KR101699567B1 - ＪｕｎＢ의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 JunB의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서 보다 구체적으로 본 발명은 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 JunB 단백질에 대한 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 면역질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, JunB의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 면역질환을 유발하는 Th17 세포의 분화를 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하며, 염증성 자가 항체를 억제하고, 항원에 의한 면역세포의 증식을 억제하는 활성이 우수하여, 면역조절 이상으로 유발되는 각종 면역질환을 치료하기 위한 치료제의 제조에 널리 활용할 수 있다.

Description

ＪｕｎＢ의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Immune Disease Comprising ＪｕｎＢ inhibitor}

본 발명은 JunB의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있지만, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다. 면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다(Wollenberg 2008).

현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용으로 인해 비경제적이고 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성, 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역 질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제 및 새로운 면역질환의 치료방법의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 면역질환을 치료할 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중, JunB 유전자의 발현을 억제하는 경우 면역질환 증상을 치료 할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 JunB 유전자의 발현 억제제 또는 JunB 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 상기 조성물을 면역질환에 걸린 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 JunB 단백질에 대한 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 JunB 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 폴리펩티드를 암호화하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 짧은 헤어핀 RNA는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 또는 JunB 단백질에 대한 항체는 JunB 유전자의 발현 또는 JunB 단백질의 활성 억제를 통해 Th17 세포분화를 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하고, 염증성 자가 항체를 억제하고, 항원에 의한 면역세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 자가면역성 간염, 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스로부터 선택된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 상기 조성물을 면역질환에 걸린 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 JunB 단백질에 대한 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 면역질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, JunB의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 면역질환을 유발하는 Th17 세포의 분화를 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하며, 염증성 자가 항체를 억제하고, 항원에 의한 면역세포의 증식을 억제하는 활성이 우수하여, 면역조절 이상으로 유발되는 각종 면역질환을 치료하기 위한 치료제의 제조에 널리 활용할 수 있다.

도 1은 CD4+ T 세포로부터 분화 유도된 Th17 세포를 대상으로 세포 내에서 발현되는 JunB의 mRNA의 양과 JunB의 발현 증가에 따른 IL-17 사이토카인의 생성 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 관절염이 유도된 마우수의 비장 조직 내에서 JunB와 IL-17을 동시에 발현하고 있는 세포들을 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 JunB의 발현을 억제시킨 T 세포를 대상으로 IL-17 사이토카인의 생성 억제 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 JunB를 과발현시킬 수 있는 발현 벡터와 JunB의 발현을 억제시킬 수 있는 벡터로 형질 도입된 T 세포 내에서 JunB의 발현 여부에 따른 IL-17의 프로모터 활성 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 관절염을 유도한 마우스 동물 모델에 JunB의 발현을 억제시킬 수 있는 벡터를 주입하고, MOCK 벡터를 주입한 대조군과 관절염의 증상 정도를 비교하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 관절염을 유도한 마우스 동물 모델에 JunB의 발현을 억제시킬 수 있는 벡터를 주입하고 JunB가 억제된 마우스 군에서 관절의 파괴 정도와 염증성 세포의 침윤 억제 정도를 사프라닌 O와 톨루딘 블루 방법의 염색법으로 염색하고 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 관절염이 유도된 마우스 동물 모델에서 혈청을 분리하고 혈청 내 CII 특이적인 염증성 항체의 발현양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 관절염이 유도된 마우스 동물 모델에 JunB의 발현을 억제시킬 수 있는 벡터를 주입하고 대조군 벡터를 주입한 군과 비교하여 항원 특이적인 면역세포의 증식 정도를 FACs 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 관절염이 유도된 마우스 동물 모델에 JunB의 발현을 억제시킬 수 있는 벡터 및 대조군 벡터를 각각 주입시킨 후, IL-17의 생성 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 이식편대숙주질환의 마우스 동물 모델을 대상으로 JunB의 발현을 억제시킨 경우, 이식거부반응이 억제됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 새로운 면역질환의 치료제 및 치료방법을 제공하는 것으로서, JunB의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제가 면역질환의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있음을 규명하였다는 점에 특징이 있다.

본 발명에서 면역질환 치료제로서 타겟팅 한 JunB는 Jun 단백질에 속하는 것으로서, Jun 단백질의 공통구조는 그 DNA 결합영역이고, 염기성 아미노산이 풍부한 영역과 인접한 류신지퍼로 구성되어 있다. Jun 단백질은 류신지퍼를 매개로 2합체를 형성하고 있으며, 염기성 영역을 매개로 특이적 DNA 배열(TGACTCA와 유사한 배열)과 결합한다. DNA에 결합한 Jun은 전사를 활성화하지만그 강도는 c-Jun＞JunD＞JunB의 순인 것으로 알려져 있다. 또한, Jun은 유연(類綠)한 Fos 패밀리단백질과 가장 안정된 헤테로이합체를 형성하여 DNA에 강하게 결합하지만 그 전사조절능은Fos 패밀리 멤버에 의해 결정된다. 또한, jun이라는 명칭은 17(junana)에서 유래한것으로서, jun 단백질은 과잉 발현 혹은 재편성에 의해 세포를 형질전환하는 능력을 갖는다는 점에서 세포증식을 촉진적으로 조절하는 것으로 학계에서는 보고 있다.

한편, 본 발명에서는 Jun 단백질 중에서 JunB의 발현을 면역세포 내에서 억제시키는 경우, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 JunB가 결핍된 세포에서는 IL-17의 프로모터 활성을 감소시키는 기작을 통해 IL-17의 생성(발현)을 억제시킨다는 사실을 확인하였다(실시예 3 및 4 참조).

또한, 본 발명의 일실시예에서는 Th17 세포의 경우, Treg 세포와는 달리 면역질환에서 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키고 있어, 이러한 Th17 세포에서 JunB의 발현 정도를 분석해 보았는데, 그 결과, JunB가 CD4+ T 세포를 Th17 세포로 분화 촉진하는 능력을 가지고 있다는 것을 알 수 있었고, 분화된 Th17 세포에서 JunB와 IL-17 사이토카인이 동시발현되고 있다는 것을 알 수 있었다(실시예 1 및 실시예 2 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 JunB가 면역질환의 증상을 가속화시키는 작용을 한다는 사실에 착안하여, 이러한 JunB의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 면역반응 또는 염증반응을 억제함을 통해 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 면역질환의 일예인 관절염 마우스 동물모델을 제작한 후, 상기 마우스에 JunB의 mRNA를 타겟팅 하여 이의 발현을 억제할 수 있는 벡터를 제작하고 이를 관절염 마우스에 주입한 한 다음, 관절염의 증상 정도를 분석한 결과, MOCK 벡터(대조군)를 주입한 대조군 마우스에 비해 JunB의 발현을 억제시킨 마우스의 경우, 관절염 지수가 현저하게 감소한 것으로 나타났다(도 5 참조).

또한, 다른 일실시예에서는 이로한 관절염의 치료 효과 기작을 보다 구체적으로 살펴보기 위해 JunB의 발현을 억제시킨 마우스와 대조군 마우스를 대상으로 관절의 파괴정도와 관절 내 염증성 세포의 침윤 정도를 분석한 결과, JunB의 발현을 억제시킨 마우스 군에서 관절의 파괴정도와 염증성 세포의 침윤이 대조군에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다(도 6 참조).

나아가 본 발명자들은 관절염 이외의 다른 자가면역질환인 이식편대숙주질환의 마우스 모델을 제조한 후, JunB의 발현을 억제시킬 수 있는 벡터와 JunB를 과발현 시킬 수 있는 벡터를 주입하고 이식면역거부 반응을 관찰한 결과, JunB를 과발현 시킨 군은 이식면역거부 반응이 증가하는 것으로 나타난 반면, JunB의 발현을 억제시킨 군은 이식면역거부 반응이 현저하게 감소된 것으로 나타났다(도 10 참조).

따라서 이러한 실험들을 통해 본 발명자들은 궁극적으로 JunB의 발현을 억제하는 방법을 통해 관절염, 이식편대숙주질환 등 자가면역질환을 포함하는 면역반응이상에 의한 면역질환을 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 JunB의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 보다 구체적으로 본 발명은 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 JunB 단백질에 대한 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 JunB 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있고, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 폴리펩티드를 암호화하는 것일 수 있다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에서 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용되는 것으로, 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)을 말한다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되고 있다(Hogrefe, 1999). 상기 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있다.

따라서 본 발명에서 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함 할 수 있으며, 또한 상기 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당분야에 널리 알려져 있고 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티(moiety)의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

또한 상기 JunB 유전자에 대한 억제제는 이에 한정되지 않지만 JunB 유전자에 대한 siRNA(small interfering RNA)일 수 있으며 또한 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 짧은 헤어핀 RNA일 수 있는데, 본 발명의 일실시예에서는 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 짧은 헤어핀 RNA로서 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 JunB 유전자의 발현을 억제시켰다.

상기 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다. 또한, 많은 회사들이 상업적으로 siRNA 합성을 제공하고 있으며, 특히 Eurogentec, Ambion, Dharmacon, 또는 Qiagen과 같은 회사가 있다.

상기 siRNA는 상대적으로 낮은 농도로도 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 얻을 수 있는 효과와 동등하거나 높은 효과를 얻을 수 있기 때문에 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 대안으로 제시되고 있으며(Thompson, 2002), 상기 siRNA는 질병의 동물 모델에 있어서 유전자 발현을 저해하기 위해 널리 이용되고 있다. 상기 siRNA의 전달 및 siRNA를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, 미국 출원 제2004/106567 및 2004/0086884는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터를 제공하고 있다.

당업자는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue): W113-W120.) 또한 당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예컨대, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 그의 결합)을 용이하게 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 JunB 유전자의 저해제는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다. 따라서 종래 당해 기술 분야에서 상기 유전자의 저해제로 알려진 화합물 또한 이용 가능하다.

뿐만 아니라 본 발명의 면역질환 예방 또는 치료용 조성물에 포함될 수 있는 유효성분으로 JunB 단백질에 대한 억제제가 포함될 수 있는데, 이러한 억제제로는 이에 한정되지는 않지만, 핵산, 화합물, 천연물 또는 단백질 등일 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질에 대한 억제제는 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체일 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.

한편, 본 발명에서 상기 “면역질환”은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 “자가면역질환“이라고 한다.

또한, “염증성 질환”이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

또한, 본 발명에서 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 자가면역성 간염, 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 상기 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 “치료”란 용어는“치료하는”이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 “치료”또는 “치료요법”은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 JunB 유전자의 발현 억제제 또는 JunB 단백질의 활성 억제제를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 JunB 유전자의 발현 억제제 또는 JunB 단백질의 활성 억제제의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 암 또는 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 면역질환에 걸린 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

Th17 세포에서 JunB 의 발현과 IL -17의 생성에 미치는 영향 분석

자가면역질환과 같이 면역 반응 이상에 의한 질환에 있어서 JunB의 억제가 이러한 질환들을 치료할 수 있는 효과가 있는지 확인하기 위해, 자가면역질환과 관련된 Th17 세포에서 JunB의 발현정도와 JunB 발현 증가에 따른 IL-17의 발현수준을 다음과 같은 방법을 통해 확인하였다.

<1-1> PCR 방법에 의한 JunB 의 발현정도 분석

먼저 마우스로부터 비장을 분리하고 이를 분쇄하여 세포를 얻은 후, 세포를 anti-mouse CD4 마이크로비드와 4℃에서 15분간 반응시키고, 세척한 다음 autoMACs 로 양성분획을 회수하였다. 분리된 CD4+ 세포 분획을 PBS로 세척하고 55℃에서 30분 동안 불활성화시킨 우태아혈청을 5%가 되도록 하고 페니실린(100U/ml) 및 스트렙토마이신(10g/ml)이 포함된 세포 배양액(RPMI1640배지, Gibco BRL, USA)에서 배양하였다. Th17세포로의 분화를 위해 1x10⁶의 세포를 24웰 플레이트에 배양하였으며 항-CD3가 코팅 처리된 23웰 플레이트에 항-CD28 항체(1ug/ml), 항IFNg 항체(2ug/ml), 항IL-4 항체(2ug/ml, 항IL-2 항체(2ug/ml), IL-6(20ng/ml), TGF-beta1(2ng/ml)를 처리하여 3일 배양하였다.

이후, CD4+T 세포에서 분화 유도된 Th17세포 내의 JunB 발현 증가 확인을 위해, 상기 분화 유도된 Th17 세포로부터 RNA를 추출한 다음, 마우스 JunB 및 대조군인 β-actin을 증폭할 수 있는 하기 표에 기재된 프라이머들을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였으며, 실시간 중합효소반응을 위한 반응액은 총 25 μl가 되도록 하였고, 용액의 조성은 2.5 μl의 10x 반응버퍼, 0.5 mM의 dNTP 및 각 프라이머 쌍을 사용하였으며, 증폭은 ABI StepOnePlus 기기를 사용하여 94℃에서 10분간 반응, 94℃에서 15초 반응 및 60℃에서 45초간의 반응을 40회 반복 수행하였다.

프라이머 서열

프라이머	프라이머 서열	서열번호
junB 센스	5′- ATGTGCACGAAAATGGAACA -3'	3
junB 안티센스	5’- CCTGACCCGAAAAGTAGCTG -3'	4
β-actin 센스	5'- GAAATCGTGCGTGACATCAAAG -3'	5
β-actin 안티센스	5'- TGTAGTTTCATGGATGCCACAG -3'	6

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 Th17로 분화된 세포의 경우 JunB의 발현이 증가한 것으로 나타났다.

<1-2> JunB 과발현 시 Th 17 분화에 미치는 영향 분석

상기 실시예 <1-1>의 결과를 통해 분화된 Th17세포에서는 JunB의 발현이 증가되는 것으로 나타났고, 따라서 본 발명자들은 JunB의 발현과 IL-17의 발현이 상관관계가 있는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 코돈 최적화로 포유류 세포에서 발현이 잘되도록 한 JunB 염기서열로 재조합 유전자를 합성하였다(Genscript, USA). 이후 시퀀싱 분석을 통해 JunB 유전자가 맞는지 확인 후 Hindlll와 Xhol의 제한 효소를 이용하여 JunB 유전자 부위를 절단한 후, pcDNA3.1+ 벡터에 삽입하여 JunB 과발현 재조합 벡터를 제조하였고, 재조합 벡터로 E.coli를 형질 전환 시킨 다음, 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하였다. 그리고 재조합된 유전자의 염기서열을 분석한 뒤, JunB 유전자의 염기서열이 정확한 재조합 플라스미드를 선택한 다음 이를 NIH 3T3 마우스 섬유아세포에 형질도입하여 상기 섬유아세포내에서 JunB를 과발현 시킨 다음, JunB를 가장 많이 발현시킬 수 있는 고효율의 pcDNA3.1+HA-mJunB 재조합벡터를 선택하였다. 그리고 이를 배양하여 다량의 플라스미드 벡터 DNA를 확보하였다. 이후 세포 내에서 JunB를 과발현 시킬 수 있는 재조합 벡터를 LBRM(mouse T lymphoma cell line)에 형질삽입 시키고 하루 뒤 Th17세포로의 분화 조건 하에서 분화시킨 다음, 3일 배양하였다. 세포를 회수하여 RNA를 추출하고 하기 표 2에 기재된 프라이머들을 사용하여 실시간중합효소반응으로 IL-17의 발현을 확인하였다.

프라이머 서열

프라이머	프라이머 서열	서열번호
IL-17 센스	5′- CCTCAAAGCTCAGCGTGTCC -3'	7
IL-17 안티센스	5’- GAGCTCACTTTTGCGCCAAG -3'	8

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 JunB 유전자를 과발현시킬 경우, 세포 내에서 Th17 세포의 분화 마커가 되는 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현도 현저히 증가하는 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 Th17 분화 유도된 세포의 경우, 상기 세포 내에서 JunB 유전자가 과발현되어 있으며, 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현도 증가되어 있다는 사실을 통해 JunB가 Th17로의 분화를 촉진하는 능력을 가지고 있음을 예상할 수 있었다. 또한, 이러한 사실을 통해 본 발명자들은 JunB의 조절을 통해 면역작용의 이상으로 유발되는 염증 또는 자가면역질환의 증상을 개선, 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상하였다.

<실시예2>

Th17세포에서 JunB와 IL-17가 동시에 발현되는 세포의 확인

본 발명자들은 JunB에 의한 면역반응 증가 확인을 위해, type ll collagen으로 유발된 관절염 마우스 유도 모델의 비장 조직을 사용하여 JunB와 IL-17이 함께 발현하는 세포의 존재를 확인하였다. 이를 위해 관절염이 유발된 마우스의 비장 조직을 동결조직 포매제(OCT compound)로 포매 시킨 후, 액화질소로 급속 냉각시키고, 냉동 절편기를 이용하여 7um 두께로 자른 후 슬라이드에 부착시켰다. 이후, 절편을 아세톤으로 고정시킨 다음, 10% 정상 염소 혈청으로 30분간 비특이적 반응을 차단시켰다. 이후 첫번째 항체로 FITC-labeled anti-JunB Ab, PE-labeled anti-IL-17 Ab, PerCP-labeled anti-CD4 Ab(BD Biosciences, San Jose, CA)를 PBS(pH7.5)에 1:100로 희석한 후 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS로 세척한 다음 이차항체를 상온에서 2시간 반응시킨 후 PBS로 한번 세척한 뒤 DAPI로 봉입하였다. 염색한 조직을 공초점 현미경으로 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 관절염이 유도된 마우스의 비장에는 IL-17와 JunB가 함께 발현되는 세포가 존재하고 있음을 알 수 있었다.

따라서 JunB의 발현은 면역질환을 초래하는 작용을 할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 JunB는 IL-17의 생성작용과 관련성이 있을 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

JunB 억제에 의한 IL-17 생성 억제정도 분석

앞서 수행한 실시예들의 결과를 통해 JunB가 Th17세포에서 발현이 증가되어 있고 IL-17의 발현을 증가시킬 수 있다는 사실에 기초하여 JunB를 억제할 경우 면역반응 제어를 통해 면역질환을 치료할 수 있을 것으로 착안하여, 본 발명자들은 JunB를 억제시켰을 때 나타나는 IL-17의 생성억제 정도를 분석하였다.

이러한 분석을 위해 JunB를 억제하는 shRNA lenti viral particle(santa cruz)과 polybrene(5ug/ml)을 같이 CD4+ T세포에 넣어주어 JunB가 억제되도록 한 뒤 Th17 세포 분화조건을 만들어 준 다음 3일 동안 배양하였고, IL-17의 발현 수준을 조사하였가.

그 결과, 대조군으로 사용한 sh lenti viral particle로 감염시켰을 때와 비교하였을 때, sh JunB로 JunB의 발현을 억제시킨 경우, IL-17의 발현이 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도 3a).

또한, 이러한 결과는 다음과 같은 실험을 통해서도 확인할 수 있었는데, 즉, JunB의 발현 억제를 위한 JunB 짧은 헤어핀 RNA 올리고를 디자인하였다. Genelink사의 프로그램을 이용해 디자인하였고 그 서열은 하기 기재된 바와 같다.

JunB sh RNA 서열(서열번호: 9); 5‘-GAAATGGAACAGCCTTTCTATCACGACGACTCAAGAGGTCGTCGTGATAGAAAGGCTGTTCCATTTTTTTTT-3’

상기 JunB sh RNA 서열을 Age1과 EcoRl의 제한효소를 이용해 lenti virus vector(pLK0.1)에 옮겨주었고, 이렇게 만들어진 JunB shRNA 벡터를 LBRM T세포주에 형질도입하여 JunB가 억제되는 세포를 만들어주었으며, 세포에 Th17세포로의 분화조건을 만들어 준 다음 3일 동안 배양한 뒤 IL-17의 생성을 real time PCR로 확인하였다.

그 결과, 앞서 실험한 결과와 마찬가지로 sh JunB의 처리로 인해 JunB가 억제 되었을 때 IL-17의 생성 또한 현저히 감소한 것으로 나타났다(도 3b 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 JunB가 세포내에서 Th17세포로의 분화를 촉진하는 기능을 가지고 있음을 발견하였고, 궁극적으로 JunB의 발현을 억제할 경우 염증성 세포인 Th17세포의 분화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예4 >

루시퍼라제 분석을 통한 JunB의 IL-17 발현에 미치는 영향분석

상기 실시예들을 통해 JunB가 IL-17의 발현에 영향을 미친다는 사실을 확인하였는데 이러한 작용이 직접적 또는 간접적인 작용에 의한 것인지 확인하기 위하여 루시퍼라제(Luciferase) 분석을 통해 IL-17 프로모터의 활성을 측정하였다. 먼저 IL-17 생성에 미치는 JunB의 역할 확인하기 위해, JunB 과발현 벡터 및 sh JunB 벡터를 각각 과발현시킨 LBRM(Tcell lymphoma)세포에 pGL4 mIL-17 2kb promoter+ CNS-5 벡터(Addgene plasmid #20128)와 대조군 Renilla 벡터를 형질 삽입한 다음 PMA(25ng/ml)와 Ionomycin(250nd/ml)로 4시간 자극한 뒤 얻은 단백질 용해액을 가지고 dual 루시퍼라제 분석을 통해 IL-17 프로모터의 활성을 분석하였다.

그 결과, 대조군 벡터를 사용한 경우에 비해 JunB가 과발현된 세포의 경우, IL-17 프로모터의 활성은 증가하는 것으로 나타난 반면, JunB가 knockdown된 세포에서는 IL-17 프로모터의 활성이 감소한 것으로 나타났다. 이로써 본 발명자들은 JunB가 직접적으로 IL-17의 프로모터에 작용하여 IL-17 프로모터의 활성을 감소시키는 것을 알 수 있었다(도 4 참조).

<실시예5>

JunB의 억제를 통한 관절염의 치료효과 분석

실제로 JunB의 억제가 관절염을 억제 또는 치료하는 효과가 있는지를 확인하기 위해, 관절염 생체모델에서 JunB의 발현억제에 따른 관절염 증상 개선 정도를 조사하였다. DBA1/J 마우스에 제 2형 콜라겐을 피내 주사하여 관절염을 유도한 다음, 관절염 유도 후 8일째에 히드로다이나믹 주입(Hydrodynamic injection) 기법을 이용하여, 상기 <실시예 3>에서 제조한 JunB의 발현 억제용 JunB shRNA 벡터를 100㎍ 정맥 주사 하였다. 이때 대조군으로는 MOCK 벡터를 주사하였다. 그리고 관절염을 유도한 후 14일과 18일째에는 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 벡터 100㎍을 다리 관절 근육에 각각 주입하였다. 이후 관절염 지수를 평가하였는데, 평가는 관절염 유도 후부터 진행하였으며, 지수는 1점에서 4점까지 평가하여 그래프로 나타내었다.

각 군의 관절염 지수를 평가한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, JunB의 발현이 억제된 경우(JunB 발현 억제 벡터가 주사된 마우스 군) 관절염 지수는 MOCK 벡터를 주사한 대조군에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다.

< 실시예 6>

관절염 생체모델에서 관절염 파괴 억제와 염증 억제 효과 분석

상기 <실시예5>를 통해 JunB의 발현 억제가 관절염의 억제에 중요한 기능을 한다는 것을 확인하였고, 나아가 이러한 억제가 관절 조직에서 관절의 파괴와 염증성 세포 억제 기작에 의한 것인지 알아보기 위해, 각 군의 마우스 관절을 채취하여 이들 관절을 10 % 중성완충포르말린에 고정시킨 후, EDTA로 뼈를 탈회시켰다. 이후 파라핀에 포매하고, 관절 조직을 7㎛ 두께의 절편으로 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본 염색을 진행하기 전에 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과시킨 다음, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰다. 염색과정은 헤마톡실린과 에오진 염색을 진행하였고, 연골에 포함된 프로토글리칸을 감지할 수 있는 Safranin O과 Toluidine blue 방법을 사용하였다.

각 군의 관절 조직을 평가해 본 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 관절염 지수와 마찬가지로 관절 조직에서도 JunB의 발현이 억제된 마우스 군에서 관절의 파괴 정도가 확연히 억제 되는 것으로 나타났고, 특히 염증성 세포들의 침윤이 억제 되어 있는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 JunB의 억제가 관절염 발생을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 관절의 파괴와 관절 내 염증성 세포의 침윤을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

염증성 자가 항체 생성의 억제 분석

관절염 생체모델에서 혈청 내 JunB 억제에 의해 염증성 자가 항체 생성이 억제되는지 알아보기 위해, 상기 <실시예 5>의 관절염이 유도된 마우스를 대상으로 관절염이 유도된 지 3주가 경과한 후, 각 마우스 군에서 혈액을 채취하고 원심 분리기를 이용하여 혈청을 분리하였으며, 96well plate에 typell collagen을 코팅한 뒤 Bethyl 사에서 제공하는 mouse IgG2a ELISA kit를 이용하여 분리된 혈청 내의 Cll 특이적인 염증성 항체(IgG2a)의 발현 양을 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 JunB가 억제된 마우스 군의 경우 혈청 내 Cll-IgG2a의 발현이 현저하게 억제 되는 것으로 나타났고, 이로써 본 발명에 따른 JunB의 억제는 관절염 동물 모델의 생체 내에서 Cll 항원에 특이적인 염증성 자가 항체를 선택적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 8>

항원특이적인 면역세포의 증식억제

관절염 마우스 모델에서 JunB 억제에 의한 항원특이적인 면역세포의 증식이 억제되는지 알아보기 위해, 상기<실시예5>에서 관절염이 유도된 마우스의 비장세포로부터 수득한 세포를 항원(이형콜라겐)으로 자극 후 증가하는 세포를 CFSE 염색한 다음 FACs 분석을 통해 확인해보았다. 분리된 각 군의 세포는 2X10^6당 0.1% BSA/PBS 1ml에 넣고 CFSE를 5uM 농도가 되게 첨가하였다. 이후 세포를 37℃에서 15분간 반응시켰고, 반응 후 차가운 1% FBS/RPMI로 세척한 다음, CFSE가 염색된 각 군의 세포는 5x10^5 세포로 48well에 도말하였다. 각 세포는 anti CD3와 type II collagen 50ug/ml을 첨가하고 3일간 배양하였다. 배양 후 세포는 FACs caliber를 사용하여 FL1-FITC 채널에서 분석하였으며, 증식되어 왼쪽으로 이동된 세포를 분석 하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 벡터를 주입한 마우스에 비해 JunB의 발현억제 벡터를 주입한 마우스의 경우 면역세포의 증식이 감소되어 있는 것으로 나타났다. 따라서 JunB의 억제는 항원에 의한 면역세포의 증식도 억제하는 것으로서 이는 자가면역질환의 치료에 매우 중요한 역할을 할 것으로 예상할 수 있었다.

< 실시예 9>

관절염 동물모델에서 JunB 억제를 통한 IL - 17발현의 억제

JunB 억제로 인한 IL-17 발현 감소를 생체 내에서 확인하기 위해, 상기 <실시예5>의 JunB 억제 관절염 유도 마우스의 비장조직를 대상으로 IL-17의 발현 수준을 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 즉 마우스 비장을 이용하여 동결절편(Optimal Cutting Temperature compound; O.C.T. compound)을 포매시킨 다음 액화질소에서 조직을 급속 냉각시키고, 냉동 절편기를 이용하여 7㎛ 두께로 슬라이드에 부착하였다. 이후 절편을 아세톤으로 고정시키고, 10% 정상 염소 혈청을 도포하여 30분간 비특이적 반응을 차단하였다. FiTC-labeled anti-CD4 항체와 PE-labeled anti-IL-17로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고 다음 날 PBS 용액으로 세척하고, 염색한 조직을 공초점 현미경으로 분석하였다.

그 결과, 대조군의 비장에서보다 JunB가 억제된 마우스의 비장에서 IL-17 발현 세포가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 JunB가 관절염 마우스 생체 내의 비장에서 IL-17의 발현을 조절함으로 염증을 조절함을 알 수 있었다(도 9 참조).

< 실시예 10>

이식면역거부반응에서 JunB 의 기능 확인

이식면역거부반응에서의 JunB의 기능을 확인하기 위하여 이식거부반응 마우스모델을 구축하였다. BalB/C 마우스에 면역세포의 억제를 위해 마우스를 TBI(total body irraditation) 800 Rad로 1분당 70cGy/mic로 조사하였다. C57BL/6 마우스에서 골수와 비장세포를 분리한 뒤 음성대조군(TCD-BM)에 사용하기 위해 골수세포에서 CD90.2 음성인 세포(T세포가 없는)를 분리하였다. TBI가 조사된 마우스에 골수세포와 비장세포를 TCD-BM(음성대조군)에는 T세포가 없는 골수세포만, 나머지 군에는 골수세포와 비장세포를 1:1 비율로 정맥 주사하였다. 그 다음날 JunB 과발현벡터, JunB 억제 벡터를 각각 정맥 주사하였고 이식면역거부반응 점수를 측정하였다. 지수의 평가는 이식면역거부반응 유도 후부터 진행하였으며, 지수는 1점에서 10점까지 평가하여 그래프로 나타내었다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 이식면역거부반응을 유도한 마우스에서 이식면역거부반응이 잘 유도 된 것으로 나타났으며, 특히 JunB 과발현 마우스에서는 이식면역거부반응이 제일 심하게 발생한 것으로 나타났으며, 반면 JunB 억제 마우스에서는 이식면역거부반응이 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 따라서 이식거부반응에서도 JunB의 억제가 거부 반응 억제에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해 본 발명자들은 JunB의 발현을 억제시킬 수 있다면 관절염과 같은 자가면역질환이나 이식면역거부반응에서 병인을 제어할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of catholic University <120> Composition for Preventing or Treating Immune Disease Comprising JunB inhibitor <130> np12-1036 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1035 <212> DNA <213> JunB DNA sequence <400> 1 atgtgcacga aaatggaaca gcctttctat cacgacgact cttacgcagc ggcgggatac 60 ggtcggagcc ctggcagcct gtctctacac gactacaaac tcctgaaacc caccttggcg 120 ctcaacctgg cggatcccta tcggggtctc aagggtcctg gggcgcgggg tccaggcccg 180 gagggcagtg gggcaggcag ctacttttcg ggtcagggat cagacacagg cgcatctctg 240 aagctagcct ccacggaact ggagcgcttg atcgtcccca acagcaacgg cgtgatcacg 300 acgacgccca cgcctccggg acagtacttt tacccccgtg ggggtggcag cggtggaggt 360 acagggggcg gcgtcaccga ggagcaggag ggctttgcgg acggttttgt caaagccctg 420 gacgacctgc acaagatgaa ccacgtgacg ccccccaacg tgtccctggg cgccagcggg 480 ggtccccagg ccggcccagg gggcgtctat gctggtccgg agccgcctcc cgtctacacc 540 aacctcagca gttactcccc agcctctgca ccctctggag gctccgggac cgccgtcggg 600 actgggagct catacccgac ggccaccatc agctacctcc cacatgcacc accctttgcg 660 ggcggccacc cggcacagct gggcttgagt cgcggcgctt ccgcctttaa agaggaaccg 720 cagaccgtac cggaggcacg cagccgcgac gccacgccgc ctgtgtcccc catcaacatg 780 gaagaccagg agcgcatcaa agtggagcga aagcggctgc ggaacaggct ggcggccacc 840 aagtgccgga agcggaagct ggagcgcatc gcgcgcctgg aggacaaggt gaagacactc 900 aaggctgaga acgcggggct gtcgagtgct gccggtctcc tacgggagca agtggcgcag 960 ctcaagcaga aggtcatgac ccatgtcagc aacggctgcc agttgctgct aggggtcaag 1020 ggacacgcct tctga 1035 <210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> JunB peptide sequence <400> 2 Met Cys Thr Lys Met Glu Gln Pro Phe Tyr His Asp Asp Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Ala Ala Gly Tyr Gly Arg Ser Pro Gly Ser Leu Ser Leu His Asp Tyr 20 25 30 Lys Leu Leu Lys Pro Thr Leu Ala Leu Asn Leu Ala Asp Pro Tyr Arg 35 40 45 Gly Leu Lys Gly Pro Gly Ala Arg Gly Pro Gly Pro Glu Gly Ser Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Tyr Phe Ser Gly Gln Gly Ser Asp Thr Gly Ala Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ala Ser Thr Glu Leu Glu Arg Leu Ile Val Pro Asn Ser Asn 85 90 95 Gly Val Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gly Gln Tyr Phe Tyr Pro 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Val Thr Glu Glu 115 120 125 Gln Glu Gly Phe Ala Asp Gly Phe Val Lys Ala Leu Asp Asp Leu His 130 135 140 Lys Met Asn His Val Thr Pro Pro Asn Val Ser Leu Gly Ala Ser Gly 145 150 155 160 Gly Pro Gln Ala Gly Pro Gly Gly Val Tyr Ala Gly Pro Glu Pro Pro 165 170 175 Pro Val Tyr Thr Asn Leu Ser Ser Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Ser 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Ser Ser Tyr Pro Thr Ala 195 200 205 Thr Ile Ser Tyr Leu Pro His Ala Pro Pro Phe Ala Gly Gly His Pro 210 215 220 Ala Gln Leu Gly Leu Ser Arg Gly Ala Ser Ala Phe Lys Glu Glu Pro 225 230 235 240 Gln Thr Val Pro Glu Ala Arg Ser Arg Asp Ala Thr Pro Pro Val Ser 245 250 255 Pro Ile Asn Met Glu Asp Gln Glu Arg Ile Lys Val Glu Arg Lys Arg 260 265 270 Leu Arg Asn Arg Leu Ala Ala Thr Lys Cys Arg Lys Arg Lys Leu Glu 275 280 285 Arg Ile Ala Arg Leu Glu Asp Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Glu Asn 290 295 300 Ala Gly Leu Ser Ser Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln 305 310 315 320 Leu Lys Gln Lys Val Met Thr His Val Ser Asn Gly Cys Gln Leu Leu 325 330 335 Leu Gly Val Lys Gly His Ala Phe 340 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JunB F primer <400> 3 atgtgcacga aaatggaaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JunB R primer <400> 4 cctgacccga aaagtagctg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta actin F primer <400> 5 gaaatcgtgc gtgacatcaa ag 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta actin R primer <400> 6 tgtagtttca tggatgccac ag 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 F primer <400> 7 cctcaaagct cagcgtgtcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 R primer <400> 8 gagctcactt ttgcgccaag 20 <210> 9 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JunB sh RNA sequence <400> 9 gaaatggaac agcctttcta tcacgacgac tcaagaggtc gtcgtgatag aaaggctgtt 60 ccattttttt tt 72

Claims (8)

1. JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 포함하는 관절염, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 JunB 유전자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것으로 특징으로 하는 관절염, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 관절염, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 JunB 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)는 JunB 유전자의 발현 또는 JunB 단백질의 활성 억제를 통해 Th17 세포분화를 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하고, 염증성 자가 항체를 억제하고, 항원에 의한 면역세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 관절염, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 약학적으로 유효한 양의 제1항의 조성물을 면역질환에 걸린 인간을 제외한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 관절염, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환의 예방 또는 치료방법.

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