TWI598101B

TWI598101B - 用於心臟再生的治療性基因混合製劑

Info

Publication number: TWI598101B
Application number: TW105112234A
Authority: TW
Inventors: 謝清河; 鄭媛元
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2017-09-11
Also published as: CN107847557B; WO2016172082A1; US10398786B2; US20180099056A1; CN107847557A; TW201701886A

Description

用於心臟再生的治療性基因混合製劑

本揭示內容是關於一種活性藥劑組合物。更具體來說，本揭示內容是關於一種選自FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的活性藥劑組合物及其用途。

由於哺乳動物之成熟個體的心肌細胞 (cardiomyocyte, CM)增生能力較差，因此心臟再生一直是此領域長期存在的挑戰。CM於出生一週內會進行最後一次的DNA合成及有絲分裂，變為雙核細胞後即不再進入細胞週期。雖然心臟受損後，殘存的CM仍具有些許程度的增生能力，然而其增生效率極低(Naqvi et al., Cell 157(4):795-807; 2014)。

已知體細胞能被重整(reprogrammed)而回復到與具有高增生能力之胚胎幹細胞(embryonic stem cell, ESC)相似的多潛能細胞(pluripotent cell)狀態(Takahashi et al., Cell 126(4):663-676; 2006)。該些重整後的細胞一般稱為誘導性多潛能幹細胞(induced pluripotent stem cell, iPS cell或iPSC)。相關領域亦已證實CM具有細胞重整的潛能。(Xu et al., Cell Res. 22(1):142-154)。此外，目前仍不了解不同時間點中CM重新進入細胞週期的詳細機制或功能。

本揭示內容是基於發明人意外地發現心肌細胞進行細胞重整的關鍵時間點，以及包含FoxM1、Id1及JNK3之基因組對於心肌細胞生長具有重要的影響。意外地，本揭示內容所述之基因組的增強子或抑制劑不僅可成功促進新生個體之心臟受損區域中心肌細胞的增生，亦能成功地促進成熟個體之心臟受損區域中心肌細胞的增生。具體來說，包含至少二種選自 FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的組合物，可成功達到此功效。

據此，本揭示內容提供了一種用以促進心臟再生或心臟細胞增生的方法；該方法包含對一有需要之個體投予一有效量之組合物，其中該組合物包含至少二種以下成分：(i) FoxM1增強子、(ii) Id1增強子及(iii) JNK3抑制劑。組合物可包含(i)及(ii)、(i)及(iii)、(ii)及(iii)。在某些實施例中，組合物可包含(i)–(iii)的所有成分。

在某些實施方式中，FoxM1增強子是一FoxM1多肽或一用以製備該FoxM1多肽的表現載體。在某些實施方式中，Id1增強子是一Id1多肽或一用以製備該Id1多肽的表現載體。或者是JNK3抑制劑是一對JNK3具有專一性之shRNA。

在任一種本揭示內容所述之方法中，投予步驟是指將一或多種用以製備FoxM1多肽、Id1多肽及對JNK3具有專一性之shRNA的表現載體傳遞至個體。在某些實施方式中，一或多種表現載體是病毒載體(例如腺病毒載體或腺病毒相關病毒載體)或非病毒載體。

能接受本揭示內容所述方法治療的個體可以是一罹患心肌梗塞、疑似罹患心肌梗塞或有罹患心肌梗塞之風險的人類病患。在某些實施例中，是將該組合物投予至一發生或疑似發生心臟退化性疾病的位置。在某些實施例中，該個體是一新生個體。在某些實施例中，該個體是一成熟個體。

在另一態樣中，本揭示內容提供了一種用以促進心臟再生的套組，該套組包含至少二種以下成分：(i)本揭示內容所述之FoxM1增強子；(ii)本揭示內容所述之Id1增強子；以及(iii)本揭示內容所述之JNK3抑制劑。套組可以包含(i)到(iii)之任何組合；舉例來說，(i)–(iii)所有成分。在某些實施例中，套組包含用以製備FoxM1多肽、Id1多肽及/或對JNK3具有專一性之shRNA的表現載體。表現載體可以是病毒載體(例如腺病毒載體或腺病毒相關病毒載體)或非病毒載體。

在任一種本揭示內容所述之套組中，套組可更包含使用操作說明，據以對一個體投予該FoxM1增強子、該Id1增強子及該JNK3抑制劑以促進心臟再生或心臟細胞增生。

在再另一態樣中，本揭示內容是關於一種用以促進心肌細胞增生及分化的方法；該方法包含將心肌細胞與至少二種以下成分共同培養：(i) FoxM1增強子；(ii) Id1增強子；以及(iii) JNK3抑制劑。該方法可更包含將培養的心肌細胞傳遞至一有需要之個體。本發明方法可使用任一種本揭示內容所述之FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑。在某些實施方式中，是將心肌細胞與(i)–(iii)的所有成分共同培養。

能接受本揭示內容所述方法治療的個體可以是一罹患心臟退化性疾病、疑似罹患心臟退化性疾病或有罹患心臟退化性疾病之風險的人類病患。在某些實施方式中，心肌細胞是自體的(autologous)心肌細胞。在其他實施方式中，心肌細胞是異體的(allogenic)心肌細胞。在某些實施方式中，個體是一新生個體。在某些實施方式中，個體是一成熟個體。

本揭示內容的範圍亦包含一種用以促進心臟再生或心臟細胞增生的藥學組合物；該組合物包含一包含至少以下二種成分的組合：(i) FoxM1增強子、(ii) Id1增強子及(iii) JNK3抑制劑；以及一藥學上可接受之載體。或者是，藥學組合物包含與組合共同培養的心肌細胞。本揭示內容更提供了任一種FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑之組合，或是與該組合共同培養的心肌細胞，藉以製備一用以促進心臟再生的藥物。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

本揭示內容部分是基於在細胞重整第2天確認CM增生的特定時間點，以及確認FoxM1、Id1及/或JNK3基因可調控CM增生。意外地，包含FoxM1、Id1及Jnk3-shRNA (一種JNK3抑制劑)之二重或三重組合的基因混合製劑可有效增加活體外及新生與成熟小鼠體內之CM的增生。本揭示內容亦揭示在損傷後，FoxM1、Id1及Jnk3-shRNA的三重組合可有效促進活體內心臟發育及再生。

因此，本揭示內容是關於利用至少二種以下成分的組合來促進CM細胞增生(活體內或活體外)的方法：(i) FoxM1增強子、(ii) Id1增強子及(iii) JNK3抑制劑。I. FoxM1 、 Id1 及 JNK3 增強子或抑制劑

本揭示內容的一態樣是關於至少二種以下成分的組合：(i) FoxM1增強子、(ii) Id1增強子及(iii) JNK3抑制劑。

在本揭示內容中，一特定基因/蛋白的增強子是指任何能於標的細胞(例如一心肌細胞)中增加由該基因編碼而成的蛋白產物(基因產物)之表現量或活性的藥劑(agent)。基因的增強子可以是一種核酸(例如一表現載體)；當將該核酸轉殖至標的細胞後，其可產生由該基因編碼的蛋白。增強子亦可以是基因產物的多肽，其與基因產物(例如全長基因產物、其功能性片段或包含基因產物之功能性片段的融合蛋白)具有相同的生物活性。在其他實施例中，增強子可以是一種能活化基因表現或改善基因產物之生物活性的藥劑(例如一核酸、一多肽或一小分子)。在某些實施方式中，相較於缺乏增強子的強況，增強子可改善基因產物的活性，且改善幅度至少為10%、20%、50%、100%、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或1,000倍。

在本揭示內容中，一特定基因/蛋白的抑制劑是指任何能於標的細胞(例如一心肌細胞)中減少由該基因編碼產生之蛋白產物的表現量或活性的藥劑。基因的抑制劑可以是一種能抑制基因表現或基因產物活性的核酸、多肽或小分子。舉例來說，抑制劑可以是反義股寡核苷酸(antisense oligonucleotide)或干擾RNA (interfering RNA)，其係能標的至標的基因或其mRNA之一或多個位置，藉以阻斷基因轉錄或蛋白轉譯。在某些實施方式中，相較於缺乏抑制劑的情況，抑制劑可抑制基因產物的活性，且抑制幅度至少為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或至少為95%。可利用習知方法來製備可專一結合至標的mRNA而不會與其他多核苷酸(polynucleotide)交互反應的反義股寡核苷酸分子。例示性之標的位置包含，但不限於，起始密碼子(initiation codon)、5’調控區域(5’ regulatory region)、編碼序列(coding sequence)及3’未轉譯區域(3’ untranslated region)。寡核苷酸抑制劑(包含反義股寡核苷酸及諸如shRNA等干擾RNA)的長度約為10到100個核苷酸、約為15到50個核苷酸、約為18到25個核苷酸，或更多個核苷酸。寡核苷酸可包含骨架的修飾，例如本所屬領域所熟知之硫代磷酸酯鍵結(phosphorothioate linkage)及2’-O糖飾(2’-O sugar modification)等。在某些情況下，寡核苷酸可包含一或多鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)。在其他實施例中，抑制劑可以是能中和標的蛋白活性的抗體(例如全長抗體或其抗原結合片段)。(i) FoxM1 增強子

本揭示內容所述之FoxM1增強子是一種能增加標的細胞(例如心肌細胞)中FoxM1表現量或活性的藥劑。FoxM1 (Forkhead box M1)是FOX轉錄因子家族中的一員。FOXM1 基因(例如基因編號：2305；基因體對照序列：NG_029590.1)可編碼出人類蛋白(例如NP_973732.1)。FoxM1具有三種同型異構物：同型異構物A、同型異構物B及同型異構物C；本揭示內容範疇包含三種同型異構物。在某些實施方式中，本揭示內容所述之FoxM1增強子為FoxM1多肽，其係與FoxM1具有相同生物活性的蛋白。FoxM1多肽可以是全長的FoxM1蛋白、其功能性片段或包含FoxM1功能性片段的融合蛋白。FoxM1包含3段功能性蛋白域(domain)，包含N端自我抑制蛋白域(N-terminal auto-inhibitory domain)、叉型頭家族DNA結合蛋白域(fork-head family DNA-binding domain)及C端轉活化蛋白域(C-terminal transactivation domain)。週期素A (cyclin A)會調控N端自我抑制蛋白域(第1-232個殘基)，據以在細胞週期之G2/M時期將FoxM1轉換為活化形式。N端蛋白域會標的結合至位於FoxM1之C端蛋白域的LXL片段(第641-748個殘基)，以進行自我抑制反應(Laoukili et al., 2008; Park et al., 2008)。在去除2個片段後，殘存的FoxM1片段會持續活化於整個細胞週期中。在某些實施例中， FoxM1的功能性片段包含FoxM1之第232-641個殘基。

在某些實施方式中，FoxM1多肽是一源自適當來源(例如人類、猴子、小鼠或大鼠)之天然存在的FoxM1多肽。舉例來說，FoxM1多肽可以是源自人類或小鼠(例如C57BL/6小鼠)的FoxM1多肽。當可想見，FoxM1多肽可以是FoxM1的同型異構物(例如天然存在的FoxM1同型異構物)。舉例來說，FoxM1可以是人類FoxM1的同型異構物A、同型異構物B或同型異構物C。本揭示內容亦包含本所屬領域熟知之其他FoxM1同型異構物。在某些實施方式中，FoxM1多肽包含序列編號：2-4之任一胺基酸序列，或本所屬領域熟知及/或本揭示內容(例如序列編號：2-4中以粗寫體標記之片段)所述之功能性片段。

FoxM1A (gi|42544167|ref|NP_973731.1|叉型頭框蛋白M1同型異構物1 [智人])： MKTSPRRPLILKRRRLPLPVQNAPSETSEEEPKRSPAQQESNQAEASKEVAESNSCKFPAGIKIINHPTMPNTQVVAIPNNANIHSIITALTAKGKESGSSGPNKFILISCGGAPTQPPGLRPQTQTSYDAKRTEVTLETLGPKPAARDVNLPRPPGALCEQKRETCADGEAAGCTINNSLSNIQWLRKMSSDGLGSRSIKQEMEEKENCHLEQRQVKVEEPSRPSASWQNSVSERPPYSYMAMIQFAINSTERKRMTLKDIYTWIEDHFPYFKHIAKPGWKNSIRHNLSLHDMFVRETSANGKVSFWTIHPSANRYLTLDQVFKPLDPGSPQLPEHLESQQKRPNPELRRNMTIKTELPLGARRKMKPLLPRVSSYLVPIQFPVNQSLVLQPSVKVPLPLAASLMSSELARHSKRVRIAPKVFGEQVVFGYMSKFFSGDLRDFGTPITSLFNFIFLCLSVLLAEEGIAPLSSAGPGKEEKLLFGEGFSPLLPVQTIKEEEIQPGEEMPHLARPIKVESPPLEEWPSPAPSFKEESSHSWEDSSQSPTPRPKKSYSGLRSPTRCVSEMLVIQHRERRERSRSRRKQHLLPPCVDEPELLFSEGPSTSRWAAELPFPADSSDPASQLSYSQEVGGPFKTPIKETLPISSTPSKSVLPRTPESWRLTPPAKVGGLDFSPVQTSQGASDPLPDPLGL MDLSTTPLQSAPPLESPQRLLSSEPLDLISVPFGNSSPSDIDVPKPGSPEPQVSGLAANRSLTEGLVLDTMNDSLSKILLDISFPGLDEDPLGPDNINWSQFIPELQ (序列編號：2)

FOXM1B (gi|42544161|ref|NP_973732.1|叉型頭框蛋白M1同型異構物3 [智人])： MKTSPRRPLILKRRRLPLPVQNAPSETSEEEPKRSPAQQESNQAEASKEVAESNSCKFPAGIKIINHPTMPNTQVVAIPNNANIHSIITALTAKGKESGSSGPNKFILISCGGAPTQPPGLRPQTQTSYDAKRTEVTLETLGPKPAARDVNLPRPPGALCEQKRETCADGEAAGCTINNSLSNIQWLRKMSSDGLGSRSIKQEMEEKENCHLEQRQVKVEEPSRPSASWQNSVSERPPYSYMAMIQFAINSTERKRMTLKDIYTWIEDHFPYFKHIAKPGWKNSIRHNLSLHDMFVRETSANGKVSFWTIHPSANRYLTLDQVFKQQKRPNPELRRNMTIKTELPLGARRKMKPLLPRVSSYLVPIQFPVNQSLVLQPSVKVPLPLAASLMSSELARHSKRVRIAPKVLLAEEGIAPLSSAGPGKEEKLLFGEGFSPLLPVQTIKEEEIQPGEEMPHLARPIKVESPPLEEWPSPAPSFKEESSHSWEDSSQSPTPRPKKSYSGLRSPTRCVSEMLVIQHRERRERSRSRRKQHLLPPCVDEPELLFSEGPSTSRWAAELPFPADSSDPASQLSYSQEVGGPFKTPIKETLPISSTPSKSVLPRTPESWRLTPPAKVGGLDFSPVQTSQGASDPLPDPLGL MDLSTTPLQSAPPLESPQRLLSSEPLDLISVPFGNSSPSDIDVPKPGSPEPQVSGLAANRSLTEGLVLDTMNDSLSKILLDISFPGLDEDPLGPDNINWSQFIPELQ (序列編號：3)

FOXM1C (gi|42544165|ref|NP_068772.2|叉型頭框蛋白M1同型異構物2 [智人])： MKTSPRRPLILKRRRLPLPVQNAPSETSEEEPKRSPAQQESNQAEASKEVAESNSCKFPAGIKIINHPTMPNTQVVAIPNNANIHSIITALTAKGKESGSSGPNKFILISCGGAPTQPPGLRPQTQTSYDAKRTEVTLETLGPKPAARDVNLPRPPGALCEQKRETCADGEAAGCTINNSLSNIQWLRKMSSDGLGSRSIKQEMEEKENCHLEQRQVKVEEPSRPSASWQNSVSERPPYSYMAMIQFAINSTERKRMTLKDIYTWIEDHFPYFKHIAKPGWKNSIRHNLSLHDMFVRETSANGKVSFWTIHPSANRYLTLDQVFKPLDPGSPQLPEHLESQQKRPNPELRRNMTIKTELPLGARRKMKPLLPRVSSYLVPIQFPVNQSLVLQPSVKVPLPLAASLMSSELARHSKRVRIAPKVLLAEEGIAPLSSAGPGKEEKLLFGEGFSPLLPVQTIKEEEIQPGEEMPHLARPIKVESPPLEEWPSPAPSFKEESSHSWEDSSQSPTPRPKKSYSGLRSPTRCVSEMLVIQHRERRERSRSRRKQHLLPPCVDEPELLFSEGPSTSRWAAELPFPADSSDPASQLSYSQEVGGPFKTPIKETLPISSTPSKSVLPRTPESWRLTPPAKVGGLDFSPVQTSQGASDPLPDPLGL MDLSTTPLQSAPPLESPQRLLSSEPLDLISVPFGNSSPSDIDVPKPGSPEPQVSGLAANRSLTEGLVLDTMNDSLSKILLDISFPGLDEDPLGPDNINWSQFIPELQ (序列編號：4)

以粗寫體標記的片段是指FoxM1持續活化的形式。其他的人類FOXM1B同型異構物包含NP_001230017.1及NP_001230018.1。

本揭示內容亦包含FoxM1多肽的變異體(variant)，例如任何與一源自生物體(例如人類、猴子、小鼠或大鼠)之FoxM1多肽不同，卻與該FoxM1多肽具有同源性且與其天然存在的對應物具有相似之生物活性的多肽。在本揭示內容中，「同源」(homologous)一詞是指核酸或多肽之間整體的關聯性。在某些實施方式中，若序列間至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同，則稱該多肽與另一多肽為「同源」(homologous)。「同源」(homologous)一詞是指至少二序列(例如胺基酸序列)之間的比對。在某些實施方式中，FoxM1多肽包含一胺基酸序列，其係至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相似於序列編號：2-4之任一胺基酸序列。

可以最佳比對方式來比對二序列，據以計算二序列(例如多肽序列)間的相似度百分比；例如可於第一及第二核酸序列之其中一條或二條插入間隔序列(gap)，以及忽略非相同的序列以進行最佳比對。在某些實施方式中，進行比對的序列長度是參照序列長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。之後比對位於對應多肽位置的胺基酸。當第一序列中一位置的胺基酸是與第二序列中對應位置的胺基酸相同時，則該些分子之該位置是相同的。二序列間的相似度百分比是序列相同位置的函數，其中若於二序列內插入間隔序列以進行最佳比對時，須將插入間隔序列的數量及各間隔序列的長度列入考量。可利用數學演算法來比對序列並檢測二序列間的相似度百分比。舉例來說，可利用以下方法來檢測二序列間的相似度百分比：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991。可將用以檢測相似度的技術編碼至公開使用的電腦程式中。例示性之用以檢測二序列同源性的電腦軟體包含，但不限於BLASTP、ClustalW、Clustal Omega及Base-By-Base。

在某些實施方式中，FoxM1多肽是一源自生物體(例如人類、猴子、小鼠或大鼠)之FoxM1多肽的功能性片段或其同源性多肽。在本揭示內容中，「FoxM1功能性片段」(FoxM1 functional fragment)是指FoxM1多肽的一部分，或是與FoxM1多肽具有同源性且與對應FoxM1多肽具有相似生物功能之蛋白的一部分。在某些實施方式中，可藉由習知方法來檢測FoxM1片段對基因表現(例如Plk1、週期素B2 (cyclin B2)、NeK2或CENPF)的調控。在某些實施方式中，可利用任何適合的方法(舉例來說，檢測H3P的表現量)來確認FoxM1片段會增加細胞的增生。在某些實施方式中，FoxM1片段會持續性地活化，亦即在細胞週期中，FoxM1片段皆係處於活化狀態，舉例來說，藉由移除一或多自我抑制蛋白域。

在某些實施方式中，FoxM1片段包含FoxM1多肽的C端。舉例來說，本發明方法所使用的FoxM1片段可包含(例如由以下所組成)序列編號：2之第232-694個胺基酸或其同源性多肽。在某些實施方式中，FoxM1片段包含序列編號：3之第232-641個胺基酸或其同源性多肽。在某些實施方式中， FoxM1片段包含序列編號：4之第232-656個胺基酸或其同源性多肽。

在其他實施方式中，本揭示內容所述之FoxM1增強子是一核酸，例如一表現載體，其係包含一可編碼出本揭示內容所述之任一種FoxM1多肽的核苷酸序列。進行編碼的核苷酸序列係可操作式地連接至一適當的啟動子。當轉殖至標的細胞(例如心肌細胞)後，核酸序列可產生FoxM1多肽。

在其他實施方式中，本揭示內容所述之FoxM1增強子是一能增加FOXM1 基因表現或活化FoxM1蛋白活性的藥劑(例如小分子)。例示性之藥劑包含，但不限於AMPK (Sengupta et al. 2012, Circ Res.)、Osteopontin (Xie et al., 2014, Int J Mol Sci.)、CXCL12 (Wang et al. 2013, BBRC)及TNF-α (Xia et al. 2012, Oncogen)。(ii)Id1 增強子

本揭示內容所述之Id1 (或DNA結合蛋白抑制劑 ID-1)增強子可以是一種能增加諸如心肌細胞等標的細胞中Id1表現量或活性的藥劑。Id1是一種螺旋-環圈-螺旋(helix-loop-helix, HLH)蛋白，能與轉錄因子之鹼性HLH家族(basic HLH family)成員形成異二聚體(heterodimer)。ID1 基因(例如基因編號：3397；基因體對照序列：NG_029639)可編碼出人類蛋白(例如NP_002156.2 and NP_ 851998.1)。在某些實施方式中，本揭示內容所述之Id1增強子是一與Id1具有相同生物活性的Id1 多肽。Id1多肽可以是全長的Id1蛋白、其功能性片段或包含 Id1功能性片段的融合蛋白。

在某些實施方式中，Id1多肽是源自適當來源(例如人類、猴子、小鼠或大鼠)之天然存在的Id1多肽。舉例來說，Id1多肽可以是源自人類或小鼠(例如C57BL/6小鼠)的Id1多肽。當可想見，Id1多肽可以是任一種Id1同型異構物。舉例來說，Id1可以是人類Id1的同型異構物A或同型異構物B。本揭示內容亦包含本所屬領域熟知之其他Id1同型異構物。在某些實施方式中，Id1多肽包含序列編號：5-6之任一胺基酸序列。

Id1同型異構物A (gi|31317299|ref|NP_002156.2| DNA結合蛋白抑制劑 ID-1同型異構物a[智人]): MKVASGSTATAAAGPSCALKAGKTASGAGEVVRCLSEQSVAISRCAGGAGARLPALLDEQQVNVLLYDMNGCYSRLKELVPTLPQNRKVSKVEILQHVIDYIRDLQLELNSESEVGTPGGRGLPVRAPLSTLNGEISALTAEAACVPADDRILCR (序列編號：5)

Id1同型異構物B (gi|31317297|ref|NP_851998.1| DNA結合蛋白抑制劑 ID-1同型異構物b [智人]): MKVASGSTATAAAGPSCALKAGKTASGAGEVVRCLSEQSVAISRCAGGAGARLPALLDEQQVNVLLYDMNGCYSRLKELVPTLPQNRKVSKVEILQHVIDYIRDLQLELNSESEVGTPGGRGLPVRAPLSTLNGEISALTAEVRSRSDH (序列編號：6)

本揭示內容亦包含Id1多肽的變異體，例如任何與一源自天然存在的對應物(例如人類、猴子、小鼠或大鼠)之Id1多肽不同，卻與該Id1多肽具有同源性的多肽。在某些實施方式中，Id1多肽是與天然存在的Id1多肽(例如源自人類或小鼠之Id1多肽)具有同源性的多肽。在某些實施方式中，Id1多肽包含與一胺基酸序列，其係序列編號：5-6任一核酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%的相似度。

在某些實施方式中，Id1多肽是Id1多肽(例如天然存在的Id1多肽)的功能性片段，且與對應Id1多肽具有相似生物活性。在某些實施方式中，Id1片段會與轉錄因子之鹼性HLH家族的成員結合。在某些實施方式中，Id1片段會與轉錄因子之鹼性HLH家族成員結合並抑制其之至少一種功能。在某些實施方式中，可利用習知方法來確認Id1片段調控基因(例如TSP-1)表現的能力。在某些實施方式中，可利用習知方法(舉例來說檢測H3P的表現量)來確認Id1片段提高細胞增生的能力。

在其他實施方式中，本揭示內容所述之Id1增強子是一核酸，例如一表現載體，其係包含一可編碼出本揭示內容所述之任一種Id1多肽的核苷酸序列。該核苷酸序列係可操作式地連接至一適當的啟動子。當轉殖至標的細胞(例如心肌細胞)後，該核酸序列即可產生Id1多肽。

在其他實施方式中，本揭示內容所述之Id1增強子是一種能增加Id1 基因表現量或Id1蛋白活性的藥劑(例如分子量通常小於5,000 kDa的小分子)。例示性的藥劑包含，但不限於，BMPs (Valdimarsdottir et al. 2002, Circulation)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF; Florholmen et al. 2004, Acta Physiol Scand)、葡萄糖或胰島素(Wice et al., 2001, Diabetologia)、LMP1 (Li et al., 2004, Oncogen)、5-氮雜-2'-去氧胞核苷(5-aza-2'-deoxycytidine, DAC)及HDAC抑制劑曲古黴素A (trichostatin A, TSA) (Yu et al., 2008, Cell Prolif.)。(iii) JNK3 抑制劑

c-Jun　N端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase 3, JNK3)亦稱為有絲分裂活化蛋白激酶10 (Mitogen-activated protein kinase 10, MAPK10)，是MAPK家族中的一種蛋白激酶，會受不同環境壓力及促發炎細胞激素的調控而活化。MAPK10 基因(例如基因編號：5602；基因體對照序列：NG_013325.2)可編碼出人類JNK3蛋白(例如NP_620448.1)。例示性的人類JNK3蛋白包含，但不限於，同型異構物1 (NP_620448.1)、同型異構物2 (NP_002744.1)、同型異構物3 (NP_620446.1)、同型異構物5 (NP_001304996.1)及同型異構物6 (NP_001304997.1)。序列編號：7是一種例示性的JNK3胺基酸序列。當可想見，本揭示內容亦包含源自其他生物體(例如人類、猴子、小鼠或大鼠)之JNK3及其天然存在的同型異構物。

JNK3同型異構物1 (gi|20986510|ref|NP_620448.1| 有絲分裂活化蛋白激酶10同型異構物 1 [智人]) MSLHFLYYCSEPTLDVKIAFCQGFDKQVDVSYIAKHYNMSKSKVDNQFYSVEVGDSTFTVLKRYQNLKPIGSGAQGIVCAAYDAVLDRNVAIKKLSRPFQNQTHAKRAYRELVLMKCVNHKNIISLLNVFTPQKTLEEFQDVYLVMELMDANLCQVIQMELDHERMSYLLYQMLCGIKHLHSAGIIHRDLKPSNIVVKSDCTLKILDFGLARTAGTSFMMTPYVVTRYYRAPEVILGMGYKENVDIWSVGCIMGEMVRHKILFPGRDYIDQWNKVIEQLGTPCPEFMKKLQPTVRNYVENRPKYAGLTFPKLFPDSLFPADSEHNKLKASQARDLLSKMLVIDPAKRISVDDALQHPYINVWYDPAEVEAPPPQIYDKQLDEREHTIEEWKELIYKEVMNSEEKTKNGVVKGQPSPSGAAVNSSESLPPSSSVNDISSMSTDQTLASDTDSSLEASAGPLGCCR (序列編號：7)

本揭示內容所述之JNK3抑制劑是一種能減少標的細胞(例如心肌細胞)內JNK3表現量或活性的藥劑。JNK3是MAPK家族的蛋白激酶，會受不同環境壓力及促發炎細胞激素的調控而活化。JNK3抑制劑可以是能抑制JNK3 基因表現或JNK3蛋白生物活性的核酸、多肽或小分子。舉例來說，抑制劑可以是反義股寡核苷酸或干擾RNA，其係能標的至標的基因或其mRNA之一或多個位置，以阻斷基因轉錄或蛋白轉譯。在某些實施方式中，JNK3抑制劑是小髮夾RNA (small hairpin RNA, shRNA)，能藉由RNA干擾作用而使JNK3 基因靜默。該種shRNA可由18-30個核苷酸(例如20-25個核苷酸)所組成。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指dsRNA導致傳訊RNA (messenger RNA)進行同源序列專一性降解(degradation)的過程。在哺乳動物細胞中，可藉由21個核苷酸雙螺旋(duplexes)之小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)在不活化宿主的干擾素(interferon)反應下來引發RNAi。本揭示內容所述之dsRNA可以是siRNA (包含二個獨立且互補的RNA鏈)或短髮夾RNA (即由RNA鏈形成的緊密髮夾結構)；可依據標的基因的序列來設計此二者。在一實施例中，會標的至JNK3 (例如小鼠JNK3)的shRNA包含CAATAGAGAGATCCAACATAA (序列編號：1)的核苷酸序列。

可將干擾RNA設計為能標的諸如人類、猴子、小鼠及大鼠細胞中一或多種JNK3同型異構物的形式。在某些實施方式中，是將干擾RNA設計為標的一或多種人類JNK3 mRNA同型異構物的形式。本所屬領域習知技藝人士當可理解如何製備及使用能標的至源自任何生物體(包含其天然存在的同型異構物)之JNK3 mRNA的干擾RNA。在某些實施方式中，是將干擾RNA設計為可標的人類JNK3 mRNA的形式。當可理解，基於JNK3同型異構物之核苷酸序列的差異，可將干擾RNA設計為能標的一或多種JNK3之同型異構物的形式。本所屬領域習知技藝人士當可理解製備及使用干擾RNA的方法，該些方法亦包含於本揭示內容之範疇中。例示性之用以製備及使用干擾RNA的方法包含，但不限於以下文獻所述：Moore, C.B., et al., “Short Hairpin RNA (shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown,” Methods Mol Biol., 2010; 629: 141-158 and Naito, Y., et al., “siRNA Design Software for a Target Gene-Specific RNA Interference,” Front Genet., 2012 Jun 11;3:102。

僅為例示性，提供GenBank 之JNK3 mRNA同型異構物gi|969536246|ref|NM_138982.3，在此作為參照。

非必要的，本揭示內容所述之JNK3的寡核苷酸抑制劑(例如反義股核酸、小干擾RNA或微型RNA (microRNA))可包含非天然存在的核鹼基、糖或共價核苷之間的鍵結(骨架)。經修飾後之寡核苷酸可具有特定特性，例如增加細胞的吸收、改善結合至標的核酸的親和性及增加活體內的穩定性。在某些實施例中，本揭示內容所述之JNK3寡核苷酸抑制劑可包含一或多鎖核酸殘基(LNA)。

在一實施例中，寡核苷酸具有經修飾的骨架，包含保留磷原子的骨架(例如可參照美國專利3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676及5,625,050)及不包含磷原子的骨架(例如可參照美國專利5,034,506、5,166,315及5,792,608)。例示性之包含磷的修飾骨架包含，但不限於，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、掌性硫代磷酸酯(chiral phosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯(phosphotriesters)、胺烷基-磷酸三酯(aminoalkyl-phosphotriesters)、甲基及其他烷基磷酸酯(phosphonates，包含3'-亞烷基磷酸酯(3'-alkylene phosphonates)、5'-亞烷基磷酸酯(5'-alkylene phosphonates)及掌性磷酸酯)、次磷酸酯(phosphinates)、胺基磷酸脂(phosphoramidates，包含3'-胺基胺基磷酸脂(3'-amino phosphoramidate)及胺基烷基胺基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidates))、硫羰基胺基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰基烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫羰基烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、磷酸硒(selenophosphates)及具有3'-5'鍵結或2'-5'鍵結的硼磷酸酯(boranophosphates)。骨架亦包含該些具有反向極性的骨架，即3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵結。可以短鏈烷基或環烷基核苷鍵結、混合雜原子及烷基或環烷基核苷鍵結，或一或多短鏈雜原子或雜環核苷鍵結來形成不包含磷原子之修飾骨架。骨架包含該些具有嗎林基鍵結(morpholino linkage，部分由核苷之糖部分形成)之骨架；矽氧烷骨架(siloxane backbones)；硫、亞碸及碸骨架(sulfide, sulfoxide and sulfone backbones)；甲乙醯基及硫代甲乙醯基骨架(formacetyl and thioformacetyl backbones)；亞甲基甲乙醯基及硫代甲乙醯基骨架(methylene formacetyl and thioformacetyl backbones)；核乙醯骨架(riboacetyl backbones)；含烯烴之骨架(alkene containing backbones)；胺基磺酸骨架(sulfamate backbones)；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨架(methyleneimino and methylenehydrazino backbones)；磺酸酯及磺醯胺骨架(sulfonate and sulfonamide backbones)；醯胺骨架(amide backbones)；以及其他具有混合N、O、S及CH₂ 成分的骨架。

在另一實施例中，本揭示內容所述之JNK3寡核苷酸抑制劑可包含一或多可取代的糖部份體(sugar moiety)。該些可取代之糖部份體的2'位置可以包含OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基及O-烷基-O-烷基。在該些基團中，烷基、烯基及炔基可以是可取代或不可取代之C1到C10烷基或C2到C10烯基及炔基。其2'位置亦可包含雜環烷基(heterocycloalkyl)、雜環烷芳基(heterocycloalkaryl)、胺基烷基胺基(aminoalkylamino)、聚烷基胺基(polyalkylamino)、可取代的矽基(substituted silyl)、RNA切割基團(RNA cleaving group)、報導基團(reporter group)、嵌入劑(intercalator)、可改善寡核苷酸之藥物動力特性(pharmacokinetic properties)的基團或可改善寡核苷酸之藥物藥效特性(pharmacodynamic properties)的基團。較佳之可取代的糖部份體包含該些具有2'-甲氧乙氧基(2'-methoxyethoxy)、2'-二甲胺氧乙氧基(2'-dimethylaminooxyethoxy)及2'-二甲胺乙氧乙氧基(2'-dimethylaminoethoxyethoxy)的糖部份體。可參照Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504。

在另一實施例中，本揭示內容所述之JNK3寡核苷酸抑制劑可包含一或多個經修飾之自然核鹼基(即腺嘌呤(adenine)、鳥嘌呤(guanine)、胸腺嘧啶(thymine)、胞嘧啶(cytosine)及尿嘧啶(uracil))。經修飾之核鹼基包含以下所述之核鹼基：美國專利3,687,808, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, CRC Press, 1993。該些核鹼基中，部分核鹼基特別能增加反義股寡核苷酸與其標的核酸的結合親和性。該些包含5-取代之嘧啶(5-substituted pyrimidines)、6-氮雜嘧啶(6-azapyrimidines)以N-2、N-6及O-6取代之嘌啶(purines；例如2-胺基丙基-腺嘌呤(2-aminopropyl-adenine)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)及5-丙炔基胞嘧啶(5-propynylcytosine))。可參照Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278。

在某些實施方式中， JNK3抑制劑可以是一種JNK3中和抗體，其可以是全長的抗體或其抗原結合片段。在本揭示內容中，「抗體」(antibody)一詞包含，但不限於，多株(polyclonal)、單株(monoclonal)、人源化(humanized)、嵌合性(chimeric)、Fab片段、Fv片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、單鏈抗體(single chain antibodies, scFv)、融合蛋白及其他包含抗體之抗原結合位置的合成蛋白。

可利用習知技藝人士熟知之方法、套組及商業性服務來製備抗體。習知技藝人士熟知之用以製備單株抗體的方法包含融合瘤技術及噬菌體呈現技術。其他適用於本揭示內容之抗體包含，舉例來說，下述文獻所述之抗體：Antibodies A Laboratory Manual, Second edition. Edward A. Greenfield. Cold Spring Harbor Laboratory Press (September 30, 2013); Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, Second Edition. Eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser. CRC Press (July 29, 2013); Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology). Patrick Chames. Humana Press (August 21, 2012); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Eds. Vincent Ossipow and Nicolas Fischer. Humana Press (February 12, 2014); and Human Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Michael Steinitz. Humana Press (September 30, 2013))。

可利用標準技術來製備抗體；舉例來說，以適當的多肽或其部分來將動物免疫，或是使用噬菌體呈現抗體庫。若欲製備多株抗體，可利用能產生免疫反應之帶有特定抗原決定位置(epitope；非必要性地，可與另一多肽產生半抗原化(haptenize)反應)的多肽來使特定哺乳動物(例如小鼠、兔子、山羊、馬等)免疫。依據宿主種類的不同，可使用不同的佐劑來增加免疫反應。該佐劑包含，但不限於，弗氏佐劑(Freund's)、礦物凝膠(mineral gel，例如氫氧化鋁)及表面活性物質(surface active substances，例如溶血卵磷脂(lysolecithin)、多聚醇(pluronic polyols)、聚陰離子(polyanions)、胜肽(peptides)、油性乳化劑(oil emulsions)、鍵孔帽貝血藍素(keyhole limpet hemocyanin)及二硝基酚(dinitrophenol))。依據已知流程收集及處理經免疫處理之動物的血清。若包含抗特定抗原決定位置之抗體的血清亦包含抗其他抗原的抗體，則可利用免疫親和層析(immunoaffinity chromatography)或其他習知技藝人士熟知的方法來純化多株抗體。本所屬領域具有通常知識者皆知用以製備及處理多株抗體的技術。

若相較於其他不相關之多肽，抗體可更具親和性地結合至JNK，則稱該抗體可專一地結合至JNK。在某些實施方式中，抗體可結合至 JNK3，且結合親和性為其他不相關多肽的至少5、至少10或至少50倍。在某些實施方式中，抗體可結合至 JNK3，且結合親和性為其他不相關多肽的至少100、至少1,000或至少10,000倍。可利用習知方法(例如表面電漿子共振(surface plasmon resonance)或Biacore^® 系統)來確認二者結合。在某些實施方式中，抗體對KIT的親和性(以解離常數(dissociation constant, K_D )來測量)至少為10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M或10^-11 M。

在某些實施例中，本揭示內容所述之抗-JNK3抗體是全人類抗體。可藉由經改良為可表現特定人類免疫球蛋白的商業化動物(例如小鼠)來製得全人類抗體。亦可使用設計為能生產更特定(例如全人類抗體)或更大量免疫反應的基因轉殖動物來製備人源化或人類抗體。例示式之技術為Amgen, Inc (Fremont, Calif.)之XenoMouse^TM 及Medarex, Inc. (Princeton, N.J.)之HuMAb-Mouse^TM 及TC Mouse^TM 。或者是，可利用噬菌體呈現或酵母菌技術進行重組來製備抗體。例如可參照美國專利號5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; and 6,265,150; and Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455。或者是，可利用噬菌體呈現技術(McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)由源自未免疫化之供體的免疫球蛋白變異蛋白域基因組，於活體外製備人類抗體及抗體片段。

在其他實施例中，抗-JNK3抗體是人源化抗體。人源化抗體是指源自非人類(例如小鼠)之抗體的抗體，其中該源自非人類之抗體可以是特定嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或包含源自非人類免疫球蛋白之最小序列的抗原結合片段。大致上來說，人源化抗體是人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中是以源自非人類物種(例如小鼠、大鼠或兔子)之互補決定區域(complementary determining region, CDR)中具有特定專一性、親和性及能力的殘基(供體抗體)取代源自受體抗體之CDR的殘基。在某些情況下，是以對應之非人類殘基來取代人類免疫球蛋白之Fv骨架區域(Fv framework region, FR)殘基。此外，人源化抗體可包含不是位於受體抗體或插入之CDR或骨架序列內的殘基，其係能增加或最佳化抗體的功效。一般來說，人源化抗體可大致包含全部之至少一及通常二個變異蛋白域，其中全部或幾乎全部之CDR區域可對應於非人類免疫球蛋白之CDR區域，且全部或幾乎全部之FR區域可對應於人類免疫球蛋白共通序列之FR區域。人源化抗體非必要性地亦可包含至少一部分之免疫球蛋白(通常是人類免疫球蛋白)的恒定區域或蛋白域(constant region或domain, Fc)。抗體可具有如WO 99/58572所述之經修飾的Fc區域。其他形式之人源化抗體可具有一或多(一、二、三、四、五、六)相對於原始抗體具有變化性的CDR，該種情況可稱該一或多CDR是「源自」(derived from)原始抗體之一或多CDR。人源化抗體亦可具備親和力成熟(affinity maturation)。可利用習知方法來建構人源化抗體。例如可參照Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)。

在另一實施例中，本揭示內容所述之抗體是嵌合型抗體，其可包含一源自人類抗體的重鏈恒定區域及輕鏈恒定區域。嵌合型抗體是指具有源自第一物種之變異區域或部分變異區域及源自第二物種之恒定區域的抗體。一般來說，在該些嵌合型抗體中，輕鏈及重鏈的變異區域會模擬源自一哺乳動物(例如小鼠、兔子及大鼠等非人類哺乳動物)之抗體的變異區域，而其恒定部分則會與另一哺乳動物(例如人類)之抗體序列同源。在某些實施方式中，可對變異區域及/或恒定區域之胺基酸進行修飾。

本揭示內容所述之JNK抑制劑亦可包含小分子抑制劑，例如JNK3抑制劑XII及SR-3576，以及習知技藝人士熟知的小分子抑制劑。例如可參照Kamenecka et al., J Biol Chem 284, 12853-12861 (2009)。JNK3的活性會受磷酸化調控，其中主要影響JNK3功能的磷酸化位置是Thr221及Tyr223。因此，本揭示內容亦包含能調控磷酸化(例如Thr221及/或Tyr223位置之磷酸化)的抑制劑。其他的例子包含，但不限於SR3576、SP600125 (Cellagen Technology, Abcam)、IQ 3 (Tocris Bioscience)、TCS JNK 5a (Abcam)、AS601245 (Abcam)及IQ-1S (Abcam)。

本揭示內容所述之用以促進心肌細胞增生的組合或基因混合製劑可包含至少二種本揭示內容所述之FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑。在某些實施例中，組合物包含一FoxM1增強子(例如一FoxM1多肽或一用以製備FoxM1多肽的表現載體)及一Id1增強子(例如一Id1多肽或一用以製備Id1多肽的表現載體)。在其他實施例中，組合物包含一FoxM1增強子(例如一FoxM1多肽或一用以製備FoxM1多肽的表現載體)及一JNK3抑制劑(例如能標的JNK3的反義股或shRNA)。在其他實施例中，組合物包含一Id1增強子(例如一Id1多肽或一用以製備Id1多肽的表現載體)及一JNK3抑制劑(例如能標的JNK3的反義股或shRNA)。在一特定實施例中，組合物包含一FoxM1增強子(例如一FoxM1多肽或一用以製備FoxM1多肽的表現載體)、一Id1增強子(例如一Id1多肽或一用以製備Id1多肽的表現載體)及一JNK3抑制劑(例如能標的JNK3的反義股或shRNA)。II. 促進心肌細胞增生

可利用任一種本揭示內容所述之組合來促進心肌細胞於活體外或活體內的增生。

在執行本揭示內容所述之方法時，是將組合中一或多種成分與一藥學上可接受的載體(賦形劑，包含緩衝液)混合，以形成一用以促進心肌細胞增生的藥學組合物。「可接受的」(Acceptable)是指載體須與組合物中的活性成分相容(且較佳是能穩定活性成分)，而不會對治療個體產生不良反應。藥學上可接受的賦形劑(載體)包含本所屬領域熟知的緩衝液。例如可參照Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。在一實施例中，是將組合中的各成分配製為個別的藥學組合物。在另一實施例中，是將組合中一種以上的成分配製為單一組合物。

本發明方法所使用的藥學組合物可包含冷凍乾燥劑型或水溶液形式之藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。在投予的劑量及濃度中，可接受的賦形劑或穩定劑對接受者不具有毒性，且可包含諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸等緩衝液；抗壞血酸(ascorbic acid)及甲硫胺酸(methionine)等抗氧化劑；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、氯化六甲雙銨(hexamethonium chloride)、苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、甲苄索氯銨(benzethonium chloride)、苯酚(phenol)、丁醇或芐醇(butyl or benzyl alcohol)；諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯(methyl or propyl paraben)等對羥基苯甲酸酯(alkyl paraben)；兒茶酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環已醇(cyclohexanol)；3-戊醇(3-pentanol)；間甲酚(m-cresol)；低分子量(約小於10個殘基)多肽；諸如血清白蛋白(serum albumin)、明膠(gelatin)或免疫球蛋白等蛋白；聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)等親水性聚合物；諸如甘胺酸(glycine)、麩醯胺酸(glutamine)、天門冬醯胺酸(asparagine)、組胺酸(histidine)、精胺酸(arginine)或離胺酸(lysine)等胺基酸；單醣(monosaccharides)、雙醣(disaccharides)及包含葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)或聚葡萄糖(dextran)等其他醣類；EDTA等螫合劑；蔗糖(sucrose)、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)或山梨醇(sorbitol)等糖類；鈉等形成鹽類的相對離子；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；及/或諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等非離子表面活化劑(surfactant)。本揭示內容進一步闡述藥學上可接受的賦形劑。

在某些實施例中，本揭示內容所述之藥學組合物包含脂質體，其係包含FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑，且可依據本所屬領域習知方法來製備，例如Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); and U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545。可增加循環時間之脂質體係揭示於美國專利號5,013,556。可利用反相蒸發法(reverse phase evaporation method)及一包含卵磷脂(phosphatidylcholine)、膽固醇(cholesterol)及源自PEG之磷脂醯乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine, PEG-PE)來製備特別有用的脂質體。可使用不同孔徑大小的過濾器來擠壓脂質體以產生具有特定粒徑的脂質體。

亦可將活性成分(例如FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑)包覆於由凝聚技術(coacervation techniques)及界面聚合(interfacial polymerization)等方法製備的微粒膠囊中；舉例來說，分別於膠體藥物傳遞系統(舉例來說脂質體、白蛋白微球、微乳膠、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳膠中的羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)或明膠-微粒膠囊及聚-甲基丙烯酸甲酯(poly-(methylmethacylate))微粒膠囊。該些技術舉例來說可參照Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)。

在其他實施例中，可將本揭示內容所述之藥學組合物製備為緩釋劑型(sustained-release format)。例示式之緩釋製備包含固體疏水性聚合物之半透明基質，其係包含一或多種本揭示內容所述之增強子/抑制劑，且該基質可具有特定的形式，例如膜狀或微粒膠囊。例示式之緩釋基質包含聚酯、水凝膠(舉例來說，聚(2-羥乙基-丙烯酸甲酯(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))或聚乙烯醇(poly(v nylalcohol))、聚乳酸(polylactides) (美國專利號3,773,919)、L-麩胺酸及7乙基-L- 麩胺酸鹽的共聚物(copolymers of L-glutamic acid and 7 ethyl-L-glutamate)、非降解之乙烯 - 乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOT^TM ，由乳酸-乙醇酸共聚物共聚物及利普安(leuprolide acetate)所組成之可注射的微球)、蔗糖乙酸酯異丁酸酯(sucrose acetate isobutyrate)及聚-D-(-)-3-羥丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)。

投予至活體體內之藥學組合物必須為無菌狀態。舉例來說，可利用無菌過濾膜進行過濾來達到無菌目的。治療組合物通常是置於具有無菌存取口的容器中，舉例來說，靜脈內溶液袋或具有可以皮下注射針頭穿刺之塞子的安瓶。

本揭示內容所述之藥學組合物可配製為單位劑量形式，例如片劑(tablet)、丸劑(pills)、膠囊(capsule)、粉末(powder)、顆粒(granules)、溶液(solution)或懸浮液(suspensions)或栓劑(suppositories)，以進行口服、非口服、直腸或吸入投予。

在製備片劑等固體組合物時，是將活性成分與藥學載體(例如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸氫鈣或膠及其他藥學稀釋劑(例如水)等習知片劑成分)混合，以形成固體預劑型組合物，其係包含本發明組合物或其非毒性之藥學上可接受之鹽類的均質混合物。均質預劑型組合物是指活性成分均勻地散佈於組合物中，藉此使組合物能細分為片劑、丸劑及膠囊等相同有效單位劑量。接著可將固體預劑型組合物細分為上述單位劑型，其係包含約0.1到約500毫克之本發明的活性成分。可塗佈新穎組合物之片劑或丸劑或將其與其他物質混合，以製備可長效作用的劑型。舉例來說，片劑或丸劑可包含一內層劑量及一外層劑量成分，後者可形成一外膜包覆前者。可以腸溶衣層(enteric layer)分隔二成分，該腸溶衣層可抵抗胃中的崩解反應，藉以使內部成分完整地通過進入十二指腸或延緩釋放。可使用不同的材料來製備該腸溶衣層或進行塗佈，該些材料包含聚合酸(polymeric acid)及聚合酸與蟲膠(shellac)、鯨蠟醇(cetyl alcohol)及乙酸纖維素(cellulose acetate)等材料形成的混合物。

適當的表面活性劑包含，聚氧乙烯山梨醇酐(polyoxyethylenesorbitan，例如Tween™ 20、40、60、80或85)及其他山梨醇酐(Span.TM. 20、40、60、80或85)等非離子藥劑。具有表面活性劑的組合物通常包含0.05到5%之表面活性劑，且可介於0.1到2.5%之間。當可理解，亦可添加其他成分，舉例來說，若有必要，甘露醇或其他藥學上可接受的載具。

可利用商業化之油脂乳化劑(例如 Intralipid^TM 、Liposyn^TM 、Infonutrol^TM 、Lipofundin^TM 及 Lipiphysan^TM )來製備適當的乳化劑。活性成分可溶於預先混合之乳化劑組合物中，或是溶於油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中；一旦與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合即形成乳化。當可理解，可添加其他的成分，舉例來說，甘油或葡萄糖　，藉以調整乳化劑的張力。適當的乳化劑通常包含最高為20%的油脂，例如介於5到20%之間的油脂。油脂乳化劑的pH值是介於5.5到8.0之間。可將FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑與Intralipid^TM 或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合以製備乳化劑組合物。

為促進有治療需要之個體體內心肌細胞的增生，可透過適當的路徑對該個體(例如人類個體)投予一有效量之一或多種藥學組合物，其係包含任一種本揭示內容所述之組合(例如包含至少二種FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑)；舉例來說，適當的路徑可是靜脈內投予(例如全劑量(bolus)或一段時間的持續注射)、肌肉內(intramuscular)、腹腔內(intraperitoneal)、腦脊髓內(intracerebrospinal)、皮下(subcutaneous)、關節內(intra-articular)、滑液膜內(intrasynovial)、鞘膜內(intrathecal)、口服、吸入或局部投予。可利用液體劑型所使用的商業化霧化器(包含噴射霧化器及超音波霧化器)來進行投予。可直接霧化液體劑型，或是重組後霧化冷凍乾燥粉末。或者是，可藉由氟碳劑型及計量劑量吸入器霧化FoxM1增強子、增強子及/或JNK3抑制劑，或是吸入冷凍乾燥及研磨粉末形式之FoxM1增強子、增強子及/或JNK3抑制劑。

可接受本揭示內容所述方法治療的個體可以是一哺乳動物；較佳是一人類。哺乳動物包含，但不限於，農場動物、運動競賽動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。需要進行治療的人類個體可以是一罹患心臟損傷或退化性疾病的人類病患、一有罹患心臟損傷或退化性疾病之風險的人類病患，或是一疑似罹患心臟損傷或退化性疾病的人類病患。在某些實施例中，人類病患為罹患心肌梗塞、疑似罹患心肌梗塞，或有罹患心肌梗塞風險之風險的個體。可利用常規醫療檢測(例如實驗室檢驗、心臟功能檢驗、心臟切片檢查、CT掃描或超音波)來確認罹患心臟損傷或心臟退化性疾病的個體。疑似罹患心臟損傷或心臟退化性疾病的個體可能具有一或多疾病的病徵。有罹患心臟損傷或心臟退化性疾病之風險的個體可以是一具有一或多該疾病風險因子的個體。

可接受本揭示內容所述之方法治療的個體可以處於任何年齡或發育狀態。在某些實施方式中，個體是一胚胎、一胎兒、一新生個體、一孩童、一青少年或一成熟個體。在本揭示內容中，一「新生個體」(neonate)是指一大於或小於30天的新生個體(例如人類或小鼠)。在本揭示內容中，一「成熟個體」(adult)是指一達到性成熟的個體(例如人類或小鼠)。

在本揭示內容中，「一有效量」(an effective amount)是指各活性藥劑(不論是單獨投予或與一或多種其他活性藥劑共同投予)能對個體產生治療功效的劑量。有效量可隨著欲治療的特定狀況、疾病的嚴重程度、患者的生理條件(如患者年齡、身體狀況、體型、性別及體重)、治療持續時間、目前療法(如果有的話)及特定投予路徑等醫療人員於其專業知識及技能範疇內予以辨斷的相關因素而有所調整。該些因素為本所屬領域習知技藝人士所熟知且不需過度實驗即可了解。通常是投予各成分或其組合的最大劑量，即在健全的醫療判斷下，投予最高的安全劑量。然而，本所屬領域具有通常知識者當可了解，病患可能基於醫藥因素、心理因素或其他因素而使用較低的劑量或耐受劑量。

亦可基於半生期等因素來決定投予劑量。舉例來說，可利用與人類免疫系統相容的多肽(例如人類FoxM1、人類Id1或其功能生片段)來延長多肽的半衰期及防止多肽受到宿主免疫系統的攻擊。通常(非必要)可基於治療及/或抑制及/或改善及/或延緩心臟疾病，來決定及調整療程中的投藥頻率。或者是，可使用FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑之持續釋放的劑型。不同的劑型及儀器皆為本所屬領域習知技藝人士所熟知。

在一實施例中，可依據經驗/實驗結果來決定在接受一或多次FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑之組合治療的個體中，本揭示內容所述之FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的投予劑量。可對個體增加活性藥劑的投予劑量。可檢測心臟受損指標來了解活性藥劑的功效。

一般來說，在投予任一種本揭示內容所述之FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑時，起始候選劑量可以約為每公斤2毫克。在本揭示內容中，依據上述因素的不同，一般每日劑量可約為每公斤0.1微克到每公斤 3微克到每公斤30微克到每公斤300微克到每公斤3毫克到每公斤30毫克到每公斤100毫克或更多。若於數天內或更長時間進行重複投予，依據狀況的不同，可持續進行治療，直到將病徵抑制到特定程度，或是直到產生足夠的治療功效以減緩心臟疾病或其病徵。例示性的劑量療程包含投予每公斤2毫克的起始劑量，接著維持每週約每公斤1毫克之增強子及/或抑制劑的投予劑量，或是維持隔週每公斤1毫克的投予劑量。然而，依據醫療人員預期達到的藥物動力衰退狀態，亦可使用其他療程。舉例來說，可採用一週1-4次的劑量。在某些實施方式中，可使用約為每毫克3 微克到每公斤2毫克(例如約為每毫克3微克、約為每毫克10微克、約為每毫克30微克、約為每毫克100微克、約為每毫克300微克、約為每公斤1毫克及約為每公斤2毫克)的劑量。在某些實施方式中，投予頻率是每週一次、每週二次、每週四次、每週五次、每週六次、每週七次、每週八次、每週九次或每週十次；或是每個月一次、每二個月一次、每三個月一次或更久。可利用習知技術及試驗來檢測治療流程。可隨著時間改變療程(包含使用的活性劑)。

當活性劑是小分子時，可將每公斤病患體重之0.1到300毫克的活性劑分成一到三劑，或如本揭示內容所述。在某些實施方式中，在治療正常體重之成熟個體時，投予劑量約為每公斤0.3到5.00毫克。可依據特定的個體、個體的醫療病史及各藥劑的特性(例如半衰期及其他習知技藝人士熟知的考量因素)來決定特定的劑量療程(即劑量、時間及重複投予)。

在本揭示內容中，FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的適當劑量會隨著特定藥劑(或其組合物)、心臟疾病類型及嚴重程度、活性劑是用於預防或治療目的、先前治療、病患的臨床病史及對拮抗劑的反應、及主治醫師的判斷不同而有所調整。醫療人員通常會投予FoxM1增強子(例如FoxM1多肽)、Id1增強子(例如Id1多肽)及/或JNK3抑制劑(例如對JNK3具有專一性的shRNA)，直至到達可產生特定療效的劑量。活性藥劑可以是持續性或間接性地投予，舉例來說，可依據接受者之生理狀況、投予係為治療或預防之目的及其他醫療人員熟知因素而有所不同。活性藥劑基本上可持續投予預選的一段時間，或是分為連續性地間隔劑量投予，例如於心臟疾病產生之前、同時或之後投予。

在本揭示內容中，「治療」(treating)一詞是指將一組合物(包含本揭示內容所述之包含FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的組合(或稱基因混合製劑))應用或投予至一罹患心臟損傷或心臟退化性疾病、具有損傷/疾病之病徵或有罹患該疾病之風險的個體，以治療、治癒、減緩、改變、改善或影響該疾病、該疾病之病徵或罹患該疾病之風險。

減緩心臟損傷或心臟退化性疾病包含延緩疾病的發生或進程或減緩疾病的嚴重程度。減緩疾病不必然要產生治療結果。在本揭示內容中，「減緩」(delaying)疾病(例如心臟退化性疾病)的發生是指延遲、阻止、延緩、穩定及/或推延疾病的進程。依據病史及/或治療個體的不同，減緩可於不同時間長度內發生。一可「減緩」(delays或alleviates)疾病發生的方法是指相較於未使用該方法，能於特定時間內減少發生疾病之一或多種病徵及/或減少病徵程度的方法。該對比通常是基於臨床研究，其係藉由特定數量之個體來產生具有統計顯著性的結果。

一疾病的「發展」(development)或「進程」(progression)是指初始的表現及/或疾病的確認歷程。可利用習知標準臨床技術來偵測疾病的發生。然而，發生亦指無法偵測的進程。在本揭示內容中，發生或進程是指病徵的生物歷程。「發展」(development)包含出現(occurrence)、再現(recurrence)及開始(onset)。在本揭示內容中，心臟損傷或心臟退化性疾病的「開始」(onset)或出現(occurrence)包含初始的開始及/或再現。

在某些實施方式中，是對有治療需要之個體投予本揭示內容所述之活性劑(例如FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑)，投予的劑量足以增加或減少標的基因產物(FoxM1, Id1, and JNK3)至少20% (例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的表現。

依據治療疾病之類型或疾病位置的不同，可利用醫療領域具有通常知識者熟知的習知方法來對個體投予藥學組合物。亦可由其他習知路徑投予組合物，例如口服、非口服、吸入噴劑、局部、直腸、鼻腔、頰部、陰道或植入物。在本揭示內容中，「非口服」(parenteral)包含皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈內(intraarterial)、滑液膜內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)、鞘膜內(intrathecal)、病灶內(intralesional)及顱內(intracranial)注射或注入技術。此外，可透過可注射儲存路徑(injectable depot route)投予至個體，例如1-、3-或6-個月之儲存可注射或具生物降解性的材料及方法。

可注射的組合物可包含多種載體，例如植物油(vegetable oils)、二甲基乙醯胺(dimethylactamide)、二甲基甲醯胺(dimethyformamide)、乳酸乙酯(ethyl lactate)、碳酸乙酯(ethyl carbonate)、肉豆蘧酸異丙酯(isopropyl myristate)、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)。進行靜脈注射時，可藉由滴注方法(drip method)投予水溶性抗體，藉此注入包含抗體及生理上可接受之賦形劑的藥物劑型。生理上可接受之賦形劑可包含，例如5%右旋葡萄糖(dextrose)、0.9%生理食鹽水、林格氏溶液或其他適合的賦形劑。可將肌肉內製劑(例如增加子/抑制劑之適合可溶性鹽形式的無菌劑型)溶解於藥學賦形劑(例如注射用水、0.9%生理食鹽水或5%葡萄糖溶液)後進行投予。

在一實施方式中，是利用位置專一或標的局部傳遞技術來投予一或多種FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑。例示式之位置專一或標的局部傳遞技術包含活性藥劑之各種可植入式儲存來源、局部傳遞導管(例如注入導管、留置導管或針頭導管)、合成移植物、動脈外膜包覆、分流器及支架或其他可植入的裝置、具有位置專一性的載體、直接注射或直接應用。例如可參照PCT公開號WO 00/53211及美國專利號5,981,568。

亦可標的傳遞包含一反義股寡核苷酸或一表現載體等治療組合物。舉例來說，以下文獻所闡述之由受器所媒介的DNA傳遞技術：Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338。在基因治療流程中，局部投予包含多核苷酸之治療組合物的劑量約為100奈克到200毫克的DNA。在某些實施方式中，在基因治療流程中，使用濃度約為500奈克到約50毫克、約為1微克到約2毫克、約為5微克到約500微克，以及約為20微克到約100微克的DNA或更高量。

可利用基因傳遞載具來傳遞本揭示內容所述之FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑的治療多核苷酸及多肽。基因傳遞載可以是病毒或非病毒來源(通常可參照Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51；Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845；Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185；及Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148)。可藉由內源性哺乳動物或外源性啟動子及/或增強子來誘發該些編碼序列的表現。編碼序列可以持續性或調控性的方式進行表現。

本所屬領域習知技藝人士皆熟知用以傳遞特定多核苷酸且可於特定細胞中進行表現的病毒相關載體。例示式的病毒相關載體包含，但不限於重組反轉錄病毒(例如可參照PCT公開號WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805;美國國專利號5,219,740及4,777,127; 英國專利號 2,200,651; 及歐洲專利號0 345 242)、腺病毒相關載體(例如辛得比斯病毒載體(Sindbis virus vectors)、森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67; ATCC VR-1247)、羅氏河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373; ATCC VR-1246)及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532))、腺病毒載體(adenoal virus vector)及腺病毒相關病毒(adeno-associated virus, AAV)載體(例如可參照PCT公開號WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984及WO 95/00655)。亦可投予與非活性腺病毒連接的DNA，如Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147所述。在某些實施例中，是利用AAV病毒載體來傳遞一或多種FoxM1增強子、Id1增強子或JNK3抑制劑。

亦可使用非病毒傳遞載具及方法，其係包含，但不限於，與非活性腺病毒連接之聚陽離子濃縮DNA (例如可參照Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147)；與配體連接之DNA (例如可參照Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985)；真核細胞傳遞載具細胞(例如可參照美國專利號5,814,482；PCT公開號WO 95/07994；WO 96/17072; WO 95/30763；及WO 97/42338)及核電荷中和或與細胞膜融合。亦可使用裸露的(Naked DNA)。例示式之裸露DNA方法介紹可參照PCT公開號WO 90/11092 and 美國專利號5,580,859。可作為基因傳遞載具的脂質體可參照美國專利號5,422,120; PCT公開號WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；及歐洲專利號0524968。其他方法可參照Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411及Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581。

很明顯地，表現載體可用以表現任一種與蛋白相關之FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑。

在某些實施方式中，可利用任一種本揭示內容所述之FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的組合促進心肌細胞於活體外的增生。可於適當條件下，將源自適當供體或由多潛能或胚胎幹細胞所分化的心肌細胞培養於FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的組合中，藉由增強子/抑制劑組合來誘發心肌細胞的增生。可將增生的心肌細胞投予至有治療需要的個體，例如一罹患心臟損傷、疑似罹患心臟損傷或有罹患心臟損傷之風險的人類個體，藉以治療心臟疾病。在某些實施例中，心肌細胞係為自體心肌細胞，即源自相同人類個體的心肌細胞。在其他實施例中，心肌細胞係為異體心肌細胞，即不同人類個體的心肌細胞。III 用於促進心肌細胞增生的套組

本揭示內容亦提供用於促進心肌細胞增生的套組。該些套組可包含一或多容器，其係包含至少二種FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑。在某些實施方式中，FoxM1增強子是一FoxM1多肽或一用以製備該FoxM1多肽的表現載體。在某些實施方式中，Id1增強子是一Id1多肽或一用以製備該Id1多肽的表現載體。在某些實施方式中，JNK3抑制劑是一對JNK3具有專一性之shRNA。在某些實施方式中，套組包含FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑。

在某些實施方式中，套組可包含依據任一種本揭示內容所述方法而撰述的使用操作說明。使用操作說明可包含依據任一種本揭示內容所述方法來投予FoxM1增強子、Id1增強子及/或JNK3抑制劑的說明，以治療、延緩或減緩心臟損傷或心臟退化性疾病。套組可更包含一用以篩選適於治療之個體的說明，其是基於確認該個體是否患有心臟損傷或心臟退化性疾病來進行篩選。在其他實施方式中，使用操作說明包含對有罹患心臟損傷/疾病之風險的個體投予一或多種活性藥劑的說明。

關於使用FoxM1增強子、Id1增強子及JNK3抑制劑的的使用操作說明，通常包含用以進行特定治療之劑量、投藥流程及投藥路徑的資訊。容器可以是單位劑量、散裝包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。套組隨附的使用操作說明通常是書寫於標籤或包裝內含物(例如套組隨附之書面資料)的書面說明，或是以機器可讀取(例如儲存於磁碟或光碟)的形式提供。

標籤或包裝內含物指出組合物是用以治療、延緩及/或減緩心臟疾病。使用操作說明可提供實施任一種本揭示內容所述之方法。

本揭示內容所述之套組是位於適當的包裝內。適當的包裝包含，但不限於，安瓶(vial)、瓶罐(bottle)、瓶子(jar)及軟包裝(flexible packaging，例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。亦可為與特定裝置(例如噴霧器等吸入或鼻腔給藥裝置)或注入裝置(例如小型泵(minipump))共同使用的包裝。套組可具有一無菌入口(舉例來說，容器可以是一靜脈內溶液袋或一具有可以皮下注射針頭穿刺之塞子的安瓶)。容器亦可具有一無菌入口(舉例來說，容器可以是一靜脈內溶液袋或一具有可以皮下注射針頭穿刺之塞子的安瓶)。

本揭示內容所述之套組可具選擇性地提供其他成分，例如緩衝液或翻譯資訊。正常來說，套組包含一容器及一標籤或包裝內含物(標示於容器上或以容器隨附型式提供)。在某些實施方式中，本揭示內容提供了用以製備本發明套組之內容物的說明。

慣用技術

除非另所有指，否則可於習知技藝人士所熟知之範疇內，利用分子生物學、微生物學、細胞生物學、生化學及免疫學之習知技術(包含重組技術)來實現本發明。下列文獻充分說明了該些技術：例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。

即使沒有進一步的說明，本所屬領域習知技藝人士仍可基於本說明書充分實施本發明。下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例 1: 心臟再生之治療性基因混合製劑

材料及方法

(i) 由新生小鼠的心臟分離心肌細胞及非心肌細胞

由2-或3-天大的C57BL/6小鼠分離並依據以下流程培養心肌細胞及非心肌細胞：(Condorelli, Morisco et al. FASEB J. 16(13):1732-1737; 2002)。簡單來說，在移除心房及主動脈後，切割心臟組織並以每毫升1毫克之胰蛋白酶(Trypsin, Sigma-Aldrich)於4°C分解2小時。加入每毫升0.8毫克的膠原蛋白酶II (Collagenase II, Invitrogen)，於37°C反應15分鐘，以40微米之過濾器過濾以移除細胞碎屑後，收集細胞。

以粒線體染劑-四甲基若丹明甲酯酸銨(methyl ester perchlorate, TMRM, Life Technology)進行染色，利用螢光活化細胞分離器FACS (Hattori, et al., Nat Methods 7(1):61-66; 2010)分析並分離具有最高強度之細胞群，藉以純化心肌細胞。收集較低之TMRM染色細胞群作為對照的非心肌細胞。

(ii) 細胞重整流程

細胞重整實驗是依據先前標準流程修改來進行(Takahashi et al., Cell 126(4):663-676; 2006)。就修改部分簡單來說，將重新種植於餵食細胞(feeder cell)的時間點由第3天延長至第10天。將iPS細胞培養液由原包含10 % KOSR或FBS之DMEM置換為包含15 % FBS之GMEM基礎細胞培養液。

在以去氧羥四環素調控OSKM基因轉殖小鼠的二次細胞重整系統中，於早期細胞重整時，是每天投予每毫升1微克的去氧羥四環素。

(iii) iPS 於活體外的分化

在不包含餵食細胞的環境中，培養經誘發之多潛能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells) 2天，收集細胞後重新懸浮於包含10 % FBS之GMEM基礎細胞培養液(Invitrogen)的分化培養液中。稀釋懸浮細胞，並滴於細胞培養盤蓋上(每滴600個細胞)。懸滴培養3天後，將胚體(embryoid boides)種植於以明膠塗佈之細胞培養盤上，繼續培養7天。以4 %三聚甲醛(paraformaldehyde)固定分化細胞，進行免疫螢光流程。

(iv) 形成畸胎瘤

將約1x10⁶ iPS細胞皮下注射至6到8週大的NOD-scid小鼠，3-4週後可觀察到畸胎瘤。以石蠟固定及包埋腫瘤後，利用蘇木精-曙紅(Hematoxylin-Eosin, Sigma-Aldrich)進行染色。

(v) 轉錄體分析 (Transcriptomic analysis)

依據使用操作說明，將由不同細胞重整時間點收集的檢體與小鼠寡微陣列(Mouse Oligo Microarray, Agilent)進行雜合反應(hybridized)，再以微陣列掃描系統(Microarray Scanner System, Agilent)來掃描陣列。以GeneSpring GX軟體(Agilent)分析所有的數據，並利用DAVID軟體分析基因本體(Gene Ontology analysis)(Huang da, et al., Nat Protoc 4(1):44-57; 2009)。

(vi) 製備及純化重組腺病毒載體

利用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)由C57BL/6小鼠純化之總反轉錄cDNA擴增Foxm1、Id1及Hmgb2 cDNA。將擴增的片段轉殖至pENTR質體中ires-EGFP旁邊的位置。之後依據pAd/PL-DEST Gateway載體套組說明(Invitrogen)，將攜帶該些特定基因的pENTR質體重組至pAd/PL-DEST質體。

依據Luo 等人所述方法，使攜帶該些特定基因的pAd/PL-DEST進行表現，藉以製備具有特定基因及EGFP表現的腺病毒(Luo et al., NT Protoc 2(5):1236-1247)。利用CsCl₂ 梯度離心來濃縮病毒。

(vii) 投予 JNK3 抑制劑 XII, SR-3576

JNK3抑制劑XII, SR-3576 (Millipore)對JNK3具有結合專一性；在活體外試驗中，是對新生小鼠之CM投予1 uM的SR-3576，並反應3小時。

(viii) 對新生及成熟小鼠注射腺病毒載體

依據以下文獻將腺病毒注射至新生小鼠體內：(Christensen et al., Circulation 101(2):178-184; Ebelt et al., Cardiovasc Res. 80(2):219-226; 2008)；將一天大的小鼠置於冰上2分鐘使其麻醉後，以帶有30號針頭的Hamiliton 注射器將病毒注入左胸骨旁之胸腔，接著將小鼠與飼育母鼠共同飼養12天。犠牲小鼠後，收集心臟以進行後續實驗。

在成鼠方面，是將1x10¹¹ 的病毒顆粒注入心臟內。治療時，在心肌梗塞後立即於受損心臟周邊的3個位置注入腺病毒。

(ix) 心肌梗塞

以吸入性異氟醚(isofluorane)麻醉8到10週大的小鼠，對其進行氣管插管後，置於囓齒動物呼吸器上。在移除心包(pericardium)後，以普理靈(prolene)縫線對左前降 (left anterior descending, LAD)冠狀動脈進行永久性接合。接合後立即確認左心室的白化區域，以判斷是否成功產生心肌梗塞。

(x) 心臟超音波

利用配有5.0-13.0 MHz手術探針之Vivid-q超音波(General Electric Company)來分析胸腔二維心臟超音波。藉由胸骨旁短軸切面的M追蹤模式來測量左心室前後壁的厚度及收縮末期與舒張末期之內徑，據以計算出左心室縮短分析(fractional shortening)及射出分率(ejection fraction)。

(xi) 馬森三色染色 (Masson’s trichrome staining)

收集心臟組織，以4%三聚甲醛固定後，進行石蠟包埋。依據標準流程切片後，藉由總左心室區域產生纖維化的百分比來測量梗塞大小。

(xii) 免疫螢光

以4%三聚甲醛固定細胞後，加入溶於阻斷緩衝液(包含5%山羊血清之PBS)的0.3 %氚核X-100 (triton X-100)反應1小時，藉以通透細胞。之後，以一級抗體OCT-4 (Santa Cruz)、SOX-2 (Millipore)、KLF-4 (Abcam)、Nanog (Reprocell)染色細胞，以確認iPS細胞的多功能性；以一級抗體Nestin (R & D)、α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin, Sigma)及α-胎兒蛋白(α-Fetoprotein, R & D)確認iPS細胞的活體外分化狀態；以及利用一級抗體Ki-67 (Genetex)、於組蛋白H3之絲胺酸10進行磷酸化(histone H3 phosphorylated at serine 10, Millipore)、Aurora B激酶(Abcam)進行基因篩選。至於SSEA-1 (Biolegend)染色，則跳過細胞通透步驟。以PBS洗滌3次後，分別加入與Alexa fluor-488或-568 (Life Technology)接合之二級抗體，反應1小時，並以DAPI (Life Technology)染色細胞核5分鐘。

將組織切片脫蠟、再水合後，以煮沸的檸檬酸鈉處理2次，每次5分鐘，藉以修復抗原(antigen-retrieval)。之後，如前述流程對切片進行相同的免疫螢光步驟，並利用與Alexa fluor-488接合之麥芽凝集素(Wheat germ agglutinin, WGA)(Life Technology)染色組織的細胞膜。

進行基因篩選時，是以Ki67及DAPI染色進行色疫螢光步驟，再利用ImageXpress微高量篩選顯微鏡(ImageXpress Micro High content screening microscope, Molecular Devices)拍攝照片。

在評估細胞重整功效方面，是使用AP受質套組、Vector Red受質套組(Vector Laboratories, Burlingame, CA)來確認類iPSC之細胞群數量。以AP⁺ 細胞群數量/慢病毒感染細胞數量來計算細胞重整功效。

(xiii) 即時定量 PCR (Quantitative real-time PCR)

依據SuperScript III反轉錄套組(Life Technology)的流程進行反轉錄。利用SYBR Green Real-Time PCR master混合物來定量各基因的表現，並以GAPDH進行標準化。

(xiv) 統計

利用Prism Gaphpad來分析所有的統計數據，並以平均值±平均值標準差(mean ± standard error of the mean, S.E.M.)來表示。利用未配對(Unpaired)、雙尾Student’s t檢測(two-tailed Student’s t-test)及單向ANOVA (one-way ANOVA)進行統計比對，P＜0.05的數值即視為具有統計差異。

結果

對基因轉殖小鼠投予可受去氧羥四環素誘發之四種Yamanaka因子，並基於不同的細胞形態及微陣列分析來檢測於心肌細胞(cardiomyocyte, CM)於不同時間點之細胞重整。第1A圖。結果指出，於細胞重整第2天可觀察到增加的CM增生。第1B及1C圖。

藉由檢測Ki-67陽性細胞群的百分比來測試本揭示內容所述之由微陣列篩選的基因對新生小鼠之CM增生的影響。抗原Ki-67是一種與細胞增生相關的核蛋白。注射攜帶特定基因的腺病毒載體或投予適當的抑制劑增加或降低特定基因於CM中的表現量。於活體外對新生小鼠之CM投予FoxM1、Id1及Jnk3抑制劑的二重或三重組合；結果顯示，相較於對照組，投予組合會使Ki67或H3P陽性細胞群的百分比增加7倍，意即投予二重或三重組合可顯著地增加CM的生長。第2A-2C圖。

對一天大的新生小鼠投予FoxM1、Id1及Jnk3-shRNA的三重組合。相較於對照組之小鼠，接受治療的小鼠具有較高之心臟對體重的比值及較高的H3P陽性細胞群百分比。第3A及3B圖。該些結果確認在心臟發育時，三重基因混合製劑能有效促進CM的增生。

於心肌梗塞後，將本揭示內容所述之三重基因混合製劑投予至成鼠的心臟周邊區域。基因混合製劑會誘發CM的增生能力，進而改善接受治療之小鼠的心臟功能。以心臟超音波及纖維化試驗進行檢測。

實施例 2 ：特定的基因混合製劑可顯著地提高成鼠體內心肌細胞的增生

材料及方法

(i) 分離成鼠之 心肌細胞

於Langendorff裝置上，由公鼠分離成鼠的心室CM。以肝素處理(heparinization) 10分鐘後，由麻醉的小鼠取出心臟並插管，利用不含鈣離子(Ca2⁺ )之台式溶液(Tyrode solution，每升120.4毫莫耳之NaCl、每升14.7毫莫耳之KCl、每升0.6毫莫耳之KH₂ PO₄ 、每升0.6毫莫耳之Na₂ HPO₄ 、每升1.2毫莫耳之MgSO₄ 、每升1.2毫莫耳之HEPES、每升4.6毫莫耳之NaHCO₃ 、每升30毫莫耳之牛磺酸(Taurine)、每升10毫莫耳之BDM、每升5.5毫莫耳之葡萄糖)進行逆向灌流。灌流3分鐘後，以與不含鈣離子之台式溶液(包含膠原蛋白酶B (每克個體體重0.4毫克，Roche)、膠原蛋白酶D (每克個體體重0.3毫克，Roche)及第XIV型蛋白酶(每克個體體重0.05毫克，Sigma-Aldrich))分解心臟組織。之後，由插管切除心室，於以包含10% FBS之不含鈣離子之台式溶液中和的分解溶液中，將組織切割為細塊。藉由緩和沖洗將成熟鼠CM由分解組織分離出來，以250微米孔徑之尼龍篩網進行過濾，以移除未分解的組織，據以收集成熟鼠CM。

結果

將去氧羥四環素注入OSKM基因轉殖小鼠，2天後分離成鼠的CM，據以確認活體體內之Oct4、FoxM1、Id1及Jnk3表現的改變(第5A圖)。檢測Oct4的過量表現以確認成功將去氧羥四環素注入活體體內(第5B圖)。如預期地，相較於對照組之CM，FoxM1及Id1具有較高的表現量，而Jnk3的表現則會顯著地受到抑制(第5B圖)。此外，在投予去氧羥四環素2天後，可發現成鼠CM具有顯著較多之H3P⁺ 細胞群(2倍)(第5C圖)。

此外，將FIJs直接注射至10週大之小鼠的心臟，以證實FIJs治療可提高成鼠體內CM的增生(第5D圖)。12天後，投予FIJs之小鼠體內的H3P⁺ 細胞群較治療對照組之小鼠體內的H3P⁺ 細胞群高出3.5倍(第5E圖)。該些結果指出，FIJs治療可有效增加成鼠體內CM的增生。

其他實施方式

可將本說明書中公開之所有技術特徵以任何組合進行組合。可使用能產生相同、均等或相似目的的技術特徵來取代在該說明書中公開的技術特徵。因此，除非另外特別指出，本說明書公開之技術特徵僅是一系列均等或類似特點的實施範例。

從上述說明書中，本所屬領域習知技藝人士可以容易地確定本發明的主要特點，並且在不悖離其精神和範圍的情況下，對本發明作出各種改變和改進以將其適應於各種用途和情況。因此，其它的實施方式亦在本發明申請專利的範疇內。

均等

雖然本說明書已經描述了本發明的多個實施方式，但是本所屬領域習知技藝人士很容易預見到用於實現本說明書所述的功能及/或獲得本說明書所述的結果及/或一個或更多個本說明書所述的優點的各種其它手段及/或結構，且所有這樣的變化及/或調整均被認為在本發明的範圍之內。更一般而言，本所屬領域習知技藝人士很容易認識到本說明書所述的所有參數、尺寸、材料和構型均是示例性的並且實際的參數、尺寸、材料和構型取決於採用本發明教導的具體應用。本所屬領域習知技藝人士僅利用常規實驗即可識別或能夠區別本說明書所述之本發明具體實施技術手段的等同技術手段。因此，當可理解，前述實施方式僅為例舉並且在所附申請專利範圍及其等同技術之技術手段的範圍內，本發明可以採取不同於所描述或所要求保護的方式實施。本發明涉及本說明書所述的各個單獨的技術特徵、系統、製品、材料、試劑盒及/或方法。此外，只要這樣的技術特徵、系統、製品、材料、試劑盒及/或方法不相互矛盾，則該些技術特徵、系統、製品、材料、試劑盒及/或方法的組合也包含在本發明的範圍之內。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

除非有明確的相反指示，否則本說明書及申請專利範圍中所述之「一」(one)應理解為「至少一」(at least one)。

在本說明書和申請專利範圍中，當可理解「及/或」(and/or)一詞是指結合元素中的「任一或二者」(either or both)，亦即在某些情況下元素係為共同存在，在其他情況下元素則為分開存在。當多個元素與「及/或」(and/or)共同表述時，應以相同的方式進行解釋，即結合元素中的「一或多個」(one or more)。除了以「及/或」(and/or)子句特定連接的元素外，亦可任選地包含其他元素，而不論其與特定連接的該些元素是否有關聯性。因此，作為非限制性之例示，當與諸如「包含」(comprising)等開放式語言結合使用時，提及「A及/或B」在一實施例中可能僅僅涉及A (可選地包含不同於B的元素)；在另一實施例中可能僅僅涉及B (可選地包含不同於A的元素)；在另一實施例中可能涉及A及B 二者(可選地包含其他元素)等。

當在本文的說明書和申請專利範圍中使用時，「或」(or)應當被理解為具有與上述定義之「及/或」(and/or)相同的含義。例如，當分開列表中的項目時，「或」(or)或「及/或」(and/or)應當被解釋為包含，即包含至少一個，但是也包含若干元素或元素清單中的超過一個元素，以及可任選地附加的未列表項目。除非有相反的明確教示(例如「僅其中之一」(only one of或exactly one of)，或者當用在申請專利範圍中時，「由……組成」(consisting of))僅涉及包含若干元素或元素清單中的單一個元素。通常，當有諸如「任一」(either)、「其中之一」(one of)、「僅其中之一」(only one of或exactly one of)等排他性詞彙置前時，本文中使用的詞彙「或」(or)應當僅解釋為指示排他性可替換項(即「一或另，而非二者」(one or the other but not both))。當在申請專利範圍中使用時，「主要是由……組成」(consisting essentially of)應當具有其在專利法領域中使用的普通含義。

在本說明書和申請專利範圍中，當可理解，若以「至少一」(at least one)連接具有一或多個元素的清單時是指選自該元素清單之元素中任何一個或多個的至少一個元素，但是不必然包含該元素清單中特定列出之各元素中的至少一個，且不排除該元素清單中元素的任何組合。這個定義也允許可任選地存在與「至少一」(at least one)詞彙所涉及之元素清單內特定標識之元素不同的元素，而不論其是否與特定標識之該些元素具有關聯性。因此，作為非限制性例示，「A及B中至少一個」(或者等效地「A或B中至少一個」，或者等效地「A及/或B中至少一個」)在一實施例中可以涉及至少一個A，可任選地包含超過一個A，其中B不存在(並且可任選地包含不同於B的元素)；在另一實施例中涉及至少一個B，可任選地包含超過一個B，其中A不存在(並且可任選地包含不同於A的元素)；在另一實施例中涉及至少一個A，可任選地包含超過一個A，以及至少一個B，可任選地包含超過一個B (並且可任選地包含其他元素)等。

當可理解，除非有相反的明確教示，在本文要求保護的包含超過一個步驟或動作的任何方法中，該方法的步驟或動作的順序不一定限於該方法的步驟或動作被記載的順序。

在申請專利範圍及上述說明書中，所有過渡詞彙(例如「包含」(comprising, including, containing)、「帶有」(carrying)、「具有」(having)、「涉及」(involving)、「持有」(holding)、「由……構成」(composed of)等)都應當被理解為開放式的，即表示包含但不限於。如美國專利局專利審查程式手冊2111.03節中所述，只有過渡詞彙「由……組成」(consisting of)及「主要是由……組成」(consisting essentially of)應當分別為封閉式或者半封閉式的過渡詞彙。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A-1C圖是基於DNA微陣列之基因本體分析結果所繪示之示意圖，其繪示細胞重整第2天時心肌細胞的生長狀態。第1A圖為實驗流程圖。第1B圖為在CM細胞重整過程中，不同時間點的細胞形態。第1C圖為在CM細胞重整過程中，基因本體的分析結果。第2A-2C圖是關於篩選會影響CM增生之基因的圖表。第2A圖繪示出表現量增加的基因。第2B圖繪示出表現量下降的基因。第2C圖為可促進CM增生之理想的FoxM1、Id1及Jnk3的三重組合。第3A-3C圖是關於以本揭示內容所述之三重組合治療活體內心臟發育的結果示意圖。第3A圖為實驗流程圖。第3B圖繪示了較高之心臟對個體體重的比值。第3C圖繪示了較高之Ki-67或H3P陽性細胞群的百分比。第4A-4E圖是關於損傷後本揭示內容所述之三重組合治療對活體內心臟再生影響的示意圖。第4A圖為損傷後CM增生的實驗流程圖。第4B圖繪示了較高之Ki-67或H3P陽性細胞群的百分比。第4C圖繪示了損傷後改善心臟功能的實驗流程圖。第4D圖為利用心臟超音波檢測改善心臟功能的結果。第4E圖為利用纖維化試驗檢測改善心臟功能的結果。第5A-5E圖是關於藉由模擬早期細胞重整來篩選活體內促進成鼠CM增生之基因的示意圖。第5A圖為觀察投予去氧羥四環素(doxycycline)或對照組之成鼠進行細胞重整的時間表。第5B圖繪示了由注射去氧羥四環素而進行細胞重整之OSKM成鼠中分離之CM及對照成鼠CM中，Oct4、FoxM1、Id1或Jnk3的RNA表現比值。第5C圖繪示了在對照組或注射去氧羥四環素之成鼠的心臟組織切片中，H3P⁺ 及cTnI⁺ 細胞群的定量結果。第5D圖為對成鼠投予腺病毒-對照或腺病毒-FIJs後的觀測時間表。第5E 圖繪示了在注射腺病毒-對照或腺病毒-FIJs之小鼠的心臟組織切片中，H3P⁺ 及cTnI⁺ 細胞群的定量結果。結果係以平均質±平均標準差(mean ± SEM)來表現。檢體數量標示於柱狀圖中。*,P ＜ 0.05，以及***,P ＜ 0.001。

＜110＞中央研究院＜120＞用於心臟再生的治療性基因混合製劑＜130＞ A0988.70070WO00 ＜140＞未指定＜141＞同時提交＜150＞ US 62/149,854 ＜151＞ 2015-04-20 ＜160＞ 7 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞合成多核苷酸＜400＞ 1 caatagagag atccaacata a 21 ＜210＞ 2 ＜211＞ 801 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 2 Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu 1 5 10 15 Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro 20 25 30 Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys 35 40 45 Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn 65 70 75 80 Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys 85 90 95 Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser 115 120 125 Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys 130 135 140 Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr 165 170 175 Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser 180 185 190 Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu 195 200 205 Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg 210 215 220 Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser 225 230 235 240 Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg 245 250 255 Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr 260 265 270 Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn 275 280 285 Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys 290 295 300 Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu 305 310 315 320 Asp Gln Val Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu 325 330 335 His Leu Glu Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn 340 345 350 Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys 355 360 365 Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro 370 375 380 Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro 385 390 395 400 Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg 405 410 415 Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Phe Gly Glu Gln Val Val Phe Gly Tyr 420 425 430 Met Ser Lys Phe Phe Ser Gly Asp Leu Arg Asp Phe Gly Thr Pro Ile 435 440 445 Thr Ser Leu Phe Asn Phe Ile Phe Leu Cys Leu Ser Val Leu Leu Ala 450 455 460 Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu 465 470 475 480 Lys Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr 485 490 495 Ile Lys Glu Glu Glu Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala 500 505 510 Arg Pro Ile Lys Val Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro 515 520 525 Ala Pro Ser Phe Lys Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser 530 535 540 Gln Ser Pro Thr Pro Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser 545 550 555 560 Pro Thr Arg Cys Val Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg 565 570 575 Arg Glu Arg Ser Arg Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys 580 585 590 Val Asp Glu Pro Glu Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg 595 600 605 Trp Ala Ala Glu Leu Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser 610 615 620 Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile 625 630 635 640 Lys Glu Thr Leu Pro Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro 645 650 655 Arg Thr Pro Glu Ser Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly 660 665 670 Leu Asp Phe Ser Pro Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu 675 680 685 Pro Asp Pro Leu Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser 690 695 700 Ala Pro Pro Leu Glu Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu 705 710 715 720 Asp Leu Ile Ser Val Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp 725 730 735 Val Pro Lys Pro Gly Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala 740 745 750 Asn Arg Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser 755 760 765 Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp 770 775 780 Pro Leu Gly Pro Asp Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu 785 790 795 800 Gln ＜210＞ 3 ＜211＞ 748 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 3 Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu 1 5 10 15 Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro 20 25 30 Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys 35 40 45 Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn 65 70 75 80 Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys 85 90 95 Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser 115 120 125 Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys 130 135 140 Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr 165 170 175 Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser 180 185 190 Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu 195 200 205 Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg 210 215 220 Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser 225 230 235 240 Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg 245 250 255 Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr 260 265 270 Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn 275 280 285 Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys 290 295 300 Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu 305 310 315 320 Asp Gln Val Phe Lys Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg 325 330 335 Asn Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met 340 345 350 Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe 355 360 365 Pro Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu 370 375 380 Pro Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys 385 390 395 400 Arg Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala 405 410 415 Pro Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly 420 425 430 Glu Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu 435 440 445 Ile Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val 450 455 460 Glu Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys 465 470 475 480 Glu Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro 485 490 495 Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val 500 505 510 Ser Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg 515 520 525 Ser Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu 530 535 540 Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu 545 550 555 560 Pro Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser 565 570 575 Gln Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro 580 585 590 Ile Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser 595 600 605 Trp Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro 610 615 620 Val Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly 625 630 635 640 Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu 645 650 655 Ser Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val 660 665 670 Pro Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly 675 680 685 Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr 690 695 700 Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu 705 710 715 720 Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp 725 730 735 Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln 740 745 ＜210＞ 4 ＜211＞ 763 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 4 Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu 1 5 10 15 Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro 20 25 30 Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys 35 40 45 Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn 65 70 75 80 Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys 85 90 95 Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser 115 120 125 Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys 130 135 140 Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys 145 150 155 160 Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr 165 170 175 Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser 180 185 190 Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu 195 200 205 Asn Cys His Leu Glu Gln Arg Gln Val Lys Val Glu Glu Pro Ser Arg 210 215 220 Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser 225 230 235 240 Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg 245 250 255 Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr 260 265 270 Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn 275 280 285 Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys 290 295 300 Val Ser Phe Trp Thr Ile His Pro Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Thr Leu 305 310 315 320 Asp Gln Val Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu 325 330 335 His Leu Glu Ser Gln Gln Lys Arg Pro Asn Pro Glu Leu Arg Arg Asn 340 345 350 Met Thr Ile Lys Thr Glu Leu Pro Leu Gly Ala Arg Arg Lys Met Lys 355 360 365 Pro Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro 370 375 380 Val Asn Gln Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val Pro Leu Pro 385 390 395 400 Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg 405 410 415 Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro 420 425 430 Leu Ser Ser Ala Gly Pro Gly Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Gly Glu 435 440 445 Gly Phe Ser Pro Leu Leu Pro Val Gln Thr Ile Lys Glu Glu Glu Ile 450 455 460 Gln Pro Gly Glu Glu Met Pro His Leu Ala Arg Pro Ile Lys Val Glu 465 470 475 480 Ser Pro Pro Leu Glu Glu Trp Pro Ser Pro Ala Pro Ser Phe Lys Glu 485 490 495 Glu Ser Ser His Ser Trp Glu Asp Ser Ser Gln Ser Pro Thr Pro Arg 500 505 510 Pro Lys Lys Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Ser Pro Thr Arg Cys Val Ser 515 520 525 Glu Met Leu Val Ile Gln His Arg Glu Arg Arg Glu Arg Ser Arg Ser 530 535 540 Arg Arg Lys Gln His Leu Leu Pro Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Leu 545 550 555 560 Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Ser Arg Trp Ala Ala Glu Leu Pro 565 570 575 Phe Pro Ala Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln 580 585 590 Glu Val Gly Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Lys Glu Thr Leu Pro Ile 595 600 605 Ser Ser Thr Pro Ser Lys Ser Val Leu Pro Arg Thr Pro Glu Ser Trp 610 615 620 Arg Leu Thr Pro Pro Ala Lys Val Gly Gly Leu Asp Phe Ser Pro Val 625 630 635 640 Gln Thr Ser Gln Gly Ala Ser Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Leu 645 650 655 Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu Gln Ser Ala Pro Pro Leu Glu Ser 660 665 670 Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro 675 680 685 Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser 690 695 700 Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu 705 710 715 720 Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu 725 730 735 Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn 740 745 750 Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln 755 760 ＜210＞ 5 ＜211＞ 155 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 5 Met Lys Val Ala Ser Gly Ser Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Pro Ser 1 5 10 15 Cys Ala Leu Lys Ala Gly Lys Thr Ala Ser Gly Ala Gly Glu Val Val 20 25 30 Arg Cys Leu Ser Glu Gln Ser Val Ala Ile Ser Arg Cys Ala Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Glu Gln Gln Val Asn Val 50 55 60 Leu Leu Tyr Asp Met Asn Gly Cys Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Val 65 70 75 80 Pro Thr Leu Pro Gln Asn Arg Lys Val Ser Lys Val Glu Ile Leu Gln 85 90 95 His Val Ile Asp Tyr Ile Arg Asp Leu Gln Leu Glu Leu Asn Ser Glu 100 105 110 Ser Glu Val Gly Thr Pro Gly Gly Arg Gly Leu Pro Val Arg Ala Pro 115 120 125 Leu Ser Thr Leu Asn Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ala Glu Ala Ala 130 135 140 Cys Val Pro Ala Asp Asp Arg Ile Leu Cys Arg 145 150 155 ＜210＞ 6 ＜211＞ 149 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 6 Met Lys Val Ala Ser Gly Ser Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Pro Ser 1 5 10 15 Cys Ala Leu Lys Ala Gly Lys Thr Ala Ser Gly Ala Gly Glu Val Val 20 25 30 Arg Cys Leu Ser Glu Gln Ser Val Ala Ile Ser Arg Cys Ala Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Glu Gln Gln Val Asn Val 50 55 60 Leu Leu Tyr Asp Met Asn Gly Cys Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Val 65 70 75 80 Pro Thr Leu Pro Gln Asn Arg Lys Val Ser Lys Val Glu Ile Leu Gln 85 90 95 His Val Ile Asp Tyr Ile Arg Asp Leu Gln Leu Glu Leu Asn Ser Glu 100 105 110 Ser Glu Val Gly Thr Pro Gly Gly Arg Gly Leu Pro Val Arg Ala Pro 115 120 125 Leu Ser Thr Leu Asn Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ala Glu Val Arg 130 135 140 Ser Arg Ser Asp His 145 ＜210＞ 7 ＜211＞ 464 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 7 Met Ser Leu His Phe Leu Tyr Tyr Cys Ser Glu Pro Thr Leu Asp Val 1 5 10 15 Lys Ile Ala Phe Cys Gln Gly Phe Asp Lys Gln Val Asp Val Ser Tyr 20 25 30 Ile Ala Lys His Tyr Asn Met Ser Lys Ser Lys Val Asp Asn Gln Phe 35 40 45 Tyr Ser Val Glu Val Gly Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr 50 55 60 Gln Asn Leu Lys Pro Ile Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala 65 70 75 80 Ala Tyr Asp Ala Val Leu Asp Arg Asn Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser 85 90 95 Arg Pro Phe Gln Asn Gln Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Leu 100 105 110 Val Leu Met Lys Cys Val Asn His Lys Asn Ile Ile Ser Leu Leu Asn 115 120 125 Val Phe Thr Pro Gln Lys Thr Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val Tyr Leu 130 135 140 Val Met Glu Leu Met Asp Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Glu 145 150 155 160 Leu Asp His Glu Arg Met Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly 165 170 175 Ile Lys His Leu His Ser Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro 180 185 190 Ser Asn Ile Val Val Lys Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe 195 200 205 Gly Leu Ala Arg Thr Ala Gly Thr Ser Phe Met Met Thr Pro Tyr Val 210 215 220 Val Thr Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Glu Asn Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met 245 250 255 Val Arg His Lys Ile Leu Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Asp Gln Trp 260 265 270 Asn Lys Val Ile Glu Gln Leu Gly Thr Pro Cys Pro Glu Phe Met Lys 275 280 285 Lys Leu Gln Pro Thr Val Arg Asn Tyr Val Glu Asn Arg Pro Lys Tyr 290 295 300 Ala Gly Leu Thr Phe Pro Lys Leu Phe Pro Asp Ser Leu Phe Pro Ala 305 310 315 320 Asp Ser Glu His Asn Lys Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu 325 330 335 Ser Lys Met Leu Val Ile Asp Pro Ala Lys Arg Ile Ser Val Asp Asp 340 345 350 Ala Leu Gln His Pro Tyr Ile Asn Val Trp Tyr Asp Pro Ala Glu Val 355 360 365 Glu Ala Pro Pro Pro Gln Ile Tyr Asp Lys Gln Leu Asp Glu Arg Glu 370 375 380 His Thr Ile Glu Glu Trp Lys Glu Leu Ile Tyr Lys Glu Val Met Asn 385 390 395 400 Ser Glu Glu Lys Thr Lys Asn Gly Val Val Lys Gly Gln Pro Ser Pro 405 410 415 Ser Gly Ala Ala Val Asn Ser Ser Glu Ser Leu Pro Pro Ser Ser Ser 420 425 430 Val Asn Asp Ile Ser Ser Met Ser Thr Asp Gln Thr Leu Ala Ser Asp 435 440 445 Thr Asp Ser Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly Pro Leu Gly Cys Cys Arg 450 455 460

Claims

一種組合物的用途，其可用以製備一藥物以促進一個體之心臟再生，其中該組合物包含至少二種以下成分：(i)一FoxM1增強子，(ii)一Id1增強子，以及(iii)一JNK3抑制劑。
如請求項1所述之用途，其中該FoxM1增強子是一FoxM1多肽或一用以製備該FoxM1多肽的表現載體。
如請求項1所述之用途，其中該Id1增強子是一Id1多肽或一用以製備該Id1多肽的表現載體。
如請求項1所述之用途，其中該JNK3抑制劑是一對JNK3具有專一性之shRNA。
如請求項1所述之用途，其中該組合物包含(i)-(iii)的所有成分。
如請求項1-5所述之任一種用途，其中該藥物包含一或多用以製備該FoxM1多肽、該Id1多肽及該對JNK3具有專一性之shRNA的表現載體。
如請求項6所述之用途，其中該一或多表現載體是病毒載體或非病毒載體。
如請求項7所述之用途，其中該病毒載體是腺病毒載體或腺病毒相關病毒載體。
如請求項1所述之用途，其中該個體是一罹患心肌梗塞、疑似罹患心肌梗塞或有罹患心肌梗塞之風險的人類病患。
如請求項9所述之用途，其中是將該組合物投予至一發生或疑似發生心臟退化性疾病的位置。
如請求項1所述之用途，其中該個體是一新生個體。
如請求項1所述之用途，其中該個體是一成熟個體。
一種用以促進心臟再生的套組，包含至少二種以下成分：(i)一FoxM1增強子，(ii)一Id1增強子，以及 (iii)一JNK3抑制劑。
如請求項13所述之套組，其中該套組包含(i)-(iii)的所有成分。
如請求項13所述之套組，其中該FoxM1增強子是一FoxM1多肽或一用以製備該FoxM1多肽的表現載體。
如請求項13所述之套組，其中該Id1增強子是一Id1多肽或一用以製備該Id1多肽的表現載體。
如請求項13所述之套組，其中該JNK3抑制劑是一對JNK3具有專一性之shRNA。
如請求項13-17所述之任一種套組，其中該套組包含用以製備該FoxM1多肽、該Id1多肽及/或該對JNK3具有專一性之shRNA的表現載體。
如請求項18所述之套組，其中該表現載體是病毒載體或非病毒載體。
如請求項19所述之套組，其中該病毒載體是腺病毒載體或腺病毒相關病毒載體。
如請求項13所述之套組，其中該套組更包含使用操作說明，據以對一個體投予該FoxM1增強子、該Id1增強子及該JNK3抑制劑以促進心臟再生。
一種用以促進心肌細胞增生及分化的方法，包含將心肌細胞與至少二種以下成分共同培養：(i)一FoxM1增強子，(ii)一Id1增強子，以及(iii)一JNK3抑制劑。
如請求項22所述之方法，其中是將該心肌細胞與(i)-(iii)的所有成分共同培養。
如請求項22所述之方法，其中該FoxM1增強子是一FoxM1多肽或一用以製備該FoxM1多肽的表現載體。
如請求項22所述之方法，其中該Id1增強子是一Id1多肽或一用以製備該Id1多肽的表現載體。
如請求項22所述之方法，其中該JNK3 抑制劑是一對JNK3具有專一性之shRNA。
如請求項22所述之方法，其中經培養的心肌細胞可用以製備一藥物以治療一個體之心臟疾病。
如請求項27所述之方法，其中該個體是一罹患心臟退化性疾病、疑似罹患心臟退化性疾病或有罹患心臟退化性疾病之風險的人類病患。
如請求項27所述之方法，其中該個體是一新生個體。
如請求項27所述之方法，其中該個體是一成熟個體。
如請求項27所述之方法，其中該心肌細胞是自體的心肌細胞。
如請求項27所述之方法，其中該心肌細胞是異體的心肌細胞。