CN107847557B - 用于心脏再生的治疗性基因混合制剂 - Google Patents

Abstract

本揭示内容是关于一种选自FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的活性药剂组合物，以及该活性药剂组合物于促进一有治疗需要的个体的心肌细胞增生及治疗一有治疗需要的个体的心脏疾病的用途。

Description

用于心脏再生的治疗性基因混合制剂

本申请案依据35U.S.C.§119(e)主张于2015年4月20日提出的“A THERAPEUTICGENE COCKTAIL FOR HEART REGENERATION”美国临时申请案号62/149,854的优先权，其全文一并纳入以供参照。

背景技术

由于哺乳动物的成熟个体的心肌细胞(cardiomyocyte,CM)增生能力较差，因此心脏再生一直是此领域长期存在的挑战。CM于出生一周内会进行最后一次的DNA合成及有丝分裂，变为双核细胞后即不再进入细胞周期。虽然心脏受损后，残存的CM仍具有些许程度的增生能力，然而其增生效率极低(Naqvi et al.,Cell 157(4):795-807；2014)。

已知体细胞能被重整(reprogrammed)而回复到与具有高增生能力的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)相似的多潜能细胞(pluripotent cell)状态(Takahashi etal.,Cell126(4):663-676；2006)。该些重整后的细胞一般称为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell或iPSC)。相关领域亦已证实CM具有细胞重整的潜能。(Xu et al.,Cell Res.22(1):142-154)。此外，目前仍不了解不同时间点中CM重新进入细胞周期的详细机制或功能。

发明内容

本揭示内容是基于发明人意外地发现心肌细胞进行细胞重整的关键时间点，以及包含FoxM1、Id1及JNK3的基因组对于心肌细胞生长具有重要的影响。意外地，本揭示内容所述的基因组的增强子或抑制剂不仅可成功促进新生个体的心脏受损区域中心肌细胞的增生，亦能成功地促进成熟个体的心脏受损区域中心肌细胞的增生。具体来说，包含至少二种选自FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的组合物，可成功达到此功效。

据此，本揭示内容提供了一种用以促进心脏再生或心脏细胞增生的方法；该方法包含对一有需要的个体投予一有效量的组合物，其中该组合物包含至少二种以下成分：(i)FoxM1增强子、(ii)Id1增强子及(iii)JNK3抑制剂。组合物可包含(i)及(ii)、(i)及(iii)、(ii)及(iii)。在某些实施例中，组合物可包含(i)–(iii)的所有成分。

在某些实施方式中，FoxM1增强子是一FoxM1多肽或一用以制备该FoxM1多肽的表达载体。在某些实施方式中，Id1增强子是一Id1多肽或一用以制备该Id1多肽的表达载体。或者是JNK3抑制剂是一对JNK3具有专一性的shRNA。

在任一种本揭示内容所述的方法中，投予步骤是指将一或多种用以制备FoxM1多肽、Id1多肽及对JNK3具有专一性的shRNA的表达载体传递至个体。在某些实施方式中，一或多种表达载体是病毒载体(例如腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体)或非病毒载体。

能接受本揭示内容所述方法治疗的个体可以是一罹患心肌梗塞、疑似罹患心肌梗塞或有罹患心肌梗塞的风险的人类病患。在某些实施例中，是将该组合物投予至一发生或疑似发生心脏退化性疾病的位置。在某些实施例中，该个体是一新生个体。在某些实施例中，该个体是一成熟个体。

在另一方面，本揭示内容提供了一种用以促进心脏再生的试剂盒，该试剂盒包含至少二种以下成分：(i)本揭示内容所述的FoxM1增强子；(ii)本揭示内容所述的Id1增强子；以及(iii)本揭示内容所述的JNK3抑制剂。试剂盒可以包含(i)到(iii)的任何组合；举例来说，(i)–(iii)所有成分。在某些实施例中，试剂盒包含用以制备FoxM1多肽、Id1多肽及/或对JNK3具有专一性的shRNA的表达载体。表达载体可以是病毒载体(例如腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体)或非病毒载体。

在任一种本揭示内容所述的试剂盒中，试剂盒可更包含使用操作说明，据以对一个体投予该FoxM1增强子、该Id1增强子及该JNK3抑制剂以促进心脏再生或心脏细胞增生。

在再另一方面，本揭示内容是关于一种用以促进心肌细胞增生及分化的方法；该方法包含将心肌细胞与至少二种以下成分共同培养：(i)FoxM1增强子；(ii)Id1增强子；以及(iii)JNK3抑制剂。该方法可更包含将培养的心肌细胞传递至一有需要的个体。本发明方法可使用任一种本揭示内容所述的FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂。在某些实施方式中，是将心肌细胞与(i)–(iii)的所有成分共同培养。

能接受本揭示内容所述方法治疗的个体可以是一罹患心脏退化性疾病、疑似罹患心脏退化性疾病或有罹患心脏退化性疾病的风险的人类病患。在某些实施方式中，心肌细胞是自体的(autologous)心肌细胞。在其他实施方式中，心肌细胞是异体的(allogenic)心肌细胞。在某些实施方式中，个体是一新生个体。在某些实施方式中，个体是一成熟个体。

本揭示内容的范围亦包含一种用以促进心脏再生或心脏细胞增生的药学组合物；该组合物包含一包含至少以下二种成分的组合：(i)FoxM1增强子、(ii)Id1增强子及(iii)JNK3抑制剂；以及一药学上可接受的载体。或者是，药学组合物包含与组合共同培养的心肌细胞。本揭示内容更提供了任一种FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂的组合，或是与该组合共同培养的心肌细胞，藉以制备一用以促进心脏再生的药物。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

图1A-1C是基于DNA微数组的基因本体分析结果所绘示的示意图，其绘示细胞重整第2天时心肌细胞的生长状态。图1A为实验流程图。图1B为在CM细胞重整过程中，不同时间点的细胞形态。图1C为在CM细胞重整过程中，基因本体的分析结果。

图2A-2C是关于筛选会影响CM增生的基因的图表。图2A绘示出表达量增加的基因。图2B绘示出表达量下降的基因。图2C为可促进CM增生的理想的FoxM1、Id1及Jnk3的三重组合。

图3A-3C是关于以本揭示内容所述的三重组合治疗活体内心脏发育的结果示意图。图3A为实验流程图。图3B绘示了较高的心脏对个体体重的比值。图3C绘示了较高的Ki-67或H3P阳性细胞群的百分比。

图4A-4E是关于损伤后本揭示内容所述的三重组合治疗对活体内心脏再生影响的示意图。图4A为损伤后CM增生的实验流程图。图4B绘示了较高的Ki-67或H3P阳性细胞群的百分比。图4C绘示了损伤后改善心脏功能的实验流程图。图4D为利用心脏超音波检测改善心脏功能的结果。图4E为利用纤维化试验检测改善心脏功能的结果。

图5A-5E是关于藉由模拟早期细胞重整来筛选活体内促进成鼠CM增生的基因的示意图。图5A为观察投予脱氧羟四环素(doxycycline)或对照组的成鼠进行细胞重整的时间表。图5B绘示了由注射脱氧羟四环素而进行细胞重整的OSKM成鼠中分离的CM及对照成鼠CM中，Oct4、FoxM1、Id1或Jnk3的RNA表达比值。图5C绘示了在对照组或注射脱氧羟四环素的成鼠的心脏组织切片中，H3P⁺及cTnI⁺细胞群的定量结果。图5D为对成鼠投予腺病毒-对照或腺病毒-FIJs后的观测时间表。图5E绘示了在注射腺病毒-对照或腺病毒-FIJs的小鼠的心脏组织切片中，H3P⁺及cTnI⁺细胞群的定量结果。结果以平均质±平均标准偏差(mean±SEM)来表达。检体数量标示于柱状图中。*,P<0.05，以及***,P<0.001。

具体实施方式

本揭示内容部分是基于在细胞重整第2天确认CM增生的特定时间点，以及确认FoxM1、Id1及/或JNK3基因可调控CM增生。意外地，包含FoxM1、Id1及Jnk3-shRNA(一种JNK3抑制剂)的二重或三重组合的基因混合制剂可有效增加活体外及新生与成熟小鼠体内的CM的增生。本揭示内容亦揭示在损伤后，FoxM1、Id1及Jnk3-shRNA的三重组合可有效促进活体内心脏发育及再生。

因此，本揭示内容是关于利用至少二种以下成分的组合来促进CM细胞增生(活体内或活体外)的方法：(i)FoxM1增强子、(ii)Id1增强子及(iii)JNK3抑制剂。

I.FoxM1、Id1及JNK3增强子或抑制剂

本揭示内容的一个方面是关于至少二种以下成分的组合：(i)FoxM1增强子、(ii)Id1增强子及(iii)JNK3抑制剂。

在本揭示内容中，一特定基因/蛋白的增强子是指任何能于标的细胞(例如一心肌细胞)中增加由该基因编码而成的蛋白产物(基因产物)的表达量或活性的药剂(agent)。基因的增强子可以是一种核酸(例如一表达载体)；当将该核酸转殖至标的细胞后，其可产生由该基因编码的蛋白。增强子亦可以是基因产物的多肽，其与基因产物(例如全长基因产物、其功能性片段或包含基因产物的功能性片段的融合蛋白)具有相同的生物活性。在其他实施例中，增强子可以是一种能活化基因表达或改善基因产物的生物活性的药剂(例如一核酸、一多肽或一小分子)。在某些实施方式中，相较于缺乏增强子的情况，增强子可改善基因产物的活性，且改善幅度至少为10％、20％、50％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或1,000倍。

在本揭示内容中，一特定基因/蛋白的抑制剂是指任何能于标的细胞(例如一心肌细胞)中减少由该基因编码产生的蛋白产物的表达量或活性的药剂。基因的抑制剂可以是一种能抑制基因表达或基因产物活性的核酸、多肽或小分子。举例来说，抑制剂可以是反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)或干扰RNA(interfering RNA)，其能标的至标的基因或其mRNA的一或多个位置，藉以阻断基因转录或蛋白翻译。在某些实施方式中，相较于缺乏抑制剂的情况，抑制剂可抑制基因产物的活性，且抑制幅度至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少为95％。可利用公知方法来制备可专一结合至标的mRNA而不会与其他多核苷酸(polynucleotide)交互反应的反义股寡核苷酸分子。例示性的标的位置包含，但不限于，起始密码子(initiation codon)、5’调控区域(5’regulatoryregion)、编码序列(coding sequence)及3’未翻译区域(3’untranslated region)。寡核苷酸抑制剂(包含反义寡核苷酸及诸如shRNA等干扰RNA)的长度约为10到100个核苷酸、约为15到50个核苷酸、约为18到25个核苷酸，或更多个核苷酸。寡核苷酸可包含骨架的修饰，例如所属领域所熟知的硫代磷酸酯键结(phosphorothioate linkage)及2’-O糖饰(2’-Osugar modification)等。在某些情况下，寡核苷酸可包含一或多锁核酸(locked nucleicacid,LNA)。在其他实施例中，抑制剂可以是能中和标的蛋白活性的抗体(例如全长抗体或其抗原结合片段)。

(i)FoxM1增强子

本揭示内容所述的FoxM1增强子是一种能增加标的细胞(例如心肌细胞)中FoxM1表达量或活性的药剂。FoxM1(Forkhead box M1)是FOX转录因子家族中的一员。FOXM1基因(例如基因编号：2305；基因体对照序列：NG_029590.1)可编码出人类蛋白(例如NP_973732.1)。FoxM1具有三种同型异构物：同型异构物A、同型异构物B及同型异构物C；本揭示内容范畴包含三种同型异构物。在某些实施方式中，本揭示内容所述的FoxM1增强子为FoxM1多肽，其是与FoxM1具有相同生物活性的蛋白。FoxM1多肽可以是全长的FoxM1蛋白、其功能性片段或包含FoxM1功能性片段的融合蛋白。FoxM1包含3段功能性蛋白域(domain)，包含N端自我抑制蛋白域(N-terminal auto-inhibitory domain)、叉型头家族DNA结合蛋白域(fork-head family DNA-binding domain)及C端转活化蛋白域(C-terminaltransactivation domain)。周期素A(cyclin A)会调控N端自我抑制蛋白域(第1-232个残基)，据以在细胞周期的G2/M时期将FoxM1转换为活化形式。N端蛋白域会靶向结合至位于FoxM1的C端蛋白域的LXL片段(第641-748个残基)，以进行自我抑制反应(Laoukili etal.,2008；Park et al.,2008)。在去除2个片段后，残存的FoxM1片段会持续活化于整个细胞周期中。在某些实施例中，FoxM1的功能性片段包含FoxM1的第232-641个残基。

在某些实施方式中，FoxM1多肽是一源自适当来源(例如人类、猴子、小鼠或大鼠)的天然存在的FoxM1多肽。举例来说，FoxM1多肽可以是源自人类或小鼠(例如C57BL/6小鼠)的FoxM1多肽。当可想见，FoxM1多肽可以是FoxM1的同型异构物(例如天然存在的FoxM1同型异构物)。举例来说，FoxM1可以是人类FoxM1的同型异构物A、同型异构物B或同型异构物C。本揭示内容亦包含本所属领域熟知的其他FoxM1同型异构物。在某些实施方式中，FoxM1多肽包含SEQ ID NO：2-4的任一氨基酸序列，或本所属领域熟知及/或本揭示内容(例如SEQID NO：2-4中以粗写体标记的片段)所述的功能性片段。

FoxM1A(gi|42544167|ref|NP_973731.1|叉型头框蛋白M1同型异构物1[智人])：

MKTSPRRPLILKRRRLPLPVQNAPSETSEEEPKRSPAQQESNQAEASKEVAESNSCKFPAGIKIINHPTMPNTQVVAIPNNANIHSIITALTAKGKESGSSGPNKFILISCGGAPTQPPGLRPQTQTSYDAKRTEVTLETLGPKPAARDVNLPRPPGALCEQKRETCADGEAAGCTINNSLSNIQWLRKMSSDGLGSRSIKQEMEEKENCHLEQRQVKVEEPSRPSASWQNSVSERPPYSYMAMIQFAINSTERKRMTLKDIYTWIEDHFPYFKHIAKPGWKNSIRHNLSLHDMFVRETSANGKVSFWTIHPSANRYLTLDQVFKPLDPGSPQLPEHLESQQKRPNPELRRNMTIKTELPLGARRKMKPLLPRVSSYLVPIQFPVNQSLVLQPSVKVPLPLAASLMSSELARHSKRVRIAPKVFGEQVVFGYMSKFFSGDLRDFGTPITSLFNFIFLCLSVLLAEEGIAPLSSAGPGKEEKLLFGEGFSPLLPVQTIKEEEIQPGEEMPHLARPIKVESPPLEEWPSPAPSFKEESSHSWEDSSQSPTPRPKKSYSGLRSPTRCVSEMLVIQHRERRERSRSRRKQHLLPPCVDEPELLFSEGPSTSRWAAELPFPADSSDPASQLSYSQEVGGPFKTPIKETLPISSTPSKSVLPRTPESWRLTPPAKVGGLDFSPVQTSQGASDPLPDPLGLMDLSTTPLQSAPPLESPQRLLSSEPLDLISVPFGNSSPSDIDVPKPGSPEPQVSGLAANRSLTEGLVLDTMNDSLSKILLDISFPGLDEDPLGPDNINWSQFIPELQ(SEQ ID NO：2)

FOXM1B(gi|42544161|ref|NP_973732.1|叉型头框蛋白M1同型异构物3[智人])：

MKTSPRRPLILKRRRLPLPVQNAPSETSEEEPKRSPAQQESNQAEASKEVAESNSCKFPAGIKIINHPTMPNTQVVAIPNNANIHSIITALTAKGKESGSSGPNKFILISCGGAPTQPPGLRPQTQTSYDAKRTEVTLETLGPKPAARDVNLPRPPGALCEQKRETCADGEAAGCTINNSLSNIQWLRKMSSDGLGSRSIKQEMEEKENCHLEQRQVKVEEPSRPSASWQNSVSERPPYSYMAMIQFAINSTERKRMTLKDIYTWIEDHFPYFKHIAKPGWKNSIRHNLSLHDMFVRETSANGKVSFWTIHPSANRYLTLDQVFKQQKRPNPELRRNMTIKTELPLGARRKMKPLLPRVSSYLVPIQFPVNQSLVLQPSVKVPLPLAASLMSSELARHSKRVRIAPKVLLAEEGIAPLSSAGPGKEEKLLFGEGFSPLLPVQTIKEEEIQPGEEMPHLARPIKVESPPLEEWPSPAPSFKEESSHSWEDSSQSPTPRPKKSYSGLRSPTRCVSEMLVIQHRERRERSRSRRKQHLLPPCVDEPELLFSEGPSTSRWAAELPFPADSSDPASQLSYSQEVGGPFKTPIKETLPISSTPSKSVLPRTPESWRLTPPAKVGGLDFSPVQTSQGASDPLPDPLGLMDLSTTPLQSAPPLESPQRLLSSEPLDLISVPFGNSSPSDIDVPKPGSPEPQVSGLAANRSLTEGLVLDTMNDSLSKILLDISFPGLDEDPLGPDNINWSQFIPELQ(SEQID NO：3)

FOXM1C(gi|42544165|ref|NP_068772.2|叉型头框蛋白M1同型异构物2[智人])：

MKTSPRRPLILKRRRLPLPVQNAPSETSEEEPKRSPAQQESNQAEASKEVAESNSCKFPAGIKIINHPTMPNTQVVAIPNNANIHSIITALTAKGKESGSSGPNKFILISCGGAPTQPPGLRPQTQTSYDAKRTEVTLETLGPKPAARDVNLPRPPGALCEQKRETCADGEAAGCTINNSLSNIQWLRKMSSDGLGSRSIKQEMEEKENCHLEQRQVKVEEPSRPSASWQNSVSERPPYSYMAMIQFAINSTERKRMTLKDIYTWIEDHFPYFKHIAKPGWKNSIRHNLSLHDMFVRETSANGKVSFWTIHPSANRYLTLDQVFKPLDPGSPQLPEHLESQQKRPNPELRRNMTIKTELPLGARRKMKPLLPRVSSYLVPIQFPVNQSLVLQPSVKVPLPLAASLMSSELARHSKRVRIAPKVLLAEEGIAPLSSAGPGKEEKLLFGEGFSPLLPVQTIKEEEIQPGEEMPHLARPIKVESPPLEEWPSPAPSFKEESSHSWEDSSQSPTPRPKKSYSGLRSPTRCVSEMLVIQHRERRERSRSRRKQHLLPPCVDEPELLFSEGPSTSRWAAELPFPADSSDPASQLSYSQEVGGPFKTPIKETLPISSTPSKSVLPRTPESWRLTPPAKVGGLDFSPVQTSQGASDPLPDPLGLMDLSTTPLQSAPPLESPQRLLSSEPLDLISVPFGNSSPSDIDVPKPGSPEPQVSGLAANRSLTEGLVLDTMNDSLSKILLDISFPGLDEDPLGPDNINWSQFIPELQ(SEQ ID NO：4)

以粗写体标记的片段是指FoxM1持续活化的形式。其他的人类FOXM1B同型异构物包含NP_001230017.1及NP_001230018.1。

本揭示内容亦包含FoxM1多肽的变异体(variant)，例如任何与一源自生物体(例如人类、猴子、小鼠或大鼠)的FoxM1多肽不同，却与该FoxM1多肽具有同源性且与其天然存在的对应物具有相似的生物活性的多肽。在本揭示内容中，「同源」(homologous)一词是指核酸或多肽之间整体的关联性。在某些实施方式中，若序列间至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同，则称该多肽与另一多肽为「同源」(homologous)。「同源」(homologous)一词是指至少二序列(例如氨基酸序列)之间的比对。在某些实施方式中，FoxM1多肽包含一氨基酸序列，其至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相似于SEQ ID NO：2-4的任一氨基酸序列。

可以最佳比对方式来比对二序列，据以计算二序列(例如多肽序列)间的相似度百分比；例如可于第一及第二核酸序列的其中一条或二条插入间隔序列(gap)，以及忽略非相同的序列以进行最佳比对。在某些实施方式中，进行比对的序列长度是参照序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。之后比对位于对应多肽位置的氨基酸。当第一序列中一位置的氨基酸是与第二序列中对应位置的氨基酸相同时，则该些分子的该位置是相同的。二序列间的相似度百分比是序列相同位置的函数，其中若于二序列内插入间隔序列以进行最佳比对时，须将插入间隔序列的数量及各间隔序列的长度列入考虑。可利用数学算法来比对序列并检测二序列间的相似度百分比。举例来说，可利用以下方法来检测二序列间的相似度百分比：ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991。可将用以检测相似度的技术编码至公开使用的计算机程序中。例示性的用以检测二序列同源性的计算机软件包含，但不限于BLASTP、ClustalW、Clustal Omega及Base-By-Base。

在某些实施方式中，FoxM1多肽是一源自生物体(例如人类、猴子、小鼠或大鼠)的FoxM1多肽的功能性片段或其同源性多肽。在本揭示内容中，「FoxM1功能性片段」(FoxM1functional fragment)是指FoxM1多肽的一部分，或是与FoxM1多肽具有同源性且与对应FoxM1多肽具有相似生物功能的蛋白的一部分。在某些实施方式中，可藉由公知方法来检测FoxM1片段对基因表达(例如Plk1、周期素B2(cyclin B2)、NeK2或CENPF)的调控。在某些实施方式中，可利用任何适合的方法(举例来说，检测H3P的表达量)来确认FoxM1片段会增加细胞的增生。在某些实施方式中，FoxM1片段会持续性地活化，亦即在细胞周期中，FoxM1片段皆处于活化状态，举例来说，藉由移除一或多自我抑制蛋白域。

在某些实施方式中，FoxM1片段包含FoxM1多肽的C端。举例来说，本发明方法所使用的FoxM1片段可包含(例如由以下所组成)SEQ ID NO：2的第232-694个氨基酸或其同源性多肽。在某些实施方式中，FoxM1片段包含SEQ ID NO：3的第232-641个氨基酸或其同源性多肽。在某些实施方式中，FoxM1片段包含SEQ ID NO：4的第232-656个氨基酸或其同源性多肽。

在其他实施方式中，本揭示内容所述的FoxM1增强子是一核酸，例如一表达载体，其包含一可编码出本揭示内容所述的任一种FoxM1多肽的核苷酸序列。进行编码的核苷酸序列可操作式地连接至一适当的启动子。当转殖至标的细胞(例如心肌细胞)后，核酸序列可产生FoxM1多肽。

在其他实施方式中，本揭示内容所述的FoxM1增强子是一能增加FOXM1基因表达或活化FoxM1蛋白活性的药剂(例如小分子)。例示性的药剂包含，但不限于AMPK(Sengupta etal.2012,Circ Res.)、Osteopontin(Xie et al.,2014,Int J Mol Sci.)、CXCL12(Wang etal.2013,BBRC)及TNF-α(Xia et al.2012,Oncogen)。

(ii)Id1增强子

本揭示内容所述的Id1(或DNA结合蛋白抑制剂ID-1)增强子可以是一种能增加诸如心肌细胞等标的细胞中Id1表达量或活性的药剂。Id1是一种螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)蛋白，能与转录因子的碱性HLH家族(basic HLH family)成员形成异二聚体(heterodimer)。ID1基因(例如基因编号：3397；基因体对照序列：NG_029639)可编码出人类蛋白(例如NP_002156.2and NP_851998.1)。在某些实施方式中，本揭示内容所述的Id1增强子是一与Id1具有相同生物活性的Id1多肽。Id1多肽可以是全长的Id1蛋白、其功能性片段或包含Id1功能性片段的融合蛋白。

在某些实施方式中，Id1多肽是源自适当来源(例如人类、猴子、小鼠或大鼠)的天然存在的Id1多肽。举例来说，Id1多肽可以是源自人类或小鼠(例如C57BL/6小鼠)的Id1多肽。当可想见，Id1多肽可以是任一种Id1同型异构物。举例来说，Id1可以是人类Id1的同型异构物A或同型异构物B。本揭示内容亦包含本所属领域熟知的其他Id1同型异构物。在某些实施方式中，Id1多肽包含SEQ ID NO：5-6的任一氨基酸序列。

Id1同型异构物A(gi|31317299|ref|NP_002156.2|DNA结合蛋白抑制剂ID-1同型异构物a[智人]):

MKVASGSTATAAAGPSCALKAGKTASGAGEVVRCLSEQSVAISRCAGGAGARLPALLDEQQVNVLLYDMNGCYSRLKELVPTLPQNRKVSKVEILQHVIDYIRDLQLELNSESEVGTPGGRGLPVRAPLSTLNGEISALTAEAACVPADDRILCR(SEQ ID NO：5)

Id1同型异构物B(gi|31317297|ref|NP_851998.1|DNA结合蛋白抑制剂ID-1同型异构物b[智人]):

MKVASGSTATAAAGPSCALKAGKTASGAGEVVRCLSEQSVAISRCAGGAGARLPALLDEQQVNVLLYDMNGCYSRLKELVPTLPQNRKVSKVEILQHVIDYIRDLQLELNSESEVGTPGGRGLPVRAPLSTLNGEISALTAEVRSRSDH(SEQ ID NO：6)

本揭示内容亦包含Id1多肽的变异体，例如任何与一源自天然存在的对应物(例如人类、猴子、小鼠或大鼠)的Id1多肽不同，却与该Id1多肽具有同源性的多肽。在某些实施方式中，Id1多肽是与天然存在的Id1多肽(例如源自人类或小鼠的Id1多肽)具有同源性的多肽。在某些实施方式中，Id1多肽包含与一氨基酸序列，其SEQ ID NO：5-6任一核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的相似度。

在某些实施方式中，Id1多肽是Id1多肽(例如天然存在的Id1多肽)的功能性片段，且与对应Id1多肽具有相似生物活性。在某些实施方式中，Id1片段会与转录因子的碱性HLH家族的成员结合。在某些实施方式中，Id1片段会与转录因子的碱性HLH家族成员结合并抑制其至少一种功能。在某些实施方式中，可利用公知方法来确认Id1片段调控基因(例如TSP-1)表达的能力。在某些实施方式中，可利用公知方法(举例来说检测H3P的表达量)来确认Id1片段提高细胞增生的能力。

在其他实施方式中，本揭示内容所述的Id1增强子是一核酸，例如一表达载体，其包含一可编码出本揭示内容所述的任一种Id1多肽的核苷酸序列。该核苷酸序列可操作式地连接至一适当的启动子。当转殖至标的细胞(例如心肌细胞)后，该核酸序列即可产生Id1多肽。

在其他实施方式中，本揭示内容所述的Id1增强子是一种能增加Id1基因表达量或Id1蛋白活性的药剂(例如分子量通常小于5,000kDa的小分子)。例示性的药剂包含，但不限于，BMPs(Valdimarsdottir et al.2002,Circulation)、白血病抑制因子(Leukemiainhibitory factor,LIF；Florholmen et al.2004,Acta Physiol Scand)、葡萄糖或胰岛素(Wice et al.,2001,Diab etologia)、LMP1(Li et al.,2004,Oncogen)、5-氮杂-2'-脱氧胞核苷(5-aza-2'-deoxycytidine,DAC)及HDAC抑制剂曲古霉素A(trichostatin A,TSA)(Yu et al.,2008,Cell Prolif.)。

(iii)JNK3抑制剂

c-Jun N端激酶3(c-Jun N-terminal kinase 3,JNK3)亦称为有丝分裂活化蛋白激酶10(Mitogen-activated protein kinase 10,MAPK 10)，是MAPK家族中的一种蛋白激酶，会受不同环境压力及促发炎细胞激素的调控而活化。MAPK10基因(例如基因编号：5602；基因体对照序列：NG_013325.2)可编码出人类JNK3蛋白(例如NP_620448.1)。例示性的人类JNK3蛋白包含，但不限于，同型异构物1(NP_620448.1)、同型异构物2(NP_002744.1)、同型异构物3(NP_620446.1)、同型异构物5(NP_001304996.1)及同型异构物6(NP_001304997.1)。SEQ ID NO：7是一种例示性的JNK3氨基酸序列。当可想见，本揭示内容亦包含源自其他生物体(例如人类、猴子、小鼠或大鼠)的JNK3及其天然存在的同型异构物。

JNK3同型异构物1(gi|20986510|ref|NP_620448.1|有丝分裂活化蛋白激酶10同型异构物1[智人])

MSLHFLYYCSEPTLDVKIAFCQGFDKQVDVSYIAKHYNMSKSKVDNQFYSVEVGDSTFTVLKRYQNLKPIGSGAQGIVCAAYDAVLDRNVAIKKLSRPFQNQTHAKRAYRELVLMKCVNHKNIISLLNVFTPQKTLEEFQDVYLVMELMDANLCQVIQMELDHERMSYLLYQMLCGIKHLHSAGIIHRDLKPSNIVVKSDCTLKILDFGLARTAGTSFMMTPYVVTRYYRAPEVILGMGYKENVDIWSVGCIMGEMVRHKILFPGRDYIDQWNKVIEQLGTPCPEFMKKLQPTVRNYVENRPKYAGLTFPKLFPDSLFPADSEHNKLKASQARDLLSKMLVIDPAKRISVDDALQHPYINVWYDPAEVEAPPPQIYDKQLDEREHTIEEWKELIYKEVMNSEEKTKNGVVKGQPSPSGAAVNSSESLPPSSSVNDISSMSTDQTLASDTDSSLEASAGPLGCCR(SEQ ID NO：7)

本揭示内容所述的JNK3抑制剂是一种能减少标的细胞(例如心肌细胞)内JNK3表达量或活性的药剂。JNK3是MAPK家族的蛋白激酶，会受不同环境压力及促发炎细胞激素的调控而活化。JNK3抑制剂可以是能抑制JNK3基因表达或JNK3蛋白生物活性的核酸、多肽或小分子。举例来说，抑制剂可以是反义寡核苷酸或干扰RNA，其能靶向至标的基因或其mRNA的一或多个位置，以阻断基因转录或蛋白翻译。在某些实施方式中，JNK3抑制剂是小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)，能藉由RNA干扰作用而使JNK3基因静默。该种shRNA可由18-30个核苷酸(例如20-25个核苷酸)所组成。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指dsRNA导致传讯RNA(messenger RNA)进行同源序列专一性降解(degradation)的过程。在哺乳动物细胞中，可藉由21个核苷酸双螺旋(duplexes)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在不活化宿主的干扰素(interferon)反应下来引发RNAi。本揭示内容所述的dsRNA可以是siRNA(包含二个独立且互补的RNA链)或短发夹RNA(即由RNA链形成的紧密发夹结构)；可依据标的基因的序列来设计此二者。在一实施例中，会标的至JNK3(例如小鼠JNK3)的shRNA包含CAATAGAGAGATCCAACATAA(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列。

可将干扰RNA设计为能靶向诸如人类、猴子、小鼠及大鼠细胞中一或多种JNK3同型异构物的形式。在某些实施方式中，是将干扰RNA设计为靶向一或多种人类JNK3mRNA同型异构物的形式。本所属领域技术人员当可理解如何制备及使用能靶向至源自任何生物体(包含其天然存在的同型异构物)的JNK3mRNA的干扰RNA。在某些实施方式中，是将干扰RNA设计为可靶向人类JNK3mRNA的形式。当可理解，基于JNK3同型异构物的核苷酸序列的差异，可将干扰RNA设计为能靶向一或多种JNK3的同型异构物的形式。本所属领域技术人员当可理解制备及使用干扰RNA的方法，该些方法亦包含于本揭示内容的范畴中。例示性的用以制备及使用干扰RNA的方法包含，但不限于以下文献所述：Moore,C.B.,et al.,“Short HairpinRNA(shRNA):Design,Delivery,and Assessment of Gene Knockdown,”Methods MolBiol.,2010；629:141-158and Naito,Y.,et al.,“siRNA Design Software for a TargetGene-Specific RNA Interference,”Front Genet.,2012Jun 11；3:102。

仅为例示性，提供GenBank的JNK3mRNA同型异构物gi|969536246|ref|NM_138982.3，在此作为参照。

非必要的，本揭示内容所述的JNK3的寡核苷酸抑制剂(例如反义股核酸、小干扰RNA或微型RNA(microRNA))可包含非天然存在的核碱基、糖或共价核苷之间的键结(骨架)。经修饰后的寡核苷酸可具有特定特性，例如增加细胞的吸收、改善结合至标的核酸的亲和性及增加活体内的稳定性。在某些实施例中，本揭示内容所述的JNK3寡核苷酸抑制剂可包含一或多锁核酸残基(LNA)。

在一实施例中，寡核苷酸具有经修饰的骨架，包含保留磷原子的骨架(例如可参照美国专利3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676及5,625,050)及不包含磷原子的骨架(例如可参照美国专利5,034,506、5,166,315及5,792,608)。例示性的包含磷的修饰骨架包含，但不限于，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、手性硫代磷酸酯(chiralphosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯(phosphotriesters)、氨烷基-磷酸三酯(aminoalkyl-phosphotriesters)、甲基及其他烷基磷酸酯(phosphonates，包含3'-亚烷基磷酸酯(3'-alkylene phosphonates)、5'-亚烷基磷酸酯(5'-alkylene phosphonates)及掌性磷酸酯)、次磷酸酯(phosphinates)、氨基磷酸脂(phosphoramidates，包含3'-氨基胺基磷酸脂(3'-amino phosphoramidate)及氨基烷基胺基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidates))、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰基烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫羰基烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、磷酸硒(selenophosphates)及具有3'-5'键结或2'-5'键结的硼磷酸酯(boranophosphates)。骨架亦包含该些具有反向极性的骨架，即3'至3'、5'至5'或2'至2'键结。可以短链烷基或环烷基核苷键结、混合杂原子及烷基或环烷基核苷键结，或一或多短链杂原子或杂环核苷键结来形成不包含磷原子的修饰骨架。骨架包含该些具有吗啉基键结(morpholino linkage，部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架(siloxane backbones)；硫、亚砜及砜骨架(sulfide,sulfoxide and sulfonebackbones)；甲乙酰基及硫代甲乙酰基骨架(formacetyl and thioformacetylbackbones)；亚甲基甲乙酰基及硫代甲乙酰基骨架(methylene formacetyl andthioformacetyl backbones)；核乙酰骨架(riboacetyl backbones)；含烯烃的骨架(alkene containing backbones)；氨基磺酸骨架(sulfamate backbones)；亚甲基亚氨基及亚甲基肼基骨架(methyleneimino and methylenehydrazino backbones)；磺酸酯及磺酰胺骨架(sulfonate and sulfonamide backbones)；酰胺骨架(amide backbones)；以及其他具有混合N、O、S及CH₂成分的骨架。

在另一实施例中，本揭示内容所述的JNK3寡核苷酸抑制剂可包含一或多可取代的糖单元(sugar moiety)。该些可取代的糖单元的2'位置可以包含OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基及O-烷基-O-烷基。在该些基团中，烷基、烯基及炔基可以是可取代或不可取代的C1到C10烷基或C2到C10烯基及炔基。其2'位置亦可包含杂环烷基(heterocycloalkyl)、杂环烷芳基(heterocycloalkaryl)、氨基烷基氨基(aminoalkylamino)、聚烷基氨基(polyalkylamino)、可取代的硅基(substitutedsilyl)、RNA切割基团(RNA cleaving group)、报导基团(reporter group)、嵌入剂(intercalator)、可改善寡核苷酸的药物动力特性(pharmacokinetic properties)的基团或可改善寡核苷酸的药物药效特性(pharmacodynamic properties)的基团。较佳的可取代的糖单元包含该些具有2'-甲氧乙氧基(2'-methoxyethoxy)、2'-二甲胺氧乙氧基(2'-dimethylaminooxyethoxy)及2'-二甲胺乙氧乙氧基(2'-dimethylamino ethoxyethoxy)的糖单元。可参照Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。

在另一实施例中，本揭示内容所述的JNK3寡核苷酸抑制剂可包含一或多个经修饰的自然核碱基(即腺嘌呤(adenine)、鸟嘌呤(guanine)、胸腺嘧啶(thymine)、胞嘧啶(cytosine)及尿嘧啶(uracil))。经修饰的核碱基包含以下所述的核碱基：美国专利3,687,808,The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990,Englisch et al.,AngewandteChemie,International Edition,1991,30,613,and Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289-302,CRC Press,1993。该些核碱基中，部分核碱基特别能增加反义股寡核苷酸与其标的核酸的结合亲和性。该些包含5-取代的嘧啶(5-substituted pyrimidines)、6-氮杂嘧啶(6-azapyrimidines)以N-2、N-6及O-6取代的嘌啶(purines；例如2-胺基丙基-腺嘌呤(2-aminopropyl-adenine)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)及5-丙炔基胞嘧啶(5-propynylcytosine))。可参照Sanghvi,etal.,eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278。

在某些实施方式中，JNK3抑制剂可以是一种JNK3中和抗体，其可以是全长的抗体或其抗原结合片段。在本揭示内容中，「抗体」(antibody)一词包含，但不限于，多株(polyclonal)、单株(monoclonal)、人源化(humanized)、嵌合性(chimeric)、Fab片段、Fv片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、单链抗体(single chain antibodies,scFv)、融合蛋白及其他包含抗体的抗原结合位置的合成蛋白。

可利用本领域技术人员熟知的方法、试剂盒及商业性服务来制备抗体。本领域技术人员熟知的用以制备单株抗体的方法包含融合瘤技术及噬菌体呈现技术。其他适用于本揭示内容的抗体包含，举例来说，下述文献所述的抗体：Antibodies A LaboratoryManual,Second edition.Edward A.Greenfield.Cold Spring Harbor Laboratory Press(September 30,2013)；Making and Using Antibodies:A Practical Handbook,SecondEdition.Eds.Gary C.Howard and Matthew R.Kaser.CRC Press(July 29,2013)；Antibody Engineering:Methods and Protocols,Second Edition(Methods inMolecular Biology).Patrick Chames.Humana Press(August 21,2012)；MonoclonalAntibodies:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology).Eds.VincentOssipow and Nicolas Fischer.Humana Press(February 12,2014)；and HumanMonoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology).Michael Steinitz.Humana Press(September 30,2013))。

可利用标准技术来制备抗体；举例来说，以适当的多肽或其部分来将动物免疫，或是使用噬菌体呈现抗体库。若欲制备多株抗体，可利用能产生免疫反应的带有特定抗原决定位置(epitope；非必要性地，可与另一多肽产生半抗原化(haptenize)反应)的多肽来使特定哺乳动物(例如小鼠、兔子、山羊、马等)免疫。依据宿主种类的不同，可使用不同的佐剂来增加免疫反应。该佐剂包含，但不限于，弗氏佐剂(Freund's)、矿物凝胶(mineral gel，例如氢氧化铝)及表面活性物质(surface active substances，例如溶血卵磷脂(lysolecithin)、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子(polyanions)、肽(peptides)、油性乳化剂(oil emulsions)、钥孔虫戚血兰素(keyhole limpet hemocyanin)及二硝基酚(dinitrophenol))。依据已知流程收集及处理经免疫处理的动物的血清。若包含抗特定抗原决定位置的抗体的血清亦包含抗其他抗原的抗体，则可利用免疫亲和层析(immunoaffinity chromatography)或其他本领域技术人员熟知的方法来纯化多株抗体。本所属领域具有通常知识者皆知用以制备及处理多株抗体的技术。

若相较于其他不相关的多肽，抗体可更具亲和性地结合至JNK，则称该抗体可专一地结合至JNK。在某些实施方式中，抗体可结合至JNK3，且结合亲和性为其他不相关多肽的至少5、至少10或至少50倍。在某些实施方式中，抗体可结合至JNK3，且结合亲和性为其他不相关多肽的至少100、至少1,000或至少10,000倍。可利用公知方法(例如表面电浆子共振(surface plasmon resonance)或

系统)来确认二者结合。在某些实施方式中，抗体对KIT的亲和性(以解离常数(dissociation constant,K_D)来测量)至少为10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M或10^-11M。

在某些实施例中，本揭示内容所述的抗-JNK3抗体是全人类抗体。可藉由经改良为可表达特定人类免疫球蛋白的商业化动物(例如小鼠)来制得全人类抗体。亦可使用设计为能生产更特定(例如全人类抗体)或更大量免疫反应的基因转殖动物来制备人源化或人类抗体。例示式的技术为Amgen,Inc(Fremont,Calif.)的XenoMouse^TM及Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-Mouse^TM及TC Mouse^TM。或者是，可利用噬菌体呈现或酵母菌技术进行重组来制备抗体。例如可参照美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；and 6,265,150；and Winter et al.,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者是，可利用噬菌体呈现技术(McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-553)由源自未免疫化的供体的免疫球蛋白变异蛋白域基因组，于活体外制备人类抗体及抗体片段。

在其他实施例中，抗-JNK3抗体是人源化抗体。人源化抗体是指源自非人类(例如小鼠)的抗体的抗体，其中该源自非人类的抗体可以是特定嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白链或包含源自非人类免疫球蛋白的最小序列的抗原结合片段。大致上来说，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中是以源自非人类物种(例如小鼠、大鼠或兔子)的互补决定区域(complementary determining region,CDR)中具有特定专一性、亲和性及能力的残基(供体抗体)取代源自受体抗体的CDR的残基。在某些情况下，是以对应的非人类残基来取代人类免疫球蛋白的Fv骨架区域(Fv framework region,FR)残基。此外，人源化抗体可包含不是位于受体抗体或插入的CDR或骨架序列内的残基，其能增加或优化抗体的功效。一般来说，人源化抗体可大致包含全部的至少一及通常二个变异蛋白域，其中全部或几乎全部的CDR区域可对应于非人类免疫球蛋白的CDR区域，且全部或几乎全部的FR区域可对应于人类免疫球蛋白共通序列的FR区域。人源化抗体非必要性地亦可包含至少一部分的免疫球蛋白(通常是人类免疫球蛋白)的恒定区域或蛋白域(constant region或domain,Fc)。抗体可具有如WO 99/58572所述的经修饰的Fc区域。其他形式的人源化抗体可具有一或多(一、二、三、四、五、六)相对于原始抗体具有变化性的CDR，该种情况可称该一或多CDR是「源自」(derived from)原始抗体的一或多CDR。人源化抗体亦可具备亲和力成熟(affinitymaturation)。可利用公知方法来建构人源化抗体。例如可参照Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。

在另一实施例中，本揭示内容所述的抗体是嵌合型抗体，其可包含一源自人类抗体的重链恒定区域及轻链恒定区域。嵌合型抗体是指具有源自第一物种的变异区域或部分变异区域及源自第二物种的恒定区域的抗体。一般来说，在该些嵌合型抗体中，轻链及重链的变异区域会仿真源自一哺乳动物(例如小鼠、兔子及大鼠等非人类哺乳动物)的抗体的变异区域，而其恒定部分则会与另一哺乳动物(例如人类)的抗体序列同源。在某些实施方式中，可对变异区域及/或恒定区域的氨基酸进行修饰。

本揭示内容所述的JNK抑制剂亦可包含小分子抑制剂，例如JNK3抑制剂XII及SR-3576，以及本领域技术人员熟知的小分子抑制剂。例如可参照Kamenecka et al.,J BiolChem 284,12853-12861(2009)。JNK3的活性会受磷酸化调控，其中主要影响JNK3功能的磷酸化位置是Thr221及Tyr223。因此，本揭示内容亦包含能调控磷酸化(例如Thr221及/或Tyr223位置的磷酸化)的抑制剂。其他的例子包含，但不限于SR3576、SP600125(CellagenTechnology,Abcam)、IQ 3(Tocris Bioscience)、TCS JNK 5a(Abcam)、AS601245(Abcam)及IQ-1S(Abcam)。

本揭示内容所述的用以促进心肌细胞增生的组合或基因混合制剂可包含至少二种本揭示内容所述的FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂。在某些实施例中，组合物包含一FoxM1增强子(例如一FoxM1多肽或一用以制备FoxM1多肽的表达载体)及一Id1增强子(例如一Id1多肽或一用以制备Id1多肽的表达载体)。在其他实施例中，组合物包含一FoxM1增强子(例如一FoxM1多肽或一用以制备FoxM1多肽的表达载体)及一JNK3抑制剂(例如能标的JNK3的反义股或shRNA)。在其他实施例中，组合物包含一Id1增强子(例如一Id1多肽或一用以制备Id1多肽的表达载体)及一JNK3抑制剂(例如能标的JNK3的反义股或shRNA)。在一特定实施例中，组合物包含一FoxM1增强子(例如一FoxM1多肽或一用以制备FoxM1多肽的表达载体)、一Id1增强子(例如一Id1多肽或一用以制备Id1多肽的表达载体)及一JNK3抑制剂(例如能靶向JNK3的反义或shRNA)。

II.促进心肌细胞增生

可利用任一种本揭示内容所述的组合来促进心肌细胞于活体外或活体内的增生。

在执行本揭示内容所述的方法时，是将组合中一或多种成分与一药学上可接受的载体(赋形剂，包含缓冲液)混合，以形成一用以促进心肌细胞增生的药学组合物。「可接受的」(Acceptable)是指载体须与组合物中的活性成分兼容(且较佳是能稳定活性成分)，而不会对治疗个体产生不良反应。药学上可接受的赋形剂(载体)包含本所属领域熟知的缓冲液。例如可参照Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。在一实施例中，是将组合中的各成分配制为个别的药学组合物。在另一实施例中，是将组合中一种以上的成分配制为单一组合物。

本发明方法所使用的药学组合物可包含冷冻干燥剂型或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20thEd.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover。在投予的剂量及浓度中，可接受的赋形剂或稳定剂对接受者不具有毒性，且可包含诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸等缓冲液；抗坏血酸(ascorbic acid)及甲硫氨酸(methionine)等抗氧化剂；防腐剂(例如十八烷基二甲基芐基氯化铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、甲苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚(phenol)、丁醇或芐醇(butyl or benzyl alcohol)；诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯(methyl or propyl paraben)等对羟基苯甲酸酯(alkyl paraben)；儿茶酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环已醇(cyclohexanol)；3-戊醇(3-pentanol)；间甲酚(m-cresol)；低分子量(约小于10个残基)多肽；诸如血清白蛋白(serum albumin)、明胶(gelatin)或免疫球蛋白等蛋白；

聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)等亲水性聚合物；诸如甘氨酸(glycine)、谷氨酰胺(glutamine)、天门冬酰氨(asparagine)、组氨酸(histidine)、精氨酸(arginine)或赖氨酸(lysine)等氨基酸；单糖(monosaccharides)、双糖(disaccharides)及包含葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)或聚葡萄糖(dextran)等其他糖类；EDTA等螫合剂；蔗糖(sucrose)、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)或山梨醇(sorbitol)等糖类；钠等形成盐类的相对离子；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；及/或诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等非离子表面活化剂(surfactant)。本揭示内容进一步阐述药学上可接受的赋形剂。

在某些实施例中，本揭示内容所述的药学组合物包含脂质体，其包含FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂，且可依据本所属领域公知方法来制备，例如Epstein,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980)；and U.S.Pat.Nos.4,485,045and 4,544,545。可增加循环时间的脂质体揭示于美国专利号5,013,556。可利用反相蒸发法(reverse phase evaporation method)及一包含卵磷脂(phosphatidylcholine)、胆固醇(cholesterol)及源自PEG的磷脂酰乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine,PEG-PE)来制备特别有用的脂质体。可使用不同孔径大小的过滤器来挤压脂质体以产生具有特定粒径的脂质体。

亦可将活性成分(例如FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂)包覆于由凝聚技术(coacervation techniques)及界面聚合(interfacial polymerization)等方法制备的微粒胶囊中；举例来说，分别于胶体药物传递系统(举例来说脂质体、白蛋白微球、微乳胶、纳米颗粒及纳米胶囊)中或巨乳胶中的羟甲基纤维素(hydroxymethylcellulose)或明胶-微粒胶囊及聚-甲基丙烯酸甲酯(poly-(methylmethacylate))微粒胶囊。该些技术举例来说可参照Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.MackPublishing(2000)。

在其他实施例中，可将本揭示内容所述的药学组合物制备为缓释剂型(sustained-release format)。例示式的缓释制备包含固体疏水性聚合物的半透明基质，其包含一或多种本揭示内容所述的增强子/抑制剂，且该基质可具有特定的形式，例如膜状或微粒胶囊。例示式的缓释基质包含聚酯、水凝胶(举例来说，聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))或聚乙烯醇(poly(vnylalcohol))、聚乳酸(polylactides)(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(copolymers of L-glutamic acid and 7ethyl-L-glutamate)、非降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOT^TM，由乳酸-乙醇酸共聚物共聚物及利普安(leuprolide acetate)所组成的可注射的微球)、蔗糖乙酸酯异丁酸酯(sucroseacetate isobutyrate)及聚-D-(-)-3-羟丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)。

投予至活体体内的药学组合物必须为无菌状态。举例来说，可利用无菌过滤膜进行过滤来达到无菌目的。治疗组合物通常是置于具有无菌存取口的容器中，举例来说，静脉内溶液袋或具有可以皮下注射针头穿刺的塞子的安瓶。

本揭示内容所述的药学组合物可配制为单位剂量形式，例如片剂(tablet)、丸剂(pills)、胶囊(capsule)、粉末(powder)、颗粒(granules)、溶液(solution)或悬浮液(suspensions)或栓剂(suppositories)，以进行口服、非口服、直肠或吸入投予。

在制备片剂等固体组合物时，是将活性成分与药学载体(例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢钙或胶及其他药学稀释剂(例如水)等公知片剂成分)混合，以形成固体预剂型组合物，其包含本发明组合物或其非毒性的药学上可接受的盐类的均质混合物。均质预剂型组合物是指活性成分均匀地散布于组合物中，藉此使组合物能细分为片剂、丸剂及胶囊等相同有效单位剂量。接着可将固体预剂型组合物细分为上述单位剂型，其包含约0.1到约500毫克的本发明的活性成分。可涂布新颖组合物的片剂或丸剂或将其与其他物质混合，以制备可长效作用的剂型。举例来说，片剂或丸剂可包含一内层剂量及一外层剂量成分，后者可形成一外膜包覆前者。可以肠溶衣层(enteric layer)分隔二成分，该肠溶衣层可抵抗胃中的崩解反应，藉以使内部成分完整地通过进入十二指肠或延缓释放。可使用不同的材料来制备该肠溶衣层或进行涂布，该些材料包含聚合酸(polymeric acid)及聚合酸与虫胶(shellac)、鲸蜡醇(cetyl alcohol)及乙酸纤维素(cellulose acetate)等材料形成的混合物。

适当的表面活性剂包含，聚氧乙烯山梨醇酐(polyoxyethylenesorbitan，例如Tween^TM20、40、60、80或85)及其他山梨醇酐(Span.TM.20、40、60、80或85)等非离子药剂。具有表面活性剂的组合物通常包含0.05到5％的表面活性剂，且可介于0.1到2.5％之间。当可理解，亦可添加其他成分，举例来说，若有必要，甘露醇或其他药学上可接受的载具。

可利用商业化的油脂乳化剂(例如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM及Lipiphysan^TM)来制备适当的乳化剂。活性成分可溶于预先混合的乳化剂组合物中，或是溶于油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中；一旦与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合即形成乳化。当可理解，可添加其他的成分，举例来说，甘油或葡萄糖，藉以调整乳化剂的张力。适当的乳化剂通常包含最高为20％的油脂，例如介于5到20％之间的油脂。油脂乳化剂的pH值是介于5.5到8.0之间。可将FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂与Intralipid^TM或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合以制备乳化剂组合物。

为促进有治疗需要的个体体内心肌细胞的增生，可透过适当的路径对该个体(例如人类个体)投予一有效量的一或多种药学组合物，其包含任一种本揭示内容所述的组合(例如包含至少二种FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂)；举例来说，适当的路径可是静脉内投予(例如全剂量(bolus)或一段时间的持续注射)、肌肉内(intramuscular)、腹腔内(intraperitoneal)、脑脊髓内(intracerebrospinal)、皮下(subcutaneous)、关节内(intra-articular)、滑液膜内(intrasynovial)、鞘膜内(intrathecal)、口服、吸入或局部投予。可利用液体剂型所使用的商业化雾化器(包含喷射雾化器及超音波雾化器)来进行投予。可直接雾化液体剂型，或是重组后雾化冷冻干燥粉末。或者是，可藉由氟碳剂型及计量剂量吸入器雾化FoxM1增强子、增强子及/或JNK3抑制剂，或是吸入冷冻干燥及研磨粉末形式的FoxM1增强子、增强子及/或JNK3抑制剂。

可接受本揭示内容所述方法治疗的个体可以是一哺乳动物；较佳是一人类。哺乳动物包含，但不限于，农场动物、运动竞赛动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠及大鼠。需要进行治疗的人类个体可以是一罹患心脏损伤或退化性疾病的人类病患、一有罹患心脏损伤或退化性疾病的风险的人类病患，或是一疑似罹患心脏损伤或退化性疾病的人类病患。在某些实施例中，人类病患为罹患心肌梗塞、疑似罹患心肌梗塞，或有罹患心肌梗塞风险的风险的个体。可利用常规医疗检测(例如实验室检验、心脏功能检验、心脏切片检查、CT扫描或超音波)来确认罹患心脏损伤或心脏退化性疾病的个体。疑似罹患心脏损伤或心脏退化性疾病的个体可能具有一或多疾病的病征。有罹患心脏损伤或心脏退化性疾病的风险的个体可以是一具有一或多该疾病风险因子的个体。

可接受本揭示内容所述的方法治疗的个体可以处于任何年龄或发育状态。在某些实施方式中，个体是一胚胎、一胎儿、一新生个体、一孩童、一青少年或一成熟个体。在本揭示内容中，一「新生个体」(neonate)是指一大于或小于30天的新生个体(例如人类或小鼠)。在本揭示内容中，一「成熟个体」(adult)是指一达到性成熟的个体(例如人类或小鼠)。

在本揭示内容中，「一有效量」(an effective amount)是指各活性药剂(不论是单独投予或与一或多种其他活性药剂共同投予)能对个体产生治疗功效的剂量。有效量可随着欲治疗的特定状况、疾病的严重程度、患者的生理条件(如患者年龄、身体状况、体型、性别及体重)、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)及特定投予路径等医疗人员于其专业知识及技能范畴内予以辨断的相关因素而有所调整。该些因素为本所属领域技术人员所熟知且不需过度实验即可了解。通常是投予各成分或其组合的最大剂量，即在健全的医疗判断下，投予最高的安全剂量。然而，本所属领域具有通常知识者当可了解，病患可能基于医药因素、心理因素或其他因素而使用较低的剂量或耐受剂量。

亦可基于半衰期等因素来决定投予剂量。举例来说，可利用与人类免疫系统兼容的多肽(例如人类FoxM1、人类Id1或其功能生片段)来延长多肽的半衰期及防止多肽受到宿主免疫系统的攻击。通常(非必要)可基于治疗及/或抑制及/或改善及/或延缓心脏疾病，来决定及调整疗程中的投药频率。或者是，可使用FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂的持续释放的剂型。不同的剂型及仪器皆为本所属领域技术人员所熟知。

在一实施例中，可依据经验/实验结果来决定在接受一或多次FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂的组合治疗的个体中，本揭示内容所述的FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的投予剂量。可对个体增加活性药剂的投予剂量。可检测心脏受损指标来了解活性药剂的功效。

一般来说，在投予任一种本揭示内容所述的FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂时，起始候选剂量可以约为每公斤2毫克。在本揭示内容中，依据上述因素的不同，一般每日剂量可约为每公斤0.1微克到每公斤3微克到每公斤30微克到每公斤300微克到每公斤3毫克到每公斤30毫克到每公斤100毫克或更多。若于数天内或更长时间进行重复投予，依据状况的不同，可持续进行治疗，直到将病征抑制到特定程度，或是直到产生足够的治疗功效以减缓心脏疾病或其病征。例示性的剂量疗程包含投予每公斤2毫克的起始剂量，接着维持每周约每公斤1毫克的增强子及/或抑制剂的投予剂量，或是维持隔周每公斤1毫克的投予剂量。然而，依据医疗人员预期达到的药物动力衰退状态，亦可使用其他疗程。举例来说，可采用一周1-4次的剂量。在某些实施方式中，可使用约为每毫克3微克到每公斤2毫克(例如约为每毫克3微克、约为每毫克10微克、约为每毫克30微克、约为每毫克100微克、约为每毫克300微克、约为每公斤1毫克及约为每公斤2毫克)的剂量。在某些实施方式中，投予频率是每周一次、每周二次、每周四次、每周五次、每周六次、每周七次、每周八次、每周九次或每周十次；或是每个月一次、每二个月一次、每三个月一次或更久。可利用公知技术及试验来检测治疗流程。可随着时间改变疗程(包含使用的活性剂)。

当活性剂是小分子时，可将每公斤病患体重的0.1到300毫克的活性剂分成一到三剂，或如本揭示内容所述。在某些实施方式中，在治疗正常体重的成熟个体时，投予剂量约为每公斤0.3到5.00毫克。可依据特定的个体、个体的医疗病史及各药剂的特性(例如半衰期及其他本领域技术人员熟知的考虑因素)来决定特定的剂量疗程(即剂量、时间及重复投予)。

在本揭示内容中，FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的适当剂量会随着特定药剂(或其组合物)、心脏疾病类型及严重程度、活性剂是用于预防或治疗目的、先前治疗、病患的临床病史及对拮抗剂的反应、及主治医师的判断不同而有所调整。医疗人员通常会投予FoxM1增强子(例如FoxM1多肽)、Id1增强子(例如Id1多肽)及/或JNK3抑制剂(例如对JNK3具有专一性的shRNA)，直至到达可产生特定疗效的剂量。活性药剂可以是持续性或间接性地投予，举例来说，可依据接受者的生理状况、投予为治疗或预防的目的及其他医疗人员熟知因素而有所不同。活性药剂基本上可持续投予预选的一段时间，或是分为连续性地间隔剂量投予，例如于心脏疾病产生之前、同时或之后投予。

在本揭示内容中，「治疗」(treating)一词是指将一组合物(包含本揭示内容所述的包含FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的组合(或称基因混合制剂))应用或投予至一罹患心脏损伤或心脏退化性疾病、具有损伤/疾病的病征或有罹患该疾病的风险的个体，以治疗、治愈、减缓、改变、改善或影响该疾病、该疾病的病征或罹患该疾病的风险。

减缓心脏损伤或心脏退化性疾病包含延缓疾病的发生或进程或减缓疾病的严重程度。减缓疾病不必然要产生治疗结果。在本揭示内容中，「减缓」(delaying)疾病(例如心脏退化性疾病)的发生是指延迟、阻止、延缓、稳定及/或推延疾病的进程。依据病史及/或治疗个体的不同，减缓可于不同时间长度内发生。一可「减缓」(delays或alleviates)疾病发生的方法是指相较于未使用该方法，能于特定时间内减少发生疾病的一或多种病征及/或减少病征程度的方法。该对比通常是基于临床研究，其藉由特定数量的个体来产生具有统计显著性的结果。

一疾病的「发展」(development)或「进程」(progression)是指初始的表达及/或疾病的确认历程。可利用公知标准临床技术来侦测疾病的发生。然而，发生亦指无法侦测的进程。在本揭示内容中，发生或进程是指病征的生物历程。「发展」(development)包含出现(occurrence)、再现(recurrence)及开始(onset)。在本揭示内容中，心脏损伤或心脏退化性疾病的「开始」(onset)或出现(occurrence)包含初始的开始及/或再现。

在某些实施方式中，是对有治疗需要的个体投予本揭示内容所述的活性剂(例如FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂)，投予的剂量足以增加或减少标的基因产物(FoxM1,Id1,and JNK3)至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的表达。

依据治疗疾病的类型或疾病位置的不同，可利用医疗领域具有通常知识者熟知的公知方法来对个体投予药学组合物。亦可由其他公知路径投予组合物，例如口服、非口服、吸入喷剂、局部、直肠、鼻腔、颊部、阴道或植入物。在本揭示内容中，「非口服」(parenteral)包含皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)、静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉内(intraarterial)、滑液膜内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)、鞘膜内(intrathecal)、病灶内(intralesional)及颅内(intracranial)注射或注入技术。此外，可透过可注射储存路径(injectable depot route)投予至个体，例如1-、3-或6-个月的储存可注射或具生物降解性的材料及方法。

可注射的组合物可包含多种载体，例如植物油(vegetable oils)、二甲基乙酰胺(dimethylactamide)、二甲基甲酰胺(dimethyformamide)、乳酸乙酯(ethyl lactate)、碳酸乙酯(ethyl carbonate)、肉豆蘧酸异丙酯(isopropyl myristate)、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。进行静脉注射时，可藉由滴注方法(drip method)投予水溶性抗体，藉此注入包含抗体及生理上可接受的赋形剂的药物剂型。生理上可接受的赋形剂可包含，例如5％右旋葡萄糖(dextrose)、0.9％生理食盐水、林格氏溶液或其他适合的赋形剂。可将肌肉内制剂(例如增加子/抑制剂的适合可溶性盐形式的无菌剂型)溶解于药学赋形剂(例如注射用水、0.9％生理食盐水或5％葡萄糖溶液)后进行投予。

在一实施方式中，是利用位置专一或标的局部传递技术来投予一或多种FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂。例示式的位置专一或标的局部传递技术包含活性药剂的各种可植入式储存来源、局部传递导管(例如注入导管、留置导管或针头导管)、合成移植物、动脉外膜包覆、分流器及支架或其他可植入的装置、具有位置专一性的载体、直接注射或直接应用。例如可参照PCT公开号WO 00/53211及美国专利号5,981,568。

亦可标的传递包含一反义股寡核苷酸或一表达载体等治疗组合物。举例来说，以下文献所阐述的由受器所媒介的DNA传递技术：Findeis et al.,Trends Biotechnol.(1993)11:202；Chiou et al.,Gene Therapeutics:Methods And Applications OfDirect Gene Transfer(J.A.Wolff,ed.)(1994)；Wu et al.,J.Biol.Chem.(1988)263:621；Wu et al.,J.Biol.Chem.(1994)269:542；Zenke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655；Wu et al.,J.Biol.Chem.(1991)266:338。在基因治疗流程中，局部投予包含多核苷酸的治疗组合物的剂量约为100纳克到200毫克的DNA。在某些实施方式中，在基因治疗流程中，使用浓度约为500纳克到约50毫克、约为1微克到约2毫克、约为5微克到约500微克，以及约为20微克到约100微克的DNA或更高量。

可利用基因传递载具来传递本揭示内容所述的FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂的治疗多核苷酸及多肽。基因传递载可以是病毒或非病毒来源(通常可参照Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1:51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5:845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1:185；及Kaplitt,Nature Genetics(1994)6:148)。可藉由内源性哺乳动物或外源性启动子及/或增强子来诱发该些编码序列的表达。编码序列可以持续性或调控性的方式进行表达。

本所属领域本领域技术人员皆熟知用以传递特定多核苷酸且可于特定细胞中进行表达的病毒相关载体。例示式的病毒相关载体包含，但不限于重组反转录病毒(例如可参照PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国国专利号5,219,740及4,777,127；英国专利号2,200,651；及欧洲专利号0 345 242)、腺病毒相关载体(例如辛得比斯病毒载体(Sindbis virus vectors)、森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗氏河病毒(Ross Rivervirus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))、腺病毒载体(adenoal virus vector)及腺病毒相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体(例如可参照PCT公开号WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655)。亦可投予与非活性腺病毒连接的DNA，如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147所述。在某些实施例中，是利用AAV病毒载体来传递一或多种FoxM1增强子、Id1增强子或JNK3抑制剂。

亦可使用非病毒传递载具(vehicle)及方法，其包含，但不限于，与非活性腺病毒连接的聚阳离子浓缩DNA(例如可参照Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)；与配体连接的DNA(例如可参照Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)；真核细胞传递载具细胞(例如可参照美国专利号5,814,482；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；及WO 97/42338)及核电荷中和或与细胞膜融合。亦可使用裸露的(Naked DNA)。例示式的裸露DNA方法介绍可参照PCT公开号WO 90/11092and美国专利号5,580,859。可作为基因传递载具的脂质体可参照美国专利号5,422,120；PCT公开号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；及欧洲专利号0524968。其他方法可参照Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581。

很明显地，表达载体可用以表达任一种与蛋白相关的FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂。

在某些实施方式中，可利用任一种本揭示内容所述的FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的组合促进心肌细胞于活体外的增生。可于适当条件下，将源自适当供体或由多潜能或胚胎干细胞所分化的心肌细胞培养于FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的组合中，藉由增强子/抑制剂组合来诱发心肌细胞的增生。可将增生的心肌细胞投予至有治疗需要的个体，例如一罹患心脏损伤、疑似罹患心脏损伤或有罹患心脏损伤的风险的人类个体，藉以治疗心脏疾病。在某些实施例中，心肌细胞为自体心肌细胞，即源自相同人类个体的心肌细胞。在其他实施例中，心肌细胞为异体心肌细胞，即不同人类个体的心肌细胞。

III用于促进心肌细胞增生的试剂盒

本揭示内容亦提供用于促进心肌细胞增生的试剂盒。该些试剂盒可包含一或多容器，其包含至少二种FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂。在某些实施方式中，FoxM1增强子是一FoxM1多肽或一用以制备该FoxM1多肽的表达载体。在某些实施方式中，Id1增强子是一Id1多肽或一用以制备该Id1多肽的表达载体。在某些实施方式中，JNK3抑制剂是一对JNK3具有专一性的shRNA。在某些实施方式中，试剂盒包含FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂。

在某些实施方式中，试剂盒可包含依据任一种本揭示内容所述方法而撰述的使用操作说明。使用操作说明可包含依据任一种本揭示内容所述方法来投予FoxM1增强子、Id1增强子及/或JNK3抑制剂的说明，以治疗、延缓或减缓心脏损伤或心脏退化性疾病。试剂盒可更包含一用以筛选适于治疗的个体的说明，其是基于确认该个体是否患有心脏损伤或心脏退化性疾病来进行筛选。在其他实施方式中，使用操作说明包含对有罹患心脏损伤/疾病的风险的个体投予一或多种活性药剂的说明。

关于使用FoxM1增强子、Id1增强子及JNK3抑制剂的的使用操作说明，通常包含用以进行特定治疗的剂量、投药流程及投药路径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或次单位剂量。试剂盒随附的使用操作说明通常是书写于标签或包装内含物(例如试剂盒随附的书面数据)的书面说明，或是以机器可读取(例如储存于磁盘或光盘)的形式提供。

卷标或包装内含物指出组合物是用以治疗、延缓及/或减缓心脏疾病。使用操作说明可提供实施任一种本揭示内容所述的方法。

本揭示内容所述的试剂盒是位于适当的包装内。适当的包装包含，但不限于，安瓶(vial)、瓶罐(bottle)、瓶子(jar)及软包装(flexible packaging，例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。亦可为与特定装置(例如喷雾器等吸入或鼻腔给药装置)或注入装置(例如小型泵(minipump))共同使用的包装。试剂盒可具有一无菌入口(举例来说，容器可以是一静脉内溶液袋或一具有可以皮下注射针头穿刺的塞子的安瓶)。容器亦可具有一无菌入口(举例来说，容器可以是一静脉内溶液袋或一具有可以皮下注射针头穿刺的塞子的安瓶)。

本揭示内容所述的试剂盒可具选择性地提供其他成分，例如缓冲液或翻译信息。正常来说，试剂盒包含一容器及一标签或包装内含物(标示于容器上或以容器随附型式提供)。在某些实施方式中，本揭示内容提供了用以制备本发明试剂盒的内容物的说明。

惯用技术

除非另所有指，否则可于本领域技术人员所熟知的范畴内，利用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生化学及免疫学的公知技术(包含重组技术)来实现本发明。下列文献充分说明了该些技术：例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Matherand P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel,et al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis,et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley andSons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,OxfordUniversity Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow andD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti andJ.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。

即使没有进一步的说明，本所属领域技术人员仍可基于本说明书充分实施本发明。下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例1:心脏再生的治疗性基因混合制剂

材料及方法

(i)由新生小鼠的心脏分离心肌细胞及非心肌细胞

由2-或3-天大的C57BL/6小鼠分离并依据以下流程培养心肌细胞及非心肌细胞：(Condorelli,Morisco et al.FASEB J.16(13):1732-1737；2002)。简单来说，在移除心房及主动脉后，切割心脏组织并以每毫升1毫克的胰蛋白酶(Trypsin,Sigma-Aldrich)于4℃分解2小时。加入每毫升0.8毫克的胶原蛋白酶II(Collagenase II,Invitrogen)，于37℃反应15分钟，以40微米的过滤器过滤以移除细胞碎屑后，收集细胞。

以线粒体染剂-四甲基若丹明甲酯酸铵(methyl ester perchlorate,TMRM,LifeTechnology)进行染色，利用荧光活化细胞分离器FACS(Hattori,et al.,Nat Methods 7(1):61-66；2010)分析并分离具有最高强度的细胞群，藉以纯化心肌细胞。收集较低的TMRM染色细胞群作为对照的非心肌细胞。

(ii)细胞重整流程

细胞重整实验是依据先前标准流程修改来进行(Takahashi et al.,Cell 126(4):663-676；2006)。就修改部分简单来说，将重新种植于饲养细胞(feeder cell)的时间点由第3天延长至第10天。将iPS细胞培养液由原包含10％KOSR或FBS的DMEM置换为包含15％FBS的GMEM基础细胞培养液。

在以脱氧羟四环素调控OSKM基因转殖小鼠的二次细胞重整系统中，于早期细胞重整时，是每天投予每毫升1微克的脱氧羟四环素。

(iii)iPS于活体外的分化

在不包含饲养细胞的环境中，培养经诱发的多潜能干细胞(induced pluripotentstem cells,iPS cells)2天，收集细胞后重新悬浮于包含10％FBS的GMEM基础细胞培养液(Invitrogen)的分化培养液中。稀释悬浮细胞，并滴于细胞培养盘盖上(每滴600个细胞)。悬滴培养3天后，将胚体(embryoid boides)种植于以明胶涂布的细胞培养盘上，继续培养7天。以4％三聚甲醛(paraformaldehyde)固定分化细胞，进行免疫荧光流程。

(iv)形成畸胎瘤

将约1x10⁶iPS细胞皮下注射至6到8周大的NOD-scid小鼠，3-4周后可观察到畸胎瘤。以石蜡固定及包埋肿瘤后，利用苏木精-曙红(Hematoxylin-Eosin,Sigma-Aldrich)进行染色。

(v)转录体分析(Transcriptomic analysis)

依据使用操作说明，将由不同细胞重整时间点收集的检体与小鼠寡微数组(MouseOligo Microarray,Agilent)进行杂合反应(hybridized)，再以微数组扫描系统(Microarray Scanner System,Agilent)来扫描数组。以GeneSpring GX软件(Agilent)分析所有的数据，并利用DAVID软件分析基因本体(Gene Ontology analysis)(Huang da,etal.,Nat Protoc 4(1):44-57；2009)。

(vi)制备及纯化重组腺病毒载体

利用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)由C57BL/6小鼠纯化的总反转录cDNA扩增Foxm1、Id1及Hmgb2cDNA。将扩增的片段转殖至pENTR质体中ires-EGFP旁边的位置。之后依据pAd/PL-DEST Gateway载体试剂盒说明(Invitrogen)，将携带该些特定基因的pENTR质体重组至pAd/PL-DEST质体。

依据Luo等人所述方法，使携带该些特定基因的pAd/PL-DEST进行表达，藉以制备具有特定基因及EGFP表达的腺病毒(Luo et al.,NT Protoc 2(5):1236-1247)。利用CsCl₂梯度离心来浓缩病毒。

(vii)投予JNK3抑制剂XII,SR-3576

JNK3抑制剂XII,SR-3576(Millipore)对JNK3具有结合专一性；在活体外试验中，是对新生小鼠的CM投予1uM的SR-3576，并反应3小时。

(viii)对新生及成熟小鼠注射腺病毒载体

依据以下文献将腺病毒注射至新生小鼠体内：(Christensen et al.,Circulation 101(2):178-184；Ebelt et al.,Cardiovasc Res.80(2):219-226；2008)；将一天大的小鼠置于冰上2分钟使其麻醉后，以带有30号针头的Hamiliton注射器将病毒注入左胸骨旁的胸腔，接着将小鼠与饲育母鼠共同饲养12天。牺牲小鼠后，收集心脏以进行后续实验。

在成鼠方面，是将1x 10¹¹的病毒颗粒注入心脏内。治疗时，在心肌梗塞后立即于受损心脏周边的3个位置注入腺病毒。

(ix)心肌梗塞

以吸入性异氟醚(isofluorane)麻醉8到10周大的小鼠，对其进行气管插管后，置于啮齿动物呼吸器上。在移除心包(pericardium)后，以普理灵(prolene)缝线对左前降(left anterior descending,LAD)冠状动脉进行永久性接合。接合后立即确认左心室的白化区域，以判断是否成功产生心肌梗塞。

(x)心脏超音波

利用配有5.0-13.0MHz手术探针的Vivid-q超音波(General Electric Company)来分析胸腔二维心脏超音波。藉由胸骨旁短轴切面的M追踪模式来测量左心室前后壁的厚度及收缩末期与舒张末期的内径，据以计算出左心室缩短分析(fractional shortening)及射出分率(ejection fraction)。

(xi)马森三色染色(Masson’s trichrome staining)

收集心脏组织，以4％三聚甲醛固定后，进行石蜡包埋。依据标准流程切片后，藉由总左心室区域产生纤维化的百分比来测量梗塞大小。

(xii)免疫荧光

以4％三聚甲醛固定细胞后，加入溶于阻断缓冲液(包含5％山羊血清的PBS)的0.3％氚核X-100(triton X-100)反应1小时，藉以通透细胞。之后，以一级抗体OCT-4(SantaCruz)、SOX-2(Millipore)、KLF-4(Abcam)、Nanog(Reprocell)染色细胞，以确认iPS细胞的多功能性；以一级抗体Nestin(R&D)、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,Sigma)及α-胎儿蛋白(α-Fetoprotein,R&D)确认iPS细胞的活体外分化状态；以及利用一级抗体Ki-67(Genetex)、于组蛋白H3的丝氨酸10进行磷酸化(histone H3phosphorylated atserine 10,Millipore)、Aurora B激酶(Abcam)进行基因筛选。至于SSEA-1(Biolegend)染色，则跳过细胞通透步骤。以PBS洗涤3次后，分别加入与Alexa fluor-488或-568(LifeTechnology)接合的二级抗体，反应1小时，并以DAPI(Life Technology)染色细胞核5分钟。

将组织切片脱蜡、再水合后，以煮沸的柠檬酸钠处理2次，每次5分钟，藉以修复抗原(antigen-retrieval)。之后，如前述流程对切片进行相同的免疫荧光步骤，并利用与Alexa fluor-488接合的麦芽凝集素(Wheat germ agglutinin,WGA)(Life Technology)染色组织的细胞膜。

进行基因筛选时，是以Ki67及DAPI染色进行色疫荧光步骤，再利用ImageXpress微高量筛选显微镜(ImageXpress Micro High content screening microscope,MolecularDevices)拍摄照片。

在评估细胞重整功效方面，是使用AP受质试剂盒、Vector Red受质试剂盒(VectorLaboratories,Burlingame,CA)来确认类iPSC的细胞群数量。以AP⁺细胞群数量/慢病毒感染细胞数量来计算细胞重整功效。

(xiii)实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)

依据SuperScript III反转录试剂盒(Life Technology)的流程进行反转录。利用SYBR Green Real-Time PCR master混合物来定量各基因的表达，并以GAPDH进行标准化。

(xiv)统计

利用Prism Gaphpad来分析所有的统计数据，并以平均值±平均值标准偏差(mean±standard error of the mean,S.E.M.)来表示。利用未配对(Unpaired)、双尾Student’st检测(two-tailed Student’s t-test)及单向ANOVA(one-way ANOVA)进行统计比对，P<0.05的数值即视为具有统计差异。

结果

对基因转殖小鼠投予可受脱氧羟四环素诱发的四种Yamanaka因子，并基于不同的细胞形态及微数组分析来检测于心肌细胞(cardiomyocyte,CM)于不同时间点的细胞重整。图1A。结果指出，于细胞重整第2天可观察到增加的CM增生。图1B及1C。

藉由检测Ki-67阳性细胞群的百分比来测试本揭示内容所述的由微数组筛选的基因对新生小鼠的CM增生的影响。抗原Ki-67是一种与细胞增生相关的核蛋白。注射携带特定基因的腺病毒载体或投予适当的抑制剂增加或降低特定基因于CM中的表达量。于活体外对新生小鼠的CM投予FoxM1、Id1及Jnk3抑制剂的二重或三重组合；结果显示，相较于对照组，投予组合会使Ki67或H3P阳性细胞群的百分比增加7倍，意即投予二重或三重组合可显著地增加CM的生长。图2A-2C。

对一天大的新生小鼠投予FoxM1、Id1及Jnk3-shRNA的三重组合。相较于对照组的小鼠，接受治疗的小鼠具有较高的心脏对体重的比值及较高的H3P阳性细胞群百分比。图3A及3B。该些结果确认在心脏发育时，三重基因混合制剂能有效促进CM的增生。

于心肌梗塞后，将本揭示内容所述的三重基因混合制剂投予至成鼠的心脏周边区域。基因混合制剂会诱发CM的增生能力，进而改善接受治疗的小鼠的心脏功能。以心脏超音波及纤维化试验进行检测。

实施例2：特定的基因混合制剂可显著地提高成鼠体内心肌细胞的增生

材料及方法

(i)分离成鼠的心肌细胞

于Langendorff装置上，由公鼠分离成鼠的心室CM。以肝素处理(heparinization)10分钟后，由麻醉的小鼠取出心脏并插管，利用不含钙离子(Ca2⁺)的台式溶液(Tyrodesolution，每升120.4毫摩尔的NaCl、每升14.7毫摩尔的KCl、每升0.6毫摩尔的KH₂PO₄、每升0.6毫摩尔的Na₂HPO₄、每升1.2毫摩尔的MgSO₄、每升1.2毫摩尔的HEPES、每升4.6毫摩尔的NaHCO₃、每升30毫摩尔的牛磺酸(Taurine)、每升10毫摩尔的BDM、每升5.5毫摩尔的葡萄糖)进行逆向灌流。灌流3分钟后，以与不含钙离子的台式溶液(包含胶原蛋白酶B(每克个体体重0.4毫克，Roche)、胶原蛋白酶D(每克个体体重0.3毫克，Roche)及第XIV型蛋白酶(每克个体体重0.05毫克，Sigma-Aldrich))分解心脏组织。之后，由插管切除心室，于以包含10％FBS的不含钙离子的台式溶液中和的分解溶液中，将组织切割为细块。藉由缓和冲洗将成熟鼠CM由分解组织分离出来，以250微米孔径的尼龙筛网进行过滤，以移除未分解的组织，据以收集成熟鼠CM。

结果

将脱氧羟四环素注入OSKM基因转殖小鼠，2天后分离成鼠的CM，据以确认活体体内的Oct4、FoxM1、Id1及Jnk3表达的改变(图5A)。检测Oct4的过量表达以确认成功将脱氧羟四环素注入活体体内(图5B)。如预期地，相较于对照组的CM，FoxM1及Id1具有较高的表达量，而Jnk3的表达则会显著地受到抑制(图5B)。此外，在投予脱氧羟四环素2天后，可发现成鼠CM具有显著较多的H3P⁺细胞群(2倍)(图5C)。

此外，将FIJs直接注射至10周大的小鼠的心脏，以证实FIJs治疗可提高成鼠体内CM的增生(图5D)。12天后，投予FIJs的小鼠体内的H3P⁺细胞群较治疗对照组的小鼠体内的H3P⁺细胞群高出3.5倍(图5E)。该些结果指出，FIJs治疗可有效增加成鼠体内CM的增生。

其他实施方式

可将本说明书中公开的所有技术特征以任何组合进行组合。可使用能产生相同、均等或相似目的的技术特征来取代在该说明书中公开的技术特征。因此，除非另外特别指出，本说明书公开的技术特征仅是一系列均等或类似特点的实施范例。

从上述说明书中，本所属领域本领域技术人员可以容易地确定本发明的主要特点，并且在不悖离其精神和范围的情况下，对本发明作出各种改变和改进以将其适应于各种用途和情况。因此，其它的实施方式亦在本发明申请专利的范畴内。

均等

虽然本说明书已经描述了本发明的多个实施方式，但是本所属领域本领域技术人员很容易预见到用于实现本说明书所述的功能及/或获得本说明书所述的结果及/或一个或更多个本说明书所述的优点的各种其它手段及/或结构，且所有这样的变化及/或调整均被认为在本发明的范围的内。更一般而言，本所属领域本领域技术人员很容易认识到本说明书所述的所有参数、尺寸、材料和构型均是示例性的并且实际的参数、尺寸、材料和构型取决于采用本发明教导的具体应用。本所属领域本领域技术人员仅利用常规实验即可识别或能够区别本说明书所述的本发明具体实施技术手段的等同技术手段。因此，当可理解，前述实施方式仅为例举并且在所附权利要求及其等同技术的技术手段的范围内，本发明可以采取不同于所描述或所要求保护的方式实施。本发明涉及本说明书所述的各个单独的技术特征、系统、制品、材料、试剂盒及/或方法。此外，只要这样的技术特征、系统、制品、材料、试剂盒及/或方法不相互矛盾，则该些技术特征、系统、制品、材料、试剂盒及/或方法的组合也包含在本发明的范围之内。

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。

除非有明确的相反指示，否则本说明书及权利要求中所述的「一」(one)应理解为「至少一」(at least one)。

在本说明书和权利要求中，当可理解「及/或」(and/or)一词是指结合元素中的「任一或二者」(either or both)，亦即在某些情况下元素为共同存在，在其他情况下元素则为分开存在。当多个元素与「及/或」(and/or)共同表述时，应以相同的方式进行解释，即结合元素中的「一或多个」(one or more)。除了以「及/或」(and/or)子句特定连接的元素外，亦可任选地包含其他元素，而不论其与特定连接的该些元素是否有关联性。因此，作为非限制性的例示，当与诸如「包含」(comprising)等开放式语言结合使用时，提及「A及/或B」在一实施例中可能仅仅涉及A(可选地包含不同于B的元素)；在另一实施例中可能仅仅涉及B(可选地包含不同于A的元素)；在另一实施例中可能涉及A及B二者(可选地包含其他元素)等。

当在本文的说明书和权利要求中使用时，「或」(or)应当被理解为具有与上述定义的「及/或」(and/or)相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，「或」(or)或「及/或」(and/or)应当被解释为包含，即包含至少一个，但是也包含若干元素或元素列表中的超过一个元素，以及可任选地附加的未列表项目。除非有相反的明确教示(例如「仅其中之一」(onlyone of或exactly one of)，或者当用在权利要求中时，「由……组成」(consisting of))仅涉及包含若干元素或元素列表中的单一个元素。通常，当有诸如「任一」(either)、「其中之一」(one of)、「仅其中之一」(only one of或exactly one of)等排他性词汇置前时，本文中使用的词汇「或」(or)应当仅解释为指示排他性可替换项(即「一或另，而非二者」(one orthe other but not both))。当在权利要求中使用时，「主要是由……组成」(consistingessentially of)应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。

在本说明书和权利要求中，当可理解，若以「至少一」(at least one)连接具有一或多个元素的列表时是指选自该元素列表的元素中任何一个或多个的至少一个元素，但是不必然包含该元素列表中特定列出的各元素中的至少一个，且不排除该元素列表中元素的任何组合。这个定义也允许可任选地存在与「至少一」(at least one)词汇所涉及的元素列表内特定标识的元素不同的元素，而不论其是否与特定标识的该些元素具有关联性。因此，作为非限制性例示，「A及B中至少一个」(或者等效地「A或B中至少一个」，或者等效地「A及/或B中至少一个」)在一实施例中可以涉及至少一个A，可任选地包含超过一个A，其中B不存在(并且可任选地包含不同于B的元素)；在另一实施例中涉及至少一个B，可任选地包含超过一个B，其中A不存在(并且可任选地包含不同于A的元素)；在另一实施例中涉及至少一个A，可任选地包含超过一个A，以及至少一个B，可任选地包含超过一个B(并且可任选地包含其他元素)等。

当可理解，除非有相反的明确教示，在本文要求保护的包含超过一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作被记载的顺序。

在权利要求及上述说明书中，所有过渡词汇(例如「包含」(comprising,including,containing)、「带有」(carrying)、「具有」(having)、「涉及」(involving)、「持有」(holding)、「由……构成」(composed of)等)都应当被理解为开放式的，即表示包含但不限于。如美国专利局专利审查程序手册2111.03节中所述，只有过渡词汇「由……组成」(consisting of)及「主要是由……组成」(consisting essentially of)应当分别为封闭式或者半封闭式的过渡词汇。

序列表

<110> 台湾地区“中央研究院”

<120> 用于心脏再生的治疗性基因混合制剂

<130> A0988.70070WO00

<140> 未指定

<141> 同时提交

<150> US 62/149,854

<151> 2015-04-20

<160> 7

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

caatagagag atccaacata a 21

<210> 2

<211> 801

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu

1 5 10 15

Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro

20 25 30

Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys

35 40 45

Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile

50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Pro Lys

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Pro Ala Ala Arg Asp Val Asn Leu Pro Arg Pro Pro Gly Ala Leu Cys

145 150 155 160

Glu Gln Lys Arg Glu Thr Cys Ala Asp Gly Glu Ala Ala Gly Cys Thr

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Ile Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ile Gln Trp Leu Arg Lys Met Ser Ser

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Asp Gly Leu Gly Ser Arg Ser Ile Lys Gln Glu Met Glu Glu Lys Glu

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210 215 220

Pro Ser Ala Ser Trp Gln Asn Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Tyr Ser

225 230 235 240

Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile Asn Ser Thr Glu Arg Lys Arg

245 250 255

Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr Trp Ile Glu Asp His Phe Pro Tyr

260 265 270

Phe Lys His Ile Ala Lys Pro Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn

275 280 285

Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys

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Asp Gln Val Phe Lys Pro Leu Asp Pro Gly Ser Pro Gln Leu Pro Glu

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Leu Ala Ala Ser Leu Met Ser Ser Glu Leu Ala Arg His Ser Lys Arg

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Val Arg Ile Ala Pro Lys Val Phe Gly Glu Gln Val Val Phe Gly Tyr

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Gln

<210> 3

<211> 748

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

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Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro

20 25 30

Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

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Pro Gln Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu Ile Ser Val Pro

675 680 685

Phe Gly Asn Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asp Val Pro Lys Pro Gly Ser

690 695 700

Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr Glu

705 710 715 720

Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu

725 730 735

Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp Asn

740 745 750

Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln

755 760

<210> 5

<211> 155

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Lys Val Ala Ser Gly Ser Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Pro Ser

1 5 10 15

Cys Ala Leu Lys Ala Gly Lys Thr Ala Ser Gly Ala Gly Glu Val Val

20 25 30

Arg Cys Leu Ser Glu Gln Ser Val Ala Ile Ser Arg Cys Ala Gly Gly

35 40 45

Ala Gly Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Glu Gln Gln Val Asn Val

50 55 60

Leu Leu Tyr Asp Met Asn Gly Cys Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Val

65 70 75 80

Pro Thr Leu Pro Gln Asn Arg Lys Val Ser Lys Val Glu Ile Leu Gln

85 90 95

His Val Ile Asp Tyr Ile Arg Asp Leu Gln Leu Glu Leu Asn Ser Glu

100 105 110

Ser Glu Val Gly Thr Pro Gly Gly Arg Gly Leu Pro Val Arg Ala Pro

115 120 125

Leu Ser Thr Leu Asn Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ala Glu Ala Ala

130 135 140

Cys Val Pro Ala Asp Asp Arg Ile Leu Cys Arg

145 150 155

<210> 6

<211> 149

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Lys Val Ala Ser Gly Ser Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Pro Ser

1 5 10 15

Cys Ala Leu Lys Ala Gly Lys Thr Ala Ser Gly Ala Gly Glu Val Val

20 25 30

Arg Cys Leu Ser Glu Gln Ser Val Ala Ile Ser Arg Cys Ala Gly Gly

35 40 45

Ala Gly Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Glu Gln Gln Val Asn Val

50 55 60

Leu Leu Tyr Asp Met Asn Gly Cys Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Val

65 70 75 80

Pro Thr Leu Pro Gln Asn Arg Lys Val Ser Lys Val Glu Ile Leu Gln

85 90 95

His Val Ile Asp Tyr Ile Arg Asp Leu Gln Leu Glu Leu Asn Ser Glu

100 105 110

Ser Glu Val Gly Thr Pro Gly Gly Arg Gly Leu Pro Val Arg Ala Pro

115 120 125

Leu Ser Thr Leu Asn Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ala Glu Val Arg

130 135 140

Ser Arg Ser Asp His

145

<210> 7

<211> 464

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Met Ser Leu His Phe Leu Tyr Tyr Cys Ser Glu Pro Thr Leu Asp Val

1 5 10 15

Lys Ile Ala Phe Cys Gln Gly Phe Asp Lys Gln Val Asp Val Ser Tyr

20 25 30

Ile Ala Lys His Tyr Asn Met Ser Lys Ser Lys Val Asp Asn Gln Phe

35 40 45

Tyr Ser Val Glu Val Gly Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr

50 55 60

Gln Asn Leu Lys Pro Ile Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala

65 70 75 80

Ala Tyr Asp Ala Val Leu Asp Arg Asn Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser

85 90 95

Arg Pro Phe Gln Asn Gln Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Leu

100 105 110

Val Leu Met Lys Cys Val Asn His Lys Asn Ile Ile Ser Leu Leu Asn

115 120 125

Val Phe Thr Pro Gln Lys Thr Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val Tyr Leu

130 135 140

Val Met Glu Leu Met Asp Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Glu

145 150 155 160

Leu Asp His Glu Arg Met Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly

165 170 175

Ile Lys His Leu His Ser Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro

180 185 190

Ser Asn Ile Val Val Lys Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe

195 200 205

Gly Leu Ala Arg Thr Ala Gly Thr Ser Phe Met Met Thr Pro Tyr Val

210 215 220

Val Thr Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr

225 230 235 240

Lys Glu Asn Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met

245 250 255

Val Arg His Lys Ile Leu Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Asp Gln Trp

260 265 270

Asn Lys Val Ile Glu Gln Leu Gly Thr Pro Cys Pro Glu Phe Met Lys

275 280 285

Lys Leu Gln Pro Thr Val Arg Asn Tyr Val Glu Asn Arg Pro Lys Tyr

290 295 300

Ala Gly Leu Thr Phe Pro Lys Leu Phe Pro Asp Ser Leu Phe Pro Ala

305 310 315 320

Asp Ser Glu His Asn Lys Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu

325 330 335

Ser Lys Met Leu Val Ile Asp Pro Ala Lys Arg Ile Ser Val Asp Asp

340 345 350

Ala Leu Gln His Pro Tyr Ile Asn Val Trp Tyr Asp Pro Ala Glu Val

355 360 365

Glu Ala Pro Pro Pro Gln Ile Tyr Asp Lys Gln Leu Asp Glu Arg Glu

370 375 380

His Thr Ile Glu Glu Trp Lys Glu Leu Ile Tyr Lys Glu Val Met Asn

385 390 395 400

Ser Glu Glu Lys Thr Lys Asn Gly Val Val Lys Gly Gln Pro Ser Pro

405 410 415

Ser Gly Ala Ala Val Asn Ser Ser Glu Ser Leu Pro Pro Ser Ser Ser

420 425 430

Val Asn Asp Ile Ser Ser Met Ser Thr Asp Gln Thr Leu Ala Ser Asp

435 440 445

Thr Asp Ser Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly Pro Leu Gly Cys Cys Arg

450 455 460

Claims (19)

1.一种组合物的用途，其可用以制备一药物以促进一个体的心脏再生，其中该组合物包含以下所有成分：

(i)一FoxM1增强子，

(ii)一Id1增强子，以及

(iii)一JNK3抑制剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该FoxM1增强子是一FoxM1多肽或一用以制备该FoxM1多肽的表达载体。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该Id1增强子是一Id1多肽或一用以制备该Id1多肽的表达载体。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该JNK3抑制剂是一对JNK3具有专一性的shRNA。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

该组合物包含该FoxM1增强子，该Id1增强子以及该JNK3抑制剂，

其中，

该FoxM1增强子是一FoxM1多肽，

该Id1增强子是一Id1多肽，以及

该JNK3抑制剂是一对JNK3具有专一性的shRNA；以及

该药物包含一或多用以制备该FoxM1多肽、该Id1多肽及该对JNK3具有专一性的shRNA的表达载体。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，该一或多表达载体是病毒载体或非病毒载体。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，该病毒载体是腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该个体是一罹患心肌梗塞、疑似罹患心肌梗塞或有罹患心肌梗塞的风险的人类病患。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，是将该组合物投予至一发生或疑似发生心脏退化性疾病的位置。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该个体是一新生个体。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该个体是一成熟个体。

12.一种用以促进心脏再生的试剂盒，包含以下所有成分：

(i)一FoxM1增强子，

(ii)一Id1增强子，以及

(iii)一JNK3抑制剂。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，该FoxM1增强子是一FoxM1多肽或一用以制备该FoxM1多肽的表达载体。

14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，该Id1增强子是一Id1多肽或一用以制备该Id1多肽的表达载体。

15.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，该JNK3抑制剂是一对JNK3具有专一性的shRNA。

16.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含

该FoxM1增强子，该Id1增强子以及该JNK3抑制剂，

其中，

该FoxM1增强子是一FoxM1多肽，

该Id1增强子是一Id1多肽，以及

该JNK3抑制剂是一对JNK3具有专一性的shRNA；以及

用以制备该FoxM1多肽、该Id1多肽及该对JNK3具有专一性的shRNA的表达载体。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，该表达载体是病毒载体或非病毒载体。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，该病毒载体是腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体。

19.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒更包含使用操作说明，据以对一个体投予该FoxM1增强子、该Id1增强子及该JNK3抑制剂以促进心脏再生。

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