JP2015529825A - 癌幹細胞に発現する分子をターゲットとした癌を診断、治療する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、新たな、がんの悪性度判定方法、がんの診断方法及び予後判定方法、がん治療剤、及びがん転移抑制剤ワクチンを提供することを課題とする。【解決手段】がんの悪性度の評価方法であって、がん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現量を測定する段階、及び当該DDX3X発現量に基づき当該がん組織の悪性度を評価する段階を含む方法。【選択図】なし

Description

本発明は、癌幹細胞に発現する分子をターゲットとした癌を診断、治療する方法、特に、がんの悪性度の判定方法、がんの予後の評価方法、がん抗原ペプチド、養子免疫用細胞組成物の製造方法、並びにがんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制剤に関する。

多くの証拠が、ほとんどの固形悪性腫瘍は不均一の腫瘍細胞で構成され、比較的少数の細胞の群が、高い腫瘍形成能、非接着性の細胞塊（スフェア）形成能、無限の自己複製能、及び非対称性分化能等のユニークな特性をもつことを示している。この特徴的な細胞群は、生物学的、生化学的、及び分子的特徴が正常な幹細胞と共通していることから、がん幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれている。古典的なＣＳＣモデルでは、ＣＳＣ細胞群と比較的分化した大多数を占めるがん細胞群のヒエラルキーは厳密であり、一方向性であるとされていた。しかし、最近のデータは、ＣＳＣと分化したがん細胞が制御されたバランスの下で、相互に変換できることを示唆している(非特許文献１)。
細胞傷害性化学療法と分子標的治療後に生き残るごく少数のがん細胞が一様にＣＳＣマーカーの１つとされているＣＤ１３３を発現していたことが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。ＣＳＣは細胞死から逃れる複数のメカニズムを有している。変異クロマチン状態、多剤排出トランスポーター、抗アポトーシス因子、ＤＮＡ修復遺伝子産物及び幹細胞に特徴的な生存シグナルなどにより、ＣＳＣは、細胞傷害性抗がん剤、分子標的治療薬、放射線療法などにより生じる致死的環境下でも生き残ることができる。このユニークながんの集団は、致死的環境を生き延びることで、遺伝子変異により永続的な薬剤耐性を獲得するがん細胞の母細胞として機能することができる（非特許文献２）。したがって、ＣＳＣシステムは、ほとんどの治療の失敗とがんの再発を担っている可能性が高い。ＣＳＣの細胞群を根絶するための効果的な治療法が開発されない限り、持続的な治癒を達成することは非常に困難である。よって、ＣＳＣの細胞群を根絶するための効果的な治療法が求められている。

Li Y, Laterra J. Cancer stem cells: distinct entities or dynamically regulated phenotypes? Cancer research. 2012;72:576-80. Sharma SV, Lee DY, Li B, Quinlan MP, Takahashi F, Maheswaran S, et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell. 2010;141:69-80. Rappa G, Fodstad O, Lorico A. The stem cell-associated antigen CD133 (Prominin-1) is a molecular therapeutic target for metastatic melanoma. Stem Cells. 2008;26:3008-17.

本発明は、新たな、がん組織の悪性度の判定方法、がんの予後の評価方法、がん抗原ペプチド、養子免疫用細胞組成物の製造方法、並びにがんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、以前の研究で、腫瘍所属リンパ節中で腫瘍抗原によりプライミングされたエフェクターＴ細胞が、脳、肺、皮膚転移モデルにおいて、抗腫瘍治療活性を有していることを報告した(Kagamu H, Shu S. Purification of L-selectin(low) cells promotes the generation of highly potent CD4 antitumor effector T lymphocytes. J Immunol. 1998;160:3444-52., Fujita N, Kagamu H, Yoshizawa H, Itoh K, Kuriyama H, Matsumoto N, et al. CD40 ligand promotes priming of fully potent antitumor CD4(+) T cells in draining lymph nodes in the presence of apoptotic tumor cells. J Immunol. 2001;167:5678-88.)。さらに近年、本発明者らは、ＣＳＣマーカーの一つであるＣＤ１３３に着目し、メラノーマ細胞全体の１％未満を占めるＣＤ１３３陽性メラノーマを純化することに成功した。このＣＤ１３３陽性メラノーマはＣＳＣの特性を有していた。このメラノーマＣＳＣワクチン接種が、特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞及びタイプ１７ Ｔヘルパー（Ｔｈ１７）細胞、及びＴｈ１細胞を誘導することを見いだした。特に、メラノーマＣＳＣ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、腫瘍組織におけるエフェクターＴ細胞とＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩを高発現した活性型樹状細胞の長時間の集積を引き起こし、高い抗腫瘍効果を示した。さらに、メラノーマＣＳＣ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を移入したマウスでは、腫瘍組織内で通常見られる制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導が認められなかった。この治療は、ＣＤ１３３陽性腫瘍細胞を根絶させ、最終的には親株メラノーマを治癒させた。以上の結果は、ＣＤ１３３陽性メラノーマ細胞は特異的な免疫原性抗原を有しており、その抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＳＣを根絶することでこれまでにない高い抗腫瘍活性をもつことを示している。

また、本発明者らは、ＣＤ１３３陽性腫瘍細胞に優位に発現する免疫原性タンパク質を解明するため、二次元電気泳動を使ってタンパク質発現を比較し、4つのタンパク質を見出した。質量分析（MS／MS）の解析データのMascotサーチから、その一つが、DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 3, X-linked（DDX3X）であると同定した。
このタンパク質は、Ｘ染色体に座位するＡＴＰ依存的ＲＮＡヘリカーゼのＤＥＡＤボックスファミリーのタンパク質（ＤＥＡＤボックスヘリカーゼ）である。ＤＥＡＤボックスヘリカーゼは、ＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡの核から細胞質への搬出、転写翻訳制御、ＲＮＡ分解、リボソームの構築など複数の機能を有している(Rocak S, Linder P. DEAD-box proteins: the driving forces behind RNA metabolism. Nature reviews Molecular cell biology. 2004;5:232-41.)。ＤＤＸ３Ｘは、進化上で、酵母からヒトまで保存されており、細胞の生存に必須であることが示唆されている。ＤＤＸ３Ｘのホモログには、Y染色体上に座位するＤＤＸ３Ｙがあり、両者の遺伝子は胎児発生の過程で働く。ヒトにおいては、ＤＤＸ３Ｘの欠損又は、機能不全は、胚細胞形成不全と関連するとされている(Matzuk MM, Lamb DJ. Genetic dissection of mammalian fertility pathways. Nat Cell Biol. 2002;4 Suppl:s41-9.)。

本発明者らは、本発明において、ＤＤＸ３ＸがＣＤ１３３陽性メラノーマ細胞の主要な免疫原性標的タンパク質であることを見出した。また、合成ＤＤＸ３Ｘのワクチン接種は、皮膚メラノーマ治療モデルにおいて腫瘍退縮効果を示した。また、ＤＤＸ３Ｘは、ＣＳＣマーカーを発現するヒトのがん細胞株で強く発現するものの、正常ヒト上皮細胞、正常ヒト内皮細胞では、わずかにしか発現されていなかった。
これらのことから、本発明者らは、
がん組織におけるＤＤＸ３Ｘの発現量は、がんの悪性度の指標となること；
また、がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の有無は、がんの予後を評価する指標となること；
ＤＤＸ３Ｘの部分ペプチド（フラグメント）ががんワクチンとなること；
また、抗ＤＤＸ３Ｘ免疫療法は、ＣＳＣを根絶させ、それによってがんを治癒する有望な方法となることができること
を着想し、更なる研究の結果、本発明を完成するに至った。

本発明は、次の態様を含む。

項１．
がんの悪性度の評価方法であって、
がん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現量を測定する段階、及び
当該ＤＤＸ３Ｘ発現量に基づき当該がん組織の悪性度を評価する段階
を含む方法。
項２．
ＤＤＸ３Ｘに対する抗体、あるいはＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡ又はそれに対応するｃＤＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドを含有し、
当該抗体又は当該ポリヌクレオチドが、がん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現量の測定のために用いられる
がん悪性度評価用キット。
項３．
がんの予後の評価方法であって、
がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞を検出する段階、及び
当該検出結果に基づきがんの予後を評価する段階
を含む方法。
項４．
ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドを含有し、
当該ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドが、がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の検出のために用いられる
がん予後評価用キット。
項５．
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、
配列番号２〜８７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する連続した９〜２０個のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
項６．
がん抗原ペプチドである項５に記載のペプチド。
項７．
項５に記載のペプチドを含有するがんワクチン。
項７−２．
がんに対するワクチン接種における使用のための項５に記載のペプチド。
項８．
がんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制用である項７に記載のがんワクチン。
項９．
抗原提示能を有する細胞をＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドでパルスする段階
を含む、養子免疫用細胞の製造方法。
項１０．
ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドでパルスされた抗原提示細胞。
項１１．
項１０に記載の抗原提示細胞を有効成分として含むＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の誘導剤。
項１１−２．
ＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の誘導における使用のための項１０に記載の抗原提示細胞。
項１２．
抗原提示能を有する細胞をＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドに暴露して当該ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドに由来する抗原を提示する細胞を得る段階、及び
当該細胞を用いてＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞を誘導する段階
を含む、養子免疫用細胞組成物の製造方法。
項１３．
前記ＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞がＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞である項１２に記載の製造方法。
項１４．
ＤＤＸ３Ｘの発現又は活性を阻害する化合物を含有するがんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制剤。
項１４−２．
がんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制における使用のためのＤＤＸ３Ｘの発現又は活性を阻害する化合物。

本発明のペプチドはがん抗原であり、これにより、がんの悪性度の判定方法、がんの予後の評価方法、がん抗原ペプチド、養子免疫用細胞組成物の製造方法、並びにがんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制剤等が提供される。

ヒトＤＤＸ３Ｘのアミノ酸配列である。 ＣＤ８陽性Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生を示すグラフである。（実施例１） ＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＩＦＮγ及びＩＬ−１７の産生を示すグラフである。（実施例１） ＣＤ８陽性Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生を示すグラフである。（実施例１） ＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＩＦＮγ及びＩＬ−１７の産生を示すグラフである。（実施例１） ワクチン接種したマウスにおける腫瘍成長曲線のグラフである。（実施例２） ワクチン接種した、形成した皮膚腫瘍を有するマウスにおける腫瘍成長曲線のグラフである。（実施例３） ワクチン接種したマウスにおける腫瘍成長曲線のグラフである。（実施例４） ＤＤ３Ｃの部分ペプチドの刺激によるＩＦＮγ産生を示すグラフである。(実施例５) ＤＤ３Ｃの部分ペプチドの刺激によるＩＦＮγ産生を示すグラフである。(実施例６) ワクチン接種したマウスにおける腫瘍成長曲線のグラフ（Ｂ）である。（実施例７） ＣＤ１３３を発現を示すフローサイトメトリーのグラフである。（実施例８） ＤＤＸ３Ｘ及びβアクチンに対する抗体を用いた、腫瘍細胞に対するイムノブロットである。（実施例８） 細胞キズ修復実験の傷修復の経過の写真である。（実施例９） スフェロイド形成能の検討におけるスフェロイドの写真である。（実施例１１）

本発明において、「がん」とは、生体における異常な細胞の非制御の増殖であり、その例としては、例えば、固形腫瘍（例えば、癌種、肉腫等）、リンパ腫及び白血病等が挙げられる。

より具体的には、がんとしては、例えば、
星細胞腫、悪性の髄芽腫、胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫等の小児の脳腫瘍；
グリオーマ、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫等の成人の脳腫瘍；
上顎洞癌、咽頭癌（上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌）、喉頭癌、口腔癌、口唇癌、舌癌、耳下腺癌等の頭頚部癌；
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸腺腫、中皮腫等の胸部癌及び腫瘍；
食道癌、肝臓癌、原発性肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膵癌、膵内分泌腫瘍等の消化器癌及び腫瘍；
陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、ウイルムス腫瘍、尿路上皮癌等の泌尿器癌及び腫瘍；
外陰癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、絨毛癌、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍等の婦人科癌及び腫瘍；
成人及び小児の軟部肉腫；骨肉腫、ユーイング腫瘍等の骨の腫瘍；
副腎皮質癌、甲状腺癌等の内分泌組織の癌及び腫瘍；悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等の悪性リンパ腫及び白血病；
慢性骨髄増殖性疾患、悪性黒色腫（メラノーマ）、有棘細胞癌、基底細胞癌、菌状息肉症等の皮膚の癌及び腫瘍；
前記腫瘍及び癌の転移巣等が挙げられる。

中でも、本発明は、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌等の胸部癌及び腫瘍；
悪性黒色腫（メラノーマ）等の皮膚の癌及び腫瘍；及び
乳癌等の婦人科癌及び腫瘍
に好適に適用される。

「ＤＤＸ３Ｘ」とは、DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 3, X-linkedである。
前述したように、このタンパク質は、Ｘ染色体に座位するＡＴＰ依存的ＲＮＡヘリカーゼのＤＥＡＤボックスファミリーのタンパク質（ＤＥＡＤボックスヘリカーゼ）である。そのアミノ酸配列は公知である。ヒトＤＤＸ３Ｘの配列（UniProtKB/Swiss-Prot: O00571.3）を図１（配列番号１）に示す。

本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）や核酸又はアミノ酸などの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（日本特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。

本明細書中、塩基配列は、特に記載しない限り、５´末端から３´末端の方向に記載する。
本明細書中、アミノ酸配列は、特に記載しない限り、Ｎ末端からＣ末端の方向に記載する。

本明細書中、「遺伝子」には、特に限定しない限り、２本鎖DNA、及び１本鎖DNA（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖DNA（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが包含される。また、本明細書で「遺伝子」とは、特に限定しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。

本明細書中、「ヌクレオチド」（又は「ポリヌクレオチド」）は、核酸と同義であって、DNA及びRNAの両方を包含するものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよい。本明細書中、ある配列を有する「ヌクレオチド」（又は「ポリヌクレオチド」）は、特に限定しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（又は「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。

本明細書中、「ポリヌクレオチド」は、特に限定しない限り、「オリゴヌクレオチド」を包含するものとする。

また、「ヌクレオチド」（又は「ポリヌクレオチド」）は、特に限定しない限り、修飾された核酸又は核酸類似体（例、PNA、LNA）を包含するものとする。

なお、「ヌクレオチド」（又は「ポリヌクレオチド」）がRNAである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。

本明細書中、「cDNA」は、特に限定しない限り、mRNAに相補的な塩基配列を有する一本鎖DNA（一本鎖cDNA）、並びに当該一本鎖cDNA及びその相補鎖からなる二本鎖DNA（二本鎖cDNA）の両方を包含するものとする。

本明細書中、「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA、第２版、1989に記載の条件）において、試料中の他のポリヌクレオチドとのクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」条件として具体的には、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃で加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃で洗浄した場合に、陽性のハイブリタイズのシグナルが観察される条件が挙げられる。

本明細書中、「タンパク質」は、特に限定しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。

本明細書中、ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドに由来するペプチドを、ＤＤＸ３Ｘ由来ペプチドと称する場合がある。

本明細書中、ＤＤＸ３Ｘの部分ペプチド（又はフラグメント）とは、ＤＤＸ３Ｘのアミノ酸配列の一部からなるペプチドを意味する。

がんの悪性度の評価方法
本発明のがんの悪性度の評価方法は、
がん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現量を測定する段階、及び
当該ＤＤＸ３Ｘ発現量に基づき当該がんの悪性度を評価する段階
を含む。

本明細書中、「がんの悪性度」とは、当該がんが、臨床的に、その宿主をどの程度早く死に至らしめてしまうかを示すものであり、具体的には、当該がんに起因する死亡率の高さ、当該がんの転移の可能性の高さ、当該がんの予後の悪さ、又は当該がんの治療の困難さとして考えることができる。

本明細書中、「がん組織」は、例えば、患者から検査のために採取されたがん組織、若しくは手術により摘出されたがん組織、又はそれらの一部であることができる。

「ＤＤＸ３Ｘ発現量」の測定は、悪性度が高いがん組織におけるＤＤＸ３Ｘ発現量と悪性度が低いがん組織におけるＤＤＸ３Ｘ発現量の区別が可能な任意の手段を採用して行えばよい。

本発明の一態様では、ＤＤＸ３Ｘの発現量の測定は、タンパク質であるＤＤＸ３Ｘの量を測定することによって行うことができる。具体的には、例えば、必要に応じて前記のがん組織から通常の方法によりタンパク質を抽出又は調製し、次いで、後記に例示する方法などによってＤＤＸ３Ｘの発現量を測定する。タンパク質の抽出又は調製は、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。

ＤＤＸ３Ｘの量を測定する方法としては、特定のタンパク質の量を測定できる方法であれば、特に制限されないが、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プロテインアレイ（プロテインチップ）法などが挙げられる。

ＥＬＩＳＡ法では、例えば、前記のがん組織から抽出又は調製したタンパク質を含有する溶液を、マイクロプレートのウェルの固相表面に吸着させた後、ＤＤＸ３Ｘに対する抗体をアプライし、酵素反応によりＤＤＸ３Ｘの量を測定する。

プロテインアレイ法では、例えば、ＤＤＸ３Ｘに対する抗体を有するプロテインアレイ（例、抗体アレイ（抗体チップ））を準備し、当該プロテインアレイに、前記のがん組織から抽出したタンパク質をアプライし、抗体抗原反応をさせた後、前記抗体に結合したＤＤＸ３Ｘの量を、ＥＬＩＳＡ法等を用いて測定する。

前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体であり得る。

また、前記抗体は、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメントであってもよい。

前記抗体は、公知の方法により製造できる。

例えば、前記抗体がポリクローナル抗体の場合は、公知の方法により大腸菌などで発現させて調製したＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチド、或いは公知の方法により合成したＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドを用いて、ウサギなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、当該免疫動物の血清から慣用の方法により調製できる。
一方、前記抗体がモノクローナル抗体の場合は、公知の方法により大腸菌などで発現させて調製したＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドを抗原として用いて、マウスなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、得られた抗体産生細胞をミエローマと細胞融合させて調製したハイブリドーマから調製できる。

本発明において用いられるＤＤＸ３Ｘの部分ペプチドとしては、例えば、後記する本発明のペプチドが好ましい。

ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドは、そのアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。当該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。このようなペプチド合成法としては、例えば「ペプチド合成」（丸善；１９７５年発行）又はPeptide Synthesis, Interscience, New York, （1996）に記載の方法が例示される。また、例えばアプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置のような公知の化学合成装置を用いて製造することもできる。

また、抗原として使用されるＤＤＸ３Ｘ、又はＤＤＸ３Ｘの部分アミノ酸配列からなるペプチドは、これをコードする遺伝子の塩基配列情報に基づくＤＮＡのクローニング、プラスミド構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収などの操作を含む一般的な遺伝子工学的手法によって、発現ベクター又はクローニングベクター等を用いて製造することもできる。

組み換えベクターは、ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより得られる。
ベクターＤＮＡは、宿主の種類及び使用目的により適宜選択すればよい。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡであってもよく、天然ＤＮＡから増殖に必要な部分以外のＤＮＡ部分が一部欠落しているものでもよい。ベクターＤＮＡとしては、例えば、染色体、エピソーム又はウイルス等に由来するベクターが挙げられる。具体的には、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウィルス（例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等）等に由来するベクター及びそれらを組み合わせたベクター、プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター（例えばコスミド及びファージミド等）が挙げられる。

前記ポリヌクレオチドを、公知の方法によりベクターＤＮＡに挿入することにより、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターが得られる。具体的には、例えば、適当な制限酵素を用いてＤＮＡ及びベクターＤＮＡを特定部位で切断し、混合してリガーゼにより再結合することができる。また、前記ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターＤＮＡのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても前記組換えベクターを得ることができる。

前記ポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターを、公知の宿主、例えば大腸菌（例えばK12）、バチルス属細菌（例えばMI114）のような細菌、酵母（例えばAH22）、昆虫細胞（例えばSf細胞）又は動物細胞（例えばCOS-7細胞、Vero細胞、CHO細胞等）等に公知の方法で導入することにより、当該組換えベクターが導入された形質転換体が得られる。

遺伝子導入方法としては、遺伝子の安定性を考慮すれば、染色体内へのインテグレート法が好ましく挙げられる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を用いることができる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook,ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、 １９８９)等に記載されている標準的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（Scrape loading）、バリスティック導入（ballistic introduction）及び感染等を例示できる。

また、ＤＤＸ３Ｘは、商業的にも入手可能である。

また、抗ＤＤＸ３Ｘ抗体は、商業的にも入手可能である。

ＤＤＸ３Ｘの量の測定に用いられる抗体は、例えば、酵素標識、放射標識、及び蛍光標識などの公知の標識方法で標識されていてもよく、ビオチンなどにより修飾されていてもよい。

本発明の別の一態様では、ＤＤＸ３Ｘの発現量の測定は、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの量を測定することによって行うことができる。具体的には、例えば、必要に応じて前記のがん組織から慣用の方法によりｍＲＮＡを抽出又は調製し、後記に例示する方法などによってＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの量を測定する。ｍＲＮＡの抽出又は調製は、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。

ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの量を測定する方法は、特定のｍＲＮＡの量を測定できる方法であれば、特に制限されないが、例えば、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡ又はそれに対応するｃＤＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドであるプローブ又はプライマーを用いた、サザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ））、定量ＰＣＲ（例、リアルタイムＰＣＲ）、又はインベーダー（商品名、ＨＯＬＯＧＩＣ社、米国）法等の公知の方法を採用して行うことができる。

マイクロアレイ法では、例えば、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡに特異的に結合するプローブが配置された核酸アレイ（核酸チップ）を準備し、当該核酸アレイに、前記のがん組織から抽出し、及び蛍光標識等で標識したｍＲＮＡ試料をアプライし、前記プローブに結合したＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの標識シグナルを測定して解析する。

リアルタイムＰＣＲでは、例えば、前記のがん組織から抽出又は調製したｍＲＮＡを、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写し、そのｃＤＮＡを鋳型として用い、ＤＤＸ３ＸのｃＤＮＡに特異的に結合するプライマーを用いて、所定の領域をＰＣＲで増幅し、増幅産物の生成をリアルタイムでモニタリングする。

ｍＲＮＡの量の測定に用いられるプローブは、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするように設計される。

プローブとしてのポリヌクレオチドは、好ましくは、例えば、ＤＤＸ３Ｘ ｍＲＮＡの塩基配列の全体配列、部分配列、及びそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて１〜数個（例、１〜１０個、１〜５個、１〜３個）の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドなどである。プローブとしてのポリヌクレオチドの長さは、通常、１５〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長である。

プローブとしてのポリヌクレオチドは、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの量の測定を可能とするために、適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質等が付加されていてもよい。

定量ＰＣＲなどによるｍＲＮＡの量の測定に用いられるプライマーは、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするように設計される。プライマーの設計は、特に制限されないが、公知の方法、例えば、プライマー設計用アルゴリズムやソフトウエアなどを利用して行なうことができる。プライマーは通常、フォワードプライマー及びリバースプライマーの一対からなるプライマーセットとして使用される。

プライマーとしてのポリヌクレオチドは、好ましくは、例えば、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの塩基配列の全体配列、部分配列、及びそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて１〜数個（例、１〜１０個、１〜５個、１〜３個）の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドなどである。プライマーとしてのポリヌクレオチドの長さは、通常、１５〜３０塩基長である。

プライマーとしてのポリヌクレオチドは、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの量の測定を可能とするために、適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質等が付加されていてもよい。

ポリヌクレオチドは、遺伝子工学的手法［Methods in Enzymology, 2005; 392: 24-35, 73-96,173-185, 405-419.; Nucleic Acids Res. 1984;12:9441；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，１０５頁（１９８６）など］、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段［J Am Chem Soc. 1967; 89(2): 450-3.; J Am Chem Soc. 1967; 89 (26): 7146-7147.］及びそれらの組合せ方法などにより製造できる。また、ＲＮＡの合成は市販のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３９００ハイスループットＤＮＡ合成器等とともにＲＮＡ合成用試薬を用いてホスホロアミダイド法により合成することもできる。

さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの合成を受託している会社又は部門に合成を委託することにより得ることもできる。

また、ＤＤＸ３Ｘの発現量の測定は、がん組織中に、ＤＤＸ３Ｘを発現している細胞数の測定によっても行うことができる。ＤＤＸ３Ｘを発現している細胞数の測定は、蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質等で標識した抗ＤＤＸ３Ｘ抗体を用いて、免疫組織染色したがん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現細胞を観察すること、又はがん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現細胞の数をフローサイトメトリー等によって計測することなどの方法によっても行うことができる。

本発明のがんの悪性度の評価方法においては、測定されたＤＤＸ３Ｘの発現量が高い場合、がん組織の悪性度は高いと評価され、測定されたＤＤＸ３Ｘの発現量が低い場合、がん組織の悪性度は低いと評価される。

ＤＤＸ３Ｘの発現量の高さと、がん組織の悪性度の高さとは、例えば、非がん組織、従来法で悪性度が高いと評価されたがん組織、及び従来法で悪性度が低いと評価されたがん組織等の各ＤＤＸ３Ｘの発現量の高さに基づいて、統計学的手法（例えば、student t検定、Kaplan-Meier法）を利用して、関係づけることができる。

本発明のがんの悪性度の評価方法の評価方法は、他のがんの悪性度の評価方法と組み合わせて実施してもよい。

がん悪性度評価用キット
本発明のがん悪性度評価用キットは、本発明のがんの悪性度の評価方法に用いることができる。

本発明のがん悪性度評価用キットは、ＤＤＸ３Ｘに対する抗体、あるいはＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡ又はそれに対応するｃＤＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドを含有する。

本発明の一態様において、がん悪性度評価用キットは、ＤＤＸ３Ｘに対する抗体を含有する。
当該抗体は、タンパク質であるＤＤＸ３Ｘの量を測定するために用いられる。
当該抗体としては、「がんの悪性度の評価方法」について説明した抗体と同様の抗体を用いることができる。

当該抗体は、プロテインアレイ（例、抗体アレイ、抗体チップ）を構成していてもよい。当該プロテインアレイは、基板及び前記抗体を有し、当該抗体は基板上に配置されている。当該基板としては、タンパク質をその上に配置できるものであれば特に制限されないが、例えば、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、及びキャピラリー等を挙げることができる。当該プロテインアレイ（抗体チップ）は、例えば、インクジェット技術を利用する方法等の、プロテインアレイの製造における慣用の方法を用いて前記抗体を基板上に固定することによって製造できる。

本発明の別の一態様において、本発明のがん悪性度評価用キットは、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡ又はそれに対応するｃＤＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドを含有する。
当該ポリヌクレオチドは、ＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡの量を測定するために用いられる。
当該ポリヌクレオチドとしては、「がんの悪性度の評価方法」について説明したポリヌクレオチドと同様のポリヌクレオチドを用いることができる。

当該ポリヌクレオチドは、核酸アレイを構成していてもよい。当該核酸アレイは、当該核酸アレイは、基板及び前記ポリヌクレオチドを有し、当該ポリヌクレオチドは基板上に配置されている。前記ポリヌクレオチドとしては、「がんの悪性度の評価方法」について説明したポリヌクレオチドが挙げられる。当該基板としては、核酸をその上に配置できるものであれば特に制限されないが、例えば、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、及びキャピラリー等を挙げることができる。当該核酸アレイは、例えば、市販のスポッターを利用する方法、又はインクジェット技術を利用する方法等の、核酸アレイの製造における慣用の方法を用いて前記ポリヌクレオチドを基板上に固定することによって製造できる。

本発明のがん悪性度評価用キットは、その目的及び形態に応じて、酵素、緩衝液、若しくは試薬、又は取り扱い説明書などを含有してもよい。

がんの予後の評価方法
本発明のがんの予後の評価方法は、
がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞を検出する段階、及び
当該検出結果に基づきがんの予後を評価する段階
を含む。

本明細書中、「がんの予後」とは、将来におけるがんの経過を意味する。

がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の検出は、好ましくは、がん患者から得た血液試料中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の検出によって行われる。
当該血液試料の取得は、慣用の方法で実施すればよい。

血液試料中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の検出は、例えば、^３Ｈ−チミジン取込アッセイ等の抗原依存的増殖の分析、^５１Ｃｒ放出アッセイ等の細胞傷害性測定、ＭＨＣ−ペプチド・テトラマー染色法、Enzyme-Linked Immunospot（ELISPOT）アッセイ、又は細胞内サイトカインアッセイ等の慣用の抗原特異的Ｔ細胞の検出方法により、実施できる。

これらの検出方法で用いられる抗原は、前記「がんの悪性度の評価方法」において説明したものが挙げられる。

がん患者の血中にＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞が検出された場合、予後が良いと評価され、一方、検出されなかった場合、予後が悪いと評価される。

本発明のがんの予後の評価方法は、他のがんの予後の評価方法と組み合わせて実施してもよい。

がん予後評価用キット
本発明のがん予後評価用キットは、本発明のがんの悪性度の評価方法に用いることができる。

本発明のがん予後評価用キットは、ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドを含有する。
当該ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドは、がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の検出のために用いられる。
当該ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドは、「がんの悪性度の評価方法」について説明したＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドと同じである。好ましくは、ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドとして、後記で説明する本発明のペプチドが用いられる。

ペプチド
本発明のペプチドは、
前記の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、
後記の配列番号２〜８７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する連続した９〜２０個のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列からなる。
前述したように、配列番号１は、ＤＤＸ３Ｘのアミノ酸配列である。

配列番号２：ＦＬＬＤＬＬＮＡＴ
配列番号３：ＮＩＴＱＫＶＶＷＶ
配列番号４：ＩＱＭＬＡＲＤＦＬ
配列番号５：ＴＦＰＫＥＩＱＭＬ
配列番号６：ＫＹＤＤＩＰＶＥＡ
配列番号７：ＲＹＩＰＰＨＬＲＮ
配列番号８：ＲＮＩＮＩＴＫＤＬ
配列番号９：ＫＱＹＰＩＳＬＶＬ
配列番号１０：ＩＧＬＤＦＣＫＹＬ
配列番号１１：ＩＥＬＴＲＹＴＲＰ
配列番号１２：ＴＲＹＴＲＰＴＰＶ
配列番号１３：ＭＧＮＩＥＬＴＲＹ
配列番号１４：ＬＶＬＡＰＴＲＥＬ
配列番号１５：ＹＰＩＳＬＶＬＡＰ
配列番号１６：ＱＹＰＩＳＬＶＬＡ
配列番号１７：ＬＥＤＦＬＹＨＥＧＹ
配列番号１８：ＦＬＤＥＹＩＦＬＡ
配列番号１９：ＬＬＶＥＡＫＱＥＶ
配列番号２０：ＦＬＬＰＩＬＳＱＩ
配列番号２１：ＤＦＬＤＥＹＩＦＬ
配列番号２２：ＳＨＶＡＶＥＮＡＬ
配列番号２３：ＶＡＶＥＮＡＬＧＬ
配列番号２４：ＡＬＧＬＤＱＱＦＡ
配列番号２５：ＬＧＬＤＱＱＦＡＧ
配列番号２６：ＧＬＤＱＱＦＡＧＬ
配列番号２７：ＤＱＱＦＡＧＬＤＬ
配列番号２８：ＮＳＳＤＮＱＳＧＧ
配列番号２９：ＫＧＲＹＩＰＰＨＬ
配列番号３０：ＰＨＬＲＮＲＥＡＴ
配列番号３１：ＲＧＲＧＤＹＤＧＩ
配列番号３２：ＹＤＧＩＧＳＲＧＤ
配列番号３３：ＲＳＧＦＧＫＦＥＲ
配列番号３４：ＫＰＬＰＰＳＥＲＬ
配列番号３５：ＬＦＳＧＧＮＴＧＩ
配列番号３６：ＦＳＧＧＮＴＧＩＮ
配列番号３７：ＩＮＦＥＫＹＤＤＩ
配列番号３８：ＹＤＤＩＰＶＥＡＴ
配列番号３９：ＴＧＮＮＣＰＰＨＩ
配列番号４０：ＥＩＩＭＧＮＩＥＬ
配列番号４１：ＩＩＭＧＮＩＥＬＴ
配列番号４２：ＩＰＩＩＫＥＫＲＤ
配列番号４３：ＧＳＧＫＴＡＡＦＬ
配列番号４４：ＴＡＡＦＬＬＰＩＬ
配列番号４５：ＡＡＦＬＬＰＩＬＳ
配列番号４６：ＩＹＡＤＧＰＧＥＡ
配列番号４７：ＬＡＶＱＩＹＥＥＡ
配列番号４８：ＩＹＥＥＡＲＫＦＳ
配列番号４９：ＲＰＣＶＶＹＧＧＡ
配列番号５０：ＣＶＶＹＧＧＡＤＩ
配列番号５１：ＬＬＶＡＴＰＧＲＬ
配列番号５２：ＡＴＰＧＲＬＶＤＭ
配列番号５３：ＧＬＤＦＣＫＹＬＶ
配列番号５４：ＬＤＦＣＫＹＬＶＬ
配列番号５５：ＬＶＬＤＥＡＤＲＭ
配列番号５６：ＶＬＤＥＡＤＲＭＬ
配列番号５７：ＧＦＥＰＱＩＲＲＩ
配列番号５８：ＦＳＡＴＦＰＫＥＩ
配列番号５９：ＹＩＦＬＡＶＧＲＶ
配列番号６０：ＲＶＧＳＴＳＥＮＩ
配列番号６１：ＡＴＧＫＤＳＬＴＬ
配列番号６２：ＳＬＴＬＶＦＶＥＴ
配列番号６３：ＦＬＹＨＥＧＹＡＣ
配列番号６４：ＬＹＨＥＧＹＡＣＴ
配列番号６５：ＬＨＱＦＲＳＧＫＳ
配列番号６６：ＱＦＲＳＧＫＳＰＩ
配列番号６７：ＩＬＶＡＴＡＶＡＡ
配列番号６８：ＴＡＶＡＡＲＧＬＤ
配列番号６９：ＩＳＮＶＫＨＶＩＮ
配列番号７０：ＬＰＳＤＩＥＥＹＶ
配列番号７１：ＥＹＶＨＲＩＧＲＴ
配列番号７２：ＬＧＬＡＴＳＦＦＮ
配列番号７３：ＴＳＦＦＮＥＲＮＩ
配列番号７４：ＦＦＮＥＲＮＩＮＩ
配列番号７５：ＮＩＴＫＤＬＬＤＬ
配列番号７６：ＤＬＬＤＬＬＶＥＡ
配列番号７７：ＥＶＰＳＷＬＥＮＭ
配列番号７８：ＡＹＥＨＨＹＫＧＳ
配列番号７９：ＥＨＨＹＫＧＳＳＲ
配列番号８０：ＳＲＦＳＧＧＦＧＡ
配列番号８１：ＦＧＡＲＤＹＲＱＳ
配列番号８２：ＧＧＧＹＧＧＦＹＮ
配列番号８３：ＧＧＹＧＧＦＹＮＳ
配列番号８４：ＧＧＦＹＮＳＤＧＹ
配列番号８５：ＳＤＧＹＧＧＮＹＮ
配列番号８６：ＧＧＮＹＮＳＱＧＶ
配列番号８７：ＮＹＮＳＱＧＶＤＷ

このようなアミノ酸配列としては、例えば、前記配列番号２〜８７に加えて、後記配列番号８８〜９２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
配列番号８８：ＫＱＹＰＩＳＬＶＬＡＰＴＲＥＬ
配列番号８９：ＥＩＩＭＧＮＩＥＬＴＲＹＴＲＰＴＰＶ
配列番号９０:ＫＧＡＤＳＬＥＤＦＬＹＨＥＧＹ
配列番号９１：ＦＶＥＴＫＫＧＡＤＳＬＥＤＦＬＹＨＥＧＹ
当該配列の末端のグルタミン残基は、環化されてピログルタミン酸を形成していてもよい。このような配列としては、例えば、
配列番号９２：ｐｙｒｏＥＹＰＩＳＬＶＬＡ
が挙げられる。

ここで、「配列番号２〜８７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する連続した９〜２０個のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド」とは、１〜数個（例、１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、１個）のアミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加などを有する「配列番号２〜８７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する連続した９〜２０個のアミノ酸配列」からなるペプチドであることができる。
本明細書中、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上）の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。

置換は、保存的置換であることができる。
保存的置換の例としては、例えば、アスパラギン酸とグルタミン酸の間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、グリシンとアラニンとの間での置換等が挙げられる。

配列番号２〜８７のいずれかで表されるアミノ酸配列の中でも好ましくは、例えば、配列番号２〜１７、４０及び４１のいずれかで表されるアミノ酸配列であり、より好ましくは例えば配列番号９、１１〜１７、４０、及び４１のいずれかで表されるアミノ酸配列である。
本発明のがん抗原ペプチドは、好ましくは９〜１５アミノ酸残基、より好ましくは９〜１２アミノ酸残基、更に好ましくは９〜１１アミノ酸残基、特に好ましくは１０アミノ酸残基からなる。
本発明のがん抗原ペプチドは、好ましくは前記の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、後記の配列番号２〜１７及び８８〜９２のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する連続した９〜２０個のアミノ酸配列からなる。
本発明のがん抗原ペプチドは、特に好ましくは、配列番号１７、８８又は８９で表されるアミノ酸配列からなる。

本発明のがん抗原ペプチドは、前記「がん組織の悪性度の評価方法」においてＤＤＸ３Ｘ、又はＤＤＸ３Ｘの部分アミノ酸配列からなるペプチドについて説明したように、公知の方法によって、単離されたペプチドとして調製することができる。
本明細書中、「単離された」とは天然に存在する状態ではないことを意味する。

本発明のペプチドは、塩の形態であってもよい。当該塩としては、例えば、塩酸、及びリン酸のような無機酸の塩；ならびに酢酸、及び酒石酸のような有機酸の塩が挙げられる。
また、本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体又は重合体等の形態として用いることもできる。

本発明のペプチドは、がん抗原ペプチドであることができる。
本明細書中、「がん抗原ペプチド」とは、がん特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に認識され、又はさらにＣＴＬを誘導し、又は／及びＣＴＬを活性化し得るペプチドを意味する。

本明細書中、「認識される」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味することができる。本明細書において、ペプチドを認識するとは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）及び当該ペプチドにＣＴＬがＴ細胞受容体を介して結合することを意味することができる。

また、本明細書中、「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するもの又はその状態を、さらに増強する又は作動させることを意味することができる。特に、「ＣＴＬが活性化する」とは、ＣＴＬがＨＬＡにより提示されたペプチドを認識することにより、例えばＩＦＮ−γのようなエフェクターを産生すること、又は、ＣＴＬが認識した標的細胞に対して細胞傷害性を示すことを意味することができる。

また、本明細書中、「誘導する」とは、ある活性又は作用を殆ど有さないもの又は状態から、その活性又は作用を発生させることを意味する。特に、「抗原特異的なＣＴＬを誘導する」とは、インビトロ又はインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識するＣＴＬを分化及び／又は増殖させることを意味することができる。

また、本明細書中、抗体又は抗原に関して「特異的」とは、免疫学的に選択的に結合することが可能な性質を示す。

がんワクチン
本発明のがんワクチンは、前記した本発明のペプチドをがん抗原として含有する。

本発明のペプチドは、単独で、又は各種担体とともに、がんワクチンに製剤することができる。
本発明のがんワクチンの剤形は、経口投与剤又は非経口投与剤のいずれであってもよい。一般的には非経口投与剤が好ましい。非経口投与剤としては、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、座剤などが挙げられる。

本発明のがんワクチンが経口投与剤である場合は、本発明のペプチドを、薬学的に許容されており、かつ本発明のペプチドのがん抗原としての活性を妨げない賦形剤とともに、がんワクチンに製剤することができる。当該賦形剤としては、例えば、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、重合アミノ酸、及びアルブミン等が挙げられる。

本発明のがんワクチンが非経口投与剤である場合は、本発明のペプチドを、薬学的に許容されており、かつ本発明のペプチドのがん抗原としての活性を妨げない担体とともに、がんワクチンに製剤することができる。当該担体としては、例えば、水、食塩、デキストロース、エタノール、グリセロール、及びＤＭＳＯ等が挙げられる。
本発明のがんワクチンは、更に、所望により、アルブミン、湿潤剤、及び／又は乳化剤などを含んでいてもよい。
また、細胞性免疫の賦活化のために、本発明のペプチドは適当なアジュバントとともに使用することができる。本発明のがんワクチンは、当該アジュバントを含有してもよい。

更に、本発明のペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によるこのペプチドの認識を増強する化合物、又は、このペプチドを免疫学的に認識する抗体などとともに使用することができる。本発明のがんワクチンは、当該化合物及び／又は抗体を含有してもよい。

本発明のがんワクチンは、その剤形に応じた慣用の方法で製造できる。

本発明のがんワクチンは、好ましくは、がんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制のために使用される。

本発明のがんワクチンは、その剤形に応じた投与方法により、ヒトに投与できる。

本発明のがんワクチンの投与量は、ヒト成人に対して、有効成分である本発明のペプチドとして、例えば、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日程度、好ましくは０．１ｍｇ〜３０ｍｇ／日程度を投与できる。投与間隔は、患者の症状、及び投与目的等に応じて適宜定めればよい。

養子免疫用細胞の製造方法
本発明の一態様において、養子免疫用細胞の製造方法は、
抗原提示能を有する細胞をＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドでパルスする段階を含む。

抗原提示能を有する細胞としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、及び又はＢリンパ球等が挙げられる。

パルスは、例えば、抗原提示能を有する細胞を、濃度１〜１０μｇ／ｍl程度のＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドを含む培地中、温度２０〜３０℃程度で３０分間〜１時間程度インキュベートすることにより行える。これにより、細胞表面に、ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬにより認識され得るがん抗原ペプチドを提示する細胞が得られる。当該細胞は単離された細胞であることができる。

当該「ＤＤＸ３Ｘの部分ペプチド」は、好ましくは、本発明のペプチドである。

また、ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬにより認識され得る、ＤＤＸ３Ｘ由来ペプチドを提示する細胞は、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることができる。

このようにして得られた、ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドでパルスされたＡＰＣは、ＤＤＸ３Ｘ由来ペプチドを提示するＡＰＣであることができ、ＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の誘導剤として使用することができる。
当該ＡＰＣは、養子免疫用細胞として、養子免疫療法のためにヒトに投与することができる。

当該ＡＰＣは、ヒトに投与する前に、公知の方法で培養してもよい。

また、このようにして得られた、ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドでパルスされたＡＰＣとともに、ＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞をインキュベートすることにより、ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬを生体外で誘導することができる。このようにして得られたＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬは単離された細胞であることができる。
当該前駆細胞としては、ＣＴＬに分化できる細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブ細胞、メモリー細胞等が挙げられる。

このようにして得られた、当該ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬもまた、養子免疫用細胞として、養子免疫療法のためにヒトに投与することができる。

当該ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬは、ヒトに投与する前に、公知の方法で培養してもよい。

すなわち、本発明の別の一態様において、本発明の養子免疫用細胞の製造方法は、
抗原提示能を有する細胞をＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドに暴露して当該ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドに由来する抗原を提示する細胞を得る段階、及び
当該細胞を用いてＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞を誘導する段階
を含む。

前記ＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞は、好ましくは、ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞である。

得られた養子免疫用細胞は、そのまま、又は各種担体とともに養子免疫用細胞組成物に製剤することができる。
養子免疫用細胞組成物の剤形は、経口投与剤又は非経口投与剤のいずれであってもよい。一般的には非経口投与剤が好ましい。非経口投与剤としては、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、座剤などが挙げられる。

養子免疫用細胞組成物が経口投与剤である場合は、得られた養子免疫用細胞を、薬学的に許容されており、かつ当該養子免疫用細胞の活性を妨げない賦形剤とともに、養子免疫用細胞組成物に製剤することができる。当該賦形剤としては、例えば、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、重合アミノ酸、及びアルブミン等が挙げられる。

本発明の養子免疫用細胞組成物が非経口投与剤である場合は、得られた養子免疫用細胞を、薬学的に許容されており、かつ当該養子免疫用細胞の活性を妨げない担体とともに、養子免疫用細胞に製剤することができる。当該賦形剤としては、例えば、水、食塩、デキストロース、エタノール、グリセロール、及びＤＭＳＯ等が挙げられる。

がんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制剤
本発明の、がんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制剤は、
ＤＤＸ３Ｘの発現又は活性を阻害する化合物を含有する。

ＤＤＸ３Ｘの発現を阻害する化合物としては、例えば、ＤＤＸ３Ｘ遺伝子のセンス鎖の一部又は全部の領域の配列（以下、単に標的配列と称する場合がある）に対して相補的な塩基配列（以下、単にアンチセンス配列と称する場合がある）を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
当該ポリヌクレオチドとしては、例えば、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）及びｓｈＲＮＡ（small hairpin RNA）が挙げられる。

前記標的配列の決定は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチによって実施、決定することができる。好ましくは、前記標的配列は、該ＤＤＸ３Ｘ遺伝子のエキソン部位から選択される。また、前記標的配列は、標的ＤＤＸ３Ｘ遺伝子の配列に対する特異性が高いことがより好ましい。

前記標的配列の塩基数は、例えば、１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基、より好ましくは１８〜２５塩基、更に好ましくは１９〜２３塩基、特に好ましくは１９〜２１塩基である。

前記アンチセンスヌクレオチドはＲＮＡであっても、ＤＮＡであってもよい。また、前記アンチセンスヌクレオチドは、ＤＤＸ３Ｘ遺伝子の発現を抑制し得る効果を有する限り、１から数塩基（例、１〜２塩基、１〜３塩基、１〜５塩基）が、少なくとも何れかの末端に付加されているか、内部において欠失、置換又は付加されている前記アンチセンス配列を有していてもよい。

前記ｓｉＲＮＡとしては、例えば、前記標的配列を含むポリヌクレオチド（センス鎖）と、アンチセンス配列を含むポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）からなる２本鎖ポリヌクレオチドを使用することができる。

前記センス鎖、及び前記アンチセンス鎖は、前記標的配列より、１若しくは数塩基（例、１〜２塩基、１〜３塩基、１〜５塩基）長程長くなっていてもよく、例えば、末端（好ましくは３´末端）に２塩基のウラシル（Ｕ）が付加されていてもよい。また、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖のいずれか又は両方は、ＤＤＸ３Ｘ遺伝子の発現を抑制し得る効果を有する限り、が１から数塩基（例、１〜２塩基、１〜３塩基、１〜５塩基）のＵ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＡが、少なくとも何れかの末端に付加されているか、内部において欠失、置換又は付加されている前記アンチセンス配列又は標的配列を有していてもよい。

前記ｓｈＲＮＡ（small hairpin RNA）としては、例えば、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖、及びアンチセンス鎖を含み、これらが、ヌクレオチド配列、非ヌクレオチド配列又はこれらの組み合わせからなる調節部分（ループ部分）で連結されたものが挙げられる。

前記調節部分がヌクレオチド配列である場合、前記ヌクレオチド配列として、１塩基以上１０キロ塩基未満のヌクレオチド配列、好ましくは１塩基長から数百塩基長のヌクレオチド配列、更に好ましくは１塩基長から数十塩基長のヌクレオチド配列、特に好ましくは１塩基長から２０塩基長のヌクレオチド配列、あるいはスプライシングなどの細胞に備わる機構により細胞質において前記の長さのポリヌクレオチドを生じる配列からなるヌクレオチド配列が例示できる。また、前記調節部分を構成するヌクレオチド配列は、前記センス配列、及び前記アンチセンス配列を含んでもよい。さらに、前記調節部分を構成するヌクレオチド配列としては、ポリＡ、ｔＲＮＡ、Ｕｓｎ ＲＮＡ、レトロウイルス由来のＣＴＥ配列などの細胞質移行性配列；ＮＦκβ結合配列、Ｅ２Ｆ結合配列、ＳＳＲＥ、ＮＦ−ＡＴなどのデコイ活性を有する配列；アデノウイルスのＶＡ１又はＶＡ２ ＲＮＡなどのインターフェロン誘導抑制配列；ＲＮａｓｅ抑制活性、アンチセンス活性、リボザイム活性等を有する配列；ｔＲＮＡあるいは発現部位を特定するためのマーカー配列；検出のための大腸菌での選択マーカー配列などのいずれ１つ又はそれらの２以上の組み合わせ配列であってもよい。デコイ活性等の部分的二重鎖を必要とする機能配列は相補的なヌクレオチドを含むことにより作製されてもよい。さらに調節部分の配列の内部にイントロンのドナー配列、アクセプター配列を含むスプライシングに必要な配列を備えさせ、これによりスプライシング機構を有する細胞内において、調節部分の配列の一部が切り出されて再度連結されるように設計していてもよい。これら調節部分の配列の構成により、より所望のＲＮＡ機能抑制効果を増す効果や前記センス配列、及び前記アンチセンス配列の安定性が得られる。

また、前記調節部分が非ヌクレオチド配列である場合、その具体例としては、ポリアミド骨格を有する核酸類似の化学合成アナログのＰＮＡ（peptide nucleic acid）を例示できる。

そして更に、本発明では、ＤＤＸ３Ｘ遺伝子発現抑制物として、前記ＤＤＸ３Ｘ遺伝子の転写を抑制するための前記ＤＤＸ３Ｘ遺伝子に対するデコイ型核酸を使用することもできる。

ＤＤＸ３Ｘの活性を阻害する公知の化合物としては、国際公開第2011/039735号パンフレットに記載されている化合物、具体的には、式：
［式中、
ＺはＣＨ_２又はＳを表す。
Ｘ及びＹは独立してＯ又はＳを表す。
ｎは０及び４の範囲内に含まれる。
Ｂは存在しないか、
を表し（ｑは０及び４の範囲内に含まれ、
Ｒ^２’は水素、−（ＣＨ_２）_ｗ’−ＯＨ，−（ＣＨ_２）_ｗ’−ＮＨ_２（ｗ'は１〜３の整数であり）を表す。）、ＢはまたＣ＝でもある。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、それぞれ独立して
Ｈ、炭素数１〜６個の直鎖又は分岐のアルキル基、非置換もしくは置換のフェニル基、非置換又は置換のフェニルアルケニル基、非置換もしくは置換のフェニルアルキニル基、非置換もしくは置換のビフェニルアルキル基、非置換もしくは置換の複素環基、非置換もしくは置換の多環式基、非置換もしくは置換の脂環基、又は（Ｒ^１ａ−）_ｍ（Ｌ−）_ｐＲ^１ｂ−
（式中、Ｒ^１ａ及びＲ^１ｂは、同一又は異なって、非置換もしくは置換の複素環基又は非置換もしくは置換のフェニル基を表し、Ｒ^１ａはまた非置換もしくは置換の多環式基も表し、Ｌは、−（ＣＨ_２）_ｑ−、−ＨＣ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＮＨＣＯＮＨ−又は−ＮＲ^１Ｃ−からなる群から選ばれる２価の連結基を表し、Ｒ^１Ｃは、水素又はアルキルであり、ｍ及びｐはそれぞれ独立して０又は１であり、及び
ｑは１〜３の整数である）
からなる群から選ばれ；あるいは
Ｒ^２及びＲ^３は、一緒になって、シクロアルキル、シクロアルケニル、非芳香族複素環、又は縮合式もしくはポリ環式環、２−オキシインドール（当該シクロアルキル、シクロアルケニル、縮合式もしくは多環式非芳香族複素環は前記の群から選ばれる１又は２以上の置換基で置換されていてもよい）を形成してもよい。
Ｗは存在しないか、又は独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣＨ_２又はＮ−Ｒ^５（式中、Ｒ^５は直鎖状又は分岐状の炭素数１〜６個のアルキル基である）を表す。
Ａは存在しないか、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、又はＮＨＣＯＮＨを表す。
Ｒ^４は、Ｈ、非置換又は置換の炭素数１〜６個のアルキル、非置換又は置換のアルケニル、非置換又は置換のアルキニル、ハロゲン、ハロアルキル、ＣＯＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＣＮ、ＯＺ’又はＳＺ’（式中、Ｚ’はＨ又は非置換又は置換の炭素数１〜６個のアルキルである）を表す。］
で表される化合物が挙げられる。

さらに、ＤＤＸ３Ｘの活性を阻害する公知の化合物としては、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 22, Issue 5, 1 March 2012, Pages 2094-2098に記載の化合物、具体的には次の化合物
が挙げられる。

さらに、ＤＤＸ３Ｘの活性を阻害する公知の化合物としては、次の化合物：
が挙げられる。

これらの化合物は、薬学上許容される塩の形態であってもよい。

ヘリカーゼであるＤＤＸ３Ｘ阻害により、次の４つのｍｉＲＮＡ：hsa-mir-301a、hsa-mir-301b、hsa-mir-429、及びhsa-miR-3922が減少する。従って、これらのｍｉＲＮＡの１以上（好ましくは全て）の活性を阻害することは、実質的にＤＤＸ３Ｘの活性を阻害することを意味する。すなわち、ｍｉＲＮＡ活性を阻害する化合物は、本発明における、ＤＤＸ３Ｘの活性を阻害する化合物に含まれる。
これらのｍｉＲＮＡの塩基配列を以下に示す。

hsa-mir-301a（miRBaseアクセッション番号 MI0000745）：
ACUGCUAACGAAUGCUCUGACUUUAUUGCACUACUGUACUUUACAGCUAGCAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGCAUCUGAAAGCAGG（配列番号９３）

hsa-mir-301b（miRBaseアクセッション番号 MI0005568）：
GCCGCAGGUGCUCUGACGAGGUUGCACUACUGUGCUCUGAGAAGCAGUGCAAUGAUAUUGUCAAAGCAUCUGGGACCA （配列番号９４）

hsa-mir-429（miRBaseアクセッション番号 MI0001641）：
CGCCGGCCGAUGGGCGUCUUACCAGACAUGGUUAGACCUGGCCCUCUGUCUAAUACUGUCUGGUAAAACCGUCCAUCCGCUGC （配列番号９５）

hsa-miR-3922（miRBaseアクセッション番号 MI0016429）：
GGAAGAGUCAAGUCAAGGCCAGAGGUCCCACAGCAGGGCUGGAAAGCACACCUGUGGGACUUCUGGCCUUGACUUGACUCUUUC （配列番号９６）

ｍｉＲＮＡ活性を阻害する化合物としては、当該ｍｉＲＮＡの一部又は全部の領域（以下、単に標的配列と称する場合がある）に対して相補的な塩基配列（アンチセンスｍｉＲＮＡ配列）を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

当該ポリヌクレオチドとしては、例えば、アンチセンスヌクレオチドが挙げられる。

前記標的配列の塩基数は、例えば、１０〜３０塩基、好ましくは１０〜２０塩基、より好ましくは１２〜１８塩基、更に好ましくは１４〜１６塩基である。

前記アンチセンスヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＬＮＡである。また、前記アンチセンスヌクレオチドは、その配列において、ｍｉＲＮＡの活性を抑制し得る効果を有する限り、１から数塩基（例、１〜２塩基、１〜３塩基、１〜５塩基）が、少なくとも何れかの末端に付加されているか、内部において欠失、置換又は付加されている前記アンチセンスｍｉＲＮＡ配列を有していてもよい。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

以下の実施例では、以下の材料及び方法を用いた。

材料及び方法
マウス
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）系統の雌のマウスを、日本クレア社より購入し、無菌の環境で飼育し、実験に使用した。
全ての動物実験は、新潟大学動物実験倫理委員会により承認された実験である。

腫瘍細胞
B6由来のメラノーマ細胞であるB16F10を、インビトロで維持した。親腫瘍細胞を フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗CD133モノクローナル抗体（13A4）と抗PEマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）で標識した。CD133陽性腫瘍細胞とCD133陰性腫瘍細胞をautoMACS（商品名、ミルテニーバイオテク社）を使用して、メーカー提供のプロトコールに従って分離した。細胞の純度は、90％より高かった。

モノクローナル抗体及びフローサイトメトリー
マウスＣＤ４（ＧＫ１．５、Ｌ３Ｔ４）、ＣＤ８（２．４３、Ｌｙｔ−２）、ＣＤ３（２Ｃ１１）及びマウスＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ１４）に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手した。抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ８ モノクローナル抗体、及び抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体は、亜致死線量（５００ ｃＧｙ）の放射線を照射したＤＢＡ／２マウスの腹水として得た。ＰＥ標識抗ＣＤ８０（１６−１０Ａ） モノクローナル抗体、抗ＣＤ８６（ＧＬ１） モノクローナル抗体、抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ１４） モノクローナル抗体、抗ＣＤ８（２．４３） モノクローナル抗体並びに抗ＣＤ２５（ＰＣ６１） モノクローナル抗体、フルオレッセンイソチアネート（ＦＩＴＣ）標識抗Ｔｈｙ１．２（３０−Ｈ１２）モノクローナル抗体及びａｎｔｉ−ＣＤ４（ＧＫ１．５） モノクローナル抗体は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社から購入した。０．５〜１×１０^６個の細胞を、標識抗体を用いて直接免疫染色法で染色し、細胞表面の表現型（フェノタイプ）を解析した。それぞれの検体（サンプル）について、ＦＡＣＳｃａｎ（商品名）フロー式マイクロフルオロメーターを使用して、総数１０，０００個の細胞について解析を行った（ベクトン デッキンソン社）。アイソタイプのコントロールとしてＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社から購入したＰＥ標識サブクラス認識抗体を使用した。検体は、解析ソフトＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商品名、ベクトン デッキンソン社）を使用して解析した。

Ｔ細胞の分別（フラクション）
ナイロンウールカラム（和光純薬社）を使用して、リンパ節（ＬＮ）細胞からＴ細胞を濃縮した。高純度（＞９０％）のＣＤ６２Ｌ低発現（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ）細胞を得るために、リンパ節のＴ細胞をさらに、ヤギ抗ラットイムノグロブリン抗体（Ｉｇ Ａｂ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）／抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ１４）モノクローナル抗体でコーティングしたＴ−２５フラスコを用いたパニング法と、ヒツジ抗ラットＩｇ Ａｂ／抗ＣＤ６２Ｌ モノクローナル抗体結合ＤｙｎａＢｅａｄｓ Ｍ−４５０ （Ｄｙｎａｌ社）による磁気ビーズ法を用いて分離した。いくつかの実験では、さらに、Hiura T, Kagamu H, Miura S, Ishida A, Tanaka H, Tanaka J, et al. Both regulatory T cells and antitumor effector T cells are primed in the same draining lymph nodes during tumor progression. J Immunol. 2005;175:5058-66で述べた磁気ビーズを用いたディプリーション法により、ＣＤ４陰性細胞とＣＤ８陰性細胞に分離した。高純度のＣＤ４陽性細胞を純化する目的では、抗ＣＤ４モノクローナル抗体結合ＤｙｎａｂｅａｄとＤｅｔａｃｈａｂｅａｄｓ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によるポジティブセレクション法を用いた。

骨髄由来樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）を、Fujita N, Kagamu H, Yoshizawa H, Itoh K, Kuriyama H, Matsumoto N, et al. CD40 ligand promotes priming of fully potent antitumor CD4(+) T cells in draining lymph nodes in the presence of apoptotic tumor cells. J Immunol. 2001;167:5678-88に記載された方法で、骨髄細胞（ＢＭ）から生じさせた。簡潔に述べると、マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナントマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｍＧＭ−ＣＳＦ；キリンビール社より譲渡）を添加した完全培地（ＣＭ培地）を使用して、Ｔ−２５フラスコの中で、３７℃で２時間インキュベートした。非接着細胞を分離し、別の新たなフラスコで培養を続けた。６日目に、非接着細胞を穏やかなピペッティングにより回収した。完全培地は１０％のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）クオリファイド（エンドトキシンフリー）非働化ウシ胎児血清、非必須アミノ酸 ０．１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム １μＭ、ペニシリン １００Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン １００μｇ／ｍｌ（全てライフテクノロジー社）及び２−メルカプトエタノール ５×１０^−５Ｍ（シグマケミカル社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地からなった。

ＤＣ／腫瘍ワクチン所属リンパ節細胞
骨髄細胞と樹状細胞を完全培地の中で、同数の放射線照射腫瘍細胞（５，０００ ｃＧｙ）とともに一晩共培養した。樹状細胞と腫瘍細胞の混合接種細胞数１×１０^６個となるように、Ｂ６マウスの両側腹部皮下に接種した。接種したＢＭ−ＤＣ／腫瘍ワクチン所属リンパ節として鼡径部リンパ節を摘出した。Watanabe S, Kagamu H, Yoshizawa H, Fujita N, Tanaka H, Tanaka J, et al. The duration of signaling through CD40 directs biological ability of dendritic cells to induce antitumor immunity. J Immunol. 2003;171:5828-36.で述べた方法により、単細胞浮遊液を調製した。

養子免疫療法
皮下腫瘍モデルを作成するため、１００μｌのハンクス液（Hanks' balanced salt solution：ＨＢＳＳ）に懸濁したＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を、Ｂ６マウスの正中線上皮下に接種した。接種後２日目又は３日目に、マウスに、亜致死量（５００ｃＧｙ）の放射線を照射し、その後ＢＭ−ＤＣ／腫瘍ワクチン所属リンパ節から分離したＴ細胞を静注した。これらのリンパ節細胞は、Fujita N, Kagamu H, Yoshizawa H, Itoh K, Kuriyama H, Matsumoto N, et al. CD40 ligand promotes priming of fully potent antitumor CD4(+) T cells in draining lymph nodes in the presence of apoptotic tumor cells. J Immunol. 2001;167:5678-88で述べたように、十分な細胞数を得るために、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（２Ｃ１１）で刺激し、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ２とともに３日間完全培地で培養したものである。皮下腫瘍の長径とそれに垂直な短径を、キャリパーを使用して測定した。

サイトカインＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞を、完全培地中で、固相化抗ＣＤ３モノクローナル抗体、又は抗原パルスしたＢＭ−ＤＣで刺激した。上清を回収し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１７の濃度を、マウスＩＦＮ−γ、ＩＬ−４又はＩＬ−１７ ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を使用して、定量的サンドイッチ酵素抗体法によって測定した。方法は、メーカーのプロトコールに従った。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能測定
ＣＤ３刺激の前に、メラノーマ細胞を５μＭの二酢酸５−（６）−カルボキシフルオレセイン，Ｎ−スクシンイミジルエステル（5-(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl diester（ＣＦＳＥ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を含むハンクス液の中で３７℃、１５分間ラベルし、２回洗浄した。ＣＦＳＥラベルされた細胞と、ラベルされなかった細胞の比は、１：１０であった。１ × １０^５／ｍｌの前記腫瘍細胞を完全培地の中で培養し、計数し、及びマイクロフルオロメーターを使用して解析して、ＣＦＳＥラベルされた細胞の数を決定した。

イムノブロット解析
細胞を回収し、プロテアーゼインヒビター混合液（Ｓｉｇｍａ社）を含むノニデットＰ−４０バッファーに溶解した。同じμｇ量のタンパク質を、７．５％のゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜（ミリポア社）に転写した。腫瘍細胞に対するイムノブロッティングは、ＤＤＸ３Ｘ（Ｓｉｇｍａ社）とβアクチン（Ｓｉｇｍａ社）に対する抗体を用いて行った。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇ及び抗ウサギＩｇ（ＢｉｏＲａｄ社及びＤａｋｏ社）を使用した。抗体が結合したタンパク質は、ＥＣＬキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使って、可視化した。全ての解析について、少なくとも３回の独立した実験を行った。

ｓｈＲＮＡによるＤＤＸ３Ｘのノックダウン
ＤＤＸ３Ｘの発現抑制細胞は、ｓｈＲＮＡレンチウイルスプラスミド（ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ；シグマ）を使用して作成した。ＤＤＸ３Ｘ標的配列を含むオリゴヌクレオチドは、ＣＣＧＧＡＣＧＴＴＣＴＡＡＧＡＧＣＡＧＴＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＧＡＣＴＧＣＴＣＴＴＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号：９７）である。Ｂ１６ ＣＤ１３３陽性細胞を新鮮な培地に加え、それぞれのウェルに、８μｇ／ｍｌのｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅを加えた。メーカーのプロトコールにしたがって、これらの細胞に、ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏプラスミドパッケージングベクターを導入した。遺伝子導入後約１６時間で培地を交換し、その後さらに４８〜７２時間培養した。被験細胞は、ピューロマイシン ２．０μｇ／ｍｌを含む新鮮培地で培養され、３〜４日ごとに新しいピューロマイシン ２．０μｇ／ｍｌを含む培地で、薬剤耐性が同定されるまで、培地交換を行った。最低５つのピューロマイシン耐性コロニーをピックアップし、各クローン毎に解析のために細胞を増やした。ＤＤＸ３Ｘのノックダウンの効果は、イムノブロッティングで確認した。

統計学的解析
グループ毎の比較は、スチューデントのｔ検定により行った。動的な腫瘍増殖データは、多変量一般線型モデルにより解析した。差は、Ｐ＜０．０５の場合、有意差があるとした。統計学的な解析は、ＳＰＳＳ統計解析ソフト（ＳＰＳＳ社）又は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアを使用した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）。

ＤＤＸ３Ｘ及びその部分ペプチド
ＤＤＸ３Ｘ及びその部分ペプチドとしては、化学合成法により調製したものを使用した。
ＤＤＸ３Ｘのアミノ酸配列は、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列である。
ペプチドＪのアミノ酸配列は、前記配列番号８９で表されるアミノ酸配列である。
である。
ペプチドＫのアミノ酸配列は、前記配列番号８８で表されるアミノ酸配列である。
ＤＤＸ３Ｘ−１０ｍｅｒのアミノ酸配列は、前記配列番号１７で表されるアミノ酸配列である。
ＤＤＸ３Ｘ−１５ｍｅｒのアミノ酸配列は、前記配列番号９０で表されるアミノ酸配列である。
ＤＤＸ３Ｘ−２０ｍｅｒのアミノ酸配列は、前記配列番号９１で表されるアミノ酸配列である。
である。

実施例１
ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の、ＣＤ１３３陽性腫瘍抗原特異的サイトカイン放出
発明者らは、合成ＤＤＸ３Ｘ抗原でプライミングされたＴ細胞がＣＤ１３３陽性メラノーマ細胞を認識することができるかどうか検討した。この実験のために、ＣＤ６２Ｌ低発現Ｔ細胞（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ）を、合成ＤＤＸ３Ｘでパルスされた樹状細胞を接種して得た所属リンパ節から分離した。
９６ウェルプレート中で、リンパ節から分離した１×１０^５個のＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を、２００μｌの完全培地（ＣＭ）中の１×１０^４個の樹状細胞で４８時間刺激した。刺激用の樹状細胞は、同数の、５，０００ｃＧｙ放射線を照射したＣＤ１３３陽性腫瘍細胞又はＣＤ１３３陰性腫瘍細胞、又は合成ＤＤＸ３Ｘ（５μｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。樹状細胞は共培養に先立って、ＣＤ１１ｃマイクロビーズで精製した。
発明者らは、こうして得られたＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、メラノーマＣＳＣ特異的にＩＦＮ−γとＩＬ−１７を分泌することを発見した。しかしながら、ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＤ１３３陰性メラノーマ及びＣＤ１３３陽性メラノーマ細胞の両方に応答した（図２、図３）。
次に発明者らは、メラノーマＣＳＣ特異的Ｔ細胞が、ＤＸＸ３Ｘを認識し、サイトカインを産生するかどうかを検討した。その結果、ＣＤ１３３陽性メラノーマ細胞をワクチン接種して得た、メラノーマＣＳＣ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、ＤＤＸ３Ｘ特異的に、サイトカインを産生することが明らかとなった（図４、図５）。驚くべきことに、メラノーマＣＳＣ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、メラノーマＣＳＣそのものによる刺激よりも、ＤＤＸ３Ｘ刺激において、より多くのサイトカインを産生した。
従って、ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＤＤＸ３Ｘを発現する腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を有し、養子免疫療法に使用できる。

実施例２
ＤＤＸ３Ｘのワクチン接種によるメラノーマ細胞に対する防御免疫の誘導
合成ＤＤＸ３Ｘをワクチン接種することにより、Ｂ１６メラノーマ細胞に対する防御免疫が誘導されるかどうか実験するために、５μｇ／ｍｌのＤＤＸ３Ｘをパルスした樹状細胞、５μｇ／ｍｌのオブアルブミン（ＯＶＡ）をパルスした樹状細胞、又は５，０００ｃＧｙ放射線照射したＣＤ１３３陽性腫瘍細胞と８時間共培養した樹状細胞を、マウスの右側腹部の皮下にワクチン接種した。１４日後に、前記マウスの腹部の正中線に沿って２×１０^６個のメラノーマ細胞を皮下接種した。それぞれのグループのマウスの数は、５匹である。図６に示すように、無処理の樹状細胞又はＯＶＡをパルスした樹状細胞による処理を受けたマウスと比較して、ＤＤＸ３Ｘをパルスした樹状細胞のワクチン接種を受けたマウスでは腫瘍の成長が有意に抑制された。さらに、ＤＤＸ３Ｘをパルスした樹状細胞をワクチン接種したマウスは、放射線照射されたＣＤ１３３陽性腫瘍細胞と共培養した樹状細胞を接種したマウスよりも著しく強力な防御免疫を示した。

実施例３
ＤＤＸ３Ｘワクチン接種の、形成した皮膚腫瘍に対する治療効果
更に、ＤＤＸ３Ｘのワクチン接種が確立した腫瘍に対する治療効果を有するかどうかを検討した。正中に１×１０^６のＢ１６メラノーマ細胞を腹部正中線に沿って皮下接種した後、２、９及び１６日目に１×１０^６の樹状細胞を右側腹部に接種した。５μｇ／ｍｌのＤＤＸ３Ｘ又はＯＶＡをパルスした１×１０^６個の樹状細胞をマウスの右側腹部に皮下接種した。それぞれのグループのマウスの数は、１２匹で行った。それぞれのマウスの腫瘍成長曲線を図７に示す。ＤＤＸ３Ｘで刺激された樹状細胞をワクチン接種した１２匹のマウスのうち６匹は、最終的には、治癒した。他のＤＤＸ３Ｘをパルスした樹状細胞を摂取したマウスでは、皮膚腫瘍の増殖が著しく抑えられた。無処理又はＯＶＡをパルスした樹状細胞をワクチン接種したマウスは、全て腫瘍により死亡した。

実施例４
ＣＤ１３３陽性メラノーマの免疫原性におけるＤＤＸ３Ｘの意義の確認
以前より、Ｂ１６メラノーマ細胞が、多くの免疫原性タンパク質を有していることが示されている。
ここで、ＣＤ１３３陽性メラノーマの免疫原性におけるＤＤＸ３Ｘの意義を明らかにするために、発明者らは、ｓｈＲＮＡによるＤＤＸ３Ｘのノックダウンにより、ＤＤＸ３Ｘを欠いたＣＤ１３３陽性メラノーマ細胞（ＤＤＸ３Ｘ欠失ＣＤ１３３陽性Ｂ１６細胞）を構築した。総線量５，０００ｃＧｙ放射線を照射した、モック−ｓｈＲＮＡ導入ＣＤ１３３陽性Ｂ１６細胞、及びＤＤＸ３Ｘ欠失ＣＤ１３３陽性Ｂ１６細胞を、樹状細胞（ＤＣ）と８時間共培養した。ＣＤ１１ｃマイクロビーズとａｕｔｏＭＡＣＳ（商品名）で精製した１×１０^６個のＣＤ１１ｃ陽性細胞を、Ｂ６マウスの皮下に接種した。免疫２週間後に、そのマウスの腹部正中線に沿って、２×１０^６個のＢ１６メラノーマ細胞を皮下に接種した。それぞれのグループのマウスの数は５匹であった。図８に示すように、ＣＤ１３３陽性親細胞、又は遺伝子導入のコントロールＣＤ１３３陽性モック遺伝子導入腫瘍細胞は、効果的な防御免疫を有した。これに対して、ＤＤＸ３Ｘを欠いたＣＤ１３３陽性腫瘍細胞では、抗腫瘍防御免疫を誘導しなかった。すなわち、ＤＤＸ３Ｘを欠いたＣＤ１３３陽性メラノーマは、ワクチン効果を失っていた。

実施例５
小細胞肺癌患者末梢血液１５ｍｌを採取した。リンホプレップ（商品名）（コスモ・バイオ株式会社）を用いた密度勾配遠心法により単核球細胞分画を採取し、ＣＤ１４^＋細胞をＣＤ１４マイクロビーズとａｕｔｏＭＡＣＳを用いて分離した。ＣＤ１４^＋細胞をｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１ｎｇ／ｍｌ，キリンビールより譲渡）とＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて培養することにより、５日目までに樹状細胞に分化、成熟させ用いた。樹状細胞は合成ＤＤＸ３Ｘ蛋白質（３．３μｇ／ｍｌ）又は同じ濃度のペプチド（ペプチドＪ、ペプチドＫ）を含んだ培養液で一晩培養した後、ＣＤ１１ｃマイクロビーズとａｕｔｏＭＡＣＳによりＣＤ１１ｃ陽性細胞を純化し、抗原提示細胞として使用した。ＣＤ１４⁻分画として得られた細胞からナイーヴＴ細胞と制御性Ｔ細胞を除去するためＣＤ６２Ｌ^ｈｉｇｈ細胞を抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（１Ｈ３）結合ダイナビーズにより除いた。このＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＣＤ１４⁻細胞をＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商品名）Ｔ細胞活性化プレート（ベクトンディッキンソン社）上で４８時間培養し、その後２０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２（シオノギ製薬より譲渡）を含んだ培養液で４日間培養した。この結果１０倍程に増加した細胞の９５％以上がＣＤ３^＋Ｔ細胞であることをＦＡＣＳにより確認し、このＣＤ３^＋Ｔ細胞を反応細胞として使用した。反応細胞１×１０^５と抗原提示細胞 １×１０^４を２００μｌの培養液で丸底９６ウェル・プレートにおいて２４時間培養し、回収した上清のＩＦＮγ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。ポジティブコントロールとして抗ＣＤ３抗体が固相化された９６ウェル・プレートでレスポンダー細胞 １×１０^５を培養した上清を用いた。結果を図９に示す。

実施例６
ＤＤＸ３Ｘ由来ペプチドによるＣＴＬの誘導及びＩＦＮγ産生
ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬの誘導、及びＤＤＸ３Ｘ由来ペプチド刺激によるＩＦＮγ産生評価を実施した。
使用した試薬類を表１に、誘導に用いたペプチドを表２に示す。

＜培地類の調製＞
Ｈｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍは５６℃，３０ｍｉｎで非働化を行い，０．２２μｍ フィルター（Ｓｅｒｕｍ Ａｃｒｏｄｉｓｃ，Ｐａｌｌ社）を用いて濾過して用いた。培地（９０％ ＡＩＭ−Ｖ＋１０％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ）は，５００ｍＬのＡＩＭ−Ｖに５０ｍＬの非働化済みＨｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍをクリーンベンチ内で添加、及び混合したものを用いた。ヘパリン含有ＨＢＳＳは，５００ｍＬのＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに１０ｍＬのヘパリンナトリウム注（１００００Ｕ／ｍＬ）を添加・混合したもの（２０Ｕ／ｍＬヘパリン）を用いた。何れも使用時までは４℃にて保存した。

＜採血対象者の選抜＞
採血対象者は、ＨＣＴ１１６が有するＨＬＡ−Ａ０２０１、又はソフトウエア（デカマーを選択した。）を用いた計算によってＤＤＸ３Ｘペプチドが高親和性を示すと予測されたＨＬＡ−Ａ＊２６０１を有する健常人ボランティアを選抜した。なおＨＬＡ−Ａ＊０２０１を有するボランティアは６名，ＨＬＡ−Ａ＊２６０１を有するボランティアは５名であった。

＜末梢血由来単核球（ＰＢＭＣ）の調製＞
健常人ボランティアより得られた末梢血（４０ｍＬ）を２０ｍＬあたり１３ｍＬのヘパリン含有ＨＢＳＳで希釈し，Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ１５ｍＬを入れたリンパ球分離チューブ（Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（商品名）、Ｇｒｅｉｎｅｒ社）へ重層した。遠心分離（２０００ｒｐｍ，２０℃，２０ｍｉｎ）後，中間層をＰＢＭＣとして５０ｍＬ遠沈管に回収し，倍量のヘパリン含有ＨＢＳＳで希釈して再び遠沈した（１８００ｒｐｍ，２０℃，５ｍｉｎ）。得られたペレットを１０ｍＬのヘパリン含有ＨＢＳＳで懸濁し，遠沈した（１２００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）。この操作を再度繰り返した。得られたＰＢＭＣのペレットを培地１ｍＬで懸濁し，１．５×１０^７細胞をＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬ誘導用に用い，残りを再刺激時の抗原提示細胞用に用いた。再刺激時の抗原提示細胞用ＰＢＭＣについてはセルバンカーに懸濁して−８０℃凍結保存し，使用時に融解して用いた。

＜ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＴＬの誘導＞
ＰＢＭＣ １．５×１０^７細胞 を１．５×１０^６細胞／ｗｅｌｌで２４ウェルプレートへ播種した（Ｄａｙ０）。次に各ｗｅｌｌにＤＤＸ３Ｘ由来ペプチド３種類（最終濃度は各２０μｇ／ｍＬ）及びＩＬ−７（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を添加し３７℃，５％ ＣＯ２で培養した。
１週間後（Ｄａｙ７），再刺激を行った。再刺激にはまず，抗原提示細胞としてＤａｙ０で凍結保存したＰＢＭＣを融解し，細胞数を３×１０^６細胞／ｍＬ以下に調製しＤＤＸ３Ｘ由来ペプチド３種を最終濃度各２０μｇ／ｍＬに添加して３７℃，２時間標識した。続いてマイトマイシンＣ［協和発酵キリン］溶液を最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように添加し，３７℃，４５分間処理した。この細胞をＡＩＭ−Ｖで２回洗浄し，培地に再懸濁し抗原提示細胞懸濁液とした。次に，１週間培養していた細胞を回収し，１．２×１０^６細胞／ウェルで２４ウェルプレートへ播種し，抗原提示細胞懸濁液を等しい細胞数で播種した。最後にＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加し，３７℃，５％ＣＯ２で培養した。２日後（Ｄａｙ９）に各ウェルの培養液を半量静かに抜き取り，代わりに４０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２含有培地を添加して培養を続けた。その後一日おき（Ｄａｙ１１，Ｄａｙ１３）に２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２含有培地で同様に培養液の半量交換操作を行った。Ｄａｙ１４及びＤａｙ２１にも同様の操作で再刺激を行い，２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２存在下で共培養し，一日おき（Ｄａｙ１６，Ｄａｙ１８，Ｄａｙ２０及びＤａｙ２３，Ｄａｙ２５，Ｄａｙ２７）に２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２含有培地で同様に培養液の半量交換操作を行い，Ｄａｙ２８まで培養を継続した。

＜ＤＤＸ３Ｘ由来ペプチド刺激によるＩＦＮγ産生評価＞
Ｄａｙ２１，Ｄａｙ２８で回収した細胞を培地で適宜希釈し９６穴丸底プレートに１００μＬずつ播種した。続いてＤＤＸ３Ｘ由来ペプチドが４０μｇ／ｍＬ含まれる培地を調製し，同じく９６穴丸底プレートに１００μＬずつ添加し（ペプチド終濃度＝２０μｇ／ｍＬ），５％ＣＯ２／３７℃にて培養した。なおＥＬＩＳＡは各刺激に対してトリプリケートで実施した。なお陰性対照刺激として溶媒であるＤＭＳＯによる刺激を採用した。
ペプチド刺激後２４時間培養した後，静かに各ウェルから培養上清を回収した。各培養上清中のＩＦＮ−γ濃度は，ＥＬＩＳＡ試薬セット（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ ｓｅｔ（ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−γ）（商品名））を用い，添付プロトコールを改変してＥＬＩＳＡを行なった。すなわちコーティング用抗体，検出用抗体，ＨＲＰ標識抗体は５００倍希釈で使用した。測定は可波長吸光マイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ（商品名）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）で行なった。

＜結果＞
結果を、図１０に示す。図中各ドナー（Ａ〜Ｊ）についての棒グラフのカラムは、左から、ＤＭＳＯ、１０ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、２０ｍｅｒを表す。
Ｄａｙ２１評価時にはＡ＊０２０１を有する３検体は何れの刺激でもＩＦＮγ産生は認められなかった。一方Ａ＊２６０１を有する５検体中２検体でＤＤＸ３Ｘ−１０ｍｅｒ刺激時にのみＩＦＮγ産生が認められた。
続いてＤａｙ２８評価時にはＡ＊０２０１を有する６検体中１検体においてＤＤＸ３Ｘ−１０ｍｅｒ刺激時にＩＦＮγ産生が認められた。一方Ａ＊２６０１を有する５検体のうちＤａｙ２１にＤＤＸ３Ｘ−１０ｍｅｒ刺激時ＩＦＮγ産生の認められた２検体以外にも，新たに１検体がＤＤＸ３Ｘ−２０ｍｅｒ刺激時にＩＦＮγ産生が認められた。
以上より健常人ＰＢＭＣをＤＤＸ３Ｘ由来ペプチド刺激することにより，刺激特異的なＩＦＮγ産生細胞の誘導が可能なことが示された。

実施例７
ＤＤＸ３Ｘ／ＤＣ免疫刺激ＣＤ４陽性Ｔ細胞の抗腫瘍効果
樹状細胞を、５μｇ／ｍＬの合成ＤＤＸ３Ｘで８時間パルスし、ＣＤ１１ｃ マイクロビーズとａｕｔｏＭＡＣＳ（商品名）で、ＣＤ１１ｃ陽性細胞（ＤＤＸ３Ｘ／ＤＣ）として分離した。ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＴ細胞は、ＤＤＸ３Ｘ／ＤＣワクチン所属リンパ節から分離した。リンパ節Ｔ細胞であるＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＴ細胞は、‘材料及び方法’で述べた方法に従って、５日間培養した。培養されたＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＴ細胞を、亜致死量（５００ｃＧｙ）の全身放射線照射を行った後２日間経った皮膚メラノーマを有するマウスに、静注した。ＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞は、抗腫瘍活性を有し、皮膚腫瘍の成長を著しく抑制することが明らかとなった（図１１Ａ）。
このことから、ＤＤＸ３Ｘ／ＤＣ ワクチン所属リンパ節Ｔ細胞が抗腫瘍治療効果をもつことが明らかとなった。
さらに、ＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれが抗腫瘍活性を担っているかを調べた。培養５日後のリンパ節Ｔ細胞を磁気ビーズを用いて精製して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を得た。１０×１０^６個のＣＤ４陽性リンパ節Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を静注した。１０×１０^６個のＣＤ８陽性Ｔ細胞を、亜致死量（５００ｃＧｙ）の全身放射線照射を行った後２日間経った皮膚メラノーマを有するマウスに注入したが、有意な抗腫瘍活性は認められなかった。これに対して、ＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、高い抗腫瘍活性を示し、その結果、腫瘍が治癒した（図１１Ｂ）．

実施例８
ＤＤＸ３Ｘの特異的発現
ＤＤＸ３Ｘがヒトの腫瘍細胞に発現しているかどうか検討するために、推定ＣＳＣマーカーであるＣＤ１３３、ＣＤ４４、及びＣＤ２４について、８７．５及びＳ２（ヒト小細胞肺癌）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌）、Ａ５４９（ヒト非小細胞癌性肺癌）、ＷＭ１１５（ヒトメラノーマ）、及びＭＣＦ７（ヒト乳癌）細胞を解析した。
図１２に示すように、８７．５及びＨＣＴ１１６は、ＣＤ１３３を発現しており、その他の細胞は発現していなかった。８７．５細胞は、浮遊凝集体状に増殖し、容易に腫瘍塊を形成した。ＭＣＦ７は、ＣＤ４４^＋及びＣＤ２４^{−／ｌｏｗ}の表現型を示し、一般的な乳癌幹細胞の表現型であると考えられた（後記参考文献１〜３）。
参考文献１：Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America. 2003;100:3983-8.
参考文献２：Ponti D, Costa A, Zaffaroni N, Pratesi G, Petrangolini G, Coradini D, et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer research. 2005;65:5506-11.
参考文献３：Kai K, Arima Y, Kamiya T, Saya H. Breast cancer stem cells. Breast Cancer. 2010;17:80-5.
また、正常ヒト細胞（ヒト上皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）、正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ））及び癌細胞（８７．５、Ｓ２、ＨＣＴ１１６、Ａ５４９、ＷＭ１１５、ＭＣＦ７）から全細胞溶解液を抽出した。ＤＤＸ３Ｘ及びβアクチンに対する抗体を用いて、腫瘍細胞に対するイムノブロット分析を行った。
実験に使用された全ての細胞においてＤＤＸ３Ｘが発現されていたのに対して、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）及び正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）では、ＤＤＸ３Ｘはわずかしか発現していなかった。さらに、８７．５、ＨＣＴ１１６及びＭＣＦ７のような、推定ＣＳＣマーカー陽性細胞では、ＤＤＸ３Ｘが強く発現していた（図１３）。従って、ＤＤＸ３Ｘは、マウスメラノーマ幹細胞で発現するのみでなく、ヒトの様々な腫瘍で発現することが示された。

実施例９
ヒト株化大腸癌細胞ＨＣＴ１１６はＣＤ１３３陽性細胞がその大部分を占め、ＤＤＸ３Ｘを高発現している。レンチウイルスベクターにより導入したｓｈＲＮＡによりＤＤＸ３Ｘをノックダウンした１−４細胞とモック（ｍｏｃｋ）遺伝子導入細胞である１−６細胞を用いて、細胞キズ修復実験を行った。なお、１−４細胞と１−６細胞の増殖速度に差がないことを予め確かめている。２４−ウェル・プレートに同数蒔いた１−４細胞と１−６細胞がサブコンフルエントに至った状態でピペットチップにより直線状に細胞剥離を行い、その後経時的に傷修復の経過を観察した。その結果、ＤＤＸ３Ｘをノックダウンした１−４細胞では、組織修復が遅延した（図１４）。

実施例１０
株化した小細胞肺癌細胞はＤＤＸ３Ｘを大量に発現していたことから、小細胞肺癌患者末梢血中にＤＤＸ３Ｘを認識してサイトカイン産生するＴリンパ球が存在するか検討した。本研究は新潟大学医学部倫理委員会において承認されている。
インフォームドコンセントを得た後、末梢血液１５ｍｌを採取した。リンホプレップ（商品名）（コスモ・バイオ株式会社）を用いた密度勾配遠心法により単核球細胞分画を採取し、ＣＤ１４^＋細胞をＣＤ１４マイクロビーズとａｕｔｏＭＡＣＳを用いて分離した。ＣＤ１４^＋細胞はｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１ｎｇ／ｍｌ，キリンビールより譲渡）とｒｈＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて培養することにより、５日目までに樹状細胞に分化した。樹状細胞は合成ＤＤＸ３Ｘ蛋白質（３．３μｇ／ｍｌ）又は同じ濃度のＯＶＡを含んだ培養液で一晩培養し、ＣＤ１１ｃ陽性細胞をＣＤ１１ｃマイクロビーズとａｕｔｏＭＡＣＳにより純化し、抗原提示細胞として使用した。ＣＤ１４⁻分画として得られた細胞からナイーヴＴ細胞と制御性Ｔ細胞を除去するためＣＤ６２Ｌ^ｈｉｇｈ細胞を抗ＣＤ６２Ｌ抗体（１Ｈ３）結合ダイナビーズにより除いた。このＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＣＤ１４⁻細胞をＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（商品名）Ｔ細胞活性化プレート（ベクトンディッキンソン社）上で４８時間培養し、その後２０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２（シオノギ製薬より譲渡）を含んだ培養液で４日間培養した。この結果得られた細胞の９５％以上がＣＤ３陽性Ｔ細胞であることをＦＡＣＳにより確認し、反応細胞として使用した。反応細胞１×１０^５と抗原提示細胞１×１０^４を２００μｌの培養液で丸底９６ウェル・プレートにおいて２４時間共培養した。共培養後回収した上清を用いてＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮγ濃度を測定した。抗原提示細胞として、蛋白質のパルスを行なっていない樹状細胞、ＤＤＸ３Ｘをパルスした樹状細胞、ＯＶＡをパルスした樹状細胞を用いた。表３中、Ｙｅｓは、ＤＤＸ３Ｘをパルスした樹状細胞と共培養したときのみにＴ細胞から有意差を持ったＩＦＮγ産生が認められたことを示している。なお、表中％Ｔｒｅｇと％Ｔｅｆｆは、末梢血から分離した直後に単核球分画をＦＡＣＳ解析し、総ＣＤ４^＋Ｔ細胞数に対する制御性Ｔ細胞比率、エフェクターＴ細胞比率を示したものである。FACS解析は、Koyama K, Kagamu H, et al. Reciprocal CD4⁺ T-cell balance of effector CD62L^low CD4⁺ and CD62L^highCD25⁺ CD4⁺ regulatory T cells in small cell lung cancer reflects disease stage. Clin Cancer Res. 2008;14:6770-9.に報告した通り、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉｇｈＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞を制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＣＤ４^＋Ｔ細胞をエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）として行った。
この結果、健常者（ＨＶ）、遠隔転移を有している小細胞肺癌患者（ＳＣＬＣ−ＥＤ）、治癒した小細胞肺癌患者では、一例もＤＤＸ３Ｘに反応するＴ細胞を検出できなかったが、遠隔転移のない小細胞肺癌（ＳＣＬＣ−ＬＤ）では１２名中５名でＤＤＸ３Ｘに反応し特異的ＩＦＮγ産生を示すＴ細胞が存在していることが明らかとなった。これは、ＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞を有する小細胞肺癌患者の予後が良好であることを示している。
表中、「Ｙｅｓ」は、血中にＤＤＸ３Ｘ−特異的Ｔ細胞が検出されたことを表し、「Ｎｏ」は、血中にＤＤＸ３Ｘ−特異的Ｔ細胞が検出されなかったことを表す。

実施例１１
ヒト株化大腸癌細胞ＨＣＴ１１６からＤＤＸ３Ｘノックダウンした１−４細胞の浮遊細胞集塊（スフェロイド）形成能を検討した。非接着状態での培養において、親株ＨＣＴ１１６（CDD133+）はスフェロイド形成する能力を有しているが、ＤＤＸ３Ｘ発現を失った１−４細胞にスフェロイド形成能はみられなかった（図１５）。

実施例１２
ＤＤＸ３ＸはＲＮＡヘリカーゼ活性を有し、C.elegansやDrosophilaではｍｉＲＮＡの核−細胞質輸送、プロセッシング、成熟に関わることが知られているが、ヒト細胞においてｍｉＲＮＡに関与していることは報告されていない。そこで、ＤＤＸ３Ｘを高発現しているヒト腫瘍細胞、ＨＣＴ１１６においてＤＤＸ３Ｘをノックダウンすることで変動するｍｉＲＮＡが存在するかを検討した。
ＨＣＴ１１６細胞からＤＤＸ３Ｘをノックダウンした１−４細胞とモック導入細胞である１−６細胞を用いて、miRCURY LNAneration（商品名） microRNA Array 6^th generation (フィルジェン社)を行った。アノテーション情報としてmiRBase Release17を使用し、アレイの読み取りにはGenePix 4000B (Molecular Devices社)、画像の数値化及び補正はArray-Pro Analyzer Ver4.5 (Media Cybemetics社)、ノーマライズにはLocal regression法を用いた。検討した２６８４のｍｉＲＮＡのうち、１−６細胞に対して１−４細胞で発現が増加しているものは認められなかった。一方、Normalized intensity≧10, Normalized intensity (sum)≧Negative controlの平均値(=85)を満たし、１−６細胞に対して1-4細胞でNormalized intensity ratio≦0.5と減少していたｍｉＲＮＡとしてhsa-miR-301a、hsa-miR-429、hsa-miR-301b, hsa-miR-3922-3pの４つを見出した。

Claims (14)

1. がんの悪性度の評価方法であって、
   がん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現量を測定する段階、及び
   当該ＤＤＸ３Ｘ発現量に基づき当該がん組織の悪性度を評価する段階
   を含む方法。
2. ＤＤＸ３Ｘに対する抗体、あるいはＤＤＸ３ＸのｍＲＮＡ又はそれに対応するｃＤＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドを含有し、
   当該抗体又は当該ポリヌクレオチドが、がん組織中のＤＤＸ３Ｘ発現量の測定のために用いられる
   がん悪性度評価用キット。
3. がんの予後の評価方法であって、
   がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞を検出する段階、及び
   当該検出結果に基づきがんの予後を評価する段階
   を含む方法。
4. ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドを含有し、
   当該ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドが、がん患者の血中のＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の検出のために用いられる
   がん予後評価用キット。
5. 配列番号１で表されるアミノ酸配列において、
   配列番号２〜８７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含有する連続した９〜２０個のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド。
6. がん抗原ペプチドである請求項５に記載のペプチド。
7. 請求項５に記載のペプチドを含有するがんワクチン。
8. がんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制用である請求項７に記載のがんワクチン。
9. 抗原提示能を有する細胞をＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドでパルスする段階
   を含む、養子免疫用細胞の製造方法。
10. ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドでパルスされた抗原提示細胞。
11. 請求項１０に記載の抗原提示細胞を有効成分として含むＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞の誘導剤。
12. 抗原提示能を有する細胞をＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドに暴露して当該ＤＤＸ３Ｘ又はその部分ペプチドに由来する抗原を提示する細胞を得る段階、及び
    当該細胞を用いてＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞を誘導する段階
    を含む、養子免疫用細胞組成物の製造方法。
13. 前記ＤＤＸ３Ｘ特異的Ｔ細胞がＤＤＸ３Ｘ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞である請求項１２に記載の製造方法。
14. がんの予防、治療、転移抑制、又は再発抑制における使用のためのＤＤＸ３Ｘの発現又は活性を阻害する化合物。