세포의 화학주성의 측정을 포함하는, 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 RIPK1 및/또는 RIPK3보다 RIPK2를 선택적으로 억제하는, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 NF-kB의 NOD2 의존적 활성화를 억제하는, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 아밀로이드-β 응집체 유도 미세아교세포의 활성화, 알파-시누클레인 응집체 유도 미세아교세포의 활성화 및/또는 A1 성상세포의 형성을 억제하는, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(ALS 또는 루게릭병), 파킨슨병, 다발성 경화증, 당뇨병성 신경병증, 폴리글루타민(polyQ) 질환, 뇌졸중, 파르병, 멘케스병, 윌슨병, 뇌 허혈, 프리온 장애, 치매, 피질기저 퇴행증, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 선천성 경직성 반신부전마비, 척수소뇌 위축증, 뇌 손상, 및/또는 척수 부상인, 방법.
  39. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 알츠하이머병 또는 파킨슨병인, 방법.

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