JP2024513003A - Ｃｓｆ１ｒアンタゴニストに対する耐性を付与するための哺乳動物細胞の遺伝子改変 - Google Patents

Ｃｓｆ１ｒアンタゴニストに対する耐性を付与するための哺乳動物細胞の遺伝子改変 Download PDF

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Abstract

Figure 2024513003000001
ミクログリア／単球は、「ニッチ」内に存在し、これにより、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）内に存在するミクログリア／単球／マクロファージの総数が制限される。したがって、内因性ミクログリアと競合し、ＣＮＳニッチを部分的または完全に占有するミクログリア、単球およびマクロファージまたはそれらを生じさせる細胞を治療的に改変するのを助けることができる方法が必要とされている。本開示は、ＣＳＦ１ Ｒ阻害剤に対する応答に、内因性脳常在ミクログリアと比較して選択的利点を有する治療用ミクログリア、治療用単球または治療用マクロファージを特徴とする。具体的には、本開示で開発される治療用細胞は、内因性ミクログリアを死滅させるのに十分な所与の用量のＣＳＦ１ Ｒ阻害剤では死滅しない。本明細書に記載される治療用細胞は、神経疾患を治療するために使用され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１日に出願された米国仮出願第６３／１６９，５７８号明細書および２０２１年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／２３６，９５１号明細書の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
出願人は、規則１３ｔｅｒ．１（ａ）に従って提出され、「ＵＣＩ ２１．０３ ＰＣＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と題された、Ａｎｎｅｘ Ｃ／ＳＴ．２５テキストファイルの形式で記録された情報が、出願時の国際出願の一部を形成するものと同一であると主張する。配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、神経疾患を治療するための方法および組成物を特徴とする。特に、方法および組成物は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的または完全な耐性を有する細胞を特徴とする。
ほとんどすべてのヒト神経疾患およびヒト神経損傷は、脳の常在免疫細胞であるミクログリアの機能、遺伝子発現および活性化状態の障害または変化を伴う。場合によっては、ミクログリアの遺伝子変異が神経疾患の主な原因であるが、他の疾患では、ミクログリア遺伝子の多型が疾患を発症するリスクを増加させる。残念なことに、これらの疾患および損傷の多くに有効な治療法は、あるにしてもわずかしかない。
ミクログリア、単球およびマクロファージは、「ニッチ」内に存在し、これにより、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）内に存在するミクログリア、単球およびマクロファージの総数が制限され得る。したがって、内因性ミクログリアと競合し、ＣＮＳニッチを部分的または完全に占有するミクログリア、単球およびマクロファージまたはそれらを生じさせる細胞を治療的に改変するのを助けることができる方法が必要とされている。本開示の目的は、遺伝子改変されたヒトミクログリアまたは関連する単球系統もしくは前駆細胞を患者に移植するための手法を含む、ミクログリアに基づく治療薬を開発することである。
本開示の目的は、神経疾患の治療のためのＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性（例えば、部分的な、完全な、増加させる、低下させる）を可能にする組成物および方法を提供することである。
ミクログリアは、生存、増殖および自己再生のために２つのリガンド（ＣＳＦ１およびＩＬ－３４）を介したＣＳＦ１Ｒシグナル伝達に依存している。様々なＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを用いて哺乳動物モデルを処置すると、中枢神経系内のミクログリアの数が減少する。さらに、これらの化合物が除去されると、生存しているミクログリアが増殖し、ニッチを急速に再び満たす。加えて、マウスの脳に移植されたヒト幹細胞由来ミクログリアもＣＳＦ１Ｒ阻害に感受性であり、ＣＳＦ１Ｒ阻害によって死滅することが見出されている（図１１Ｆ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｉ、図１１Ｊ）。
内因性ミクログリアニッチと競合するために、治療用ミクログリア、治療用単球、治療用マクロファージまたはそれらの前駆細胞もしくは前駆体は、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤に対するそれらの応答に、内因性脳常在ミクログリアと比較して選択的利点を有する必要がある。具体的には、内因性ミクログリアを死滅させるのに十分な所与の用量のＣＳＦ１Ｒ阻害剤で死滅しない治療用細胞を開発する必要がある。場合によっては、この選択的利点は、さらに高い用量のＣＳＦ１Ｒ阻害剤が、治療用ミクログリア、治療用マクロファージ、治療用単球またはそれらの前駆細胞もしくは前駆体も、安全性の目的のために必要が生じた場合に死滅させることができるように部分的であるべきである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質（例えば、ヒトＣＳＦ１Ｒタンパク質）をコードする核酸を含む細胞（例えば、改変ヒト細胞）を特徴とする。他の実施形態では、本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ヒト細胞を特徴とする。さらなる実施形態では、本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸を含む改変ヒト細胞を特徴とする。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、対象を治療する方法を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与すること、および対象を、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と接触させることを含み得る。他の実施形態では、方法は、対象を、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と接触させること、および対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与することを含み得る。
さらなる実施形態では、本開示はまた、対象を治療する方法を特徴とする。方法は、対象を、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と接触させること、および改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と比較して、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）の増殖または生存を示差的に変化させることを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸組成物およびベクターをさらに特徴とし得る。
本開示の技術的特徴は、神経疾患の治療のための治療用ミクログリア、治療用マクロファージ、治療用単球またはそれらの前駆細胞もしくは前駆体を作製するための、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性（例えば、部分的な、完全な、増加した、または低下した耐性）の使用を含む。本開示を何らかの理論または機構に限定することを望むものではないが、本開示の技術的特徴は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性（例えば、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト耐性）を有する多能性幹細胞からのミクログリア、単球、ＨＳＰＣ（造血幹細胞または前駆細胞）または原始マクロファージの生成を有利に提供すると考えられる。本明細書に記載されるように、何らかの形態の前処置または選択的利点を用いなければ、前述の細胞の移植は、中枢神経系（ＣＮＳ）への部分的または限定的な生着のみを示す可能性が高い。本開示は、哺乳動物の脳内のミクログリア、マクロファージもしくは単球またはそれらの前駆細胞（ＨＳＰＣ、ＰＭＰ）の治療的生着を顕著に促進する、ここで記載されている手法を開発する。現在知られている先行の参考文献または研究のいずれも、本発明の特有の発明的な技術的特徴を有しない。
本開示の組成物および方法は、医療にＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを使用するための現在のパラダイムからの大きな逸脱を表す。例えば、先行技術は、内因性ミクログリアを除去し、脳への骨髄由来単球および／または血液由来単球の侵入を促進するためのＣＳＦ１Ｒ阻害剤の使用を教示している。しかし、脳に浸潤する骨髄由来単球および／または血液由来単球は、浸潤後何カ月も経ってもミクログリアと機能的および転写的に異なるままである。さらに、骨髄由来単球および／または血液由来単球は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対してミクログリアと同じ感受性を有さず、これらの細胞がミクログリアではないことを実証している。これにより、神経疾患の治療のための改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む治療用ミクログリア（例えば、ヒトミクログリア）の拡大増殖を促進する本開示から離れていることが教示される。
さらに、ほとんどの主要な製薬会社は、いくつかの形態の癌を治療するためのＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト化合物を開発している。しかし、内因性ミクログリアはＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して極めて感受性であり、これらの化合物の用量を増大させると治療に応答して死滅する。これは、マウスの脳に移植されたヒト幹細胞由来ミクログリア（図１１Ｆ、図１１Ｇ、図１１Ｈ、図１１Ｉ、図１１Ｊ）、および培養されたヒトミクログリア（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄおよび図４Ｅ）にも当てはまる。逆説的に、本開示は、移植されたミクログリア（例えば、移植された治療用ミクログリア；すなわち、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含むミクログリア）の長期生着を改善するために、ミクログリアに対して毒性である化合物（例えば、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト）を利用する。本開示の方法は、通常はそのような生着に適していない確立されたミクログリアニッチに、移植されたミクログリア（例えば、移植された治療用ミクログリア；すなわち、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含むミクログリア）の広範囲な生着を達成するという課題を解決する。
さらに、本開示の技術的特徴は、驚くべき結果に寄与し、これらの変異に関連する転帰の予測不可能性を示す。例えば、提案された点変異のうちの２つは、阻害剤処理の２４時間後に評価した場合、複数の漸増用量にわたって２つのＣＳＦ１Ｒ阻害剤（すなわち、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト）に対する完全な（１００％）保護をもたらす（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄおよび図４Ｅ）。対照的に、第３の変異Ｇ７９５Ｖは、ミクログリアへのｉＰＳＣの分化の成功を妨げた（図１）。これらのデータは、ＣＳＦ１Ｒに導入される特定のＤＮＡおよび結果として生じるアミノ酸変化の重要性を実証し、いくつかの変化はＣＳＦ１Ｒ阻害剤（すなわち、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト）に対する所望の耐性を達成するが、他の変化は代わりにミクログリアの分化または生存の能力を損なう可能性があることを実証している。
したがって、本開示は、ヒトミクログリア、ヒトマクロファージおよびヒト単球ならびに／またはそれらの前駆体細胞（ＨＳＰＣ、エリスロミエロイド前駆細胞（ＥＭＰ）または原始マクロファージ前駆細胞（ＰＭＰ））の競合的生着を促進する方法および組成物を特徴とする。細胞は、限定するものではないが、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む多能性幹細胞、骨髄由来造血幹細胞、臍帯血細胞、血液由来単球、胎児卵黄嚢マクロファージもしくは組織マクロファージ、成人組織由来マクロファージを含む様々な供給源から、またはミクログリア、ＨＳＰＣ、単球もしくはマクロファージへの別の細胞型の直接再プログラミングを介して得ることができる。さらに、本開示は、限定するものではないが、心臓、皮膚、肝臓、肺、腎臓、眼、前立腺および卵巣由来の細胞を含むＣＳＦ１Ｒ発現細胞の競合的生着を促進する方法および組成物を特徴とし得る。
本明細書に記載されるいかなる特徴または特徴の組合せも、そのようないかなる組合せに含まれる特徴が、文脈、本明細書、および当業者の知識から明らかなように相互に矛盾しない限り、本開示の範囲内に含まれる。本開示のさらなる利点および態様は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において明らかである。
本開示の特徴および利点は、添付の図面に関連して提示される以下の詳細な説明の考察から明らかになるであろう。
対照ミクログリアおよびＣＳＦ１Ｒ変異体ミクログリアのインビトロ増殖速度を示す。同質遺伝子的ｉＰＳＣ由来造血前駆細胞をミクログリアに分化させ、細胞密度を最初の１４日間使用した。２つの野生型同質遺伝子的対照株（Ｃｎｔｌ－１およびＣｎｔｌ－２）は、ｉＰＳＣ－ミクログリアの増殖速度に、ある程度の変動性が予測されることを実証している。ｈＣＳＦ１Ｒ Ｇ７９５ＡおよびｈＣＳＦ１Ｒ Ｇ７８５Ｃの両変異体は、２つの対照株と同等の増殖速度を示す。対照的に、ｈＣＳＦＲ Ｇ７９４Ｖ変異体は、細胞密度の急速な低下を示し、分化の６日目を超えて残った生細胞はない。これらのデータは、アミノ酸置換の特定の選択が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト耐性も示すことができる生存ミクログリアの生成の成功にとって重要であることを実証している。
選択されたＣＳＦ１Ｒ変異がトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさず、同時にＰＬＸ５６２２に耐性を付与することを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異がトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさず、同時にＰＬＸ５６２２に耐性を付与することを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異がトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさず、同時にＰＬＸ５６２２に耐性を付与することを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異がトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさず、同時にＰＬＸ５６２２に耐性を付与することを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異がトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさず、同時にＰＬＸ５６２２に耐性を付与することを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異がトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさず、同時にＰＬＸ５６２２に耐性を付与することを示す。図２Ａは、上位２，０００個の遺伝子を使用した主成分分析により、データセット内の変動の主な原因がＰＬＸ５６２２に対するＷＴ応答であることが明らかにされることを示す。図２Ｂおよび図２Ｃは、ＤＭＳＯ処理されたＭＵＴ１（すなわち、Ｇ７９５Ａ；図２Ｂ）またはＭＵＴ２（すなわち、Ｇ７９５Ｃ；図２Ｃ）とＷＴミクログリアとの間のピアソン相関係数の線形回帰分析および計算により、完全トランスクリプトームと２４９個の遺伝子のコアミクログリア遺伝子シグネチャーとを調査した場合に、高度の一致が確認されたことを示す。図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、ＰＬＸ５６２２を用いたＷＴ（図２Ｄ）、ＭＵＴ１（すなわち、Ｇ７９５Ａ；図２Ｅ）およびＭＵＴ２（すなわち、Ｇ７９５Ｃ；図２Ｆ）ミクログリアの２４時間の処理が、ＤＭＳＯ処理細胞と比較した場合に、ＷＴ細胞（ＦＤＲ≦０．０５；ｌｏｇ２（ＦＣ）≧±１）内で顕著なトランスクリプトーム変化を誘導したことを示す。しかし、ＭＵＴ１およびＭＵＴ２の両株の処理は遺伝子発現を顕著に変化させることができず、これらの株がＰＬＸ５６２２の効果に抵抗性であることが示唆された。
ＣＳＦ１Ｒ変異体および対照ｘＭＧ（ミクログリア）の距離マトリックスを示す。ＲＮＡ－ｓｅｑ発現数を正規化し、分散安定化変換を使用して変換した。ペアワイズユークリッド距離を全サンプル間で計算し、サンプルを距離によって階層的にクラスタリングした。これらのデータは、Ｇ７９５Ａ変異体ミクログリアのトランスクリプトームがＷＴ ＣＳＦ１Ｒミクログリアのトランスクリプトームと最も同等であることを実証している。
ヒト幹細胞由来ミクログリアもインビトロでＣＳＦ１Ｒ阻害に感受性であり、ＣＳＦ１Ｒ阻害によって死滅することを示す。 ヒト幹細胞由来ミクログリアもインビトロでＣＳＦ１Ｒ阻害に感受性であり、ＣＳＦ１Ｒ阻害によって死滅することを示す。 ヒト幹細胞由来ミクログリアもインビトロでＣＳＦ１Ｒ阻害に感受性であり、ＣＳＦ１Ｒ阻害によって死滅することを示す。 ヒト幹細胞由来ミクログリアもインビトロでＣＳＦ１Ｒ阻害に感受性であり、ＣＳＦ１Ｒ阻害によって死滅することを示す。 ヒト幹細胞由来ミクログリアもインビトロでＣＳＦ１Ｒ阻害に感受性であり、ＣＳＦ１Ｒ阻害によって死滅することを示す。図４Ａは、０．１％ＤＭＳＯ、２５０ｎｍ ＰＬＸ３３９７、５００ｎｍ ＰＬＸ３３９７および１μｍ ＰＬＸ３３９７を含む完全培地を用いた培養時に２４時間にわたって画像化されたカスパーゼ３／７レベルを示す。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３生細胞イメージャを用いて撮像された画像。図４Ｂは、０．１％ＤＭＳＯ、２５０ｎｍ ＰＬＸ５６２２、５００ｎｍ ＰＬＸ５６２２および１μｍ ＰＬＸ５６２２を含む完全培地を用いた培養時に２４時間にわたって画像化されたカスパーゼ３／７レベルを示す。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３生細胞イメージャを用いて撮像された画像。図４Ｃは、０．１％ＤＭＳＯ、２５０ｎｍ エディコチニブ（ＪＮＪ－４０３４６５２７）、５００ｎｍ エディコチニブおよび１μｍ エディコチニブを含む完全培地を用いた培養時に２４時間にわたって画像化されたカスパーゼ３／７レベルを示す。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３生細胞イメージャを用いて撮像された画像。図４Ｄは、０．１％ＤＭＳＯ、２５０ｎｍ ＢＬＺ９４５、５００ｎｍ ＢＬＺ９４５および１μｍ ＢＬＺ９４５を含む完全培地を用いた培養時に２４時間にわたって画像化されたカスパーゼ３／７レベルを示す。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３生細胞イメージャを用いて撮像された画像。図４Ｅは、ＰＬＸ３３９７との培養時の２４時間後の野生型ミクログリア、Ｇ７９５ＡミクログリアおよびＧ７９５Ｃミクログリアに関するカスパーゼ３／７蛍光活性の代表的な画像を示す。全パネルについて、６つの独立したウェルにおけるｎ＝４の画像を定量した。平均値±ＳＥＭとして表されるデータ。
Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアがＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト誘導性細胞死に耐性であることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアがＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト誘導性細胞死に耐性であることを示す。細胞はカスパーゼ媒介性アポトーシス以外のプロセスから死滅し得ることから、Ｇ７９５Ａ変異がＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによって誘導される任意の形態の細胞死に対してさらに広範囲な耐性を提供するかどうかを決定することが重要である。したがって、５００ｎＭ（図５Ａ）もしくは１ｕＭ（図５Ｂ）のＤＭＳＯビヒクル対照、または４つのＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト、ＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ５６２２、エディコチニブおよびＢＬＺ９４５のうちの１つを用いて、Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ－ミクログリアおよび野生型（ＷＴ）ｉＰＳＣ－ミクログリアを２４時間処理した。次いで、２色生存率／細胞傷害性アプローチ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌ３２２４；ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔ）を使用して、生細胞対死細胞の割合を定量した。ＤＭＳＯによる処理の２４時間後に、死んだミクログリアはほとんど観察されない。対照的に、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによる処理は、野生型ミクログリアでは実質的な細胞死を誘導するが、Ｇ７９５Ａミクログリアでは細胞死をほとんどまたは全く誘導しない。生細胞を円によって示す。
ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＣＳＦ－１Ｒ／Ｍ－ＣＳＦ－Ｒ（ｐａｎＴｙｒ）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ｎ＝７によって検出されるように、４８時間後の２５ｎｇ／ｍｌのＨｕｍａｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃３００－２５）による、変異体ＣＳＦ１Ｒを発現するミクログリアの処理が、ＣＳＦ－１Ｒ／Ｍ－ＣＳＦ－Ｒタンパク質のチロシンリン酸化を刺激することを示す。ＷＴミクログリアと比較して、ＣＳＦ１Ｒ Ｇ７９５Ａを発現するミクログリアは同様にリン酸化するが、ＣＳＦ１Ｒ Ｇ７９５Ｃを発現するミクログリアは上昇したレベルのリン酸化を示す。これらのデータは、Ｇ７９５ＡおよびＧ７９５ＣはともにＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する耐性を付与するが、Ｇ７９５Ｃ変異はＣＳＦ１Ｒシグナル伝達の増強をもたらし得ることを示唆している。平均値±ＳＥＭとして表されるデータ。
ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合したＣＳＦ１Ｒ受容体の結晶構造を示す。 ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合したＣＳＦ１Ｒ受容体の結晶構造を示す。 ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合したＣＳＦ１Ｒ受容体の結晶構造を示す。 ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合したＣＳＦ１Ｒ受容体の結晶構造を示す。図７Ａは、ＰＬＸ５６２２ ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合したヒトＣＳＦ１Ｒ受容体を示し、図７Ｂは、ＰＬＸ３３９７ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合したＣＳＦ１Ｒ受容体を示す。結晶構造を調査して、同じ結合ポケットへのＡＴＰの正常な結合を損なわずに、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの結合を立体的に妨害し得るアミノ酸置換を予測した。ヒトＣＳＦ１Ｒに結合したＣＳＦ１ＲアンタゴニストＰＬＸ５６２２（図７Ａ）またはＰＬＸ３３９７（図７Ｂ）の結晶構造は、以前に公開された。この公的に入手可能なデータを使用して、ＡＴＰ結合ポケットを調査した。分子モデリングを通して、ＣＳＦ１Ｒへの正常なＡＴＰ結合を破壊せずに、ＰＬＸ５６２２もしくはＰＬＸ３３９７または他のＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの結合を損なう可能性が高い単一アミノ酸変化を予測した（図７Ｃ）。具体的には、このモデリングは、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）またはシステイン（Ｃ）のいずれかによるアミノ酸Ｇ７９５の置換が、ＡＴＰの正常な結合能力を破壊することなく、ＰＬＸ５６２２および／またはＰＬＸ３３９７結合の立体障害を増加させることを示唆している。結合を防ぐ他の変異も調査することができた（図７Ｄ）。
ＣＳＦ１Ｒコード配列内の位置７９５で単一アミノ酸点変異をコードする同質遺伝子的ヒトｉＰＳＣ細胞株の産生の成功を実証するＤＮＡクロマトグラムを示す。この特定の場合では、ＣＲＩＳＰＲを介した遺伝子編集によって各株を生成した。ただし、限定するものではないが、ＴＡＬＥＮ、従来の相同組換え、ウイルス遺伝子送達または他のＣＲＩＳＰＲ変異体を含む様々な他の遺伝子編集方法によって、同様の変化を導入することができる。
選択されたＣＳＦ１Ｒ変異が、インビボでトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさないことを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異が、インビボでトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさないことを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異が、インビボでトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさないことを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異が、インビボでトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさないことを示す。 選択されたＣＳＦ１Ｒ変異が、インビボでトランスクリプトームシグネチャーにほとんど影響を及ぼさないことを示す。図９Ａは、上位２，０００個の遺伝子を使用した主成分分析により、Ｇ７９５Ａミクログリア、Ｇ７９５ＣミクログリアおよびＷＴミクログリア間の変動の主な原因が、ＣＳＦ１Ｒ変異ではなく個々の動物に起因することが明らかにされることを示す。対照的に、Ｇ７９５Ｖを比較すると、この変異に基づく分離がいくらかあり、Ｇ７９５Ｖは、遺伝子発現を実質的に変化させることなくミクログリアの生成を可能にしない可能性があることがさらに示される。図９Ｂおよび図９Ｃは、Ｇ７９５Ａ（図９Ｂ）またはＧ７９５Ｃ（図９Ｃ）とＷＴミクログリアとの間のピアソン相関係数の線形回帰分析および計算により、完全トランスクリプトームと１９０個の遺伝子のコアミクログリアシグネチャーとを調査した場合に、高度の一致が確認されたことを示す。図９Ｄおよび図９Ｅは、ＷＴ細胞と比較した場合に、ＭＩＴＲＧマウスでは、移植２ヶ月後に外植されたヒトミクログリアのボルケーノプロットが、変異体細胞では最小の有意なトランスクリプトーム変化（ＦＤＲ≦０．０５；ｌｏｇ２（ＦＣ）≧±１）を示すことを示す。
Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、同質遺伝子的野生型ｉＰＳＣ由来ミクログリアのトランスクリプトームシグネチャーと高度に類似する、インビボでの異種移植後のトランスクリプトームシグネチャーを示すことを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、同質遺伝子的野生型ｉＰＳＣ由来ミクログリアのトランスクリプトームシグネチャーと高度に類似する、インビボでの異種移植後のトランスクリプトームシグネチャーを示すことを示す。異種移植適合性マウスに野生型（ＷＴ）ミクログリアまたはＧ７９５Ａ ｉＰＳＣ－ミクログリアを生着させ、２ヶ月後、ヒト細胞を単離し、バルクＲＮＡ配列決定によって調査した。図１０Ａは、個々のＷＴ生着マウスおよびＧ７９５Ａ生着マウスから単離されたｘＭＧについて、検出された全遺伝子にわたる相関を示す。個々のマウスレシピエント間の差は、いくらかの変動性をもたらすが、ＷＴ ｘＭＧとＧ７９５ ｘＭＧとは高度に相関したままであり、Ｒ２は０．８０～０．９５である。図１０Ｂは、さらに選択されたミクログリア特異的遺伝子リストを使用して同様の比較を行ったことを示す。この比較は、同様に、野生型ｘＭＧとＧ７９５Ａ ｘＭＧとの間の強い相関を明らかにし、Ｒ２は０．７８～０．９７であった。以前のインビトロＲＮＡ配列決定分析と一致して、これらの結果は、Ｇ７９５Ａ ＣＳＦ１Ｒ変異がインビボ生着後のヒトミクログリアの基礎となるトランスクリプトームにほとんどまたは全く影響を及ぼさず、検出された分散の大部分が個々のマウスグラフトレシピエント間の差によるものであることを実証している。
Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。 Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ由来ミクログリアが、ＣＳＦ１Ｒアゴニスト処置に耐性であり、成体哺乳動物脳内でのヒトミクログリアの強固な生着を可能にすることを示す。異種移植適合性マウスに、２月齢で５００，０００個のｉＰＳＣ由来ヒトミクログリア（ｘＭＧ）の両側定位的海馬内注射を投与した。マウスに、ホモ接合性ＣＳＦ１Ｒ耐性Ｇ７９５ＡヒトｉＰＳＣ株または同質遺伝子的未改変野生型ヒトｉＰＳＣから分化したｘＭＧを投与した。マウスが４週齢の時点で、４週間にわたって、齧歯類固形飼料中６００ｍｇ／ｋｇのＰＬＸ３３９７を自由に摂取できるようにした。次いで、マウスを殺処分し、脳の半分を蛍光免疫組織化学的検査および共焦点顕微鏡法によって検査した。図１１Ａ～図１１Ｅは、１ヶ月のＰＬＸ３３９７処置の過程にわたって、Ｇ７９５Ａ ｘＭＧが増殖し、海馬および皮質内の初期注射部位から拡大増殖することを示す。ミクログリアをＩＢＡ－１によって標識し（図１１Ａおよび図１１Ｆ）、ヒト特異的マーカーＫｕ８０（図１１Ｂおよび図１１Ｇ）を使用してヒトミクログリアの核を共標識し、Ｋｉ６７（図１１Ｃおよび図１１Ｈ）を使用して、皮質および視床内の残りの非占有ニッチに向かって移動する増殖性ヒトｘＭＧの「波面」を示す（矢印）。図１１Ｅは、図１１Ｄの四角で囲まれた領域の高倍率画像が、全ＩＢＡ１＋ミクログリアがＫｕ８０を共発現することを実証することを示す。対照的に、野生型ヒトｘＭＧでは、ＰＬＸ３３９７処置の１ヶ月後に生存するのはほんの一握りである（図１１Ｆ～図１１Ｉ）。例えば、図１１Ｊの矢印は、図１１Ｉに示される四角で囲まれた領域内の４つの生存ｘＭＧのみを明らかにしている。
成体ｈＣＳＦ１マウスへの移植後のＣＳＦ１Ｒ－Ｇ７９５ＡヒトｉＰＳＣ－ミクログリア生着の定量を示す。完全に占有された成体ミクログリアニッチへのＣＳＦ１Ｒ－Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ－ミクログリアの移植（ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによる処置を用いず）は、ミクログリアマーカーＩＢＡ１とヒト特異的核マーカーＫｕ８０（Ｋｕ８０＋／Ｉｂａ１＋）との共局在化によって測定されるように、ヒトミクログリアの極めて限られた生着（全ミクログリアの５～１０％）を生じる。対照的に、ＣＳＦ１Ｒ－Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ－ミクログリア移植の後に、ＰＬＸ３３９７含有マウス固形飼料（食物中６００ｍｇ／ｋｇのＰＬＸ３３９７）を用いてマウスを１０日間処置すると、ヒトミクログリアの割合はほぼ２５％に増加する。Ｋｕ８０とＩＢＡ１との共発現によって証明されるように、ＰＬＸ３３９７処置（食物中６００ｍｇ／ｋｇのＰＬＸ３３９７）の３０日間後、脳内の全ミクログリアの９０～９５％がヒトである。ＣＳＦ１Ｒ－Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ－ミクログリアを移植し、移植前、移植中または移植後のいずれかにＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト処置の濃度および持続時間を変化させることによって、ヒトｉＰＳＣ－ミクログリア生着の程度を制御することができる。
本明細書に記載されるすべての特徴および利点を提供しない実施形態を含め、本開示の実施形態を詳細に説明してきたが、特定の変形例および修正が当業者には明らかであろう。本開示は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替もしくは追加の実施形態ならびに／または使用およびそれらの明白な修正および均等物に及ぶことが当業者によって理解されるであろう。さらに、多数の変形例が様々な程度に詳細に示され説明されているが、本開示の範囲内にある他の修正は、本開示に基づいて当業者には容易に明らかになるであろう。また、実施形態の特定の特徴および態様の様々な組合せまたは部分的組合せが行われてもよく、依然として本開示の範囲内に含まれると考えられる。したがって、本開示の様々な態様を形成するために、開示された実施形態の様々な特徴および態様を互いに組み合わせることができるか、または置き換えることができることを理解されたい。ひいては、本明細書に開示される本開示の範囲は、本明細書に記載される特定の開示された実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」またはそれらの変形例が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、そのような用語は、用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であることが意図される。
用語
本明細書で使用される場合、「ＣＳＦ１Ｒ発現細胞」は、ＣＳＦ１Ｒを発現する細胞、またはＣＳＦ１Ｒを発現するように誘導され得る細胞、またはＣＳＦ１Ｒを発現する細胞に分化する細胞を指し得る。ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の非限定的な例には、限定するものではないが、ミクログリア、単球、ＨＳＰＣ（造血幹細胞または造血前駆細胞）、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、ホフバウアー細胞、絨毛外栄養膜細胞、食細胞、または多能性幹細胞由来の原始マクロファージが含まれ得る。さらに、ＣＳＦ１Ｒ発現細胞は、遺伝的手法または小分子手法のいずれかを介してｉＰＳＣ、単球または線維芽細胞から直接再プログラミングされたミクログリアを指し得る。
本明細書で使用される場合、「ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞」は、ＣＳＦ１Ｒ受容体を発現し、食作用、すなわち、細胞がその原形質膜を使用して細胞外粒子または細菌、基質、タンパク質、脂質または凝集体を貪食し、次いで、この領域を内在化してファゴソームを形成するプロセスに関する能力を有する細胞を指し得る。ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞の非限定的な例には、限定するものではないが、ミクログリア、マクロファージ、単球、樹状細胞または他の食細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞はＣＳＦ１Ｒ発現細胞である。
本明細書で使用される場合、「示差的な耐性」は、ＣＳＦ１ＲアンタゴニストによるＣＳＦ１Ｒシグナルの阻害が、未改変細胞に観察されるものとは異なる用量応答関係、または応答の大きさを示す、改変細胞内で生じる状態を指し得る。他の実施形態では、示差的な耐性とは、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と比較して、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖または生存を変化させることを指し得る。いくつかの実施形態では、示差的な耐性は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的な、完全な、増加した、または低下した耐性を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ＣＳＦ１Ｒシグナル阻害」は、リン酸化事象または脱リン酸化事象、遺伝子発現などのＣＳＦ１Ｒシグナル伝達カスケードの段階でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによって引き起こされる用量依存的低減を指し得る。
本明細書で使用される場合、「部分的な耐性」は、増大した用量のＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによって依然として破壊される改変細胞を指す。部分的な耐性は、結合定数（Ｋｄ）もしくはＡＴＰの増加、キナーゼ活性の低下、ＣＳＦ１リガンドに対する結合親和性の低下、またはシグナル伝達の低下に起因し得る。
本明細書で使用される場合、「完全な耐性」は、ＣＳＦ１Ｒシグナル阻害がいかなる濃度のアンタゴニストでも決して起こらない改変細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「増加した耐性」は、ＣＳＦ１Ｒシグナル阻害が、未改変細胞で観察されるものと比較して、増加した濃度のアンタゴニストで起こる改変細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「低下した耐性」は、ＣＳＦ１Ｒシグナル阻害が、未改変細胞で観察されるものと比較して、低下した濃度の受容体アンタゴニストで起こる改変細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、区別なく使用される。本明細書で使用される場合、対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）または霊長類（例えば、サル、類人猿およびヒト）であり得る。特定の実施形態では、対象はヒトである。一実施形態では、対象は、本明細書に記載の疾患、障害または病態を有する哺乳動物（例えば、ヒト）である。別の実施形態では、対象は、本明細書に記載の疾患、障害または病態を発症するリスクがある哺乳動物（例えば、ヒト）である。ある特定の場合では、患者という用語は、医学的ケアを受けているヒト、または獣医学的ケアを受けている動物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「神経疾患」は、脳、ならびに身体および脊髄全体に見られる神経に影響を及ぼす損傷、外傷、障害または疾患を指す。
本明細書で使用される用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療的処置および予防的手段の両方を指し、その目的は、疾患（例えば、神経疾患）の発症を予防するかまたは遅らせること、例えば、障害の発現を遅らせること、または病態、疾患もしくは障害、例えば、不十分なもしくは望ましくない器官機能もしくは組織機能を特徴とするあらゆる障害の少なくとも１つの有害作用もしくは症状を低減することである。１つ以上の症状または臨床マーカーがその用語が本明細書で定義されているように低減する場合、治療は一般に「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止した場合、治療は「有効」である。すなわち、「治療」には、症状の改善または疾患のマーカーの低減だけでなく、治療の非存在下で予測される症状の停止または進行の遅延または悪化も含まれる。有益または望ましい臨床結果には、限定するものではないが、検出可能または検出不能を問わず、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（例えば、悪化しない）、疾患の進行の遅延、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的を問わず）が含まれる。「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存期間と比較して、生存期間を延ばすことも意味し得る。「治療」はまた、疾患を改善すること、その合併症の重症度を軽減すること、それが現れるのを予防すること、それが再発するのを予防すること、それが悪化するのを単に予防すること、それに含まれる炎症反応を緩和すること、またはそのような治療努力が最終的に失敗したとしても、前述のいずれかに影響を及ぼす治療努力を含む。
ここで図１～図１２を参照すると、本開示は、神経変性疾患の治療のためのＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する治療的に設計されたＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、治療用ミクログリア）を作製および使用するための方法および組成物を特徴とする。
中枢神経系内の細胞は、「ニッチ」内に存在し得、これにより、哺乳動物ＣＮＳ内に存在し得る細胞の総数が制限され得る。本開示は、ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、ＣＳＦ１Ｒを発現する食細胞、ＨＳＰＣ、樹状細胞、エリスロミエロイド前駆細胞、ミクログリア、マクロファージまたは単球）を使用して、神経疾患および神経損傷の新しい治療法を開発することを目的とする。しかし、いくつかの疾患では、ＣＮＳ内でのそのような細胞の生着および／または成熟は、既存の内因性ミクログリアの存在によって制限される可能性が高い。そのような適応症の場合、移植された哺乳動物細胞に選択的な生存または増殖の利点を提供することができる方法は、生着、したがって、治療活性を改善するであろう。重要なことに、そのような手法はまた、安全でなければならず、制御されない増殖を誘発してはならない。
本開示は、ＣＳＦ１Ｒを発現する細胞に分化する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞またはそれらの前駆細胞もしくは幹細胞を特徴とし、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の改変細胞、または造血幹細胞および造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）由来の改変細胞の場合、未分化細胞に改変を導入し、場合により、改変をスクリーニングまたは選択し、改変細胞を単球系統またはマクロファージ系統などの細胞または細胞系統に分化させることを含み得る、本開示による改変細胞の作製方法も包含される。
本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す細胞（例えば、ヒト細胞）を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ヒト細胞を特徴とする。本開示はまた、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸を含む細胞（例えば、ヒト細胞）を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸を含む改変ヒト細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の細胞（例えば、ヒト細胞）は、ＣＳＦ１Ｒを発現し、ＣＳＦ１Ｒ発現細胞であり得る。他の実施形態では、本開示の細胞（例えば、ヒト細胞）は、ＣＳＦ１Ｒを発現するように誘導または分化され得る。
本開示はまた、ＣＳＦ１Ｒを発現している、本明細書に記載の改変細胞を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＳＦ１Ｒを発現している、本明細書に記載の改変ヒト細胞を特徴とする。細胞は、ＣＳＦ１Ｒを発現するように誘導および／または分化され得、多能性幹細胞、造血幹細胞、エリスロミエロイド前駆細胞および造血前駆細胞からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、ＣＳＦ１Ｒ発現ヒト）細胞には、限定するものではないがミクログリア、マクロファージ、単球または他の食細胞が含まれ得る。他の実施形態では、ＣＳＦ１Ｒを発現するように誘導または分化され得る細胞には、限定するものではないが、多能性幹細胞、造血幹細胞、エリスロミエロイド前駆細胞または造血前駆細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、改変細胞（例えば、改変ヒト細胞）は、限定するものではないが、ミクログリア、単球、マクロファージ、造血前駆細胞（ＨＰＣ）および造血幹細胞（ＨＳＣ）、エリスロミエロイド前駆細胞（ＥＭＰ）、原始マクロファージおよび原始マクロファージ前駆細胞（ＰＭＰ）または臍帯血造血幹細胞を含む前駆体細胞である。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的に耐性である。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストには、限定するものではないが、ＰＬＸ５６２２、ＰＬＸ３３９７（ペキシダルチニブ）、ＢＬＺ９４５、Ｋｉ２０２２７、ＪＮＪ－４０３４６５２７；ＪＮＪ－５２７（エディコチニブ）、ｃＦＭＳ受容体阻害剤ＩＩ、ＡＺ３０４、ＡＲＲＹ－３８２、ＹＭ－９０７０９、ＧＷ２５８０、ＰＬＸ１０８－０１、ＰＬＸ７４８６、ＰＬＸ６４７、ＡＲＲＹ－３８２、ＪＮＪ－４０３４６５２７、エマクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）（ＲＧ７１５５）、ＡＭＧ８２０、ＩＭＣ－ＣＳ４（ＬＹ３０２２８５５）、ＭＣＳ１１０、ＢＰＲ１Ｒ０２４、ＡＺＤ７５０７、ＪＴＥ－９５２、ＪＮＪ－２８３１２１４１、ｃ－ＦＭＳ－ＩＮ－８またはＣＳＦ１Ｒ－ＩＮ－２２が含まれ得る。
他の実施形態では、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストには、その同族リガンド（例えば、ＣＳＦ１またはＩＬ－３４）、基質または下流エフェクターとのＣＳＦ１Ｒ相互作用を阻害する任意の化合物が含まれ得る。その同族リガンド、基質または下流エフェクターとのＣＳＦ１Ｒ相互作用を阻害する化合物の非限定的な例には、限定するものではないが、ＣＳＦ１ＲとホスホリパーゼＣガンマ２（ＰＬＣｇ２）、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）およびＧｒｂ２／Ｇａｂ２／Ｓｈｐ２複合体との間の相互作用を遮断する抗体または薬物が含まれる。いくつかの実施形態では、示差的なＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト耐性は、ＣＳＦ１Ｒの下流の遺伝子を改変することによって付与される。非限定的な例には、限定するものではないが、ＩＮＰＰ５Ｄ（ＳＨＩＰ１）、ＴＲＥＭ２、ＤＡＰ１２、ＰＬＣＧ２、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＰＫＣ、ＦＩＭＰ、ＪＮＫ、Ａ－ＳＭａｓｅ、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）およびＧｒｂ２／Ｇａｂ２／Ｓｈｐ２複合体が挙げられ得る。他の実施形態では、部分的なＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト耐性は、ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストを用いてミクログリアを前処理することによって付与される。さらなる実施形態では、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストには、ＡＴＰ結合部位（すなわち、ＡＴＰ結合ポケット）を遮断することによってＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を阻害する任意の化合物が含まれ得る。
表１は、野生型ＣＳＦ１Ｒ配列、および改変ＣＳＦ１Ｒアミノ酸配列（すなわち、本明細書に記載の改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質）の非限定的な例、ならびに本明細書に記載の改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸配列の非限定的な例を示す。そのような核酸の例には、野生型核酸配列と比較して１つ以上のサイレントな、または保存された核酸置換を有するものが挙げられる。太字の核酸（ＮＡ）は、１つ以上のサイレントな、または保存された核酸置換が配列に組み込まれ得る場所の例である。本明細書では、潜在的な核酸が強調されている。







いくつかの実施形態では、細胞（例えば、改変ヒト細胞）は、ＣＳＦ１Ｒ受容体（すなわち、ＣＳＦ１Ｒタンパク質）に関する遺伝子に１つ以上の遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、改変ヒト細胞）は、ＣＳＦ１Ｒタンパク質（すなわち、ＣＳＦ１Ｒ受容体）に１つ以上の遺伝子改変を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ受容体（すなわち、ＣＳＦ１Ｒタンパク質）の１つ以上の遺伝子改変は、構成的に活性なＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を誘導しない。改変ＣＳＦ１Ｒ受容体（すなわち、ＣＳＦ１Ｒタンパク質）は、ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリガンドによって依然として活性化（例えば、リン酸化）され得る。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリガンドには、限定するものではないが、ＣＳＦ１、ＩＬ－３４、ＣＳＦ１Ｒのアゴニストもしくは活性化抗体、またはそれらの組合せが含まれ得る。いくつかの実施形態では、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質は、ＣＳＦ１リガンドによって活性化される。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１リガンドは、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する。他の実施形態では、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質は、ＩＬ－３４リガンドによって活性化される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－３４リガンドは、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、改変ＡＴＰ結合ポケットをもたらす。ＣＳＦ１Ｒ受容体（すなわち、ＣＳＦ１Ｒタンパク質）の改変ＡＴＰ結合ポケットは、（野生型ＣＳＦ１Ｒタンパク質と比較して）減少した結合空間（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐａｃｅ）を有し得る。いくつかの実施形態では、改変ＡＴＰ結合ポケットは、薬物（例えば、ＣＳＦ１ＲアンタゴニストまたはＣＳＦ１Ｒアゴニスト）に結合することができない。他の実施形態では、改変ＡＴＰ結合ポケットは、ＡＴＰに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ受容体の１つ以上の遺伝子改変は、ＣＳＦ１Ｒタンパク質のＡＴＰ結合活性を妨害しない。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ受容体の１つ以上の遺伝子改変は、薬物（例えば、ＣＳＦ１ＲアンタゴニストまたはＣＳＦ１Ｒアゴニスト）が結合するためのポケットを欠くが、ＣＳＦ１Ｒタンパク質の正常なＡＴＰ結合活性を妨害しない。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は点変異である。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、単一アミノ酸置換をもたらす。他の実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、単一アミノ酸挿入をもたらす。さらなる実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、単一アミノ酸欠失をもたらす。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、ＣＳＦ１Ｒタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす。アミノ酸配列の変化は、場合により、Ｇ７９５、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３およびＶ６４７から選択されるアミノ酸残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、アミノ酸置換をもたらす。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、単一アミノ酸置換をもたらす。単一アミノ酸点変異は、Ｇ７９５Ａ、Ｇ７９５ＶおよびＧ７９５Ｃからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ遺伝子は、改変細胞内のＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的または完全な耐性を付与するように改変される。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ遺伝子は、単一点変異によって改変される。他の実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ遺伝子の単一点変異は、限定するものではないが、位置Ｇ７９５、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３および／またはＶ６４７に、これらの単一アミノ酸置換を含み得る。非限定的な例として、置換は、Ｇ７９５Ａ、Ｇ７９５Ｖ、またはＧ７９５Ｃ、またはＧ７９５Ｄ、またはＧ７９５Ｅ、またはＧ７９５Ｆ、またはＧ７９５Ｇ、またはＧ７９５Ｈ、またはＧ７９５Ｉ、またはＧ７９５Ｋ、またはＧ７９５Ｌ、またはＧ７９５Ｍ、またはＧ７９５Ｎ、またはＧ７９５Ｐ、またはＧ７９５Ｑ、またはＧ７９５ＲまたはＧ７９５Ｓ、またはＧ７９５Ｔ、またはＧ７９５Ｗ、またはＧ７９５Ｙを含み得る。
いかなる理論または機構にも束縛されることを望むものではないが、これらの残基、またはＡＴＰ結合部位に結合した小分子阻害剤と直接接触する任意の他のアミノ酸残基の置換は、それらの結合を変化させると予測される。わずかにさらに大きな官能基を含むアミノ酸置換：セリン；トレオニン；システイン；バリン；ロイシン；イソロイシン；およびメチオニンは、プレキシコン結合と衝突するがそれでもなおＣＳＦ１Ｒ機能のためのＡＴＰ結合を可能にする嵩高い置換基を導入すると予測される。さらに大きなアミノ酸置換：フェニルアラニン、チロシン、リジン、アルギニンおよびトリプトファンは、阻害剤およびＡＴＰの両方と立体的に衝突し、それによって、正常なＣＳＦ１Ｒ機能を阻害すると予測される。対照的に、あまり嵩高くない側鎖を有するアミノ酸、例えば、グリシンまたはアラニンによる置換は、わずかに大きいまたは非相溶性の極性側鎖による立体障害に起因して天然配列によって弱く結合されるだけのアンタゴニスト種への結合を改善し得る。ひいては、当業者であれば、アロステリックなアンタゴニストの結合部位を定義するこれらおよび他の残基が本開示の目的に従って改変を受け得ることを理解するであろう。
他の実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、ＣＳＦ１Ｒタンパク質の複数のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、複数のアミノ酸の変化は、隣接するアミノ酸に対するものである。他の実施形態では、複数のアミノ酸の変化は、隣接していないアミノ酸に対するものである。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変（例えば、点変異）は、ＣＳＦ１Ｒタンパク質（すなわち、ＣＳＦ１Ｒ受容体）のＡＴＰ結合ポケット内にある。他の実施形態では、１つ以上の遺伝子改変（例えば、点変異）は、ＣＳＦ１Ｒタンパク質（すなわち、ＣＳＦ１Ｒ受容体）のＡＴＰ結合ポケットの外側にある。本開示をいかなる理論または機構にも限定することを望むものではないが、ＣＳＦ１Ｒタンパク質のＡＴＰ結合ポケットの外側の変異は、アロステリズムを介して作用してアンタゴニスト結合を阻害し得ると考えられる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、エクスビボで導入される。他の実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、導入遺伝子をコードする核酸を細胞（例えば、ヒト細胞）にトランスフェクトまたは導入することによって誘導される。さらなる実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、標的とされるヌクレアーゼ、ニッカーゼまたは塩基編集エフェクター（ｂａｓｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）もしくはリボ核タンパク質複合体の形質導入または導入によって導入される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子をコードする核酸を細胞に導入することは、細胞（例えば、ヒト細胞）をウイルスベクターと接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒ遺伝子の１つ以上の遺伝子改変（例えば、点変異）は、限定するものではないが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集系、ＴＡＬＥＮゲノム編集系およびＺＦＮゲノム編集系を含む、当技術分野で公知の部位特異的変異誘発方法またはランダム変異誘発方法によって生成される。代替的にまたは追加的に、改変ＣＳＦ１Ｒ導入遺伝子は、例えば、裸の核酸などのＤＮＡベクターもしくはＲＮＡベクター、リポソーム、もしくは他のカプセル化された核酸ベクター、人工染色体、ならびに／またはレンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターによって細胞（例えば、ヒト細胞）に導入され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む細胞（例えば、ヒト細胞）は、野生型ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む細胞（例えば、ヒト細胞）の遺伝子発現プロファイルを保持する。いくつかの実施形態では、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含むインビトロ細胞（例えば、インビトロヒト細胞）は、野生型ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含むインビトロ細胞（例えば、インビトロヒト細胞）と同様の遺伝子発現プロファイルを有する。他の実施形態では、インビボで移植された、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む細胞（例えば、ヒト細胞）は、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を損なわない、移植された細胞（例えば、ヒト細胞）の類似の遺伝子発現プロファイルを有する。さらなる実施形態では、本明細書に記載の改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）は、野生型ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）の遺伝子発現プロファイルを保持する。
本開示はまた、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒ発現細胞を含む組成物を特徴とし得る。本開示はまた、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒ発現食細胞を含む組成物を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、組成物は、複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、複数の細胞の少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有するＣＳＦ１Ｒ発現細胞である。他の実施形態では、複数の細胞の少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有するＣＳＦ１Ｒ発現食細胞である。
本開示は、対象を治療する方法を特徴とする。方法は、対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与すること、および対象を、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と接触させることを含む。他の実施形態では、方法は、対象を、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と接触させること、および対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的な耐性または完全な耐性である。
本明細書に記載の改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ヒトＣＳＦ１Ｒ発現細胞）は、別の遺伝子（例えば、ＣＳＦ１Ｒ遺伝子の外側）に１つ以上の改変（例えば、１つ以上の遺伝子改変をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）は、神経疾患を治療するか、治癒させるか、改善するか、予防するか、または緩和するのに有用な遺伝子産物を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）によって普通ならば発現されない。他の実施形態では、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）は、神経疾患を治療するか、治癒させるか、改善するか、予防するか、または緩和するのに有用な他の遺伝子改変を発現する。他の実施形態では、他の遺伝子改変（ＣＳＦ１Ｒ遺伝子の外側）は、変異した遺伝子を修正して、その他の遺伝子の変異によって引き起こされる疾患を治療するために使用される。
いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによって阻害されるＣＳＦ１Ｒシグナルは、対象にとって内因性のＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）の増殖または生存である。他の実施形態では、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と比較して対象の内因性ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）の増殖または生存を減少させるのに十分な量で対象に投与される。
本開示はまた、対象を治療する方法を特徴とし得る。方法は、対象を、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と接触させること、および改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と比較して、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）の増殖または生存を示差的に変化させることを含み得る。いくつかの実施形態では、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して部分的に耐性である。いくつかの実施形態では、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）の増殖または生存を示差的に変化させる工程は、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）と比較して未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞（例えば、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞）の増殖または生存を減少させるのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与することを含む。
本明細書に記載の方法は、対象のＣＮＳ内の内因性ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞の約０．１％、または約１％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９９％、または約９９．５％を死滅させ得る。他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象のＣＮＳ内の内因性ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞をすべて死滅させ得る。
本明細書に記載の方法は、対象のＣＮＳ内の改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞の約０．１％、または約１％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９９％、または約９９．５％の生着をさらに可能にし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象のＣＮＳ内の改変ＣＳＦ１Ｒ発現食細胞の完全な生着を可能にする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象を本開示の改変細胞またはベクターと接触させることによって神経疾患を治療すること、予防すること、緩和すること、または改善することに関する。いくつかの実施形態では、神経疾患は、神経系の疾患を含む。神経疾患の非限定的な例には、限定するものではないが、認知症、神経変性疾患、遺伝性疾患、脊髄損傷、外傷性脳損傷、化学物質または他の薬剤への曝露によって引き起こされるまたは悪化する疾患などが含まれ得る。
本開示はまた、神経疾患を治療するための組成物であって、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な（例えば、増加した、低下した、部分的な、または完全な）耐性を有する複数の改変細胞を含む組成物を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、改変細胞はＣＳＦ１Ｒ発現細胞である。
本開示は、本明細書に記載のＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸組成物およびベクターをさらに特徴とし得る。いくつかの実施形態では、核酸組成物およびベクターは、限定するものではないが、導入遺伝子、マーカーまたはレポーター遺伝子などを含むペイロードを含み得る。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、発現制御配列に作動可能に連結された、本明細書に記載の核酸組成物を含む。
いくつかの実施形態では、核酸組成物は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的な耐性、完全な耐性、増加した耐性、または低下した耐性である。
他の実施形態では、核酸組成物は、１つ以上の遺伝子改変を含む改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子改変は、Ｇ７９５Ａ、Ｇ７９５Ｖ、Ｇ７９５Ｃ、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３およびＶ６４７からなる群から選択されるアミノ酸置換をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む核酸組成物を含む発現ベクターを特徴とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターは、培養細胞または内因性細胞を改変するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターは、培養細胞、または上記細胞の子孫がポリペプチドを発現するように、培養細胞をトランスフェクトするために使用される。他の実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターは、核酸を形質導入することによって（例えば、ウイルスベクターに感染させてＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト耐性細胞をインサイチュで作製することによって）内因性ＣＳＦ１Ｒ発現細胞を改変するために使用される。
本開示の方法および組成物は、本開示の変異を導入し、それによって、改変細胞を作製するように構成された改変細胞またはベクターまたはゲノム編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ系またはＺＦＮ系）が、疾患または障害の予防、緩和、改善または治癒に使用されるヒト用途または獣医学用途に有利に使用され得る。一般に、これらの方法は、対象をそのような細胞を生成するように構成された改変細胞またはベクターまたはゲノム編集系と接触させる工程、および対象をＣＳＦ１Ｒアンタゴニストと接触させる工程を含む。
まず、本開示の方法が好適であり得る対象に目を向けると、任意の対象がこれらの方法による治療の候補であり得るが、対象の天然細胞または内因性細胞と比較してＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な応答を特徴とする、本開示の細胞と対象を接触させることによって予防、緩和、改善または治癒され得る神経疾患などの疾患に罹患しているか、またはそれに罹患すると予測されるか、もしくはそれに罹患する傾向がある対象を治療することが有利であり得る。上記を限定するものではないが、本開示の方法による治療に適した神経疾患は、認知症、神経変性疾患、脱髄疾患、気分障害または人格障害、外傷性脳損傷、遺伝性疾患、悪性腫瘍または良性腫瘍、転移性腫瘍または転移性増殖などを含み得る。
対象は、任意の好適な時点で、任意の好適な投与経路によって、例えば、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、実質内、髄腔内、頭蓋内（ｉｎｔｅｒｃｒａｎｉａｌ）、骨間もしくは他の注射もしくは注入、経皮投与（ベクターの場合）によって、および／または外科的埋込みもしくは外科的移植によって、本開示の改変細胞またはベクターと接触させられ得る。任意の好適な数の細胞、または任意の好適な力価のベクター、例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８個などの細胞、および／または１０１４、１０１３、１０１２、１０１１、１０１０、１０９個もしくはそれ以下のビリオンもしくはウイルスゲノムが投与され得る。改変細胞に関して、対象が接触させられる細胞は、対象自身の細胞に由来してもよいか（自己細胞）、または別のドナーに由来してもよい（同種細胞）。
当業者であれば、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する本開示の改変細胞の示差的な感受性は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの存在下で最も明確に現れ得ることを理解するであろう。したがって、対象はＣＳＦ１Ｒアンタゴニストといつでも接触させられ得るが（例えば、限定するものではないが、本開示の改変細胞と対象を接触させる前の前処理または前処置として）、本開示のいくつかの実施形態は、対象を改変細胞もしくはベクターと接触させる工程と同時におよび／またはその後にＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与することを含む。ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、連続的または不連続的に投与されてもよく、投与の開始または中止は、スケジュールされ得るかもしくは事前プログラムされ得るか、または対象からの生理学的読出し、例えば、バイオマーカー濃度、バイオマーカーもしくはその小分子活性成分もしくは代謝産物の血清濃度もしくは組織濃度、画像化シグナルもしくは徴候などに応答してもよい。
１つの非限定的な例として、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する低下した感受性（すなわち、部分的または完全な耐性）を示す改変細胞の場合、上記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、そのような細胞が占有するニッチ内の天然細胞の増殖または生存を減少させるために対象に投与され、それによって、改変細胞に選択的利点を付与し、場合により、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの非存在下で観察されるものと比較して、改変細胞の生着または他の挙動の速度を増加させてもよい。この投与は、対象を改変細胞またはベクターと接触させる工程の前に、それと同時に、またはその後に開始されてもよく、場合により終了されてもよい。上記を限定するものではないが、改変細胞がミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞である場合、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、改変ミクログリア系統細胞の移植前、移植と同時、および／または移植後に対象に投与されて、内因性ミクログリアの増殖および／または生存を制限し、それによって、普通ならば観察されるであろうよりも、改変ミクログリアの高度の生着および／または大きな空間分布をもたらし得る利点を改変ミクログリアに付与してもよい。
代替的にまたは追加的に、本開示の改変細胞は、未改変細胞と比較して、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する増加した感受性を示し得る。この場合、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストは、一般に（必ずしもそうとは限らないが）、対象を改変細胞と接触させる工程の前および最中は差し控えられ、代わりに、対象を改変細胞またはベクターと接触させた後に投与されて、例えば、治療過程の終了時に、生理学的もしくは薬理学的測定からのシグナルに応答して、および／または有害事象、もしくは改変細胞を利用した治療介入の有効性の低下に応答して、改変細胞の増殖または生存を制限する。
本開示の改変細胞は、場合により、同じタイプの天然細胞と比較して１つ以上の追加の改変を含む。これらの改変には、限定するものではないが、１つ以上の導入遺伝子、または変異を修正するか、もしくは遺伝子産物の発現を減少もしくは増加させる１つ以上の遺伝子改変が含まれ得る。上記を限定するものではないが、本開示は、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する感受性が低下したＣＳＦ１Ｒ対立遺伝子を発現するように操作されたミクログリア細胞、および酵素または結合タンパク質などの分泌導入遺伝子、アンチセンス、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ、キメラ抗原受容体などの細胞表面タンパク質、膜結合免疫グロブリンまたはその断片、アプタマーなどを含む。本開示はまた、実質的に上記のような細胞を作製するベクターおよび方法、ならびに対象を治療するために細胞またはベクターを使用する、対象を治療する方法を含む。
本開示を何らかの理論または機構に限定することを望むものではないが、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する現在特許請求されている細胞を実現するために、様々な方法を使用することができると考えられる。本明細書には、この目的を達成する非限定的な方法／例が記載されている。均等物または置換物は、本開示の範囲内である。
例
以下は、本発明の非限定的な例である。上記例は、本発明を限定することを決して意図するものではないことを理解されたい。均等物または置換物は、本発明の範囲内である。
ヒトミクログリア、ヒトマクロファージおよびヒト単球ならびに／またはそれらの前駆体細胞（造血前駆細胞（ＨＰＣ）および造血幹細胞（ＨＳＣ）、エリスロミエロイド前駆細胞（ＥＭＰ）または原始マクロファージ前駆細胞（ＰＭＰ）の競合的生着を促進するために、いくつかの手法を独立してまたは組み合わせて使用することができる。１）同じ結合ポケットへのＡＴＰの正常な結合を損なわずに、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの結合を立体的に妨害し得るアミノ酸置換を予測するために、アンタゴニスト（ＰＭＩＤ：３１４３４８７９）に結合したＣＳＦ１Ｒ受容体の以前に公開された結晶構造を使用すること。２）ＰＣＲを介したランダム変異誘発を使用してアミノ酸変化を導入し、続いて、ｉＰＳ－ミクログリアをＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに曝露し、次いで、生存変異体を配列決定して、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する耐性を付与するが、構成的に活性なＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を同時に誘導しない変異を同定すること。３）ＣＳＦ１Ｒの下流の遺伝子を改変すること、例えば、ＳＨＩＰ１（ＩＮＰＰ５Ｄ）の発現を欠失または一過性に低下させてＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を増強する。４）ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達のアゴニストが移植されているミクログリアを前処理することはまた、移植された細胞内のＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を調節し、一過性に増加させて、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト処置に対する耐性を促進するために、ｓｉＲＮＡ遺伝子送達手法またはマイクロＲＮＡ遺伝子送達手法を使用することもできる。最初の２つの戦略に関連する追加の詳細およびデータを以下に示す。
戦略１：同じ結合ポケットへのＡＴＰの正常な結合を損なわずに、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの結合を立体的に妨害し得るアミノ酸置換を予測するための、アンタゴニスト（ＰＭＩＤ：３１４３４８７９）に結合したＣＳＦ１Ｒ受容体の結晶構造。ヒトＣＳＦ１Ｒに結合したＰＬＸ５６２２の結晶構造を得、ＡＴＰ結合ポケットを調査した（図７Ａ）。分子モデリングを通して、ＣＳＦ１Ｒへの正常なＡＴＰ結合を破壊せずに、ＰＬＸ５６２２もしくはＰＬＸ３３９７または他のＣＳＦ１Ｒアンタゴニストの結合を損なう可能性が高い単一アミノ酸変化が予測された。具体的には、このモデリングは、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）またはシステイン（Ｃ）のいずれかによるアミノ酸Ｇ７９５の置換が、ＡＴＰの正常な結合能力を破壊することなく、ＰＬＸ５６２２および／またはＰＬＸ３３９７結合の立体障害を増加させることを示唆している（図７Ａおよび図７Ｂ）。結合を防ぐ他の変異も調査することができた（図７Ｄ）。これらの単一アミノ酸置換の各々、すなわち、Ｇ７９５Ａ、Ｇ７９５Ｖ、Ｇ７９５Ｃを有するヒトｉＰＳＣを生成するためにＣＲＩＳＰＲ標的化戦略を設計し、ＣＲＩＳＰＲ標的化戦略は、これらの改変ヒトｉＰＳＣ株を成功裏に産生した（編集された配列を示すサンガー配列決定クロマトグラムを図８に示す）。次いで、得られたｉＰＳＣをミクログリアに分化させ、様々な濃度のＰＬＸ３３９７またはＰＬＸ５６２２のいずれかに曝露した。ミクログリア細胞死（アポトーシス）を検出するために、カスパーゼ－３／７蛍光発生レポーターを使用した。図４Ａは、ＰＬＸ３３９７に応答した野生型（ＷＴ）未編集ヒトｉＰＳＣ－ミクログリア対Ｇ７９５ＡおよびＧ７９５Ｃ ＣＳＦ１Ｒ変異体株における細胞死の用量依存的誘導を示し、図４Ｂは、ＰＬＸ５６２２に対する応答を示す。ＰＬＸ化合物処理の２４時間以内に、ＷＴヒトミクログリアは、いずれかの化合物に応答して、アポトーシスの強固な用量依存的誘導を示す。対照的に、Ｇ７９５ＡおよびＧ７９５Ｃの両変異体株は、細胞死に対する完全な耐性を示す。図４Ｆは、ＰＬＸ３３９７およびＰＬＸ５６２２の各用量にわたる細胞密度（位相差顕微鏡法、１列目）および蛍光カスパーゼ－３／７活性（２列目）の代表的な画像を提供した。
結晶構造をさらに調査することにより、変異した場合にＰＬＸ５６２２および／またはＰＬＸ３３９７の結合の減少をもたらし得る他の位置も提示される。例には、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３およびＶ６４７（図４Ｄ）が挙げられる。これらの位置はいずれも、ＰＬＸ５６２２および／またはＰＬＸ３３９７の結合部位に密接に接触しており、変異した場合に結合を防ぎ得る。
戦略２：ＰＣＲを介したランダム変異誘発を使用してアミノ酸変化を導入し、続いて、ｉＰＳ－ミクログリアをＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに曝露し、次いで、生存変異体を配列決定して、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する耐性を付与するが、構成的に活性な、または抑制されたＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を同時に誘導しない変異を同定する。ＣＳＦ１Ｒ遺伝子にランダム変異を有するｉＰＳＣ細胞株または単球細胞株のプールを生成する。次いで、このプールをミクログリアに分化させ、ＣＳＦ１／ＩＬ－３４中止またはＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト処理のいずれかに応答して細胞の生存をモニタリングする。ＰＣＲおよび配列決定によって、これらの条件下でさらに長く生存する細胞を調査して、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する耐性を付与し得るＣＳＦ１Ｒ変異を同定する。次いで、カウンタースクリーニングを行って、過剰増殖、または増殖の顕著な喪失ももたらさないＣＳＦ１Ｒ変異を同定する。最適な変異が同定されたら、これらの変異を有するｉＰＳＣ株を拡大増殖させ、これらの株に由来するミクログリアをキメラモデルにおいてインビボで調査して、インビボでのＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する耐性を決定する。
蛍光発生カスパーゼ３／７検出器（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）と２４時間にわたる微速度撮影イメージングとを使用して、試験したＣＳＦ１Ｒ阻害剤の各々に対する耐性を定量した。ＷＴミクログリアは、２４時間のイメージングにわたって、ＤＭＳＯ対照処理と比較して、漸増濃度のＰＬＸ３３９７（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）、ＰＬＸ５６２２（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）、エディコチニブおよびＢＬＺ９４５に対して有意なレベルのカスパーゼの増加を示し、マクロファージコロニー刺激因子／コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の阻害に対する細胞死応答の増加が示された。一方、Ｇ７９５Ａ ｉＰＳＣ－ミクログリアおよびＧ７９５Ｃ ｉＰＳＣ－ミクログリアは、ＤＭＳＯ対照処理と比較して、漸増濃度のＰＬＸ３３９７、ＰＬＸ５６２２、エディコチニブまたはＢＬＺ９４５のいずれかに対してカスパーゼレベルの有意な増加を示さなかった。これらの結果は、遺伝子改変されたＣＳＦ１受容体の結果としてのＰＬＸ処理に対する獲得耐性を示す（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄおよび図４Ｅを参照）。
細胞死アッセイ：ｉＰＳ－ミクログリアを９６ウェルプレート当たり７０Ｋ細胞（６ウェル／株／条件）で播種した。時間０に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ １：１０００を用いて全ミクログリアを処理した。記載された培地、すなわち、新鮮完全培地＋０．１％ＤＭＳＯ、完全培地＋２５０ｎＭ ＰＬＸ３３９７、完全培地＋５００ｎＭ ＰＬＸ３３９７、完全培地＋１μｍ ＰＬＸ３３９７、完全培地＋２５０ｎＭ ＰＬＸ５６２２、完全培地＋５００ｎＭ ＰＬＸ５６２２、完全培地＋１μｍ ＰＬＸ５６２２、完全培地＋２５０ｎＭ エディコチニブ、完全培地＋５００ｎＭ エディコチニブ、完全培地＋１μｍ エディコチニブ、完全培地＋２５０ｎＭ ＢＬＺ９４５、完全培地＋５００ｎＭ ＢＬＺ９４５、完全培地＋１μｍ ＢＬＺ９４５中で細胞を維持した。ウェル当たり４つの２０×画像を２４時間にわたって１時間ごとに収集した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ２０２０Ｂソフトウェアを使用して、フェイズコンフルエンス（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）（視覚的にゲートアウトされたアポトーシス細胞）およびカスパーゼ３／７シグナル（緑色）のための画像マスクを生成した。グラフは、３つの株：ＷＴ、Ｇ７９５Ａ、Ｇ７９５Ｃを備えた、フェイズコンフルエンスに対して正規化されたカスパーゼを示す（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄおよび図４Ｅを参照）。
実施形態
以下の実施形態は、例示のみを意図しており、決して限定するものではない。
実施形態１：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ヒト細胞。
実施形態２：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸を含む、実施形態１の細胞。
実施形態３：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸を含む改変ヒト細胞。
実施形態４：ＣＳＦ１Ｒタンパク質に１つ以上の遺伝子改変を含む、実施形態１～３のいずれか１つの細胞。
実施形態５：１つ以上の遺伝子改変が、ＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列の変化をもたらし、変化が、Ｇ７９５、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３およびＶ６４７から選択されるアミノ酸残基の置換を場合により含む、実施形態４の細胞。
実施形態６：１つ以上の遺伝子改変が、改変ＡＴＰ結合ポケットをもたらす、実施形態１～５のいずれか１つの細胞。
実施形態７：改変ＡＴＰ結合ポケットが、減少した結合空間を有する、実施形態６の細胞。
実施形態８：改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合することができない、実施形態７の細胞。
実施形態９：改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＡＴＰに結合することができる、実施形態６の細胞。
実施形態１０：ＣＳＦ１Ｒタンパク質の１つ以上の遺伝子改変が、ＣＳＦ１Ｒタンパク質のＡＴＰ結合活性を妨害しない、実施形態１～９のいずれか１つの細胞。
実施形態１１：ＣＳＦ１Ｒタンパク質の１つ以上の遺伝子改変が、構成的に活性なＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を誘導しない、実施形態１～１０のいずれか１つの細胞。
実施形態１２：改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＣＳＦ１リガンドによって活性化される、実施形態１１の細胞。
実施形態１３：ＣＳＦ１リガンドが、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、実施形態１２の細胞。
実施形態１４：改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＩＬ－３４リガンドによって活性化される、実施形態１１の細胞。
実施形態１５：ＩＬ－３４リガンドが、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、実施形態１４の細胞。
実施形態１６：１つ以上の遺伝子改変が、エクスビボで導入される、実施形態４の細胞。
実施形態１７：１つ以上の遺伝子改変が、導入遺伝子をコードする核酸を細胞にトランスフェクトもしくは導入することによって、または標的とされるヌクレアーゼ、ニッカーゼもしくは塩基編集エフェクターもしくはリボ核タンパク質複合体を形質導入もしくは導入することによって誘導される、実施形態４の細胞。
実施形態１８：導入遺伝子をコードする核酸を細胞に導入することが、細胞をウイルスベクターと接触させることを含む、実施形態１７の細胞。
実施形態１９：改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む細胞が、野生型ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む細胞の遺伝子発現プロファイルを保持する、実施形態１～１８のいずれか１つの細胞。
実施形態２０：別の遺伝子に１つ以上の改変をさらに含む、実施形態１～１９のいずれか１つの細胞。
実施形態２１：ＣＳＦ１Ｒを発現している、実施形態１～２０のいずれか１つによる改変ヒト細胞。
実施形態２２：ＣＳＦ１Ｒを発現するように誘導および分化され、多能性幹細胞、造血幹細胞、エリスロミエロイド前駆細胞および造血前駆細胞からなる群から選択される、実施形態２１の細胞。
実施形態２３：ＣＳＦ１Ｒ発現細胞であり、ミクログリア、マクロファージ、単球または他の食細胞からなる群から選択される、実施形態２２の細胞。
実施形態２４：実施形態２０～２３のいずれか１つによるＣＳＦ１Ｒ発現細胞を含む組成物。
実施形態２５：ＣＳＦ１Ｒ発現細胞がＣＳＦ１Ｒ発現細胞である、実施形態２４の組成物。
実施形態２６：複数の細胞を含み、細胞の少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有するＣＳＦ１Ｒ発現細胞である、実施形態２５の組成物。
実施形態２７：対象を治療する方法であって、（ａ）対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与すること、および（ｂ）対象を、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と接触させることを含む方法。
実施形態２８：対象を治療する方法であって、（ａ）対象を、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と接触させること、および（ｂ）対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与することを含む方法。
実施形態２９：ＣＳＦ１Ｒ発現細胞がＣＳＦ１Ｒ発現細胞である、実施形態２７および実施形態２８の方法。
実施形態３０：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的な耐性または完全な耐性である、実施形態２７～２９のいずれか１つの方法。
実施形態３１：改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞が、野生型ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の遺伝子発現プロファイルを保持する、実施形態２７～３０のいずれか１つの方法。
実施形態３２：改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞が、神経疾患を治療するか、治癒させるか、改善するか、予防するか、または緩和するのに有用な遺伝子産物または他の遺伝子改変を発現する、実施形態２７～３１のいずれか１つの方法。
実施形態３３：遺伝子産物が、ＣＳＦ１Ｒ発現細胞によって普通ならば発現されない導入遺伝子である、実施形態３２の方法。
実施形態３４：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによって阻害されるＣＳＦ１Ｒシグナルが、対象にとって内因性のＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖または生存である、実施形態３３の方法。
実施形態３５：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と比較して内因性ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖および／または生存を減少させるのに十分な量で対象に投与される、実施形態２７～３４のいずれか１つの方法。
実施形態３６：対象を治療する方法であって、（ａ）対象を改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と接触させること、および（ｂ）改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と比較して、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖または生存を示差的に変化させることを含む方法。
実施形態３７：改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞がＣＳＦ１Ｒ発現食細胞である、実施形態３６の方法。
実施形態３８：改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して部分的に耐性である、実施形態３６および実施形態３７の方法。
実施形態３９：未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖または生存を示差的に変化させる工程が、改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と比較して未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖および／または生存を減少させるのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを対象に投与することを含む、実施形態３６の方法。
実施形態４０：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸組成物。
実施形態４１：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的な耐性または完全な耐性である、実施形態４０の組成物。
実施形態４２：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する増加した耐性である、実施形態４０の組成物。
実施形態４３：ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する示差的な耐性が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する低下した耐性である、実施形態４０の組成物。
実施形態４４：改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、１つ以上の遺伝子改変を含む、実施形態４０～４３のいずれか１つの組成物。
実施形態４５：１つ以上の遺伝子改変が、ＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列の変化をもたらし、変化が、Ｇ７９５、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３およびＶ６４７から選択されるアミノ酸残基の置換を場合により含む、実施形態４４の組成物。
実施形態４６：１つ以上の遺伝子改変が、改変ＡＴＰ結合ポケットをもたらす、実施形態４４の組成物。
実施形態４７：改変ＡＴＰ結合ポケットが、減少した結合空間を有する、実施形態４６の組成物。
実施形態４８：改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合することができない、実施形態４７の組成物。
実施形態４９：改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＡＴＰに結合することができる、実施形態４６の組成物。
実施形態５０：ＣＳＦ１Ｒタンパク質の１つ以上の遺伝子改変が、ＣＳＦ１Ｒタンパク質のＡＴＰ結合活性を妨害しない、実施形態４４の組成物。
実施形態５１：ＣＳＦ１Ｒタンパク質の１つ以上の遺伝子改変が、構成的に活性なＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を誘導しない、実施形態４４の組成物。
実施形態５２：改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＣＳＦ１リガンドによって活性化される、実施形態５１の組成物。
実施形態５３：ＣＳＦ１リガンドが、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、実施形態５２の組成物。
実施形態５４：改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＩＬ－３４リガンドによって活性化される、実施形態５１の組成物。
実施形態５５：ＩＬ－３４リガンドが、改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、実施形態５４の細胞。
実施形態５６：発現制御配列に作動可能に連結された、実施形態４０～５５のいずれか１つの核酸組成物を含む発現ベクター。
実施形態５７：培養細胞が、ポリペプチドを発現する、実施形態５６のベクターによってトランスフェクトされた培養細胞、または上記細胞の子孫。
実施形態５８：実施形態５６のベクターに感染した内因性細胞であって、ポリペプチドを発現する内因性細胞。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、参照された数の±２０％を指す。
本開示の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲の範囲を超えない修正をそれに加えることができることは当業者には容易に明らかであろう。したがって、本開示の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。いくつかの実施形態では、本特許出願で提示される図は、角度、寸法の比率などを含め、縮尺通りに描かれている。いくつかの実施形態では、図は代表的なものにすぎず、特許請求の範囲は図の寸法によって限定されない。いくつかの実施形態では、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用して本明細書に記載される本開示の説明は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と説明され得る実施形態を含み、したがって、語句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を使用して本開示の１つ以上の実施形態を特許請求するための書面による説明要件を満たす。
配列表３ ＜２２３＞ここで、ｎｎｎはＧＣＴである
配列表３ ＜２２３＞ここで、ｎｎｎはＧＣＣである
配列表３ ＜２２３＞ここで、ｎｎｎはＧＣＡである
配列表３ ＜２２３＞ここで、ｎｎｎはＧＣＧである
配列表５ ＜２２３＞ここで、ｎｎｎはＴＧＴである
配列表５ ＜２２３＞ここで、ｎｎｎはＴＧＣである
配列表７ ＜２２３＞ここで、ＮＮＮはＧＴＴである
配列表７ ＜２２３＞ここで、ＮＮＮはＧＴＣである
配列表７ ＜２２３＞ここで、ＮＮＮはＧＴＡである
配列表７ ＜２２３＞ここで、ＮＮＮはＧＴＧである

Claims (58)

  1. ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ヒト細胞。
  2. ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１に記載の細胞。
  3. ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸を含む改変ヒト細胞。
  4. 前記ＣＳＦ１Ｒタンパク質に１つ以上の遺伝子改変を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
  5. 前記１つ以上の遺伝子改変が、ＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列の変化をもたらし、前記変化が、Ｇ７９５、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３およびＶ６４７から選択されるアミノ酸残基の置換を場合により含む、請求項４に記載の細胞。
  6. 前記１つ以上の遺伝子改変が、改変ＡＴＰ結合ポケットをもたらす、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞。
  7. 前記改変ＡＴＰ結合ポケットが、減少した結合空間を有する、請求項６に記載の細胞。
  8. 前記改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合することができない、請求項７に記載の細胞。
  9. 前記改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＡＴＰに結合することができる、請求項６に記載の細胞。
  10. 前記ＣＳＦ１Ｒタンパク質の前記１つ以上の遺伝子改変が、前記ＣＳＦ１Ｒタンパク質のＡＴＰ結合活性を妨害しない、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞。
  11. 前記ＣＳＦ１Ｒタンパク質の前記１つ以上の遺伝子改変が、構成的に活性なＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を誘導しない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞。
  12. 前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＣＳＦ１リガンドによって活性化される、請求項１１に記載の細胞。
  13. 前記ＣＳＦ１リガンドが、前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、請求項１２に記載の細胞。
  14. 前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＩＬ－３４リガンドによって活性化される、請求項１１に記載の細胞。
  15. 前記ＩＬ－３４リガンドが、前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、請求項１４に記載の細胞。
  16. 前記１つ以上の遺伝子改変が、エクスビボで導入される、請求項４に記載の細胞。
  17. 前記１つ以上の遺伝子改変が、導入遺伝子をコードする核酸を前記細胞にトランスフェクトもしくは導入することによって、または標的とされるヌクレアーゼ、ニッカーゼもしくは塩基編集エフェクターもしくはリボ核タンパク質複合体を形質導入もしくは導入することによって誘導される、請求項４に記載の細胞。
  18. 導入遺伝子をコードする前記核酸を細胞に導入することが、前記細胞をウイルスベクターと接触させることを含む、請求項１７に記載の細胞。
  19. 改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む前記細胞が、野生型ＣＳＦ１Ｒタンパク質を含む細胞の遺伝子発現プロファイルを保持する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の細胞。
  20. 別の遺伝子に１つ以上の改変をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の細胞。
  21. ＣＳＦ１Ｒを発現している、請求項１～２０のいずれか一項に記載の改変ヒト細胞。
  22. ＣＳＦ１Ｒを発現するように誘導および分化され、多能性幹細胞、造血幹細胞、エリスロミエロイド前駆細胞および造血前駆細胞からなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞。
  23. ＣＳＦ１Ｒ発現細胞であり、ミクログリア、マクロファージ、単球または他の食細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の細胞。
  24. 請求項２０～２３のいずれか一項に記載のＣＳＦ１Ｒ発現細胞を含む組成物。
  25. 前記ＣＳＦ１Ｒ発現細胞がＣＳＦ１Ｒ発現細胞である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 複数の細胞を含み、前記細胞の少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有するＣＳＦ１Ｒ発現細胞である、請求項２５に記載の組成物。
  27. 対象を治療する方法であって、
    ａ）前記対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量でＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを前記対象に投与すること、および
    ｂ）前記対象を、前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と接触させること
    を含む方法。
  28. 対象を治療する方法であって、
    ａ）前記対象を、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を有する改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と接触させること、および
    ｂ）前記対象の細胞内でＣＳＦ１Ｒシグナルを阻害するのに十分な量で前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを前記対象に投与すること
    を含む方法。
  29. 前記ＣＳＦ１Ｒ発現細胞がＣＳＦ１Ｒ発現細胞である、請求項２７および請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する前記示差的な耐性が、前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的な耐性または完全な耐性である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞が、野生型ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の遺伝子発現プロファイルを保持する、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞が、神経疾患を治療するか、治癒させるか、改善するか、予防するか、または緩和するのに有用な遺伝子産物または他の遺伝子改変を発現する、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記遺伝子産物が、前記ＣＳＦ１Ｒ発現細胞によって普通ならば発現されない導入遺伝子である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストによって阻害される前記ＣＳＦ１Ｒシグナルが、前記対象にとって内因性のＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖または生存である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストが、前記改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と比較して前記内因性ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖および／または生存を減少させるのに十分な量で前記対象に投与される、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 対象を治療する方法であって、
    ａ）前記対象を改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と接触させること、および
    ｂ）前記改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と比較して、未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖または生存を示差的に変化させること
    を含む方法。
  37. 前記改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞がＣＳＦ１Ｒ発現食細胞である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞が、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して部分的に耐性である、請求項３６および請求項３７に記載の方法。
  39. 前記未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖または生存を示差的に変化させる工程が、前記改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞と比較して前記未改変ＣＳＦ１Ｒ発現細胞の増殖および／または生存を減少させるのに十分な量で前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストを前記対象に投与することを含む、請求項３６に記載の方法。
  40. ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対して示差的な耐性を示す改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質をコードする核酸組成物。
  41. 前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する前記示差的な耐性が、前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する部分的な耐性または完全な耐性である、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する前記示差的な耐性が、前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する増加した耐性である、請求項４０に記載の組成物。
  43. 前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する前記示差的な耐性が、前記ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに対する低下した耐性である、請求項４０に記載の組成物。
  44. 前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、１つ以上の遺伝子改変を含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記１つ以上の遺伝子改変が、ＣＳＦ１Ｒのアミノ酸配列の変化をもたらし、前記変化が、Ｇ７９５、Ｌ７８５、Ｍ６３７、Ｅ６３３およびＶ６４７から選択されるアミノ酸残基の置換を場合により含む、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記１つ以上の遺伝子改変が、改変ＡＴＰ結合ポケットをもたらす、請求項４４に記載の組成物。
  47. 前記改変ＡＴＰ結合ポケットが、減少した結合空間を有する、請求項４６に記載の組成物。
  48. 前記改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニストに結合することができない、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記改変ＡＴＰ結合ポケットが、ＡＴＰに結合することができる、請求項４６に記載の組成物。
  50. 前記ＣＳＦ１Ｒタンパク質の前記１つ以上の遺伝子改変が、前記ＣＳＦ１Ｒタンパク質のＡＴＰ結合活性を妨害しない、請求項４４に記載の組成物。
  51. 前記ＣＳＦ１Ｒタンパク質の前記１つ以上の遺伝子改変が、構成的に活性なＣＳＦ１Ｒシグナル伝達を誘導しない、請求項４４に記載の組成物。
  52. 前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＣＳＦ１リガンドによって活性化される、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記ＣＳＦ１リガンドが、前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質が、ＩＬ－３４リガンドによって活性化される、請求項５１に記載の組成物。
  55. 前記ＩＬ－３４リガンドが、前記改変ＣＳＦ１Ｒタンパク質のリン酸化を誘導する、請求項５４に記載の細胞。
  56. 発現制御配列に作動可能に連結された、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
  57. 培養細胞が、前記ポリペプチドを発現する、請求項５６に記載のベクターによってトランスフェクトされた培養細胞、または前記細胞の子孫。
  58. 請求項５６に記載のベクターに感染した内因性細胞であって、前記ポリペプチドを発現する内因性細胞。
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