KR101976782B1

KR101976782B1 - 수용성 공통 감마 수용체 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101976782B1
Application number: KR1020170112715A
Authority: KR
Inventors: 홍창완; 김건아; 조유나; 이병혁
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2017-09-04
Publication date: 2019-05-09
Also published as: KR20190026235A

Abstract

본 발명은 수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain) 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 저해제를 포함하는 항암 치료 보조제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수용성 공통 감마 수용체를 특이적으로 표적하는 압타머에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수용성 공통 감마 수용체 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 sγc를 타겟으로 하여 이의 활성을 저해함으로써 세포 독성 CD8+ T 세포의 항암 반응을 증진시킨다. Sγc는 CD8+ T 세포의 생존 및 증식에 중요한 γc 사이토카인 중 IL-2 및 IL-15의 신호전달 경로를 억제하는 역할을 하여 CD8+ T 세포의 항암 반응을 억제하므로, 본 발명은 항암치료에서 CD8+ T 세포의 기능을 증진시키는 새로운 항암치료 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수용성 공통 감마 수용체 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for preventing or treating cancer comprising soluble common gamma chain inhibitor}

본 발명은 수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain, sγc) 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 저해제를 포함하는 항암 치료 보조제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수용성 공통 감마 수용체를 특이적으로 표적하는 압타머에 관한 것이다.

암은 인류의 지난 수십 년간의 부단한 노력에도 불구하고 난치병 중의 하나로 여전히 남아 있다. 암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고, 비 조절적 방식으로 증식 및 불사화되어 발생하는 질병이다. 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되어 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다. 이에 따라 암과 관련된 다양한 생체 내 분자의 동정 및 상기 분자를 표적으로 하는 약물의 개발에 대한 요구가 계속되고 있다.

수용성 공통 감마 수용체는 활성화된 T 세포에서 분비되는 수용성 형태의 공통 감마 수용체이다. 이는 세포 표면에 발현되며 γc 사이토카인 신호 전달의 필수 보조 단백질인 공통 감마 수용체 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된다. 한편, 수용성 공통 감마 수용체가 CD8+ T 세포의 활성에 미치는 연구는 아직까지 진행된 바가 없다.

한편, 압타머는 짧은 단일 가닥의 올리고 뉴클레오타이드로, 높은 친화도와 특이성으로 표적 물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있다. 이러한 압타머는 대부분의 경우에 단백질을 포함하는 표적 물질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 암을 포함하는 다양한 질병의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.

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Meißner et al, " A soluble form of the murine common g chain is present at high concentrations in vivo and suppresses cytokine signaling", Blood. 2001 Jan 1;97(1):183-91. Lundstrom et al, " Soluble IL7Rα potentiates IL-7 bioactivity and promotes autoimmunity", Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 May 7;110(19):E1761-70 (2013.04.22).

본 발명자들은 수용성 공통 감마 수용체를 억제하면 CD8+ T 세포의 IL-2 및 IL-15 신호전달 경로를 강화함으로써 항암 효과를 높일 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 IL-2뿐 아니라 IL-15 신호전달 경로에도 관여하는 수용성 공통 감마 수용체의 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 저해제를 포함하는 항암 치료 보조제 및 수용성 공통 감마 수용체를 특이적으로 표적하는 압타머를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain) 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain) 저해제를 포함하는 CD8+ T 세포에 의한 항암 치료 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 핵산 압타머로, 상기 핵산 압타머는 수용성 공통 감마 수용체를 특이적으로 표적하는 것을 특징으로 하는, 핵산 압타머를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 핵산 압타머로, 상기 핵산 압타머는 수용성 공통 감마 수용체를 특이적으로 표적하는 것을 특징으로 하는, 핵산 압타머를 제공한다.

본 발명에 따른 수용성 공통 감마 수용체 저해제는 수용성 공통 감마 수용체를 타겟으로 하여 이의 활성을 저해함으로써 세포 독성 CD8+ T 세포의 항암 반응을 증진시킨다. 수용성 공통 감마 수용체는 CD8+ T 세포의 생존 및 증식에 중요한 γc 사이토카인 중 IL-2 및 IL-15의 신호전달 경로를 억제하는 역할을 하여 CD8+ T 세포의 항암 반응을 억제하므로, 본 발명은 항암치료에서 CD8+ T 세포의 기능을 증진시키는 새로운 항암치료 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain, 이하 sγc) 유무에 따른 CD8+ T 세포의 증식 양상을 나타낸 도이다(빈 원: IL-2로 자극된 대조군 CD8+ T 세포(veh), 채워진 원: sγc 처리한 CD8+ T 세포(rsγc)).
도 2는 sγc 처리에 따른 OVA 특이적으로 면역된 CD8+ T 세포의 사이토카인(IFNγ) 생산량을 나타낸 도이다.
도 3은 sγc 처리에 따른 CD8+ T 세포의 항암 독성 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 sγc 발현에 따른 CD8+ T 세포의 사이토카인(IFNγ) 및 granzyme B 생산량을 나타낸 도이다(WT: 대조군, sγcKO: sγc 넉-다운 마우스, sγcTg: sγc 과발현 마우스).
도 5는 sγc 발현에 따른 생체 내 CD8+ T 세포의 사이토카인(IFNγ) 및 granzyme B 생산량을 나타낸 도이다(OT-I: 대조군, sγcKOOT-I: sγc 넉-다운 마우스의 CD8+ T 세포, sγcTgOT-I: sγc 과발현 마우스의 CD8+ T 세포).
도 6은 sγc 발현에 따른 암 증식 양상을 나타낸 도이다(WT: WT CD8 T 세포가 처리된 대조군, sγcKOOTI: sγc KO된 OTⅠ T 세포가 이식된 마우스, OTI: OTⅠ T 세포가 이식된 마우스, sγcTgOTI: sγc가 과발현된 OTⅠ T 세포가 이식된 마우스).
도 7은 도 6에서 사용된 마우스에서 암 덩어리를 적출하여 이식된 독성 T 세포의 sγc 발현에 따른 종양의 무게 변화 양상을 나타낸 도이다.
도 8은 마우스에 이식된 sγcKO OT-Ⅰ CD8+ T 세포의 증식능력을 나타낸 도이다.
도 9는 이식된 CD8+ T세포의 사이토카인 및 granzyme B 분비량을 나타낸 도이다.
도 10은 sγc에 특이적으로 반응하는 5개의 압타머를 처리 후 분리한 sγc의 웨스턴 블롯을 실시한 결과를 나타낸 도이다(IP: immunoprecipitation, IB: Immuno blotting, α-γc-ED: gc의 외부 구조를 특이적으로 인식하는 항체).
도 11은 Nap29의 염기서열을 이용하여 예측한 압타머의 이차구조를 나타낸 도이다.
도 12는 Nap30의 염기서열을 이용하여 예측한 압타머의 이차구조를 나타낸 도이다.
도 13은 sγc의 이합체 형성 및 압타머에 의한 이합체 형성 억제로 IL-2 신호전달경로가 활성화되는 메커니즘을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain, 이하 sγc) 저해제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 sγc는 수용성 형태의 공통 감마 수용체이다. 공통 감마 수용체의 경우 인터루킨(IL)-2, -4, -7, -9, -15 및 -21의 신호전달에 공통으로 공유되는 수용체로 면역세포의 생존, 발달, 분화, 기능 등에 필수적인 요소이며, γc는 활성 T 세포에서 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 그 발현이 증가된다.

본 발명에 따른 sγc 저해제는 sγc가 IL-2 및 IL-15와 결합하여 IL-2 및 IL-15 신호전달을 억제하는 것을 막아, T 세포에 의한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. IL-2(Interleukin-2, 인터루킨 2)는 T 세포가 분비하는 사이토카인으로서 체내 적응면역반응에 있어서 T 세포에 의한 NK 세포(자연살해세포)의 활성화에 관여하는 것으로 알려져 있으며 시험관 내에서 NK 세포를 활성화 시키기 위해 일반적으로 많이 사용되는 사이토카인이다. IL-15(Interleukin-15, 인터루킨 15)는 4개의 나선 구조로 이루어진 사이토카인으로 IL-2와 많은 유사성을 가지고 있으며, CD8+ T 세포나 자연살해세포(NK cell)에 미치는 영향에 있어서 IL-2와 비슷한 기능을 가지며 수용체 결합과 신호 전달에도 IL-2 수용체의 β와 γ subunit을 필요로 한다. 다만, IL-15의 경우 주로 T 세포에서 생산되는 IL-2와 달리 활성화된 수지상세포 또는 대식세포(macrophage)와 태반이나 근육과 같은 비림프 조직, 그리고 상피세포나 섬유세포에서 생산되는 사이토카인으로서 체내 선천면역반응 과정에서 NK 세포의 활성화 및 증식을 유발한다.

본 발명에 있어서, 상기 저해제는 압타머, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니고, 바람직하게는, 압타머일 수 있다.

상기 “압타머(Aptamer)”는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 압타머는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다.

상기 “안티센스 뉴클레오티드”는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다. 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.

상기 “siRNA”는 센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 sγc mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 저해제는 서열번호 1로 표시되는 압타머일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 저해제는 서열번호 2로 표시되는 압타머일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 저해제는 사이토카인 생산량을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “사이토카인”은 말초혈액 단핵구를 자연 살해세포로 유도하는데 사용 가능한 면역 활성화 사이토카인을 의미하며, IFN-γ(인터페론-감마), TNF-α(종양괴사인자-알파) 및 MIP-1β(대식세포 염증성 단백질-1β)로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인일 수 있다. IFN-γ 는 NK 세포, 수지상 세포, Tc 세포, Th1 세포 등에 의해 분비되며, 암의 제어에 대한 선천성 면역과 적응성 면역에 중요한 역할을 하는 사이토카인으로 알려져 있다. TNF-α 또한 암세포를 죽일 뿐만 아니라, 대식세포와 같은 세포에 작용하여 세균과 같은 외부 침입자들을 죽이는 역할을 하며, T 세포의 활성을 유도하고, B 세포에 작용하여 항체 생산을 위한 보조인자로 작용한다. 따라서, 예를 들어, IFN-γ나 TNF-α의 수치가 정상인에 비해 낮은 경우 암의 제어를 위한 NK 세포의 활성에 문제가 있음을 나타낼 수 있으므로, 인위적으로 활성화시킨 NK 세포로부터 분비된 IFN-γ나 TNF-α의 양을 정상인의 IFN-γ나 TNF-α의 양과 비교함으로써 NK 세포의 활성을 판단할 수 있게 된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 sγc 넉-다운된 마우스에서 IFNγ 및 Granzyme B가 확연하게 증가하고 sγc 넉-다운 마우스에서, OVA 항원에 의해 면역된 CD8+ T 세포(OTⅠ T 세포)의 사이토카인 생산량이 증가함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 수용성 공통 감마 수용체 저해제는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 저해제는 CD8+ T 세포의 IL-2 또는 IL-15 신호전달을 강화시키는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CD8+ T 세포를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함된 Sγc 저해제에 의해 IL-2와 IL-15의 신호전달이 강화되는 바, 그 결과 조성물에 포함된 CD8+ T 세포가 활성화되어 CD8+ T 세포의 항암 면역 반응이 증진될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여량은 암을 예방 또는 치료하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 암의 종류, 암의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 저해제는 CD8+ T 세포의 생존율을 증가시키고, 그 결과 CD8+ T 세포에 의한 항암면역 반응을 증가시켜 효과적인 항암 치료 보조제로 사용될 수 있다.

본 발명의 수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain) 저해제를 포함하는 CD8+ T 세포에 의한 항암 치료 보조제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조할 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항암치료 보조제는 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 항암치료 보조제로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 항암치료 보조제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항암치료 보조제는 경구 또는 비경구 투여를 위한 제제 일 수 있다. 예를 들어, 경구제제는 캡슐제, 정제, 피복정, 서방정, 과립제, 산제, 시럽, 현탁제, 유제, 즙, 에어로졸, 좌제일 수 있고, 비경구제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 일 수 있다. 비경구제제의 경우에는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 직장, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

경구 투여를 위한 제제의 경우, 허용 가능한 약제학적 담체는 희석제, 방부제, 결합제, 윤활제, 붕괴제, 팽윤제, 충진제, 안정화제 및 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 담체는 또한 가소제, 색소, 색료, 안정화제 및 유동화제를 포함할 수 있는 코팅 조성물의 모든 성분들을 포함할 수 있다. 적합한 코팅 물질의 예로는 세룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필 세룰로오스, 히드록시프로필 메틸세룰로오스, 히드록시프로필 메틸세룰로오스 프탈레이트 및 히드록시프로필 메틸세룰로오스 아세테이트 석시네이트와 같은 세룰로오스 중합체; 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 아크릴산 중합체 및 공중합체, 및 메타크릴수지, 제인, 셀락 및 다당류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 상기 코팅 물질은 가소제, 색소, 색료, 유동화제, 안정화제, 다공 형성제 및 계면활성제와 같은 통상적인 담체를 함유할 수 있다. 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제는 희석제, 결합제, 윤활제, 붕괴제, 색료, 안정화제 및 계면활성제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 1로 표시되는 핵산 압타머는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 핵심 서열로 할 수 있다.

상기 서열번호 2로 표시되는 핵산 압타머는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 핵심 서열로 할 수 있다.

기존 연구에 의하면 sγc는 이합체를 형성했을 때 효과적인 γc 사이토카인 억제 효과를 보인다. 따라서 sγc의 이합체 형성을 저해하는 저해제는 항암 독성 T 세포 기능을 증진시킬 수 있으며, 본 발명자들은 압타머를 기반으로 한 저해제를 개발하였다. 압타머는 기존의 단일항체의 단점을 보완한 대체물질로, 상기 핵산 압타머는 sγc 이합체를 형성하는 구조에 특이적으로 결합하여 이합체 형성을 억제하므로 사이토카인 발현 조절이 가능해 항종양 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

상기 압타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX라 불리는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 압타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

상기 핵산 압타머는 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산 압타머는 서열번호 3 또는 4의 핵심 서열을 포함하는 핵산 압타머 또는 이의 작용상 동등한 변이체일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 압타머는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가질 수 있으며, 상기 서열과 상보적인 서열도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 또는 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열일 수 있다. 구체적으로, 핵산 압타머 유전자는 서열번호 1 또는 2의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Sγc 처리 유무에 따른 CD8+ T 세포의 증식 양상 확인

1.1 sγc의 준비

DMEM 배양액 250μl에 Plus reagent 8μl를 넣어 MIX1을 만들고 fresh한 DMEM 250μl에 sγc DNA 2μg 및 lipopectamin 6μl를 넣어 MIX2를 만들어 실온에서 15분간 반응시켰다. MIX1과 MIX2를 섞어 30분간 실온에서 반응 시키는 동안 6-웰 플레이트에서 50~60% 자란 293T 세포를 PBS로 세척하였다. 그 후 MIX1+2 500μl를 293T 세포가 있는 웰에 방울 방울 떨어뜨려 37℃ 에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간 후 20% FBS를 2ml 넣고 37℃에서 3일간 배양하여 얻어진 상층액을 통해 sγc를 수득하였다.

1.2 CD8+ T 세포의 증식 양상 확인

Sγc 처리가 CD8+ T 세포의 세포 증식(cell proliferation)에 미치는 영향을 측정하기 위하여 CFSE [carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester; Invitrogen] proliferation assay를 이용하여 세포 증식을 측정하였다. 대조군(WT) 쥐의 림프절에서 CD4 특이 항체와 B 세포 특이 항체로 B 세포와 CD4+ 세포를 제거하여 분리한 CD8+ T 세포를 CFSE로 8분간 염색하여 human IL-2 단독 또는 Sγc를 처리하여 2일, 3일 배양한 뒤 유세포분석기(FACs, fluorescent-activated cell sorter)를 이용하여 세포의 형광 감도 정도를 측정하여 세포의 증식능력 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, in vitro에서 IL-2로 자극된 대조군(veh)의 CD8+ T 세포는 매우 활발히 증식을 하는 반면, sγc를 처리하게 되면 대조군보다 CD8+ T 세포의 증식이 2일과 3일에 평균 50%로 줄어드는 것을 확인하였다.

실시예 2. Sγc 처리 유무에 따른 CD8+ T 세포의 사이토카인 생산량 및 세포 독성 확인

2.1 CD8+ T 세포의 사이토카인 생산량 확인

CFSE 염색된 CD8+ T 세포를 OVA(ovalbumin) 펩타이드로 자극하여 OVA 특이적인 면역 상태에서 sγc 처리 유무에 따른 CD8+ T 세포의 사이토카인 IFNγ 생산량을 측정하였다. OVA₂₅₇ _-264는 0ng/ml, 1ng/ml, 10ng/ml 및 100ng/ml 의 순차적인 농도로 처리하였고, 실험군에는 sγc를 처리하여 2일 배양하였다. 표면 단백질을 4℃에서 30분간 염색한 뒤 세포막을 뚫는 용액을 20분간 실온에서 처리하여 세포막을 뚫은 뒤 세포질로 발현된 IFNγ를 실온에서 40분간 염색하여 FACs로 사이토카인 생산량을 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, OVA 특이적으로 면역된 CD8+ T 세포에서는 IFNγ 발현이 증가하였으나, sγc를 처리하면 모든 농도에서 세포 독성 사이토카인인 IFNγ의 발현이 확연하게 줄어드는 것을 확인하였다.

2.2 CD8+ T 세포의 항암 독성 확인

CD8+ T 세포의 항암 독성을 실험하기 위해 3일간 5ug/ml의 sγc 및 10ng/ml의 OVA로 자극된 마우스 비장세포에서 분리해낸 CD8+ T 세포에 EL4 (CFSE-low 0.5uM)와 EG7(CFSE-High 2.5uM: 표적세포)를 각각 섞어 8시간 동안 배양한 뒤 이 두 그룹을 합하여 FACS를 이용해 항암 독성을 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, sγc 처리된 CD8+ T 세포는 대조군에 비하여 훨씬 더 낮은 수준의 항암 독성을 가지고 있음을 확인하였다. 구체적으로, sγc 가 처리된 독성 CD8+ T 세포의 경우, 표적세포(T)에 대한 효과세포(E)의 비율이 높아짐에도 불구하고 CFSE-high에 해당하는 히스토그램 높이의 감소율이 대조군에 비하여 현저히 적음을 확인하였다. 이를 통해 sγc 처리에 따라 CD8+ T 세포의 사이토카인(IFNγ) 발현의 현저한 감소와 상응하여 CD8+ T 세포의 항암 독성도 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 이는 CD8+ T 세포의 증식과 항암 독성 기능이 sγc에 의해 억제됨을 의미한다.

실시예 3. in vivo 동물모델에서 sγc 발현에 따른 CD8+ T 세포의 사이토카인 생산량 확인

3.1 동물모델의 준비

본 연구실 소유의 γcKO 쥐와 mγcBACTg 쥐를 교배하여 세포막의 감마 수용체는 정상적으로 발현되지만 수용성 감마 수용체는 발현하지 않는 sγcKO (γc-/-mγcBACTg) 쥐를 생산하였다. Human CD2 프로모터를 가지는 벡터에 sγc cDNA를 삽입한 뒤 수태된 B6 쥐의 난모세포에 삽입하여 sγc가 과발현되는 sγcTg쥐를 생산하였다.

3.2 sγc 넉-다운 마우스(sγcKO)의 사이토카인 생산량 확인

상기 sγc 넉-다운(knock-down) 마우스(sγcKO)의 사이토카인(IFNγ) 및 Granzyme B 발현 능력을 알아보기 위하여 유세포분석을 수행하였다. 대조군, sγc 넉-다운 마우스(sγcKO) 및 sγc 과발현 마우스(sγcTg)의 비장을 분리하고 단일 세포로 분리한 뒤 FACs를 통해 면역조절 기능을 조사하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군(WT) 및 sγc 과발현 마우스(sγcTg)에 비해 sγc 넉-다운된 마우스에서 IFNγ 및 Granzyme B가 확연하게 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 sγc가 CD8+ T 세포의 사이토카인 생산을 억제함을 확인하였으며, sγc를 넉-다운 시키는 경우 CD8+ T 세포의 사이토카인 생산을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. Sγc 넉-다운 마우스를 이용한 사이토카인 생산 및 종양 억제능 확인

4.1 OVA 항원 특이적 면역된 CD8+ T 세포의 사이토카인 생산량 확인

sγc 넉-다운 마우스 및 sγc 과발현 마우스에서, OVA 항원에 의해 면역된 CD8+ T 세포(OT-Ⅰ T 세포)의 사이토카인 생산량을 측정하였다. OT-Ⅰ T 세포를 생체 내에서 2주간 면역화 시킨 뒤, 림프절의 CD8+ T 세포를 분리하여 OVA로 재활성화 시켰을 때의 세포 독성 사이토카인인 IFNγ 및 Granzyme B 생산량을 측정하였다. 이를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, sγc 넉-다운 마우스의 CD8+ T 세포(sγcKOOT-I)에서 대조군(OT-I)이나 sγc 과발현 마우스의 CD8+ T 세포(sγcTgOT-I)보다 IFNγ 및 Granzyme B 생산량이 확연하게 증가된 것을 확인하였다.

4.2 OVA 항원 특이적 면역된 CD8+ T 세포에서 종양의 크기 감소 확인

마우스에 5 X 10⁵ 개의 OVA 항원 발현 종양 세포(EG7)를 피하로 주입하였다. 그로부터 10일 후, 대조군(WT), sγcKO된 OVA 특이 CD8+ T 세포인 OT-I 세포(sγcKOOT-I), OT-I 세포(OT-I) 및 sγc가 과발현된 OT-I 세포(sγcTgOT-I)를 5~6 × 10⁶/100㎕/mouse (in PBS)로 각각 정맥 주사하였다. 주사 후 종양 증식을 관찰하였고 실험 마지막에 생쥐를 희생시켜 무게 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, WT, OT-I, sγcTg OT-Ⅰ T세포가 이식된 마우스보다 sγcKO된 OT-I T 세포가 이식된 마우스에서 종양의 크기가 가장 많이 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, sγcKO된 OT-Ⅰ T 세포가 이식된 마우스에서 종양의 무게가 가장 많이 감소한 것을 확인하였다. 이는 CD8+ T 세포에 의해 생산되는 sγc가 항암 면역 반응을 저하시킴을 의미한다. 저하된 항암 반응은 sγc 제거 시 회복되었으며, 이를 통해 sγc 제거를 통해 항암 면역 반응을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

4.3 이식된 CD8+ T 세포의 지속력 확인

마우스에 이식된 sγcKO OT-Ⅰ CD8+ T 세포의 지속력을 확인하였다. 공여 세포와 수여 세포를 구분하기 위하여 콘제닉 마우스(congenic mouse)를 사용하여 공여 세포의 증식을 관찰하였다. 공여 세포는 CD45.1/2을 발현하고 수여 생쥐의 세포는 CD45.2를 발현하기 때문에 이 단백질을 마커로 하여 각각의 경우를 관찰하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, CD45.1 양성의 이식된 sγcKOOT-ITg CD8+ T 세포는 이식된 후 OT-I 또는 sγcTgOT-ITg CD8+ T 세포보다 12일에는 4배, 35일 에는 200배 이상 더 많이 살아있는 것을 확인하였다. 이는 이식된 CD8+ T 세포의 sγc 넉-다운으로 인해 CD8+ T 세포가 이식된 숙주 몸에서 더 오래 살아남음을 의미한다.

4.4 이식된 CD8+ T 세포의 사이토카인 분비량 확인

CD8+ T 세포가 이식된 마우스의 피와 비장세포에서 CD8+ T 세포와 이식해준 세포의 표면 단백질인 CD45.1을 30분간 4℃에서 염색하여 FACs로 생체 내에 남아있는 이식된 세포를 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, sγcTgOT-I 마우스와 비교했을 때 사이토카인을 생산하는 CD8+ T 세포는 sγcKOOT-I 마우스에서 항원(OVA) 특이적 반응에 의한 IFNγ 분비량이 16배, Granzyme B는 17배 증가하고 비특이적 자극(PMA/Ionomycin)에서 IFNγ 분비량은 11배, Granzyme B는 2배 이상 증가함을 확인하였다. 이는 이식된 CD8+ T세포의 sγc 넉-다운으로 인해 CD8+ T 세포의 사이토카인 분비가 증가함을 의미한다.

이를 통해 sγc는 세포 독성 CD8+ T 세포의 생존, 증식에 중요한 γc 사이토카인중 하나인 IL-2, IL-15의 신호 전달을 억제하는 역할을 하여 세포독성 CD8+ T 세포의 항암 반응을 저해함을 확인하였다. 따라서, sγc를 제거 또는 기능을 저해하여 세포 독성 CD8+ T 세포의 항암 반응을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. Sγc을 타겟으로 한 기능 저해제로서의 압타머 설계

상기 실시예를 통해, sγc가 새로운 항암 치료의 표적이 될 수 있으며, sγc 억제시 CD8+ T 세포의 IL-2, IL-15 신호전달을 강화함으로써 항암 효과를 높일 수 있음을 확인하였으므로 sγc를 저해할 수 있는 압타머 저해제를 설계하였다.

구체적으로는 다음과 같다. SELEX 기술을 이용하여 9 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴하여 총 5개의 압타머를 이용한 실험을 수행하였다. HEK 293T 세포에 sγc 발현 벡터 0.5㎍를 형질주입 기법으로 주입하고, 6시간 후 각각의 압타머를 100nM씩 처리하였다. 이를 37℃ CO₂ 배양기에 2일 동안 배양한 뒤 상층액을 분리하였다. IP 실험기법에 sγc의 extracellular domain(ED) 부분을 잡는 α-sγc-ED 항체를 이용하여 상층액에서 sγc를 분리하였으며, 분리한 sγc에 1M DTT 처리 없이 웨스턴 블랏(IB) 실험을 진행하여 sγc를 크기 별로 분리하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 다수의 후보군 중 sγc의 이합체를 가장 효과적으로 억제하는 압타머는 Nap29, Nap30임을 확인하였으며, 이의 이차 구조를 예측한 결과는 각각 도 11 및 도 12에 나타내었고 Nap29의 서열은 서열번호 1로, Nap30의 서열은 서열번호 2로 나타내었다.

본원 발명과 같이 sγc의 이합체 형성을 특이적으로 방해하는 압타머는 항암치료에 있어서 sγc를 표적으로 하여 환자 내 CD8+ T 세포의 IL-2, IL-15 신호전달을 강화할 수 있다.

이를 통해, 상기 압타머는 sγc를 저해함에 따라 세포독성 CD8+ T 세포의 항암 반응을 증진하여 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Composition for preventing or treating cancer comprising soluble common gamma chain inhibitor <130> PNU1-343 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nap 29 full sequence <400> 1 cgagcgtcct gcctttgcaa tccgtgactc atatactata gcggatgctg aagcactcac 60 cgacagccac ccag 74 <210> 2 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nap 30 full sequence <400> 2 cgagcgtcct gcctttgaag acgcgttcac gacgacttgt ctagcttagc gcgtgtgcac 60 cgacagccac ccag 74 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nap 29 core sequence <400> 3 aatccgtgac tcatatacta tagcggatgc tgaagcac 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nap 30 core sequence <400> 4 agacgcgttc acgacgactt gtctagctta gcgcgtgt 38

Claims

수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain) 저해제 및 CD8+ T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 저해제는 압타머, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 저해제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 압타머인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 저해제는 사이토카인 생산량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 저해제는 CD8+ T 세포의 IL-2 또는 IL-15 신호전달을 강화시키는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 요도암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 피부암, 골수종, 백혈병 및 악성림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
수용성 공통 감마 수용체(soluble common gamma chain) 저해제 및 CD8+ T 세포를 포함하는 CD8+ T 세포에 의한 항암 치료 보조제로서,
상기 저해제는 압타머, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암 치료 보조제.
제8항에 있어서, 상기 저해제는 CD8+ T 세포의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 항암 치료 보조제.
서열번호 1로 표시되는 핵산 압타머로, 상기 핵산 압타머는 수용성 공통 감마 수용체를 특이적으로 표적하는 것을 특징으로 하는, 핵산 압타머.
서열번호 2로 표시되는 핵산 압타머로, 상기 핵산 압타머는 수용성 공통 감마 수용체를 특이적으로 표적하는 것을 특징으로 하는, 핵산 압타머.