KR102626708B1 - 알로페론을 포함하는 nk세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 nk 세포 배양방법 - Google Patents
알로페론을 포함하는 nk세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 nk 세포 배양방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알로페론을 함유하는 NK 세포 배양용 조성물에 관한 것으로서, NK 세포 배양시 배지에 첨가함으로써 기존의 NK 세포 배지를 사용하는 경우와 비교하여 NK 세포의 수득률을 증가시키고, NK 세포의 활성화까지 유도할 수 있다.
Description
본 발명은 NK 세포 배양용 조성물에 관한 것으로서, NK 세포 배양 배지에 알로페론을 첨가하여 NK 세포의 증식율을 증가시키고, NK 세포의 활성도를 증가시킬 수 있다.
면역계의 유효성을 자극시킬 수 있는, 곤충을 포함한 동물 및 식물조직의 물질을 함유한 여러가지 자연산 성분들이 알려져 있다. 그 중, 알로페론(Alloferon)은 감염된 파리의 면역물질에서 기원한 분자량 1265 달톤의 선형 펩타이드로 지금까지 다양한 연구에 의하면 면역조절(immune modulating)작용을 통해 광범위한 항바이러스, 항암, 항염증 항알러지 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 알로페론은 체내에 신속히 흡수되어 장기간 안정적으로 체류함으로써 그 효능을 극대화하고, 특히 무독성의 약품분류 상 Class I의 신약으로 판매되고 있다.
한편, NK 세포는 림프구에 포함되는 면역 세포의 하나로, 만들어지면서부터 외부의 적을 살상하는 능력을 갖추고 있다는 특성으로 인해 '자연살상(Natural Killer, NK) 세포'라고 불린다. NK 세포는 체내에서 폭넓게 행동하면서, 암 세포와 바이러스 감염 세포 등의 이상 세포를 발견하면 제일 먼저 단독으로 공격할 수 있다. 이러한 단독성과 즉효성이 NK 세포의 가장 큰 특징이다. NK 세포는 항원 항체 반응이 없기 때문에 직접 자유롭고 유연하게 이상 세포를 공격할 수 있어서, 암 세포를 공격하는 면역 세포 중에서도 능력이 출중하여 세포 치료제로 주목 받고 있다.
한국특허공고 제10-0394864호는 이러한 알로페론의 항암제로서의 용도를 개사한다. 그러나 NK 세포의 배양 물질로 사용함으로서, NK 세포의 증식률 증가 효과나 NK 세포 활성에 영향을 미칠 수 있음은 개시하지 않는다.
일 양상은, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드 또는 이들의 조합을 포함하는 NK 세포 배양용 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포 배양용 조성물은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드 또는 이들의 조합; IL-2; 및 IL-12, IL-15, OKT-3 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 NK 세포 배양용 조성물은 FBS 또는 자가 혈장, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 트랜스페린 또는 이들의 조합을 더 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 NK 세포 배양용 조성물은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드 또는 이들의 조합, IL-2, IL-12, IL-15, 및 OKT-3을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 NK 세포 배양용 조성물은 상기 폴리펩티드를 6 mg/L 내지 40 mg/L로 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 NK 세포 배양용 조성물은 상기 IL-2를 세포 배양 배지 총 부피 대비 0.5 mg/L 내지 5 mg/L; IL-12를 세포 배양 배지 총 부피 대비 0.5 mg/L 내지 5 mg/L; IL-15를 세포 배양 배지 총 부피 대비 5 mg/L 내지 15 mg/L; 및 OKT-3을 세포 배양 배지 총 부피 대비 10 mg/L 내지 30 mg/L로 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 NK 세포 배양용 조성물은 상기 FBS 또는 자가 혈장을 배양 배지 총 부피 대비 1 v/v% 내지 20 v/v%; 상기 인간 혈청 알부민을 배양 배지 총 부피 대비 100 mg/L 내지 3,000 mg/L; 상기 인슐린을 배양 배지 총 부피 대비 5 mg/L 내지 15 mg/L; 및 상기 트랜스페린을 배양 배지 총 부피 대비 5 mg/L 내지 15 mg/L로 포함한다.
다른 양상은, 상기 NK 세포 배양용 조성물이 함유된 배지에서 NK 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 NK 세포 배양용 조성물은, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드 또는 이들의 조합; 및 IL-2, IL-12, IL-15, OKT-3 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 각 폴리펩티드는 알로페론으로서, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드는 알로페론 1, 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드는 알로페론 2, 서열번호 3로 표시되는 폴리펩티드는 알로페론 3, 및 서열번호 4로 표시되는 폴리펩티드는 알로페론 4로 명명될 수 있다.
상기 폴리펩티드는 알로페론 1, 알로페론 2, 알로페론 3, 및 알로페론 4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조합일 수 있다. 구체적으로, 일 구체예에 따른 NK 세포 배양용 조성물은 상기 폴리펩티드는 알로페론 1, 알로페론 2, 알로페론 3, 및 알로페론 4를 각각 단독 물질로 포함할 수 있고, 알로페론 1 및 2의 조합, 알로페론 1 및 3의 조합, 알로페론 1 및 4의 조합, 알로페론 2 및 3의 조합, 알로페론 2 및 4의 조합, 알로페론 3 및 4의 조합, 또는 알로페론 1, 2, 3, 및 4의 조합을 포함할 수 있다.
상기 NK 세포 배양용 조성물은, IL-2 (interleukin -2), IL-12(interleukin-12), IL-15 (interleukin-15), 및 OKT-3(Anti-CD3 antibody)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 NK 세포 배양용 조성물은 IL-2에 더하여 IL-12, IL-15, 및 OKT-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다. 여기서, IL-2는 배양 배지 총 부피 대비 0.5 mg/L 내지 5 mg/L, 0.5 mg/L 내지 4 mg/L, 1 mg/L 내지 3 mg/L, 1 mg/L 내지 2.5 mg/L, 1.5 mg/L 내지 2.5 mg/L, 또는 2 mg/L로 포함될 수 있다. IL-12는 배양 배지 총 부피 대비 0.5 mg/L 내지 5 mg/L, 0.5 mg/L 내지 4 mg/L, 1 mg/L 내지 3 mg/L, 1 mg/L 내지 2.5 mg/L, 1.5 mg/L 내지 2.5 mg/L, 또는 2 mg/L로 포함될 수 있다. IL-15는 배양 배지 총 부피 대비 5 mg/L 내지 15 mg/L, 7 mg/L 내지 12 mg/L, 8 mg/L 내지 11 mg/L, 또는 10 mg/L로 포함될 수 있다. OKT-3는 배양 배지 총 부피 대비 10 mg/L 내지 30 mg/L, 12 mg/L 내지 28 mg/L, 15 mg/L 내지 25 mg/L, 18 mg/L 내지 22 mg/L, 19 mg/L 내지 21 mg/L 또는 20mg/L로 포함될 수 있다. 상기 NK 세포 배양용 조성물은, IL-2는 포함하면서, IL-12, IL-15, 및 OKT-3은 포함하지 않을 수 있다. IL-2와 알로페론의 조합을 포함하면 NK 세포의 배양 효율이 현저히 증가하므로, 비용 절감과 불필요한 성분 함유로 인한 부작용을 최소화하는데 유리할 수 있다. 다만 배양 안정성과 같은 문제를 해결하기 위해 IL-2 및 알로페론에 IL-12, IL-15, 또는 OKT-3을 첨가하거나 그 양을 적절히 증감할 수 있다.
상기 NK 세포 배양용 조성물은, FBS 또는 자가 혈장, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 및 트랜스페린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 FBS 또는 자가 혈장은 배양 배지 총 부피 대비 1 v/v% 내지 20 v/v%, 5 v/v% 내지 15 v/v%, 8 v/v% 내지 12 v/v%, 또는 10 v/v%로 포함될 수 있다. 상기 인간 혈청 알부민은 배양 배지 총 부피 대비 100 mg/L 내지 3,000 mg/L, 500 mg/L 내지 2,500 mg/L, 1,000 mg/L 내지 2,500 mg/L, 1,500 mg/L 내지 2,500 mg/L, 1,800 mg/L 내지 2,200 mg/L, 또는 2,000mg/L로 포함될 수 있다. 상기 인슐린은 배양 배지 총 부피 대비 5 mg/L 내지 15 mg/L, 7 mg/L 내지 12 mg/L, 8 mg/L 내지 11 mg/L, 또는 10 mg/L로 포함될 수 있다. 상기 트랜스페린은 배양 배지 총 부피 대비 5 mg/L 내지 15 mg/L, 7 mg/L 내지 12 mg/L, 8 mg/L 내지 11 mg/L, 또는 10 mg/L로 포함될 수 있다.
상기 NK 세포 배양용 조성물은 기본 배지로 통상적으로 알려진 배지를 포함하고, 예를 들어 RPMI 1640 배지가 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 NK 세포 배양용 조성물은 상기 폴리펩티드를 6 mg/L 내지 40 mg/L, 8 mg/L 내지 30 mg/L, 8 mg/L 내지 25 mg/L, 8 mg/L 내지 20 mg/L, 8 mg/L 내지 15 mg/L, 8 mg/L 내지 12 mg/L, 또는 10 mg/L로 포함한다.
상기 NK 세포 배용용 조성물의 각 성분의 함량은 NK 세포 수 1×104 cells/ml 내지 1×106 cells/ml, 또는 1×105 cells/ml를 배양하기에 적합한 양일 수 있다.
다른 양상은, 개체로부터 분리된 혈액으로부터 NK 세포를 수득하는 단계; 및
청구항 1의 NK 세포 배양 배지에 NK 세포를 배양하는 단계를 포함하는, NK 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 NK 세포 배양용 조성물을 사용하여 NK 세포를 배양하는 경우, 알로페론을 처리하지 않는 경우와 비교하여 NK 세포 수득률을 3배 이상 증가시킬 수 있다. 또한 NKT 세포의 증식률은 알로페론을 처리하지 않는 경우와 비교하여 0.6 배 이하, 0.55 배 이하, 0.5 배 이하, 0.45 배 이하, 또는 0.4 배 이하로 감소시킬 수 있으므로, NK 세포 배양용으로 유리하다. (***NKT 세포의 기능 확인 후 삭제)
본 발명의 NK 세포 배양용 조성물은 또한 NK 세포를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 NK 세포 배양용 조성물을 포함하는 배지에서 배양한 경우 배양 전 대비 NKp30의 발현량은 45% 이상, 바람직하게는 55% 이상이고, NKp44의 발현량은 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상이고, NKp46의 발현량은 65% 이상, 바람직하게는 80% 이상이고, 퍼포린(perforin)의 발현량은 90% 이상, 바람직하게는 99% 이상일 수 있다. 또한 본 발명의 NK 세포 배양용 조성물을 포함하는 배지에서 배양한 경우 알로페론을 포함하지 않는 배지에서 배양한 경우에 비해 IFN-gamma 분비량이 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 또는 6 배 이상 증가할 수 있다.
본 발명의 NK 세포 배양용 조성물은 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"를 의미한다. 본 발명의 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 약학적 조성물의 투여로 암 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 약학적 조성물의 투여로 암 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 양상에 따른 NK 세포 배양용 조성물을 포함하는 배지에서 NK 세포를 배양함으로써, NK 세포의 수득률을 증가시킬 수 있다.
또한 일 양상에 따른 NK 세포 배양용 조성물의 존재하에 배양된 NK 세포는 우수한 암 살상 효과를 가지므로, 우수한 NK 세포를 배양하는데 유익하다.
도 1은 NK 세포 배양 배지에서 14일 동안 배양한 NK 세포의 모양을 이미지로 나타낸 것이다.
도 2는 NK 세포 배양 배지의 조건에 따른 세포의 증식 배수를 배양 일수에 따라 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 알로페론 펩타이드 처리 농도에 따른 세포 수 증식률을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 NK 세포 배양 조건에 따른 NK 세포 증식률을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 알로페론 1을 처리시 배양 초기(0일)에서 배양 종료 (21일) 후 NK cell의 증가 비율을 보여주는 FACS 분석 결과이다.
도 6은 일 구체예에 따른 NK 세포 배양 배지에서 배양시 NK 세포의 활성 정도를 FACS로 확인한 이미지이다.
도 7은 각 NK 세포 배양 배지 조건에 따른 NK 세포의 암세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 각 NK 세포 배양 배지 조건에 따른 세포의 과립화 분석 결과를 나타낸 FACS 분석 결과이다.
도 2는 NK 세포 배양 배지의 조건에 따른 세포의 증식 배수를 배양 일수에 따라 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 알로페론 펩타이드 처리 농도에 따른 세포 수 증식률을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 NK 세포 배양 조건에 따른 NK 세포 증식률을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 알로페론 1을 처리시 배양 초기(0일)에서 배양 종료 (21일) 후 NK cell의 증가 비율을 보여주는 FACS 분석 결과이다.
도 6은 일 구체예에 따른 NK 세포 배양 배지에서 배양시 NK 세포의 활성 정도를 FACS로 확인한 이미지이다.
도 7은 각 NK 세포 배양 배지 조건에 따른 NK 세포의 암세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 각 NK 세포 배양 배지 조건에 따른 세포의 과립화 분석 결과를 나타낸 FACS 분석 결과이다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이하의 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이하의 실험예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. NK 세포의 수득 및 NK 세포 배양 배지의 제조
1-1.
NK 세포의 수득
인간 체혈자로부터 혈액을 30ml 수집하고, RosetteSep NK enrichment antibody cocktail (50 ul/ml)을 첨가한 후 인산염완충용액(PBS)로 1:1 v/v로 희석하였다. 밀도구배원심분리(Ficoll-Plaque)를 이용하여 1600 rmp, 20 분 원심분리하여 NK 세포를 함유하는 세포층을 분리하였다. 이를 PBS로 세척하고 원심분리하는 방식으로 2회 반복하였다. 그런 다음 트립판 블루 염색하여 세포 수를 카운팅하고, 평균 수득 세포수 1.6 ~ 3.0 x 10^5 cell/ml을 얻은 후, NK 세포 배양 배지에서 세포를 배양하였다.
1-2.
NK 세포 배양 배지의 제조
NK세포 배양 배지로는 기존에 NK배양에 필요하다고 알려진 여러가지 물질을 조합한 것을 사용하였다. 구체적으로, RPMI1640를 기본 배지로 하고, 여기에 10% (v/v)FBS(F2442, Merck) 또는 자가혈장, 인간 혈청 알부민(Human serum albumin) 2,000mg/L, 재조합 인간 인슐린 10 mg/L, 재조합 인간 트랜스페린 10 mg/L, 재조합 인간 인터루킨2 (IL-2) 2 mg/L, 재조합 인간 인터루킨12 (IL-12) 2 mg/L, 재조합 인간 인터루킨15 (IL-15) 10 mg/L, 및 Anti-CD3 항체 (OKT-3) 20mg/L를 혼합하였다. 이를 실시예 1의 NK 세포 배양 배지로 하고, 여기에 필요에 따라 알로페론을 0.1~100mg/L로 필요에 따라 추가로 혼합하여 사용하였다.
1-3.
NK 세포 배양 배지의 NK 세포 배양 효과 확인
상기 실시예 1에 따라 제조된 NK 세포 배양 배지에서 NK 세포를 배양하였다. 그 결과, 도 1과 같이 배양 전의 전혈세포에는 매우 적은 숫자의 NK세포 포함 클러스터가 존재하나 배양 이후 이러한 클러스터의 크기가 커지고 숫자가 증가하는 것을 확인하였다.
시험예 1. 알로페론 첨가에 따른 NK 세포 배양 효과 확인
상기 실시예 1에서 제조된 각 배지에 알로페론을 첨가하는 경우에 따른 세포 증식 효과를 Cell proliferation assay ([3H]-thymidine incorporation)로 확인하였다.
구체적으로, 96-well plates에 NK 세포(1×105 cells/ml)를 넣어준 후 실시예 1의 NK 세포 배양 배지에 알로페론 1 내지 4를 각각 10mg/L씩 처리한 후 5% CO2, 37°C의 환경에서 48 시간 또는 21일 동안 배양하였다. 배양 후 [3H]-thymidine (37 mBq)을 well 당 0.2 μCi씩 넣어주고 8 시간 배양하였다. 96-well harvester를 이용하여 세포와 배지를 모두 glass fiber filter (size 90.120 mm; Wallac, Turkr, Finland)로 옮겼다. Filter를 말린 후 scintillator sheet (Meltilex, Wallac)를 녹여 filter를 코팅하였다. 그 후 1450 MicroBeta TriLux (PerkinElmer Life and Analytical Sciences)를 이용하여 방사능을 측정하였다. 여기서 첨가된 알로페론 1 내지 4의 각 아미노산 서열은 하기의 표 1과 같다.
| 알로페론 1 (서열번호 1) | HGVSGHGQHGVHG |
| 알로페론 2 (서열번호 2) | GVSGHGQHGVHG |
| 알로페론 3 (서열번호 3) | SGHGQHGV |
| 알로페론 4 (서열번호 4) | VSGHGQHGVH |
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, NK 세포 배양 배지에 알로페론1 내지 4를 각각 10mg/L로 처리하고 21일 동안 배양한 결과 NK 세포의 숫자가 평균 약 1430배 증가하였다. 반면 대조군인 일반배지에서는 NK 세포가 거의 자라지 않았고, 알로페론을 함유하지 않는 실시예 1의 NK 배양 배지에서 배양한 경우에도 NK세포가 자라기는 하나 21일 동안 약 1/5 정도로만 자라는 것을 확인하였다.
동일한 방식으로 알로페론 1의 농도를 달리하여 처리하고 21일 동안 배양한 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 처리해주는 알로페론의 양이 0.1~100mg/L로 증가할 수록 NK 세포의 양은 증가하였으나 10 mg/L의 농도에서 최대값을 이루는 것을 확인하였다.
시험예 2. 알로페론과 다른 인터루킨의 공동 처리 시 변화 확인
NK 세포의 배양시 알로페론 외에 영향을 미치는 인자를 확인하기 위해, 다양한 인터루킨의 조합을 공동 처리한 후 NK 세포 증식 효과를 확인하였다. 배지 조성을 제외하고 NK 세포 배양 방법은 시험예 1과 동일하게 하여 21일 동안 배양(***기간 임의)하였다.
그 결과 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알로페론 1만을 10mg/L로 넣었을 때 NK세포의 증식이 유도되는 것을 확인할 수 있었고, 다만 IL-2가 제외되는 경우는 세포 증식 효과가 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
시험예 3. NK 세포 증가 비율의 확인
NK 세포 증가 비율을 확인하기 위해 Flow Cytometry (FACS analysis) 분석을 수행하였다. 구체적으로, NK 세포를 시험예 1과 실시예 1(비처리) 및 실시예 1에 알로페론 1 내지 4를 각각 10mg/L 함유하는 배지에서 같이 21일 동안 배양하고 배양 전후의 세포를 1,400 rpm의 속도로 5분간 원심분리하여 수거하고, 수거된 세포를 PBS를 이용해 2번 세척하였다. 그런 다음 1ml의 PBS에 세포를 부유시키고 트립판 블루 염색을 통해 살아 있는 세포의 세포수를 측정하였다. FACS 튜브에 1 x 10^6 cells/tube가 되도록 분주하고 2 ml의 PBS를 추가하였다. 그 후 400g, 4℃에서 5분간 원심분리한 후 세포를 제외한 상등액을 제거하였다. 남겨진 세포 펠렛에 100㎕의 1% 알부민을 첨가하고 PBS와 함께 항체를 넣고 혼합하였다. 항체 (CD3-FITC, CD56-PE)를 각각 NK 세포에 처리하여 빛을 차단한 상태로 30 분 반응시킨 후 다시 PBS를 이용하여 세포를 2 회 세척하였다. NK 세포를 적정량의 PBS에 부유시킨 후 FACSVerse(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 자료를 비교 분석하였다. 그 결과를 표 2, 표 3, 및 도 5에 나타내었다.
실시예 1의 NK 세포 배양 배지에 10 mg/L의 알로페론 1을 추가하여 배양 초기(0일)에서 배양 종료 (21일) 후 NK cell 및 다른 면역세포의 증가 비율을 확인한 결과, NK 세포의 증가는 일반배지 (RPMI)에서 키웠을 때에 비하여 세포 숫자는 1430배 증가하였으며, 그 중에서 NKT 세포의 증가는 560배, NK세포의 증가는 8,790배 증가하여 배양 후에는 대조 군에 비해 NK 세포의 증가가 현저히 높은 것을 확인하였다.
동일한 방법으로 알로페론 2 내지 4를 각각 처리한 후 NK 세포 증가 비율을 확인하였고, 이를 하기의 표 3에 나타내었다. 알로페론을 처리하지 않은 실시예 1의 NK 세포 배양 배지에서 배양된 군과 비교하면 알로페론을 처리하는 경우 NK 세포의 증식률이 3 배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다.
시험예 4. NK 세포 활성 수용체 발현의 비교
상기 시험예 3의 결과를 바탕으로 NK 세포의 활성도를 측정하기 위해 수용체 발현을 확인하고 비교하였다. 구체적으로 시험예 3과 같이 NK 세포를 각 배지에서 배양하고 21일간 증식된 NK세포의 활성도를 측정하기 위하여, 증식된 NK세포를 Flow cytometry로 분리하고, 이 세포에 대해 activating marker의 발현을 추가로 확인하였다. 배양한 NK 세포를 PBS을 이용하여 2 회 세척한 후 FACS 튜브에 1 x 10^6 cells/tube가 되도록 분주하고 2 ml의 PBS를 추가하였다. 그 후 400g, 4℃에서 5분간 원심분리 한 후 세포를 제외한 상등액을 제거하였다. 남겨진 세포 펠렛에 100㎕의 1% 알부민을 첨가하고 PBS와 함께 항체 (CD3-FITC, CD56-PE)를 이용하여 Sorting한 후 이를 표면 마커에 따라 분리하였다. 분리된 세포에 추가로 NK 세포 표면의 activating receptors (NKp30, NKp44, NKp46) 및 Perforin의 발현을 확인하기 위하여 항체 (Anti-NKp30, anti-NKp44, anti NKp46 및 Perforin 항체를 각각 NK 세포에 처리하여 빛을 차단한 상태로 30 분 반응시킨 후 다시 PBS를 이용하여 세포를 2 회 세척하였다. NK 세포를 적정양의 PBS에 부유시킨 후 FACS AriaII (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 자료를 비교 분석하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 알로페론 1을 첨가한 NK배지에서 배양한 세포는 알로페론이 첨가되지 않은 일반배지나 실시예 1의 NK 세포 배양 배지보다 높은 NK 활성도를 보여주었다.
마찬가지로 알로페론 2 내지 4에 대해서도 동일한 시험을 수행한 결과, 하기의 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 알로페론이 첨가되지 않은 일반배지나 실시예 1의 NK 세포 배양 배지와 비교하여 높은 NK 활성도를 보여주었다.
시험예 5. NK 세포의 IFN-gamma의 분비율 확인
IFN-r는 NK세포의 활성도를 나타내는 지표 물질로, 분비량이 증가될수록 높은 세포 독성을 갖고, 분화 능력이 증가되는 것으로 간주된다.
이를 확인하기 위해, 분리한 NK 세포를 세척 후 일반 배지에 10mg/L의 IL-2를 처리하고, 시험군에 따라 알로페론 1 내지 4 (0.1~100ng/ml, 또는 100mg/L)를 추가로 처리하여 24-well plate (1×105 cells/well)에 넣어준 후 5% CO2, 37 ℃의 환경에서 48 시간 반응시켰다. NK 세포에서 분비되는 IFN-γ는 세포를 배양한 배양액에서 Human IFN-γ ELISA kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. ELISA용 96-well plate의 well에 coating buffer에 희석된 capture antibody를 100 ㎕씩 넣어준 후 밀봉하여 4 ℃에서 overnight 하였다. Wash buffer를 사용하여 3 회 세척하고 남은 buffer를 모두 제거해 주었다. 각 well에 assay diluent를 200 ㎕씩 넣어주고 상온에서 1 시간 반응시켜 blocking 하였다. 다시 wash buffer를 사용하여 3 회 세척하고 남은 buffer를 모두 제거해 주었다. 준비된 IFN-γ standard와 culture supernatants를 100 ㎕씩 넣어주고 plate를 밀봉한 후 상온에서 2 시간 반응시켰다. Wash buffer를 이용하여 5 회 세척하고 남은 buffer를 모두 제거해 주었다. Well마다 Working detector (Detection Antibody + SAv-HRP reagent)를 100 ㎕씩 넣어주고 plate를 밀봉한 후 상온에서 1 시간 반응시켰다. Wash buffer를 이용하여 7 회 세척하고 남은 buffer를 모두 제거해 주었다. 각 well에 Substrate solution을 100 ㎕씩 넣어주고 빛을 차단시켜준 상태에서 상온에서 30 분 반응시켰다. 각 well에 Stop solution을 50 ㎕씩 넣어주고 30 분 이내에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 하기의 표 5 및 6에 나타내었다.
시험예 6. NK 세포의 암세포에 대한 세포 독성 확인
암세포에 대한 세포독성능을 평가하기 위해 혈액 암 세포주인 K562(한국세포주은행)를 분양 받아 사용하였다. 표적세포(Target cell)로 사용된 혈액암세포주 K562는 헤모사이토미터로 계수하여 1.0×104 세포수를 1의 비율로 사용하였고, 영향세포(Effecter cell)로 사용된 분화를 끝낸 NK세포는 각각 NK배지에 알로페론 1을 첨가하여 배양된 세포(NK배지+알로페론), 실시예 1의 NK배지에서만 배양된 세포(NK배지) 및 인간혈액에서 분리한 NK세포(대조군)에서 세포를 계수하여 1×104, 5×104, 10×104의 세포수를 비율로 사용하였다. 표적세포와 영향세 포를 96웰 플레이트에 RPMI1640 배지(serum free)와 함께 1:1, 5:1, 10:1 (E:T ratio)의 비율로 분주하여 37℃ 인큐베이터에서 4시간 공배양(co-culture)하였다. 그 후, 죽은 세포의 비율은 MTT assay (DoGen, EZ-cytox) Kit을 사용하여 Bio-Rad Microplate Reader, i-Mark에서 450 nm 필터로 측정하여 세포-매개 세포독성(Cell-mediated cytotoxicity)을 확인하였다. Spontaneous release는 Media만 넣어준 것을 사용하였으며, Maximum release는 2% Triton x-100을 넣어준 것을 사용하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
시험예 7. 세포의 과립화 분석
NK 세포의 과립화를 측정하기 위해 CD107a lysosome-associated membrane protein-1 (LAMP-1)의 발현을 Flow cytometry를 통해 측정하였다. 표적 세포를 96-well round bottom plate에 1 x 105 개씩 분주하고 실시예 1의 NK배지+알로페론, 실시예 1의 NK배지 및 대조군의 NK 세포를 E:T ratio (1:1)에 맞춰 well에 분주하였다. Anti-CD107a-PE (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) 항체를 넣어준 후 5% CO2, 37 ℃의 환경에서 4 시간 배양하였다. PBS를 이용하여 2 회 세척한 후 anti-CD56-APC (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) 항체를 처리하여 빛을 차단한 상태로 30 분 반응시킨 후 다시 PBS를 이용하여 세포를 2 회 세척하였다. NK 세포를 적정양의 PBS에 부유시킨 후 FACSVerse (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하고 자료를 비교 분석하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, NK 세포가 퍼포린과 그랜자임 등의 과립을 분비할 때 증가하는 CD107a의 발현을 측정함으로써 NK 세포의 세포독성 능력을 확인하였다.
<110> NK Medics
<120> Composition for culturing NK cells containing alloferon and
method for culturing NK cells using the same
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Claims (9)
- 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드 및 IL-2 를 필수적으로 포함하고,
IL-12, IL-15, OKT-3 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 배지에서 배양되며,
상기 폴리펩티드 또는 이들의 조합은 6 mg/L 내지 40 mg/L로 포함되는 것을 특징으로 하는 NK 세포 배양용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, FBS 또는 자가 혈장, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 트랜스페린 또는 이들의 조합을 더 포함하는 NK 세포 배양용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드, IL-2, IL-12, IL-15, 및 OKT-3을 포함하는 NK 세포 배양용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 개체로부터 분리된 혈액으로부터 NK 세포를 수득하는 단계; 및
청구항 1의 NK 세포 배양 배지에 NK 세포를 배양하는 단계를 포함하는, NK 세포 배양 방법.
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