CN117580871A - 哺乳动物细胞的基因修饰赋予对csf1r拮抗剂的抗性 - Google Patents

Abstract

小胶质细胞/单核细胞存在于“生态位”中，这限制了哺乳动物中枢神经系统(CNS)内驻留的小胶质细胞/单核细胞/巨噬细胞的总数。因此，需要有助于治疗性地修饰小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞或产生它们的细胞的方法，以与内源性小胶质细胞竞争并部分或完全占据CNS生态位。本公开的特征在于治疗性小胶质细胞、单核细胞或巨噬细胞，与内源性脑内驻留的小胶质细胞相比，它们在对CSF1R抑制剂的响应中具有选择性优势。具体地，本公开中开发的治疗性细胞在足以杀死内源性小胶质细胞的给定剂量的CSF1R抑制剂下不会死亡。本文记载的治疗性细胞可用于治疗神经系统疾病。

Description

哺乳动物细胞的基因修饰赋予对CSF1R拮抗剂的抗性

相关申请的交叉引用

本申请请求2021年4月1日提交的美国临时申请号63/169,578和2021年8月25日提交的美国临时申请第63/236,951号的优先权，它们的内容通过引用而整体并入本文。

序列表的引用

申请人声明，在第13条之三第1(a)款下以附件C/ST.25文本文件的形式标题为>＞>UCI 21.03PCT序列表_ST25<<<提交的记录的信息，与提交的国际申请的组成部分相同。序列表的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容的特征在于，用于治疗神经系统疾病的方法和组合物；特别地，所述方法和组合物的特征在于细胞对CSF1R拮抗剂具有部分或完全抗性。

背景技术

几乎每种人类神经系统疾病和损伤都涉及小胶质细胞(大脑的驻留免疫细胞)的功能、基因表达和激活状态的损伤或改变。在某些情况下，小胶质细胞的基因突变是神经系统疾病的主要原因，而在其他疾病中，小胶质细胞基因的多态性增加了患上这种疾病的风险。不幸的是，对于许多这些疾病和伤害，几乎没有有效的治疗方法。

小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞存在于一个“生态位(niche)”内，该生态位可限制驻留在哺乳动物中枢神经系统(CNS)内的小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞的总数。因此，需要能够帮助治疗性地修饰小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞或产生它们的细胞以与内源性小胶质细胞竞争并部分或完全占据CNS生态位的方法。本公开内容的目标是开发基于小胶质细胞的治疗方法，包括将基因修饰的人类小胶质细胞或相关的单核细胞谱系或祖细胞移植到患者体内的方法。

发明内容

本公开内容的目的在于提供允许对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性(例如，部分的；完全的；增加的；减少的)的组合物和方法，用于治疗神经系统疾病。

小胶质细胞依靠通过两个配体(CSF1和IL-34)的CSF1R信号传导来存活、增殖和自我更新。用各种CSF1R拮抗剂治疗哺乳动物模型减少了中枢神经系统内小胶质细胞的数量。此外，当这些化合物被去除时，存活的小胶质细胞增殖并迅速重新填充生态位。此外，已发现移植到小鼠脑中的来源于人类干细胞的小胶质细胞还易受CSF1R抑制影响并被其杀死(图11F，11G，11H，11I，11J)。

为了与内源性生态位竞争，治疗性小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞或它们的祖细胞或前体在对CSF1R抑制剂的响应方面与内源性脑驻留小胶质细胞相比需要具有选择性优势。具体地，人们需要开发出在足以杀死内源性小胶质细胞的给定剂量的CSF1R抑制剂下不会死亡的治疗性细胞。在某些情况下，这种选择性优势应该只是部分的，以便出于安全目的的需要，更高剂量的CSF1R抑制剂也可以杀死治疗性小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞或其祖细胞或前体。

在一些实施方案中，本公开内容的特征在于包含核酸的细胞(例如，经修饰的人类细胞)，该核酸编码对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白(例如，人CSF1R蛋白)。在其他实施方案中，本公开内容的特征在于经修饰的人类细胞，其表现出对CSF1R拮抗剂的差异化抗性。在另一实施方案中，本公开内容的特征在于经修饰的人类细胞，其包含编码对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的修饰的CSF1R蛋白的核酸。

在一些实施方案中，本公开内容的特征还可以在于治疗受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂，并将受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)接触。在其他实施方案中，所述方法可包括将受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)接触，并向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂。

在另一实施方案中，本公开内容的特征还可以在于治疗受试者的方法。所述方法包括将受试者与修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)接触，并差异化地改变未修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)相对于经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)的增殖或存活。

在一些实施方案中，本公开内容的特征还可以在于编码经修饰的CSF1R蛋白的核酸组合物和载体，该经修饰的CSF1R蛋白如本文中所述的表现出对CSF1R拮抗剂的差异化抗性。

本公开内容的技术特征包括利用对CSF1R拮抗剂的差异化抗性(例如，部分的、完全的、增加的或降低的抗性)来制造治疗性小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞或它们的祖细胞或前体，用于治疗神经系统疾病。在不希望将本公开内容限制在任何理论或机理的情况下，人们认为本公开内容的技术特征有利地提供了由对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性(例如，CSF1R拮抗剂抗性)的多能干细胞产生小胶质细胞、单核细胞、HSPC(造血干细胞或祖细胞)或原始巨噬细胞。如本文记载的，在没有某种形式的调节或选择性优势的情况下，上述细胞的移植将可能表现出仅部分或有限地植入中枢神经系统(CNS)。本公开内容开发了当前描述的方法，其将显著地促进小胶质细胞、巨噬细胞，或单核细胞或它们的祖细胞(HSPC，PMP)在哺乳动物大脑中的治疗性植入。目前已知的现有参考文献或研究均不具有本发明独特的、创造性的技术特征。

本公开内容的组合物和方法代表了与CSF1R拮抗剂在医学中使用的当前模式的显著偏离。例如，现有技术教导使用CSF1R抑制剂来清除内源性小胶质细胞并促进骨髓和/或血液来源的单核细胞进入大脑。然而，渗入大脑的骨髓和/或血液来源的单核细胞即使在渗入数月后，在功能和转录方面仍与小胶质细胞保持不同。此外，骨髓和/或血液来源的单核细胞对CSF1R拮抗剂的敏感性与小胶质细胞不同，这表明这些细胞不是小胶质细胞。这是背离本公开内容的教导，本公开内容促进包含经修饰的CSF1R蛋白的治疗性小胶质细胞(例如，人小胶质细胞)的扩增，用于治疗神经系统疾病。

此外，大多数主要的制药公司已开发出用于治疗某些形式的癌症的CSF1R拮抗剂化合物。然而，内源性小胶质细胞对CSF1R拮抗剂极为敏感，并且会在使用更高剂量的这些化合物治疗时死亡。移植到小鼠脑中的人类干细胞来源的小胶质细胞(图11F，11G，11H，11I，11J)，以及培养的人小胶质细胞(图4A、4B、4C、4D和4E)，也是如此。矛盾的是，本公开内容利用对小胶质细胞有毒的化合物(例如，CSF1R拮抗剂)来改进移植的小胶质细胞(例如，移植的治疗性小胶质细胞，即包含经修饰的CSF1R蛋白的小胶质细胞)的长期植入。本公开内容的方法解决了实现移植的小胶质细胞(例如，移植的治疗性小胶质细胞，即包含经修饰的CSF1R蛋白的小胶质细胞)广泛植入通常不适合这种植入的已建立的小胶质细胞生态位中的难题。

此外，本公开内容的技术特征促成了令人惊讶的结果，并说明了与这些突变相关的结果的不可预测性。例如，在抑制剂治疗24小时后进行评估时，所提出的两个点突变在多个递增剂量下导致对两种CSF1R抑制剂(即CSF1R拮抗剂)的完全(100％)保护(图4A、4B、4C、4D和4E)。相比之下，第3个突变G795V阻止了iPSC成功分化为小胶质细胞(图1)。这些数据证明了引入CSF1R的特定的DNA和由此产生的氨基酸变化的重要性，虽然一些变化将实现对CSF1R抑制剂(即CSF1R拮抗剂)预期的抗性，但其他的变化可能会损害小胶质细胞分化或存活的能力。

因此，本公开内容的特征在于促进人小胶质细胞、巨噬细胞和单核细胞和/或其前体细胞(HSPC、红系骨髓细胞祖细胞(EMP))或原始巨噬细胞祖细胞(PMP))的竞争性植入的方法和组合物。细胞可具有多种来源，包括但不限于多能干细胞，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPSC)、骨髓来源的造血干细胞、脐带血细胞、血液来源的单核细胞、胎儿卵黄囊或组织巨噬细胞、成人组织来源的巨噬细胞，或通过将另一种细胞类型直接重编程为小胶质细胞、HSPC、单核细胞或巨噬细胞。此外，本公开内容的特征在于可促进表达CSF1R的细胞的竞争性植入的方法和组合物，包括但不限于来自心脏、皮肤、肝脏、肺、肾脏、眼睛、前列腺和卵巢的细胞。

本文中记载的任何特征或特征的组合都包括在本公开内容的范围内，条件是任何此类组合中包含的特征不相互矛盾，这在上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识中是显而易见的。本公开内容的其它优点和方面在以下详细描述和权利要求书中是显而易见的。

附图说明

本公开内容的特征和优点将通过考虑与附图相关的以下详细描述而变得显而易见，其中：

图1显示了对照和CSF1R突变体小胶质细胞的体外生长动力学。将等基因iPSC来源的造血祖细胞向小胶质细胞分化，并在前14天使用细胞密度。两个野生型等基因对照系(Cntl-1和Cntl-2)表明，iPSC小胶质细胞的增殖率预计存在一定程度的变化。hCSF1RG795A和G785C突变体显示出与两个对照系相当的增殖率。相比之下，hCSFR G794V突变体表现出细胞密度的快速降低，在分化第6天之后没有存活细胞残留。这些数据表明，氨基酸取代的特定选择对于成功产生也能表现出CSF1R拮抗剂抗性的存活的小胶质细胞至关重要。

图2A、2B、2C、2D、2E和2F显示所选择的CSF1R突变对转录组特征几乎没有影响，同时赋予对PLX5622的抗性。图2A显示了使用前2,000个基因的主成分分析，揭示了数据集中变化的主要来源是对PLX5622的WT响应。图2B和图2C显示了用DMSO处理的MUT1(即G795A；图2B)或MUT2(即G795C；图2C)和WT小胶质细胞之间的皮尔逊相关系数的线性回归分析和计算，证实了在检查全转录组以及249个基因的核心小胶质细胞基因特征时的高度一致性，。图2D、2E和2F显示了与DMSO处理的细胞相比，用PLX5622对WT(图2D)、MUT1(即G795A；图2E)和MUT2(即G795C；图2F)小胶质细胞进行24小时处理在WT细胞中诱导了显著的转录组变化(FDR≤0.05；log2(FC)≥±1)。然而，对MUT1和MUT2系的处理均未能显著地改变基因表达，表明这些系对PLX5622的影响具有抗性。

图3显示了CSF1R突变体和对照xMGs(小胶质细胞)的距离矩阵。RNA-seq表达计数使用方差稳定变换(a variance stabilizing transformation)进行归一和转化。计算所有样本之间的成对欧几里得(Euclidean)距离，并根据距离对样本进行分层聚类(hierarchically clustered)。这些数据表明，G795A突变体小胶质细胞的转录组与WTCSF1R小胶质细胞的转录组最为等同。

图4A、4B、4C、4D和4E显示了人类干细胞来源的小胶质细胞还在体外易受CSF1R抑制影响并被其杀死。图4A显示了在含有0.1％DMSO、250nm PLX3397、500nm PLX3397和1μmPLX 3397的完全培养基的培养物中在24小时内成像的半胱天冬酶3/7的水平。在IncucyteS3活细胞成像仪上成像。图4B显示了在含有0.1％DMSO、250nm PLX5622、500nm PLX5622和1μm PLX5622的完全培养基的培养物中在24小时内成像的半胱天冬酶3/7水平。在IncucyteS3活细胞成像仪上成像。图4C显示了在含有0.1％DMSO、250nm依地可替尼(Edicotinib)(JNJ-40346527)、500nm依地可替尼和1μm依地可替尼的完全培养基的培养物中在24小时内成像的半胱天冬酶3/7水平。在Incucyte S3活细胞成像仪上成像。图4D显示了在含有0.1％DMSO，250nm BLZ945，500nm BLZ945和1μm BLZ945的完全培养基的培养物中在24小时内成像的半胱天冬酶3/7水平。在Incucyte S3活细胞成像仪上成像。图4E显示了野生型(Wildtype)、G795A和G795C小胶质细胞在PLX3397培养24小时后半胱天冬酶3/7荧光活性的代表性图像。对于所有面板，对6个独立孔中的n＝4图像进行了定量。数据表示为平均值±SEM。

图5A和图5B显示了G795A iPSC来源的小胶质细胞对CSF1R拮抗剂诱导的细胞死亡的抗性。由于细胞可能死于半胱天冬酶介导的细胞凋亡以外的过程，因此确定G795A突变是否对CSF1R拮抗剂诱导的任何形式的细胞死亡提供更广泛的抗性非常重要。因此，G795A和野生型(WT)iPSC-小胶质细胞用500nM(图5A)或1μM(图5B)的DMSO载体对照或如下四种CSF1R拮抗剂中的一种处理24小时：PLX3397、PLX5622、依地可替尼(Edicotinib)和BLZ945。然后使用双色生存能力/细胞毒性方法(Thermo L3224；LIVE/DEAD^TM生存能力/细胞毒性试剂盒)对活细胞与死细胞的百分比进行定量。用DMSO处理24小时后观察到非常少的死亡小胶质细胞。相比之下，用CSF1R拮抗剂处理诱导野生型小胶质细胞中大量细胞死亡，但G795A小胶质细胞中几乎不会诱导细胞死亡。活细胞用圆圈表示。

图6显示了用25ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(Peprotech#300-25)处理表达突变体CSF1R的小胶质细胞在48小时后刺激CSF-1R/M-CSF-R蛋白的酪氨酸磷酸化，如Phospho-CSF-1R/M-CSF-R(panTyr)Sandwich ELISA Kit n＝7所检测的。表达CSF1R G795A的小胶质细胞相似地磷酸化，而与WT小胶质细胞相比，表达CSF1RG795C的小胶质细胞表现出升高的磷酸化水平。这些数据表明，虽然G795A和G795C都赋予对CSF1R拮抗剂的抗性，但G795C突变可能导致增强的CSF1R信号传导。数据表示为平均值±SEM。

图7A、7B、7C和7D显示了与CSF1R拮抗剂结合的CSF1R受体的晶体结构。图7A显示了与PLX5622 CSF1R拮抗剂结合的人CSF1R受体，图7B显示了与PLX3397CSF1R拮抗剂结合的CSF1R受体。检查晶体结构以预测氨基酸取代，这些氨基酸取代可能在空间上阻碍CSF1R拮抗剂的结合，同时不损害ATP与同一结合口袋的正常结合。与人CSF1R结合的CSF1R拮抗剂PLX5622(图7A)或PLX3397(图7B)的晶体结构先前已公开。利用这些公开可用的数据，检查了ATP结合口袋。通过分子建模，预测了单个氨基酸的变化(图7C)，这可能会损害PLX5622、PLX3397或其他CSF1R拮抗剂的结合，同时不会破坏ATP与CSF1R的正常结合。具体地，这个模型表明，用丙氨酸(A)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)取代氨基酸G795将增加PLX5622和/或PLX3397结合的空间位阻，而不会破坏ATP的正常结合能力。也可探索其他突变以防止结合(图7D)。

图8显示了DNA色谱图，其证明了等基因人iPSC细胞系的成功产生，所述等基因人iPSC细胞系编码在CSF1R编码序列中第795位的单个氨基酸点的突变。在这种特殊案例中，每个细胞系通过CRISPR介导的基因编辑产生。然而，类似的变化可以通过多种其他基因编辑方法引入，包括但不限于TALEN、传统的同源重组、病毒基因递送或其他CRISPR变体。

图9A、9B、9C、9D和9E显示了选择的CSF1R突变对体内转录组特征几乎没有影响。图9A显示使用前2,000个基因的主成分分析揭示了G795A、G795C和WT小胶质细胞之间变化的主要来源归因于个体动物，而非CSF1R突变。相反，当比较G795V时，基于这个突变存在一些分离，进一步表明G795V可能无法在不实质性地改变基因表达的情况下产生小胶质细胞。图9B和图9C显示了G795A(图9B)或G795C(图9C)与WT小胶质细胞之间的皮尔逊(Pearson)相关系数的线性回归分析和计算，证实了在检查全转录组和190个基因核心小胶质细胞特征时的高度一致性。图9D和图9E显示了与WT细胞相比，在MITRG小鼠移植后2个月外植的人小胶质细胞的火山图，显示在突变细胞中表现出最小的显著转录组改变(FDR≤0.05；log2(FC)≥±1)。

图10A和图10B显示了G795A iPSC来源的小胶质细胞表现出在体内异种移植后与等基因野生型iPSC来源的小胶质细胞高度相似的转录组特征。异种移植相容的小鼠用野生型(WT)或G795A iPSC-小胶质细胞移植，且在两个月后，通过批量RNA测序分离并检查人细胞。图10A显示了从个体WT和移植了G795A的小鼠中分离出的xMG的所有检测到的基因之间的相关性。个体小鼠受体之间的差异导致一些变化，但WT和G795xMG保持高度相关，R²在0.80和0.95之间。图10B显示了使用进一步选择的小胶质细胞特异性基因列表进行的类似比较。这种比较同样揭示了野生型和G795A xMG之间的强相关性，R²在0.78和0.97之间。与先前的体外RNA测序分析一致，这些结果表明，G795ACSF1R突变对体内植入后人小胶质细胞的潜在转录组几乎没有影响，并且大多数检测到的差异是由于个体小鼠移植受体之间的差异导致的。

图11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I和11J显示了G795A iPSC来源的小胶质细胞对CSF1R激动剂治疗具有抗性，并且能够将人小胶质细胞牢固地植入成年哺乳动物的大脑中。异种移植相容的小鼠在2个月大时接受双侧立体定向海马内500,000个iPSC来源的人小胶质细胞(xMG)注射。小鼠接受从纯合子CSF1R抗性G795A人iPSC系或等基因未修饰的野生型人iPSC分化的xMG。在4岁时，在啮齿动物随意进食中用600mg/kg PLX3397治疗小鼠4周。然后处死小鼠，并通过荧光免疫组织化学和共聚焦显微镜检查半个大脑。图11A-11E显示了在一个月的PLX3397治疗过程中，G795A xMG从海马体和皮层内的初始注射部位开始增殖和扩增。小胶质细胞用IBA-1(图11A和11F)标记，人特异性标记物Ku80(图11B和11G)用于共标记人小胶质细胞的细胞核，Ki67(图11C和11H)用于证实增殖的人xMG向皮层和丘脑中残留的未占用的生态位迁移的“波前”(箭头)。图11E显示图11D中框状区域的更高功率图像表明所有IBA1+小胶质细胞共表达Ku80。相反，只有少量野生型人xMG在PLX3397治疗后存活一个月(图11F-11I)。例如，图11J中的箭头显示图11I所示的框状区域内仅有四个存活的的xMG。

图12显示了移植到成年hCSF1小鼠中后CSF1R-G795A人iPSC小胶质细胞植入的定量。将CSF1R-G795A iPSC-小胶质细胞移植到完全占据的成人小胶质细胞生态位(未用CSF1R拮抗剂治疗)中，产生了非常有限的人小胶质细胞植入(占小胶质细胞总量的5-10％)，其通过小胶质细胞标志物IBA1和人特异性核标记物Ku80(Ku80+/Iba1+)的共定位测量。相反，当CSF1R-G795A iPSC-小胶质细胞移植后，用含有PLX3397的小鼠食物(食物中600mg/kg PLX3397)治疗小鼠10天时，人小胶质细胞的百分比增加到将近25％。经过30天的PLX3397治疗(食物中600mg/kg PLX3397)，大脑中90-95％的小胶质细胞是人的，Ku80和IBA1的共表达证明了这一点。通过移植CSF1R-G795A iPSC-小胶质细胞并在移植前、移植中或移植后改变CSF1R拮抗剂治疗的浓度和持续时间，可控制人iPSC-小胶质细胞植入的程度。

具体实施方式

尽管已详细描述了本公开的实施方式，但对于本领域技术人员来说，某些变化和修改是显而易见的，包括不提供本文所记载的所有特征和益处的实施方式。本领域技术人员可理解，本公开内容的范围超出了具体公开的实施方式，扩展到其它替代或附加实施方式和/或用途，以及其明显的修改和等同物。此外，虽然已经以不同程度地详细地显示并记载了许多变化，但在本公开内容的范围内的其他修改基于本公开内容对于本领域技术人员将是显而易见的。还设想可对实施方式的特定特征和方面进行多种组合或子组合，且仍然落入本公开内容的范围。相应地，应理解公开的实施方式的多个特征和方面可以相互组合或替代，以形成本公开内容的不同模式。因此，本公开内容的范围不应受到本文所记载的特定公开实施方式的限制。

本文所用的单数形式“一种(a/an)”和“所述”也意在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，如果具体说明和/或权利要求中使用术语“包括”、“具有”、“用”或其变体，则此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式进行包括。

术语

本文使用的“表达CSF1R的细胞”可指表达CSF1R的细胞或可经诱导表达CSF1R的细胞或分化为表达CSF1R的细胞。表达CSF1R的细胞的非限制性例子可包括但不限于小胶质细胞、单核细胞、HSPC(造血干细胞或祖细胞)、巨噬细胞、树突状细胞、朗格汉斯(Langerhans)细胞、库普弗(Kupffer)细胞、霍夫鲍尔(Hofbauer)细胞、绒毛外滋养层细胞、吞噬细胞或来自多能干细胞的原始巨噬细胞。此外，表达CSF1R的细胞可指通过基因或小分子方法直接从iPSC、单核细胞或纤维原细胞重编程的小胶质细胞。

本文使用的“表达CSF1R的吞噬细胞”可指表达CSF1R受体且具有吞噬能力的细胞；细胞利用其质膜吞噬细胞外颗粒或细菌、底物、蛋白质、脂质或聚体，然后将这个区域内化以形成吞噬体的过程。表达CSF1R的吞噬细胞的非限制性实例可包括但不限于小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或其他吞噬细胞。在一些实施方式中，表达CSF1R的吞噬细胞是表达CSF1R的细胞。

本文使用的“差异化抗性”可指在经修饰的细胞中发生的一种状态，其中CSF1R拮抗剂对CSF1R信号的抑制表现出，与未修饰的细胞中观察到的不同的剂量-响应关系或响应幅度。在其他实施方式中，差异化抗性可指未修饰的表达CSF1R的细胞相对于修饰的表达CSF1R的细胞的增殖或存活的改变。在一些实施方式中，差异化抗性可包括对CSF1R拮抗剂的部分、完全、增加或降低的抗性。

本文使用的“CSF1R信号抑制”可指在CSF1R信号级联(例如，磷酸化或去磷酸化事件、基因表达等)的步骤中由CSF1R拮抗剂导致的剂量依赖性减少。

本文使用的“部分抗性”是指仍被高剂量的CSF1R拮抗剂破坏的经修饰的细胞。部分抗性可能是由于结合常数(Kd)或ATP增加、激酶活性降低、与CSF1配体的结合亲和力降低或信号转导减少。

本文使用的“完全抗性”是指在任何浓度的拮抗剂下都不会发生CSF1R信号抑制的经修饰的细胞。

本文使用的“增加的抗性”是指经修饰的细胞，其中，相对于在未修饰的细胞中观察到的，在拮抗剂浓度增加的情况下，发生CSF1R信号抑制。

本文使用的“降低的抗性”是指经修饰的细胞，其中，相对于在未修饰的细胞中观察到的，在受体拮抗剂浓度降低的情况下，发生CSF1R信号抑制。

本文所用的术语“受试者”和“患者”可互换使用。本文使用的受试者可以是非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠等)或灵长类动物(例如，猴子、猿和人)。在特定实施方式中，受试者是人。在一个实施方式中，受试者是患有本文记载的疾病、障碍或病症的哺乳动物(例如，人)。在另一个实施方式中，受试者为具有发展为本文记载的疾病、障碍或病症的风险的哺乳动物(例如，人)。在某些情况下，患者一词是指接受医疗护理的人或接受兽医护理的动物。

本文使用的术语“神经系统疾病”是指影响大脑以及遍布全身和脊髓的神经的损伤、创伤、病症或疾病。

本文使用的术语“处理”、“治疗”或“疗法”是指治疗性处理以及预防性或预防措施，其中，目的是预防或减缓疾病(例如，神经系统疾病)的发展，例如，减缓病症的发展，或减少病症、疾病或障碍的至少一种不良反应或症状，例如，任何以器官或组织功能不足或不理想为特征的病症。如果一种以上的症状或临床标志物减少，那么治疗通常如本文定义的那样是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状的改善或疾病标志物的减少，还包括在没有治疗的情况下预期的症状进展或恶化的停止或减缓。有益或期望的临床结果包括但不限于缓解一种以上的症状、减轻疾病程度、稳定(例如，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也意味着与不接受治疗的预期生存期相比延长的生存期。“治疗”还包括改善疾病、减轻其并发症的严重程度、防止其显性、防止其复发、仅防止其恶化、减轻其中包括的炎症反应或影响以上任何一项的治疗尝试，即使这种治疗尝试最终不成功。

现在参考图1-12，本公开内容的特征在于用于产生和使用经治疗性设计的表达CSF1R的细胞(例如，治疗性小胶质细胞)的方法和组合物，这些细胞对用于治疗神经退行性疾病的CSF1R拮抗剂具有差异化抗性。

中枢神经系统内的细胞可存在于“生态位”内，其可限制能驻留在哺乳动物CNS内的细胞总数。本公开内容旨在使用表达CSF1R的细胞(例如，表达CSF1R的吞噬细胞、HSPC、树突状细胞、红系骨髓细胞祖细胞、小胶质细胞、巨噬细胞或单核细胞)来开发用于神经系统疾病和损伤的新疗法。然而，对于某些疾病，这些细胞在CNS内的植入和/或成熟可能会受到现有的内源性小胶质细胞存在的限制。对于这种情况，一种能够为移植的哺乳动物细胞提供选择性存活或增殖优势的方法将改善植入，从而改善治疗活性。重要的是，这种做法也必须是安全的且不会引起不受控制的增殖。

本公开内容的特征在于分化为表达CSF1R的细胞的经修饰的表达CSF1R的细胞或其祖细胞或干细胞，其中，经修饰的表达CSF1R的细胞对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性。还包含根据本公开内容的制造经修饰的细胞的方法，其可包括，在诱导来源于多能干细胞(iPSC)或造血干细胞和祖细胞(HSPC)的经修饰细胞的情况下，将修饰引入未分化的细胞中，可选地筛选或选择修饰，以及将经修饰的细胞分化为细胞或细胞谱系，例如单核细胞或巨噬细胞谱系。

本公开内容的特征在于对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的细胞(例如，人细胞)。在一些实施方式中，本公开内容的特征在于对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的人类细胞。本公开内容的特征还可以在于包含编码经修饰的CSF1R蛋白的核酸的细胞(例如，人类细胞)，该经修饰的CSF1R蛋白对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性。在一些实施方式中，本公开内容的特征在于包含编码经修饰的CSF1R蛋白的核酸的修饰的人类细胞，所述经修饰的CSF1R蛋白对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性。在一些实施方式中，本公开内容的细胞(例如，人类细胞)表达CSF1R，并且可以是表达CSF1R的细胞。在其他实施方式中，本公开内容的细胞(例如，人类细胞)可被诱导或分化以表达CSF1R。

本公开内容的特征还可以在于本文记载的表达CSF1R的经修饰的细胞。在一些实施方式中，本公开内容的特征在于本文记载的表达CSF1R的经修饰的人类细胞。所述细胞可被诱导和/或分化以表达CSF1R，并且可选自多能干细胞、造血干细胞、红系骨髓细胞祖细胞和造血祖细胞。

在一些实施方式中，表达CSF1R的细胞(例如，表达CSF1R的人类细胞)可包括但不限于小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞或其它吞噬细胞。在其他实施方式中，可被诱导或分化以表达CSF1R的细胞可包括但不限于多能干细胞、造血干细胞、红系骨髓细胞祖细胞或造血祖细胞。在一些实施方式中，经修饰的细胞(例如，经修饰的人类细胞)是前体细胞，包括但不限于小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血祖细胞(HPC)和造血干细胞(HSC)、红系骨髓细胞祖细胞(EMP)、原始巨噬细胞和原始巨噬细胞祖细胞(PMP)或脐带血造血干细胞。

在一些实施方式中，经修饰的细胞对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性。在一些实施方式中，CSF1R拮抗剂可包括但不限于PLX5622、PLX3397(培昔达替尼(pexidartinib))、BLZ945、Ki20227、JNJ-40346527；JNJ-527(依地可替尼(Edicotinib))、cFMS受体抑制剂II、AZ304、ARRY-382、YM-90709、GW2580、PLX108-01、PLX7486、PLX647、ARRY-382、JNJ-40346527、Emactuzumab(RG7155)、AMG820、IMC-CS4(LY3022855)、MCS110、BPR1R024、AZD7507、JTE-952、JNJ-28312141、c-FMS-IN-8或CSF1R-IN-22。

在其他实施方式中，CSF1R拮抗剂可包括任何抑制CSF1R与其同源配体(例如CSF1或IL-34)、底物或下游效应子相互作用的化合物。抑制CSF1R与其同源配体、底物或下游效应子相互作用的化合物的非限制性实例包括但不限于阻断CSF1R与磷脂酶C-γ2(PLCg2)、脾酪氨酸激酶(Syk)和Grb2/Gab2/Shp2络合物之间相互作用的抗体或药物。在一些实施方式中，差异性CSF1R拮抗剂抗性通过修饰CSF1R下游的基因赋予。非限制性实例可包括但不限于INPP5D(SHIP1)、TREM2、DAP12、PLCG2、PI3K、AKT、PKC、FIMP、JNK、A-SMase、脾酪氨酸激酶(Syk)和Grb2/Gab2/Shp2络合物。在其他实施方式中，部分CSF1R拮抗剂抗性通过用CSF1R信号转导的激动剂或拮抗剂预处理小胶质细胞赋予。在进一步的实施方式中，CSF1R拮抗剂可包括任何通过阻断ATP结合位点(即ATP结合口袋)来抑制CSF1R信号传导的化合物。

表1显示了野生型CSF1R序列和经修饰的CSF1R氨基酸序列(即本文记载的经修饰的CSF1R蛋白)的非限制性实例，以及编码本文记载的经修饰CSF1R蛋白的核酸序列的非限制性实例。这些核酸的实例包括与野生型核酸序列相比具有一个以上沉默或保守核酸取代的那些核酸。粗体的核酸(NA)是其中一个以上沉默或保守的核酸取代可结合到序列中的实例。本文的说明中突出显示了潜在的核酸。

在一些实施方式中，细胞(例如，经修饰的人类细胞)在用于CSF1R受体(即CSF1R蛋白)的基因中包含一种以上的基因修饰。在一些实施方式中，细胞(例如，经修饰的人类细胞)在CSF1R蛋白(即CSF1R受体)中包含一种以上的基因修饰。

在一些实施方案中，CSF1R受体(即CSF1R蛋白)中一种以上的基因修饰不诱导组成性活性的CSF1R信号传导。经修饰的CSF1R受体(即CSF1R蛋白)仍可被CSF1R蛋白的配体激活(例如，磷酸化)。在一些实施方式中，CSF1R蛋白的配体可包括但不限于CSF1、IL-34、CSF1R激动剂、活化抗体，或它们的组合。在一些实施方式中，经修饰的CSF1R蛋白通过CSF1配体激活。在一些实施方式中，CSF1配体诱导经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。在其他实施方式中，经修饰的CSF1R蛋白通过IL-34配体激活。在一些实施方式中，IL-34配体诱导经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

在一些实施方式中，一种以上的基因修饰导致经修饰的ATP结合口袋。CSF1R受体(即CSF1R蛋白)的经修饰的ATP结合口袋可具有减小的结合空间(与野生型CSF1R蛋白相比)。在一些实施方式中，经修饰的ATP结合口袋不能结合药物(例如，CSF1R拮抗剂或激动剂)。在其它实施方式中，经修饰的ATP结合口袋可结合ATP。在一些实施方式中，CSF1R受体中的一种以上的基因修饰不干扰CSF1R蛋白的ATP结合活性。在一些实施方式中，CSF1R受体中的一种以上的基因修饰缺乏药物(例如，CSF1R拮抗剂或激动剂)的结合口袋，但不干扰CSF1R蛋白的正常ATP结合活性。

在一些实施方式中，一种以上的基因修饰是点突变。在一些实施方式中，一种以上的基因修饰导致单个氨基酸取代。在其他实施方式中，一种以上的基因修饰导致单个氨基酸插入。在进一步的实施方式中，一种以上的基因修饰导致单个氨基酸删除。

在一些实施方式中，一种以上的基因修饰导致CSF1R蛋白的氨基酸序列发生变化。氨基酸序列的变化可选地包括选自G795、L785、M637、E633和V647的氨基酸残基的取代。在一些实施方式中，一种以上的基因修饰导致氨基酸取代。在一些实施方式中，一种以上的基因修饰导致单个氨基酸取代。单个氨基酸的点突变可选自G795A、G795V和G795C。

在一些实施方式中CSF1R基因被修饰以在经修饰的细胞中赋予对CSF1R拮抗剂的部分或完全抗性。在一些实施方式中，用单点突变修饰CSF1R基因。在其他实施方式中，CSF1R基因的单点突变可包括但不限于在G795、L785、M637、E633和/或V647位置的这些单个氨基酸取代。作为非限制性实例，所述取代可包括G795A、G795V、G795C、G795D、G795E、G795F、G795G、G795H、G795I、G795K、G795L、G795M、G795N、G795P、G795Q、G795R、G795S、G795T、G795W或G795Y。

在不希望受到任何理论或机理限制的情况下，预测这些残基或任何其他氨基酸残基的取代将会改变它们的结合，所述残基与结合有ATP结合位点的小分子抑制剂直接接触。包含稍大官能团(例如丝氨酸；苏氨酸；半胱氨酸；缬氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；和蛋氨酸)的氨基酸取代：预期会引入与plexxikon结合冲突但仍允许ATP结合CSF1R功能的大取代基。更大的氨基酸取代：苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸，预期会与抑制剂和ATP均发生空间冲突，从而抑制正常的CSF1R功能。相反，用侧链体积较小的氨基酸(如甘氨酸或丙氨酸)的取代可改善与拮抗剂种类的结合，这些拮抗剂种类由于稍大或极性不相容的侧链的空间位阻而仅与天然序列弱结合。因此，本领域技术人员理解，定义变构拮抗剂结合位点的这些和其他残基可根据本公开内容的目的进行修饰。

在其它实施方式中，一种以上的基因修饰导致CSF1R蛋白的多个氨基酸发生变化。在一些实施方式中，多个氨基酸的变化是指相邻的氨基酸发生变化。在其它实施方式中，多个氨基酸的变化是指非相邻的氨基酸发生变化。

在一些实施方式中，一种以上的基因修饰(例如，点突变)位于CSF1R蛋白(即CSF1R受体)的ATP结合口袋内。在其他实施方式中，一种以上的基因修饰(例如，点突变)位于CSF1R蛋白(即CSF1R受体)的ATP结合口袋之外。在不希望将本公开内容限制在任何理论或机理的情况下，认为CSF1R蛋白的ATP结合口袋之外的突变可通过变构效应作用以抑制拮抗剂结合。

在一些实施方式中，一种以上的基因修饰是体外引入的。在其他实施方式中，通过转染或将编码转基因的核酸引入细胞(例如，人类细胞)来诱导一种以上的基因修饰。在进一步的实施方式中，通过转导或引入靶向核酸酶、内切酶、碱基编辑效应子或核糖核蛋白络合物来引入一种以上的基因修饰。在一些实施方式中，在细胞中引入编码转基因的核酸包括将细胞(例如，人类细胞)与病毒载体接触。

在一些实施方式中，CSF1R基因中一种以上的基因修饰(例如，点突变)是通过本领域已知的定点或随机突变方法产生的，包括但不限于CRISPR-Cas、TALEN和ZFN基因组编辑系统。可替代地或附加地，经修饰的CSF1R转基因可通过例如DNA或RNA载体(例如，裸核酸、脂质体或其他包封的核酸载体)、人工染色体和/或病毒载体(例如慢病毒和腺相关病毒载体)引入细胞(例如，人类细胞)。

在一些实施方式中，本文记载的包含经修饰的CSF1R蛋白的细胞(例如，人类细胞)保留包含野生型CSF1R蛋白的细胞(例如，人类细胞)的基因表达谱。在一些实施方式中，包含经修饰的CSF1R蛋白的体外细胞(例如，体外人类细胞)具有与包含野生型CSF1R蛋白的体外细胞(例如，体外人类细胞)相似的基因表达谱。在其他实施方式中，体内移植的包含经修饰的CSF1R蛋白的细胞(例如，人类细胞)具有与移植细胞(例如，人类细胞)相似的基因表达谱，该移植细胞不损害经修饰的CSF1R蛋白。在进一步的实施方式中，本文记载的经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，表达CSF1R的吞噬细胞)保留表达野生型CSF1R的细胞(例如，表达CSF1R的吞噬细胞)的基因表达谱。

本公开内容的特征还可在于本文记载的包含表达CSF1R的细胞的组合物。本公开内容的特征还可在于本文记载的包含表达CSF1R的吞噬细胞的组合物。在一些实施方式中，组合物包含多个细胞。在一些实施方式中，至少0.1％、至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或至少99.5％的多个细胞是对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的表达CSF1R的细胞。在其他实施方式中，至少0.1％、至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或至少99.5％的多个细胞是对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的表达CSF1R的吞噬细胞。

本公开内容的特征在于治疗受试者的方法。所述方法包括向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂，并将受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)接触。在其他实施方式中，所述方法包括将受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)接触，并向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂。在一些实施方式中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂的部分抗性或完全抗性。

本文记载的经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达人CSF1R的细胞)可进一步包含一种以上的修饰(例如，在另一基因(例如，CSF1R基因之外)中一种以上的基因修饰)。在一些实施方式中，经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)表达可用于治疗、治愈、改善、预防或减缓神经系统疾病的基因产物。在一些实施方式中，所述基因产物不以其他方式通过表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)表达。在其他实施方式中，经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)表达可用于治疗、治愈、改善、预防或减缓神经系统疾病的其它基因修饰。在其他实施方式中，使用其它基因修饰(CSF1R基因之外)纠正突变基因，治疗由该其他基因中的突变引起的疾病。

在一些实施方式中，被CSF1R拮抗剂抑制的CSF1R信号是受试者内源的表达CSF1R的细胞(例如，表达CSF1R的吞噬细胞)的增殖或存活。在其他实施方式中，CSF1R拮抗剂以足以使内源性表达CSF1R的细胞(例如，表达CSF1R的吞噬细胞)的增殖或存活相对于经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)减少的量施用于受试者。

本公开内容的特征还在于治疗受试者的方法。所述方法可包括将受试者与经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)接触，并差异化地改变未修饰的表达CSF1R的细胞(例如，未修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)相对于经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)的增殖或存活。在一些实施方式中，经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)对CSF1R拮抗剂具有部分抗性。在一些实施方式中，差异化地改变未修饰的表达CSF1R的细胞(例如，未修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)的增殖或存活的步骤包括向受试者施用足以使未修饰的表达CSF1R的细胞(例如，未修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)的增殖或存活相对于经修饰的表达CSF1R的细胞(例如，经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞)减少的量的CSF1R拮抗剂。

本文记载的方法可杀死受试者CNS内约0.1％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约99.5％的内源性表达CSF1R的吞噬细胞。在其它实施方式中，本文中记载的方法可以杀死受试者CNS内所有内源性表达CSF1R的吞噬细胞。

本文记载的方法可进一步允许将约0.1％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约99.5％的经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞植入受试者的CNS内。在一些实施方式中，本文记载的方法允许将经修饰的表达CSF1R的吞噬细胞完全植入受试者的CNS内。

在一些实施方式中，本文记载的方法旨在通过将受试者与本文记载的经修饰的细胞或载体接触来治疗、预防、减缓或改善神经系统疾病。在一些实施方式中，神经系统疾病包括神经系统的疾病。神经系统疾病的非限制性实例可包括但不限于痴呆、神经退行性疾病、基因疾病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、因接触化学品或其他药剂而引起或恶化的疾病等。

本公开内容的特征还可在于用于治疗神经系统疾病的组合物，所述组合物包含多个对CSF1R拮抗剂具有差异化(例如，增加的、减少的、部分的或完全的)抗性的经修饰的细胞。在一些实施方式中，经修饰的细胞是表达CSF1R的细胞。

本公开内容的特征进一步在于本文记载的编码对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白的核酸组合物和载体。在一些实施方式中，所述核酸组合物和载体可包括有效载荷(payload)，其包括但不限于转基因、标记物或报告基因等。在一些实施方式中，表达载体包含本文记载的可操作地连接至表达控制序列的核酸组合物。

在一些实施方式中，核酸组合物包含对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白。在一些实施方式中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂的部分、完全、增加或降低的抗性。

在其他实施方式中，核酸组合物包含经修饰的CSF1R蛋白，该经修饰的CSF1R蛋白包含一种以上的基因修饰。在一些实施方式中，一种以上的基因修饰导致氨基酸取代，该氨基酸取代选自G795A、G795V、G795C、L785、M637、E633和V647。

在一些实施方式中，本公开内容的特征在于包含核酸组合物的表达载体，该核酸组合物包含对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白。

在一些实施方式中，本文记载的表达载体可用于修饰培养的细胞或内源性细胞。在一些实施方式中，本文记载的表达载体用于转染培养的细胞，使得培养的细胞或所述细胞的后代表达多肽。在其他实施方式中，本文记载的表达载体用于通过转导核酸(例如，通过用病毒载体感染以原位产生CSF1R拮抗剂抗性细胞)来修饰内源性表达CSF1R的细胞。

本公开内容的方法和组合物可有利地用于人类或兽医应用中，从而将经修饰的细胞或载体或基因组编辑系统(例如，CRISPR-Cas、TALEN或ZFN系统)用于预防、减轻、改善或治愈疾病或病症，所述基因组编辑系统被配置为引入本公开的突变并由此产生经修饰的细胞。通常，这些方法将包括以下步骤：将受试者与经修饰的细胞或载体或被配置为产生这类细胞的基因组编辑系统接触，并使受试者与CSF1R拮抗剂接触。

首先转到本公开内容的方法可能适合的受试者，任何受试者都可以是根据这些方法进行治疗的候选者，但治疗那些患有或者预测或易患如神经系统疾病的疾病的受试者可能是有利的，该疾病可以通过使受试者与本公开的细胞接触来预防、减轻、改善或治愈，相对于受试者的天然或内源性细胞，该细胞的特征在于其对CSF1R拮抗剂的差异化响应。在不限制以上内容的情况下，可通过本公开的方法治疗的神经系统疾病可包括痴呆、神经退行性疾病、脱髓鞘疾病、情绪或人格障碍、创伤性脑损伤、基因疾病、恶性或良性肿瘤、转移性肿瘤或生长等。

受试者可以在任何合适的时间通过任何合适的给药途径与本公开的经修饰的细胞或载体接触，包括但不限于通过静脉内、肌肉内、腹膜内、实质内(intraparenchymal)、鞘内、颅间、骨间或其它注射或输注、经皮给药(用于载体)和/或通过手术植入或移植。可施用任何合适数量的细胞或载体的滴度，例如，10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸等个细胞，和/或10¹⁴、10¹³、10¹²、10¹¹、10¹⁰、10⁹或更少的病毒粒子或病毒基因组。关于经修饰的细胞，与受试者接触的细胞可来自受试者自身的细胞(自体细胞)，也可来自其他供体(同种异体细胞)。

本领域技术人员将理解，本公开的经修饰的细胞对CSF1R拮抗剂的差异化敏感性可在CSF1R拮抗剂的存在下最清楚地表现出来。因此，虽然受试者可在任何时候与CSF1R拮抗剂接触(包括但不限于在使受试者与本公开的经修饰的细胞接触之前进行预处理或调节处理)，但本公开的一些实施方式包括在将受试者与经修饰的细胞或载体接触的步骤同时和/或之后向受试者施用CSF1R拮抗剂。CSF1R拮抗剂可连续或不连续地施用，并且施用的开始或停止可以是预定的或预先计划的，或者它可以响应于受试者的生理读数，例如生物标志物浓度、生物标志物或小分子活性成分或其代谢物的血清或组织浓度、成像信号或体征等。

作为非限制性实例，在经修饰的细胞对CSF1R拮抗剂表现出降低的敏感性(即部分或完全抗性)的情况下，可将所述CSF1R拮抗剂施用于受试者以减少该细胞所占据的生态位内天然细胞的增殖或存活，从而赋予经修饰的细胞选择性优势，并可选地增加经修饰的细胞相对于CSF1R拮抗剂不存在的情况下观察到的植入速率或其它表现。这种施用可在受试者与经修饰的细胞或载体接触的步骤之前、同时或之后开始-也可以可选地终止。在不限制以上内容的情况下，如果经修饰的细胞是小胶质细胞或小胶质细胞祖细胞，可在经修饰的小胶质细胞谱系细胞移植之前、同时和/或之后向受试者施用CSF1R拮抗剂，以限制内源性小胶质细胞的增殖和/或存活，从而赋予经修饰的小胶质细胞优势，其可导致相对于其他情况下观察到经修饰的小胶质细胞更大程度的植入和/或更大的空间分布。

可替换地或附加地，本公开的经修饰的细胞相对于未修饰的细胞可表现出对CSF1R拮抗剂增加的敏感性。在这种情况下，CSF1R拮抗剂通常(但不一定)在受试者与经修饰的细胞接触之前和期间被截留，而是在受试者与经修饰的细胞或载体接触后施用，例如，在治疗过程结束时限制经修饰的细胞的增殖或存活，其响应于来自生理或药理上测量的信号，和/或响应于不良事件或利用经修饰的细胞的治疗干预的疗效降低。

本公开的经修饰的细胞可选地包含一种以上的相对于相同类型的天然细胞的额外修饰。这些修饰可包括但不限于一个以上的转基因，或一种以上的纠正突变或减少或增加基因产物表达的基因修饰。在限制以上内容的情况下，本公开内容包括经改造以表达对CSF1R拮抗剂敏感性降低的CSF1R等位基因的小胶质细胞，以及分泌的转基因，例如酶或结合蛋白、RNA(例如反义的)、miRNA或siRNA、细胞表面蛋白(例如嵌合抗原受体)、膜结合免疫球蛋白或其碎片，适体等。本公开内容还包括载体和基本如上所述制造这些细胞的方法，以及使用细胞或载体来治疗受试者的治疗受试者的方法。

在不希望将本公开内容限制于任何理论或机理的情况下，认为可使用多种方法来实现目前请求保护的对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的细胞。本文记载了实现这个目标的非限制性方法/实例。等同物或替代物均在本公开内容的范围内。

实施例

以下是本发明的非限制性实施例。应理解，所述实施例不旨在以任何方式限制本发明。等同物或替代物均在本发明的范围内。

为了促进人小胶质细胞、巨噬细胞和单核细胞和/或其前体细胞(造血祖细胞(HPC)和造血干细胞(HSC)、红系骨髓细胞祖细胞(EMP)或原始巨噬细胞祖细胞(PMP))的竞争性植入，可单独或组合使用几种方法。1)使用先前公布的与拮抗剂结合的CSF1R受体的晶体结构(PMID：31434879)，来预测可能在空间上阻碍CSF1R拮抗剂结合但同时不损害ATP与同一结合袋的正常结合的氨基酸取代。2)使用PCR介导的随机突变引入氨基酸变化，然后将iPS-小胶质细胞暴露于CSF1R拮抗剂，然后对存活的突变体进行测序，以识别赋予对CSF1R拮抗剂抗性但不同时诱导组成性活性的CSF1R信号传导的突变。3)修饰CSF1R下游的基因，例如，删除或暂时性降低SHIP1(INPP5D)的表达以增强CSF1R信号传导。4)用CSF1R信号传导激动剂移植的预处理小胶质细胞，也可使用siRNA或microRNA基因递送方法来调节和暂时性增加移植细胞中的CSF1R信号传导，以增加对CSF1R拮抗剂处理的抗性。以下提供的是与前两种策略相关的额外详细信息和数据。

策略1：与拮抗剂结合的CSF1R受体的晶体结构(PMID：31434879)，用于预测氨基酸取代，这些氨基酸取代可在空间上阻碍CSF1R拮抗剂的结合，但同时不损害ATP与同一结合袋的正常结合。获得与人CSF1R结合的PLX5622的晶体结构，并检查ATP结合口袋(图7A)。通过分子建模预测单个氨基酸的变化可能会损害PLX5622、PLX3397或其他CSF1R拮抗剂的结合，但同时不会破坏ATP与CSF1R的正常结合。具体地，这个模型表明，用丙氨酸(A)、缬氨酸(V)或半胱氨酸(C)替换氨基酸G795将增加PLX5622和/或PLX3397结合的空间位阻，但不会破坏ATP的正常结合能力(图7A和7B)。也可探索其他突变来防止结合(图7D)。设计了一种CRISPR靶向策略以产生携带这些单个氨基酸取代(G795A、G795V、G795C)中的每一个的人iPSC，并成功产生了这些经修饰的人iPSC细胞系(图8所示为显示编辑序列的Sanger测序色谱图)。然后将得到的iPSC分化为小胶质细胞，并暴露于不同浓度的PLX3397或PLX5622。为了检测小胶质细胞的死亡(细胞凋亡)，使用半胱天冬酶-3/7荧光报告基因。图4A显示了相对于G795A和G795CCSF1R突变系，野生型(WT)未经编辑的人iPSC-小胶质细胞响应于PLX3397的细胞死亡的剂量依赖性诱导。图4B显示了对PLX5622的响应。在PLX化合物处理的24小时内，WT人小胶质细胞对任一化合物表现出强大的剂量依赖性细胞凋亡诱导。相反，G795A和G795C突变系均表现出对细胞死亡的完全抗性。图4F提供了各个剂量的PLX3397和PLX5622的细胞密度(相差显微镜，第一列)和荧光半胱天冬酶-3/7活性(第二列)的代表性图像。

对晶体结构的进一步检查还显示出其他位置，如果发生突变，可导致PLX5622和/或PLX3397结合的降低。实例包括L785、M637、E633和V647(图4D)。这些位置都与PLX5622和/或PLX3397结合位点密切接触，并且在突变时可阻止结合。

策略2：PCR介导的随机诱变将用于引入氨基酸变化，然后将iPS-小胶质细胞暴露于CSF1R拮抗剂，然后对存活的突变体进行测序，以识别赋予对CSF1R拮抗剂抗性但不同时诱导组成性活性或抑制的CSF1R信号传导的突变。将产生携带CSF1R基因的随机突变的iPSC或单核细胞系的池。然后，将这个池分化为小胶质细胞，并监测响应于CSF1/IL-34停药或CSF1R拮抗剂处理的细胞的存活。在这些条件下存活更长时间的细胞将通过PCR和测序进行检查，以识别可能赋予对CSF1R拮抗剂抗性的CSF1R突变。然后进行计数器筛选以识别那些不会导致过度增殖或增殖显著损失的CSF1R突变。一旦确定了最佳突变，携带这些突变的iPSC细胞系将被扩增，并且将在嵌合模型中体内检查衍生自这些细胞系的小胶质细胞，以体内测定对CSF1R拮抗剂的抗性。

使用荧光半胱天冬酶3/7检测器(Essen BioScience)和24小时的延时成像对测试的各个CSF1R抑制剂的抗性进行定量。在24小时的成像中，与DMSO对照处理相比，随着PLX3397(MedChemExpress)、PLX5622(MedChemExpress)、依地可替尼和BLZ945浓度的增加，WT小胶质细胞表现出显著增加水平的半胱天冬酶，这表明其对抑制巨噬细胞集落刺激因子/集落刺激因子1受体(CSF1R)的细胞死亡响应的增加。另一方面，与DMSO对照处理相比，在增加PLX3397、PLX5622、依地可替尼或BLZ945浓度时，G795A和G795C iPSC-小胶质细胞的半胱天冬酶水平没有显著增加。这些结果表明，经基因修饰的CSF1受体导致获得了对PLX处理的抗性(参见图4A、4B、4C、4D和4E)。

细胞死亡试验：将iPS-小胶质细胞以每96孔板70K细胞接种(每个条件下每行6个孔)。在时间为0时，所有小胶质细胞均用IncuCyte半胱天冬酶-3/7绿色细胞凋亡测定试剂1：1000处理。将细胞维持在所述培养基中：新鲜完全培养基+0.1％DMSO、完全培养基+250nMPLX3397、完全培养基+500nM PLX3397、完全培养基+1μmPLX3397、完全培养基+250nMPLX5622、完全培养基+500nM PLX5622、完全培养基+1μm PLX5622、完全培养基+250nM依地可替尼、完全培养基+500nM依地可替尼、完全培养基+1μm依地可替尼、完全培养基+250nMBLZ945、完全培养基+500nM BLZ945、完全培养基+1μm BLZ945。在24小时内，每孔每小时收集4张20×图像，持续24小时。使用IncuCyte 2020B软件，生成相位融合(phaseconfluence)(视觉上挑出(gate out)凋亡细胞)的半胱天冬酶3/7信号(绿色)的掩模图像。图像显示归一化为相位融合的半胱天冬酶，用3个系完成：WT、G795A、G795C(参见图4A、4B、4C、4D和4E)。

实施方式

以下实施方式仅旨在用于说明且不以任何方式受到限制。

实施方式1：对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的人类细胞。

实施方式2：根据实施方式1的细胞，所述细胞包含编码对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白的核酸。

实施方式3：经修饰的人类细胞，包含编码对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白的核酸。

实施方式4：根据实施方式1-3中任一项所述的细胞，所述细胞在CSF1R蛋白中包含一种以上的基因修饰。

实施方式5：根据实施方式4所述的细胞，其中，所述一种以上的基因修饰导致CSF1R的氨基酸序列的变化，所述变化可选地包括选自G795、L785、M637、E633和V647的氨基酸残基的取代。

实施方式6：根据实施方式1-5中任一项所述的细胞，其中，一种以上的基因修饰导致经修饰的ATP结合口袋。

实施方式7：根据实施方式6所述的细胞，其中，所述经修饰的ATP结合口袋具有减小的结合空间。

实施方式8：根据实施方式7所述的细胞，其中，所述经修饰的ATP结合口袋不能结合CSF1R拮抗剂。

实施方式9：根据实施方式6所述的细胞，其中，所述经修饰的ATP结合口袋可结合ATP。

实施方式10：根据实施方式1-9中任一项所述的细胞，其中，CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不干扰CSF1R蛋白的ATP结合活性。

实施方式11：根据实施方式1-10中任一项所述的细胞，其中，CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不诱导组成性活性的CSF1R信号传导。

实施方式12：根据实施方式11所述的细胞，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过CSF1配体激活。

实施方式13：根据实施方式12所述的细胞，其中，所述CSF1配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

实施方式14：根据实施方式11所述的细胞，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过IL-34配体激活。

实施方式15：根据实施方式14所述的细胞，其中，所述IL-34配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

实施方式16：根据实施方式4所述的细胞，其中，所述一种以上的基因修饰是体外引入的。

实施方式17：根据实施方式4所述的细胞，其中，所述一种以上的基因修饰通过转染或将编码转基因的核酸引入细胞中来诱导，或通过转导或引入靶向核酸酶、内切酶、碱基编辑效应子或核糖核蛋白络合物来诱导。

实施方式18：根据实施方式17所述的细胞，其中，将编码转基因的核酸引入细胞中包含将所述细胞与病毒载体接触。

实施方式19：根据实施方式1-18中任一项所述的细胞，其中，所述包含经修饰的CSF1R蛋白的细胞保留包含野生型CSF1R蛋白的细胞的基因表达谱。

实施方式20：根据实施方式1-19中任一项所述的细胞，其中，所述细胞进一步包含在另一基因中一种以上的修饰。

实施方式21：根据实施方式1-20中任一项所述的经修饰的人类细胞，所述人类细胞表达CSF1R。

实施方式22：根据实施方式21所述的细胞，其中，所述细胞被诱导并分化以表达CSF1R，所述细胞选自多能干细胞、造血干细胞、红系骨髓细胞祖细胞和造血祖细胞。

实施方式23：根据实施方式22所述的细胞，其中，所述细胞是表达CSF1R的细胞，所述细胞选自小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞或其他吞噬细胞。

实施方式24：组合物，所述组合物包含实施方式20-23中任一项所述的表达CSF1R的细胞。

实施方式25：根据实施方式24所述的组合物，其中，所述表达CSF1R的细胞是表达CSF1R的细胞。

实施方式26：根据实施方式25所述的组合物，所述组合物包含多个细胞，其中，至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的所述细胞是对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的表达CSF1R的细胞。

实施方式27：一种治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂；以及(b)使受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞接触。

实施方式28：一种治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)使受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞接触；以及(b)向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂。

实施方式29：根据实施方式27和28所述的方法，其中，所述表达CSF1R的细胞是表达CSF1R的细胞。

实施方式30：根据实施方式27-29中任一项所述的方法，其中，所述对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性是对CSF1R拮抗剂的部分或完全抗性。

实施方式31：根据实施方式27-30中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞保留表达野生型CSF1R的细胞的基因表达谱。

实施方式32：根据实施方式27-31中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞表达用于治疗、治愈、改善、预防或减缓神经系统疾病的基因产物或其他基因修饰。

实施方式33：根据实施方式32所述的方法，其中，所述基因产物是不以其他方式通过表达CSF1R的细胞表达的转基因。

实施方式34：根据实施方式33所述的方法，其中，被CSF1R拮抗剂抑制的CSF1R信号是受试者内源的表达CSF1R的细胞的增殖或存活。

实施方式35：根据实施方式27-34中任一项所述的方法，其中，CSF1R拮抗剂以足以使内源性表达CSF1R的细胞的增殖和/或存活相对于经修饰的表达CSF1R的细胞减少的量施用于受试者。

实施方式36：一种治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)使受试者与经修饰的表达CSF1R的细胞接触，以及(b)差异化地改变未修饰的表达CSF1R的细胞相对于经修饰的表达CSF1R的细胞的增殖或存活。

实施方式37：根据实施方式36所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞是表达CSF1R的吞噬细胞。

实施方式38：根据实施方式36或37所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞对CSF1R拮抗剂具有部分抗性。

实施方式39：根据实施方式36所述的方法，其中，差异化地改变未修饰的表达CSF1R的细胞的增殖或存活的步骤包括向受试者施用足以使未修饰的表达CSF1R的细胞的增殖和/或存活相对于经修饰的表达CSF1R的细胞减少的量的CSF1R拮抗剂。

实施方式40：核酸组合物，所述组合物编码对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白。

实施方式41：根据实施方式40所述的组合物，其中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂的部分抗性或完全抗性。

实施方式42：根据实施方式40所述的组合物，其中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂增加的抗性。

实施方式43：根据实施方式40所述的组合物，其中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂降低的抗性。

实施方式44：根据实施方式40-43中任一项所述的组合物，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白包含一种以上的基因修饰。

实施方式45：根据实施方式44所述的组合物，其中，所述一种以上的基因修饰导致CSF1R氨基酸序列的变化，所述变化可选地包括选自G795、L785、M637、E633和V647的氨基酸残基的取代。

实施方式46：根据实施方式44所述的组合物，其中，所述一种以上的基因修饰导致经修饰的ATP结合口袋。

实施方式47：根据实施方式46所述的组合物，其中，所述经修饰的ATP结合口袋具有减小的结合空间。

实施方式48：根据实施方式47所述的组合物，其中，所述经修饰的ATP结合口袋不能结合CSF1R拮抗剂。

实施方式49：根据实施方式46所述的组合物，其中，所述经修饰的ATP结合口袋能结合ATP。

实施方式50：根据实施方式44所述的组合物，其中，所述CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不干扰CSF1R蛋白的ATP结合活性。

实施方式51：根据实施方式44所述的组合物，其中，所述CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不诱导组织性活性的CSF1R信号传导。

实施方式52：根据实施方式51所述的组合物，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过CSF1配体激活。

实施方式53：根据实施方式52所述的组合物，其中，所述CSF1配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

实施方式54：根据实施方式51所述的组合物，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过IL-34配体激活。

实施方式55：根据实施方式54所述的细胞，其中，所述IL-34配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

实施方式56：表达载体，所述表达载体包含实施方式40-55中任一项所述的核酸组合物，所述核酸组合物可操作地连接至表达控制序列。

实施方式57：用实施方式56所述的载体转染的培养的细胞或所述细胞的后代，其中，所述培养的细胞表达多肽。

实施方式58：用实施方式56所述的载体感染的内源性细胞，其中，所述内源性细胞表达多肽。

本文使用的术语“大约”是指参照数字的正负20％。

尽管已经显示并记载了本公开的优选实施方式，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对其进行不超出所附权利要求的范围的修改。因此，本公开的范围仅受以下权利要求的限制。在一些实施方式中，本专利申请中展示的附图是按比例绘制的，包括角度、尺寸比等。在一些实施方式中，附图仅具有代表性且权利要求不受附图尺寸的限制。在一些实施方式中，本文记载的公开内容中使用的短语“包含”包括可被记载为“基本上由…组成”或“由…组成”的实施方式，因此，满足了使用短语“基本上由…组成”或“由…组成”来要求保护本公开的一个以上实施方案的书面描述要求。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 哺乳动物细胞的基因修饰赋予对CSF1R拮抗剂的抗性

<130> UCI 21.03 PCT

<150> 63/169,578

<151> 2021-04-01

<150> 63/236,951

<151> 2021-08-25

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2919

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

atgggcccag gagttctgct gctcctgctg gtggccacag cttggcatgg tcagggaatc 60

ccagtgatag agcccagtgt ccctgagctg gtcgtgaagc caggagcaac ggtgaccttg 120

cgatgtgtgg gcaatggcag cgtggaatgg gatggccccc catcacctca ctggaccctg 180

tactctgatg gctccagcag catcctcagc accaacaacg ctaccttcca aaacacgggg 240

acctatcgct gcactgagcc tggagacccc ctgggaggca gcgccgccat ccacctctat 300

gtcaaagacc ctgcccggcc ctggaacgtg ctagcacagg aggtggtcgt gttcgaggac 360

caggacgcac tactgccctg tctgctcaca gacccggtgc tggaagcagg cgtctcgctg 420

gtgcgtgtgc gtggccggcc cctcatgcgc cacaccaact actccttctc gccctggcat 480

ggcttcacca tccacagggc caagttcatt cagagccagg actatcaatg cagtgccctg 540

atgggtggca ggaaggtgat gtccatcagc atccggctga aagtgcagaa agtcatccca 600

gggcccccag ccttgacact ggtgcctgca gagctggtgc ggattcgagg ggaggctgcc 660

cagatcgtgt gctcagccag cagcgttgat gttaactttg atgtcttcct ccaacacaac 720

aacaccaagc tcgcaatccc tcaacaatct gactttcata ataaccgtta ccaaaaagtc 780

ctgaccctca acctcgatca agtagatttc caacatgccg gcaactactc ctgcgtggcc 840

agcaacgtgc agggcaagca ctccacctcc atgttcttcc gggtggtaga gagtgcctac 900

ttgaacttga gctctgagca gaacctcatc caggaggtga ccgtggggga ggggctcaac 960

ctcaaagtca tggtggaggc ctacccaggc ctgcaaggtt ttaactggac ctacctggga 1020

cccttttctg accaccagcc tgagcccaag cttgctaatg ctaccaccaa ggacacatac 1080

aggcacacct tcaccctctc tctgccccgc ctgaagccct ctgaggctgg ccgctactcc 1140

ttcctggcca gaaacccagg aggctggaga gctctgacgt ttgagctcac ccttcgatac 1200

cccccagagg taagcgtcat atggacattc atcaacggct ctggcaccct tttgtgtgct 1260

gcctctgggt acccccagcc caacgtgaca tggctgcagt gcagtggcca cactgatagg 1320

tgtgatgagg cccaagtgct gcaggtctgg gatgacccat accctgaggt cctgagccag 1380

gagcccttcc acaaggtgac ggtgcagagc ctgctgactg ttgagacctt agagcacaac 1440

caaacctacg agtgcagggc ccacaacagc gtggggagtg gctcctgggc cttcataccc 1500

atctctgcag gagcccacac gcatcccccg gatgagttcc tcttcacacc agtggtggtc 1560

gcctgcatgt ccatcatggc cttgctgctg ctgctgctcc tgctgctatt gtacaagtat 1620

aagcagaagc ccaagtacca ggtccgctgg aagatcatcg agagctatga gggcaacagt 1680

tatactttca tcgaccccac gcagctgcct tacaacgaga agtgggagtt cccccggaac 1740

aacctgcagt ttggtaagac cctcggagct ggagcctttg ggaaggtggt ggaggccacg 1800

gcctttggtc tgggcaagga ggatgctgtc ctgaaggtgg ctgtgaagat gctgaagtcc 1860

acggcccatg ctgatgagaa ggaggccctc atgtccgagc tgaagatcat gagccacctg 1920

ggccagcacg agaacatcgt caaccttctg ggagcctgta cccatggagg ccctgtactg 1980

gtcatcacgg agtactgttg ctatggcgac ctgctcaact ttctgcgaag gaaggctgag 2040

gccatgctgg gacccagcct gagccccggc caggaccccg agggaggcgt cgactataag 2100

aacatccacc tcgagaagaa atatgtccgc agggacagtg gcttctccag ccagggtgtg 2160

gacacctatg tggagatgag gcctgtctcc acttcttcaa atgactcctt ctctgagcaa 2220

gacctggaca aggaggatgg acggcccctg gagctccggg acctgcttca cttctccagc 2280

caagtagccc agggcatggc cttcctcgct tccaagaatt gcatccaccg ggacgtggca 2340

gcgcgtaacg tgctgttgac caatggtcat gtggccaaga ttggggactt cgggctggct 2400

agggacatca tgaatgactc caactacatt gtcaagggca atgcccgcct gcctgtgaag 2460

tggatggccc cagagagcat ctttgactgt gtctacacgg ttcagagcga cgtctggtcc 2520

tatggcatcc tcctctggga gatcttctca cttgggctga atccctaccc tggcatcctg 2580

gtgaacagca agttctataa actggtgaag gatggatacc aaatggccca gcctgcattt 2640

gccccaaaga atatatacag catcatgcag gcctgctggg ccttggagcc cacccacaga 2700

cccaccttcc agcagatctg ctccttcctt caggagcagg cccaagagga caggagagag 2760

cgggactata ccaatctgcc gagcagcagc agaagcggtg gcagcggcag cagcagcagt 2820

gagctggagg aggagagctc tagtgagcac ctgacctgct gcgagcaagg ggatatcgcc 2880

cagcccttgc tgcagcccaa caactatcag ttctgctga 2919

<210> 2

<211> 972

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970

<210> 3

<211> 2919

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> G795A CSF1R

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，nnn是GCT

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，nnn是GCC

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，nnn是GCA

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，nnn是GCG

<400> 3

atgggcccag gagttctgct gctcctgctg gtggccacag cttggcatgg tcagggaatc 60

ccagtgatag agcccagtgt ccctgagctg gtcgtgaagc caggagcaac ggtgaccttg 120

cgatgtgtgg gcaatggcag cgtggaatgg gatggccccc catcacctca ctggaccctg 180

tactctgatg gctccagcag catcctcagc accaacaacg ctaccttcca aaacacgggg 240

acctatcgct gcactgagcc tggagacccc ctgggaggca gcgccgccat ccacctctat 300

gtcaaagacc ctgcccggcc ctggaacgtg ctagcacagg aggtggtcgt gttcgaggac 360

caggacgcac tactgccctg tctgctcaca gacccggtgc tggaagcagg cgtctcgctg 420

gtgcgtgtgc gtggccggcc cctcatgcgc cacaccaact actccttctc gccctggcat 480

ggcttcacca tccacagggc caagttcatt cagagccagg actatcaatg cagtgccctg 540

atgggtggca ggaaggtgat gtccatcagc atccggctga aagtgcagaa agtcatccca 600

gggcccccag ccttgacact ggtgcctgca gagctggtgc ggattcgagg ggaggctgcc 660

cagatcgtgt gctcagccag cagcgttgat gttaactttg atgtcttcct ccaacacaac 720

aacaccaagc tcgcaatccc tcaacaatct gactttcata ataaccgtta ccaaaaagtc 780

ctgaccctca acctcgatca agtagatttc caacatgccg gcaactactc ctgcgtggcc 840

agcaacgtgc agggcaagca ctccacctcc atgttcttcc gggtggtaga gagtgcctac 900

ttgaacttga gctctgagca gaacctcatc caggaggtga ccgtggggga ggggctcaac 960

ctcaaagtca tggtggaggc ctacccaggc ctgcaaggtt ttaactggac ctacctggga 1020

cccttttctg accaccagcc tgagcccaag cttgctaatg ctaccaccaa ggacacatac 1080

aggcacacct tcaccctctc tctgccccgc ctgaagccct ctgaggctgg ccgctactcc 1140

ttcctggcca gaaacccagg aggctggaga gctctgacgt ttgagctcac ccttcgatac 1200

cccccagagg taagcgtcat atggacattc atcaacggct ctggcaccct tttgtgtgct 1260

gcctctgggt acccccagcc caacgtgaca tggctgcagt gcagtggcca cactgatagg 1320

tgtgatgagg cccaagtgct gcaggtctgg gatgacccat accctgaggt cctgagccag 1380

gagcccttcc acaaggtgac ggtgcagagc ctgctgactg ttgagacctt agagcacaac 1440

caaacctacg agtgcagggc ccacaacagc gtggggagtg gctcctgggc cttcataccc 1500

atctctgcag gagcccacac gcatcccccg gatgagttcc tcttcacacc agtggtggtc 1560

gcctgcatgt ccatcatggc cttgctgctg ctgctgctcc tgctgctatt gtacaagtat 1620

aagcagaagc ccaagtacca ggtccgctgg aagatcatcg agagctatga gggcaacagt 1680

tatactttca tcgaccccac gcagctgcct tacaacgaga agtgggagtt cccccggaac 1740

aacctgcagt ttggtaagac cctcggagct ggagcctttg ggaaggtggt ggaggccacg 1800

gcctttggtc tgggcaagga ggatgctgtc ctgaaggtgg ctgtgaagat gctgaagtcc 1860

acggcccatg ctgatgagaa ggaggccctc atgtccgagc tgaagatcat gagccacctg 1920

ggccagcacg agaacatcgt caaccttctg ggagcctgta cccatggagg ccctgtactg 1980

gtcatcacgg agtactgttg ctatggcgac ctgctcaact ttctgcgaag gaaggctgag 2040

gccatgctgg gacccagcct gagccccggc caggaccccg agggaggcgt cgactataag 2100

aacatccacc tcgagaagaa atatgtccgc agggacagtg gcttctccag ccagggtgtg 2160

gacacctatg tggagatgag gcctgtctcc acttcttcaa atgactcctt ctctgagcaa 2220

gacctggaca aggaggatgg acggcccctg gagctccggg acctgcttca cttctccagc 2280

caagtagccc agggcatggc cttcctcgct tccaagaatt gcatccaccg ggacgtggca 2340

gcgcgtaacg tgctgttgac caatggtcat gtggccaaga ttnnngactt cgggctggct 2400

agggacatca tgaatgactc caactacatt gtcaagggca atgcccgcct gcctgtgaag 2460

tggatggccc cagagagcat ctttgactgt gtctacacgg ttcagagcga cgtctggtcc 2520

tatggcatcc tcctctggga gatcttctca cttgggctga atccctaccc tggcatcctg 2580

gtgaacagca agttctataa actggtgaag gatggatacc aaatggccca gcctgcattt 2640

gccccaaaga atatatacag catcatgcag gcctgctggg ccttggagcc cacccacaga 2700

cccaccttcc agcagatctg ctccttcctt caggagcagg cccaagagga caggagagag 2760

cgggactata ccaatctgcc gagcagcagc agaagcggtg gcagcggcag cagcagcagt 2820

gagctggagg aggagagctc tagtgagcac ctgacctgct gcgagcaagg ggatatcgcc 2880

cagcccttgc tgcagcccaa caactatcag ttctgctga 2919

<210> 4

<211> 972

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> G795A CSF1R

<400> 4

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970

<210> 5

<211> 2919

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> G795C CSF1R

<220>

<221> misc_特征

<222> (2328)..(2385)

<223> 其中，nnn是TGT

<220>

<221> misc_特征

<222> (2328)..(2385)

<223> 其中，nnn是TGC

<400> 5

atgggcccag gagttctgct gctcctgctg gtggccacag cttggcatgg tcagggaatc 60

ccagtgatag agcccagtgt ccctgagctg gtcgtgaagc caggagcaac ggtgaccttg 120

cgatgtgtgg gcaatggcag cgtggaatgg gatggccccc catcacctca ctggaccctg 180

tactctgatg gctccagcag catcctcagc accaacaacg ctaccttcca aaacacgggg 240

acctatcgct gcactgagcc tggagacccc ctgggaggca gcgccgccat ccacctctat 300

gtcaaagacc ctgcccggcc ctggaacgtg ctagcacagg aggtggtcgt gttcgaggac 360

caggacgcac tactgccctg tctgctcaca gacccggtgc tggaagcagg cgtctcgctg 420

gtgcgtgtgc gtggccggcc cctcatgcgc cacaccaact actccttctc gccctggcat 480

ggcttcacca tccacagggc caagttcatt cagagccagg actatcaatg cagtgccctg 540

atgggtggca ggaaggtgat gtccatcagc atccggctga aagtgcagaa agtcatccca 600

gggcccccag ccttgacact ggtgcctgca gagctggtgc ggattcgagg ggaggctgcc 660

cagatcgtgt gctcagccag cagcgttgat gttaactttg atgtcttcct ccaacacaac 720

aacaccaagc tcgcaatccc tcaacaatct gactttcata ataaccgtta ccaaaaagtc 780

ctgaccctca acctcgatca agtagatttc caacatgccg gcaactactc ctgcgtggcc 840

agcaacgtgc agggcaagca ctccacctcc atgttcttcc gggtggtaga gagtgcctac 900

ttgaacttga gctctgagca gaacctcatc caggaggtga ccgtggggga ggggctcaac 960

ctcaaagtca tggtggaggc ctacccaggc ctgcaaggtt ttaactggac ctacctggga 1020

cccttttctg accaccagcc tgagcccaag cttgctaatg ctaccaccaa ggacacatac 1080

aggcacacct tcaccctctc tctgccccgc ctgaagccct ctgaggctgg ccgctactcc 1140

ttcctggcca gaaacccagg aggctggaga gctctgacgt ttgagctcac ccttcgatac 1200

cccccagagg taagcgtcat atggacattc atcaacggct ctggcaccct tttgtgtgct 1260

gcctctgggt acccccagcc caacgtgaca tggctgcagt gcagtggcca cactgatagg 1320

tgtgatgagg cccaagtgct gcaggtctgg gatgacccat accctgaggt cctgagccag 1380

gagcccttcc acaaggtgac ggtgcagagc ctgctgactg ttgagacctt agagcacaac 1440

caaacctacg agtgcagggc ccacaacagc gtggggagtg gctcctgggc cttcataccc 1500

atctctgcag gagcccacac gcatcccccg gatgagttcc tcttcacacc agtggtggtc 1560

gcctgcatgt ccatcatggc cttgctgctg ctgctgctcc tgctgctatt gtacaagtat 1620

aagcagaagc ccaagtacca ggtccgctgg aagatcatcg agagctatga gggcaacagt 1680

tatactttca tcgaccccac gcagctgcct tacaacgaga agtgggagtt cccccggaac 1740

aacctgcagt ttggtaagac cctcggagct ggagcctttg ggaaggtggt ggaggccacg 1800

gcctttggtc tgggcaagga ggatgctgtc ctgaaggtgg ctgtgaagat gctgaagtcc 1860

acggcccatg ctgatgagaa ggaggccctc atgtccgagc tgaagatcat gagccacctg 1920

ggccagcacg agaacatcgt caaccttctg ggagcctgta cccatggagg ccctgtactg 1980

gtcatcacgg agtactgttg ctatggcgac ctgctcaact ttctgcgaag gaaggctgag 2040

gccatgctgg gacccagcct gagccccggc caggaccccg agggaggcgt cgactataag 2100

aacatccacc tcgagaagaa atatgtccgc agggacagtg gcttctccag ccagggtgtg 2160

gacacctatg tggagatgag gcctgtctcc acttcttcaa atgactcctt ctctgagcaa 2220

gacctggaca aggaggatgg acggcccctg gagctccggg acctgcttca cttctccagc 2280

caagtagccc agggcatggc cttcctcgct tccaagaatt gcatccaccg ggacgtggca 2340

gcgcgtaacg tgctgttgac caatggtcat gtggccaaga ttnnngactt cgggctggct 2400

agggacatca tgaatgactc caactacatt gtcaagggca atgcccgcct gcctgtgaag 2460

tggatggccc cagagagcat ctttgactgt gtctacacgg ttcagagcga cgtctggtcc 2520

tatggcatcc tcctctggga gatcttctca cttgggctga atccctaccc tggcatcctg 2580

gtgaacagca agttctataa actggtgaag gatggatacc aaatggccca gcctgcattt 2640

gccccaaaga atatatacag catcatgcag gcctgctggg ccttggagcc cacccacaga 2700

cccaccttcc agcagatctg ctccttcctt caggagcagg cccaagagga caggagagag 2760

cgggactata ccaatctgcc gagcagcagc agaagcggtg gcagcggcag cagcagcagt 2820

gagctggagg aggagagctc tagtgagcac ctgacctgct gcgagcaagg ggatatcgcc 2880

cagcccttgc tgcagcccaa caactatcag ttctgctga 2919

<210> 6

<211> 972

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> G795C CSF1R

<400> 6

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970

<210> 7

<211> 2919

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CSF1R G795V

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，NNN是GTT

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，NNN是GTC

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，NNN是GTA

<220>

<221> misc_特征

<222> (2383)..(2385)

<223> 其中，NNN是GTG

<400> 7

atgggcccag gagttctgct gctcctgctg gtggccacag cttggcatgg tcagggaatc 60

ccagtgatag agcccagtgt ccctgagctg gtcgtgaagc caggagcaac ggtgaccttg 120

cgatgtgtgg gcaatggcag cgtggaatgg gatggccccc catcacctca ctggaccctg 180

tactctgatg gctccagcag catcctcagc accaacaacg ctaccttcca aaacacgggg 240

acctatcgct gcactgagcc tggagacccc ctgggaggca gcgccgccat ccacctctat 300

gtcaaagacc ctgcccggcc ctggaacgtg ctagcacagg aggtggtcgt gttcgaggac 360

caggacgcac tactgccctg tctgctcaca gacccggtgc tggaagcagg cgtctcgctg 420

gtgcgtgtgc gtggccggcc cctcatgcgc cacaccaact actccttctc gccctggcat 480

ggcttcacca tccacagggc caagttcatt cagagccagg actatcaatg cagtgccctg 540

atgggtggca ggaaggtgat gtccatcagc atccggctga aagtgcagaa agtcatccca 600

gggcccccag ccttgacact ggtgcctgca gagctggtgc ggattcgagg ggaggctgcc 660

cagatcgtgt gctcagccag cagcgttgat gttaactttg atgtcttcct ccaacacaac 720

aacaccaagc tcgcaatccc tcaacaatct gactttcata ataaccgtta ccaaaaagtc 780

ctgaccctca acctcgatca agtagatttc caacatgccg gcaactactc ctgcgtggcc 840

agcaacgtgc agggcaagca ctccacctcc atgttcttcc gggtggtaga gagtgcctac 900

ttgaacttga gctctgagca gaacctcatc caggaggtga ccgtggggga ggggctcaac 960

ctcaaagtca tggtggaggc ctacccaggc ctgcaaggtt ttaactggac ctacctggga 1020

cccttttctg accaccagcc tgagcccaag cttgctaatg ctaccaccaa ggacacatac 1080

aggcacacct tcaccctctc tctgccccgc ctgaagccct ctgaggctgg ccgctactcc 1140

ttcctggcca gaaacccagg aggctggaga gctctgacgt ttgagctcac ccttcgatac 1200

cccccagagg taagcgtcat atggacattc atcaacggct ctggcaccct tttgtgtgct 1260

gcctctgggt acccccagcc caacgtgaca tggctgcagt gcagtggcca cactgatagg 1320

tgtgatgagg cccaagtgct gcaggtctgg gatgacccat accctgaggt cctgagccag 1380

gagcccttcc acaaggtgac ggtgcagagc ctgctgactg ttgagacctt agagcacaac 1440

caaacctacg agtgcagggc ccacaacagc gtggggagtg gctcctgggc cttcataccc 1500

atctctgcag gagcccacac gcatcccccg gatgagttcc tcttcacacc agtggtggtc 1560

gcctgcatgt ccatcatggc cttgctgctg ctgctgctcc tgctgctatt gtacaagtat 1620

aagcagaagc ccaagtacca ggtccgctgg aagatcatcg agagctatga gggcaacagt 1680

tatactttca tcgaccccac gcagctgcct tacaacgaga agtgggagtt cccccggaac 1740

aacctgcagt ttggtaagac cctcggagct ggagcctttg ggaaggtggt ggaggccacg 1800

gcctttggtc tgggcaagga ggatgctgtc ctgaaggtgg ctgtgaagat gctgaagtcc 1860

acggcccatg ctgatgagaa ggaggccctc atgtccgagc tgaagatcat gagccacctg 1920

ggccagcacg agaacatcgt caaccttctg ggagcctgta cccatggagg ccctgtactg 1980

gtcatcacgg agtactgttg ctatggcgac ctgctcaact ttctgcgaag gaaggctgag 2040

gccatgctgg gacccagcct gagccccggc caggaccccg agggaggcgt cgactataag 2100

aacatccacc tcgagaagaa atatgtccgc agggacagtg gcttctccag ccagggtgtg 2160

gacacctatg tggagatgag gcctgtctcc acttcttcaa atgactcctt ctctgagcaa 2220

gacctggaca aggaggatgg acggcccctg gagctccggg acctgcttca cttctccagc 2280

caagtagccc agggcatggc cttcctcgct tccaagaatt gcatccaccg ggacgtggca 2340

gcgcgtaacg tgctgttgac caatggtcat gtggccaaga ttnnngactt cgggctggct 2400

agggacatca tgaatgactc caactacatt gtcaagggca atgcccgcct gcctgtgaag 2460

tggatggccc cagagagcat ctttgactgt gtctacacgg ttcagagcga cgtctggtcc 2520

tatggcatcc tcctctggga gatcttctca cttgggctga atccctaccc tggcatcctg 2580

gtgaacagca agttctataa actggtgaag gatggatacc aaatggccca gcctgcattt 2640

gccccaaaga atatatacag catcatgcag gcctgctggg ccttggagcc cacccacaga 2700

cccaccttcc agcagatctg ctccttcctt caggagcagg cccaagagga caggagagag 2760

cgggactata ccaatctgcc gagcagcagc agaagcggtg gcagcggcag cagcagcagt 2820

gagctggagg aggagagctc tagtgagcac ctgacctgct gcgagcaagg ggatatcgcc 2880

cagcccttgc tgcagcccaa caactatcag ttctgctga 2919

<210> 8

<211> 972

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CSF1R G795V

<400> 8

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Val Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970

Claims (58)

1.经修饰的人类细胞，其对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞包含编码经修饰的CSF1R蛋白的核酸，所述经修饰的CSF1R蛋白对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性。

3.经修饰的人类细胞，所述细胞包含编码经修饰的CSF1R蛋白的核酸，所述经修饰的CSF1R蛋白对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞，其中，所述细胞包含CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰。

5.根据权利要求4所述的细胞，其中，所述一种以上的基因修饰导致CSF1R的氨基酸序列的变化，所述变化可选地包括选自G795、L785、M637、E633和V647的氨基酸残基的取代。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞，其中，所述一种以上的基因修饰导致经修饰的ATP结合口袋。

7.根据权利要求6所述的细胞，其中，所述经修饰的ATP结合口袋具有减小的结合空间。

8.根据权利要求7所述的细胞，其中，所述经修饰的ATP结合口袋不能结合CSF1R拮抗剂。

9.根据权利要求6所述的细胞，其中，所述经修饰的ATP结合口袋能结合ATP。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的细胞，其中，CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不干扰CSF1R蛋白的ATP结合活性。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中，CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不诱导组成性活性CSF1R信号传导。

12.根据权利要求11所述的细胞，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过CSF1配体激活。

13.根据权利要求12所述的细胞，其中，所述CSF1配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

14.根据权利要求11所述的细胞，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过IL-34配体激活。

15.根据权利要求14所述的细胞，其中，所述IL-34配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

16.根据权利要求4所述的细胞，其中，所述一种以上的基因修饰是体外引入的。

17.根据权利要求4所述的细胞，其中，所述一种以上的基因修饰通过转染或将编码转基因的核酸引入细胞中来诱导，或通过转导或引入靶向核酸酶、内切酶、碱基编辑效应子或核糖核蛋白络合物来诱导。

18.根据权利要求17所述的细胞，其中，将编码转基因的核酸引入细胞中包括将所述细胞与病毒载体接触。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞，其中，所述包含经修饰的CSF1R蛋白的细胞保留包含野生型CSF1R蛋白的细胞的基因表达谱。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的细胞，其中，所述细胞还包含另一基因中的一种以上的修饰。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的经修饰的人类细胞，其中，所述细胞表达CSF1R。

22.根据权利要求21所述的细胞，其中，所述细胞被诱导并分化以表达CSF1R，所述细胞选自多能干细胞、造血干细胞、红系骨髓细胞祖细胞和造血祖细胞。

23.根据权利要求22所述的细胞，其中，所述细胞是表达CSF1R的细胞，所述细胞选自小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞或其他吞噬细胞。

24.组合物，所述组合物包含权利要求20-23中任一项所述的表达CSF1R的细胞。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述表达CSF1R的细胞是表达CSF1R的细胞。

26.根据权利要求25所述的组合物，所述组合物包含多个细胞，其中，至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的所述细胞是对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的表达CSF1R的细胞。

27.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：

(a)向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂；以及

(b)使受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞接触。

28.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：

(a)使受试者与对CSF1R拮抗剂具有差异化抗性的经修饰的表达CSF1R的细胞接触；以及

(b)向受试者施用足以抑制受试者细胞中CSF1R信号的量的CSF1R拮抗剂。

29.根据权利要求27和28所述的方法，其中，所述表达CSF1R的细胞是表达CSF1R的细胞。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂的部分或完全抗性。

31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞保留表达野生型CSF1R的细胞的基因表达谱。

32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞表达用于治疗、治愈、改善、预防或减缓神经系统疾病的基因产物或其他基因修饰。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述基因产物是不以其他方式通过表达CSF1R的细胞表达的转基因。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，通过CSF1R拮抗剂抑制的CSF1R信号是受试者内源的表达CSF1R的细胞的增殖或存活。

35.根据权利要求27-34中任一项所述的方法，其中，CSF1R拮抗剂以足以使表达CSF1R的内源性细胞的增殖和/或存活相对于经修饰的表达CSF1R的细胞减少的量施用于受试者。

36.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：

(a)使受试者与经修饰的表达CSF1R的细胞接触，以及

(b)差异化地改变未修饰的表达CSF1R的细胞相对于经修饰的表达CSF1R的细胞的增殖或存活。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞是表达CSF1R的吞噬细胞。

38.根据权利要求36和37所述的方法，其中，所述经修饰的表达CSF1R的细胞对CSF1R拮抗剂具有部分抗性。

39.根据权利要求36所述的方法，其中，差异化地改变未修饰的表达CSF1R的细胞的增殖或存活的步骤包括：向受试者施用足以使未修饰的表达CSF1R的细胞的增殖和/或存活相对于经修饰的表达CSF1R的细胞减少的量的CSF1R拮抗剂。

40.核酸组合物，所述组合物编码对CSF1R拮抗剂表现出差异化抗性的经修饰的CSF1R蛋白。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂的部分抗性或完全抗性。

42.根据权利要求40所述的组合物，其中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂增加的抗性。

43.根据权利要求40所述的组合物，其中，对CSF1R拮抗剂的差异化抗性是对CSF1R拮抗剂降低的抗性。

44.根据权利要求40-43中任一项所述的组合物，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白包含一种以上的基因修饰。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中，所述一种以上的基因修饰导致CSF1R的氨基酸序列的变化，所述变化可选地包括选自G795、L785、M637、E633和V647的氨基酸残基的取代。

46.根据权利要求44所述的组合物，其中，所述一种以上的基因修饰导致经修饰的ATP结合口袋。

47.根据权利要求46所述的组合物，其中，所述经修饰的ATP结合口袋具有减小的结合空间。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中，所述经修饰的ATP结合口袋不能结合CSF1R拮抗剂。

49.根据权利要求46所述的组合物，其中，所述经修饰的ATP结合口袋能结合ATP。

50.根据权利要求44所述的组合物，其中，所述CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不干扰CSF1R蛋白的ATP结合活性。

51.根据权利要求44所述的组合物，其中，所述CSF1R蛋白中的一种以上的基因修饰不诱导组成性活性CSF1R信号传导。

52.根据权利要求51所述的组合物，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过CSF1配体激活。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中，所述CSF1配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

54.根据权利要求51所述的组合物，其中，所述经修饰的CSF1R蛋白通过IL-34配体激活。

55.根据权利要求54所述的细胞，其中，所述IL-34配体诱导所述经修饰的CSF1R蛋白的磷酸化。

56.表达载体，所述表达载体包含权利要求40-55中任一项所述的核酸组合物，所述核酸组合物可操作地连接至表达控制序列。

57.用权利要求56所述的载体转染的培养细胞或所述细胞的后代，其中，所述培养细胞表达多肽。

58.用权利要求56所述的载体感染的内源性细胞，其中，所述内源性细胞表达多肽。