KR101514521B1 - X형 구조의 dna를 유효 성분으로 포함하는 면역 효과 및 항암 효과 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 있어서 XL-DNA 및 XS DNA는 TLR9에 결합하여 IFN-β, COX2 발현을 증가시키고, 수지상 세포의 IL-12, TNF-α의 분비를 증가시키며, 수지상 세포 표면에 보조 자극 분자인 CD80, CD86 발현을 증가시키는 등 선천성 면역 세포를 자극하여 후천성 면역 반응을 효과적으로 유도하며, 특히 대장암에 있어서 독소루비신과 병용 투여시 몸무게 감소 등의 부작용 없이 소량으로도 뛰어난 항암 효능을 나타내는바, 항암 약물에 대한 항암 보조제로서 암 질환에 대한 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

X형 구조의 DNA를 유효 성분으로 포함하는 면역 효과 및 항암 효과 증진용 조성물{A Composition containing X structured DNA for enhancing Immunity and Anti-Cancer Effect}

본 발명은 4개의 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 형성된 X형 구조의 DNA를 유효성분으로 포함하는 면역 및 항암 효과 증진용 조성물에 관한 것이다.

세균성 DNA는 B 세포와 천연 킬러 세포를 활성화시키는 면역 자극 효과를 지니고 있지만, 척추동물의 DNA는 이러한 효과를 지니고 있지 않는 것으로 보고되고 있다. 현재, 이러한 세균성 DNA의 면역 자극 효과는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드가 특별한 염기 환경 (CpG 모티프) 하에 존재하는 것에 따른 결과인 것으로 인식되고 있는데, 이러한 디뉴클레오티드는 세균성 DNA에서는 흔히 발견되지만, 척추동물 DNA에서는 메틸화되고 과소표시된다 . 세균성 DNA의 면역 자극 효과는 이들 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)에 의해 모방될 수 있다. 이러한 CpG ODN은 인간 및 뮤린 (murine) 백혈구에 대한 고도의 자극 효과를 지니므로, B 세포 증식; 사이토킨 및 면역글로불린 분비; 천연 킬러 (NK) 세포 용해 활성 및 IFN-γ 분비; 및 수지상 세포 (DC) 및 기타 항원 제시 세포의 활성화를 유도시켜 공-자극성 분자를 발현시키고, 사이토킨, 특히 Th1-유사 T 세포 반응의 발생을 증진시키는 데에 있어 중요한 Th1-유사 사이토킨을 분비시킨다. 상기와 같은 천연 포스포디에스테르 주쇄 CpG ODN의 면역 자극 효과는 CpG 모티프가 메틸화되거나, CpG로 변화되거나 또는 제거 또는 변경되는 경우에 상기 효과가 현저하게 저하된다는 점에서 고도로 CpG 특이적이다.

또한, CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 백신 세팅에서 보강제의 효과를 향상시키는 것으로 보고되었다. 미국 특허 6,406,705 B1에는 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위한 CpG 올리고뉴클레오티드, 비-핵산 보강제 및 항원의 조합 사용이 기재되어 있다. 비-핵산 보강제는 데포 (depot) 효과를 생성시키는 보강제, 면역계를 자극하는 보강제 및 상기 두 활성을 모두 갖는 보강제를 포함하였다. 그러나, 상기 특허에는 비-CpG 올리고뉴클레오티드를 이용한 면역 자극 효과에 대해서는 교시되거나 제안된 바 없었다.

미국 특허 6,406,705

본 발명의 목적은 면역 효과를 증진시킬 수 있는 신규한 구조의 DNA를 제공하고, 이를 종래 사용되고 있는 항암제에 병용 투여하여 항암 효과를 증진시킬 수 있는 항암 효과 증진용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합 또는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 X형 구조의 DNA를 유효성분으로 포함하는 면역 효과 증진용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 X형 구조의 DNA는 X형 구조의 DNA 상호 간의 상보적 결합에 의해 중합체(polymer)를 형성하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합 또는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 X형 구조의 DNA를 유효성분으로 포함하는 항암 효과 증진용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암 효과 증진용 조성물은 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 X형 구조의 DNA는 X형 구조의 DNA 상호 간의 상보적 결합에 의해 중합체(polymer)를 형성하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 X형 구조의 DNA는 선천성 면역 반응을 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 선천성 면역 반응은 대식세포에서 IFN-β 또는 COX-2의 프로모터 활성을 증가시켜 유도되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 선천성 면역반응은 수지상 세포에서 IL-12 또는 TNF-α의 분비를 증가시켜 유도되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 선천성 면역반응은 수지상 세포 표면의 CD80 및 CD86의 발현을 증가시켜 유도되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 X형 구조의 DNA는 TLR9에 결합하여 선천성 면역 반응을 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 X형 구조의 DNA는 독소루비신(Doxorubicin)과 병용 투여하여 대장암 치료 효과를 증진시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 X형 구조의 DNA는 독소루비신(Doxorubicin) 1 중량부 대비 1 내지 5 중량부로 병용 투여하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 XL-DNA 및 XS-DNA는 TLR9에 결합하여 IFN-β, COX2 발현을 증가시키고, 수지상 세포의 IL-12, TNF-α의 분비를 증가시키며, 수지상 세포 표면에 보조 자극 분자인 CD80, CD86 발현을 증가시키는 등 선천성 면역 세포를 자극하여 후천성 면역 반응을 효과적으로 유도하며, 특히 대장암에 있어서 독소루비신과 병용 투여시 몸무게 감소 등의 부작용 없이 소량으로도 뛰어난 항암 효능을 나타내는바, 항암 약물에 대한 항암 보조제로서 암 질환에 대한 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 XL-DNA 및 XS-DNA의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 XL-DNA 및 XS-DNA에 의한 COX-2 프로모터(A) 및 IFN-β 프로모터(B)의 활성화 정도를 보여주는 루시퍼라아제 분석 결과이다.
도 3은 골수 유래 수지상 세포에서 XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 의한 IL-12 및 TNF-α의 mRNA 발현양 변화를 보여주는 qRT-PCR 결과이다.
도 4는 골수 유래 수지상 세포에서 XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 의한 IL-12 및 TNF-α의 단백질 발현양 변화를 보여주는 ELISA 결과이다.
도 5는 XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 의한 골수 유래 수지상 세포 표면의 보조 자극 분자인 CD80, CD86 발현양을 보여주는 FACS 결과이다.
도 6은 HEK293T 세포에 TLR9을 형질전환한 후, XL-DNA 처리에 의해 NF-κB가 활성화되는지 관찰한 루시퍼라아제 분석 결과이다.
도 7은 야생형 및 TLR9 결핍 마우스에서 분리된 골수 유래 수지상 세포에서 XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 의해 MAPK 및 IκBα가 활성화되는지 관찰한 웨스턴 블라팅 결과이다.
도 8은 야생형 및 TLR9 결핍 마우스에서 분리된 골수 유래 수지상 세포에서 XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 의해 IL-12, TNF-α, IFN-β의 mRNA 발현양이 변화하는지 관찰한 qRT-PCR 결과이다.
도 9는 야생형 및 TLR9 결핍 마우스에서 분리된 골수 유래 수지상 세포에서 XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 의해 IL-12, TNF-α의 단백질 발현양이 변화하는지 관찰한 ELISA 결과이다.
도 10은 XL-DNA가 TLR9과 직접적으로 결합하는지 관찰한 면역침강법 결과이다.
도 11은 대장암 마우스 모델에서 항암제인 독소루비신과 XL-DNA를 병용 투여시 몸무게 변화와 종양 크기 변화를 관찰한 결과이다.

본 발명은 X형 구조의 DNA를 유효성분으로 포함하는 면역 효과 증진용 조성물 및 항암 효과 증진용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 상기 면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환을 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 자가면역질환이라고 한다.

또한, 염증성 질환이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

또한, 본 발명에서 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역성 간염, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스를 포함할 수 있다.

본 발명에서 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법" 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환의 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 X형 구조의 DNA를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 마우스를 대상으로 하였다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 본 발명에서는 다세포계(고형암) 암을 의미한다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다. 본 발명에서는 포유동물의 암을 치료하는데 효과적인 화합물의 양을 말하는 것이다.

"상승작용(synergy)"이라는 용어는, 각 성분이 병용(조합) 투여될 때 발생되는 효과가, 단일 성분으로서 단독으로 투여될 때 발생되는 효과의 합보다 더 큰 것을 말한다(Chou and Talalay, Adv. Enzyme. Regul. , 22:27-55, 1984). 본 발명에 따른 소라페닙(Sorafenib) 화합물과 탁산 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 상기 두 성분을 병용 투여함으로써 암치료 효과를 상승시키는 작용을 한다.

"병용 투여(administered in combination)"라는 용어는 화합물 또는 성분이 대상 동물에 함께 투여되는 것을 의미한다. 각 화합물 또는 성분이 함께 투여된다는 것은 원하는 치료 효과를 얻기 위해서, 각 성분을 동일한 시간에 또는 임의의 순서로 또는 상이한 시간에 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 XL-DNA 및 XS-DNA의 신규한 용도에 관한 것으로, 특히 XL-DNA와 XS-DNA에 의한 면역반응 증진 효과에 기인한 항암 효과 증진용 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 XL-DNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 X형 구조의 DNA를, XS-DNA는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 X형 구조의 DNA를 말한다.

상기 XL-DNA는 X형 구조의 DNA 상호 간의 상보적 결합에 의해 중합체(polymer)를 형성할 수 있다.

이와 같은 XL-DNA와 XS-DNA는 선천성 면역 반응을 유도하는 것으로 실험적으로 확인되었는데, RAW 264.7 세포에 XL-DNA와 XS-DNA를 처리하면 IFN-β와 COX2 프로모터가 활성화되고, 수지상 세포의 IL-12 p40와 TNF-α의 mRNA 발현 및 단백질 발현이 증가되며, 수지상 세포 표면에 보조 자극 분자인 CD80, CD86의 발현이 증가되는 것으로 확인되었다.

또한, 이러한 XL-DNA와 XS-DNA가 선천성 면역 반응을 유도하는 기전은 TLR9 의존적인 것으로 확인되었는데, 즉, TLR9이 발현되지 않는 HEK293T 세포에 임의로 TLR9을 발현시킨 후 XL-DNA와 XS-DNA를 처리한 경우에만 특이적으로 NFκB가 활성화되는 것으로 확인되었고, TLR9이 발현되지 않는 돌연변이형 마우스 모델에서 유래한 골수 수지상 세포의 경우에서는 TLR9이 발현되는 야생형 마우스 유래 골수 수지상 세포의 경우와 상반되게, XL-DNA 또는 XS-DNA를 처리하여도 MAPK가 활성화되거나, NFκB가 활성화되지 않는 것으로 나타났다. 또한, TLR9이 발현되지 않는 돌연변이형 마우스 모델에서 유래한 골수 수지상 세포의 경우에서는 TLR9이 발현되는 야생형 마우스 유래 골수 수지상 세포의 경우와 달리 IL-12, TNF-α, IFN-β의 발현양이 현저히 적은 것으로 확인되었다.

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 XL-DNA와 XS-DNA가 선천성 면역반응을 유도하고, 이는 TLR9 의존적임을 확인하였다.

대부분의 암 환자들의 치료는 외과적 수술과 방사선요법, 화학요법을 병행하여 이루어진다. 방사선요법과 화학요법은 악성 세포를 치료하는 방법으로 면역력 약화 등의 심각한 부작용 때문에 환자의 건강을 해치는 단점을 가지고 있다. 이에 T 세포 또는 대식세포, 수지상세포를 포함한 면역세포를 활성화시켜 면역세포에 의한 직접적인 암세포 제거를 통하여 항암제의 작용을 증진시키는 ‘면역반응 증진 효과에 기인한 항암 요법‘ 이 제기되고 있다. 활성화된 항원제시세포는 보조자극제 (co-stimulatory molecule)를 발현하면서 근처의 림프절로 이동하여 T 세포를 자극한다. 또한, 이들로부터 분비된 사이토카인, 특히 IL-12 는 T세포의 반응을 증가시킬 뿐 아니라 Th1 면역 반응 쪽으로 유도 할 수도 있다. IL-12 는 주로 대식세포, B 세포, DC등에서 분비되어 T세포, NK세포 등을 자극하여 분열을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 최종적으로 활성화된 선천면역 세포와 T 세포들은 암세포에 대한 면역력을 유지하는데 있어 중요한 역할을 한다.

따라서 본 발명자들은 이러한 뛰어한 선천성 면역반응 유도 활성을 갖는 XL-DNA와 XS-DNA의 활용 방안을 모색하던 중 종래 항암제와 병용 투여에 의한 항암 효과 상승(synergistic) 효과를 비교해 보고자 하였다.

이를 위하여, 본 발명자들은 AOM과 DSS를 처리하여 대장암 모델을 구축하고 종래 항암 물질로 알려진 독소루비신(doxorubicin)과 병용 투여한 결과, 종래 독소루비신 투여량의 절반의 투여량에서도 대장암 치료 효과를 발휘하는 것으로 나타났으며 이 경우 독소루비신 투여에 의해 야기되는 몸무게 감소 등의 부작용도 나타나지 않는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 XL-DNA 및 XS-DNA의 독소루비신에 대한 항암 약물의 능력을 증강시키는 용도에 관한 것이다. 즉, 독소루비신의 능력을 증가시키는, XL-DNA 또는 XS-DNA를 유효성분으로 함유하는 항암 보조제; 및/또는 독소루비신과 XL-DNA 또는 XS-DNA를 병용 처리하는 것을 포함하는 암질환 치료방법에 관한 것이다.

본 발명의 XL-DNA 및 XS-DNA는 독소루비신을 포함하는 기존 항암제의 항암 약물 특성을 증강시키는 보조 요법(adjuvant setting)으로 실행될 수 있다.

"보조 요법"은 암의 병력을 가졌으며, 탁산 화합물을 이용한 화학요법에 반응했던 개체에서의 임상요법을 지칭하는 것으로, 보조 요법에서의 치료 또는 투여는 후속 치료 방식을 지칭한다. 위험 정도는 여러 인자, 대부분 통상적으로 처음 치료될 때의 질환 정도에 따라 달라진다.

상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서, 치료 및 예방 대상이 되는 암은 다세포계 고형암으로써, 예를 들어, 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종과 같은 고형암 또는 이들 암의 하나 이상의 조합일 수 있으나, 바람직하게는 상기 암은 대장암을 의미한다.

또한, 본 발명은 XL-DNA 또는 XS-DNA와 독소루비신 등의 기존 항암제를 조합한 암의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

상기와 같은 항암용 조성물은 약학적(약제) 조성물로서, 본 발명의 화합물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

상기 항암용 조성물은 생물체 내로 약리학적 유효량으로 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 조성물은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 산 화합물들을 반응시켜서 얻어질 수도 있다.

"약리학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 투여되는 화합물의 량이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감하는 것을 의미한다. 따라서, 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키거나 (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키게 하는 것을 의미하며, (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 량을 의미한다.

"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

"약리학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제로 정의된다. 여기에 사용된 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 약리학적으로 허용되는 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제 조성물로서, 투여될 수 있다.

(a) 투여 경로

적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여 격막내, 직접 심실내, 복강내, 또는 안내 주사뿐만 아니라, 근육내, 피하, 정맥, 골수 주사를 포함한 비경구 전달을 포함한다. 바람직하게는 비경구 전달이다. 또한, 예를 들어, 종종 침적 또는 서방성 제형으로, 충실성 종양에 직접적으로 주사하는 것에 의해, 전신 방식보다는 국소 방식으로 화합물을 투여할 수도 있다.

(b) 투여 순서

본 발명의 상기 항암용 조성물은 X형 구조를 가진 DNA와 기존 항암제가 단일 조성물(single composition)의 형태이거나 또는 개별적인 조성물(separate composition)의 형태일 수 있다. 그리고, 상기 조성물이 개별적인 조성물(separate composition)의 형태인 경우, 상기 조성물은 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다

(c) 조성물/제형

본 발명의 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀션화, 캡슐화, 트래핑과 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해, 공지 방식으로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 약학적 조성물은, 약학적으로 사용될 수 있는 제형으로의 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제들 또는 보조제들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수도 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게 사용될 수 있다

본 발명의 화합물은, 주사에 의해, 예를 들어, 큰 환약 주사나 연속적인 주입에 의해, 비경구 투입용으로 제형화될 수도 있다. 주사용 제형은, 예를 들어, 방부제를 부가한 앰플 또는 멀티-도스 용기로서 단위 용량 형태로 제공될 수도 있다. 조성물은 유성 또는 액상 비히클상의 현탁액, 용액, 에멀션과 같은 형태를 취할 수도 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형용 성분들을 포함할 수도 있다.

상기 설명한 제형들 이외에, 화합물들은 침적체로서 제형될 수 있다. 그와 같이 오랫동안 활성을 나타내는 제형들은 이식(예를 들어 피하에 또는 근육내에) 또는 근육내 주입에 의해 투여될 수도 있다. 따라서, 화합물들은, 예를 들어, 적절한 고분자 또는 소수성 물질(예를 들어 허용 가능한 오일내의 에멀션과 같이), 또는 이온 교환 수지를 가지고, 또는 예를 들어 저용해성 염과 같은 저용해성 유도체로서 제형될 수도 있다.

(d) 유효량

본 발명에서 사용에 적합한 약학적 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 량으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위 내에 있다. 전신 투여를 위하여 치료학적 유효량 또는 투여 용량 (dose)은 인비트로 분석으로부터 초기에 평가될 수 있다. 예를 들면, 투여 용량은 세포 배양에서 결정되는 것과 같이 IC50을 포함하는 순환 농도 (circulating concentration) 범위에 이르게 하기 위해서 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 이러한 정보는 사람에 대한 유효한 투여 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.

또한, 초기 투여 용량은 예를 들면 당해 기술분야에서 널리 알려진 기술을 사용하여 동물 실험 등의 in vivo 데이타로부터 평가될 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 동물 데이터에 기초하여 사람에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.

정확한 산정, 투여 루트 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다. 통상적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 선량 범위는 환자 체중의 약 0.5 내지 1000 mg/kg 일 수 있다. 투여량은, 환자에게 요구되는 정도에 따라, 한번에 또는 하루 또는 그 이상의 과정으로 일련의 둘 또는 그 이상으로 제공될 수도 있다.

물론, 투여되는 조성물의 양은 치료될 개체에 따라, 객체의 체중에 따라, 통증의 심각에 따라, 투여 방식 및 의사의 판단에 따라 달라지게 된다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서 수득한 값은 평균± SEM 으로 표시하였다.

< 실시예 1>

XL - DNA 와 XS - DNA 의 제작

하기 표에 기재된 4개의 올리고뉴클레오타이드를 동일한 양으로 어닐링 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 50mM NaCl]에 용해하고 멸균된 Milli-Q 워터를 첨가하여 최종 농도가 0.5mM이 되도록 준비하였다. 혼합물을 95℃에서 5분, 65℃에서 2분, 62℃에서 1분간 반응시키고, 서서히 4℃까지 온도를 낮추어 주었다. XL-DNA와 XS-DNA는 21% PAGE를 이용하여 200V에서 1.5-2 시간동안 전기영동하여 확인하였다.

	염기서열
XL-DNA	X01: 5'-ACG TCG ACC GAT GAA TAG CGG TCA GAT CCG TAC CTA CTC G- 3'(서열번호 1)
	X02: 5'-ACG TCG AGT AGG TAC GGA TCT GCG TAT TGC GAA CGA CTC G- 3'(서열번호 2)
	X03: 5'-ACG TCG AGT CGT TCG CAA TAC GGC TGT ACG TAT GGT CTC G- 3'(서열번호 3)
	X04: 5'-ACG TCG AGA CCA TAC GTA CAG CAC CGC TAT TCA TCG GTC G- 3'(서열번호 4)
XS-DNA	X01: 5'-TGA CGA TGA ATA GCG GTC AGA TCC GTA CCT-3'(서열번호 5)
	X02: 5'-TGA CAG GTA CGG ATC TGC GTA TTG CGA ACG-3'(서열번호 6)
	X03: 5'-TGA CCG TTC GCA ATA CGG CTG TAC GTA TGG-3'(서열번호 7)
	X04: 5'-TGA CCC ATA CGT ACA GCA CCG CTA TTC ATC-3'(서열번호 8)

상기 표에서 볼 수 있듯이, XL-DNA의 경우 X01의 ACC는 X04의 GGT, X02의 AGT는 X01의 ACT, X03의 AGT는 X02의 ACT, X04의 AGA는 X03의 TCT와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 가지고 있다.

따라서, 도 1에 나타낸 바와 같이 XL-DNA는 모노머(monomer)가 상호 결합된 형태의 응집된 복합체 구조(polymer)로 존재할 수 있고, XS-DNA의 경우 상보적으로 결합할 수 있는 말단부가 결여되어 있어 모노머(monomer) 형태로만 존재할 수 있다.

<실시예 2>

XL-DNA와 XS-DNA의 IFN-β 및 COX-2 프로모터 활성화 효과 분석

CpG DNA와 같은 일부 올리고뉴클레오티드는 면역반응을 효과적으로 유도하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명자들은 XL-DNA와 XS-DNA도 이와 같은 면역반응을 유도할 수 있는지 확인해 보고자 하였다.

이를 위하여 대식세포주인 RAW264.7 세포에 IFN-β 프로모터 루시퍼라아제 또는 COX-2 프로모터 루시퍼라아제 리포터 유전자를 영구 발현시키는 세포주를 제작하였다. 상기 세포주에 XL-DNA 및 XS-DNA를 각각 0.01, 0.1, 1 μM씩 처리하고 8시간 경과 후, 루시퍼라아제 용해용 버퍼를 이용하여 세포를 용해시킨 후, luciferase assay kit(promega, USA)를 이용하여 제조자 방식에 따라 IFN-β 및 COX-2의 프로모터 활성을 관찰하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 의해 IFN-β 및 COX-2 프로모터 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, XL-DNA의 경우, XS-DNA에 비해 더 좋은 IFN-β 및 COX-2 프로모터 활성이 나타나는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3>

XL - DNA 와 XS - DNA 의 면역 사이토카인 생성 효과 분석

본 발명자들은 상기 실시예 2를 통하여 XL-DNA와 XS-DNA가 대식세포의 IFN-β와 COX-2 프로모터 활성을 증가시켜 선천성 면역반응을 유도하는 것으로 확인하였다. 이에 본 발명자들은 XL-DNA와 XS-DNA가 후천성 면역세포 활성화에 중요하다고 알려진 수지상 세포의 면역사이토카인의 분비를 유도하는지 확인해 보기로 하였다.

이를 위하여 본 발명에 따른 XL-DNA와 XS-DNA를 골수 유래 수지상 세포에 각각 0.01, 0.1, 1 μM씩 처리하고 4 시간 경과 후 quantitative RT-PCR에 의해 IL-12 및 TNF-α의 mRNA 양을 측정하였다. 즉, XL-DNA와 XS-DNA를 처리한 골수 유래 수지상 세포로부터 총 RNA는 Welprep^TM 시약(Jeil Biotechservices Inc., Daegu, Korea)으로 분리하였으며, 역전사반응은 ImProm II^TM 역전사시약 (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 제조자 방식에 따라, 1ul의 cDNA를 주형으로 IQ^TM SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 IQ5 (Bio-Rad)으로 RT-PCR을 실시하였다. 정량화는 efficiency-corrected △△Cq 방법에 의해 도출하였다. 상대적 발현량은 β-actin 을 이용하여 정규화하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, XL-DNA 및 XS-DNA 처리에 따라 농도 의존적으로 IL-12 및 TNF-α의 mRNA 양이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 XL-DNA 처리에 의해 발현되는 IL-12 및 TNF-α의 mRNA 양이 XS-DNA 처리에 의해 발현되는 IL-12 및 TNF-α의 mRNA 양에 비해 2배 가량 많은 것으로 나타났다.

한편 본 발명자들은 상기 IL-12 및 TNF-α 단백질 분비량을 추가적으로 관찰해 보았는데, 이를 위하여 XL-DNA와 XS-DNA를 골수 유래 수지상 세포에 각각 0.01, 0.1, 1 μM씩 처리하고 18 시간 경과 후 ELISA에 의해 분비된 IL-12 및 TNF-α의 양을 측정하였다.

그 결과 단백질 분비량도 mRNA 발현양과 비슷한 양상을 나타내었으나, XL-DNA 처리시 XS-DNA를 처리한 경우보다 IL-12의 경우 3배 이상, TNF-α의 경우 6배 이상 더 많이 분비되는 것으로 확인되었다(도 4 참조).

상기와 같은 결과를 통해 XL-DNA와 XS-DNA는 수지상 세포에서 IL-12 및 TNF-α의 분비를 유도하여 후천성 면역세포 활성화에 기여함을 알 수 있었다.

<실시예 4>

XL-DNA와 XS-DNA에 의한 보조 자극(co-stimulatory) 분자 발현 분석

XL-DNA와 XS-DNA의 면역세포 활성 효과를 관찰하기 위한 또 다른 지표로 보조 자극 분자의 발현을 측정해 보고자 하였다. 즉, CD80, CD86와 같은 보조 자극 분자는 활성화된 선천성 면역세포의 표면에 발현되어 후천성 면역세포를 활성화시키는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는바, XL-DNA와 XS-DNA 처리에 따른 수지상 세포의 CD80 및 CD86 발현을 분석해 보았다.

이를 위하여 수지상 세포를 XL-DNA 또는 XS-DNA(0.01, 0.1, 1μM)로 24시간 자극하고, CD80, CD86 발현을 FACS로 분석해 보았다.

그 결과, 수지상 세포 표면에서 CD80와 CD86의 발현이 XL-DNA와 XS-DNA의 처리에 따라 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 발현 양상은 특히 XL-DNA를 처리한 경우 더욱 현저하게 나타나는 것으로 확인되었다(도 5 참조).

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 XL-DNA와 XS-DNA가 항원 제시세포 중 하나인 수지상 세포를 활성화시키며, 수지상 세포를 활성화시킴으로써 면역 사이토카인인 IL-12, TNF-α를 분비시키는 외에도, 보조 자극 분자의 세포 표면 발현을 촉진시켜 후천성 면역세포의 활성화에 기여하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 5>

XL-DNA 및 XS-DNA의 TLR9 의존성 확인

<5-1> HEK293T 세포에서 TLR9 발현에 따른 NF-κB의 루시퍼라아제 활성

TLR9은 박테리아나 바이러스가 가지고 있는 메틸화되지 않은 DNA(CpG DNA)에 반응하여 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명자들은 XL-DNA와 XS-DNA의 면역 세포 활성화가 TLR9을 통해 이루어지는지 확인해 보고자 하였다.

이를 위하여 HEK293T 세포에 pcDNA3.1(+)NF-κB-Luc와 pMSCVpuro-mTLR9-myc 발현 벡터를 SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 제조자 방식에 따라 동시에 형질주입하고, XL-DNA를 각각 0.01, 0.1, 1μM 처리하여 NF-κB 루시퍼라아제 리포터 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 종래 TLR9의 리간드로 알려진 CpG 올리고뉴클레오티드와 유사하게 XL-DNA 처리에 의해 농도 의존적으로 NF-κB 가 활성화되는 것으로 나타났고, TLR9을 형질주입한 경우에만 이러한 경향이 나타나는 것으로 확인되어, XL-DNA도 TLR9 의존적으로 면역세포를 활성화 시키는 것임을 알 수 있었다(도 6 참조).

<5-2> 일차배양 수지상 세포에서 TLR9 발현에 따른 MAPK 활성

본 발명자들은 상기 실시예 <5-1>을 통해 XL-DNA가 TLR9 의존적으로 면역세포를 활성화 시키는 것임을 관찰한 바, 이를 좀 더 명확히 하고자 TLR9 결핍 생쥐의 골수로부터 유래된 수지상 세포를 이용하여 추가 실험을 진행하였다.

즉, TLR9 결핍 생쥐와 야생형 생쥐로부터 각각 골수 유래 수지상 세포를 일차배양하고, 각각 실험군인 XL-DNA(1μM), 음성 대조군인 TLR7 리간드 R848(100ng/ml), 양성 대조군인 CpG1668(1μM)을 처리한 후 세포를 용해하여 웨스턴 블라팅을 실시하였다.

그 결과, 야생형 생쥐의 골수로부터 유래한 수지상 세포에서는 XL-DNA 처리에 의해 MAPK인 ERK, JNK, p38가 인산화되고, NFκB의 활성화 지표인 IκBα가 인산화된 반면, TLR9 결핍 생쥐의 골수로부터 유래한 수지상 세포에서는 MAPK와 IκBα의 인산화되지 않은 것으로 확인되었다(도 7 참조).

<5-3> 일차배양 수지상 세포에서 TLR9 발현에 따른 면역 사이토카인 발현

한편, 상기 실시예 <5-2>의 야생형 생쥐와 TLR9 결핍형 생쥐로부터 유래한 수지상 세포에 XL-DNA와 XS-DNA를 처리하고 IL-12, TNF-α, IFN-β 발현양을 비교해 보았다.

즉, TLR9 결핍 생쥐와 야생형 생쥐로부터 각각 골수 유래 수지상 세포를 일차배양하고, 각각 실험군인 XL-DNA(1μM), XS-DNA(1μM), 음성 대조군인 TLR7 리간드 R848(100ng/ml), 양성 대조군인 CpG1668(1μM)을 처리한 후 qRT-PCR 및 ELISA assay를 통하여 IL-12, TNF-α, IFN-β의 mRNA 발현양, IL-12, TNF-α의 단백질 발현양을 조사하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이 XL-DNA 및 XS-DNA에 의해 IL-12, TNF-α, IFN-β의 mRNA 양이 증가하였고, IL-12, TNF-α의 단백질 발현양도 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 이와 같은 면역 사이토카인 발현 증가는 XS-DNA에 비하여 XL-DNA에 의해 현저히 증가하는 것으로 확인되었다.

<실시예 6>

XL-DNA와 TLR9의 결합 여부 확인

상기 실시예를 통하여 XL-DNA가 TLR9 의존적 신호 전달 경로를 활성화 시키는 것으로 확인된 바, 본 발명자들은 XL-DNA가 TLR9과 직접적으로 결합하는지 추가적으로 확인해 보고자 하였다.

이를 위하여 HEK293T 세포에 mTLR9-Myc/His 발현용 플라스미드를 SuperFect Transfection Reagent (Qiagen)를 이용하여 제조자 방식에 따라 형질전환하고, 24시간 배양 후 용해시켰다. 그 용해물을 바이오티닐화된 XL-DNA(biotynylated XL-DNA)와 4시간 동안 반응시키고, NA-bead와 2시간 동안 추가 반응시킨 후 면역침강하여 항-Myc 항체로 면역블라팅하였다.

그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, TLR9과 XL-DNA가 직접적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

XL-DNA와 XS-DNA의 대장암 모델에서의 항암 효과 분석

상기 실시예를 통하여 XL-DNA와 XS-DNA의 면역 증진 효과를 확인한 바, 본 발명자들은 XS-DNA 에 비하여 보다 높은 면역증진 효과를 보이는 XL-DNA가 이러한 면역 증진 효과를 통하여 항암 효과를 증진시킬 수 있는지 실험해 보았다.

이를 위하여 우선 AOM/DSS 대장암 모델를 구축하였는데, 6주령 BALB/c 마우스에 발암물질인 AOM(azoxymethane)을 10mg/kg 용량으로 복강 주사하고, 7일 후 염증유발물질인 DSS(dextran sodiem sulphate)를 식수의 2% 농도로 섞어 7일간 공급하였다. 이후 7일간 휴지기를 가지며 관찰하고 다시 DSS를 식수의 2% 농도로 섞어 7일간 공급하였다. 이후, 3주간 주 2회 항암제인 독소루비신(doxorubicin)(1 또는 2 mg/kg)을 단독 투여하거나, XL-DNA(2.5 또는 5 mg/kg)를 병용 투여하여 몸무게 변화와 직경 3mm 이상의 종양의 수를 관찰하여 암 치료 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 독소루비신을 1mg/kg 용량으로 단독 투여시 몸무게 감소는 없었으나 치료 효과도 확인할 수 없었고, 독소루비신을 2mg/kg 용량으로 단독 투여시 직경 3mm 이상의 종양의 수가 감소하여 치료 효과가 있는 것으로 확인되었으나, 몸무게도 함께 감소하는 것으로 나타났다.

그러나, 독소루비신 1 mg/kg과 XL-DNA 2.5mg/kg을 병용 투여한 경우, 직경 3mm 이상의 종양의 수가 현저히 감소하였고, 몸무게의 감소도 나타나지 않는 것으로 확인되었다.

한편, 독소루비신 1mg/kg을 XL-DNA 5mg/kg과 병용 투여한 경우, 종양 치료 효과는 있었으나 몸무게가 감소하는 현상이 관찰되었다.

따라서, 상기와 같은 결과를 통해 독소루비신과 같은 항암제와 본 발명인 XL-DNA 또는 XS-DNA를 병용 투여시 항암제의 투여량을 감소시키면서도 동일한 효과를 나타낼 수 있어 항암제 투여에 의해 발생하는 부작용을 최소화시킬수 있음을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 실시예를 통하여 X형 구조를 갖는 DNA가 선천성 면역반응의 주요 항원 제시 세포인 수지상 세포를 활성화시켜 면역 사이토카인 및 보조 자극 분자의 생성을 유도하고 그 결과 후천성 면역반응을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명에 의하면 대장암에서 X형 구조를 갖는 DNA를 항암제와 병용 투여시 항암제 투여 농도를 낮추더라도 동일한 항암 효과를 발휘하여, 항암제 과다 투여시 발생하는 부작용을 줄일 수 있으므로 항암제 보조제로써 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A Composition containing X structured DNA for enhancing Immunity and Anti-Cancer Effect <130> PN1303-114 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming self-assemblable X structured DNA <400> 1 acgtcgaccg atgaatagcg gtcagatccg tacctactcg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming self-assemblable X structured DNA <400> 2 acgtcgagta ggtacggatc tgcgtattgc gaacgactcg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming self-assemblable X structured DNA <400> 3 acgtcgagtc gttcgcaata cggctgtacg tatggtctcg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming self-assemblable X structured DNA <400> 4 acgtcgagac catacgtaca gcaccgctat tcatcggtcg 40 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming non-self-assemblable X structured DNA <400> 5 tgacgatgaa tagcggtcag atccgtacct 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming non-self-assemblable X structured DNA <400> 6 tgacaggtac ggatctgcgt attgcgaacg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming non-self-assemblable X structured DNA <400> 7 tgaccgttcg caatacggct gtacgtatgg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> one of the 4 polynucleotides for forming non-self-assemblable X structured DNA <400> 8 tgacccatac gtacagcacc gctattcatc 30

Claims (12)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 상보적 결합에 의해 형성된 X형 구조의 DNA(XL-DNA)를 포함하며, 상기 XL-DNA 상호 간의 상보적 결합에 의해 중합체(polymer)를 형성하며, 상기 중합체는 독소루비신(Doxorubicin) 1 중량부 대비 1 내지 5 중량부로 병용 투여하여 대장암 치료 효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 대장암에 대한 항암 효과 증진용 약제학적 조성물.
4. 삭제
5. 제3항에 있어서,
   상기 중합체는 선천성 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 대장암에 대한 항암 효과 증진용 약제학적 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 선천성 면역 반응은 대식세포에서 IFN-β 또는 COX-2의 프로모터 활성을 증가시켜 유도되는 것을 특징으로 하는 대장암에 대한 항암 효과 증진용 약제학적 조성물.
7. 제5항에 있어서,
   상기 선천성 면역반응은 수지상 세포에서 IL-12 또는 TNF-α의 분비를 증가시켜 유도되는 것을 특징으로 하는 대장암에 대한 항암 효과 증진용 약제학적 조성물.
8. 제5항에 있어서,
   상기 선천성 면역반응은 수지상 세포 표면의 CD80 및 CD 86의 발현을 증가시켜 유도되는 것을 특징으로 하는 대장암에 대한 항암 효과 증진용 약제학적 조성물.
9. 제5항에 있어서,
   상기 중합체는 TLR9에 결합하여 선천성 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 대장암에 대한 항암 효과 증진용 약제학적 조성물.
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