KR102646708B1 - T 세포 반응을 촉진하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 T 세포 반응을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 사람 DC에서 CLEC-1의 발현 및 기능을 시험하였고 최초로 세포-표면 발현을 입증하였다. 본 발명자들은 T-세포 반응의 조정에 있어서 개시를 수반한 이의 기능적 역할을시험하였다. 본 발명자들은 CLEC-1 결핍성 랫트 및 랫트 CLEC-1 Fc 융합 단백질을 사용하여 시험관내 및 생체내에서 CLEC-1 신호전달의 파괴가 시험관내 Th17 활성화를 향상시키고 생체내에서 T 세포 프라이밍 및 Th17과 Th1 활성화를 향상시킴을 밝혔다. 특히, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 T 세포 반응을 촉진하기 위한 CLEC-1 길항제에 관한 것이다.

Description

T 세포 반응을 촉진하는 방법
발명의 분야:
본 발명은 T 세포 반응을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
암은 2012년에 820만명의 사망을 차지하는(세계 암 보고, 2014, 세계 보건 기구) 전세계적으로 사망의 주된 원인이므로 주요 관심사가 되고 있다. 예를 들면, 암은 심장 질환만이 이를 능가하는, 미국에서 사망의 두 번째로 가장 일반적인 사망의 원인이며, 매 4명의 사망 중 거의 1명의 사망을 차지한다(cancer facts and figures 2015, American Cancer Society). 다수의 존재하는 치료에도 불구하고, 암을 치료하는 개선된 방법이 여전히 요구되고 있다.
T 세포 반응은 항종양 면역 반응의 주요 요인을 나타낸다. 항종양 T-세포 반응은 거의 알려져 있지 않지만, 몇가지 연구는 세포독성 CD8-형 및 헬퍼(helper) CD4-형 반응이 중심 역할을 담당함을 입증하였다(Motz, GT and Coukos, G (2013). Deciphering and reversing tumor immune suppression. Immunity 39: 61-73) (Bos, R and Sherman, LA (2010). CD4+ T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+ T lymphocytes. Cancer Res 70: 8368-8377) (Tosolini, M, et al. (2011). Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells (Th1, Th2, Treg, Th17) in patients with colorectal cancer. Cancer Res 71: 1263-1271). 더욱이, Th17 세포는 면역 세포를 종양 내로 보충하거나, 효과기 CD8+ T 세포를 활성화시키거나, 또는 심지어 직접 Th1 표현형으로 전환시켜 IFN-γ를 생산함으로써 항종양 면역 반응을 구동시킨다(Th17 Cell Plasticity and Functions in Cancer Immunity, Leslie Gu
Figure 112019050516720-pct00001
ry and St
Figure 112019050516720-pct00002
phanie Hugues, BioMed Research International, Volume 2015 (2015)).
치료학적 항종양 면역력을 활성화시키기 위한 가장 촉망되는 시도 중에는 면역 체크포인트(immune checkpoint)의 차단이 있다. 면역 체크포인트는 자가-내성을 유지하는데 중요하고 부수적인 조직 손상을 최소화시키는 면역계 내로 내장된 과잉의 억제 경로를 지칭한다. 현재 종양은 면역 내성의 주요 메카니즘으로서 특히 골수 세포를 통해 특정의 면역-체크포인트 경로를 선취(co-opt)함이 명확하다(Couzin-Frankel 2013; De Henau, Rausch et al. 2016).
과거 수년 동안, 축적되는 증거는, 종양이 억제성 C-형 렉틴 수용체(CLR)의 생리학적 공정, 특히 골수 세포 활성화를 억제하고 면역 회피(immune evasion)를 촉진하기 위한 상처 치유를 수반하는 것을 사용함을 입증하고 있다. CLR은 종양 세포에 의한 비정상적인 글리코실화뿐만 아니라 죽은 세포에 의해 방출된 지질, 단백질 또는 DAMP와 같은 보다 다양한 리간드를 인식하는 특이성을 갖는다(Geijtenbeek and Gringhuis 2009; Yan, Kamiya et al. 2015). 몇가지 실험적 연구는 CLR이 암 진행 및 세포-부착 또는 T-세포 반응 성형(T-cell response shaping)에서 이들의 기능에 의한 전이성 확산에 기여함을 입증하고 있다(Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al. 2017). 예를 들면, 면역조절성 수용체 DC-SIGN, MINCLE, DCIR 및 BDCA-2는 골수 세포 활성화, 염증을 억제하고 Foxp3+ CD4+ CD25+ Tregs 확장을 구동시키는데 중요한 것으로 밝혀졌다(Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al. 2017). DC-SIGN은 거의 모든 사람 암종에서 과발현된 암배아 항원을 인식하여(Nonaka, Ma et al. 2008) 골수 세포에 의한 면역억제성 사이토킨 IL-10 및 IL-6의 분비를 촉진한다. 게다가, DC-SIGN 유전자 프로모터에서 다형성(polymophism)은 결장직장 암 환자에서 증가된 위험과 관련된 것으로 밝혀졌다(Lu, Bevier et al. 2013). MINCLE은 췌장 관 선암종에서 종양 침윤성 백혈구 및 특히 골수 억제 세포(MSC)에 의해 향성되는 것으로 밝혀졌다. MINCLE와 죽은 세포로부터 방출된 SAP130(히스톤 데아세틸라제 복합체의 소단위)의 연결은 강력한 종양-주변 억제(peri-tumoral suppression)를 유도한다(Seifert, Werba et al. 2016). 유사하게, CLR LOX-1은 암 환자에서 혈액 또는 종양-침윤 호중구의 세포 표면에서 특이적으로 향상되는 반면(15 내지 50%) 건강한 공여체의 혈액 속에서는 거의 검출불가능한 것으로 밝혀졌다(Condamine, Dominguez et al. 2016). 이러한 연구에서, 이들은 소포체 스트레스(endoplasmic reticulum stress)가 LOX-1 발현을 유도하고 강력한 억제 기능으로 호중구를 MSC로 전환시킴을 밝혀내었다.
역으로, DECTIN-1과 같은 활성화 CLR의 신호전달(signaling)을 개시하는 것은 항-종양 면역력을 증가시키고 Treg 및 MSC를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Tian, Ma et al. 2013). DECTIN-1의 리간드인, 베타-글루칸의 투여는 쥐 암종 모델(Li, Cai et al. 2010; Masuda, Inoue et al. 2013; Tian, Ma et al. 2013), 사람 흑색종, 신경아세포종, 림프종 이종이식체 모델(Modak, Koehne et al. 2005) 뿐만 아니라 사람 난소암 및 위암(Inoue, Tanaka et al. 1993; Oba, Kobayashi et al. 2009)에서도 종양 성장을 억제한다.
따라서, 이러한 미세환경에서 특별하게 유도되는 억제성 CLR을 표적화하는 것은 골수 세포 활성화 및 항-종양 면역력을 향상시키는 촉망되는 치료학적 전략임을 나타낸다.
과거에, 본 발명자들은 C-형 렉틴-유사 수용체-1(C-type lectin-like receptor-1: CLEC-1)이 설치류에서의 동종이식편 내성의 모델에서 상향-조절됨을 확인하였다(Thebault, Lhermite et al. 2009). CLEC-1은 C-형 렉틴-유사 수용체의 DECTIN-1 집단에 속하며(Plato, Willment et al. 2013) 오래전에 확인되었지만, 리간드 및 신호전달은 특성화되어 있지 않고 있다. CLEC-1은 CLEC-2, DECTIN-1, CLEC-9A, MICL, MAH 및 LOX-1을 포함하는 CTLR의 DECTIN-1 집단에 속하며, 오래전에 확인되었지만(Colonna M, Samaridis J, Angman L. Molecular characterization of two novel C-type lectin-like receptors, one of which is selectively expressed in human dendritic cells. Eur J Immunol. 2000;30(2):697-704), 리간드, 하부 신호전달(downstream signaling) 및 생물학적 효과는 특성화되지 않고 있다. CLEC-1은 세포질성 테일(cytoplasmic tail)에서 면역수용체 타이로신-기반 활성화(ITAM) 또는 억제성(ITIM) 모티프(motif)를 함유하지 않지만 오히려 특성화되지 않은 신호전달 서열내에 타이로신 잔기를 함유한다(Flornes LM, Nylenna O, Saether PC, Daws MR, Dissen E, Fossum S. The complete inventory of receptors encoded by the rat natural killer cell gene complex. Immunogenetics. 2010;62(8):521-530). 그러나, 이러한 모티프가 포스포릴화를 겪는지 또는 다른 CTLR에서와 같이 CLEC-1이 안정한 발현 및 신호전달을 위한 어댑터 쇄(adaptor chain)를 필요로 하는지의 여부는 알려져 있지 않다. CLEC-1은 또한 Dectin-1, DC-SIGN 또는 CLEC-2로서 3중-산성 모티프(tri-acidic motif)[DDD]를 함유한다. 흥미롭게도, 이러한 삼중-산성 모티프는 Dectin-1가 Raf-1 활성을 조절하고 대부분의 CTLR에 의해 유도된 카스파제 보충성 도메인-함유 단백질 9(Card9)-의존성 NF-κB 경로를 억제하여 분비된 사이토킨의 세트 및 후속적인 Th1 및 Th17 세포 분화의 균형을 재프로그램화하는 것으로 나타났다(Gringhuis SI, den Dunnen J, Litjens M, et al. Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk. Nat Immunol. 2009;10(2):203-213). 사람 CLEC-1 단백질 발현, 조절 및 기능에 있어서는 지금까지 거의 기술되어 있지 않아 왔다. 사람 CLEC-1이 소포체 단백질과 유사한 염색 양식으로 내피 세포내에서 세포내적으로만 검출될 수 있으며 TGF-β 또는 염증성 저극은 세포 표면으로의 유의적인 전좌를 촉진할 수 없다는 것을 개시하는 CLEC-1 발현에 대해 유일하게 하나의 공보가 존재한다(The human C-type lectin-like receptor CLEC-1 is upregulated by TGF-β and primarily localized in the endoplasmic membrane compartment. Sattler et al., ScandJImmunol. 2012 Mar;75(3):282-92). 따라서, hCLEC-1에 대한 당해 분야의 기술 상태에서 이용가능한 유일한 정보(즉, 내피 세포내에서의 세포내 국재화(localisation))는 랫트에서 알려진 것과는 대조적이다(즉, 내피 및 골수 세포의 표면에서 국재화된 rCLEC-1).
본 발명자들은 최초로 CLEC-1이 통상의 DC(cDC)에 의해서 및 사람 혈액 속의 단핵구 및 DC의 작은 소단위에 의해 발현되고 면역억제성 사이토킨 TGFβ에 의해 향상됨을 밝혀내었다. 이들은 설치류 및 사람 둘 다에서 CLEC-1이 골수 세포내에서 억제성 수용체로서 작용하며 생체내(in vivo)에서 IL12p40 발현 및 하부 Th1 및 Th17을 방지함을 입증하였다.
이들은 또한 사람 T 세포 증식 및 사람 IFN-감마가 CLEC-1의 길항제로서 항-hCLEC-1 항체를 사용하여 증가됨을 밝혀내었다. 이들은 또한 CLEC-1이 결핍된 마우스가 종양 성장에 대해 보다 우수하게 내성이며 간암종 마우스 모델에서 증가된 생존율을 나타냄을 입증하였다. 본 발명자들은 사람 CLEC-1이 M2-형 전-종양성 대식구에 의해, 흉막 삼출 중피종 및 난소 종양 복수액으로부터의 골수 세포에 의해 발현됨을 밝혀내었다. 따라서, 세포-표면 수용체로서 CLEC-1은 임상 셋팅에서 항-종양 면역력을 향상시키기 위한 유용한 치료학적 도구임을 나타낼 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 T 세포 반응을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 청구범위에 의해 정의된다.
발명의 상세한 설명:
놀랍게도, 본 발명자들은 사람 DC에서 CLEC-1의 발현 및 기능을 시험하였으며 최초로 세포-표면 발현에 대해 입증하였다. 본 발명자들은 또한 사람에서 h-CLEC-1이 M2-형 전-종양성 대식구에 의해, 흉막 삼출 중피종 및 난소 종양 복수액으로부터의 골수 세포에 의해 발현됨을 밝혀내었다. 이들은 T-세포 반응의 결집에 대한 개시(triggering)를 수반하는 이의 기능적 역할을 연구하였다.
또한, 이들은 CLEC-1 결핍성 랫트 및 랫트 CLEC-1 Fc 융합 단백질을 사용하여 DC 기능 및 하부 T-세포 면역성에 있어서 CLEC-1 신호전달의 파괴의 결과를 시험관내(in vitro) 및 생체내에서 시험하였다. CLEC-1 신호전달의 파괴는 시험관내 Th17 활성화를 향상시키고 T 세포 프라이밍(priming)과 Th17 및 Th1 활성화를 생체내에서 향상시킨다. 이들의 결과는 DC에서 CLEC-1이 하부 Th17 및 Th1 세포 활성화의 정도 및 품질을 억제하고 세포-표면 수용체로서 T 세포 반응을 조정하기 위한 치료학적 도구를 제공할 수 있음을 명확하게 나타낸다. 본 발명자들은 또한 사람 T 세포 증식 및 사람 IFN -감마가 CLEC -1의 길항제로서 항- hCLEC -1 항체를 사용하여 증가되는 것을 밝혀내었다. 이들은 또한 CLEC-1이 결핍된 마우스가 종양 성장에 대해 보다 우수하게 내성이며 간암종 마우스 모델에서 증가된 생존율을 나타냄을 입증하였다. 결과는 CLEC-1이 활성화 역치(activation threshold)를 상승시킴으로써 골수 세포내에서 억제성 수용체의 역할을 함을 나타낸다. CLEC-1 불활성화는 T 세포 증식과 Th1 및 Th17 분극화(polarization) 둘 다를 증가시킨다.
따라서, 본 발명의 제1 국면은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 CLEC-1의 길항제를 투여함을 포함하여, 대상체에서 T 세포 반응을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
대상체가 암을 앓고 있는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 국면은 본 발명의 CLEC-1 길항제를 포함하는, 조성물, 특히 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 세포 표면에서 T-세포 수용체를 갖고 세포-매개된 면역력에 있어서 중심 역할을 담당하는 림프구 유형인 T 림프구를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포 반응"은 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 합성을 수반하는 임의의 생물학적 공정을 지칭한다.
T 세포 반응은 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 합성을 평가함으로써 당해 분야의 기술자로부터 잘 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 일 구현예에서, T 세포 반응은 CLEC-1을 발현하는 수지상 세포로부터 유도된 동종이계 단핵세포와 혼합된 말초 혈액으로부터 단리된 정제된 T 세포로 이루어진 혼합된 백혈구 반응(MLR)을 수행함으로써 측정된다. T 세포의 증식은 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester) 희석에 의해 평가할 수 있으며 IFNγ 발현은 T 세포 속에서 유동 세포분석법 및 상층액 속에서 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 설치류, 고양이과, 개과, 및 영장류와 같은 포유동물을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 대상체는 사람이다.
용어 "암"은 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 신체의 다른 부분에 침입하거나 확산하는 잠재능을 지닌 비정상적인 세포 성장에 수반하는 질환의 그룹을 지칭한다. 용어 "암"은 또한 원발성 및 전이성 암 둘 다를 추가로 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 암의 예는 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립샘, 피부, 위, 고환, 혀, 또는 자궁으로부터 선택된 암 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 암은 이에 한정되지 않지만, 구체적으로 다음의 조직학적 유형일 수 있다: 악성 신생물; 암종; 분화되지 않은 암종; 거대 및 방추상 세포 암종(giant and spindle cell carcinoma); 소 세포 암종; 유두 암종; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종(pilomatrix carcinoma); 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma); 유상 변천 세포 암종(papillary transitional cell carcinoma); 선암종; 악성 가스트린종(gastrinoma); 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 소주 선암종(trabecular adenocarcinoma); 샘낭암종; 선종 폴립에서의 선암종; 선암종, 가족성폴립증; 고형 암종(solid carcinoma); 악성, 유암종(carcinoid tumor); 기관지-폐포 선암종(branchiolo-alveolar adenocarcinoma); 유두모양샘 암종; 염색소 암종; 호산세포 암종(acidophil cardinoma); 호산성 세포 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성세포 암종(basophil carcinoma); 투명 세포 선암종(clear cell adenocarcinoma); 과립상 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종(papillary and follicular adenocarcinoma); 비 캡슐화 경화성 암종(non encapsulating sclerosing carcinoma); 부신 외피 암종; 상피성 암종; 피부 부속기관 암종(skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지선 선암종(sebaceous adenocarcinoma); 귀지샘 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막표피모양 암종; 낭샘암종; 유두성 낭샘암종; 유두모양의 장액성 낭샘암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭샘암종(mucinous cystadenocarcinoma); 점액성 선암종(mucinous adenocarcinoma); 반지세포암종(signet ring cell carcinoma); 침윤성 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 속질 암종(medullary carcinoma); 소엽 암종; 염증성 암종; 유선의 페제트병(paget's disease); 샘꼬리세포암종; 선편평세포암종; 편평상피화생이 있는 선암종(adenocarcinoma w/squamous metaplasia); 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립층 세포 종양; 및 악성 모세포종(roblastoma, malignant); 세르톨리 세포 암종(Sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor); 악성 지질 세포 종양; 악성 곁신경절종; 악성, 유방외 곁신경절종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종; 글로만지오사코마(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 멜라닌 결핍 흑생종; 얕은 확산 흑색종(superficial spreading melanoma); 거대 색소 모반내 악성 흑색종; 상피 세포 흑색종; 악성 청색모반; 육종; 섬유 육종; 악성 섬유조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형횡문근육종; 꽈리 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양(mixed tumor, malignant); 혼합된 뮬레 종양(mullerian mixed tumor); 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종; 악성 블레너종양(brennertumor, malignant); 악성 엽상종양(phyllodestumor, malignant); 활막육종; 악성 중피종; 난소고환증; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막 암종; 악성 중간콩팥종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽연골육종; 골의 거대 세포 종양; 유윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치성 종양(odontogenic tumor, malignant); 사기질모세포치아 육종(ameloblasticodontosarcoma); 악성 법랑모세포종; 사지질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종; 별아교세포종; 원형질성 별아교세포종(protoplasmic astrocytoma); 원섬유성 별아교세포종(fibrillary astrocytoma); 성모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 희소돌기아교모세포종; 원시신경외배엽종양; 대뇌 육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환(Hodgkin's disease); 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 파라육아종(paragranuloma); 소형 림프구성 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 거대 세포, 확산성, 악성 림프종; 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종; 기타 구체화된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; masT 세포 육종; 면역증식성 소장 질환(immunoproliferative small intestinal disease); 백혈병; 림프성 백혈병; 혈장세포성백혈병(plasma cell leukemia); 적백혈병; 림프육종세포백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성백혈병; 단구성백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구성 백혈병(megakaryoblasticleukemia); 골수성 육종; 및 털세포백혈병(hairy cell leukemia).
일부 구현예에서, 대상체는 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 중추신경계 암, 유방암, 캐슬맨 질환 경부암(Castleman disease cervical cancer), 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 담낭암, 위장 유암종양, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 카포시 육종, 신장암, 후두 및 하인두암, 간암, 폐암, 중피종, 형질구종, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경아세포종, 구강 및 구강인두암, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체암, 전립샘암, 망막아세포종, 횡문근육종, 침샘암, 피부암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상샘암, 질암, 외음부암, 및 자궁암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암으로 고생한다.
일 구현예에서, 암은 간암이다.
일 구현예에서, 암은 간암종이다.
일 구현예에서, 암은 난소암이다.
일 구현예에서, 암은 신경교종이다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유리하거나 바람직한 결과를 수득하기 위한 시도이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 의도된 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 질환으로부터 생성되는 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화(예컨대, 질환의 악화를 방지하거나 지연시킴), 질환의 확산의 방지 또는 지연, 질환의 재발의 방지 또는 지연, 질환의 진행의 지연 또는 지체, 질환 상태의 완화, 질환의 차도(부분적으로 또는 전체적으로)의 제공, 질환을 치료하는데 요구되는 하나 이상의 다른 의약의 용량의 감소, 질환의 진행의 지연, 삶의 질의 상승, 및/또는 생존 연장. 용어 "치료"는 예방학적 치료를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "방지하다"는 제공된 상태를 획득하거나 진행될 위험에 있어서의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CLEC-1"은 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 특히 포유동물 종(mammal species)으로부터의 C-형 렉틴-유사 수용체-1, 보다 특히 사람 CLEC-1을 지칭한다. CLEC-1은 CLEC-2, DECTIN-1, CLEC-9A, MICL, MAH 및 LOX-1을 포함하는 C형-렉틴 유사 수용체(CTLR)의 DECTIN-1 집단에 속한다.
바람직하게는, 용어 "사람 CLEC-1"은 Q8NC01 Uniprot 수탁 번호에 의해 언급되고 51267 NCBI 수탁 번호에 의해 언급된 CLEC1A 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열의 단백질을 지칭한다.
특히, CLEC-1 길항제는 사람 CLEC-1의 길항제이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CLEC-1 길항제"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 CLEC-1의 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나, 감소시키는 천연 또는 합성의, 임의의 화합물을 지칭한다. 특히, CLEC-1 길항제는 수용체 CLEC-1과 이의 리간드 중 적어도 하나, 보다 특히 및 이의 리간드 모두 사이의 상호작용을 억제한다. 보다 특히, CLEC-1 길항제는 수용체 CLEC-1 또는 이의 리간드 중 임의의 하나에 결합할 수 있다. CLEC-1 길항제는 T 세포 반응을 향상시키며, 특히 IFN감마와 같이 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 합성을 향상시킨다.
예를 들면, CLEC-1 길항제는:
a) 이들의 표면 위에 CLEC-1을 발현하는 다수의 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포를 후보물 화합물과 함께 항온처리하는 단계;
c) 상기 후보물 화합물이 CLEC-1에 결합하여 이의 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나 감소시키는지, 및 특히 상기 후보물이 T 세포 반응을 촉진하는지를 측정하는 단계; 및
d) CLEC-1에 결합하여 이의 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나 감소시키고 특히 T 세포 반응을 촉진시키는 후보물 화합물을 선택하는 단계로 이루어진 단계를 포함하는 방법에 의해 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, CLEC-1 길항제는 작은 유기 분자이다. 용어 "작은 유기 분자"는 약제에 일반적으로 사용된 유기 분자에 비교가능한 크기의 분자를 지칭한다. 이러한 용어는 생물학적 거대분자(예컨대, 단백질, 핵산 등)를 배제한다. 바람직한 소 유기 분자는 크기가 약 5000 Da 이하, 보다 특히 2000 Da 이하, 및 가장 특히 약 1000 Da 이하이다.
일부 구현예에서, CLEC-1 길항제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, CLEC-1 길항제는 CLEC-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은 적어도 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M 이상의 친화성으로 항원에 결합하고/하거나 비특이적인 항원에 대한 이의 친화성보다 적어도 2배 이상 큰 친화성으로 표적에 결합하는 항원 수용체의 능력을 지칭한다. 친화성은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 다양한 방법에 의해 측정할 수 있다. 이러한 방법은 비아코어 분석(Biacore Analysis), 블리츠 분석(Blitz Analysis) 및 스캐챠드 플롯(Scatchard plot)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바이오센서 분석에 의해, 특히 비아코어 분석에 의해 측정될 수 있는 바와 같이, CLEC-1, 특히 사람 CLEC-1에 대해 KD 값이 10-8 M 이하, 바람직하게는 10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 1.10-10 M 이하이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 CLEC-1의 길항제, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC-1, 특히 사람 CLEC-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서, 사람 CLEC-1의 세포외 도메인의 아미노산 서열은
(서열 번호:1)이다.
일 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1의 길항제, 특히 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 인식된 아미노산 서열은 CERRAGMVKPESLHVPPETLGEGD (서열 번호: 2)이다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체"는 천연적으로 발생하는 및 비-천연적으로 발생하는 항체 둘 다를 포함한다. 구체적으로, "항체"는 폴리클로날, 모노클로날, 재조합체(키메라 및 사람화된 포함), 이특이적, 다특이적 및 변형된 항체뿐만 아니라 이의 1가 및 2가 항원-결합 단편도 포함한다. 또한, "항체"는 키메라 항체, 전체적으로 합성인 항체, 단일쇄 항체, 및 이의 단편을 포함한다. 항체는 사람 또는 비사람(nonhuman) 항체일 수 있다. 비사람 항체는 재조합 방법으로 사람화시켜 사람에서 이의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "변형된(modified) 항체"는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 분자에 상응하며, 여기서 상기 항체 또는 이의 단편은 기능적으로 상이한 분자와 연관된다.
본원에 기술된 항체 또는 이의 부분(portion)의 일 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체는 완전한 사람 모노클로날 항체이다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체는 사람화된 항체이다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 경쇄를 포함한다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 중쇄를 포함한다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 Fab 부분을 포함한다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 F(ab')2 부분을 포함한다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 Fc 부분을 포함한다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 aFv 부분을 포함한다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 가변 도메인을 포함한다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 부분의 일 구현예에서, 항체의 부분은 항체의 하나 이상의 CDR 도메인(domain)을 포함한다.
항체는 통상의 방법론에 따라 제조된다. 모노클로날 항체는 코흘러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 방법(Nature, 256:495, 1975)을 사용하여 생성시킬 수 있다. 본 발명에 유용한 모노클로날 항체를 제조하기 위하여, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물을 적합한 간격(예컨대, 주당 2회, 매주, 1개월당 2회 또는 매달)에서 CLEC-1의 항원성 형태로 면역화한다. 동물에게는 희생시키기 1주 내에 항체의 최종 "부스트(boost)"를 투여할 수 있다. 면역화 동안에 면역원성 보조제를 사용하는 것이 흔히 바람직하다. 적합한 면역원성 보조제는 프루언트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant), 프루언트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant), 명반, 리비 보조제(Ribi adjuvant), 헌터스 타이터막스(Hunter's Titermax), QS21 또는 Quil A와 같은 사포닌 보조제, 또는 CpG-함유 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 적합한 보조제는 이러한 분야에 잘 알려져 있다. 동물은 피하, 복막내, 근육내, 정맥내, 비강내 또는 다른 경로에 의해 면역화시킬 수 있다. 제공된 동물은 다수 형태의 항원을 사용하여 다수의 경로로 면역화할 수 있다. 요약하면, 재조합 CLEC-1은 재조합 세포주를 사용한 발현에 의해 제공될 수 있다. 특히, CLEC-1은 이들의 표면에 CLEC-1을 발현하는 사람 세포의 형태로 제공될 수 있다. 면역화 요법 후, 림프구를 비장, 림프절 또는 동물의 다른 기관으로부터 단리하여 폴리에틸렌 글리콜과 같은 제제를 사용하여 적합한 흑색종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 형성시킨다. 융합 후, 세포를 하이브리도마의 성장을 위해 허용되지만 융합 파트너를 위한 것이 아닌 배지에 (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996)에 기술된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 둔다. 하이브리도마의 배양 후, 세포 상층액을 즉, 항원에 특이적으로 결합하는, 목적한 특이성을 갖는 항체의 존재에 대해, 분석한다. 적합한 분석 기술은 ELISA, 유동 세포분석법, 면역침전, 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 포함한다. 다른 스크리닝 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 바람직한 기술은 비-변성 ELISA, 유동 세포분석법, 및 면역침전과 같이, 구조적으로 완전한, 천연적으로 폴딩된 항원에 대한 항체의 결합을 확인하는 것들이다.
일 구현예에서, CLEC-1의 길항제는 키메라 항체, 사람화된 항체 및 완전한 사람 모노클로날 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체, 특히 키메라 마우스/사람 항체이다. 본 발명에 따라서, 용어 "키메라 항체"는 비-사람 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인 및 사람 항체의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.
일부 구현예에서, 항체는 사람화된 항체, 특히 사람화된 모노클로날 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은, "사람화된"은 이의 단백질 서열이 사람에서 천연적으로 생산된 항체 변이체에 대해 이들의 동일성을 증가시키도록 변형된 비-사람 종으로부터 생성된 항체를 기술한다. 따라서 동물, 특히 설치류 및 특히 랫트(rat)에서 원래 수득된 다음, 동물의 면역화 및 항체, 특히 하이브리도마로부터 모노클로날 항체의 생산 후, 항체를 이후 골격 내에서 및 임의로 또한 CDR 서열내에서 아미노산 잔기의 치환에 의해 이들의 VH 및/또는 VL 서열 내에서 변형시켜 사람화된 항체를 수득한다. 특히, 상기 사람화된 항체는 원래의 CDR 영역과 관련하여 개별적으로 고려된 CDR 영역 내에서 10% 미만의 돌연변이된 아미노산 잔기를 가지며, 바람직하게는 1개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 가지거나 가지지 않는다. 사람화 방법은 미국 특허 제4,816,567호, 제5,225,539호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호 및 제5,859,205호에 기술된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 항체는 완전한 사람 항체, 특히 완전한 사람 모노클로날 항체이다. 완전한 사람 모노클로날 항체는 또한 사람 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자자리(loci)의 거대 부분에 대해 유전자이식된 마우스를 면역화시켜 제조할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,591,669호, 제5,598,369호, 제5,545,806호, 제5,545,807호, 제6,150,584호, 및 이에 인용된 참고문헌을 참고하며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 이들 동물은 유전적으로 변형됨으로서 내인성(예컨대, 쥐) 항체의 생산시 기능성 결실이 존재하도록 한다. 동물은 추가로 변형시켜 사람 배선(germ-line) 면역글로불린 유전자 유전자자리 모두 또는 일부를 함유하도록 함으로써 이러한 동물의 면역화는 목적한 항원에 대한 완전한 사람 항체의 생산을 야기할 것이다. 이러한 마우스(예컨대, XenoMouse(Abgenix), HuMAb 마우스(Medarex/GenPharm))의 면역화에 이어서, 모노클로날 항체를 표준 하이브리도마 기술에 따라 제조할 수 있다. 이러한 모노클로날 항체는 사람 면역글로불린 아미노산 서열을 가질 것이므로 사람에게 투여되는 경우 사람 항-마우스 항체(KAMA) 반응을 유발할 것이다. 시험관내 방법은 또한 사람 항체를 생산하기 위해 존재한다. 이는 파아지 디스플레이 기술(미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호) 및 사람 B 세포의 시험관내 자극(미국 특허 제5,229,275호 및 제5,567,610호)를 포함한다. 이들 특허의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
다양한 항체 분자 및 단편은 IgA, 분비성 IgA, IgE, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 한정되지 않는, 일반적으로 공지된 면역글로불린 부류 중 어느 것으로부터도 기원할 수 있다. IgG 소부류는 또한 당해 분야의 기술자에게 알려져 있으며 사람 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 단일 도메인 항체이다. 용어 "단일 도메인 항체"(sdAb) 또는 "VHH"는 천연적으로 경쇄를 결여하고 있는 낙타과 포유동물에서 발견될 수 있는 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인을 지칭한다. 이러한 VHH는 또한 "nanobody®"로 불린다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성을 매개하지 않으므로 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유도하는 Fc 부분을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 직접 또는 간접적으로 CLEC-1을 발현하는 세포의 고갈을 유도하지 않는다(예컨대, CLEC-1을 발현하는 세포의 수에 있어서 10%, 20%, 50%, 60% 이상의 제거 또는 감소를 유도하지 않는다). 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 Fc 도메인을 결여하고 있거나(예컨대, CH2 및/또는 CH3 도메인을 결여하고 있다) IgG2 또는 IgG4 동형의 Fc 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 세포-매개된 반응을 지칭하며, 여기서 비-특이적인 세포독성 세포(예컨대, 천연 킬러(NK) 세포, 호중구, 및 대식구)는 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 분해를 유발하지 않는다. 임의의 특수한 작용 메카니즘에 한정되는 것을 원하지 않지만, ADCC를 매개하는 이러한 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다.
CLEC-1을 발현하는 세포와 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "고갈하는"은 사멸시키거나, 제거하거나, 용해하거나, 이러한 사멸, 제거 또는 분해를 유도함으로써, 샘플 또는 대상체내에 존재하는 CLEC-1을 발현하는 세포의 수에 부정적으로 영향을 미치는 공정, 방법, 또는 화합물을 의미한다.
일 구현예에서, CLEC-1 길항제는 항원-결합 항체 모방체(mimetic)이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원-결합 항체 모방체"는 항체의 능력을 모방하는 항원에 결합할 수 있는 능력을 지닌 인공 단백질, 펩타이드 및 임의의 화학적 화합물을 지칭한다.
이러한 모방체는 아피딘(affitin) 및 안티칼린(anticalin)뿐만 아니라 압타머(펩타이드 압타머(aptamer) 및 올리고뉴클레오타이드 압타머)를 포함한다.
일 구현예에서, CLEC-1 길항제는 압타머이다. 압타머는 분자 인식의 측면에서 항체에 대해 대안을 나타내는 분자의 부류이다. 압타머는 고 친화성 및 특이성을 지닌 표적 분자의 임의의 부류를 실질적으로 인식하는 능력을 지닌 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고펩타이드 서열이다. 이러한 리간드는 무작위 서열 라이브러리의 대수적 농축에 의한 리간드의 전신계적 진화(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment: SELEX)에 의해 단리할 수 있다. 무작위 서열 라이브러리는 DNA의 조합적 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 이러한 라이브러리에서, 각각의 구성원은 유일한 서열의, 궁극적으로 화학적으로 변형된 선형 올리고머이다. 펩타이드 압타머는 2개의 하이브리드 방법에 의해 조합 라이브러리로부터 선택되는 이. 콜라이(E. coli) 티오레독신 A와 같은 플랫포옴 단백질에 의해 나타난 구조적으로 구속된 항체 가변 영역으로 이루어진다.
일부 구현예에서, CLEC-1 길항제는 폴리펩타이드이다.
용어 "폴리펩타이드"는 본원에서 특이적인 길이를 갖는 아미노산의 중합체를 의미한다. 따라서, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질은 "폴리펩타이드"의 정의에 포함되며 이들 용어는 명세서 전체뿐만 아니라 청구범위에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "폴리펩타이드"는 포스포릴화, 아세틸화, 글리코실화 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 해독 후 변형을 배제하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2 내지 200개 아미노산을 포함한 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 2 내지 190개, 특히 10 내지 180개, 10 내지 170개, 10 내지 160개, 10 내지 150개, 10 내지 140개, 10 내지 130개, 10 내지 120개, 10 내지 110개 아미노산을 포함하는 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 10 내지 100개의 아미노산을 포함하는 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 50 내지 100개 아미노산을 포함하는 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 아미노산의 길이를 갖는다.
특수한 구현예에서, 폴리펩타이드는 CLEC-1의 기능성 등가물이다. 본원에 사용된 바와 같은, CLEC-1의 "기능성 등가물"은 적어도 하나의 CLEC-1 리간드에 결합함으로써 CLEC-1과 이의 상호작용을 방지할 수 있는 화합물이다. 용어 "기능성 등가물"은 CLEC-1의 단편, 돌연변이체, 및 뮤테인(mutein)을 포함한다. 용어 "기능적으로 등가인"은 따라서 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 결실, 치환 또는 첨가에 의해 아미노산 서열을 변경시킴으로써, 단백질 유사체가 이의 리간드에 결합하는 능력을 보유하도록 하여 수득된 CLEC-1의 임의의 등가물을 포함한다. 아미노산 치환은 예를 들면, 아미노산 서열을 암호화하는 DNA의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 이루어질 수 있다.
기능적 등가물은 CLEC-1의 리간드에 결합하고 CLEC-1의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함함으로써 CLEC-1의 리간드를 트랩핑(trapping)할 수 있는 가용성 수용체를 형성하는 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 기능적 등가물은 CLEC-1의 가용성 형태를 포함한다. 이러한 단백질, 또는 이의 기능적 등가물의 적합한 가용성 형태는 예를 들면, 이로부터 전이막 도메인이 화학적, 단백질분해적 또는 재조합 방법에 의해 제거된 단백질의 절단된(truncated) 형태를 포함할 수 있다. 특히, 기능적 등가물은 상응하는 단백질의 전체 길이에 걸쳐 상응하는 단백질과 적어도 80% 동일성(identity), 보다 특히 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 및 심지어 보다 특히 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상응하는 단백질"은 이에 대해 본 발명의 기능성 등가물이 유사한 기능을 갖는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 제시에서 참고가 이루어진 동일성의 퍼센트는 비교될 서열의 전반적인 정렬을 기반으로, 다시 말해서, 예를 들면, Needleman and Wunsch 1970의 알고리즘을 사용하여, 이들의 전체 길이에 걸쳐 서열의 정렬을 기반으로 측정된다. 이러한 서열 비교는 예를 들면, 10.0과 동일한 매개변수 "갭 오픈(Gap open)", 0.5와 동일한 매개변수 "갭 연장(Gap Extend)", 및 매트릭스 "BLOSUM 62"를 사용함으로써 니이들(needle) 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. needle과 같은 소프트웨어는 website ebi.ac.uk worldwide 하에서 명칭 "니이들" 하에 이용가능하다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "기능적으로 등가인 단편"은 또한 CLEC-1의 리간드에 결합하는 CLEC-1의 임의의 단편 또는 단편의 조립체(assembly)를 의미할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CLEC-1의 적어도 하나의 리간드에 대해 CLEC-1의 결합을 억제할 수 있는, 폴리펩타이드, 특히 기능적 등가물을 제공하며, 이러한 폴리펩타이드는 CLEC-1의 세포외 도메인의 적어도 일부의 서열에 상응하는 서열을 갖는 연속된 아미노산을 포함하고, 이러한 부분은 CLEC-1의 리간드에 결합한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드, 특히 기능적 등가물은 CLEC-1의 세포외 도메인에 상응한다.
일부 구현예에서, CLEC-1의 기능적 등가물은 이종 폴리펩타이드에 결합하여 융합 단백질을 형성한다. 본원에 사용된 바와 같은, "융합 단백질"은 이종 폴리펩타이드(즉, 동일한 폴리펩타이드 외의 다른 폴리펩타이드)에 작동적으로 연결된 본 발명의 기능적 등가물 모두 또는 일부(전형적으로 생물학적으로 활성인)를 포함한다. 융합 단백질 내에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 본 발명의 기능적 등가물 및 이종 폴리펩타이드가 서로에 대해 프레임내(in-frame)에서 융합되어 있음을 나타내기 위해 의도된다. 이종 폴리펩타이드는 본 발명의 기능적 등가물의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, CLEC-1의 기능적 등가물을 면역글로불린 불변 도메인(constant domain)(Fc 영역)에 융합시켜 면역접합체(immunoadhesin)를 형성한다. 면역접합체는 사람 항체의 많은 가치있는 화학적 및 생물학적 특성을 지닐 수 있다. 면역접합체는 적절한 사람 면역글로불린 힌지(hinge) 및 불변 도메인(Fc) 서열에 연결된 바람직한 특이성을 지닌 사람 단백질 서열로부터 작제될 수 있으므로, 목적한 결합 특이성은 전체적으로 사람 성분을 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 면역접합체는 환자에 대해 최소한으로 면역원성이며, 만성 또는 반복된 사용에 안전하다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 천연의 서열 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 여전히 다른 구현예에서, Fc 영역은 기능성 Fc 영역이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Fc 영역"은 천연의 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계부가 변할 수 있지만, 사람 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터, 이의 카복시-말단까지의 길이로 정의된다. 면역접합체의 부착 부분 및 면역글로불린 서열 부분은 최소의 링커에 의해 연결될 수 있다. 면역글로불린 서열은 전형적으로 면역글로불린 불변 도메인이지만, 필수적이지는 않다. 본 발명의 키메라에서 면역글로불린 모이어티(moiety)는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM로부터 수득될 수 있으나, 전형적으로 IgG1 또는 IgG4이다. 일부 구현예에서, CLEC-1의 기능적 등가물 및 면역접합체의 면역글로불린 서열 부분은 최소의 링커에 의해 연결된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "링커"는 본 발명의 폴리펩타이드와 면역글로불린 서열 부분을 연결하는 적어도 하나의 아미노산의 서열을 지칭한다. 이러한 링커는 입체 장애를 방지하는데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30개의 아미노산 잔기를 갖는다. 그러나, 상한치는 중요하지 않지만, 예컨대, 이러한 폴리펩타이드의 생물약제 생산과 관련하여 편의성의 이유로 선택된다. 링커 서열은 천연적으로 발생하는 서열이거나 비-천연적으로 발생하는 서열일 수 있다. 치료학적 목적을 위해 사용되는 경우, 링커는 전형적으로 면역접합체가 투여되는 대상체에서 비-면역원성이다. 링커 서열의 하나의 유용한 그룹은 제WO 96/34103호 및 제WO 94/04678호에 기술된 바와 같은 중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 기원한 링커이다. 다른 예는 폴리-알라닌 링커 서열이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 당해 분야의 기술자에게 명백할 바와 같이, 임의의 적합한 수단에 의해 생산될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 충분한 양의 폴리펩타이드를 생산하기 위하여, 발현은 편리하게는 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 달성할 수 있다. 특히, 폴리펩타이드는 재조합 수단, 암호화된 핵산 분자로부터의 발현에 의해 생산된다. 다양한 상이한 숙주 세포내에서 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템을 잘 알려져 있다. 재조합 형태로 발현되는 경우, 폴리펩타이드는 특히 숙주 세포내에서 암호화하는 핵산으로부터의 발현에 의해 생성된다. 임의의 숙주 세포도 특수한 시스템의 개개 요건에 따라, 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩타이드의 발현을 위해 당해 분야에서 이용가능한 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell), HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 세포 및 많은 다른 것들을 포함한다. 세균이 또한 이를 사용하여 세균이 조작되어 성장될 수 있는 용이성으로 인하여, 재조합 단백질의 생산을 위한 바람직한 숙주이다. 일반적인, 바람직한 세균 숙주는 이. 콜라이이다.
본 발명의 폴리펩타이드, 이의 단편 및 본 발명에 따른 융합 단백질은 글리코실화(예컨대, N-연결되거나 O-연결된 글리코실화), 미리스틸화, 팔미틸화, 아세틸화 및 포스포릴화(예컨대, 세린/트레오닌 또는 타이로신)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 해독 후 변형을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료학적 방법에 사용된 폴리펩타이드는 이들의 치료학적 효능을 증진시키기 위해 변형시킬 수 있는 것으로 고려된다. 치료학적 화합물의 이러한 변형은 독성을 감소시키거나, 순환 시간을 증가시키거나, 생물분포를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 잠재적으로 중요한 치료학적 화합물의 독성은 생물분포를 변형시키는 다양한 약물 담체 비히클과 조합시킴으로써 유의적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 국면은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 CLEC-1의 길항제를 투여함을 포함하여, 대상체에서, 특히 T 세포 반응을 촉진시킴으로써, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 따라서, 특히 T 세포 반응을 촉진시킴으로써, 암의 치료시 사용하기 위한 CLEC-1의 길항제에 관한 것이다.
본 발명은 따라서, 특히 T 세포 반응을 촉진시킴으로써, 암의 치료용 의약의 제조를 위한 CLEC-1의 길항제의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여된다.
용어 "투여하다" 또는 "투여"는 점막, 피내, 정맥내, 피하, 근육내, 동맥내 전달 및/또는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 물리적 전달의 임의의 다른 방법에 의해서와 같이, 물질이 신체 외부에 존재하므로(예컨대, 본 발명의 CLEC-1 길항제) 이를 대상체 내로 주사하거나 기타의 경우에는 물리적으로 전달하는 작용을 지칭한다. 질환, 또는 이의 증상이 치료되는 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발생 후에 발생한다. 질환 또는 이의 증상이 방지되는 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발생 전에 일어난다.
"치료학적 유효량"이라는 용어는 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비(benefit/risk ratio)에서 암의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한 CLEC-1 길항제의 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 1일 투여량은 건전한 의학적 판단의 영역 내에서 주치의에 의해 결정될 것이다. 임의의 특수한 대상체에 대한 특이적인 치료학적 유효 용량 수준은 암의 중증도, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용된 특정 화합물의 배출 속도; 치료 기간; 및 의학 분야에 잘 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 예를 들면, 화합물의 용량을 목적한 치료학적 효과를 달성하는데 요구되는 것보다 더 적은 수준에서 시작하여 목적한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당해 분야의 기술 내에 잘 알려져 있다. 그러나, 생성물의 1일 투여량은 1일당 성인당 0.01 내지 1,000 mg의 광범위한 범위에 걸쳐 변할 수 있다. 전형적으로, 조성물은 치료될 대상체에게 증상 조절을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg의 활성 성분의 용량을 함유한다. 의약은 전형적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분, 전형적으로 1 mg 내지 약 100 mg의 활성 성분을 함유한다. 약물의 유효량은 1일당 0.0002 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 체중, 특히 1일당 약 0.001 mg/kg 내지 7 mg/kg의 체중의 용량 수준에서 일반적으로 공급된다.
본 발명에 따른 조성물은 비경구, 경피, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소 또는 비강 투여용으로 제형화된다.
적합한 단위 투여형은 정제, 겔제, 캅셀제, 산제, 과립제 및 경구 현탁제 또는 액제와 같은 경구-경로형, 설하 및 볼내 투여형, 에어로졸, 임플란트, 피하, 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하, 경피, 척추강내 및 비강내 투여형 및 직장 투여형을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물, 특히 약제학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 약제학적 조성물은 주사될 수 있는 제형을 위해 약제학적으로 허용되는 비히클(vehicle)을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균, 염수 용액(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 무수, 특히 경우에 따라 멸균수 또는 생리학적 염수의 첨가 시 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 동결-건조된 조성물일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다.
전형적으로, 본 발명의 활성 성분(즉, CLEC-1 길항제)은 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 임의로 생분해성 중합체와 같은, 임의로 서방출 매트릭스와 함께 조합되어 약제학적 조성물을 형성한다.
용어 "약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용되는"은 적절하게는 포유동물, 특히 사람에게 투여하는 경우, 부작용, 알레르기 반응 또는 다른 부적당한 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다.
약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 무-독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 지칭한다. 담체는 또한 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산 매질, 이의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산제의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 표면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항세균 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 생성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 일스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 조성물 속에서 사용함으로써 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 제2의 활성 성분과 함께 대상체에게 투여된다.
상기 제2의 활성 성분은 하기 기술된 바와 같은 프로바이오틱 및 치료제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 따라서, CLEC-1의 길항제와 암의 치료시 사용하기 위한 제2의 활성 성분의 조합물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 대상체에게 표준(통상의) 치료와 함께 투여된다. 본 발명은 따라서 CLEC-1의 길항제와 암의 치료시 사용하기 위한 통상의 치료와의 조합에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "표준 또는 통상의 치료"는 암을 앓는 대상체에게 일반적으로 투여된 암의 임의의 치료(약물, 방사선치료요법 등)을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 대상체에게 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께, 예컨대, 암을 치료하기 위해 투여된다. 이러한 투여는 동시에, 별도로 또는 연속적일 수 있다. 동시 투여의 경우, 제제는 경우에 따라, 하나의 조성물로서 또는 별도의 조성물로서 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 전형적으로 치료될 장애와 관련된다. 예시적인 치료제는 다른 항암 항체, 세포독성제, 화학치료제, 항-혈관형성제, 항암 면역원, 세포 주기 제어/세포자멸사 조절제, 호르몬 조절제, 및 하기 기술된 다른 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 화학치료제, 표적화된 암 치료요법, 면역치료제 또는 방사선치료요법과 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 화학치료제와 함께 사용된다. 본 발명은 따라서 CLEC-1의 길항제와 암의 치료시 사용하기 위한 화학치료제의 조합에 관한 것이다.
용어 "화학치료제"는 종양 성장을 억제하는데 효과적인 화학적 화합물에 관한 것이다. 화학치료제의 예는 티오테파 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카브로쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오라르니드 (triethylenethiophosphaorarnide) 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 카른프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 트립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라누스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로소우레아; 에네디인 항생제(예컨대, 칼리체아미신, 특히 칼리체아미신(11 및 칼리체아미신 211, 참고: 예를 들면, Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 에스테라미신; 및 네오카르지노시타틴 크로모포레 및 관련된 크로모프로테인에디이네안티오바이오틱크로모포레), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 칸니노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이단르비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙톰그린(streptomgrin), 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 티메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 푸린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카므모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테스이미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파르니드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이타신 및 안사미토신과 같은 마이타시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토 스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로겐나늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아르닌(trichlorotriethylarnine); 트리초테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브롬톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비토시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 톡소이드, 예컨대, 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스턴 소재)및 독세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 카펙시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤(Farestone))을 포함하는 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드, 및 고세렐린과 같은 항-에스트로겐; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같이 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬 제제가 또한 이러한 정의에 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 표적화된 암 치료요법과 함께 사용된다. 본 발명은 따라서 CLEC-1의 길항제와 암의 치료에 사용하기 위한 표적화된 치료요법의 조합에 관한 것이다.
표적화된 암 치료요법은 암의 성장, 진행, 및 확산에 관여하는 특이적인 분자("분자 표적")를 방해함으로써 암의 성장 및 확산을 차단하는 약물 또는 다른 물질이다. 표적화된 암 치료요법은 때때로 "분자 표적화된 약물", "분자 표적화된 치료요법", "정밀 의약", 또는 유사한 명칭으로 불린다. 일부 구현예에서, 표적화된 치료요법은 대상체에게 타이로신 키나제 억제제를 투여하는 것으로 이루어진다. 용어 "타이로신 키나제 억제제"는 수용체 및/또는 비-수용체 타이로신 키나제의 선택적이거나 비-선택적인 억제제로서 작용하는 다양한 치료제 중 어느 것을 지칭한다. 타이로신 키나제 억제제 및 관련 화합물은 당해 분야에 잘 알려져 있고 미국 특허 공보 제2007/0254295호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 이의 전문이 참고로 포함된다. 타이로신 키나제 억제제와 관련된 화합물은 타이로신 키나제 억제제의 효과를 개괄할 것으로, 예컨대, 관련된 화합물은 타이로신 키나제 신호전달 경로의 상이한 구성원에서 작용하여 이러한 타이로신 키나제의 타이로신 키나제 억제제와 동일한 효과를 생산할 것임이 당해 분야의 숙련가에게 익술할 것이다. 본 발명의 구현예의 방법에서 사용하기에 적합한 타이로신 키나제 억제제 및 관련 화합물은 다사티닙(BMS-354825), PP2, BEZ235, 사라카티닙, 게피티닙(이레싸), 수니티닙(수텐트; SU11248), 에를로티닙(타르세바; OSI-1774), 라파티닙(GW572016; GW2016), 카네르티닙(CI 1033), 세막시닙(SU5416), 바탈라닙(PTK787/ZK222584), 소라페닙(BAY 43-9006), 이마티닙(글리벡; STI571), 레플루노마이드(SU101), 반데타닙(작티마; ZD6474), 이의 MK-2206 (8-[4-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 하이드로클로라이드) 유도체, 이의 유사체 및 이의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 추가의 타이로신 키나제 억제제 및 관련 화합물은 예를 들면, 미국 특허 공보 제2007/0254295호, 미국 특허 제5,618,829호, 제5,639,757호, 제5,728,868호, 제5,804,396호, 제6,100,254호, 제6,127,374호, 제6,245,759호, 제6,306,874호, 제6,313,138호, 제6,316,444호, 제6,329,380호, 제6,344,459호, 제6,420,382호, 제6,479,512호, 제6,498,165호, 제6,544,988호, 제6,562,818호, 제6,586,423호, 제6,586,424호, 제6,740,665호, 제6,794,393호, 제6,875,767호, 제6,927,293호, 및 제6,958,340호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 본원에 이의 전문이 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 타이로신 키나제 억제제는 경구 투여되고 적어도 하나의 제I상 임상 시험, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 제II상 임상 시험, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 하나의 제III상 임상 시험에 적용되고, 가장 바람직하게는 적어도 하나의 혈액학적 또는 종양학적 처방을 위해 FDA에 의해 승인된 소 분자 키나제 억제제이다. 이러한 억제제의 예는 게피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 카네르티닙, BMS-599626(AC-480), 네라티닙, KRN-633, CEP-11981, 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙, AZM-475271, CP-724714, TAK-165, 수니티닙, 바탈라닙, CP-547632, 반데타닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 탄두티닙, 미도스타우린, 엔자스타우린, AEE-788, 파조파닙, 악시티닙, 모타세닙, OSI-930, 세디라닙, KRN-951, 도비티닙, 셀리시클립, SNS-032, PD-0332991, MKC-I(Ro-317453; R-440), 소라페닙, ABT-869, 브리바닙(BMS-582664), SU-14813, 텔라티닙, SU-6668, (TSU-68), L-21649, MLN-8054, AEW-541, 및 PD-0325901을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 면역치료제와 함께 사용된다. 본 발명은 따라서, CLEC-1의 길항제와 암의 치료에 사용하기 위한 면역치료제의 조합물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역치료제"는 암 세포에 대해 신체의 면역 반응을 간접적으로 또는 직접적으로 향상시키거나, 자극하거나 증가시키고/시키거나 다른 항암 치료요법의 부작용을 감소시키는 화합물, 조성물 또는 치료에 관한 것이다. 면역치료요법은 따라서 암 세포에 대한 면역계의 반응을 직접 또는 간접적으로 자극하거나 향상시키고/시키거나 다른 항암제에 의해 유발되었을 수 있는 부작용을 감소시키는 치료요법이다. 면역치료요법은 또한 면역학적 치료요법, 생물학적 치료요법, 생물학적 반응 개질제 치료요법 및 생물치료요법으로서 당해 분야에서 언급된다. 당해 분야에 공지된 일반적인 면역치료요법의 예는 사이토킨, 암 백신, 모노클로날 항체 및 비-사이토킨 보조제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 면역치료학적 치료는 대상체에게 면역 세포(T 세포, NK 세포, 수지 세포, B 세포...)를 투여하는 것으로 이루어질 수 있다. 면역치료제는 비특이적일 수 있는데, 즉, 면역계를 일반적으로 증강시킴으로써 사람 신체가 암 세포의 성장 및/또는 확산과 싸우는데 보다 효과적으로 되도록 하거나, 이들이 특이적일 수 있는데, 즉, 암 세포 자체에 대해 표적화될 수 있다. 면역치료요법 섭생(regimen)은 비-특이적인 및 특이적인 면역치료제의 사용과 조합될 수 있다. 비-특이적인 면역치료제는 면역계를 자극하거나 간접적으로 증진시키는 물질이다. 비-특이적인 면역치료제는 암의 치료를 위한 주요 치료요법으로서 단독으로 뿐만 아니라 주요 치료요법에 대해 부가적으로 사용되어져 왔으며, 여기서 비-특이적인 면역치료제는 보조제로서 기능하여 다른 치료요법(예컨대, 암 백신)의 효능을 향상시킨다. 비-특이적인 면역치료제는 또한 이후의 내용에서 다른 치료요법의 부작용, 예를 들면, 특정의 화학치료제에 의해 유도된 골수 억제를 감소시키기 위해 기능할 수 있다. 비-특이적인 면역치료제는 주요 면역계 세포에서 작용하고 사이토킨 및 면역글로불린의 증가된 생산과 같은 제2 반응을 유발할 수 있다. 대안적으로, 제제 자체는 사이토킨을 포함할 수 있다. 비-특이적인 면역치료제는 일반적으로 사이토킨 또는 비-사이토킨 보조제로서 분류된다. 다수의 사이토킨은 암의 치료요법에서 면역계를 증강시키도록 고안된 비-특이적인 면역치료요법으로서, 또는 다른 치료요법과 함께 제공된 보조제로서의 적용이 발견되었다. 적합한 사이토킨은 인터페론, 인터루킨 및 콜로니-자극 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 의해 고려된 인터페론(IFN)은 IFN의 일반적인 유형, IFN-알파(IFN-α), IFN-베타(IFN-β) 및 IFN-감마(IFN-γ)를 포함한다. IFN은 암세포 상에서 예를 들면, 이들의 성장을 지연시키고/시키거나 보다 일반적인 거동으로 세포내로의 이들의 발달을 촉진하고/하거나 이들의 항원 생산을 증가시킴으로써 암 세포를 면역계가 보다 용이하게 인식하여 파괴하도록 함으로써, 암 세포에서 직접 작용할 수 있다. IFN은 또한 예를 들면, 혈관형성을 지연시키고/시키거나, 면역계를 증강시키고/시키거나 천연 킬러(NK) 세포, T 세포 및 거대세포를 자극함으로써, 암 세포에서 간접적으로 작용할 수 있다. 재조합 IFN-알파는 로페론(Roche Pharmaceuticals) 및 인트론 A(Schering Corporation)로서 상업적으로 이용가능하다. 본 발명에 의해 고려된 인터루킨은 IL-2, IL-4, IL-11 및 IL-12를 포함한다. 상업적으로 이용가능한 재조합 인터루킨의 예는 Proleukin®(IL-2; Chiron Corporation) 및 Neumega®(IL-12; Wyeth Pharmaceuticals)를 포함한다. Zymogenetics, Inc.(워싱톤주 시애틀 소재)는 현재 IL-21의 재조합체 형태를 시험중에 있으며, 이는 또한 본 발명의 조합물에서 사용하도록 고려되고 있다. 본 발명에 의해 고려되는 콜로니-자극 인자(CSF)는 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF 또는 필그라스팀), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF 또는 사르그라모스팀) 및 에리트로포이에틴(에포에틴 알파, 다르베포이에틴)을 포함한다. 하나 이상의 성장 인자를 사용한 치료는 전통적인 화학치료요법 중인 대상체에서 새로운 적혈구 세포의 생성을 자극하는데 도움을 줄 수 있다. 따라서, CSF를 사용한 치료는 화학치료요법과 관련된 부작용을 감소시키는데 도움을 줄 수 있으며 보다 고 용량의 화학치료제가 사용되도록 허용할 수 있다. 다양한-재조합 콜로니 자극 인자, 예를 들면, Neupogen®(G-CSF; Amgen), 네울라스타(펠필그라스팀; Amgen), 류킨(GM-CSF; Berlex), 프로크리트(에리쓰로포이에틴; Ortho Biotech), 에포겐(에리쓰로포이에틴; Amgen), 아르네스프(에리쓰로포이에틴)이 상업적으로 이용가능하다. 본 발명의 조합 조성물 및 조합 치료 방법은 또한 "전체 세포" 및 "적응성" 면역치료요법 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 CC2+ 및/또는 CD8+ T 세포(예를 들면, 종양-특이적인 항원 및/또는 유전적 향상으로 증식된 T 세포)와 같은 면역계 세포(예를 들면, 종양-침윤 림프구(TIL)), 항체 발현 B 세포 또는 다른 항체-생산 또는 -제시 세포, 수지 세포(예컨대, GM-CSF 및/또는 Flt3-L와 같은 DC-확장제와 함께 배양된 수지 세포, 및/또는 종양-관련된 항원-로딩된 수지 세포), 항-종양 NK 세포, 소위 하이브리드 세포, 또는 이의 조합물의 주입 또는 재-주입을 포함할 수 있다. 세포 분해물은 또한 이러한 방법 및 조성물에 유용할 수 있다. 이러한 국면에서 유용할 수 있는 임상 시험에서 세포 "백신"은 CanvaxinTM, APC-8015(Dendreon), HSPPC-96(Antigenics), 및 Melacine® 세포 분해물을 포함한다. 임의로 명반과 같은 보조제와 혼합된, 암 세포로부터 유래된 항원, 및 이의 혼합물(참고: 예를 들면, Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001)은 또한 이러한 방법 및 조합 조성물 속의 성분일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CLEC-1 길항제는 방사선치료요법과 함께 사용된다. 본 발명은 따라서 CLEC-1의 길항제와 암 치료에 사용하기 위한 방사선치료요법의 조합물에 관한 것이다.
방사선치료요법은 환자에게 방사선 또는 방사선약제의 관련된 투여를 포함할 수 있다. 방사선 공급원은 치료되는 환자에 대해 외부 또는 내부일 수 있다(방사선 치료는 예를 들면, 외부 비임 방사선 치료요법(EBRT) 또는 근접치료(brachytherapy: BT)일 수 있다). 이러한 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 방사활성 요소는 예컨대, 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오드-123, 요오드-131, 및 인듐-111을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은:
a) 이들의 표면에 CLEC-1를 발현하는 다수의 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포를 후보물 화합물과 함께 항온처리하는 단계;
c) 상기 후보물 화합물이 CLEC-1에 결합하여 이의 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나 감소시키는지를 측정하고 상기 후보물이 T 세포 반응을 촉진하는지를 측정하는 단계; 및
d) CLEC-1에 결합하여 이의 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나, 감소시키고 T 세포 반응을 촉진시키는 후보물 화합물을 선택하는 단계로 이루어진 단계를 포함하는, CLEC-1 길항제를 스크리닝(screening)하는 방법에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 또한 단계 d)에서 선택된 후보물 화합물을 동물 모델에게 투여함으로써 상기 후보물의 보호 및/또는 치료 효과를 입증하는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로, 이러한 스크리닝 방법은 이들의 표면에 CLEC-1을 발현하는 적절한 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 특히, CLEC-1을 암호화하는 핵산을 사용하여 세포를 감염시킴으로서 본 발명의 수용체를 발현할 수 있다. 이러한 형질감염은 당해 분야에 잘 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 암을 치료하는데 사용된 화합물의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 T 세포 반응을 촉진할 수 있는 CLEC-1 길항제를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1: 사람 기관 및 세포에서 CLEC-1 mRNA 및 단백질의 발현 및 조절
A) CLEC-1 mRNA 발현을 말초 혈액 백혈구(PBL), 호중구(neutro), 단핵구(mono), 단핵구 유도된 수지 세포(moDC), 사람 대동맥 내피 세포(HAEC), T 및 B 세포에서 정량적 RT-PCR에 의해 평가하였다.
B) mAb 항-hCLEC-1을 사용한 사람 혈액 i) CD45+ CD14- CD11c+ HLA-DR고(high) DC, ii) CD45+ CD14+ 단핵구, iii) SSC고 (high) CD16+ 호중구 상에서 및 iiii) HAEC(세포외 및 세포내) 위에서 및 속에서 유동 세포분석법에 의해 평가된 IgG1 동형 또는 CLEC-1 염색(staining)의 대표적인 점(dot) 및 막대 그래프 플롯. CLEC-1의 중첩된 영상을 지닌 막대그래피 플롯은 대조군 동형 IgG1으로 염색된 세포의 막대그래프 플롯과 일치한다.
C) 사람 moDC에서 CLEC-1 발현. i) 자극되지 않은 (US) 세포 및 mAb 항-hCLEC-1을 사용한 물질 및 방법에서 기술된 바와 같은 LPS(TLR4-L), 폴리 I:C(TLR3-L), R848(TLR7-L) 및 TGF-β로 자극된 세포에서 유동 세포분석법에 의해 평가된 세포-표면 CLEC-1(APC) 및 HLA-DR(FITC)를 발현하는 moDC의 %의 대표적인 점 플롯. IgG1 동형은 대조군으로서 수행하였다. ii) 막대그래프는 6개의 독립된 실험에서 CLEC-1 염색의 평균 형광성 강도(MFI) ± SEM을 나타낸다. CLEC-1 MFI 염색의 통계적 분석은 본 발명자와 자극된 세포 사이에서 수행하였다.
도 2: 사람 moDC 성숙( muturation ) 및 하부(downstream) T 세포 활성화를 개시하는 CLEC-1의 효과
A) 단독으로 또는 혈소판-결합된 항-CLEC-1 mAb 또는 IgG1 동형 대조군과 함께 항온처리한 사람 moDC를 교호적으로 LPS(1μg/ml)를 사용하여 24시간 동안 동시 자극시키고, 수거하며 CD80, CD86, CD83 및 HLA-DR을 유동 세포분석법으로 평가하고 B), TNF-α, IL-12p70, IL-6, IL-23 및 IL-10을 ELISA에 의해 상층액 속에서 평가하였다.
C) 이후에, 세포를 세척하고 동종이계의 T 세포 속에서 CFSE 희석에 의해 유동 세포분석법으로 평가하고 IL-17 및 IFN-γ를 상층액 속에서 ELISA로 평가하였다.
도 3: 랫트 BMDC 성숙, 사이토킨 분비 및 T-세포 활성화 특성에 대한 CLEC -1 결핍(CLEC-1 KO 랫트)의 효과.
BMDC를 WT 또는 KO 랫트로부터 '물질 및 방법'란에 기술된 바와 같이 8일 동안 생성시키고, 4일 동안 MLR 속에서 나이브(nave) 랫트로부터의 동종이계 정제된 CD4+ T 세포와 함께 항온처리하였다. i) 유동 세포분석법에 의한 CFSE 희석에 의해 CD4+ T 세포 내에서 평가된 증식의 막대그래프 및 대표적인 염색 및 ii) 유동 세포분석법에 의해 평가된 게이트된 CD4+ T 세포 중에서 IL-17+ 및 IFN-γ+ 세포의 퍼센트의 막대그래프 및 대표적인 도트 플롯. 데이타는 4개의 독립된 실험의 평균 ± SEM으로서 막대그래프로 나타내었다.
도 4: 랫트 BMDC - 매개된 T 세포 활성화에 대한 CLEC -1 Fc 융합 단백질을 사용한 CLEC-1 신호전달 차단의 효과
야생형 랫트로부터의 BMDC를 MLR 속에서 4일 동안 나이브 랫트로부터의 동종이계성의 정제된 CD4+ T 세포와 CLEC-1-Fc 또는 관련되지 않은 hSEAP-Fc 융합 단백질(동일한 조건 하에서 생산되어 정제됨)(10μg/ml)과 함께 항온처리하였다. i) Foxp3+ 및 Foxp3- 세포의 증식을 CD4+ T 세포 내에서 CFSE 희석에 의해 유동 세포분석법으로 평가하였고 ii) IL-17 및 IFN-γ 사이토킨 생산은 ELISA에 의해 MLR의 상층액 속에서 평가하였다. 데이타는 4개의 독립된 실험의 평균 ± SEM으로서 막대그래프로 나타내었다.
도 5: 생체내 (in vivo ) DC- 매개된 CD4+ T-세포 프라이밍(priming) 및 Th 분극화 결말(polarization fate)에 대한 CLEC-1 결핍(CLEC-1 KO 랫트)의 효과.
A) CLEC-1 mRNA 발현을 2차 림프 기관(SLO)으로부터의 랫트 CD103+ CD4-(교차-제시) 및 CD4+(비-교차-제시) 통상의 DC의 상이한 세포 아형에서 정량적 RT-PCR에 의해 평가하였다(n=5, *p<0.05).
B) WT 및 CLEC-1 KO 랫트를 CFA 및 KLH 단백질(100μg/ml)을 사용하여 발바닥에서 피하로 면역화하였다. 면역화 후 10일째에, 슬와부 림프절을 수거하고 KLH 또는 대조군 OVA(25 μg/ml)의 존재하에서 3일 동안 배양하였다. i) CFSE 희석에 의해 평가된 CD4+ T에 있어서의 증식 및 ii) 유동 세포분석법에 의해 평가된 게이트된 CD4+ T 세포 중에서 IL-17+, IL-17+ IFN-γ+ 및 IFN-γ+ 세포의 증식의 막대그래프 및 대표적인 플롯. 데이타는 4개의 독립된 실험의 평균 ± SEM으로서 막대그래프로 나타내었다.
도 6: MLR 활성화( moDCs + Allo T)에 대한 CLEC -1의 잠재적인 갈항제의 효과.
MLR은 고 수준의 CLEC-1을 발현하는 동종이계 단핵구 유도된 수지 세포(5X104)와 혼합된 말초 혈액(5X104)으로부터 단리된 정제된 T 세포로 이루어진다. 동형 대조군(IgG1) 또는 항-사람 CLEC-1 항체를 0.5 내지 10 μg/ml의 용량으로 5일 동안 가하였다. 이후에, T 세포의 증식을 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르 희석에 의해 평가하고 IFN-γ 발현을 T 세포내에서 유동 세포분석법으로 및 상층액 속에서 ELISA로 평가하였다(도 6a, 6b 및 6c, 막대그래프 및 대표적인 플롯).
도 7: 암에서 억제성 체크포인트(checkpoint) CLEC -1(설치류에서 개념의 증명).
a) 설치류(hepa 1.6 간세포암종 종양 세포을 b6 마우스의 간에 간문맥으로 주사하고, Clec1a 발현을 Q-PCR로 평가하였다).
b) CLEC-1 결핍성 설치류는 야생형 동물 마우스보다 종양에 대해 보다 우수하게 투쟁한다; hepa 1.6 간암종 종양 세포를 b6 WT 또는 Clec1a 결핍성 마우스의 간 속에 문맥 내로 주사하고, 데이타를 마우스생존 윌콕슨 시험(micesurvival Wilcoxson test)의 %로 나타낸다. ***p<0.001
c) 랫트: C6 신경교종 세포(백만개)를 스프라그 다울리(spd) WT 또는 Clec1a 결핍성 랫트의 옆구리에 피하 주사하고 종양 용적을 d35까지 모니터링하였다.
d) C6 신경교종 세포(백만개)를 스프라그 다울리(spd) WT 또는 Clec1a 결핍성 랫트의 옆구리에 피하 주사하고 종양 및 림프절을 18일째에 수거하여 inos, ifng 및 tnfa에 대해 Q-PCR에 적용시켰다. 데이타는 hprt에 대해 상대적인 inos, ifng 및 tnfa의 발현의 막대그래프로 나타내고 종양(n=3)에 대해 임의의 단위(한배 새끼 WT 랫트에서 발현과 비교한 배 변화(fold change), 1의 값)로 또는 림프절에 대해 트랜스크릿 비(transcrit ratio)로 나타낸다(n=6,* p<0.05)
도 8: CLEC -1은 M2-형 전- 종양성 대식구에 의해 발현되고 흉막 삼출 중피종 및 난소 종양 복수액으로부터 골수 세포에 의해 발현된다 .
사람 단핵구를 Zajac, Blood, 2013에 기술된 바와 같이 M-CSF와 함께 배양하여 M0 대식구를 생성시킨 후 IFNγ, LPS 또는 IL-4와 함께 배양하여 M1 또는 M2 대식구를 생성시켰다. CLEC-1 발현을 Q-PCR (a) 및 유동 세포분석법 (b)으로 평가하였다, n=4 *p<0.05. 중피종으로부터의 흉막 삼출액을 수집하여 유동 세포분석법에 적용시켜 FcBlock 및 사람 AB 양성 혈청(동형 대조군)을 사용한 Fc 수용체의 차단 후 CD45+ HLA DR+ CD16+ 골수 세포에서 CLEC-1 발현을 평가하였다(c). 복수액을 난소 암종 환자의 통상의 보호 동안 수집하고 단핵 세포를 피콜 구배(Ficoll gradient) 후 단리한다. 사람 CD14+ 세포를 CD14 마이크로비드(microbead) 및 AutoMACS를 사용한 양성 선택을 사용하여 단리한다. Fc 수용체를 FcBlock 및 사람 AB 양성 혈청으로 차단한 후, CD14+ 세포를 동형 대조군 모노클로날 항체 또는 항-사람 CLEC-1으로 염색하였다(d).
실시예 1:
물질 및 방법
동물
랫트를 "Centre d'ElevageJanvier"(Genest, 프랑스 생-이슬(Saint-Isle) 소재)로부터 구입하고 실험 과정을 페이 드 라 로이르(Pays de la Loire)의 동물 실험 윤리 위원회(Committee on the Ethics of Animal Experiments)에 의해 승인되고 프랑스 정부의 고등 교육 및 연구 부처(French Government's Ministry of Higher Education and Research)에 의해 인가된 프로토콜에 따라 엄격하게 수행하였다. Clec-1 녹 아웃(KO)을 형질도입 랫트 및 교배된 RT1a 루이스 배경(Lewis backgroun)에서 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nucleases: ZFN) 기술을 사용하여 형질도입 랫트 및 면역현상 플랫폼 시설(Transgenic Rats and Immunophenomics Platform facility)(SFR-Sant
Figure 112019050516720-pct00005
-Nantes)에서 생성시켰다. 32 kDa의 예측된 크기에서 CLEC-1 단백질의 부재를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
항체
항-사람 CLEC-1 모노클로날 Ab(mAb)를 Balb/c 마우스를 hCLEC-1의 세포외 도메인을 암호화하는 펩타이드로 면역화함으로써 림프구 체세포 하이브리도마(Biotem, 프랑스 아프리에(Apprieu) 소재)에 의해 생성시키고 ELISA에 의해 재조합 사람 CLEC-1 단백질(RD system)에서 스크리닝함으로써 선택한 후 단백질 A에서 크로마토그래피로 정제하였다. 항-사람 CLEC1 mAb(IgG-D6)는 Santa Cruz Biotechnologies(캘리포니아주 달라스 소재)로부터 구입하였다. 정제된 항-랫트-β-액틴, CD3(G4.18); 항-랫트 TCRαβ-A647 또는 -A488(R73), CD4-PECy7(OX35), CD8-A488(Ox8), IL-17-APC(ebio17B7), Foxp3-APC, IFNγ-FITC, CD11b-PerCP-Cy5.5(WT.5), CD103(αE 인테그린)-FITC 및 항-사람 포스포타이로신(p-Tyr)(4G10), CD4-PE, CD3-APC, CD45-PercP, CD3-FITC, CD19-PE, CD16-PE, CD14-FITC HLA-DR-APC/Cy7, HLA-DR-FITC, CD11c-PECy7, CD11b-FITC CD80-FITC, CD86-FITC, CD83-FITC 및 IgG1 동형 대조군은 BD Biosciences (Franklin Lakes)로부터 구입하였다.
아연 핑거 뉴클레아제(Zinc Finger Nucleasw:ZFN ) 기술에 의한 clec -1 - / - 녹-아웃(KO) 랫트의 생성
랫트 clec -1에 대해 특이적인 시험관내 전사된 mRNA-암호화 ZFN-표적화된 서열(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)을 앞서 기술한 바와 같이 수정된 1개 세포 단계의 배아 속에 미세주사하였다. 태아에서의 돌연변이를 PCR로 검출하였다. 설립자 중 1명은 7bp 결실이 세포외 도메인의 대부분을 결여하고 있는 CLEC-1의 114개 아미노산에서 예비성숙 정지-코돈(premature stop-codon)을 야기함을 나타내었다. 이형접합체를 교배시켜 KO 및 야생형(WT) 한배새끼를 생성하였다.
랫트 CLEC-1 Fc 융합 단백질의 생성
CLEC-1의 세포되 도메인(ADK94891 아미노산 74-261)을 암호화하는 cDNA를 PCR로 증폭시키고 5' 및 3' 말단을 ECORI BglII 제한 부분로 각각 태그시켰다. 분해 후, cDNA 생성물을 클로닝하고 FcγRI 결합을 방지하기 위해 3개의 아미노산 위에서 돌연변이된 IgG2a Fc 단편을 함유하는 pFUSE-mIgG2Ae1-Fc2 v10[Fab](Invivogen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 벡터내로 프레임내에 삽입하였다. 플라스미드를 진핵 세포내에서 리포펙타민으로 제조업자의 지시(ThermoFisher)에 따라 형질감염시켰다. CLEC-1 Fc를 상층액으로부터 HiTrap g 친화성 컬럼(GE Healthcare Bio-sciences, 펜실베니아주 피츠버그 소재)로 정제하고, Slide-A-Lyzer 투석 카세트(ThermoFisher)를 사용하여 투석하고 BCA 단백질 검정 시약 키트(Protein Assay Reagent Kit)(Pierce)를 사용하여 정량화하였다. 순도 및 단백질 구조를 SDS-PAGE에 이은 꼬마지에 염색(Coomassie staining) 및 웨스턴 블롯 검정에 의해 항-마우스 IgG 또는 항-랫트 CLEC-1 항체를 사용하여 보충 물질 및 방법의 웨스턴 블롯 단락에서 기술된 바와 같이 확인하였다. 절단된 형태의 삶 배아 알칼린 포스파타제(hSEAP Fc)를 분비한 대조군 재조합체가 생성되었으며(pFUSE-SEAP-hFc, Invivogen) CLEC-1 Fc보다는 동일한 조건 하에서 정제하였다.
KLH 면역화
랫트를 발바닥에서 100 μl의 완전 프루언트 보조제(Complete Freund Adjuvant: CFA)(Difco) 속에 유액화시킨(v:v) 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 단백질(Sigma)(100μg)로 피하 면역화시키고 슬와의 림프절을 면역화 후 10일째에 수거하였다. 나이브 WT 랫트로부터의 카복시플루오레세인석신이미딜 에스테르(CFSE)(Molecular Probes/Invitrogen)-표지된(5 μM) 총 세포(1X105) 또는 정제된 CD4+ T 세포(1X105) 및 T-세포 고갈된 비장세포(1X105)를 KLH 또는 비관련성 단백질 OVA(25μg/ml)를 사용하여 3일 동안 시험관내 2차 챌린지(challenge)에 적용시켰다.
유동 세포분석법 및 세포 분류
염색 전에, 세포를 제조업자의 지시에 의해 기술된 바와 같이 Fc 블록(BD Biosciences)에 적용시켰다. 세포내 사이토킨 염색을 위해, 세포를 4시간 동안 PMA 및 이오노마이신(각각 50 ng/ml 및 1 μg/ml)으로 단백질 수송 억제제 GolgiStop (2 ㎕/웰)의 존재하에서 자극시키고 고정 및 투과(Facspermeabilizing 용액)(모든 시약은 BD Biosciences로부터 구입하였다)에 적용시켰다. 염색된 세포(2.5 ㎍/ml)의 형광성 표지화를 FACS LSR II(BD Biosciences)를 사용하여 측정하고 FlowJo® 소프트웨어(Tree Star, Inc., 애쉬랜드 소재)로 분석하였다.
세포 분류를 위해, 랫트 CD4+ T 세포 및 CD11b+CD103+CD4- 및 CD11b+CD103+CD4+ DC를 나이브 랫트의 비장으로부터 FACSAria 유동 세포분석기(BD Biosciences)를 사용한 양성 선택에 의해 TCR+ 및 CD4+로 및 CD11b, CD103 및 CD4 염색 각각으로 및 사람 세포의 경우 T 및 B 세포에 대해 각각 SSC저CD45+CD3+ 또는 CD19+로, 호중구에 대해 SSC고CD45+CD16+, 단핵구에 대해 SSC저CD45+CD14+ 및 cDc에 대해 SSC저CD45+HLA-DR+CD11c+로 정제하였다. 순도는 >99%이었다.
죽은 세포는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)-음성 세포에서 게이팅함으로써 배제시켰다.
세포 생성, 시험관내 자극 및 혼합된 백혈구 반응(MLR)
-사람 단해구-기원한 DC(moDC)를 IL-4(40 ng/ml; AbCys, 프랑스 파리 소재) 및 GM-CSF(1000IU/ml; AbCys)가 보충된, 완전 RPMI 1640 배지(10% 내독소가 없는 FCS (Perbio Sciences), 2 mM L-글루타민(Sigma), 1 mM 피루브산나트륨(Sigma), 1 mMHepes(Sigma), 및 5x10-5 M 2-머캅토에탄올(Sigma)) 속에서 7일 동안 배양된 현탁분리한(elutriated) 단핵구로부터 생성시켰다. 이후에, 세포를 24 시간 동안(1X106/ml) LPS(0.5 μg/ml)(Sigma), 폴리 I:C(2 μg/ml)(Invivogen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재), R848(2.5 μg/ml)(Invivogen), 재조합 사람 TGFβ1(20 ng/ml)(R&D systems)으로 대안적으로 플레이트에 이미 코팅된 10 μg/ml의 항-CLEC-1 mAb 또는 IgG1 동형 대조군의 존재하에서 자극시키고 유동 세포분석법에 적용시키거나 5X104개의 동종이계 사람 T 세포(Pan T 세포 분리 키트(Mylteni))와 함께 5일 동안(MLR) 배양(12.5X103)하였다. 재조합 CLEC-1-His 태그(R&D system) 또는 비관련된 재조합 돼지 알파1,3GT-6-His 단백질을 MLR 중 10 μg/ml에서 가하였다. 증식을 CFSE 프로파일에 의해 CD3+CD4+ 세포 속에서 유동 세포분석법으로 측정하고 IL-17 및 IFN-γ 사이토킨을 상층액 속에서 ELISA에 의해 평가하였다.
- 대동맥(HAEC) 또는 제정맥(Umbilical Vein)(HUVEC)으로부터 사람 내피 세포(EC)를 단리하고 배양하며 1000 단위/ml의 재조합 사람 TNFα (eBiosciences)로 12시간 동안 교호적으로 자극시켰다.
- 사람 단핵구를 Zajac, Blood, 2013에 기술된 바와 같이 M-CSF와 함께 배양하여 M0 대식구를 생성시킨 후 IFNγ, LPS 또는 IL-4와 함께 배양하여 M1 또는 M2 대식구를 생성시켰다.
- 중피종을 지닌 환자로부터의 흉막 삼출액을 수집하고 유동 세포분석법에 적용시켰다.
- 복수액을 난소 암종 환자의 통상의 보호 동안 수집하고 단핵 세포를 피콜 구배(Ficoll gradient) 후 단리한다. 사람 CD14+ 세포를 CD14 마이크로비드 및 AutoMACS를 사용한 양성 선택을 사용하여 단리한다.
-Rat CD4+ T 세포를 플레이트 결합된 항-CD3(클론 G4.18)(5μg/ml)으로 자극시켰다. 나이브, CLEC-1 WT 및 KO LEW.1A(RT1a) 한배새끼의 랫트로부터의 골수-기원한 DC(BMDC)를 세포를 8일 동안 랫트 IL-4(4 ng/ml) 및 쥐 GM-CSF(1.5 ng/ml)가 보충된 완전 RPMI 배지 속에서 배양함으로써 수득하였다. 이후에, BMDC를 LPS(1 μg/ml)(Sigma) 또는 자이모잔(20μg/ml)(Invivogen)으로 전사체 분석을 위해 6시간 동안 및 성숙 마커의 발현 및 MLR(5μM CFSE로 표지된 LEW.1W(RT1u) 나이브 랫트의 중피종 림프절로부터의 정제된 동종이계 CD4+ T 세포와 함께 5일의 공-배양)을 위해 24시간 동안 자극시켰다. 대안적으로, 랫트 CLEC-1 Fc 융합 단백질 및 대조군 hSEAP-Fc(10μg/ml)를 MLR 속에서 내독소 억제제 폴리믹신 B(10μg/ml)(Invivogen)의 존재하에서 가하였다.
RNA 추출 및 실시간 정량적 RT-PCR
조직, 종양 또는 세포로부터의 총 RNA를 제조업자의 지시에 따라 트리졸(Invitrogen)을 사용하여 제조하였다. 혼주된 사람 기관(pooled human organ)으로부터의 cDNA를 사람 면역계로부터 및 MTC 패널 I을 남성 또는 여성 백인으로부터 구입하였다(Clontech Mountain View). 실시간 정량적 PCR을 ViiA 7 실시간 PCR 시스템 및 SYBR® 그린(Green) PCR 마스터 믹스(Master mix)(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT)를 내인성 대조군 유전자로서 사용하여 출발하는 양의 RNA에 있어서의 변화에 대해 표준화하였다. 상대적인 발현을 2-△△Ct 방법을 사용하여 계산하고 임의의 단위로 나타내었다.
면역침전 및 웨스턴 블롯
사람 moDC를 항-CLEC-1 또는 대조군 IgG1 동형(Invitrogen) mAb 코팅된 플레이트(10 μg/ml) 위에 5 또는 20분 동안 배지 속에서 자이모잔(20 μg/ml)과 함께 또는 이의 부재하에 플레이팅하였다. 사람 moDCs, HAEC, HUVEC 및 HEK를 프로테아제 억제제 칵테일(cocktail)이 들어있는 Nonidet P-40 1% 분해 완충액(Sigma Aldrich) 속에서 분해하였다. CLEC-1 면역침전을 4μg의 항-사람 CLEC1 mAb(D6)를 사용한 후 단백질 G-세파로즈 비드와 함께 항온처리함으로써 수행하였다. 이후에 단백질을 밤새 PNGase F(Sigma Aldrich)로 처리하고, 용출시키며 5분 동안 램믈리(Laemmli) 샘플 완충액 속에서 비등시켜 용해하였다. 단백질 농도를 BC 검정 키트(kit)를 사용하여 표준물로서 BSA(Interchim, San Pedro)로 측정하였다. 니트로셀룰로즈 막을 트윈-20-트리스 완충된 염수 및 5% 우유로 차단시키고 0.5μg/ml의 항포스포타이로신(4G10) 또는 2μg/ml의 항 CLEC1 mAb에 이어, 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 제2 Ab(Jackson immunoresearch, 펜실베니나주 웨스트 그로브 소재)와 함께 항온처리하였다. 프로테옴 프로파일러(Proteome Profiler) 사람 NF-κB 경로 배열 키트(Pathway Array Kit)를 제조업자의 지시(R&D System)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 화학발광성에 의한 검출을 웨스트 피코 화학발광성 기질(West Pico chemiluminescence substrate)(Thermofisher scientific, Waltham, MA)을 사용하여 수행하고 단백질 발현을 Las 4000(Fuji)에 의해 평가하였다.
면역조직화학
호중구, moDC, 부착성 형질감염된 HEK293T 세포 및 HUVEC 세포(커버슬립(coverslip) 위에서 밤새 배양됨)를 4% 파라포름알데하이드(Electron Microscopy Science, 미국 펜실베이니아주 하트필드 소재)로 고정시키고 moDC를 제외하고 트리톤 X100(0.1%)으로 투과하였다. 세포를 항-CLEC1 mAb(D6) 또는 IgG1 동형 대조군(Invitrogen)(4 μg/ml)으로 1시간 동안 실온에서 moDC에 대해 PBS 1% FCS, 1% BSA 및 Fc 블록을 사용한 후 제2 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 568 항-마우스 IgG1 항체를 사용하여 1시간 동안 염색하였다. 1% DAPI를 함유하는 PBS 속에서 10분 항온처리한 후, 슬라이드를 프로롱 안티페이드 시약(Prolong Antifade Reagent)(Invitrogen)을 사용하여 탑재시키고 형광 현미경(Nikon A1 R Si 공초점 현미경)으로 관찰하였다. 영상을 연속 방식으로 수득하고(X60 Plan Apo N.A: 1.4, zoom 2) ImageJ 프로그램을 사용하여 분석하였다.
생체내 종양 모델
hepa 1.6 간암종 종양 세포를 b6 WT 또는 Clec1a 결핍성 마우스의 간에서 간문맥으로 주사하였다. C6 신경교종 세포(백만개)를 스프라그 다울리(spd) WT 또는 Clec1a 결핍성 랫트의 옆구리에 피하 주사하였다.
통계적 분석
모든 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 소프트웨어(Graphpad Prism software)(La Jolla)를 사용하여 2-테일 쌍을 이루지 않은 비매개변수 스튜던츠 시험(two-tailed unpaired nonparametric Student's t test)(Mann-Whitney)으로 수행하였다. 결과는 p 값이 < 0.05인 경우 유의적인 것으로 고려하였다.
결과
사람 골수 DC는 세포-표면에서 CLEC-1을 발현한다.
사람에서 CLEC-1 발현에 대한 제한된 정보만이 지금까지 발표되어 왔다. 사람 CLEC-1 단백질 발현, 조절 및 기능에 대하여 지금까지 기술된 것은 거의 없었다. 사람 CLEC-1이 소포체 단백질을 닮은 염색 방식으로 내피 세포내에서 세포내적으로만 검출될 수 있으며 TGF-β 또는 염증 자극 중 어는 것도 세포 표면에 대한 유의적인 전좌를 촉진할 수 있다는 것(사람 C-형 렉틴-유사 수용체 CLEC-1은 TGF-β에 의해 상향조절되며 주로 내부 원형질 막 구획에 국재화된다)을 개시하는 CLEC-1 발현에 대해 유일하게 하나의 공보가 존재한다(Sattler et al., ScandJImmunol. 2012 Mar;75(3):282-92). 따라서, hCLEC-1(즉, 내피 세포에서 세포내 국재화)에 있어서 당해 분야의 기술 상태에서 이용가능한 유일한 정보는 랫트에 대해 알려져 있는 것과는 대조적이다(즉, rCLEC-1은 내피 및 골수 세포의 표면에 국재화하였다).
본 발명자들은 폐 및 태반에서 CLEC-1 전사체의 강력한 발현 및 흉선, 림프절, 비장 및 편도선과 같은 림프 기관에서 보다 중간의 발현을 정량적 RT-PCR로 관찰하였다(데이타는 나타내지 않음). 사람 세포 아형에서, 붕부한 CLEC-1 전사체가 호중구, 단핵구, moDC 및 HAEC에서 발견되었으며(도 1a) T 및 B 세포에서는 전사체가 검출되지 않았다. moDCs 및 EC에서 CLEC-1 단백질의 존재는 CLEC-1 면역침전에 이은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었으며(데이타는 나타내지 않음) 내피 HEK 세포에서 관찰된 적은 양과는 대조적이다. 본 발명자들은 세포외 도메인에 대해 지시된 마우스 항-사람CLEC-1 mAb를 생성하였으며 문헌에서 앞서 기술된 것을 확증하는 형질감염된 HEK 세포의 세포-표면에서 CLEC-1의 낮은 이소성(ectopic) 발현을 관찰하였다(데이타는 나타내지 않음). 다른 CLR의 경우, CLEC-1은 다른 어댑터 쇄, 다른 PRR 또는 효과적인 발현, 수송 및 세포-표면 안정성을 위한 충분한 글리코실화를 필요로 할 수 있다. CLEC-1 단백질의 세포-표면 발현은 형질감염된 세포에서 면역조직화학으로 확인하였다(데이타는 나타내지 않음).
생성된 mAb와 관련하여, 이들은 유동 세포분석법에 의해 본 발명자의 지식에 대해 최초로 골수 CD16- DC(CD45+CD14-HLA-DR고CD11c+)가 순환하는 사람 혈액의 아집단(subpopulation) 및 CD14+CD16+ 단핵구(CD45+CD14+CD16+)에서 CLEC-1의 세포-표면 발현을 입증하였다. 세포-표면 발현은 BDCA3+ 골수 DC 아집단(BDCA3+CD45+HLA-DR고CD11c저(low)) 또는 CD123+형질세포양 DC(CD123+CD11c-HLA-DR고)에서 관찰되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). CLEC-1의 낮은 발현은 이에 대한 발현이 주로 세포내에서 이미 보고된 호중구 또는 HAEC의 세포-표면에서 관찰되었다(도 1b). CLEC-1 단백질의 동일한 국재화는 면역조직화학에 의해 사람 호중구 및 EC 내에서 세포내 CLEC-1 염색 및 DC에서 세포-표면 발현을 사용하여 관찰하였다(데이타는 나타내지 않음). 중요하게도, 본 발명자가 랫트에서 이미 기술한 것과 유사하게, 본 발명자들은 사람에서 CLEC-1 발현이 TLR 리간드와 같은 염증성 자극에 의해 DC에서 하향-조절되며 TGFβ에 의해 상향조절됨을 관찰하였다(대표적인 점 플롯 및 MFI 막대그래프, 각각 도 1c).
사람 moDC에서 개시하는 CLEC -1은 시험관내 하부 동형이계 Th17 활성화를 억제한다.
CLEC-1 천연 리간드는 아직 확인되지 않고 있으므로, 본 발명자들은 항-사람 CLEC-1 mAb를 사용하여 moDC의 세포-표면에서 리간드 및 가교-결합 CLEC-1을 모방하였다. 저 스트링전트 조건(low stringent condition)에서 CLEC-1 면역침전 후, 본 발명자들은 CLEC-1 개시 후 예측된 크기의 CLEC-1(32 kDa)에서 타이로신 포스포릴화가 없음을 웨스턴 블롯에 의해 관찰하였으며, 이는 세포질 테일에서 타이로신 모티프가 직접 포스포릴화되지 않음을 시사한다(데이타는 나타내지 않음). 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 크기가 대략 40 내지 50 kDa인 수개의 밴드의 향상되거나 감소된 포스포릴화를 사용한 타이로신 포스포릴화 양식에 있어서 몇가지 변화를 관찰하였으며, 이는 CLEC-1이 확인될 나머지 결합 파트너를 통해 이러한 신호를 보내는 기능성 수용체임을 시사한다.
본 발명자들은 이후에 CLEC-1 개시가 다른 활성화 또는 억제성 CLR에 대해 기술되어 있으므로 moDC의 TLR-유도된 성숙을 조절하는지를 시험하였다. 본 발명자들은 CLEC-1 개시가 자체적으로 유도하지 않거나 활성화 마커 CD80, CD86, CD83 및 HLA-DR(도 2a)의 발현 및 TNFα, IL-12, IL-6, IL-23 또는 IL-10(도 2b)의 생산에 따른 moDC의 LPS-유도된 성숙 상태를 강화하거나 억제하지 않음을 관찰하였다. 유사한 결과가 다른 TLR 리간드를 사용하여 관찰되었다(데이타는 나타내지 않음).
이후에, 본 발명자들은 하부 동종이계 T 세포 반응을 분극화하는 moDC의 능력에 대한 개시하는 CLEC-1의 효과를 평가하였다. 후속적인 동종이계 T 세포 증식에 있어서의 차이는 CLEC-1 개시 단독 만(도 2c)으로 또는 TLR와의 조합시 관찰되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 그러나, 본 발명자들은 동종이계 T 세포에 의해 분비된 유의적으로 적은 IL-17 및 많은 IFNγ를 나타내었으며 이는 moDC에서 CLEC-1 개시가 후속적인 동종이계성 Th17 활성화를 감소시키고 Th1 하나에 대한 반응을 왜곡시켰음을 시사한다(도 2c).
CLR 신호전달이 NF-κB의 활성화를 이끌었음을 고려할 때, 본 발명자들은 단독으로 또는 DECTIN-1 및 TLR 신호전달 경로 둘 다의 효능제인, 자이모산과 함께 CLEC-1 개시 후 프로테옴 프로파일러(Proteome profiler)에 의한 NF-κB 경로의 수준 및 활성화를 시험하였다. 본 발명자들은 자이모잔과 대조적으로, CLEC-1 개시가 NF-κB 억제제인 IκBα의 분해에 의해서, 및 RelA p65(Ser529) 소단위의 포스포릴화에 의해서 평가된 NF-κB 경로의 자체 활성화에 의해 유도되지 않음을 관찰하였다(데이타는 나타내지 않음). 그러나, 본 발명자들은 CLEC-1 개시의 결합(conjunction)이 자이모잔에 의해 유도된 IκBα의 분해를 감소시켰음을 나타내었다. 그러나, p65 소단위의 포스?O화에 있어서의 유의적인 감소는 관찰되지 않았다. Ser529에서의 포스포릴화는 IKKβ 의존성이므로, 이들 데이타는 CLEC-1이 IKKβ 활성화 경로를 특히 억제할 수 있음을 시사한다. 종합하면, 이들 데이타는, 사람 moDC에서의 CLEC-1 개시가 기능적으로 활성이며 본 발명자들이 사이토킨 생산에 대한 유의적인 효과를 관찰하지 않았지만 PRR에 의해 유도된 NF-κB 신호전달 경로를 조절하여 이들의 활성화 상태를 미세하게 조절하고 하부 Th17 반응을 억제할 수 있음을 시사한다.
랫트 BMDC에서 CLEC -1 신호전달의 파괴는 시험관내 T 세포 반응을 향상시킨다.
CLEC-1의 기능으로의 통찰력을 얻기 위하여, 본 발명자들은 CLEC-1 결핍성 랫트를 생성하였다. CLEC-1 결핍성 랫트는 살아있었고, 건강하였으며 예측된 멘델법칙의 빈도로 이형접합체 번식으로부터 출생하였다. 정지 상태에서, CLEC-1 결핍성 랫트는 혈액 및 말초 림프 기관 속에서 일정한 골수 및 림프구 면역 세포 구획을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음).
본 발명자들은 CLEC-1 결핍성 랫트로부터 BMDC를 생성하였고 이들 세포가 LPS 자극(CD80, CD86, 제I 및 제II 부류 MHC)에 대한 반응시 일반적으로 분화하여 성숙함을 관찰하였다(데이타는 나타내지 않음). 흥미롭게도, 본 발명자들은 LPS 또는 자이모산에 의한 활성화 후, CLEC-1 결핍성 BMDC가 야생형 랫트로부터의 BMDC보다 보다 높은 수준의 IL-12p40 전사체를 발현하였음을 관찰하였다(데이타는 나타내지 않음). IL-6, IL-23, TGFβ 및 IL-10 발현에 대해 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 인상적으로, CLEC-1 결핍성 BMDC는 Th17 T 세포의 증가된 활성화와 관련된 동종이계 CD4+ T 세포의 향상된 증식을 유도하였다(도 3).
이러한 데이타를 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 랫트 CLEC-1 Fc 융합 단백질을 생성하였다(데이타는 나타내지 않음). 이러한 융합 단백질은 FcγRI 결합을 방지하기 위해 3번 아미노산에서 돌연변이된 IgG Fc 단편에 융합된 랫트 CLEC-1의 세포외 도메인으로 이루어졌으며, BMDC에서 이의 추정되는 리간드와의 CLEC-1 상호작용을 차단할 수 있으므로 CLEC-1 결핍성을 모방한다. 유사하게, 본 발명자들은 시험관내 MLR 속에서 CLEC-1 Fc 융합 단백질의 존재 하에 비-Foxp3 동종이계 효과기 T 세포의 보다 많은 증식 및 보다 더 Th17 활성화를 관찰하였다(도 4). 중요하게도, Th-17의 유도는 항-CD3 폴리클로날 활성화 후 정제된 T 세포에서 CLEC-1 Fc를 사용하여 관찰되었으며(데이타는 나타내지 않음), 이는 이러한 효과가 BMDC에서 CLEC-1 신호전달 파괴에 대해 특이적이며 CLEC-1 Fc의 연결 및 T 세포에서 추정된 리간드에 대한 효능제 효과에 기인하지 않음을 입증한다.
종합적으로 고려할 때, 이러한 데이타는 골수종, 특히 DC에서 CLEC-1 신호전달의 부재가 시험관내 효율적인 T 세포 증식 및 활성화에 요구되는 이들의 활성화 상태를 향상시켰음을 시사한다.
CLEC-1 결핍성은 생체내 DC-매개된 T 세포 반응을 향상시킨다.
본 발명자들은 이후 DC-매개된 Th 분화에 이은 외부 항원 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 및 완전 프루언트 보조제를 사용한 피하 주사에 의한 면역화에서 생체내 CLEC-1의 잠재적인 기능을 시험하였다. 첫째로, 이들은 림프절에서 cDC CD103+ CD11b+의 상이한 아형에 있어서의 CLEC-1 전사체 발현을 평가하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 CLEC-1 발현이 죽은 세포의 식세포작용에 대해 전문화되고 세포독성 활성을 나타내는 마우스에서 CD8α+ DC에 상응하는 CD4- DC로 제한함을 관찰하였다.
면역화 후, 이들은 배수하는 림프절의 시험관내 제2 챌린지 후, 증가된 수의IL-17+, IL-17+IFNγ+ 및 IFNγ+ CD4+ T 세포와 관련된 면역화된 CLEC-1 결핍성 랫트로부터 KLH-특이적인 CD4+ T 세포의 증가된 증식을 관찰하였다(막대그래프 및 대표적인 점 플롯, 도 5b). 중요하게는, KLH에 대한 향상된 리콜 반응(recall reponse)이 또한 야생형 랫트로부터의 DC의 존재하에서 면역화된 CLEC-1 결핍성 랫트로부터의 정제된 CD4+ T 세포를 사용하여 관찰하였으며, 이는 CLEC-1의 부재하에서 생체내 T 세포 프라이밍에 있어서 특이적인 증가를 입증하였다(데이타는 나타내지 않음). 이러한 데이타는 cDC에 있어서 CLEC-1 신호전달의 결핍성이 하부 T 세포-매개된 면역 반응을 악화시킴을 입증한다.
토의(Discussion)
본 연구에서, 본 발명자들은 본 발명자의 지식으로 최초로, 사람 CLEC-1이 후속적인 효과기 Th17 반응을 억제하는 기능적인 DC 세포-표면 조절 수용체임을 입증하였다. 더욱이, CLEC-1 결핍성 랫트는 과도한 DC-매개된 CD4+ T 세포 프라이밍의 방지에 있어서 CLEC-1에 대한 생체내 역할을 나타내었다. 랫트에서와 같이, 이들은 사람 moDC에서의 CLEC-1 발현이 염증성 자극에 의해 감소되고 TGFβ에 의해 상향조절됨을 관찰하였다. 감소에 이은 염증 자극을 사용한 DC에서의 이러한 발현 프로파일은 또한 생체내 T 세포 반응 및 염증을 억제하는 것으로 밝혀진 MICL 또는 DCIR과 같은 다른 억제성 수용체에 대해 관찰된 전통적인 반응을 나타낸다(Uto T. et al. Clec4A4 is a regulatory receptor for dendritic cells that impairs inflammation and T-cell immunity. Nat Commun. 2016;7:11273) (Redelinghuys P, et al. MICL controls inflammation in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2015). 흥미롭게도, 본 발명자들은 CLEC-1이 림프 기관에서 cDC의 CD4+ 아집단에 의해 랫트에서 발현됨을 발견하였다. DC의 이러한 아집단은 죽은 세포의 세포독성 활성 및 식세포작용에 관여되고 IL-12의 주요 생산자이고 종양 항원의 교차-제시에 관여하는 것으로 기술된 CD8α+ DCs 마우스 대응부에 상응한다. 이러한 발현 양식은 CD8α-cDC에 한정되는 것으로 밝혀진 억제성 수용체 CDIR-2와는 대조적이다. 그럼에도 불구하고, 사람 혈액에서, CLEC-1은 CD16-CD14- 골수 DC의 아집단 상의 세포-표면에서 발현되지만 CD8α+ DC의 사람 대응부인, BDCA3+ DC상에서는 발현되지 않은 것으로 관찰되었다. 사람과 설치류 사이의 불일치는 추가의 시험을 정당화한다. 본 발명자들은 CLEC-1 신호전달의 파괴가 시험관내에서 특히 DC-매개된 Th17 활성화를 향상시키지만 Th1 및 Th17 반응 둘 다는 생체내 면역화 후 증가하였음을 관찰하였다. 이는 CLEC-1이 PRR의 공-맞물림(co-engagement)에 따라 Th1 및 Th17 반응을 차등적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 역으로, DC에서 활성화 수용체로서 작용하는 DECTIN-1은 분극화 사이토킨 IL-12 및 IL-23의 분비를 미세하게 조절함으로써 리간드 및 PRR 공-맞물림에 따라 Th17/Th1 균형을 차등적으로 촉진한다(Gringhuis SI, et al. Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk. Nat Immunol. 2009;10(2):203-213) (LeibundGut-Landmann S, et al. Syk- and CARD9-dependent coupling of innate immunity to the induction of T helper cells that produce interleukin 17. Nat Immunol. 2007;8(6):630-638) (Lee EJ, et al. Mincle Activation and the Syk/Card9 Signaling Axis Are Central to the Development of Autoimmune Disease of the Eye. J Immunol. 2016;196(7):3148-3158). 예를 들면, 아스퍼길러스 푸미가투스(Aspergillus Fumigatus) 챌린지에 대한 반응시, DECTIN-1은 IFN-γ 및 IL12p40 발현을 감소시킴으로써 Th1 분극화를 감소시켜 마우스에서 Th17 분극화를 특히 강화시키는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 DC에서 CLEC-1 신호전달이 Th17 분극화 사이토킨의 PRR-유도된 발현을 억제함을 관찰하지 않았으며 랫트 KO BMDC에서 IL-12p40 생산에 대한 효과만을 주목하였다. 이러한 결과는 DC에서 CLEC-1이 분극화 사이토킨의 발현보다는 다른 메카니즘에 의해 Th17/Th1 균형을 형성할 수 있음을 시사한다. 예를 들면, DECTIN-1 신호전달은 DC 상의 공자극 분자 Ox40 리간드의 발현을 또한 조절함으로써 T 세포 분극화 운명(polarization fate)에 영향을 미침이 밝혀졌다(Joo H, et al. Opposing Roles of Dectin-1 Expressed on Human Plasmacytoid Dendritic Cells and Myeloid Dendritic Cells in Th2 Polarization. J Immunol. 2015;195(4):1723-1731). 흥미롭게도, 본 발명자들은 사람 DC에서 CLEC-1 개시가 DECTIN-1 신호전달에 의해 유도된 IkBα 분해를 방지함을 관찰하였다. 따라서, CLEC-1은 또한 CLR을 활성화함으로써 매개되고 Th17 반응을 특이적으로 유지하는 것으로 알려진 Card9 신호전달 경로를 방지할 수 있다.
본 발명자들은 CLEC-1 Fc 융합 단백질을 사용하여 내인성 리간드를 발현하는 세포를 검출할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 이들의 데이타는 CLEC-1 리간드가 조혈 세포에 의해 발현되거나 "천연적으로" 특히 조직 또는 세포 손상의 맥락에서 방출될 수 있음을 시사한다. 리간드는 DCIR-2에 대한 경우에서와 같이 또는 대안적으로는 T 세포에서 CLEC-1 발현 세포 자체에 의해 발현될 수 있다. 내인성 DECTIN-1 리간드는 CLEC-1과는 대조적으로 T 세포 증식을 향상시키는 공자극 분자로서 작용하는 T 세포에 의해 발현되는 것으로 보고되어 왔다(Ariizumi K, et al. Identification of a novel, dendritic cell-associated molecule, dectin-1, by subtractive cDNA cloning. J Biol Chem. 2000;275(26):20157-20167).
이러한 발견은 하부 T 세포 활성화의 정도 및 품질의 엄격한 조절에 있어서 DC내 CLEC-1의 관련성을 확립하며 세포-표면 수용체로서 T 세포 반응을 조작하는 치료학적 도구를 제공할 수 있다.
따라서, 골수 세포에서 세포-표면 억제성 수용체로서 CLEC-1은 치료학적 중재를 위한 잠재적인 표적 및 암에서 새로운 치료 패러다임임을 강조한다.
수개의 실험 연구는 CLR이 세포-부착 또는 T-세포 반응 성형에 있어서 이들의 기능에 의해 암 진행 및 전이성 확산에 기여함을 입증한다((Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al. 2017). 예를 들면, 면역조절성 수용체 DC-SIGN, MINCLE, DCIR 및 BDCA-2는 골수 세포 활성화, 염증을 억제하며 Foxp3+ CD4+ CD25+ Treg 확장을 구동시키는데 중요함이 밝혀졌다(Yan, Kamiya et al. 2015; Ding, Yao et al. 2017). DC-SIGN은 거의 모든 사람 암종에서 과발현된 암배아 항원을 인식하고(Nonaka, Ma et al. 2008) 골수 세포에 의한 면역억제성 사이토킨 IL-10 및 IL-6의 분비를 촉진한다. 게다가, DC-SIGN 유전자 프로모터에 있어서 다형성은 결장직장 암 환자에서 증가된 위험과 관련된 것으로 밝혀졌다(Lu, Bevier et al. 2013). MINCLE는 췌장 문맥 선암종에서 및 특히 골수 억제 세포(MSC)에 의해 종양 침윤 백혈구가 향상됨이 밝혀졌다. 죽은 세포로부터 방출된 MINCLE와 SAP130(히스톤 데아세틸라제 복합체의 소단위)의 연결은 강력한 종양-주변 억제를 유도한다(Seifert, Werba et al. 2016). 유사하게, CLR LOX-1은 암 환자에서 혈액 또는 종양-침윤 호중구의 세포 표면에서 특이적으로 향상되지만(15 내지 50%) 건강한 공여자의 혈액 속에서는 거의 검출불가능함이 밝혀졌다(Condamine, Dominguez et al. 2016). 본 연구에서, 이들은 소포체 스트레스가 LOX-1 발현을 유도하며 강력한 억제 기능으로 호중구를 MSC로 전환시킴을 밝혔다.
역으로, DECTIN-1과 같은 활성화 CLR의 개시 신호전달은 항-종양 면역성을 탑재하여 Treg 및 MSC를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Tian, Ma et al. 2013). DECTIN-1의 리간드인, 베타-글루칸의 투여는 쥐 암종 모델(Li, Cai et al. 2010; Masuda, Inoue et al. 2013; Tian, Ma et al. 2013), 사람 흑색종, 신경아세포종, 림프종 이종이식체 모델(Modak, Koehne et al. 2005) 뿐만 아니라, 사람 난소 및 위암(Inoue, Tanaka et al. 1993; Oba, Kobayashi et al. 2009)에서 종양 성장을 억제한다.
따라서, CLEC-1 길항제에 의해 DC 또는 보다 광범위하게는 골수 세포 활성화를 향상시키는 것은 암에서 중요한 임상 관련성을 가질 수 있는 하부 효과기 T-세포 면역을 조절하기 위한 면역 체크포인트 표적을 나타낼 수 있다.
실시예 2
본 발명자들은 랫트에서 CLEC-1 Fc 융합 단백질을 사용한 CLEC-1 차단이 혼합된 백혈구 반응(MLR)에서 T 세포 증식을 향상시킴을 밝혀내었다(참고: 실시예 1). 이들은 사람 CLEC-1의 세포외 부분에 대해 지시된 몇가지 mAb를 생성하였고 이들은 하나의 mAb가 CLEC-1 신호전달의 길항제인 것으로 여겨지므로 혼합된 백혈구 반응(MLR)에서 T 세포 증식 및 IFN-γ 생산을 향상시킴을 밝히고 있다. MLR은 고 수준의 CLEC-1을 발현하는 동종이계 단핵구 기원한 수지 세포(12.5X103)와 혼합된 말초 혈액(5X104)으로부터 단리된 정제된 T 세포로 이루어져 있다. 동형 대조군(IgG1) 또는 항-사람 CLEC-1 항체를 5일 동안 0.5 내지 10 μg/ml의 용량에서 가하였다. 이후에, T 세포의 증식을 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르 희석으로 평가하고 IFNγ 발현을 T 세포에서 유동 세포분석법에 의해 및 상층액에서 ELISA에 의해 평가하였다(도 6a 및 도 6b, 6c 막대그래프 및 대표적인 플롯).
실시예 3
CLEC -1은 종양에서 고도로 발현되며 종양 면역성에 있어서 기능적 역할을 담당한다.
마우스 간암종 모델(hepa 1.6 종양 세포의 문맥내 주사)에서, 본 발명자들은 종양내 CLEC-1의 증가된 및 장기-지속 발현을 관찰하였다(도 7a). 중요하게도, 이러한 모델에서, CLEC-1이 결핍된 마우스(Derrick J. Rossi로부터 제공됨, Harvard Stem Cell Institute, 캠브릿지 소재)는 종양 성장에 대해 보다 우수하게 내성이며 증가된 생존율을 나타낸다(KO에서 중간 생존 28d 대 WT에서 21d)(도 7b). 유사하게, 피하(sc.) 랫트 신경교종 모델(C6)에서, 본 발명자들은 CLEC-1 결핍성 랫트 5마리 중 3마리에서 종양의 총 퇴행을 관찰하였다(본 발명자의 실험실에서의 ZFN technology에 의해 발생됨)(도 7c). 중요하게는, 종양내 Q-PCR에 의해 종양 세포 접종 후 18일 째에 수거된 종양에서, inos, tnfa 및 ifng의 보다 높은 mRNA 발현이 CLEC-1 결핍성 랫트에서 평가되었다(도 7d). ifng의 보다 높은 mRNA 발현이 림프절에서 검출되었다(도 7b). 이러한 데이타는 CLEC-1 결핍성 랫트에서의 보다 우수한 항-종양 반응을 입증하며 CLEC1의 부재가 보다 항-종양성인 M1 대식구 및 보다 큰 세포독성 및 Th1 T 세포를 유도하였음을 시사한다.
CLEC -1 발현은 교차-제시에서 전문화된 cDC로 제한된다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 랫트 및 마우스 둘 다에서 제2 림프구 기관으로부터의 cDC에 의한 CLEC-1 발현이 항원(랫트에서 CD4+, 마우스에서 CD8α+)의 교차 제시로 전문화된 DC의 특이적인 부분집합으로 제한됨을 관찰하였다(도 5a). 이러한 세포는 고 수준의 IL-12를 분비하고 항 종양 세포독성 CD8+ T 림프구(CTL) 반응의 활성화에 관여함이 밝혀졌다. 따라서, DC의 이러한 전문화된 부분집합에서 억제성 수용체로서 작용함으로써, CLEC-1 개시는 종양 항원에 대한 IL-12 생산, 효율적인 교차제시 및 CTL 반응을 방지할 수 있다.
CLEC -1은 M2-형 전- 종양성 대식구에 의해 발현되고 흉막 삼출 중피종 및 난소 종양 복수액으로부터 골수 세포에 의해 발현된다.
본 발명자들은 M1-형 항-종양 대식구와 비교하거나 M0 대식구와 비교하여 사람 M2-형 전종양성 대식구에 있어서 전사체 (a) 및 단백질 수준 (b) 둘 다에서의 보다 높은 CLEC-1 발현을 관찰하였다(도 8). 또한, 본 발명자들은 흉막 삼출 중피종으로부터의 사람 골수 CD45+ HLADR+ CD16+ 세포 (c) 및 난소 암종 복수액 (d)으로부터의 CD14+ 골수 세포에 있어서 CLEC-1 세포-표면 단백질 발현을 관찰하였다(도 8). 이러한 데이타는 CLEC-1 발현이 종양 미세환경 속에서 골수 세포 상에서 향상되며 종양 면역 회피에서 중요한 역할을 할 수 있음을 입증한다.
결론적으로, 상기 결과의 측면에서(특히 CLEC-1 Fc 융합 단백질 및 사람 CLEC-1의 세포외 부분에 대해 지시된 항체는 T 세포 증식을 향상시키는 것을 나타낸 결과), CLEC-1 길항제는 암의 치료에 사용될 수 있다는 것이 신뢰가능한 것으로 여겨진다.
참고문헌:
본 명세서 전체에서, 다양한 참고문헌은 본 발명이 속한 기술 분야의 상태를 기술한다. 이러한 참고문헌의 개시내용은 본 개시내용으로의 참고에 의해 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) Universite de Nantes OSE Immunotherapeutics <120> METHODS FOR PROMOTING T CELLS RESPONSE <130> IP20193647FR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO:1 <400> 1 Tyr Tyr Gln Leu Ser Asn Thr Gly Gln Asp Thr Ile Ser Gln Met Glu 1 5 10 15 Glu Arg Leu Gly Asn Thr Ser Gln Glu Leu Gln Ser Leu Gln Val Gln 20 25 30 Asn Ile Lys Leu Ala Gly Ser Leu Gln His Val Ala Glu Lys Leu Cys 35 40 45 Arg Glu Leu Tyr Asn Lys Ala Gly Ala His Arg Cys Ser Pro Cys Thr 50 55 60 Glu Gln Trp Lys Trp His Gly Asp Asn Cys Tyr Gln Phe Tyr Lys Asp 65 70 75 80 Ser Lys Ser Trp Glu Asp Cys Lys Tyr Phe Cys Leu Ser Glu Asn Ser 85 90 95 Thr Met Leu Lys Ile Asn Lys Gln Glu Asp Leu Glu Phe Ala Ala Ser 100 105 110 Gln Ser Tyr Ser Glu Phe Phe Tyr Ser Tyr Trp Thr Gly Leu Leu Arg 115 120 125 Pro Asp Ser Gly Lys Ala Trp Leu Trp Met Asp Gly Thr Pro Phe Thr 130 135 140 Ser Glu Leu Phe His Ile Ile Ile Asp Val Thr Ser Pro Arg Ser Arg 145 150 155 160 Asp Cys Val Ala Ile Leu Asn Gly Met Ile Phe Ser Lys Asp Cys Lys 165 170 175 Glu Leu Lys Arg Cys Val Cys Glu Arg Arg Ala Gly Met Val Lys Pro 180 185 190 Glu Ser Leu His Val Pro Pro Glu Thr Leu Gly Glu Gly Asp 195 200 205 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO:2 <400> 2 Cys Glu Arg Arg Ala Gly Met Val Lys Pro Glu Ser Leu His Val Pro 1 5 10 15 Pro Glu Thr Leu Gly Glu Gly Asp 20

Claims (29)

  1. 치료학적 유효량의 사람 CLEC-1의 길항제를 포함하는, 사람 대상체의 암 치료용 약학 조성물로,
    사람 CLEC-1의 길항제가,
    - 항체 또는 이의 항원-결합 단편;
    - 사람 CLEC-1의 기능성 등가물이고, 사람 CLEC-1의 세포외 도메인을 포함하거나 또는 사람 CLEC-1의 세포외 도메인과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 단백질; 및
    - 사람 CLEC-1의 압타머,
    로 구성된 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    사람 대상체가, 악성 신생물(neoplasm); 암종(malignant); 분화되지 않은 암종(carcinoma); 거대 및 방추상 세포 암종(giant and spindle cell carcinoma); 소 세포 암종; 유두 암종; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종(pilomatrix carcinoma); 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma); 유상 변천 세포 암종(papillary transitional cell carcinoma); 선암종; 악성 가스트린종(gastrinoma); 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 소주 선암종(trabecular adenocarcinoma); 샘낭암종; 선종 폴립에서의 선암종; 선암종, 가족성폴립증; 고형 암종(solid carcinoma); 악성, 유암종(carcinoid tumor); 기관지-폐포 선암종(branchiolo-alveolar adenocarcinoma); 유두모양샘 암종; 염색소 암종; 호산세포 암종(acidophil cardinoma); 호산성 세포 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성세포 암종(basophil carcinoma); 투명 세포 선암종(clear cell adenocarcinoma); 과립상 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종(papillary and follicular adenocarcinoma); 비 캡슐화 경화성 암종(non encapsulating sclerosing carcinoma); 부신 외피 암종; 상피성 암종; 피부 부속기관 암종(skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지선 선암종(sebaceous adenocarcinoma); 귀지샘 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막표피모양 암종; 낭샘암종; 유두성 낭샘암종; 유두모양의 장액성 낭샘암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭샘암종(mucinous cystadenocarcinoma); 점액성 선암종(mucinous adenocarcinoma); 반지세포암종(signet ring cell carcinoma); 침윤성 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 속질 암종(medullary carcinoma); 소엽 암종; 염증성 암종; 유선의 페제트병(paget's disease); 샘꼬리세포암종; 선편평세포암종; 편평상피화생이 있는 선암종(adenocarcinoma w/squamous metaplasia); 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립층 세포 종양; 및 악성 모세포종(roblastoma, malignant); 세르톨리 세포 암종(Sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor); 악성 지질 세포 종양; 악성 곁신경절종; 악성, 유방외 곁신경절종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종; 글로만지오사코마(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 멜라닌 결핍 흑생종; 얕은 확산 흑색종(superficial spreading melanoma); 거대 색소 모반내 악성 흑색종; 상피 세포 흑색종; 악성 청색모반; 육종; 섬유 육종; 악성 섬유조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형횡문근육종; 꽈리 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양(mixed tumor, malignant); 혼합된 뮬레 종양(mullerian mixed tumor); 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종; 악성 블레너종양(brennertumor, malignant); 악성 엽상종양(phyllodestumor, malignant); 활막육종; 악성 중피종; 난소고환증; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막 암종; 악성 중간콩팥종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽연골육종; 골의 거대 세포 종양; 유윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치성 종양(odontogenic tumor, malignant); 사기질모세포치아 육종(ameloblasticodontosarcoma); 악성 법랑모세포종; 사지질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종; 별아교세포종; 원형질성 별아교세포종(protoplasmic astrocytoma); 원섬유성 별아교세포종(fibrillary astrocytoma); 성모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 희소돌기아교모세포종; 원시신경외배엽종양; 대뇌 육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환(Hodgkin's disease); 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 파라육아종(paragranuloma); 소형 림프구성 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 거대 세포, 확산성, 악성 림프종; 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종; 기타 구체화된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; masT 세포 육종; 면역증식성 소장 질환(immunoproliferative small intestinal disease); 백혈병; 림프성 백혈병; 혈장세포성백혈병(plasma cell leukemia); 적백혈병; 림프육종세포백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성백혈병; 단구성백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구성 백혈병(megakaryoblasticleukemia); 골수성 육종; 및 털세포백혈병(hairy cell leukemia)으로 구성된 군에서 선택된 암을 앓고 있는, 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    사람 대상체가, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 중추신경계 암, 유방암, 캐슬맨 질환 경부암(Castleman disease cervical cancer), 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 담낭암, 위장 유암종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 카포시 육종, 신장암, 후두 및 하인두 암, 간암, 폐암, 중피종, 형질구종, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경아세포종, 구강 및 구강인두 암, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체암, 전립샘암(prostate cancer), 망막아세포종, 횡문근육종, 침샘암, 피부암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상샘암, 질암, 외음부암, 자궁암, 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 암종(carcinoma), 신경 교종(glioma), 백혈병, 림프종(lymphoma), 및 육종(sarcoma)으로 구성된 군에서 선택된 암을 앓고 있는, 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 길항제가, 천연 또는 합성의, CLEC-1의 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나, 또는 감소시키는 화합물인, 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 길항제가 수용체 CLEC-1과 이의 리간드 중 적어도 하나 사이의 상호작용을 억제하는, 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 길항제가 T 세포 반응을 촉진하는, 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 길항제가,
    T 세포 증식을 증가시키거나, 또는
    사이토킨 합성을 증가시키거나, 또는
    T 세포 증식을 증가시키고 사이토킨 합성을 증가시키는, 약학 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 길항제가, 사람 CLEC-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는, 약학 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    사람 CLEC-1의 길항제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    사람 CLEC-1의 길항제가 키메라 항체, 사람화된 항체 및 완전한 사람 모노클로날 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 사람 CLEC-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합되는 약학 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 사람 CLEC-1 도메인에 특이적으로 결합되는 약학 조성물
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    사람 CLEC-1의 길항제가 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 단백질인 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 단백질이, 적어도 하나의 CLEC-1 리간드와 CLEC-1 사이의 상호작용을 방지하는, 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 단백질이, 적어도 하나의 CLEC-1 리간드와 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 CLEC-1의 세포외 도메인 사이의 상호작용을 방지하는, 약학 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 단백질이 면역글로불린 불변 도메인에 융합되는, 약학 조성물.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고펩타이드, 또는 단백질이 사람 CLEC-1의 세포외 도메인을 포함하거나 또는 사람 CLEC-1의 세포외 도메인과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 약학 조성물.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    사람 CLEC-1의 길항제가 압타머인, 약학 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    사람 CLEC-1의 길항제가 암의 통상의 치료와 함께 사용되는, 약학 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    사람 CLEC-1의 길항제가 화학치료제, 표적화된 암 치료요법, 면역치료제 또는 방사선치료요법으로 구성된 군에서 선택되는 제제와 함께 사용되는, 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제제는 세포독성제, 항-혈관형성제(anti-angiogenic agent), 항암 면역원제, 세포 주기 제어/세포자멸사 조절제, 항암 항체, 및 호르몬 조절제로 구성된 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 사람 CLEC-1의 길항제가, 상기 제제와의 동시의, 별도의 또는 연속적인 투여에 사용되는, 약학 조성물.
  23. T 세포 반응을 촉진할 수 있는 CLEC-1 길항제를 확인하는 단계를 포함하는, 암 치료에 사용되는 화합물의 제조방법.
  24. 제23항에있어서,
    화합물이 제1항의 약학 조성물에서 기술된 길항제인, 제조방법.
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