KR101941139B1

KR101941139B1 - Api5 단백질을 유효성분으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물

Info

Publication number: KR101941139B1
Application number: KR1020170083598A
Authority: KR
Inventors: 강태흥; 박영민; 김영섭
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-01-22
Also published as: KR20190003106A

Abstract

본 발명은 미성숙 수지상 세포의 성숙화를 유도하기 위한 API5 단백질의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 API5를 유효성분으로 하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 및 이를 통해 성숙화된 수지상 세포를 포함하는 암 백신 또는 암 치료제를 제공한다. 상기 API5 단백질은 미성숙 수지상 세포의 TLR4(toll-like receptor 4)에 결합하여 수지상 세포의 성숙화 과정을 유도하며, 이에 따라 성숙된 수지상 세포는 암 항원으로 자극되었을 때, 암 항원에 대한 특이적인 CD8+ T 세포를 생성할 수 있으며, 이에 따라 종양 생장 억제 및 암 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포는 암 항원에 의해 자극되었을 때 암 항원에 특이적인 기억 T 세포를 생성할 수 있어, 이에 따라 암에 대한 예방 효과를 나타낼 수 있다.

Description

API5 단백질을 유효성분으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물{Composition for inducing maturation of dendritic cell comprising API5 protein}

본 발명은 미성숙 수지상 세포의 성숙화를 유도하기 위한 API5 단백질의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 API5를 유효성분으로 하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 및 이를 통해 성숙화된 수지상 세포를 포함하는 암 백신 또는 암 치료제를 제공한다.

항원 제시 세포(Antigen-presenting cells; APC)는 단백질 항원을 세포 내 이입(endocytosis)한 후, 항원 유래 펩타이드 조각을 MHC Ⅰ형 분자와 함께 T 세포에 제시하여 이를 활성화하는 세포를 의미하는 것으로, 체내에서 세포성 면역을 담당한다. 이 중, 수지상 세포(Dendritic cells; DCs)는 선천성(innate) 및 적응(adaptive) 면역 시스템의 교량 역할을 하는 가장 강력한 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 주로 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재하며 특히 피부에 있는 세포를 랑게르한스 세포라 한다. 수지상 세포는 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있으며, 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작된다. 특정 발달 단계에서 상기 세포는 수상돌기(dendrites)라고 하는 돌기를 뻗는다.

수지상 세포는 조혈 골수 전구세포(hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래한다. 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 분화하며, 높은 엔도시토시스 활성 및 T-세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR(toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다.

TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 화학적 특징을 인식하며, 미성숙 수지상 세포는 살아있는 자가세포로부터 니블링(nibbling)이라는 과정을 통해 세포막을 탐식한다. 이들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해하며, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC(Major Histocompatibility Complex) 분자를 이용하여 그 세포 표면에 나타나게 된다. 동시에, 그것은 CD(Cluster of Differentiation)80, CD86, 및 CD40과 같이 T-세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시킨다. 그것들은 비 항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T-세포, 킬러 T-세포 뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킨다.

모든 헬퍼 T-세포는 하나의 특정 항원에 대해 특이적이다. 오직 전문적인 항원 제시 세포(예를 들어, 대식세포, B 림프구, 수지상 세포)만이 맞는 항원이 존재할 때 항원 특이적인 헬퍼 T-세포를 활성화시킨다. 그러나 대식세포와 B 림프구는 메모리 T-세포만 활성화시킬 수 있는 반면에 수지상 세포는 메모리 및 처녀(naive) T-세포를 모두 활성화시킬 수 있어서 가장 강력한 항원 제시 세포이다.

성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포 또는 대식세포로 바뀔 수 있다. 단핵구는 골수의 줄기세포에서 유래한다. 단핵구 유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, PBMC를 조직 배양 플레이트에 넣어서 단핵구가 부착되게 할 수 있는데 이 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)로 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNF-α로 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.

완전히 성숙한 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포와는 정성적 및 정량적으로 상이하다. 완전히 성숙한 수지상 세포는 고 수준의 MHC(Major Histocompatibility Complex) I형 및 II형 항원, 및 고수준의 T 세포 공동자극성 분자, 즉 CD80 및 CD86을 발현시킨다. 이들 변화는 수지상 세포의 T 세포 활성화 능력을 증가시키는데, 이는 이들이 세포 표면상의 항원 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어 CD28과 같은 T 세포 상의 공동자극성 분자의 대응물을 통한 T 세포 활성화의 양을 증가시키기 때문이다. 추가로, 성숙한 수지상 세포는 다량의 사이토카인을 생성하며, 이 사이토카인은 T 세포 반응을 자극하고 유도한다. 이들 사이토카인 중 대표적인 두 가지는 인터루킨 10(IL-10) 및 인터루킨 12(IL-12)이다. 이들 사이토카인은 유도된 T 세포 반응의 방향에 대해 정반대의 효과를 갖는다. IL-10이 생성되면 Th-2형 반응이 유도되는 반면, IL-12가 생성되면 Th-1형 반응이 유도된다. 후자의 반응은 세포 면역 반응이 요구되는 경우, 예를 들면 암 면역요법에서 특히 바람직하다. Th-1형 반응에 의해 세포 면역계의 작동인자 공격수단인 세포독성 T 림프구(CTL)가 유도 및 분극화된다. 이러한 작동인자 공격수단은 종양 성장을 억제하는데 가장 효과적이다. IL-12는 또한 자연살해(NK) 세포의 성장을 유도하고, 항-혈관신생 활성을 가지며, 이는 모두 효과적인 항-종양 공격수단이다. 따라서, IL-12를 생성하는 수지상 세포의 사용은 면역자극에 사용하는데 이론상 최적으로 적합하다.

한편, 암환자에서는 수지상 세포의 기능이 저하되어 있어 정상적인 항암 면역능을 유도하는 것이 어렵다. 지금까지 수지상 세포의 활성을 조절(활성화)하는 물질들에 대해 많은 연구가 진행되었으나 생체독성의 부작용으로 생체에의 직접적인 응용에 문제가 많았다. 그러나 상기와 같이 수지상 세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상 세포의 활성을 촉진하여 이를 성숙시키고, 상기 강력한 면역 반응을 일으키는 성숙 수지상 세포를 이용하여 세포 면역 치료에 응용할 수 있는지에 대한 연구가 계속되고 있다.

세포 사멸 억제자-5(Apoptosis inhibitor-5, API5) 단백질은 암 세포 내에서 높은 수준으로 발현되어, 암 치료의 조절 타겟으로 사용될 수 있음이 알려져 있다. API5를 과발현하는 암세포는 T 세포의 공격에 대해 내성을 나타내어, 항암 면역 내성을 가질 수 있어, API5 발현 저해제를 항암 면역 우회암의 예방 또는 치료용 조성물로 제공하는 연구에 대하여 공지된 바 있으며(대한민국 공개특허 10-2013-0102990 호), 이 외에도 암세포주에서 API5 과발현에 따라 암세포의 증식이 증가하여 자궁경부암 환자의 생존률이 감소한다는 것에 관한 연구가 보고된 바 있다. 이와 같이, API5가 암 세포 내에서 발현 수준이 증가하여 암과의 상관관계를 가질 수 있음이 보고된 바 있으나, 이를 통해 면역세포의 성숙화를 유도할 수 있는지의 여부에 대한 연구는 진행된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 수지상 세포의 성숙화를 유도하여 암 예방 및 치료용 백신으로 유용하게 사용할 수 있도록 하는 물질을 탐색하기 위해 노력한 결과, API5 단백질이 미성숙 수지상 세포의 TLR4(toll-like receptor 4)에 결합하여 수지상 세포의 성숙화 과정을 유도하며, 이에 따라 성숙 수지상 세포는 암 항원을 인식하였을 때 상기 암 항원에 대하여 특이적인 CD8+ 세포독성 T 세포를 생성할 수 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 API5 단백질에 의해 성숙화된 수지상 세포는 암 항원에 의해 자극되었을 때, 암에 대한 치료 효과를 나타낼 뿐 아니라, 기억 T 세포를 형성하여 예방 효과를 함께 나타낼 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상술한 바와 같이, 성숙된 수지상 세포를 암을 비롯한 질병의 세포 치료제로 사용하고 있으나, 보다 미성숙 수지상 세포의 성숙화 과정을 보다 효과적으로 유도할 수 있는 물질을 발굴하기 위한 연구가 계속되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 성숙 수지상 세포를 이용하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 항암 보조제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 API5 단백질(apoptosis inhibitor-5)을 유효성분으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 API5 단백질을 처리하여 배양하는 단계;를 포함하는, 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 API5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 수지상 세포는 TLR4(toll-like receptor 4)를 발현하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 방법은, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수지상 세포의 성숙화 유도 방법으로 제조된 성숙 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 API5 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 암은 대장암, 치종암, 혈액암, 후두암, 식도암, 구강암, 기저세포암, 담도암, 갑상선암, 직장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

또한, 상기 항암 보조제는 수지상 세포를 암에 대한 백신 또는 치료제로 사용할 때, 예방 또는 치료 효과를 증가시키기 위한 것일 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 API5(apoptosis inhibitor-5) 단백질을 유효성분으로 하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다. 상기 API5 단백질은 미성숙 수지상 세포의 TLR4(toll-like receptor 4)에 결합하여 수지상 세포의 성숙화 과정을 유도하며, 이에 따라 성숙된 수지상 세포는 암 항원으로 자극되었을 때, 암 항원에 대한 특이적인 CD8+ T 세포를 생성할 수 있으며, 이에 따라 종양 생장 억제 및 암 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포는 암 항원에 의해 자극되었을 때 암 항원에 특이적인 기억 T 세포를 생성할 수 있어, 이에 따라 암에 대한 예방 효과를 나타낼 수 있다.

API5 매개로 성숙된 수지상 세포는 종래 수지상 세포의 성숙화 유도를 위해 사용되는 LPS 보다 성숙화 효율이 높고, 이에 따라 성숙된 수지상 세포가 나타내는 암 치료 효과 및 암 예방 효과를 높은 수준으로 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, LPS는 생체 내에서 염증 반응을 유발할 수 있는 등 부작용이 나타날 우려가 있으나, API5는 인간 유래의 재조합 단백질을 사용하여 생체 안전성을 가질 수 있어 보다 효과적일 수 있다.

도 1은 과발현한 인간 API5 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 2는 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포에서 분비되는 사이토카인 마커의 분비 수준을 비교한 결과이다.
도 3은 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포의 표면에 발현되는 성숙화 마커 인자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포 내에서 신호전달계 활성화 수준의 변화를 시간의 흐름에 따라 확인한 결과이다.
도 5는 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포의 이동능 수준을 확인하기 위해 이동능 마커의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 6은 단백질분해효소 또는 LPS 차단 물질을 처리한 후 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포에서 분비되는 사이토카인 마커의 분비 수준을 비교한 결과이다.
도 7은 단백질분해효소 또는 LPS 차단 물질을 처리한 후 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포의 표면에 발현되는 성숙화 마커 인자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 API5에 의한 수지상 세포 성숙화 과정에서, 수지상 세포의 API5 수용체를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 TLR4 발현 여부에 따른 API5 유도의 수지상 세포 성숙화 여부를 확인하기 위해 수지상 세포 표면에 발현된 성숙화 마커 인자의 발현을 확인한 결과이다.
도 10은 TLR4 발현 여부에 따른 API5 유도의 수지상 세포 성숙화 여부를 확인하기 위해 수지상 세포로부터 분비된 사이토카인의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 TLR4 발현 여부에 따른 API5 유도의 수지상 세포 성숙화 여부를 확인하기 위해 수지상 세포 내 신호전달계 활성화 수준을 확인한 결과이다.
도 12는 API5 유도의 성숙 수지상 세포를 암 항원으로 자극하여 접종한 마우스에서 암 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 생성 수준을 확인한 결과이다:(a) 암 항원으로 OVA 펩타이드; (b) 암 항원으로 E7 펩타이드; 및 (c) 암 항원으로 AH1-A5 펩타이드를 사용한 결과이다.
도 13은 API5 유도의 성숙 수지상 세포에 의한 암 예방 효과를 확인한 결과이다:(a) 암 항원으로 OVA 펩타이드; (b) 암 항원으로 E7 펩타이드; 및 (c) 암 항원으로 AH1-A5 펩타이드를 사용한 결과이다.
도 14는 API5 유도의 성숙 수지상 세포에 의해 생성된 암 항원 특이적인 기억 T 세포의 생성 및 이에 따른 암 예방 효과를 확인한 결과이다: 암 항원으로 OVA 펩타이드로 자극하였을 때 (a) OVA 특이적인 T 세포의 수 및 (b) 종양을 가지지 않는 마우스의 비율을 나타내며; 암 항원으로 E7 펩타이드로 자극하였을 때 (c) E7 특이적인 T 세포의 수 및 (d) 종양을 가지지 않는 마우스의 비율을 나타내고; 및 암 항원으로 AH1-A5 펩타이드로 자극하였을 때 (e) AH1-A5 특이적인 T 세포의 수 및 (f) 종양을 가지지 않는 마우스의 비율을 나타낸다.
도 15는 API5 유도의 성숙 수지상 세포를 암 항원으로 자극한 후 접종하였을 때의 암 치료 효과를 확인한 결과이다: 암 항원으로 OVA 펩타이드로 자극하였을 때 (a) 종양 크기 및 (b) 마우스 생존률을 나타내며; 암 항원으로 E7 펩타이드로 자극하였을 때 (c) 종양 크기 및 (d) 마우스 생존률을 나타내고; 및 암 항원으로 AH1-A5 펩타이드로 자극하였을 때 (e) 종양 크기 및 (f) 마우스 생존률을 나타낸다.
도 16은 API5 유도의 성숙 수지상 세포에서 TLR4 발현 여부에 따른 T 세포 생성능을 비교한 결과이다.
도 17은 API5 유도의 성숙 수지상 세포를 이용한 암 치료 효과에 있어서, TLR4 발현 여부에 따른 암 치료 효과를 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

이에 따라, 본 발명은 API5 단백질(apoptosis inhibitor-5)을 유효성분으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물에 있어서, API5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 암호화되는 아미노산 서열인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 API5는 인간 유래의 단백질인 것이 가장 바람직하다.

그러나, 본 발명의 API5는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로만 한정되지 않고, 이의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 기능적 동등물은 펩타이드의 아미노산 부가, 치환 또는 결실로 인해, 상기 신규한 항생 펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명의 API5 단백질이 TLR4에 인식될 수 있는 부위의 실질적으로 동일/유사한 구조 또는 서열을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물에 있어서, 상기 수지상 세포는 면역 시스템의 항원 제시의 면역 세포 중 하나이며, 특정 항원을 인식하여 활성화되면 인식한 항원 특이적인 T 세포를 생성할 수 있다. 본 발명의 API5 단백질은 미성숙한 수지상 세포 표면의 TLR4(toll-like receptor 4)에 결합하여 수지상 세포의 성숙화 과정을 유도할 수 있다는 관점에서, 상기 수지상 세포는 TLR4를 발현하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 항원 제시 세포로 알려진 면역 세포 중, 표면 수용체로서 TLR4를 발현하는 세포로는 수지상 세포 외에 대식 세포(macrophage) 등을 들 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 일반적인 사실이지만, 대식 세포는 TLR4를 통해 면역 억제를 유도하는 경우가 있어 면역 활성을 증진시키고자 하는 목적에 반대되는 효과를 가져올 우려가 있어 적절하지 않다. 또한, 상기 TLR4 수용체는 암 세포의 표면에도 발현되는 경우가 있어, 이 때 상기 암 세포가 API5와 결합하면 오히려 암 세포의 세포 사멸이 억제될 우려가 있다.

따라서, API5를 이용하는 본 발명의 수지상 세포 성숙화 유도 방법은 다른 면역 세포를 포함하지 않는 것으로 차단된 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것이 바람직하다. 당업계에서는 API5가 암 세포 내에서 발현 수준이 증가하여 암 치료의 표적으로 사용할 수 있음이 알려져 있는 바와 같이, 체내에 API5를 투여하여 활성을 나타내는 경우 오히려 암 치료 효과에 반하는 결과가 나타날 우려가 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 재조합 API5 단백질을 과발현하여(도 1), 마우스 유래의 미성숙 수지상 세포에 처리하고 성숙화 마커를 확인한 결과, 성숙화 마커 사이토카인의 분비 수준, 표면 인자의 발현 수준 및 수지상 세포 내 신호전달계 활성화 수준이 증가하는 등, API5에 의해 수지상 세포의 성숙화가 효과적으로 유도되는 것을 확인하였다(도 2 내지 도 7).

또한, 본 발명자들은 API5 단백질이 미성숙 수지상 세포의 성숙화 과정을 유도하도록 하는 수용체를 확인한 결과, 수지상 세포 표면의 TLR4에 API5가 결합하여 성숙화 과정이 유도되는 것을 확인하였다(도 8).

따라서, 본 발명의 API5는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 API5는 종래 기술에 따라 사용되는 내독소(endotoxin)인 LPS보다 성숙화 효율이 높고, 독성을 나타내지 않는다는 점에서 보다 안전하므로, 세포 치료제로서 수지상 세포를 사용하기 위한 성숙화 유도에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 암은 수지상 세포를 예방 백신 또는 세포 치료제로서 적용할 수 있는 것으로 통상의 기술자가 이해하는 암이라면 제한없이 적용될 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 대장암, 치종암, 혈액암, 후두암, 식도암, 구강암, 기저세포암, 담도암, 갑상선암, 직장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 성숙 수지상 세포는 본 발명의 수지상 세포의 성숙화 유도 방법, 즉 API5 단백질로 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 방법을 통해 성숙된 수지상 세포이다. 상기 API5 단백질로 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 방법을 통해 성숙된 수지상 세포는 추가로 치료 타겟이 되는 암의 항원에 의해 자극되고, 이를 암 예방을 위한 백신 및/또는 암 치료를 위한 세포 치료제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포를 OVA 펩타이드, E7 펩타이드 또는 AH-A5 펩타이드의 암 항원 펩타이드로 자극한 다음, 마우스에 접종하고 항원 펩타이드를 주입하여, 활성화된 수지상 세포가 해당 암 항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 생성할 수 있음을 확인하였다(도 12). 이 후, 본 발명자들은 동일한 방법으로 활성화된 수지상 세포를 마우스에 접종한 후, 암 세포를 주입하였을 때 암 예방 효과에 의해 종양 크기가 증가하지 않는 것으로 확인하였으며(도 13), 이는 상기 활성화된 수지상 세포가 기억 T 세포를 생성하였기 때문에 나타난 결과인 것으로 확인하였다(도 14). 또한, 본 발명자들은 암 세포가 주입된 마우스에 상기 활성화된 수지상 세포를 접종하였을 때, 유의적인 암 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 15).

아울러, 본 발명자들은 API5에 의해 성숙되고, 암 항원으로 자극되어 활성화된 수지상 세포에서 API5가 TLR4에 의존적인지 여부를 확인한 결과, TLR4를 발현하는 수지상 세포에서 API5에 의한 성숙화 및 이후 암 치료 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 16 및 도 17).

따라서, 본 발명은 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. API5 매개로 성숙된 수지상 세포는 종래 수지상 세포의 성숙화 유도를 위해 사용되는 LPS 보다 성숙화 효율이 높고, 이에 따라 성숙된 수지상 세포가 나타내는 암 치료 효과 및 암 예방 효과를 높은 수준으로 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, LPS는 생체 내에서 염증 반응을 유발할 수 있는 등 부작용이 나타날 우려가 있으나, API5는 인간 유래의 재조합 단백질을 사용하여 생체 안전성을 가질 수 있어 보다 효과적일 수 있다.

아울러, 본 발명은 API5 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 API5 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제를 제공한다.

본 발명의 항암 보조제는, 수지상 세포를 암에 대한 백신 또는 치료제로 사용할 때, 예방 또는 치료 효과를 증가시키는 역할을 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 면역 증강제는 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.

상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 두류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 두류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재조합 API5 단백질의 제조

본 발명에서 수지상세포(dendritic cell)의 성숙화 유도에 사용하기 위한 성숙화유도 물질로서, API5 단백질의 과발현을 유도하였다.

구체적으로, 인간 API5 단백질을 암호화하는 유전자(서열번호 2)을 pET28b 벡터에 삽입하여 pET28b-API5 DNA를 제작한 후, 상기 DNA로 대장균(E. coli)를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 가나마이신(kanamycin) 포함의 5 mL LB broth 배지에 접종하여 16 시간 배양함으로써 전배양(pre-culture)한 후, 이를 250 mL LB broth 배지로 옮겨 본배양(main-culture)을 개시하였다. 3 시간 동안 본배양 한 후, 배지에 IPTG를 첨가하여 6 시간 동안 추가 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양 종료 후, 대장균을 수득하고, 세포를 파쇄한 다음 Ni-NTA resin을 사용하여 대장균 내에 과발현된 API5 단백질을 수득 정제하였다. 최종적으로 수득한 재조합 API5 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 서열분석을 통해 공지된 API5 단백질과 동일함을 확인하였다(도 1).

API5 단백질의 수지상 세포 성숙화 유도 효과 확인

<2-1> 마우스 유래 미성숙 수지상 세포의 분리

본 발명자들은 먼저, API5 단백질이 수지상 세포의 성숙화를 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 마우스의 골수로부터 미성숙한 수지상세포를 분리하였다.

먼저, 6 내지 8주령 된 C57BL/6 마우스 또는 BALB/c 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하고, 혈장내 혈액 세포를 분리하였다. 분리한 세포를 RPMI 1640 (10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 및 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)를 포함하는 배지에서 접종하고, 37 ℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하여, 마우스 유래 미성숙 수지상 세포를 수득하였다. 이 때 GM-CSF는 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용하였다.

<2-2> API5에 의한 수지상 세포 성숙화 마커 사이토카인 분비 수준 변화 확인

API5에 의해 수지상 세포가 성숙화 유도될 수 있는지를 확인하기 위해, 성숙화된 수지상 세포에서 분비되는 사이토카인 마커의 분비 수준을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 분리된 미성숙 수지상 세포를 배지에 접종한 다음, 상기 <실시예 1>에서 제조한 API5 단백질(1 μg/ml 또는 5 μg/ml)을 처리한 후 16 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 배양 상층액을 수득하여 이에 포함된 전-염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 및 IL-12) 및 인터페론-베타(IFN-β)의 분비량을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 양성 대조군으로서, 수지상세포의 성숙을 촉진하는 것으로 잘 알려진 LPS 100 ng/ml를 API5 대신 처리하고 동일한 방법으로 사이토카인의 분비 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 API5를 처리하지 않은 미처리 대조군에서는 해당 사이토카인의 분비가 나타나지 않는 것에 비해, API5를 처리한 수지상 세포에서는 유의적으로 전-염증성 사이토카인 및 IFN-β의 분비를 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 5 μg/ml API5 처리군의 경우, 양성 대조군인 LPS 처리군과 유사 수준의 사이토카인 분비 수준을 나타내는 것을 확인하였다.

<2-3> API5에 의한 수지상 세포 성숙화 마커 표면 인자 발현 수준 변화 확인

API5에 의해 수지상 세포가 성숙화 유도될 수 있는지를 확인하기 위해, 성숙화된 수지상 세포의 표면에서 발현되는 성숙화 지표 인자의 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 분리된 미성숙 수지상 세포를 배지에 접종한 다음, 상기 <실시예 1>에서 제조한 API5 단백질(1 μg/ml 또는 5 μg/ml)을 처리한 후 16 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 수지상 세포를 수득하여 PBS로 세척한 후, FITC-CD11c와 PE-CD40, CD80, CD86 및 MHC class Ⅰ으로 각각 염색하고, FACSCalibur를 사용하여 유동 세포 분석(flow cytometry)을 수행하여 MHC I, CD40, CD80 및 CD86의 발현 수준을 확인하였다. 양성 대조군으로서, 수지상세포의 성숙을 촉진하는 것으로 잘 알려진 LPS 100 ng/ml를 API5 대신 처리하고 동일한 방법으로 성숙화 지표 인자의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 API5를 처리하지 않은 미처리 대조군에서는 해당 성숙화 지표 인자가 발현되지 않는 것에 비해, API5를 처리한 수지상 세포에서는 유의적으로 수지상세포 성숙화 지표 인자가 발현되는 것을 확인하였다. 특히, 5 μg/ml API5 처리군의 경우, 양성 대조군인 LPS 처리군과 유사 수준으로 성숙화 지표 인자를 발현하는 것으로 확인하였다.

<2-4> API5에 의한 수지상 세포 내 신호전달계 활성화 수준 변화 확인

API5에 의해 수지상 세포가 성숙화 유도될 수 있는지를 확인하기 위해, API5 처리 후 시간의 흐름에 따라 수지상 세포 내의 신호전달계 활성화 수준의 변화를 확인하였다. 이를 위해 수지상 세포의 성숙화에 필수적인 요소로 알려져 있는 MAPK(mitogenactivated protein kinases) 신호전달계의 단백질인 ERK, JNK, P38 및 AKT의 활성화 수준과, NF-κB 활성화 지표인 IkB-α의 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 분리된 미성숙 수지상 세포를 배지에 접종한 다음, 상기 <실시예 1>에서 제조한 API5 단백질을 5 μg/ml 농도로 처리하여 배양하였다. 배양 개시로부터 60 분이 되는 시점까지, 10 분 간격으로 수지상세포를 수득하고 파쇄한 다음, 공지된 방법에 따라 웨스턴 블럿을 수행하여 ERK, JNK, P38, AKT 및 IkB-α 단백질의 발현 및 인산화 수준을 확인하였다.

그 결과 도 4에서 나타난 바와 같이 API5 단백질을 처리한 수지상 세포 내에서 배양 개시 직후로부터 배양 개시 후 50분까지 pERK, pJNK, pP38 및 pAKT의 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하여 MAPK 신호전달계가 활성화되는 것으로 확인하였다. 반면, IkB-α의 발현 수준은 점차 감소하므로, API5 단백질 처리에 의해 NF-κB 활성화 수준이 감소하는 것으로 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 실시예 <2-2> 내지 실시예 <2-4>의 실험 결과를 통해, API5 단백질이 미성숙한 수지상 세포의 활성화를 유도할 수 있음을 확인하였다.

<2-5> API5에 의한 수지상 세포의 이동능 수준 변화 확인

API5에 의해 성숙화가 유도된 수지상 세포가 이동능을 나타내는지 확인하기 위해, 수지상 세포의 이동능을 간접적으로 지표하는 CCR7의 발현을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 분리된 미성숙 수지상 세포를 배지에 접종한 다음, 상기 <실시예 1>에서 제조한 API5 단백질(1 μg/ml 또는 5 μg/ml)을 처리한 후 16 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 수지상 세포를 수득하여 PBS로 세척한 후, FITC-CD11c와 PE-CCR7로 염색하고, FACSCalibur를 사용하여 유동 세포 분석(flow cytometry)을 수행하여 CCR7 발현 양성 세포의 수를 확인하였다.양성 대조군으로서, 수지상세포의 성숙을 촉진하는 것으로 잘 알려진 LPS 100 ng/ml를 API5 대신 처리하고 동일한 방법으로 이동능 지표의 발현을 확인하였다. 미처리 대조군으로는, 미성숙 수지상세포에 유도인자(LPS, API5)를 처리하지 않고 동일 조건에서 배양한 다음, 이동능 지표의 발현을 확인하였다.

그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, API5 처리 실험군에서는 C57BL/6 마우스 유래 수지상 세포 및 BALB/c 마우스 유래 수지상 세포 모두에서 API5를 처리함에 따라 CCR7 발현 양성 세포수가 유의적으로 증가하여 LPS 처리의 양성 대조군과 유사한 수준을 나타내는 것으로 확인하였다.

<2-6> API5에 의한 수지상 세포 성숙화 유도 효과 재확인

본 발명의 실시예 <2-1> 내지 <2-6>에서 확인한, API5의 수지상 세포 성숙화 유도 효과가, LPS 오염이 아닌 API5 단백질에 의한 결과임을 재확인하기 위해서, 배지 내에 단백질분해효소 또는 LPS 차단물질인 폴리마이신 B(polymycin B)를 처리하여 수지상 세포 성숙화 수준을 재확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 분리된 미성숙 수지상 세포를 배지에 접종한 다음, 상기 <실시예 1>에서 제조한 API5 단백질을 5 μg/ml 농도로 처리한 후 16 시간 동안 배양하였다. 이 때, API5 단백질을 끓는 물에서 가열하여 변성을 유도(boiling)하거나, 단백질 가수분해효소 K(proteinase K) 또는 폴리마이신 B와 혼합하여 처리하여 배양하였다.

배양 종료 후, 먼저 배양 상층액을 수득하여 이에 포함된 전-염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 및 IL-12) 및 인터페론-베타(IFN-β)의 분비량을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 또한, 배양 종료 후 수득한 수지상 세포는 PBS로 세척한 후, FITC-CD11c와 PE-CD40 및 MHC class Ⅰ으로 각각 염색하고, FACSCalibur를 사용하여 유동 세포 분석(flow cytometry)을 수행하여 MHC I 및 CD40의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과 도 6 및 도 7에서 나타난 바와 같이, API5 처리군에서는 API5 단백질의 활성 차단 및 구조 분해의 차이에 따라 수지상 세포 성숙화 수준이 변화하는 것을 확인하였다. 먼저 사이토카인 분비 수준을 확인하였을 때, LPS 처리 양성대조군에서는 가열 변성(boiling) 및 단백질 가수분해효소 K를 첨가하여도 LPS 만을 처리한 경우와 유사한 수준으로 사이토카인의 분비 수준을 나타내는 반면, LPS 차단 물질을 처리하였을 때에는 수지상 세포의 성숙화 지표인 사이토카인이 유의적으로 발현되지 않는 것을 확인하였다(도 6). API5 단백질 처리군의 경우, API5 처리군 및 폴리마이신 B 처리군에서 유사 수준으로 수지상 세포 성숙화 지표 사이토카인이 분비되는 것을 확인하였다(도 6). 또한, 단백질을 가열 변성한 실험군에서는 변성을 유도하지 않은 실험군에 비해 낮은 수준으로 사이토카인을 분비하며, 단백질 가수분해효소 K 첨가 실험군에서는 수지상 세포의 성숙화 과정이 유도되지 않은 것을 확인하였다. 성숙화된 수지상 세포의 표면 발현 인자인 CD40 및 MHC I의 발현을 확인하였을 때에도, 사이토카인 분비 수준과 동일한 경향으로 표면 인자를 발현하는 것으로 확인하였다(도 7).

이를 통해, LPS를 처리하는 수지상 세포 성숙화 유도 과정에서는 단백질의 활성 또는 구조 분해 여부와 관계없이 성숙화를 유도할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, API5 단백질에 의한 수지상 세포 성숙화 유도 과정은 LPS 오염에 의한 것이 아닌, API5 단백질에 의한 효과임을 알 수 있다. 아울러, 단백질 변성에 의한 활성 차단시에는 일부 수지상 세포에서 성숙화가 유도되었으나 단백질이 가수분해되었을 때에는 수지상 세포의 성숙화가 유도되지 않은 것을 통해, 본 발명의 API5 단백질은 단백질의 활성에 의해 수지상 세포와 반응하여 성숙화를 유도하는 것이 아니라, 수지상 세포가 API5 단백질의 구조를 인식하여 성숙화 과정이 유도되는 것으로 예상하였다.

시험관 내 수준( In vitro )에서 TLR 4(toll-like receptor 4) 의존적인 API5 유도 수지상 세포 성숙화 과정의 확인

<3-1> 수지상 세포 성숙화 과정에서 API5의 수용체 확인

상기 실시예 <2-6>을 통해, API5 단백질에 의한 수지상 세포의 성숙화 유도 과정이 단백질의 활성에 의한 결과가 아니라 수지상 세포가 API5 단백질의 구조를 인식하여 나타나는 결과인 것으로 예상하였다. 이에, 본 발명자들은 수지상 세포가 API5 단백질을 인식하는 역할을 하는 수용체가 어떤 것인지 확인하고자 하였다.

이를 위하여, 먼저 헬라 세포를 가수분해한 가수분해물(Hela cell lysate) 1 mg 과 재조합 인간 TLR4 단백질 1ug을 NP-40 1ml에 넣고 반응시키면서, TLR4 항체 1 ug 및 protein G 비드를 순차적으로 넣었다. 상기 TLR4 및 protein G 비드는 추가적으로 넣을 때마다 4 ℃에서 16 시간 반응을 진행하였다. 모든 과정을 진행한 후, NP-40 버퍼 1mL로 세 번 세척과정을 실시 한 후에, 1X SDS-loabing 버퍼 30 uL로 추출하여 SDS-PAGE gel에 전개하여 단백질 밴드를 확인하였다. 이때 재조합 인간 TLR4 단백질 25 ng, 헬라 세포 가수분해물 30 ug은 input으로 사용하여 면역침강이 되었는지 확인하였다. 면역침강 후 재조합 TLR4 단백질 및 재조합 API5 단백질 확인을 위해서는 항-히스티딘 항체를 사용하였고 세포내 API5의 확인을 위해서는 API5 항체를 사용하였다. 재조합 인간 API5, TLR4 단백질의 면역침강에는 각각의 단백질을 1 ug, 0.5 ug을 사용하였다.

그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 API5 단백질은 세포 유래 단백질 중 TLR4와 결합하는 것으로 확인하였으며, 이를 통해 미성숙 수지상 세포의 표면에 발현된 수용체인 TLR4에 API5가 결합하여 성숙화 과정이 유도되는 것으로 예상할 수 있었다(도 8).

<3-2> TLR4 발현 여부에 따른 API5 유도의 수지상 세포 성숙화 과정 유도 여부 확인

API5가 수지상 세포의 표면에 발현되는 수용체로서 TLR4와 결합하여 성숙화를 유도할 수 있음을 재확인하기 위해서, TLR4 발현 여부에 따라 API5를 처리하였을 때 수지상 세포의 성숙화 유도 여부가 달라지는지를 확인하였다

구체적으로, 마우스 골수 유래의 수지상 세포에서 TLR2 또는 TLR4의 발현을 억제하여, 정상 세포(WT), TLR2 미발현 세포(TLR2-/-) 및 TLR4 미발현 세포(TLR4-/-) 군으로 나누었다. 그런 다음, 각각의 세포에 대하여 API5 단백질을 5 μg/ml 농도로 처리하고 16 시간 동안 배양하였다. 배양 개시 직후, 10 분 후, 30 분 후 및 60 분 후에 수지상세포를 수득하고 파쇄한 다음, 공지된 방법에 따라 웨스턴 블럿을 수행하여 ERK, JNK, P38, AKT 및 IkB-α 단백질의 발현 및 인산화 수준을 확인하였다. 그런 다음 배양 종료 후, 배양 상층액을 수득하여 이에 포함된 전-염증성 사이토카인 및 IFN-β의 분비량을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 이와 함께 수득한 수지상 세포는 PBS로 세척한 후, FITC-CD11c와 PE-CD40, CD80, CD86 및 MHC class Ⅰ으로 각각 염색하고, FACSCalibur를 사용하여 유동 세포 분석(flow cytometry)을 수행하여 MHC I, CD40, CD80 및 CD86의 발현 수준을 확인하였다. 양성 대조군으로서, LPS 100 ng/ml를 API5 대신 처리하고 동일한 방법으로 성숙화 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 9 내지 도 11에서 나타난 바와 같이, 정상 세포 및 TLR2-/- 세포에서 유사한 수준으로 API5에 의한 수지상 세포의 성숙화가 유도되는 반면, TLR4-/- 세포에서는 API5를 동일 농도로 처리하였음에도 수지상 세포의 성숙화 지표의 발현 및 관련 MAPK 신호전달계의 활성이 유의적으로 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 9 내지 도 11). 이를 통해, API5 단백질은 미성숙 수지상 세포 표면의 TLR4에 결합하여 수지상 세포의 성숙화 과정이 유도되는 것으로 확인하였다.

API5 매개의 수지상 세포 백신이 암 항원에 대하여 특이적인 CD8+ T 세포를 생성하는 효과 확인

API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포가 암 백신으로서 사용될 수 있는지 확인하기 위해, 상기 수지상 세포가 투여된 마우스에서 암 항원에 대하여 특이적인 CD8+ T 세포를 생성할 수 있는지 확인하였다.

먼저, C57BL/6 마우스를 그룹당 3 마리의 총 6 그룹으로 나누고, 이들을 각각 용매 대조군(PBS 처리군, Con); 무처리 대조군(미성숙 수지상 세포 투여군, imDC); API5 및 성숙 수지상 세포 투여군(API5+mDC); 암 항원 및 미성숙 수지상 세포 투여군(Ag+imDC); 암 항원, API5 및 성숙 수지상 세포 투여군(Ag+API5+mDC); 및 암 항원, LPS 및 성숙 수지상 세포 투여군(Ag+LPS+mDC)으로 지정하였다. 이와 같이 나눈 마우스 그룹에 수지상 세포는 2×10⁶ 세포/마우스의 농도로 접종하였으며, 암 항원으로는 OVA 펩타이드, E7 펩타이드 또는 AH-A5 펩타이드를 각각 1 μg/ml 농도로 첨가(plusing)하였고, API5 단백질은 5 μg/ml로, LPS는 100 ng/ml 농도로 투여하였다. 각각의 군에 투여하는 물질 및 수지상 세포는 일주일 간격으로 총 2 회 접종하였다. 접종을 위해 사용한 암 항원 펩타이드 중 E7(Db-restricted E7 49-57 (RAHYNIVTE)) 및 OVA(Kb-restricted OVA 257-264(SIINFEKL)) 펩타이드는 Anygen(Jeollanam-do, Republic of Korea)에서 합성한 것을 사용하였으며, 성숙 수지상 세포는 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 미성숙 수지상 세포에 API5 또는 LPS를 처리하여 성숙화되도록 유도한 것을 사용하였다. 암 항원을 투여하는 실험군에서는 OVA 펩타이드, E7 펩타이드 또는 AH-A5 펩타이드를 성숙 또는 미성숙 수지상 세포에 가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음, PBS로 2 회 세척한 것을 사용하였다.

마지막 접종 후 7일 째에 마우스의 비장 세포(splenocytes)를 분리한 다음, RPMI 1640(10% FBS, 1% penicillin streptomycin, 0.5% 2-mercaptoethanol을 포함) 배지에 분리한 비장 세포를 접종하고 37 ℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이 때, 배양 배지에는 1 μl/ml golgi plug 및 1 μl/ml 암 항원을 넣어 배양하였다. 16 시간 동안 배양한 후, 세포를 수득하여 PBS로 세척하고, PE-CD8a 항체로 염색하였다. 그런 다음, 고정, 투과 과정 후 다시 FITC-IFN-γ 항체로 염색한 세포를 FACSCallibur를 사용해 유동 세포 분석(FACS)하였다. 유동 세포 분석 결과, 비장 세포 중 CD8 및 IFN-γ에 모두 양성인 세포를 암 항원 특이적 CD8+ 세포독성 T 세포로 정의하고, 각각의 군에서 해당 CD8+ 세포독성 T 세포의 생성 비율을 확인하였다.

그 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이 API5 처리로 성숙화된 수지상 세포에 암 항원 펩타이드를 첨가한 실험군에서 다른 마우스 그룹에 비해 월등히 높은 수준으로 CD8+ 세포독성 T 세포를 생성하는 것을 확인하였다(도 12). 보다 구체적으로, 암 항원으로 자극을 유도하지 않은 수지상 세포에서는 API5에 의한 성숙의 여부와 관계없이 유의적인 CD8+ 세포독성 T 세포가 생성되지 않았으며, 이에 비해 암 항원으로 자극을 유도한 수지상 세포 접종군에서는 추출한 비장 세포에서 암 항원을 재투여하였을 때 CD8+ 세포독성 T 세포를 생성하는 것을 확인하였다. 특히, LPS 및 API5로 성숙화를 유도한 성숙 수지상 세포에서 보다 유의적으로 높은 수준의 CD8+ 세포독성 T 세포 생성 효과를 나타낼 수 있었으며, LPS보다 API5로 성숙화 유도한 수지상 세포에서 현저히 높은 수준의 CD8+ 세포독성 T 세포 생성능을 나타내는 것을 통해, 본원 발명의 API5 단백질이 LPS보다 높은 CD8+ 세포독성 T 세포 생성능을 나타내는 것으로 확인하였다.

API5 매개의 수지상 세포 백신의 암 예방 효과 확인

<5-1> API5 매개의 성숙 수지상 세포 접종에 따른 암 예방 효과 확인

API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포가 암 백신으로서 사용될 때 효과적으로 암 예방 효과를 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 4]에서 지정한 바와 같은 총 6 개의 마우스 그룹에 투여 물질 및 수지상 세포를 총 2 회 접종하였다. 마지막 접종을 하고 7 주간 마우스를 사육한 다음, E7 펩타이드를 항원으로 사용한 E7 백신 그룹에 2.5×10⁵ 개의 TC-1 세포; OVA 펩타이드를 항원으로 사용한 OVA 백신 그룹에 5×10⁶ 개의 EG.7 세포; 및 AH1-A5 펩타이드를 항원으로 사용한 AH1-A5 백신 그룹에 2×10⁵ 개의 CT26 세포;를 각각의 마우스 그룹의 피하에 주입하였다. 그런 다음, Kaplan-Meier 생존 분석실험을 통해 종양 생장을 나타내지 않는 마우스의 비율을 확인하였다.

그 결과 도 13에서 나타난 바와 같이 API5 처리로 성숙화된 수지상 세포에 암 항원 펩타이드를 첨가한 실험군에서는 암세포를 피하 주입한 것으로부터 생성되는 종양을 나타내는 마우스가 없는 것으로 확인하여, API5에 의해 성숙화된 수지상 세포가 다른 마우스 그룹에 비해 월등히 높은 암 예방 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 13).

<5-2> API5 중개의 수지상 세포 백신의 기억 T 세포 생성능 및 이에 따른 암 예방 효과의 확인

본 발명의 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포가 유의적인 암 예방 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였으므로, 암 항원 특이적인 기억 T 세포의 생성 여부를 확인하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 4]에서 지정한 그룹 중, API5 및 성숙 수지상 세포 투여군(API5+mDC); 및 암 항원, API5 및 성숙 수지상 세포 투여군(Ag+API5+mDC)에 투여 물질 및 수지상 세포를 총 2 회 접종하였다. 마지막 접종을 하고 7 주간 마우스를 사육한 다음, 마우스의 비장 세포(splenocytes)를 분리하여 1 ㎕/ml golgi plug 및 1 ㎕/ml 암 항원을 포함하는 배지에서 16 시간 배양하여 수지상 세포를 암 항원으로 자극하였다. 그런 다음, 세포를 수득하여 PBS로 세척하고, PE-CD8a 항체로 염색하고 고정, 투과 과정 후 다시 FITC-IFN-γ 항체로 염색하였다. 염색된 세포는 유동 세포 분석하여 CD8 및 IFN-γ에 모두 양성인 세포를 암 항원 특이적 기억 T 세포로서 확인하였다.

그런 다음, 암 항원에 따라 E7 백신 그룹에 2×10⁵ 개의 TC-1 세포; OVA 백신 그룹에 1×10⁶ 개의 EG.7 세포; 및 AH1-A5 백신 그룹에 2×10⁵ 개의 CT26 세포;를 각각의 마우스 그룹의 피하에 주입하였다. 그런 다음, 암세포 주입 후 1 주일 후에 비장세포를 다시 수득하여 위와 동일한 방법으로 암 항원 특이적 기억 T 세포가 증폭된 수준을 확인하였다. 마지막으로, 암세포 주입 후 30 일 동안 2 내지 3 일 간격으로 종양의 성장을 관찰하였다.

그 결과, 도 14에서 나타난 바와 같이 API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포가 기억 T 세포의 생성을 유도하여 유의적안 암 예방 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 투여 물질 및 수지상 세포의 마지막 접종 7 주 후에 기억 T 세포의 생성 여부를 확인하였을 때 유의적인 수준으로 기억 T 세포가 생성되었으며, 이후 암 세포를 주입하고 1주 후에는 기억 T 세포에 의해 암 세포 특이적인 CD8+ 세포독성 T 세포의 생성 수준이 현저히 증폭하는 것을 확인하여, 기억 T 세포의 촉진에 의해 암 예방 효과를 나타낼 수 있을 것으로 확인하였다(도 14a, 도 14c 및 도 14e). 이와 함께, 예방 백신의 접종 7 주 후에 피하로 주사된 암세포가 종양 조직으로 성장되지 않는 것을 확인하여, 이를 통해 기억 T 세포에 의해 암 예방 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 14b, 도 14d 및 도 14f).

API5 매개 수지상 세포의 백신으로서 암 치료 효과 확인

API5에 의해 성숙화 유도된 수지상 세포가 생체 내에서 유의적으로 암 치료 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위해, 먼저 암 세포를 가지는 마우스 군에서 성숙 수지상 세포에 의한 암 치료 효과를 확인하였다.

구체적으로, 먼저 정상 C57BL/6 마우스에 2×10⁵ 개의 TC-1 세포; 1×10⁶ 개의 EG.7 세포; 또는 2×10⁵ 개의 CT26 세포;를 각각의 마우스 그룹의 피하에 주입하였다. 그런 다음 암세포 주입 3 일 후에, 상기 [실시예 4]에서 지정한 6 개의 마우스 그룹에 투여 물질 및 수지상 세포를 접종하였다. 이 때, TC-1 세포를 주입한 마우스에 대한 암 항원은 E7 펩타이드를 사용하였고, EG.7 세포를 주입한 마우스에 대한 암 항원은 OVA 펩타이드를 사용하였으며, CT26 세포를 주입한 마우스에 대한 암 항원은 AH1-A5 펩타이드를 사용하였다. 각각의 조건에 따라 마우스에 투여 물질 및 수지상 세포를 일주일 간격으로 총 2 회 접종하고, 총 60 일 동안 마우스를 사육하였다. 사육 중, 2 내지 3일 간격으로 암 세포로부터 형성된 종양 조직의 크기를 측정하였고, Kaplan-Meier 생존 분석 실험을 통해 사육 기간 동안의 마우스 생존률을 확인하였다.

그 결과, 도 15에서 나타난 바와 같이, 암 세포를 가지는 마우스에 투여된 수지상 세포 중 성숙화된 후 암 항원으로 자극된 수지상 세포를 접종한 실험군에서 다른 마우스 그룹에 비해 높은 수준의 암 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로, 암 항원으로 자극을 유도하지 않은 수지상 세포에서는 API5에 의한 성숙의 여부와 관계없이 유의적인 암 치료 효과를 나타내지 않았다. 이에 비해 암 항원으로 자극을 유도한 수지상 세포 접종군 중 미성숙 수지상 세포를 접종하는 경우에는 암 치료 효과가 높지 않은 것을 확인하였다. 또한, LPS 및 API5로 성숙화를 유도한 성숙 수지상 세포에서 유의적으로 높은 수준의 암 치료 효과를 나타내어 종양의 크기가 유의적으로 증가하지 않을 뿐 아니라 마우스의 생존률이 증가하는 것을 나타내었으며, 특히 LPS보다 API5 처리군에서 가장 높은 암 치료 효과를 나타내는 것으로 확인하였다.

생체 내에서 TLR4 의존적인 API5 매개 T 세포의 생성 효과 및 암 치료 효과의 확인

<7-1> TLR4 발현 유무에 따른 수지상 세포의 T 세포 생성 여부 확인

본 발명에서는 API5가 미성숙한 수지상 세포 표면의 TLR4와 결합하여 수지상 세포의 성숙화를 유도하고, 이를 통해 성숙 수지상 세포가 암 특이적인 T 세포를 생성하여 암 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이를 다시 한 번 확인하고자, API5 유도의 성숙 수지상 세포 백신에서 TLR4 의존성을 재증명하였다.

구체적으로, 정상 C57BL/6 마우스에 API5를 처리하여 성숙화 유도한 수지상 세포 및 암 항원으로서 E7 펩타이드를 일주일 간격으로 두 번 접종하였다. 이 때, 수지상 세포는 야생형(wild type) 또는 TRL4-/- 세포를 사용하였다. 마지막 접종 후 7일 째에 마우스의 비장 세포를 분리한 다음, 상기 [실시예 4]와 동일한 방법으로 암 항원 특이적 CD8+ 세포독성 T 세포의 생성 비율을 확인하였다.

그 결과 도 16에서 나타난 바와 같이, TLR4를 발현하지 않는 수지상 세포는 API5에 의한 성숙화 과정이 유도되지 않아 E7 항원 특이적 CD8+ 세포독성 T 세포의 발현 수준이 유의적으로 나타나지 않는 반면, TLR4를 발현하는 WT 세포에서는 API5에 의해 성숙화된 수지상 세포로부터 E7 항원 특이적 CD8+ 세포독성 T 세포가 유의적으로 생성되는 것을 확인하였다(도 16).

<7-2> TLR4 발현 유무에 따른 API5 매개 수지상 세포의 암 치료 효과 확인

API5 매개의 성숙 수지상 세포가 TLR4을 발현하는 경우에 암 항원 특이적 T 세포를 생성할 수 있음을 확인하여, 이로부터 암 치료 효과를 유의적으로 나타낼 수 있는지 또한 확인하고자 하였다.

구체적으로, 먼저 정상 C57BL/6 마우스에 2×10⁵ 개의 TC-1 세포를 각각의 마우스 그룹의 피하에 주입하였다. 그런 다음 암세포 주입 3 일 후 및 10 일 후에, API5를 처리하여 성숙화 유도한 수지상 세포 및 암 항원으로서 E7 펩타이드를 접종하였다. 이 때, 수지상 세포는 야생형(wild type) 또는 TRL4-/- 세포를 사용하였다. 접종 후에는 마우스를 총 60 일 동안 사육하였으며, 사육 중 2 내지 3일 간격으로 암 세포로부터 형성된 종양 조직의 크기를 측정하였고, Kaplan-Meier 생존 분석 실험을 통해 사육 기간 동안의 마우스 생존률을 확인하였다.

그 결과 도 17에서 나타난 바와 같이 TLR4를 발현하지 않는 수지상 세포로부터는 E7 항원 특이적 CD8+ 세포독성 T 세포의 생성이 나타나지 않았던 것과 동일하게 종양이 지속적으로 성장하여 암세포 주입 후 30 일에 모든 마우스가 사망하는 것으로 확인하였다. 이에 비해, TLR4를 발현하는 WT 세포에서는 API5에 의해 성숙화된 수지상 세포 접종 군에서는 종양 성장이 유의적으로 나타나지 않았으며 생존률 또한 높은 수준으로 지속되어, 암 치료 효과를 나타내는 것으로 확인하였다(도 17).

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Composition for inducing maturation of dendritic cell comprising API5 protein <130> 1062544 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1515 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgccgacag tagaggagct ttaccgcaat tatggcatcc tggccgatgc cacggagcaa 60 gtgggccagc ataaagatgc ctatcaagtg atattggatg gtgtgaaagg tggtactaag 120 gaaaagcgat tagcagctca atttattccg aaattcttta agcattttcc agaattggct 180 gattctgcta tcaatgcaca gttagacctc tgtgaggatg aagatgtatc tattcgacgt 240 caagcaatta aagaactgcc tcaatttgcc actggagaaa atcttcctcg agtggcagat 300 atactaacgc aacttttgca gacagatgac tctgcagaat ttaacctagt gaacaatgcc 360 ctattaagta tatttaaaat ggatgcaaaa gggactttag gtgggttgtt cagccaaata 420 cttcaaggag aggacattgt tagagaacga gcaattaaat tcctttctac aaaacttaag 480 actttaccag atgaagtctt aacaaaggaa gtggaagagc ttatactaac tgaatccaaa 540 aaggtcctag aagatgtgac tggtgaagaa tttgttctat ttatgaagat actgtctggg 600 ttaaaaagct tacagacagt gagtggaaga cagcaacttg tagagttggt ggctgaacag 660 gccgacctag aacagacctt caatccctcg gatcctgact gtgtggacag gctcttacag 720 tgcactcggc aggcagtacc cctcttctct aaaaatgtcc attccacaag gtttgtgaca 780 tatttctgtg agcaggttct ccctaacctc ggtaccttga ctaccccagt ggaaggtctt 840 gatatacagt tggaggtatt gaaattgttg gcggagatga gttcattttg tggtgacatg 900 gaaaaactag aaacaaattt aaggaaacta tttgataagt tattggaata catgcccctc 960 cctccagaag aggcagaaaa tggagagaat gctggtaatg aagaacccaa gctacagttc 1020 agttatgtgg aatgtttgtt gtacagtttt caccagttgg gccgaaaact tccagatttc 1080 ttaacagcca aactgaatgc agaaaagctc aaagatttca aaatcaggct gcagtacttt 1140 gcacggggcc tgcaagttta tatcagacaa cttcgcttag ctctccaggg taaaacgggt 1200 gaggccttaa aaacagaaga gaacaagatt aaagtcgttg cattgaaaat aacaaacaat 1260 atcaatgttt taatcaagga tctcttccac attcctcctt cttataagag cacagtaaca 1320 ctatcctgga aacctgtaca aaaggttgag attgggcaaa agagagccag tgaagataca 1380 acttcaggtt caccacccaa gaaatcttca gcaggaccaa aaagagatgc caggcagatt 1440 tataaccctc ccagtgggaa atatagcagc aatttgggca actttaatta tgagaggagc 1500 cttcagggga agtaa 1515 <210> 2 <211> 524 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Thr Val Glu Glu Leu Tyr Arg Asn Tyr Gly Ile Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Thr Glu Gln Val Gly Gln His Lys Asp Ala Tyr Gln Val Ile Leu 20 25 30 Asp Gly Val Lys Gly Gly Thr Lys Glu Lys Arg Leu Ala Ala Gln Phe 35 40 45 Ile Pro Lys Phe Phe Lys His Phe Pro Glu Leu Ala Asp Ser Ala Ile 50 55 60 Asn Ala Gln Leu Asp Leu Cys Glu Asp Glu Asp Val Ser Ile Arg Arg 65 70 75 80 Gln Ala Ile Lys Glu Leu Pro Gln Phe Ala Thr Gly Glu Asn Leu Pro 85 90 95 Arg Val Ala Asp Ile Leu Thr Gln Leu Leu Gln Thr Asp Asp Ser Ala 100 105 110 Glu Phe Asn Leu Val Asn Asn Ala Leu Leu Ser Ile Phe Lys Met Asp 115 120 125 Ala Lys Gly Thr Leu Gly Gly Leu Phe Ser Gln Ile Leu Gln Gly Glu 130 135 140 Asp Ile Val Arg Glu Arg Ala Ile Lys Phe Leu Ser Thr Lys Leu Lys 145 150 155 160 Thr Leu Pro Asp Glu Val Leu Thr Lys Glu Val Glu Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Thr Glu Ser Lys Lys Val Leu Glu Asp Val Thr Gly Glu Glu Phe Val 180 185 190 Leu Phe Met Lys Ile Leu Ser Gly Leu Lys Ser Leu Gln Thr Val Ser 195 200 205 Gly Arg Gln Gln Leu Val Glu Leu Val Ala Glu Gln Ala Asp Leu Glu 210 215 220 Gln Thr Phe Asn Pro Ser Asp Pro Asp Cys Val Asp Arg Leu Leu Gln 225 230 235 240 Cys Thr Arg Gln Ala Val Pro Leu Phe Ser Lys Asn Val His Ser Thr 245 250 255 Arg Phe Val Thr Tyr Phe Cys Glu Gln Val Leu Pro Asn Leu Gly Thr 260 265 270 Leu Thr Thr Pro Val Glu Gly Leu Asp Ile Gln Leu Glu Val Leu Lys 275 280 285 Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Phe Cys Gly Asp Met Glu Lys Leu Glu 290 295 300 Thr Asn Leu Arg Lys Leu Phe Asp Lys Leu Leu Glu Tyr Met Pro Leu 305 310 315 320 Pro Pro Glu Glu Ala Glu Asn Gly Glu Asn Ala Gly Asn Glu Glu Pro 325 330 335 Lys Leu Gln Phe Ser Tyr Val Glu Cys Leu Leu Tyr Ser Phe His Gln 340 345 350 Leu Gly Arg Lys Leu Pro Asp Phe Leu Thr Ala Lys Leu Asn Ala Glu 355 360 365 Lys Leu Lys Asp Phe Lys Ile Arg Leu Gln Tyr Phe Ala Arg Gly Leu 370 375 380 Gln Val Tyr Ile Arg Gln Leu Arg Leu Ala Leu Gln Gly Lys Thr Gly 385 390 395 400 Glu Ala Leu Lys Thr Glu Glu Asn Lys Ile Lys Val Val Ala Leu Lys 405 410 415 Ile Thr Asn Asn Ile Asn Val Leu Ile Lys Asp Leu Phe His Ile Pro 420 425 430 Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Val Thr Leu Ser Trp Lys Pro Val Gln Lys 435 440 445 Val Glu Ile Gly Gln Lys Arg Ala Ser Glu Asp Thr Thr Ser Gly Ser 450 455 460 Pro Pro Lys Lys Ser Ser Ala Gly Pro Lys Arg Asp Ala Arg Gln Ile 465 470 475 480 Tyr Asn Pro Pro Ser Gly Lys Tyr Ser Ser Asn Leu Gly Asn Phe Asn 485 490 495 Tyr Glu Gln Arg Gly Ala Phe Arg Gly Ser Arg Gly Gly Arg Gly Trp 500 505 510 Gly Thr Arg Gly Asn Arg Ser Arg Gly Arg Leu Tyr 515 520

Claims

API5 단백질(apoptosis inhibitor-5)을 유효성분으로 하는, 수지상 세포(dendritic cell, DC)의 성숙화(maturing) 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 API5 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 수지상 세포는 TLR4(toll-like receptor 4)를 발현하는 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
미성숙 수지상 세포에 API5 단백질을 처리하여 배양하는 단계;를 포함하는, 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
제 4항에 있어서, 상기 방법은, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
제 4항의 방법으로 제조된 성숙 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 암은 대장암, 치종암, 혈액암, 후두암, 식도암, 구강암, 기저세포암, 담도암, 갑상선암, 직장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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