KR101804248B1

KR101804248B1 - Fstl1 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101804248B1
Application number: KR1020150165863A
Authority: KR
Inventors: 박배근
Original assignee: 주식회사 메타신
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-12-04
Also published as: KR20170060995A

Abstract

본 발명은 FSTL1(Follistatin-like 1) 단백질을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, AP-1(activator protein 1) 타겟 유전자인 FSTL1은 AKT 활성을 억제하고, 종양 억제 단백질인 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)을 활성을 증가시키며, NF-κB(nuclear factor-κB)의 DNA 결합 및 타겟 유전자인 IL-6, GM-CSF, MMP-9, VEGF 및 ICAM1의 발현을 차단하고, 동물모델에서 유의적인 유방암 성장 억제 및 뼈전이 억제효과를 나타내므로, 특히 유방암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

FSTL1 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition containing a FSTL1 protein for the prevention and treatment of cancer}

본 발명은 FSTL1(Follistatin-like 1) 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 인류의 지난 수십 년간의 부단한 노력에도 불구하고 난치병 중의 하나로 여전히 남아 있다. 암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고, 비 조절적 방식으로 증식 및 불사화되어 발생하는 질병이다. 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되어 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다.

이에 따라 암과 관련된 다양한 생체 내 분자의 동정 및 상기 분자를 표적으로 하는 약물의 개발에 대한 요구가 계속되고 있으며, 상기 약물 중 일부를 조합하여 암의 치료 효과를 증진하기 위한 노력 또한 계속되고 있다. 최근에 암세포생물학, 의약 화학 등의 제반 학문의 눈부신 발전과 더불어 탁솔, 라파마이신 및 17-알릴아미노젤다나마이신(17-allylaminogeldanamycin; 17-AAG)과 같은 다수의 항암제들이 개발되었으며, 글리벡(Gleevec)과 같은 새로운 작용 기전을 가진 항암제가 개발되고 있다.

다양한 암 중, 유방암은 모든 암 중에서 가장 연구가 많이 된 암 중의 하나이지만, 환경적 요인과 유전적 요인 두 가지에 의해 발생한다고 알려져 있고, 아직 확실하게 유방암의 원인으로 밝혀진 것은 없다. 하지만, 여러 연구 결과를 통해 몇 가지 요인들이 가능성을 보이고 있는데, 그 중 여성 호르몬인 에스트로겐이 발암과정에 중요한 역할을 한다는 것에는 이견이 없다. 유방 세포는 에스트로겐의 자극에 의하여 증식 및 분화하므로 결국 개인에게 있어서 유방암 발생 위험은 에스트로겐에 노출되는 시간에 의해 결정될 것으로 생각되고 있다. 즉, 에스트로겐에 노출되는 기간이 길수록 유방암의 발생이 증가한다는 것이다. 그 외에도 과도한 영양 및 지방 섭취, 유전적 요인, 비만 그리고 호르몬 불균형을 초래하는 장기간의 피임약 복용 및 여성 호르몬제의 장기간 투여 등도 유방암의 원인으로 생각하고 있다.

환자가 암에 의해 사망에 이르게 되는 것은 암의 전이에 기인하는데, 특히 유방암은 뼈의 전이를 통하여 재발하는 경우가 많으며, 임상학적 사례에 의하면 유방암 초기 전이의 30 내지 40%, 그리고 사망한 환자의 90% 이상에서 뼈 조직으로의 전이가 발생한 것으로 보고된 바 있다. 선택적인 뼈전이를 유발하는 원인은 크게 세 가지로 나누어 볼 수 있는데, 첫째, 적색 골수 주위에 혈류량이 많아 혈류 이동성에 의한 유방암 세포의 뼈 조직에로의 접근성이 높고, 다음으로는 무엇보다도 회귀성 유방암 세포 표면 분자(즉, Homing receptor of breast cancer cell)와 결합하는 뼈 조직 기질 세포에서의 흡착 분자(즉, Drawing ligand molecule) 발현에 의한 것이다. 마지막으로 뼈 조직 내에 유방암 세포의 증식을 촉진하는 칼슘(Ca² ⁺) 및 성장 인자 등이 많이 내포되어 있기 때문인데, 단일 또는 소수의 유방암 세포에 의한 뼈전이가 일어나게 되면 이에 의한 뼈 조직 파괴(Bone destruction. 즉, 골 흡수 Bone resorption)가 진행되고 이 과정에서 방출된 위 인자들에 의한 유방암의 증식이 가속화되어(즉, 악순환 Vicious cycle) 종국적으로 대부분의 환자가 사망에 이르게 되는 것이다.

이때 골 흡수는 파골세포(Osteoclasts)의 작용에 의해서 진행되는데, 유방암 세포에서 활성화된 NF-κB(Nuclear Factor-kappaB)의 전사 작용 조절에 의한 PTHrP(Paratyroid hormone-related protein) 및 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 분자 발현으로 파골세포 분화가 개시된다. PTHrP는 조골세포(Osteoblasts)를 통해 OPG(Osteoprotegrin)와 RANK(Receptor activator of NF-κB)에 경쟁적으로 결합하는 RANKL(RANK ligand)을 증가시키는 동시에, OPG (즉, RANKL antagonist or RANK inhibitor)의 발현을 감소시켜 RANK와 RANKL의 결합을 촉진한다. RANKL가 RANK와 결합하면 파골 세포 전구체(Osteoclast precursors)의 발현이 증가하게 된다. GM-CSF는 파골 세포 전구체의 생성 및 분화를 촉진하고, 파골 세포의 분화를 돕는다.

NF-κB는 세포의 생존, 면역반응 통제, 암이나 염증 등 자가면역 조절 역할을 하는 단백질인데, 다른 많은 전사인자가 그렇듯이 NF-κB 역시 작용하는 세포의 종류와 작용 시점 등에 따라 서로 다른 기능을 한다. 유방암 세포의 경우, NF-κB는 항상 활성화 상태로 존재하면서 발암, 증식 및 전이 기전을 조절한다. NF-κB의 활성화는 IκB(Inhibitor-κB)를 인산화하는 효소인 IKK(IκB kinase)에 의해 조절되는데, 활성화된 NF-ΚB는 핵 안으로 위치 이동하여 표적 유전자를 전사 개시한다.

FSTL1(Follistatin-like 1)은 최초로 마우스 골아 세포주 MC3T3-E1에서 규명되었는데, TGF-β1(Transforming growth factor-β1)로 유도된 유전자 생산물로, TSC-36(TGF-β1-stimulated clone 36)으로 알려져 있고 인간 단백질과 92% 이상의 상동성을 가진다. 인간 조직에서, FSTL1은 심장, 태반, 전립선, 난소 및 소장에서 강하게 발현되며(참고문헌 1,2), 동물의 배아에서, FSTL1은 마우스 신장 및 폐의 발달뿐만 아니라(참고문헌 3), 닭의 중배엽 등쪽화(Dorsalization) 및 신경유도를 조절하는데 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 또한, 몇몇 인간 암 세포주(참고문헌 4, 5, 6), 암 조직(참고문헌 7), 또는 종양 유전자로 형질전환된 세포(참고문헌 8)에서는 발현이 감소된다고 알려져 있으나, 유방암 및 유방암 뼈전이에 있어서, FSTL1의 역할에 대해서는 현재까지 알려진바 없다.

이에, 본 발명자들은 신규한 유방암 치료 표적물질을 개발하기 위해 노력한 결과, AP-1(Activator protein 1) 타겟 유전자인 FSTL1은 AKT 활성을 억제하고, 종양 억제 단백질인 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)의 활성을 증가시키며, NF-κB의 신호 경호(Signalling pathway)를 억제 조절하고, NF-κB 타겟 유전자인 IL-6, GM-CSF, MMP-9, VEGF 및 ICAM1의 발현을 차단하며, 동물모델에서 유의적인 유방암 성장 억제 및 뼈전이 억제효과를 확인함으로써, 상기 FSTL1 단백질을 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

1. Tanaka, M. et al. Cloning of follistatin-related protein as a novel autoantigen in systemic rheumatic diseases. Int Immunol 10, 1305-14 (1998). 2. Vertegaal, A.C. et al. cDNA micro array identification of a gene differentially expressed in adenovirus type 5- versus type 12-transformed cells. FEBS Lett 487, 151-5 (2000). 3. Adams, D., Larman, B. & Oxburgh, L. Developmental expression of mouse Follistatin-like 1 (Fstl1): Dynamic regulation during organogenesis of the kidney and lung. Gene Expr Patterns 7, 491-500 (2007). 4. Sumitomo, K. et al. Expression of a TGF-beta1 inducible gene, TSC-36, causes growth inhibition in human lung cancer cell lines. Cancer Lett 155, 37-46 (2000). 5. Mashimo, J., Maniwa, R., Sugino, H. & Nose, K. Decrease in the expression of a novel TGF beta1-inducible and ras-recision gene, TSC-36, in human cancer cells. Cancer Lett 113, 213-9 (1997). 6. Hambrock, H.O. et al. Structural characterization of TSC-36/Flik: analysis of two charge isoforms. J Biol Chem 279, 11727-35 (2004). 7. Meehan, K.L., Holland, J.W. & Dawkins, H.J. Proteomic analysis of normal and malignant prostate tissue to identify novel proteins lost in cancer. Prostate 50, 54-63 (2002). 8.Johnston, I.M. et al. Regulation of a multigenic invasion programme by the transcription factor, AP-1: re-expression of a down-regulated gene, TSC-36, inhibits invasion. Oncogene 19, 5348-58 (2000).

본 발명의 목적은 FSTL1(Follistatin-like 1), FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 암 예방 및 개선용 건강식품에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FSTL1(Follistatin-like 1) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 FSTL1 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 AP-1(activator protein 1) 타겟 유전자인 FSTL1은 AKT 활성을 억제하고, 종양 억제 단백질인 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)을 활성을 증가시키며, NF-κB(nuclear factor-κB)의 DNA 결합 및 타겟 유전자인 IL-6, GM-CSF, MMP-9, VEGF 및 ICAM1의 발현을 차단하고, 동물모델에서 유의적인 유방암 성장 억제 및 뼈전이 억제효과를 나타내므로, 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 c-jun/AP-1 돌연변이(Dominant-Negative Mutant) 유전자를 레트로바이러스(Retrovirus)로 형질도입된 MDA-MB-231 유방암 세포주(MDA/T)에서 FSTL1(Follistatin-like 1)이 발현됨을 확인한 도이다:
MDA/V: 대조군 레트로바이러스로 형질도입된 MDA-MB-231 유방암 세포주:
protein F: FSTL1 단백질.
도 2는 FSTL1 단백질에 의한 AKT 활성 억제 및 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)의 종양 억제 기능 유도 효과를 확인한 도이다.
도 3은 FSTL1 단백질에 의한 NF-κB의 DNA 결합 및 전사 조절 작용 억제, 및 NF-κB의 표적 단백질 발현 차단 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 FSTL1 단백질에 의한 유방암 세포의 부착 및 침윤 기전의 억제 및, 종양혈관신생인자 발현의 차단 효과를 in vitro 모델에서 확인한 도이다.
도 5는 FSTL1 단백질의 유방종양 증식, 뼈전이 억제 및 파골세포 감소 효과를 동물모델에서 확인한 도이다.
도 6은 쥐 골수세포 ex vivo 모델에서 FSTL1 단백질에 의한 파골세포생성(Osteoclastogenesis) 억제 효과를 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 FSTL1(Follistatin-like 1) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하고, 구체적으로는 유방암, 대장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 보다 바람직하며, 더욱 구체적으로는 유방암인 것이 가장 바람직하다.

상기 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, 재조합 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 세포는 조혈 줄기세포(Hematopoietic stem cells), 수지상 세포(Dendritic cells), 자가이식 종양세포(Autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(Established tumor cells)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 세포 자체, 및 상기 세포를 배양한 배양액 모두를 이용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암의 성장과 전이 관련성이 있다고 알려진 전사 인자 AP-1(Activator protein-1)의 표적 단백질을 확인한 결과, c-jun/AP-1의 우성 음성 돌연변이를 발현하는 레트로바이러스로 형질도입된 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 FSTL1 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(도 1 참조).

또한, FSTL1의 항암 활성 신호 경로를 확인한 결과, 본 발명의 FSTL1는 AKT1의 인산화를 유방암 및 전이 전립선암 세포주에서 억제하는데 (도 2a 및 도 2d 참조), 특히 AKT의 업스트림 신호 표적 단백질인 PI-3 Kinase 억제제로 알려진 화합물보다 유의적으로 억제 조절함으로써(도 2c 참조), FSTL1은 탁월한 AKT 활성 억제제임을 확인하였다. 아울러 FSTL1은 종양 억제자 PTEN의 인산화를 억제하여 종양 억제 효과를 증가시키며, 그 양이 증가할수록 그 효과는 증대됨을 확인하였다(도 2b 참조).

또한, 유방암 세포에서 NF-κB의 DNA 결합 억제 조절 효과를 확인한 결과, FSTL1는 NF-κB의 전사적 유전자 발현을 억제 조절할 수 있음으로써, 유방암 뼈전이의 억제제로서 역할을 수행할 수 있음을 확인하였다(도 3 참조).

또한, FSTL1은 in vitro 모델에서 NF-κB에 의해 조절되는 유방암 세포의 부착 및 침윤 (Invasion) 기전 매개 분자 그리고 종양혈관신생인자를 유의적으로 발현 억제하고(도 4a 참조), 침윤 능력을 약 79% 이상 현저히 감소시키는 것을 확인하였다(도 4b 참조).

또한, 동물모델에서 FSTL1의 효과를 확인한 결과, FSTL1는 종양 성장 및, 유방암 뼈 전이를 유의적으로 억제하며(도 5 참조), 아울러 파골세포의 양적 감소 (도 5 우측 하단 참조) 및 파골세포생성을 ex vivo 모델에서 억제(도 6 참조)하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 AP-1 타겟 유전자인 FSTL1은 종양 발생 및 세포 생존과 관련된 AKT 활성을 억제하고, 종양 억제 단백질인 PTEN의 기능을 증가시키며, NF-κB의 신호 경로를 차단하여 타겟 단백질 발현을 억제하여, 동물모델에서 유의적인 유방암 성장 억제 및 뼈 전이 억제효과를 나타내므로, 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 치료상으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 mg을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 mg을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 10³ 내지 10¹² IU(10 내지 10¹⁰ PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 10⁵ 내지 10¹⁰ IU를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 경우, 10³ 내지 10⁸ 개를 함유하는 것이 바람직하고, 10⁴ 내지 10⁷개를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁷ 내지 10¹¹ 바이러스 입자(10⁵ 내지 10⁹ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10³ 내지 10⁶ 세포/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁸ 내지 10¹⁰ 입자(10⁶ 내지 10⁸ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10² 내지 10⁵ 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

또한, 본 발명은 FSTL1 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 AP-1 타겟 유전자인 FSTL1은 종양 발생 및 세포 생존과 관련된 AKT 활성을 억제하고, 종양 억제 단백질인 PTEN의 기능을 증가시키며, NF-κB의 신호 경로를 차단하여 타겟 단백질 발현을 억제하여, 동물모델에서 유의적인 유방암 성장 억제 및 뼈 전이 억제효과를 나타내므로, 암 예방 및 개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 FSTL1 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, FSTL1 단백질, FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 암 전이 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하고, 구체적으로는 유방암, 대장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 보다 바람직하며, 더욱 구체적으로는 유방암인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 FSTL1은 암 전이와 관련된 분자인 MMP-9, VEGF 및 ICAM-1의 발현을 유의적으로 억제함을 확인하였다(표 1 및 도 4 참조).

따라서, 본 발명의 AP-1 타겟 유전자인 FSTL1은 종양 발생, 세포 증식 및 세포 생존과 관련된 AKT 활성을 억제하고, 종양억제제인 PTEN의 기능을 증대시키며, NF-κB의 신호 경로를 방해하고, NF-κB 타겟 유전자인 IL-6, GM-CSF, MMP-9, VEGF 및 ICAM1의 발현을 차단하며, 동물모델에서 유의적인 유방암 성장 억제 및 뼈전이 억제효과를 나타내므로, 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 FSTL1 단백질, FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 FSTL1 단백질, FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 골대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 골대사성 질환은 뼈 전이암(Bone metastatic cancer), 고형암 뼈전이, 고형암 뼈전이에 의한 근골격 합병증, 악성 종양으로 인한 과칼슘혈증, 다발성 골수종, 원발성(Primary) 뼈 종양, 골다공증, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈흡수 질환 및 파게트병(Paget's disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 유방암 뼈전이 인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 AP-1 타겟 유전자인 FSTL1은 종양 발생, 세포 증식 및 세포 생존과 관련된 AKT 활성을 억제하고, 종양억제제인 PTEN의 기능을 증대시키며, NF-κB의 신호 경로를 방해하고, NF-κB 타겟 유전자인 IL-6, GM-CSF, MMP-9, VEGF 및 ICAM1의 발현을 차단하며, 동물모델에서 유의적인 유방암 성장 억제 및 뼈전이 억제효과를 나타내므로, 유방암 뼈전이를 포함하는 골대사성 질환 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 유방암 세포주 및 전립선암 세포주의 배양

본 발명에서 사용된 인체 유방암 세포(MDA-MB-231 cell) 및 전립선암 세포(PC-3M cells)는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포는 습윤한 5% CO₂, 37℃ incubator에서 Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Nutrient Mixture Ham’s F12(DMEM/F12, Gibco/BRL. Gaithersburg, MD, USA), 10% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 μg/mL Streptomycin (Gibco/BRL)이 포함되도록 세포배양액을 제조하여 배양하였다. 세포수(즉, Cell density)가 10 cm 배양 dish의 80~90% 정도에 이를 때, Phosphatate Buffered Saline solution(PBS)으로 2번 씻어내고 Trypsin-EDTA(Gibco/BRL)를 처리하여 세포를 계대 배양하거나, in vivo 또는 in vitro 실험을 위해 샘플을 준비하였고, 세포 배양액은 2~3일 마다 교환하였다.

< 실시예 2> 전사 인자 AP-1(Activator protein-1)의 표적 단백질 확인

암의 성장과 전이와 관련성이 있다고 알려진 전사인자 AP-1 그리고 FSTL1에 의한 세포 내 유전자 변화 패턴을 분석하기 위하여, c-jun/AP-1의 우성 음성 돌연변이(Dominant-Negative Mutant) 유전자 또는 FSTL1 클론을 레트로바이러스로 형질도입된 각각의 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 발현이 증가 또는 감소되는 매개 유전자군(즉, Gene pool)을 Northern blotting 및 cDNA 마이크로어레이 분석(즉, Human genome-U133 plus 2.0 genechip, Affymetrix, Inc.을 사용)을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, c-jun/AP-1의 우성 음성 돌연변이 도입에 의해 FSTL1 유전자가 상향 발현되고, 대조군 유방암 세포주에서는 FSTL1 유전자 및 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 1).

따라서, FSTL1 단백질이 종양 억제와 상호 관련성이 있음을 확인하였다.

< 실험예 1> FSTL1 항암 활성 신호 경로 확인

FSTL1의 항암 활성 신호 경로를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 배양한 유방암 세포(MDA-MB-231 cell), 전립선암 세포(PC-3M) 또는 대조군으로 공 레트로바이러스(retrovirus)로 형질도입된 MDA-MB-231 유방암 세포주(MDA/C)에 FSTL1 컨디션 배지(5%, v/v) 및, Akt 신호전달 체계의 활성 인자인 IGF-1(insulin-like factor-1) 100 ng/ml을 처리한 후, Akt1 및 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) 활성을 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다. 한편, 대조약물로는 PI-3K(phosphatidylinositol-3 kinase) 억제제 또는 Akt 억제제인 LY294002를 사용하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 FSTL1 컨디션 배지는 Akt1의 인산화를 억제하고(도 2a 및 도 2d), PI-3K의 업스트림 신호 표적인, 암 억제자 PTEN의 인산화를 억제하여 종양 억제 효과를 증가시키며, 특히 기존 PI-3K 억제제 또는 Akt 억제제로 알려진 화합물보다 본 발명의 FSTL1 컨디션 배지는 Akt1의 인산화를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 2b).

< 실험예 2> FSTL1 의 NF -κB 신호 경로 조절 확인

FSTL1의 NF-κB 신호 경로를 확인하기 위하여, 먼저, Human Genome-U133 Plus 2.0 Genechip, Affymetrix를 이용하여, FSTL1에 의해 유전자 발현이 하향 조절된 유전자를 분석하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, FSTL1에 의해 하향 조절된 유전자는 혈관신생, 세포 접착/이동, 세포 성장, 염증 및 종양 형성 조절 등의 기능을 가지는 유전자임을 확인하였다(표 1).

또한, mRNA 수준에서, FSTL1는 NF-κB 에 의해 조절되는 사이토카인인 IL-8(interleukin-8), 과립구 대식세포 집락 촉진인자(Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)의 발현을 차단하는 것을 확인하였다(도 3a).

또한, 루시퍼라제 리포터 분석을 통해, FSTL1는 NF-κB 가 사이토카인 프로모터에 결합하는 것을 정량적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 3B).

또한, EMSA(electromobility gel shift assay)을 통해 FSTL1은 NF-κB의 전사 활성을 방해하는 것을 확인하였다(도 3c). 그러나 FSTL1는 TNF-α 의존적 신호 경로에 따르지 않음을 확인하였다. FSTL1 처리에 따라, IκBα를 분해할 뿐만 아니라, Akt 및 IκBα 인산화의 손상을 확인하였다.

따라서, FSTL1는 Akt-매개된 NF-κB 신호 유도를 조절할 수 있고, 유방암 뼈전이의 억제자로서 역할을 수행할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 3> FSTL1 의 NF -κB 신호 경로 억제 효과 확인

FSTL1-매개된 다양한 분자(MMP-9, VEGF, ICAM-1)의 발현을 분석하였다. 상기 분자들은 NF-κB에 의해 조절되는 것으로, 전이와 관련된 침윤(invasion), 혈관신생 및 세포부착과 관련되어 있다. 특히, MMP-9은 종양 혈관신생 및 전이뿐만 아니라, 유방암의 활성을 촉진하는 암에 필요에 성장 인자의 활성과 관련되어 있다. 게다가 MMP-9은 파골세포에 의해 발현되고, 파골세포의 이동(migration)에 필요하다. 따라서, MMP-9는 골 흡수와 관련된 파골 세포 미세 환경에서 중요한 역할을 한다.

이에, 상기 <실시예 2>에서 제조한 FSTL1를 발현하는 유방암 세포주 및 대조군 유방암 세포주를 이용하여 MMP-9, VEGF, ICAM-1의 발현 변화를 immunoblot 및 zymography를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 FSTL1은 in vitro에서 상기 인자 모두를 유의적으로 억제하고(도 4a), FSTL1-매개된 침윤 능력을 약 79% 이상 현저히 감소시키는 것을 확인하였다(도 4b).

< 실험예 4> 동물모델에서 FSTL1 의 효과 확인

<4-1> 실험동물의 준비

누드마우스는 BALB/c/nu(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea)를 기본 종으로, 20 마리 모두 생후 6~8주, 체중이 약 20 g의 암컷만을 사용하였다. 멸균 소독된 쥐장에서 멸균된 물과 사료를 공급하였고, 층판기류 (lamina flow)를 지속적으로 유지한 크린 벤취 속에 두어 청정한 환경을 유지하였으며, 모든 술식 또한 크린 벤취 속에서 시행하였다. 누드마우스의 주야간 생물학적 주기를 위하여 실내등을 12 시간은 조영하고, 12 시간은 점멸하였다.

<4-2> 종양 성장 억제 효과 확인

상기 실험예 <4-1>에서 준비한 누드 마우스에 상기 <실시예 2>에서 준비한 FSTL1를 발현하는 유방암 세포주를 1 cc 주사기 및 25 게이지의 주삿바늘을 이용하여 누드마우스 등에 피하주사 접종한 후, 대조군 유방암 세포주를 이식한 누드마우스와 종양 부피를 측정하였다. 종양 부피는 길이와 너비를 caliper로 3일에 한 번씩 측정하여 Gutman 등이 제안한 방법의 공식으로 종양의 부피를 산출하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 FSTL1를 발현하는 유방암 세포주가 이식된 마우스는 종양의 성장이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 5a).

<4-3> 골 용해성 뼈전이 억제 효과 확인

도 5b에 나타낸 바와 같이 본 발명의 FSTL1는 뼈전이를 약 67% 이상 억제하는 것을 확인하였다(도 5b).

< 실험예 5> FSTL1 의 파골세포 형성( Osteoclastogenesis ) 억제 효과 확인

<5-1> 마우스 골수세포의 배양

ICR mouse(6~9주, 수컷)를 경추 탈골한 후 70% 에탄올로 소독하였다. 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다. 경골 원심부를 절단하고 슬개골을 탈골시켜 경골을 적출하였다. 뼈 양끝을 조금 잘라 한쪽 끝에 25G의 주삿바늘을 꽂고 α-MEM을 흘려보내 골수세포를 시험관에 모았다. 원심 분리한 후 α-MEM에 현탁하고 2배의 Gey's solution을 가해 적혈구를 제거했다. 원심 분리한 후 10% FBS가 함유된 α-MEM으로 재현탁하였다.

<5-2> 파골세포 형성( Osteoclastogenesis ) 억제 효과 확인

상기 <5-1>에서 배양한 골수세포를 96 웰 플레이트에 1×10³ 개로 접종하였다. 그런 다음, 본 발명의 FSTL1 CM을 전처리한 후, RANKL을 처리하여 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 지 7일 후, 파골 세포를 잘 관찰할 수 있도록 TRAP(tartrate resistance acid phosphatase) 염색법을 통해 염색을 한 뒤, 파골세포로 분화된 세포의 수를 계수하여 FSTL1 CM의 파골세포 분화 억제 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 FSTL1 CM은 파골세포 형성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 6).

Claims

FSTL1(Follistatin-like 1) 단백질을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
FSTL1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 2항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 세포는 조혈 줄기세포, 수지상 세포, 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
FSTL1 단백질을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강식품.