KR101627404B1 - Dab2 유전자가 넉 다운된 수지상 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Dab2 유전자가 넉-다운된 수지상 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 Dab2 유전자가 넉-다운(knock-down) 넉-아웃 (knock-out) 혹은 Dab2 단백질의 활성이 저해된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하고, Dab2 유전자가 넉-다운(knock-down) 넉-아웃 (knock-out) 혹은 Dab2 단백질의 활성이 저해된 수지상 세포는 항원 포식, 세포의 임파절 이동성, 염증성 사이토카인 발현 등이 향상될 뿐만 아니라, 암세포를 공격할 수 있는 항원 특이적 세포독성임파구 (CTL) 및 관련 T 세포를 활성화시킬 수 있는바, 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

Dab2 유전자가 넉 다운된 수지상 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for preventing or treating cancers comprising dendritic cells with Dab2 gene silenced}
본 발명은 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 Dab2 유전자가 넉 다운된 수지상 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
수지상 세포(Dendritic Cell, DC)는 항원 특이적인 적응 면역 반응을 개시하는 중요한 전문 항원 제시 세포 (APC)이다. 수지상 세포는 기원, 형태, 표현형, 기능, 성숙화 과정 등에 따라 다양한 특성을 갖는다. 일반적으로 수지상세포는 마우스 골수줄기세포 또는 사람의 단핵구를 추출하여 과립구-마크로파지콜로니 자극인자 (Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)와 IL-4를 첨가한 배지에서 in vitro에서 분화시켜 수지상세포 연구에 사용한다. 그러나 체내에서 골수 줄기세포에서 수지상 세포(DC)로의 분화 및 유지에 대한 in vivo 기전은 거의 알려지지 않았다. 환경이나 유전적 요인도 수지상 세포(DC) 분화에 중요한 인자이지만, 현재까지 잘 알려지지 않고 있다. 수지상 세포(DC)는 상황에 따라 T 세포 반응을 촉진 또는 억제할 수 있어 체내 면역의 항상성을 조절하는 중요한 세포이다. 국부적으로 면역관용 수지상 세포(DC)는 조절 T 세포 (Treg 세포)활성화를 통해 면역억제 혹은 면역관용 기전을 담당하며 이 경우 인터루킨 10 (IL - 10) 또는 transforming growthfactor-β (TGF-β)와 같은 사이토카인 발현으로 면역조절이 진행된다. TGF-β 및 Foxp3을 발현하는 Treg 세포는 면역반응 조절을 담당하며 면역의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다.
한편, Dab2(disabled-2) 유전자는 몇몇 수용체를 통한 신호전달 기전 및 엔도사이토시스에 관여하는 어답터 단백질로 잘 알려져 있다. Dab2 단백질은 N-말단에 저밀도 리포단백질 수용체 (LDL receptor) 및 TGF-β 수용체와 같은 막 단백질과 결합하는 포스포타이로신 결합 도메인을 가지고 있다. 또한 Dab2는 Grb2 같은 SH3 도메인을 가진 단백질과 결합 할 수 있는 프롤린 리치 도메인(PRD)을 C-말단 에 포함하고 있다. Dab2 유전자는 두 종류의 단백질 P96과 P67을 발현한다. 주된 형태인 P96 Dab2 단백질은 성인에서 발현되는 반면, P67 단백질은 배아 발달과정 동안 주로 발현된다.
Dab2 단백질은 뇌, 신장, 난소, 유방 등을 포함한 여러 조직이나 기관의 세포에서 폭넓게 발현된다. Dab2는 여러 종양조직에서 정상조직보다 낮은 발현을 보이며, 정상 세포에서는 Dab2 발현이 세포 증식을 강력히 억제하는 것으로 보아 중요한 종양 억제 인자로 알려져 있다. MAPK 신호전달과정 (Ras - Raf 경로)은 세포의 성장, 증식 및 분화에 중요하게 작용하는 신호전달 기전이다. Dab2는 Sos와 경쟁적으로 성장인자 및 Ras 경로를 조절하는 Grb2와 결합한다. Dab2의 종양 억제 기전은 casein kinase 2 (CK2)에 의해 S1579위치에 인산화된 low-density lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6)와 결합하여 LRP6을 엔도사이토시스 시킴으로써 Wnt/β-catenin 신호전달 의한 LRP6의 엔도사이토시스 기전을 방해함으로써 Wnt에 의한 암 형성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 Dab2의 종양억제 기전은 흉선분화나 T 세포 분화, 생존, 성숙에 핵심적으로 관여하는 Wnt/β-catenin 신호전달 기전의 조절에 대해서는 설명하지 못하고 있다.
한편, 이제까지 암 치료의 대부분은 수술, 항암제 및 방사선 치료가 주종을 이루었다. 그러나, 이러한 치료는 부작용이 따르고, 완치가 어려워 암의 근본적인 치료법은 되지 못하는 실정이다. 특히, 전이암이나 재발암의 경우 대부분 수술적 치료가 불가능하고, 화학적 치료제에 저항성을 가지는 경우가 많으므로 이러한 암환자들을 위한 새로운 치료제의 개발이 절실히 요구되는 실정이다. 이러한 가운데 최근 연구 개발되고 있는 수지상 세포를 이용한 암 치료제(국내등록특허 10-1169331 참조)는 기존의 어떠한 치료제보다 환자 지향적이며, 기억면역에 의해 장기적으로 효능을 볼 수 있어 동일 암에 대한 전이나 재발 방지에 매우 효과적이며 안전하여 새로운 항암 면역치료법으로 기대된다. 그러나 지난 10여 년간 수지상세포 항암백신의 암 치료효능은 기대만큼의 효과를 보이지 못하고 있어 최근 연구에서는 수지상세포 백신의 효능강화가 가장 큰 당면과제가 되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 수지상세포 항암백신의 치료효과의 한계 등 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 Dab2 유전자의 발현 또는 Dab2 단백질의 활성이 억제된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 Dab2 유전자의 발현 또는 Dab2 단백질의 활성이 억제된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 Dab2 유전자의 발현은 상기 Dab2 유전자가 넉-다운(knock-down) 또는 넉-아웃(knock-out)됨으로써 억제되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 넉-다운(knock-down)은 상기 Dab2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 리보자임(ribozyme)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 넉-아웃(knock-out)은 Dab2 유전자를 암호화하는 DNA를 제거 또는 손상시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Dab2 단백질의 활성 억제는 상기 Dab2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 또는 항체에 의해 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 siRNA는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Dab2 유전자의 발현이 억제된 수지상 세포에서는 MHCII, CD80, CD86 또는 CD40의 발현이 증가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 T 세포 증식을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 항원 특이적 세포독성임파구(CTL)를 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 암은 방광암, 뼈암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
더욱이, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 암 예방 또는 치료에 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 Dab2 유전자가 넉-다운(knock-down) 넉-아웃 (knock-out) 혹은 Dab2 단백질의 활성이 저해된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하고, Dab2 유전자가 넉-다운(knock-down) 넉-아웃 (knock-out) 혹은 Dab2 단백질의 활성이 저해된 수지상 세포는 항원 포식, 세포의 임파절 이동성, 염증성 사이토카인 발현 등이 향상될 뿐만 아니라, 암세포를 공격할 수 있는 항원 특이적 세포독성임파구 (CTL) 및 관련 T 세포를 활성화시킬 수 있는바, 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 골수줄기세포로부터 수지상 세포로 분화 발생과정에서 Dab2 유전자 발현을 (A) 마이크로 어레이 분석 (B) qRT-PCR 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 (A) 골수줄기세포의 수지상세포로 분화과정에서 및 (B) 비장으로부터 분리된 수지상 세포에서 Dab2 유전자 발현을 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (A)는 Dab2가 넉-다운된 수지상 세포에서 Dab2 유전자의 발현 여부를 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 확인한 결과 및 (B)는 Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 표현형을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 항원 uptake capacity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 (A)는 Dab2 넉-다운된 수지상 세포에서 세포 이동에 관여하는 수용체인 CCR7의 발현의 증가 여부를 확인한 결과 및 (B)는 CCL19 케모카인에 대한 수지상세포 이동능 향상을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 (A)는 Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 사이토카인 분비 증감을 확인한 결과, (B)는 Dab2 넉-다운 수지상 세포에 의한 T 세포 증식 콜로니형성 사진결과, (C)는 Dab2 넉-다운 수지상 세포에 의한 T 세포증식을 MTT 분석법으로 분석한 결과, (D)는 Dab2 넉-다운 수지상세포의 T 세포 증식능을 CFSE로 표지 후 FACS로 분석한 결과, (E)는 Dab2 넉-다운 수지상세포와 T 세포 공배양 시 T 세포에서 분비되는 사이토카인의 분비 증감을 확인한 결과, (F)는 Dab2 넉-다운 수지상세포로 백신주사한 OT-1 마우스 spleen과 임파절 세포 배양용액에서 γ-인터페론의 발현을 조사한 결과, (G)는 Dab2 넉-다운 수지상세포로 백신주사 한 OT-1 마우스 spleen과 임파절의 CTL을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Dab2 넉-다운된 수지상 세포를 이용하여 (A) E.G7 종양 마우스모델 및 (B) EL4 종양 마우스 모델에서 항암치료 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8의 (A)는 Dab2가 과발현된 수지상 세포에서 Dab2 과발현 여부를 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 확인한 결과, (B)와 (C)는 Dab2 과발현된 수지상 세포의 표현형을 확인한 결과, (D)는 Dab2 과발현된 수지상 세포의 사이토카인 분비 증감을 확인한 결과 및 (E)는 Dab2 과발현된 수지상 세포를 이용하여 E.G7 종양 마우스모델에서 항암치료효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서, 종양억제인자로 잘 알려진 Dab2가 수지상세포 분화과정에서 높이 발현되는 것을 발견하였다. 이러한 Dab2 발현이 수지상세포의 항암면역유도 활성에 영향을 미칠 것으로 판단되어, Dab2 유전자 넉-다운(knock-down) 혹은 과발현(over-expression) 실험을 통해 수지상세포의 in vitro 면역유도능과, 종양 마우스에서 암치료 효능 등을 조사하였다. 그 결과 Dab2를 넉-다운한 수지상세포의 경우 면역유도관련 세포표면항원, CCR7 발현, 임파절 이동능, T 세포 증식능, CTL 유도능, 종양 억제능 등이 일관성 있게 현저히 향상됨을 확인하였다. 또한 Dab2가 과발현될 경우 수지상세포백신의 면역유도능과 종양치료효능이 사라지는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Dab2가 수지상세포의 면역유도능을 억제하는 조절자로 작용함을 시사하며, Dab2 유전자발현을 억제 혹은 차단함으로써 보다 효과적인 수지상세포항암 백신을 개발할 수 있음을 새롭게 발견하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Dab2 유전자의 발현 또는 Dab2 단백질의 활성이 억제된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "암(cancer)" 은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 본 명세서에서 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)과 동일한 의미로도 사용되며, 고체 종양 및 혈액 종양(blood born tumor)을 포함하되 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 본 발명에서 암은 방광암, 뼈암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 수지상 세포에서의 Dab2 유전자의 발현 억제는 Dab2 유전자를 넉-다운(knock-down) 또는 넉-아웃(knock-out)시킴으로써 이루어지며, 보다 구체적으로, 넉-다운(knock-down)은 상기 Dab2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 리보자임(ribozyme)에 의해 이루어지고, 넉-아웃(knock-out)은 Dab2 유전자를 암호화하는 DNA를 제거 또는 손상시킴으로써 이루어진다.
또한, 본 발명에서 Dab2 단백질의 활성 억제는 상기 Dab2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 이루어지는 것이 바람직하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니며, Dab2 단백질 활성을 저해는 모든 약물을 사용하여도 무방하다.
본 발명에서, "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 Dab2 단백질의 결합 도메인을 억제하여 Dab2 단백질의 활성을 억제하는 것으로서, 상기 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수도 있다.
또한, 본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.
더욱이, 본 발명에서 "항체"는 Dab2에 특이적이고 직접적으로 결합하여 Dab2의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 Dab2에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 Dab2에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 Dab2 항체를 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 수지상 세포는 인간 또는 마우스 유래일 수 있으며, 바람직하게는 인간 혈액으로부터 수지상 세포를 분리하거나 혈액으로부터 분리된 단핵구 또는 마우스 골수로부터 분리된 골수 줄기세포로부터 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 마우스의 골수 또는 비장으로부터 수지상 세포를 분화시키는 과정에서(실시예 1 참조) 서열번호 7 및 서열번호 8의 siRNA를 사용하여 수지상 세포에서 Dab2 유전자를 넉-다운(knock-down)시킨 후(실시예 2 참조), 표현형 및 기능 변화를 확인한 결과, Dab2 넉-다운된 수지상 세포에서 T 세포를 활성화 시키는데 중요한 MHCII, CD80, CD86, CD40의 발현이 증가되고, 수지상 세포의 식세포 작용도 강화되며, 세포 이동능도 향상되었다(실시예 4 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 T 세포 면역 유도능 변화를 확인한 결과, Dab2가 넉-다운 된 수지상 세포에서 IL-12와 IL-6의 분비가 증가하였고, IL-10의 분비는 감소하였으며, Dab2 넉-다운된 수지상 세포에 의하여 T 세포의 증식이 크게 향상되었다(실시예 5 참조).
더욱이, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 Dab2 넉-다운된 수지상 세포를 이용한 항암치료 효능을 확인한 결과, 닭 유래 알부민(OVA)을 발현하는 E.G7 종양 마우스모델에서 OVA 펩타이드를 처리한 Dab2-넉다운 수지상 세포 (OVA-DC/si-Dab2)가 Dab2 정상 수지상 세포 (OVA-DC/si-con)보다 더 효과적으로 암 성장을 억제하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 약학적 조성물은 Dab2 유전자의 넉-다운, 넉-아웃 (knock-out) 및 Dab2 단백질의 활성이 저해된 모든 종류의 수지상 세포와 함께 항암 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 최소 2주에서 최장 12개월 간격으로 최소 1회에서 최고 20회 혹은 그 이상 투여할 수 있으며, 1회 투여 시 1 x 106 ~ 1 x 108 세포를 환자 및 투여경로에 따라 양을 달리하여 투여할 수 있으며, 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비
1-1. 수지상 세포 분리
수지상 세포(DC)는 골수줄기세포 (bone marrow stem cells)를 수지상세포로 분화시키거나 또는 비장(spleen)으로부터 직접 분리하여 배양하였다. 보다 구체적으로, 골수 유래 수지상 세포 (Bone marrow-derived DC, BM-DC)는 6-8주령 female C57BL/6 마우스의 대퇴골과 경골로부터 골수 세포를 분리한 후, 적혈구를 제거하기 위해 ACK lysis buffer (Lonza)를 처리하였다. 세포를 세척하고 10 ng/ml mGM-CSF (Creagene Inc.)를 포함하는 세포 배양배지 (10% FBS와 penicillin/streptomycin이 포함된 RPMI 1640)로 배양하였다. 2일 후, 배양된 세포의 상층액을 제거한 후 mGM-CSF가 포함된 새로운 배양배지 2 ml로 교체하였다. 배양 4일째, mGM-CSF가 포함된 새로운 배양배지 1 ml을 첨가하였다. 배양 6일째, 비접착성 세포들을 수거하여 미성숙 수지상세포 (immature DCs, imDC)로 사용하였다. 성숙 수지상 세포(mature DC, mDC)는 미성숙 수지상 세포(immature DC)를 LPS (100~200 ng/ml) 존재 하에 24 시간동안 배양하여 준비하였다.
또한, 비장 수지상세포(Splenic DC)는 Miltenyi Biotech에서 제공한 방법에 따라 CD11c microbeads를 이용하여 6-8주령 C57BL/6 마우스의 비장에서 분리하여 사용하였다.
1-2. 실험방법
가. 마이크로어레이 분석
cDNA 마이크로 어레이는 Macrogene Inc (www.macrogene.com)에서 진행하였다. 보다 구체적으로, C57BL/6 마우스에서 얻은 골수세포를 2, 4, 6일 동안 mGM-CSF 조건 하에서 배양하였으며, 0일째 샘플은 마우스 골수세포를 사용하였다. 2일째 샘플은 접착성 세포를 긁어서 회수하였고 4일과 6일째 샘플은 부유세포를 회수하여 사용하였다. 각 배양 샘플로부터 전체 RNA로부터 Illumina TotalPrep RNA Amplificatin Kit (Ambion, Austin, TX)를 사용하여 바이오틴이 표지된 cRNA를 합성하였다. 바이오틴이 표지된 cRNA는 Illumina MouseRef-8 Expression Beadchip (Illumina, Inc., San Diego, CA)에 혼합되었다.
나. quantitative RT-PCR
Total RNA는 TRIzol (Invitrogen)를 이용하여 세포로부터 정제하였다. cDNA는 RevertAidTM H Minus Reverse transcriptase 와 Oligo dT primers (Fermentas)를 이용하여 합성하였다. Quantitative PCR은 SYBR green PCR Mastermix (Qiagen)를 이용하여 진행하였고, RT-PCR은 Maxime RT-PCR kit (iNtRON Biotechnology, Inc.)를 이용하여 진행하였다. 사용된 primer의 구체적인 서열정보는 하기 표 1에 나타내었다.
구분 Forward primer(5'→3') Reverse primer(5'→3')
Dab2 tgc tcg tga tgt gac aga ca
(서열번호 1)		 agg gtc att agg gcc tca ct
(서열번호 2)
GAPDH aat gtg tcc gtc gtg gat ct
(서열번호 3)		 tcc acc acc ctg ttg ctg ta
(서열번호 4)
β-actin gta tgc ctc ggt cgt acc a
(서열번호 5)		 ctt ctg cat cct gtc agc aa
(서열번호 6)
다. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
세포를 차가운 PBS로 세척한 후, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 mM NaF, 10 mM Na3VO4, 0.5% NP40 그리고 protease inhibitor cocktail (Pierce)를 포함하는 lysis buffer에 의해 lysis시켰다. Whole cell lysates는 Bradford reagent (Bio-Rad)를 이용하여 동일한 농도로 조절하였으며, 40-120 μg의 lysate를 사용하여 8-12% acrylamide gel에 SDS-PAGE를 진행하였으며 PVDF membrane (Milipore)로 transfer하였다. immunoblotting을 진행하기 위해, membrane을 0.5% Tween20이 포함된 TBS (TBST)로 제조된 5% non-fat dry milk로 상온에서 한 시간 동안 blocking 하였다. 그리고 membrane을 TBST로 4회 세척하고 4% non-fat dry milk로 희석한 1차 항체를 최적의 농도로 처리한 후 4℃에서 overnight하여 배양하였다. TBST로 4회 세척 후, HRP가 결합된 2차 항체와 함께 45분 동안 배양하였다. 결합된 항체는 chemiluminescent HRP substrate (Millipore, USA) 그리고 autoradiographic film (Agfa Healthcare NV, Belgium)를 이용하여 검출하였다.
라. 통계분석
모든 실험은 일관된 결과로 적어도 세 번의 실험을 반복하였다. 통계학적인 데이터는 mean ± SD로 표현하였다. 각 그룹 간 평균 비교는 Student's t-test로 평가하였다. 0.05보다 적은 P-value (p＜0.05)는 통계적 유의성이 고려되었다.
실시예 2. 수지상 세포에서 Dab2 유전자의 넉-다운(knock-down)
Dab2 유전자가 넉-다운(knock-down)된 수지상 세포를 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
즉, Murine Dab2를 타겟으로 하는 siRNA를 BLOCK-IT RNAi Designer (Invitrogen)와 Dharmacon RNAi Technologies (Thermo Scientific) 프로그램을 이용하여 설계하고 제작하였다. Dab2의 넉-다운(knock-down)을 위해서는 두 종류의 Dab2 siRNA를 사용하였고, 대조군으로 control siRNA를 사용하였으며, 각각의 siRAN의 구체적인 정보는 다음과 같다:
5'-CCU GUU GUC UAC AGU CCU U-3' (si-Dab2-1)(서열번호 7)
5'-CCA CCU CUU GUU CCC UCA A-3' (si-Dab2-2)(서열번호 8)
5'-CCU UGU AUC GAC CUG UCU U-3'(control siRNA)(서열번호 9)
Lipofectamine RNAiMAX/Gene porter transfection kit (Life Technologies)와 kit에 제공된 방법을 이용하여 Dab2 si-RNA (siDab2) 또는 control siRNA (sicon)를 Day 4 또는 Day 5의 수지상 세포(DC) 전구세포에 transfection 하였다. 상온에서 20분 동안 배양한 후, 200 μl의 혼합액을 2 ml의 수지상 세포(DC) 배양액에 첨가하였다. 4시간 배양 후, 10% FBS가 포함된 RPMI1640을 같은 양 첨가하였다. 24-48시간 후, 세포를 세척하고 Dab2녹-다운 미성숙 수지상세포 (Dab2-KD imDC)로 이후 실험에서 사용하였다.
실시예 3. 수지상 세포 분화발생 중 Dab2 발현 확인
수지상 세포로 분화 발생하는 과정에서 Dab2 유전자의 발현을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
먼저, 수지상 세포로 분화 발생하는 과정에서 Dab2 유전자의 발현 여부를 mRNA 수준에서 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스에서 얻은 골수세포를 이용하여 실시예 1-2의 마이크로어레이 분석 방법과 quantitative RT-PCR을 통해 Dab2 유전자의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 골수줄기세포로부터 수지상 세포로 분화 발생하는 과정에서 Dab2 유전자의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.
추가적으로, 수지상 세포로 분화 발생하는 과정에서 Dab2 유전자의 발현 여부를 단백질 수준에서 확인하기 위하여, 골수 유래 수지상 세포 (Bone marrow-derived DC, BM-DC)와 비장 수지상세포 (Splenic DC) 각각에서의 Dab2 단백질 발현을 실시예 1-2의 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 골수줄기세포로부터 수지상 세포로 분화 발생하는 과정에서 Dab2 단백질의 발현도 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 표현형 및 기능 변화 확인
4-1. Dab2 발현 확인
실시예 1-2의 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 Dab2가 넉-다운된 수지상 세포에서 Dab2 유전자의 발현 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 3의 A에 나타내었다.
도 3의 A에 나타낸 바와 같이, Dab2가 넉-다운된 수지상 세포에서 Dab2 유전자의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
4-2. Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 표현형 확인
세포의 phenotype을 분석하기 위해, direct immunofluorescence staining을 수행하였다. 세포는 다음과 같은 항체들로 4℃에서 20분 동안 FACS buffer에서 staining 되었다 : FITC-labeled rat anti-mouse CD14(rmC5-3), anti-mouse CD86(GL1), anti-mouse I-A/I-E(2G9), anti-mouse MHCI(H-2Kd), PE-labeled hamster anti-mouse CD11c (HL3), anti-mouse CD80(16-10A1), rat anti-mouse-CD40(3/23) (BD Pharmingen), FITC-labeled isotype control antibodies. 세포 세척 후, 세포는 FACS Calibur (BD) using CellQuest 또는 FlowJo software를 이용하여 분석하였다. intracellular Dab2 staining을 위해, 세포를 PE-labeled hamster anti-mouse CD11c antibody로 prestaining 하고 BD Cytofix/CytopermTM kit (BD Bioscience Pharmingen)를 이용하여 세포고정과 permiabilization하였다. 그리고 BD Perm/wash buffer 에서 1시간 동안 rabbit anti-mouse Dab2 antibody (Abcam) 또는 rabbit isotype control antibody를 staining 한 다음 second FITC-labeled goat anti-rabbit IgG antibody를 staining하였다. BD Perm/wash buffer로 세포를 세척한 후 flow cytometry로 분석하였고, 그 결과를 도 3의 B에 나타내었다.
도 3의 B에 나타낸 바와 같이, Dab2 넉-다운된 수지상 세포에서 T 세포를 활성화 시키는데 중요한 MHCII, CD80, CD86, CD40의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.
4-3. Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 항원 uptake capacity 확인
골수유래 수지상세포 (BMDC)는 C57BL/6 마우스의 골수로 부터 생성하였다. 4일째, Dab2 si-RNA 또는 control si-RNA를 수지상세포 (DC) 전구세포에 transfection하였다. 48시간 후, 세포를 LPS (100~200 ng/ml)로 24시간 동안 자극하였다. 세포를 수획하여, 2 × 105 세포를 FACs tube에서 37℃ 또는 4℃에서 45분 동안 안정화 시킨 후, 1 mg/ml FITC-conjugated dextran을 첨가하여 한 시간 동안 uptaking 시켰다. 그리고 차가운 staining buffer로 반응을 종료시켰다. 세척된 세포는 PE-conjugated anti-CD11로 염색하였으며, FACS Calibur flow cytometer를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Dab2가 넉-다운 된 수지상 세포의 식세포작용 역시 강화됨을 확인할 수 있었다.
4-4. Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 이동능 확인
먼저, 항체로 anti-mouse-CCR7과 PE-labeled isotype control를 사용한 것을 제외하곤 실시예 4-2와 동일한 방법으로 실험을 실시하였고, 그 결과를 도 5의 A에 나타내었다. 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포 (DC) 에서는 세포 이동에 관여하는 수용체인 CCR7의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.
다음으로, Transwell system을 이용한 in vitro chemotaxis assay을 실시하였다. 즉, 골수유래 수지상세포 (BMDC)의 Chemotaxis는 24-well transwell chambers (SPL, Korea and Corning Costar, Cambridge, MA)에서 8 μM pore size의 polycarbonate filter를 통해 수지상세포 (DC) 이동능을 측정하였다. BMDC는 C57BL/6 마우스의 골수세포로 부터 분화 제조하였다. 수지상세포 (DC) 분화 4일째, Dab2 si-RNA 또는 control si-RNA를 DC 전구세포에 transfection하였다. 48시간 후, 세포를 LPS (100~200 ng/ml)로 24시간 동안 자극하였고 PBS로 세척하였다. Transwell plate의 lower chambers에 0.6 ml의 serum-free RPMI 1640 배지에 희석된 CCL19 (300 ng/ml)를 넣고, upper chambers에는 상기와 같이 LPS를 처리한 성숙 수지상세포 (mDC)를 채운 다음 transwell plate를 3시간동안 37℃ CO2 incubator에서 배양하였다. lower chamber에서 migration된 수지상세포 (DC)를 수획하고, 이동한 수지상세포 (DC) 세포의 수를 정량하였으며, 그 결과를 도 5의 B에 나타내었다.
도 5의 B에 나타낸 바와 같이, Dab2가 넉-다운된 수지상 세포는 CCL19으로의 세포 이동능 (chemotaxis)이 향상됨을 알 수 있었다.
실시예 5. Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 T 세포 면역 유도능 변화 확인
5-1. Dab2 넉-다운에 의한 수지상 세포의 사이토카인 분비 증감 확인
Dab2 넉-다운된 수지상 세포로부터 분비되는 염증반응 관련 사이토카인 발현의 증감을 control siRNA (sicon)를 transfection한 수지상 세포와 비교하였다. 보다 구체적으로, 골수유래 수지상 세포에서 분비된 사이토카인은 배양한 상층액에서 IL-6, IL-12p70, TNF-α ELISA kit를 이용하여 검출하였고, 그 결과를 도 6의 A에 나타내었다.
도 6의 A에 나타낸 바와 같이, Dab2가 넉-다운 된 수지상 세포는 염증반응을 유도하는 IL-12와 IL-6의 분비가 통계적으로 유의미하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 Dab2가 넉-다운 된 수지상세포 (DC)가 T 세포 증식 및 활성을 더 효과적으로 유도할 수 있고 이로 인해 암의 생성이나 성장을 억제하는 세포독성임파구 (CTL)의 활성을 증가시실 수 있음을 시사한다.
5-2. Dab2 넉-다운 수지상세포 (DC)의 T 세포 증식활성 강화 확인
Dab2 넉-다운 수지상세포 (DC)의 CTL 활성유도 여부를 조사하기 위해 Dab2 넉-다운된 수지상 세포 (DC/si-Dab2)와 Dab2 정상 수지상세포 (DC/si-con)를 각각 OT-1 T 세포와 공배양한 후 T 세포 증식을 정량하기 위해 colony 형성 assay 와 MTT assay를 수행하였다. Dab2 넉-다운 수지상세포와 Dab2 정상 수지상세포를 OVA257-264(SIINFEKL)(서열번호 10) 펩타이드로 1시간 처리한 후 OT-1 마우스 spleen에서 nylon wool columns (Poly Sciences, Warrington, PA, USA)으로 분리한 OT-1 T 세포와 1:10 비율로 3일간 공배양 하였다. 도 6의 B는 공배양 3일째 수지상세포에 의해 형성된 T 세포 콜로니를 현미경으로 촬영한 것으로 Dab2 넉-다운 수지상세포에 의해 형성된 콜로니가 Dab2 정상인 대조군 수지상세포에 의해 형성된 콜로니보다 현저히 큰 것을 확인할 수 있었다.
또한 이렇게 증폭된 T 세포를 MTT [3-(4,4-Dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay로 정량하였다. MTT assay 는 3일간 공배양한 세포에 MTT 용액 20μl/well (5mg/ml)를 첨가하여 4시간 반응시킨 다음 실온에서 안정화 용액을 첨가하여 반응을 종결시키고 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 6의 C에 나타내었다. 도 6의 C에 나타낸 바와 같이, Dab2 넉-다운 수지상세포가 Dab2 정상인 대조군 수지상세포 보다 T 세포 증식력이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
더욱이, 항암활성에 직접 작용하는 CD8 T 세포의 증식을 보다 정확히 분석하기 위해 Dab2 넉-다운 수지상세포와 Dab2 정상 수지상세포를 OVA257-264 펩타이드로 처리한 후 CFSE (Carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester)로 1시간동안 표지된 OT-1 T세포와 3일간 공배양 하고, 증식된 T 세포를 형광유세포분석기로 분석하였고, 그 결과를 도 6의 D에 나타내었다. 도 6의 D에 나타낸 바와 같이, Dab2 넉-다운 수지상세포가 Dab2 정상인 대조군 수지상세포 보다 CD8 T 세포 증식력이 현저히 높음을 확인할 수 있었다.
5-3. Dab2 넉-다운 수지상세포와 공배양한 Th 세포에서 분비되는 사이토카인 분비 증감 확인
Dab2 넉-다운된 수지상 세포 (DC/si-Dab2)와 Dab2 정상 수지상세포 (DC/si-con)를 각각 T 세포와 공배양시 T 세포에서 분비되는 사이토카인의 증감을 비교하였다.
보다 구체적으로, Dab2 넉-다운된 수지상 세포 (DC/si-Dab2)와 Dab2 정상 수지상세포를 OVA323 -339(ISQAVHAAHAEINEAGR)(서열번호 11) 펩타이드로 1시간 처리한 후 OT-2 마우스의 비장에서 nylon wool columns (Poly Sciences, Warrington, PA, USA)으로 순수 분리한 OT-2 T 세포와 각각 1:10 비율로 섞어 3일간 공배양 하였다. 배양 3일 후 상층액에서 IFN-γ, IL-17A, IL-4의 레벨을 ELISA kit (Biolegend)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 6의 E에 나타내었다.
도 6의 E에 나타낸 바와 같이, Dab2 넉-다운된 수지상 세포에 의해 증식된 T 세포가 분비하는 IFN-γ와 IL-17이 유의미하게 증가함을 확인할 수 있었다. 반면 Th2 type의 사이토카인인 IL-4는 분비되는 양도 낮고 두 군간의 차이도 거의 없었다. 이를 종합하면 Dab2 넉-다운된 수지상 세포가 Dab2 정상 수지상세포보다 효과적으로 Th1/Th17 등의 CD4+ T 세포매개 염증반응과 CD8+ T 세포 매개 CTL 활성을 유도할 수 있음을 시사한다.
5-4. Dab2 넉-다운에 의한 수지상세포의 in vivo CTL 활성 유도능 확인
OVA257 -264 peptide (SIINFEKL)(서열번호 10)가 감작된 Dab2 넉-다운된 수지상 세포 (DC/si-Dab2)와 Dab2 정상 수지상세포 (DC/si-con)를 일주일 간격으로 2회 OT-1 마우스 피하에 접종하였다. 14일 후 마우스를 안락사시키고, spleen 과 DLN (draining lymph node)를 추출하여, splenocytes와 DLN 세포를 6 well plate에 웰당 2 × 106 세포 씩 접종 후 10 μg/ml OVA257 -264 팹타이드(SIINFEKL)(서열번호 10)존재 하에 일주일동안 배양하여 작용세포 (effector cell)를 준비하고 배양 상청액의 r-interferon 발현 정도를 조사하였고, 그 결과를 도 6의 F에 나타내었다. 또한, 이 작용세포를 1μM CFSE로 1시간 동안 표지된 표적세포(target cell, EL4와 E.G7)와 비율을 달리하여 섞어 4시간 동안 함께 배양하였다. 반응 후 세포를 수거하여 PI staining 후, CTL 활성을 FACS로 분석하였고, 그 결과를 도 6의 G에 나타내었다.
도 6의 F 및 도 6의 G에 나타낸 바와 같이, Dab2 넉-다운된 수지상 세포를 접종한 마우스의 spleen 과 DLN에서 생성된 작용세포가 Dab2 정상 수지상세포를 접종한 마우스의 작용세포보다 r-IFN를 더 많이 분비하였으며(도 6의 F), CTL 활성도 향상됨을 확인할 수 있었다(도 6의 G). 이러한 결과는 Dab2 넉-다운이 수지상세포의 항암면역을 향상시킬 수 있음을 강력하게 시사한다.
실시예 6. Dab2 넉-다운된 수지상 세포를 이용한 암치료 효능 확인
C57BL/6 마우스의 오른쪽 대퇴부 피하 (subcutaneously, s.c.)를 통해 EL4와 E.G7 세포를 마우스당 5 × 105 세포를 주입하였다. Tumor가 생성된 마우스에 OVA257 -264 펩타이드(SIINFEKL)를 처리한 Dab2 넉-다운된 수지상 세포 (DC/si-Dab2)와 Dab2 정상 수지상세포 (DC/si-con)를 암세포 접종 후 3일과 10일 두 차례 피하로 vaccination을 하였다. 암의 성장은 caliper를 이용하여 7일째부터 매 2-3일 간격으로 측정하였다. 암의 정량은 짧은 축 (너비)의 길이를 A 그리고 긴 축의 길이를 B라고 했을 때, V = (A2 X B)/2로 계산하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 닭 유래 알부민(OVA)을 발현하는 E.G7 종양 마우스모델에서 Dab2 넉-다운 수지상 세포를 이용하여 면역치료를 수행한 결과, OVA 펩타이드를 처리한 Dab2-넉다운 수지상 세포 (OVA-DC/si-Dab2)가 Dab2 정상 수지상 세포 (OVA-DC/si-con)보다 더 효과적으로 암 성장을 억제함을 확인할 수 있었다 (도 7의 A). 하지만, OVA를 발현하지 않는 EL4 종양 마우스 모델에서는 상기 두 가지 수지상 세포에 의해 암성장 억제효과가 나타나지 않았다(도 7의 B). 상기 결과로부터, E.G7 종양 마우스모델에서 OVA-DC/si-Dab2에 의한 항암효과가 OVA항원 특이적으로 일어난 것임을 알 수 있다.
실시예 7. Dab2가 과발현된 수지상 세포의 항암치료 효능 억제 확인
7-1. Dab2 과발현된 수지상 세포 준비
Dab2 유전자 p96을 PCR로 증폭하여 pEF-Myc 플라스미드 벡터에 클로닝하고 (pEF-Myc/Dab2), 이를 분화 4일째의 골수유래 수지상세포에 lipofectamin kit를 사용하여 형질전환시킨 다음 48시간 후에 수획하였다. 이를 LPS (200ng/ml)가 든 배지에 24시간 배양하여 Dab2를 과발현 하는 성숙 수지상세포(mDC/pEF-Myc/Dab2)를 만들었다. 도 8의 A는 anti-Myc 과 anti-Dab2 항체를 사용하여 실시예 1-2의 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 수지상 세포에서 Dab2 단백질이 과발현됨을 확인한 결과이다.
7-2. Dab2 과발현된 수지상 세포의 표현형 확인
실시예 4-2와 동일한 방법으로 Dab2가 과발현된 수지상 세포의 표현형을 확인하였고, 그 결과를 도 8의 B 및 C에 나타내었다.
도 8의 B 및 C에 나타낸 바와 같이, Dab2가 과발현된 수지상 세포에서 T 세포를 활성화 시키는데 중요한 MHCI, MHCII, CD80, CD86, CD40의 발현이 정상군에 비하여 통계적으로 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 통계적 유의성은 *p<0.05, **p<0.01으로 표기함.
7-3. Dab2 과발현된 수지상 세포의 사이토카인 분비 증감 확인
실시예 5-1과 동일한 방법에 의해 Dab2가 과발현된 수지상 세포 (mDC/pEF-Myc/Dab2)에서 분비되는 염증반응 관련 사이토카인의 증감을 Dab2 정상 수지상 세포 (mDC/con vector) 와 비교하였고, 그 결과를 도 8의 D에 나타내었다.
도 8의 D에 나타낸 바와 같이, Dab2가 과발현된 수지상 세포는 Th1 면역유도에 관여하는 IL-12의 분비가 통계적으로도 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다. 통계적 유의성은 *p<0.05 로 표기함.
7-4. 종양 마우스 모델에서 암 치료 억제 여부 확인
실시예 6과 동일한 방법으로 닭 유래 알부민(OVA)을 발현하는 E.G7 종양 마우스모델에서 OVA257 -264 팹타이드(SIINFEKL)(서열번호 10)를 처리한 Dab2 과발현 수지상 세포를 종양세포 주입 후 3, 10일 째 2차례에 걸쳐 피하로 vaccination 한 후 암성장을 관찰하였다. 그 결과를 도 8의 E에 나타내었다.
도 8의 E에 나타낸 바와 같이, OVA 펩타이드를 처리한 Dab2 과발현 수지상 세포 (OVA-DC/+Dab2)가 Dab2 정상 수지상 세포 (OVA-DC/+con)보다 암 성장 억제효과가 현저히 떨어짐을 확인하였다. 이는 Dab2의 과발현으로 정상 수지상세포의 항암면역 유도능이 억제됨을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Composition for preventing or treating cancers comprising dendritic cells with Dab2 gene silenced <130> PB14-11903 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dab2 Forward primer <400> 1 tgctcgtgat gtgacagaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dab2 Reverse primer <400> 2 agggtcatta gggcctcact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward primer <400> 3 aatgtgtccg tcgtggatct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse primer <400> 4 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Forward primer <400> 5 gtatgcctcg gtcgtacca 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Reverse primer <400> 6 cttctgcatc ctgtcagcaa 20 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-Dab2-1 <400> 7 ccuguugucu acaguccuu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-Dab2-2 <400> 8 ccaccucuug uucccucaa 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA <400> 9 ccuuguaucg accugucuu 19 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA peptide 257-264 <400> 10 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA peptide 323-339 <400> 11 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg

Claims (10)

  1. Dab2 유전자의 발현이 억제된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 Dab2 유전자의 발현은 상기 Dab2 유전자가 넉-다운(knock-down)됨으로써 억제되고,
    상기 조성물은 항원 특이적 세포독성임파구(CTL)를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 넉-다운(knock-down)은 상기 Dab2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 리보자임(ribozyme)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제3항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 Dab2 유전자의 발현이 억제된 수지상 세포에서는 MHCII, CD80, CD86 또는 CD40의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 T 세포 증식을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 암은 방광암, 뼈암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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