MX2015003572A

MX2015003572A - Compuestos para tratar el bloqueo de remielinizacion en enfermedades asociadas con la expresion de la proteina de envoltura herv-w.

Info

Publication number: MX2015003572A
Application number: MX2015003572A
Authority: MX
Inventors: Hervé Perron; Reza Firouzi; Patrick Küry; Raphaël Faucard; Alexandra Madeira; Julie Joanou
Original assignee: Geneuro Sa
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2013-10-01
Publication date: 2015-08-20
Also published as: DK2904009T3; JP6538138B2; RS58320B1; CA2882781A1; EA201791525A2; ES2710748T3; CY1121237T1; IL274047A; IL274047B; JP2016500651A; IL264382B; RU2015116149A; HUE043419T2; PL2904009T3; EP3447070A1; JP2018065814A; HRP20210779T1; AU2018217328B2; SI3447070T1; KR102098033B1

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos y composiciones innovadores para prevenir y/o tratar un mecanismo perjudicial recién descubierto, el cual bloquea la capacidad de reparación de la mielina endógena del sistema nervioso (NS) adulto en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

Description

COMPUESTOS PARA TRATAR EL BLOQUEO DE REMIELINIZACIÓN EN ENFERMEDADES ASOCIADAS CON LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE ENVOLTURA HERV-W CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se refiere a compuestos y composiciones innovadores para prevenir y/o tratar un mecanismo dañino recién descubierto, el cual bloquea la capacidad de reparación de mielina endógena del sistema nervioso adulto (NS) en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

Este novedoso enfoque terapéutico combina una inhibición de los efectos patogénicos corriente arriba de Env en células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) junto con una inhibición de los efectores corriente abajo finales de la patogenicidad de Env en diferenciación de OPC (radicales de NO), los cuales muestran ahora bloquear la remielinización de enfermedades asociadas con HERV-W que afectan el sistema nervioso.

La presente invención se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden (i) al menos un ligando anti-HERV-W Env y/o (ii) al menos un fármaco inhibidor de radicales libres de óxido nítrico (NO) para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

La composición cuando combina tanto ligando como fármacos inhibidores de NO se dirige al inductor de Env corriente arriba así como a los efectores de NO corriente abajo en este proceso recién descifrado causando bloqueo de remielinización en lesiones de NS.

Además, la acción sinérgica de los dos tipos de compuestos (que se dirigen a Env y NO, respectivamente) incrementa la rapidez y eficacia de una terapia en pacientes con lesiones no remielinizantes inducidas por la activación de HERV-W (en particular cuando está asociada con el subtipo MSRV, aislado con partículas viriónicas de células MS1) y por la expresión de su proteína Env en el sistema nervioso.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a un ligando anti-HERV-W Env para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

En la presente invención, los términos “bloqueo de diferenciación” o “bloqueo de remielinización” se usan para resumir el recién descubierto fenómeno que consiste en (i) la inhibición de la diferenciación de células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) inducida por proteína de envoltura HERV-W (en particular del subtipo MSRV), (ii) la producción resultante de NO a partir de OPCs y (iii) la inhibición resultante de la producción de mielina por OPCs, como se describe en el ejemplo 1.

Las enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV se definen como enfermedades asociadas con HERV-W que afectan el sistema nervioso y más particularmente, pero de una manera no limitativa: esclerosis múltiple (MS), más particularmente de Esclerosis Múltiple en Recaída-Remisión (RRMS), la esclerosis múltiple progresiva tal como Esclerosis Múltiple Progresiva Secundaria (SPMS) o Esclerosis Múltiple Progresiva Primaria (PPMS), Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica (CIDP ), psicosis tales como esquizofrenia y trastorno bipolar , en las cuales también se describe el deterioro de mielina .

Clásicamente, las lesiones de esclerosis múltiple (MS) son atribuidas a una pérdida inmunológicamente mediada de oligodendrocitos y de vainas de mielina con daño axonal. Los efectos en las células inmunológicas que son mediados por la proteína de envoltura (Env) del retrovirus asociado con esclerosis múltiple (MSRV) de la familia HERV-W de retrovirus endógenos en asociación con lesiones inflamatorias del sistema nervioso (NS) han sido descritos7. Sin embargo, una patogenicidad directa de MSRV-Env en células gliales que incluye el bloqueo de remielinización de placas MS por células precursoras de oligodendrocitos (OPC) era previamente desconocido y nunca se había demostrado.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la inhibición de los efectos patogénicos corriente arriba de Env en células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) se lleva a cabo usando un ligando anti-HERV-W Env. El ligando anti-HERV-W Env de la presente invención se define por su capacidad para unirse a la proteína Env.

El término “unirse” o “unión” del ligando significa una interacción o asociación al menos temporal o con un antígeno objetivo, por ejemplo, Env, que comprende fragmentos del mismo que contienen un epitopo.

De acuerdo con la presente invención, HERV-W ENV significa proteína codificada por el gen Env de cualquier miembro de la familia HERV-W, incluyendo el subgrupo MSRV como el definido a partir de secuencias identificadas en ARN de partículas retrovirales de MS14’23.

El ligando de la presente invención también puede definirse como estando comprendido dentro de una proteína scFV recombinante, un fragmento Fab, un anticuerpo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, monoclonal, oligoclonal, quimerizado, manipulado o humanizado o humano. En un aspecto particular de la invención, el anticuerpo que comprende el ligando es una IgG humanizada o humana, y más particularmente una IgGl o una lgG4.

Más particularmente, el ligando de la presente invención comprende al menos una y muy preferiblemente cada una de las regiones determinadoras de complementariedad (CDRs) que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

El ligando mencionado arriba comprende al menos una y muy preferiblemente cada una de las regiones determinadoras de complementariedad (CDRs) codificadas por SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30.

Como se indicó arriba, el bloqueo de remielinización también se traduce en la producción de NO a partir de OPCs. Entonces, de acuerdo con un aspecto más, la presente invención también se refiere a un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

Las enfermedades asociadas con la expresión de HERVW ENV son aquellas definidas arriba.

En un aspecto más específico de la invención, un fármaco inhibidor de radicales libres de óxido nítrico (NO), fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico o fármaco inhibidor de NO es cualquier fármaco que puede inhibir los efectos biológicos de moléculas de NO, también llamadas radicales NO, los fármacos inhibidores de NO se seleccionan de entre éster metílico de N9-nitro-L-arginina (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT), ácido fumárico o fumarato de dimetilo (DMF).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que combina al menos un ligando anti- MSRV/HERV-W Env como el definido arriba y al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico como los definidos arriba. Esta composición se usa en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV, las enfermedades siendo aquellas definidas arriba.

El producto farmacéutico que contiene un ligando anti-HERV-W Env como el definido arriba; y un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico como el definido arriba se consideran un producto en combinación para administración simultánea, separada o dispersa con el tiempo para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

De acuerdo con los resultados descritos abajo en modelos de ratón de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) inducida por Env, se demostró un efecto sinérgico de la combinación de un ligando anti-MSRV/HERV-W Env con al menos una de estas moléculas inhibidoras de NO, en comparación con cualquiera de estos agentes terapéuticos dados solos. Incluso cuando se dieron solos, el fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico o el ligando anti-MSRV/HERV-W Env muestran una eficacia terapéutica con recuperación de déficit clínico que se sabe está asociado con lesiones de mielina en EAE . No obstante, la comparación entre (i) fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico o el ligando anti- MSRV/HERV-W Env y (ii) combinación de al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico y al menos un ligando anti-MSRV/HERV-W Env evidencia una gran ventaja del uso de esta combinación en el curso del tratamiento.

De esta manera, la ausencia de infiltrados inflamatorios y/o lesiones con actividad inflamatoria (por ejemplo, placas inactivas de MS) no impide tratar el bloqueo de remielinización inducido por Env en pacientes afectados. Esto es de particular relevancia en pacientes con MS progresiva (formas progresivas primarias o secundarias) que se sabe tienen numerosas lesiones sin actividad inflamatoria, las cuales ya no muestran más incremento por gadolinio de la señal de formación de imágenes por resonancia magnética en la mayoría de las lesiones de cerebro y médula espinal.

La presente invención también se refiere a un método para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV que comprende la administración de al menos un ligando anti-MSRV/HERV-W Env a un ser humano.

En un aspecto específico, el método comprende además la administración de al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV, que comprende la administración de al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico a un ser humano.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Detección de expresión de proteína Env y receptor de TLR4 en tejido de MS. (A, B) Inmunohistoquímica anti-Env reveló proteína Env (flechas) en NAWM cerca de una lesión activa crónica (B) pero no en materia blanca de cerebro sano (A). (C) OPCs OHg2-positivas en cercana proximidad a células microgliales Env-positivas en el borde de una lesión activa crónica. (D-D”’) Tejido cerebral de control sano con OPCs PDGFRa-positivas que incorporan co-expresión de TLR4 (flechas). (E-E”’) OPCs En NAWM cerca de una lesión activa de un paciente de MS que expresa tanto TLR4 como PDGFRa (flechas). Barras de escala: 50 pm.

Figura 2. Regulación de la expresión de TLR4 durante diferenciación de OPC. (A) RT-PCR Cuantitativa que muestra una regulación descendente progresiva de la expresión de TLR4 durante diferenciación de OPC en rata espontánea en cultivo durante un periodo de nueve días. La expresión de GAPDH se usó como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios +/- desviación estándar derivada de 3 experimentos independientes. Prueba t (***P < 0.001 ). (B,B’) La inmunotinción con anti-TLR4 demostró que después de la supresión mediada por ARN de horquilla pequeño (shRNA) de TLR4, OPCs transfectadas estuvieron libres de la expresión de TLR4 (flecha) asegurando especificidad de anticuerpo. Las OPCs mostradas fueron fijadas tres días post transfección y las células transfectadas fueron marcadas mediante expresión de eGFP. Nótese que las células no transfectadas adyacentes fueron positivas para TLR4. (C-D’) Ejemplos representativos de OPCs doble-positivas para galactocerebrósido (GalC/TLR4 después de tres días (C,C’) y OPCs doble-positivas para proteína básica de mielina (MBP)/TLR4 después de seis días (D,D’) de diferenciación espontánea en cultivo. Las puntas de flecha en (D) apuntan a OPCs más altamente diferenciadas que incorporan sólo niveles reducidos de expresión de TLR4 reflejando así datos de expresión génica mostrados en (A). Las flechas indican fuerte expresión de células menos maduras.

Figura 3. Efectos pro-inflamatorios de Env recombinante en OPCs de rata cultivadas. (A, B, C) Estimulación de OPCs por Env recombinante en solución (A, Env soluble), Env recombinante unida en superficie (B; Env sólida) y Env unida a membrana (C) expresada en células de glioblastoma U343 transfectadas con pV14Env (D-D’) todas llevaron a una fuerte inducción de la expresión de iNOS después de ocho horas de estimulación en comparación con controles de regulador de pH respectivos o con OPCs cultivadas en presencia de células de glioblastoma U343 transfectadas con pV14ctrl (E-E’). En la endotoxina de preparación Env recombinante los niveles fueron <5 EU/mL según se mide por la prueba LAL. (D-E’) Inmunotinciones anti-Env de células U343 transfectadas con pV14Env y pV14ctrl que revelan expresión en superficie de Env. (F-G’) La morfología oligodendroglial evaluada por inmuno-tinciones con 04 siguen sin alterar después de la estimulación con Env recombinante unida en superficie mostrada después de un día (F,F’) así como después de cinco días (G, G’) en cultivo. (H) Análisis espectrométrrico indirecto de sobrenadantes de cultivo celular que miden que el producto de desintegración de NO nitrito reveló niveles dependientes de dosis incrementados significativamente de NO en muestras de OPC simuladas por Env recombinante soluble durante 24 horas. (I-K) Citocinas pro-inflamatorias tales como TNFa, IL-Ib e IL-6 sufren sobrerregulación después de la estimulación con Env recombinante unida en superficie. GAPDH se usó como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios +/-desviación estándar y representan 1 de 6 (A), 8 (B), 3 (H) y 8 (I-K) experimentos independientes, respectivamente. Prueba t (***P < 0.001). Barras de escala: 50 pm.

Figura 4. Comparación de la sensibilidad a HERV-W Env en OPCs de rata inmaduras (de un día de edad = OPC) y maduras (siete días de edad; “OPCs maduras” u oligodendrocitos = OL). Ambos tipos de células fueron sujetos a estimulación con 100 ng/ml de Env recombinante soluble. Aunque significativo en comparación con controles de regulador de pH la sobrerregulación de iNOS y citosina después de la estimulación con Env en OLs es menos pronunciada en comparación con OPCs. Se usó la expresión de GAPDH como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios +/- desviación estándar y se derivan de uno representativo de 3 experimentos independientes. Prueba t (***P<0.001 ; **P < 0.01 ; *P < 0.05).

Figura 5. Reacciones dependientes de Env de OPCs humanas. (A) Estimulación de OPCs humanas cultivadas con Env unido en superficie (sólido y recombinante soluble (soluble) llevaron a una fuerte inducción de la expresión de iNOS después de 24 horas de estimulación en comparación con células tratadas con regulador de pH. La expresión de GAPDH se usó como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios +/- desviación estándar y se derivan de uno representativo de 3 experimentos independientes. Prueba t (***P < 0.001). (B,B’) Tinciones inmunofluorescentes de OPCs humanas positivas para GalC cultivadas revelan una fuerte señal para TLR4 (mostrada después de tres días en cultivo). Barras de escala: 50 pm.

Figura 6. Experimentos de neutralización de la vía de Env. (A) La inactivación con calor de Env recombinante llevó a una inducción del gen iNOS aprobada en comparación con Env recombinante nativa después de 8 horas de estimulación de OPC. Ambas preparaciones, Env nativa y Env desnaturalizada (Env calor) se aplicaron a una concentración de 1 ,000 ng/ml. (B, C) La reducción de la expresión de iNOS en OPCs después de la inhibición farmacológica de IRAK1/4 y TRIF, respectivamente. Después de una etapa de pre-incubación de 2 horas con 3,200 nM de inhibidor de IRAK1/4 1 o 50 mM de péptido inhibidor de TRIF las OPCs fueron estimuladas con Env recombinante unida a superficie (sólido) durante 8 horas y posteriormente lisadas. (D) Reducción de la expresión de iNOS en OPCs después del bloqueo mediado por anticuerpos del receptor de Env TLR4. Después de una etapa de pre-incubación de 2 horas con anticuerpo anti-TLR4 a una concentración de 15 mg/ml a 37°C, OPCs fueron estimuladas con rEnv sólido durante 8 horas y luego lisadas. La expresión de GAPDH se usó como gen de referencia. Los datos se muestran como valores medios +/- desviación estándar y se derivan de uno representativo de 3 experimentos independientes cada uno. Prueba t (***P < 0.001 , **P < 0.01 ). (E) Localización nuclear incrementada de NFKB después de la estimulación de OPCs con Env recombinante unida en superficie (sólido) durante 8 horas. Los datos se muestran como valores medios +/- desviación estándar y se derivan de uno representativo de 3 experimentos independientes cada uno. Prueba t (***P < 0.001 ). (F-G’) Inmunotinciones con NFKB representativas de OPCs estimuladas con regulador de pH (control) y Env. Barras de escala: 50 pm.

Figura 7. Generación de OPCs positivas a 3-nitrotirosina (3-NT). (A) Tinciones inmunofluorescentes revelaron que después de 24 horas i de estimulación de Env (Env recombinante unida en superficie) significativamente más OPCs expresaron el marcador de estrés nitrosante dependiente de NO 3-NT en comparación con células tratadas con regulador de pH. Como control positivo se usó S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), un fuerte donador de NO. Sin embargo, cuando las OPCs fueron incubadas con L-NAME, una molécula inhibidora de iNOS, a una concentración de 100 mM durante 30 minutos a 37°C antes de la estimulación con Env, la positividad a 3-NT se redujo a niveles de control. El enantiómero inactivo D-NAME no pudo abolir la inducción de 3-NT dependiente de Env. Los datos se muestran como valores medios +/-desviación estándar y se derivan de uno representativo de 3 experimentos independientes. Prueba t (***P < 0.001). (B-F’) Inmunotinciones anti-3-NT representativas de células de control (B,B’), OPCs estimuladas con Env (C,C’), OPCs pre-incubadas con L-NAME (D,D’), D-NAME (E,E’) y OPCs expuestas a SNAP (F, F’). Barras de escala: 50 pm. (G-G’”) Tinciones inmunofluorescentes de secciones de tejido NAWM de pacientes con MS demostraron que OPCs residentes (marcadas por su expresión del marcador precursor PDGFRa, flechas) pueden sufrir estrés nitrosante como se revela por su positividad a 3-NT.

Figura 8. Inhibición dependiente de Env de la diferenciación de OPC. (A,B) Análisis inmunofluorescente que demuestra que después de un día y tres días de estimulación con Env recombinante unido en superficie, un número significativamente reducido de OPCs expresaron la CNPase del marcador de mielina temprano así como las MBPas de marcador de mielina tardío en comparación con células de control. Los datos se muestran como valores medios +/- desviación estándar y se derivan de un representativo de 4 experimentos. Prueba t (***P < 0.001). (C-C”’) y (D-D’”) Muestran inmunotinciones con anti-CNPase y anti-MBP representativas de OPCs de control y estimuladas con Env. (E) Incubación de OPCs con 100 mM de L-NAME en combinación con Env recombinante unida en superficie durante tres días llevó a la detención del bloqueo de diferenciación de OPC mediado por Env según se revela por inmunotinciones con anti-MBP. La aplicación de D-NAME no fue capaz de rescatar la expresión de mielina. Los datos se muestran como valores medios +/- desviación estándar y se derivan de uno representativo de 4 experimentos independientes. Prueba t (***P < 0.001 ; n.s. no significativo). (F-H’) Inmunotinciones con MBP representativas de OPCs estimuladas con Env sola, una combinación de Env y L-NAME y una combinación de Env y D-NAME, respectivamente. Barras de escala: 50 pm.

Figura 9. Expresión de marcadores de maduración de OPC después de 24 y 72 horas de estimulación en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env. MSRV-Env recubierta (+ Env-T) indujo una reducción en el porcentaje de OPC positiva a CNPase después de 24 horas de estimulación (A), así como una reducción en el porcentaje de OPC positiva a MPB después de 72 horas de estimulación (B), cuando se comparó con su regulador de pH de dilución (regulador de pH). Los datos se presentan como media ± SEM de un experimento evaluado en decaplicados (410 a 563 células contadas por grupo; *p<0.05 prueba t (A) y 364 a 491 células contadas por grupo; 1/?<0.001 prueba de suma de clasificaciones de Mann-Whitncy (B)).

Figura 10. Expresión de CNPase en OPC humana después de 24 horas de estimulación por MSRV-Env y GNbACl. (A) MSRV-Env Recubierta induce una reducción en el porcentaje de OPC positiva a CNPase después de 24 horas de estimulación. GNbACl a 50 nM o 200 nM Inhibe completamente el efecto de MSRV-Env, en ambos protocolos de tratamientos con GNbACl probados (GNbACl-A o GNbACl -B). Los datos se presentan como media ± SEM de 2 a 8 experimentos independientes (705 a 3,878 células contadas por grupo). (B) GNbACl (50 nM o 200 nM) recubierto solo o junto con BSA (1 mg/ml), en ambos protocolos de tratamientos GNbACl probados (GNbAC l -A o GNbACl -B) no tiene efecto en el porcentaje de OPC positiva para CNPase. Los datos se presentan como media ± SEM de un experimento evaluado en decaplicados (399 a 512 células contadas por grupo; p>0.05; ANOV de una vía).

Figura 11. Expresión de CNPase en cultivos de OPC humanos después de 24 horas de estimulación por MSRV-Env y GNbACl añadidos al medio de cultivo. MSRV-Env (3 nM) diluida en el medio de cultivo de células reduce significativamente la expresión de CNPase después de 24 horas de tratamiento. GNbACl (200 nM) Inhibe completamente este efecto, mientras que no demuestra ningún efecto solo. Los datos se presentan como media ± SEM de 2 a 4 experimentos independientes (927 a 1 ,913 células contadas por grupo); *p<0.001 vs. regulador de pH; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc de Fischer LSD).

Figura 12. Expresión de MBP en cultivos de OPC humanos después de 72 horas de estimulación por MSRV-Env y GNbACl. (A) MSRV-Env recubierta (Env-T) induce una reducción en el porcentaje de OPC positivas para MBP después de 72 horas de estimulación. GNbACl a 50 nM inhibe parcialmente el efecto de MSRV-Env, y esta inhibición es completa a 200 nM, en ambos protocolos de tratamientos GNbACl probados (GNbACl-A o GNbACl -B). (B) MSRV-Env (3 nM) añadida en el medio de cultivo de células reduce significativamente la expresión de MBP después de 72 horas de tratamiento. GNbACl (200 nM) inhibe completamente este efecto (B). Los datos se presentan como media ± SEM de (A) 2 a 8 experimentos independientes (924 a 4, 156 células contadas por grupo) *p<0.05; **p<0.001 vs. regulador de pH; y ><0.001 vs. Env-T; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc de Fisher LSD, y de (B) 2 a 4 experimentos independientes (1 ,013 a 1 ,834 células contadas por grupo; *p<0.001 vs. regulador de pH; y/?<0.001 vs. Env-T; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc de Fisher LSD).

Figura 13. Expresión de marcadores de maduración de OPC después de 24 y 72 horas de estimulación por MSRV-Env y GNbACl recubiertas. MSRV-Env recubierta induce (A) una reducción en el porcentaje de OPC humana positiva para CNPase despues de 24 horas de estimulación así como (B) una reducción en el porcentaje de OPC humana positiva para MBP después de 72 horas de estimulación. (A) GNbACl (200 nM) Inhibe completamente el efecto de MSRV-Env, en ambos protocolos de tratamiento con GNbACl probados (GNbACl -A o GNbACl -B). Los datos se presentan como media ± SEM de 6 experimentos independientes (2,805 a 3,039 células contadas por grupo; *p<0.05 vs. regulador de pH; yr<0.05 vs. MSRV-Env; ANOVA- 1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguidas por análisis post-hoc de Newman Keuls del estudiante y (B) 5 a 6 experimentos independientes (1,671 a 2,066 células contadas por grupo; *p<0.05 vs. regulador de pH; yr<0.05 vs. MSRV-Env; ASNOVA-1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguida por análisis post-hoc de Dunn).

Figura 14. La inhibición de la maduración de OPC humana inducida por MSRV-Env es completamente revertida por GNbACl. MSRV-Env recubierta (Env) induce (A) una reducción en el porcentaje de OPC humana positiva para CNPase después de 24 horas de estimulación así como (B) una reducción en el porcentaje de OPC humana positiva para MBP después de 72 horas de estimulación. GNbACl (200 nM) inhibe completamente el efecto de MSRV-Env, en ambos protocolos de tratamiento con GNb AC1 probados (+ GNbACl A o + GNbACl B). Los resultados se expresan como el porcentaje de células positivas a CNPase (A) o MBP (B) y representan la media ± SEM de 8-14 experimentos independientes (3,600 a 6,800 células contadas por grupo (A) y 2,700 a 5,800 células contadas por grupo (B)). *p< 0.05 vs. CTRL; y/?<0.05 vs. MSRV-Env; ANOVA-1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguida por análisis post-hoc de Dunn.

Figura 15. La inhibición de la maduración de OPC humana inducida por MSRV-Env es completamente revertida por GNbACl (datos normalizados). MSRV-Env se recubrió en portaobjetos de cámaras de cultivo antes de sembrar OPCs. GNbACl (200 nM) Se mezcla con MSRV-Env antes de recubrir (GNbACl-A) o se incuba en cámaras de cultivo recubiertas con MSRV-Env (GNbAC l -B). Los datos son cuantificados como el porcentaje de (A) células positivas a CNPase o (B) MBP y se expresan como el porcentaje de cambio a la condición CTRL (regulador de pH MSRV-Env). Los resultados representan la media ± SEM de 8-14 experimentos independientes (3,600 a 6,800 células contadas por grupo (A) y 2,700 a 5,800 células contadas por grupo (B)). *p< 0.05 vs. CTRL; y/?<0.05 vs. MSRV-Env; ANOVA-1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguidas por análisis post-hoc de Dunn.

Figura 16. Cinética de puntuación clínica EAE de los grupos A, B, C y F (A-controles positivos de EAE no tratados, B-EAE tratado con GNbACl 200 m , C-EAE tratado con L-NAME, F-EAE tratado con GNbAc 200 pg+L-NAME).

Figura 17. Cinética de puntuación clínica de EAE de grupos A, B, D y G (A-Controles positivos a EAE no tratados, B-EAE tratado con GNbAcl 200 mg, D-EAE tratado con SMT, G-EAE tratado con GNbAc 200 gg+SMT).

Figura 18. Cinética de puntuación clínica de EAE de grupos A, B, E y H (A-Controles positivos a EAE no tratados, B-EAE tratado con GNbAcl 200 mg, E-EAE tratado con DMF, H-EAE tratado con GNbAc 200 pg+DMF).

Figura 19. Cinética de tiempo en Rotarod a 23 rpm.

Eje X: Días de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.

Eje Y: Ganancia o pérdida de tiempo en Rotarod, con relación al día -7.

A: Grupos A, B, “1 inyección” y “2 inyecciones” de Env; B: grupos A, B, C y F.

C: Grupos A, B, D y G; D: grupos A, B, E y H.

Figura 20. Cinética de tiempo en Rotarod a 26 rpm.

Eje X: Días de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.

Eje Y: Ganancia o pérdida de tiempo en Rotarod, con relación al día -7.

C: Grupos A, B, D y G; D: grupos A, B, E y H.

Figura 21. Cinética de tiempo en Rotarod a 29 rpm.

Eje X: Días de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.

Eje Y: Ganancia o pérdida de tiempo en Rotarod, con relación al día -7.

C: Grupos A, B, D y G; D: grupos A, B, E y H.

Figura 22. Cinética de puntuación clínica de EAE de los grupos A, B, C y D (A-controles negativos a EAE simulado, B-controles positivos a EAE no tratados, C-EAE tratados con GNbAc 200 mg, D-EAE tratado con GNbAc 500 pg).

Figura 23. Cinética de puntuación clínica de EAE de los grupos A, B, E y F (A-controles negativos a EAE simulado, B-controles positivos a EAE tratados con SMT, G-EAE tratados con GNbAc 200 mg + SMT).

Figura 24. Cinética de puntuación clínica de EAE de los grupos A, B, G y H (A-controles negativos a EAE simulado, B-controles positivos a EAE tratados con DMF, H-EAE tratados con GNbAc 200 pg + DMF).

Figura 25. La cinética de ganancia de peso durante el periodo de estudio (ganancia de peso relativa en comparación con el día antes de la primera inyección de inmunógenos). Grupos A, B, C y D (A-controles negativos a EAE simulado, B-controles positivos a EAE no tratados, C-EAE tratado con GNbAc 200 pg, D-EAE tratado con GNbAc 500 pg).

Figura 26. La cinética de ganancia de peso durante el periodo de estudio (ganancia de peso relativa en comparación con el día antes de la primera inyección de inmunógenos). Grupos A, B, E y F (A-controles negativos a EAE simulado, B-controles positivos a EAE no tratados, D-EAE tratado con SMT, G-EAE tratado con GNbAc 200 mg + SMT).

Figura 27. La cinética de ganancia de peso durante el periodo de estudio (ganancia de peso relativa en comparación con el día antes de la primera inyección de inmunógenos). Grupos A, B, G y H (A-controles negativos a EAE simulado, B-controles positivos a EAE no tratados, E-EAE tratado con DMF, H-EAE tratado con GNbAc 200 pg + DMF).

Figura 28. Cinética de tiempo en Rotarod a 16 rpm.

Eje X: Días de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.

Eje Y: Ganancia o pérdida de tiempo en Rotarod, con relación al día -7.

A: Grupos A, B, C y D; B: grupos A, B, E y F; C: grupos A, B, G y H.

Figura 29. Cinética de tiempo en Rotarod a 26 rpm.

Eje X: Días de valores medidos, de acuerdo con el protocolo. Eje Y: Ganancia o pérdida de tiempo en Rotarod, con relación al día -7.

A: Grupos A, B, C y D; B: grupos A, B, E y F; C: grupos A, B, G y H.

Figura 30. Cinética de tiempo en Rotarod a 29 rpm.

Eje X: Días de valores medidos, de acuerdo con el protocolo.

Eje Y: Ganancia o pérdida de tiempo en Rotarod, con relación al día -7.

A: Grupos A, B, C y D; B: grupos A, B, E y F; C: grupos A, B, G y H.

Figura 31. Cinética de puntuación clínica de EAE de todos los grupos durante el periodo de estudio (A-controles negativos a EAE simulado, B-controles positivos a EAE tratados con simulación de anticuerpo de isotipo, C-EAE tratado con GNbAc 500 mg, D-EAE tratado con fumarato de sodio y E-EAE tratado con GNbAc 500 pg+fumarato de sodio).

Resumen de las abreviaturas usadas Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no se intenta que limiten la invención.

Ejemplo 1 : El bloqueo de remielinización inducido por la proteína de envoltura de la familia HERV-W inhibe la diferenciación de células precursoras oligodendrogliales en lesiones desmielinizadas del sistema nervioso. 1.1 Materiales y métodos 1.1.1 Cultivo de células precursoras de oligodendrocitos Células precursoras de oligodendrocitos de rata (OPCs) fueron purificadas como se describió previamente . Las OPCs fueron ya sea mantenidas en medio de proliferación (medio Sato complementado con 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblasto básico humano recombinante y 10 ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas recombinante-AA; R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania), mientras que la diferenciación fue iniciada por medio Sato complementado con 0.5% de suero de becerro fetal. Células de precursor de oligodendrocitos fetal humano (hOPC) y medios respectivos se compraron de 3H Biomedical, Uppsala, Suecia. Env Recombinante se produjo y se purificó por PX-Therapeutics (Grenoble, Francia) de acuerdo con las especificaciones QC de GeNeuro (Ginebra, Suiza) que suministraron los lotes de proteínas. Los niveles de endotoxinas fueron <5 EU/mL según se mide por la prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL). La estimulación de Env se llevó a cabo usando tres enfoques diferentes mediante el uso de i) proteína Env de longitud completa recombinante diluida en medio de diferenciación a 10 ng/ml, 100 ng/ml y 1 ,000 ng/ml, ii) proteína Env recombinante recubierta en cajas de cultivo de células a una concentración de superficie de 17.53 ng/cm y iii) al sembrar OPCs en células de glioblastoma U343 transfectadas que sobreexpresaban Env, respectivamente. Experimentos de estimulación de control se llevaron a cabo usando la preparación de regulador de pH Env recombinante (20 mM de histidina, 5% (p/v) de sacarosa, 0.01% (p/v) de polisorbato 20, pH 6.0) a diluciones iguales. Mediciones de concentración de NO en sobrenadantes de OPC se llevaron a cabo usando un kit de ensayo de óxido nítrico colorimétrico (Merck-Millipore/Calbiochem, Darmstadt, Alemania) y la absorbancia se determinó a 540 nm usando un lector de placa Anthos 2001 (Anthos labtec Instruments, Salzburg, Austria). La evaluación de la morfología de OPC se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-04 Merck-Millipore/Chemicon, Darmstadt, Alemania) tomando en cuenta el diámetro de la célula y el grado de ramificación del proceso. Inhibidor de IRAK-1/4 1 (1 -(2-(4-morfolinil)etil)-2-(3-nitrobenzoilamino)benzimidazol, N-(2-morfoliniletil)-2-(3-nitrobenzoilamido)-benz-imidazol; SigmaAldrich, Hamburg, Alemania) los experimentos se llevaron a cabo a una concentración de 2,400 nM, experimentos de péptido inhibidor de TRIF (Invivogen, San diego, E.U.A.) se llevaron a cabo a una concentración de 50 mM de acuerdo con los protocolos del fabricante. La inactivación de Env se llevó a cabo exponiendo Env recombinante a una temperatura de 123°C durante 1 hora. Experimentos de bloqueo del receptor de anticuerpo TLR4 se llevaron a cabo a una concentración de anticuerpo de 15 mg/ml. Experimentos de bloqueo de L-NAME/D-NAME se llevaron a cabo a una concentración de 100 mM cada uno, se usó S-nitroso-N-acetil-DL- penicilamina (SNAP) a una concentración de 100 ng/ml. 1.1.2 Precursor de oligodendrocitos y transfección de células de glioblastoma U343 OPCs fueron cultivadas durante 24 horas en medio de proliferación y la transfección se llevó a cabo usando el reactivo NanoJuice (Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania) empleando un shRNA que codificaba para vector de supresión de TLR4 con base en el vector HuSH 29 pGFP-V-RS (OriGene, Rockville, Maryland, E.U.A.) para prueba de especificidad anti-anticuerpo TLR4. Para la expresión de Env unida a membrana en células de glioblastoma U343 un vector de expresión de citrina9 para visualización de células transfectadas se combinó con una sobreexpresión de Env (vector pV14 con nt 1 a nt 1629 de la secuencia de codificación del gen de env tipo HERV-W MSRV -GenBank AF331500.1-suministrado por Geneuro SA, Suiza) a una relación de 1 :5. Un vector vacío correspondiente se usó como control. La transfección de células de glioblastoma U343 se logró usando Lipofectamine (Life Technologies, Darmstadt, Alemania). 1.1.3 Tinciones de tejidos de esclerosis múltiple Para tinciones dobles de 01ig2/Env tejido de MS humano incrustado en parafina fijado con formalina se cortó y secciones de 5 pm fueron desparafinizadas en xileno y rehidratadas a través de alcohol gradado en agua destilada. La actividad peroxidasa endógena se inactivó al incubar los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 0.3% en metal. Los portaobjetos fueron luego enjuagados con agua destilada y transferidos a una solución de 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA (pH 9) para lograr recuperación de antígenos inducida por calor. En adelante, los portaobjetos fueron enfriados a la temperatura ambiente, enjuagados en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) e incubados tanto con anti-01ig2 (1 :300; Merck-Millipore) como con anticuerpo anti-Env 3B2H4 (1 :500, GeNeuro, Geneva, Suiza) durante la noche a 4°C. Después, se incubaron secciones con anti-conejo de burro marcado con Alexa 488 (1 :400; Life Technologies/Molecular Probes, Darmstadt, Alemania) para detectar anti ratón de cabra marcado con 01ig2 y Alexa 555 para visualizar Env. Para tinciones dobles de TLR4/PGRFRa tejido congelado instantáneamente se cortó y secciones de 5 mm fueron incubadas con anticuerpo anti-TLR4 (1 :100; Merck-Millipore) y anti-PDGFa (1 :50; eBiosciences, San Diego, California, E.U.A.) durante la noche a 4°C. TLR4 Se detectó usando anti ratón de cabra marcado con Alexa 488 (1 :400; Life Technologies/Molecular Probes) y PDGFRa con anti-rata de conejo biotinilado (1 :500; Vector Laboratories, Burlingame, CA, E.U.A.) y estreptavidina marcada con Alexa 647 (1 :400; Life Technologies/Molecular Probes), respectivamente. Para tinciones nucleares, se incubaron secciones con solución de tinción Hoechst (1 :100, Sigma-Aldrich, Hamburg, Alemania) durante 1 minuto y se cubrieron con Vectashield (Vector Laboratories). Se llevó a cabo el análisis microscópico con un microscopio de barrido por láser confocal Leica TCS SP2 AOBS (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania). 1.1.4 Tinciones de celulas cultivadas Las tinciones de células cultivadas fijas en paraformaldehído se llevaron a cabo como se describió previamente . Anticuerpos primarios fueron diluidos como sigue: anticuerpo anti-TLR4 (1/1000; Merck- Millipore, Darmstadt, Alemania), anticuerpo anti-Env 3B2H4 (1/500; GeNeuro, Ginebra, Suiza), anticuerpo anti-nucleótido 3’-fosfodiesterasa 2’, 3’-cíclica (CNPase) (1/1000; Covance, Princeton, New Jerscy, E.U.A.), anticuerpo monoclonal anti-proteína básica de mielina (MBP; 1/1000; convance, Princeton, New Jersey, E.U.A.), anticuerpo policlonal anti-proteína básica de mielina (1 : 1000; Millipore, Schwalbach, Alemania), anticuerpo anti-galactocerebrósido (GalC), anticuerpo anti-04 (ambos 1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania); anticuerpo anti-3-NT (1/1000; Abcam, Cambridge, MA, E.U.A.) y anticuerpo anti-NFicB (1/1000; Abcam, Cambridge, MA, E.U.A.). Anticuerpos conjugados a Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594 (ambos 1 :500), se usaron para visualización de señal. Los núcleos fueron teñidos con 4’,6-diamino-2fenilindol (DAPI; Roche, Basel, Suiza). 1.1.5 Preparación de ARN, síntesis de ADNc reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa cuantitativa La purificación de ARN a partir de células cultivadas se llevó a cabo usando el procedimiento RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). ARN aislado se transcribió inversamente usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Life Technologies/Applied Biosystems). La determinación cuantitativa de los niveles de expresión génica se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencia 7900HT (Life Technologies/Applied Biosystems) usando la mezcla maestra universal Power SybrGreen (Life Technologies/Applied Biosystems). Secuencias de cebadores se determinaron usando software PrimerExpress 2.0 (Life Technologies/Applied Biosystems) y se probaron para la generación de amplicones específicos: TLR4_fwd: CTGGGTTTCTGCTGTGGACA (SEQ ID NO: 7) TLR4_rev: AGGTTAGAAGCCTCGTGCTCC (SEQ ID NO: 8) riNOS_fwd: CTCAGCACAGAGGGCTCAAAG (SEQ ID NO: 9) riNOS rev: TGCACCCAAACACCAAGGT (SEQ ID NO: 10) huiNOS fwd: TGAGGAGCAGGTCGAGGACT (SEQ ID NO: 11) huiNOS_rev: TGATAGCGCTTCTGGCTCTTG (SEQ ID NO: 12) huGAPDH_fwd: TGGACCTGACCTGCCGTCTA (SEQ ID NO: 13) huGAPDH rev: AGGAGTGGGTGTCGCTGTTG (SEQ ID NO: 14) TNFa fwd: AGCCCTGGTATGAGCCCATGTA (SEQ ID NO: 15) TNFa rev: CCGGACTCCGTGATGTCTAAG (SEQ ID NO: 16) ILipjwd: GAAACAGCAATGGTCGGGAC (SEQ ID NO: 17) ILlp rev: AAGACACGGGTTCCATGGTG (SEQ ID NO: 18) IL6_fwd: GTTGTGCAATGGCAATTCTGA (SEQ ID NO: 19) IL6_rev: TCTGACAGTGCATCATCGCTG (SEQ ID NO: 20) GAPDH fwd: GAACGGGAAGCTCACTGGC (SEQ ID NO: 21 ) GAPDH rev: GCATGTCAGATCCACAACGG (SEQ ID NO: 22) ODC fwd: GGTTCCAGAGGCCAAACATC (SEQ ID NO: 23) ODC rev: GTTGCCACATTGACCGTGAC (SEQ ID NO: 24) GAPDH y ODC se usaron como genes de referencia, y los niveles de expresión génica relativos se determinaron de acuerdo con el método AACt (Life Technologies/Applied Biosystems). Cada muestra se midió por cuadruplicado. Los datos se muestran como valores medios ± desviación estándar, y se aplicó la prueba t para determinar el significado estadístico. 1.2 Resultados 1.2.1 Localización de proteína Env cerca de lesiones MS activas crónicas y en las inmediaciones de OPCs residentes Usando análisis inmunohistológicos estudiamos la localización de la proteína Env en muestras de tejido cerebral humano. Esto reveló la presencia de proteína Env bastante abundante en NAWM cerca de las lesiones de MS activas crónicas (CAL, figura IB) así como los bordes de CALs en cercana proximidad a OPCs 01ig2-positivas (figura 1C). NAWM En mayor distancia a lesiones no mostró inmunorreactividad a Env discernible (figura 1A). Para evidenciar más el impacto potencial de la proteína Env en OPCs residentes y de esta manera en la reparación de mielina relevante, buscamos además OPCs doble-positivas a TLR4 y receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas alfa (PDGFRa). Pudimos detectarlas en cerebros sanos (figura 1D-D”’) y en NAWM de pacientes de MS (figura 1E-E’”). Esto demostró claramente que en cerebro de MS, OPCs positivas para TLR4 pueden detectarse en las inmediaciones de células que expresan HERV-W Env o de la proteína secretada correspondiente, lo cual los hace objetivos susceptibles de este agonista patógeno de TLR-4 como el descrito10. No obstante, esto constituye un descubrimiento inesperado y abre perspectivas aún no vistas de aplicación debido a que TLR4 se desconocía previamente que fuera expresado en tales condiciones en OPCs y sobre todo, además no se sabía, debido a que la proteína de envoltura HERV-W tal como MSRV-Env por lo tanto no podría contemplarse como interactuando directamente con OPCs en esta etapa precisa de diferenciación con efectos dramáticos finales en su potencial de mielinización. 1.2.2 Expresión de TLR4 por OPCs de rata y humanas cultivadas Estudios previos habían evidenciado esencialmente un efecto pro-inflamatorio dependiente de TLR4 en monocitos y células dendríticas10. La inmunotinción con anti-TLR4 confirmó la expresión de este receptor en la superficie de células precursoras oligodendrogliales tanto de ratas como humanas (figuras 2C,C’ y 5B). Además, la supresión mediada por ARNsh específica de TLR4 en OPCs de rata sustanció la especificidad del inmunomarcado previo (figura 2B,B’). Para poder evaluar la cinética de expresión del receptor TLR4 a partir de OPCs jóvenes a maduras, llevamos a cabo co-tinción usando anticuerpo anti-galactocerebrósido (GalC), así como anticuerpos anti-proteína básica de mielina (MBP), un marcador para OPCs más maduras, después de tres a seis días de diferenciación en cultivo (figura 2C-D’)· Interesantemente, la expresión del gen del receptor de TLR4 con el tiempo se encontró que era subregulada durante el curso de la diferenciación celular (figura 2A), mientras que la detección de proteína TLR4 específica sólo produjo una señal débil en puntos de tiempo tardíos en OPCs de rata madura morfológicamente (figura 2D) en comparación con células más jóvenes. 1.2.3 Estimulación de OPC por Env induce la expresión de citocinas pro-inflamatorias y la NO sintasa inducible La estimulación de OPCs de rata por proteína Env recombinante disuelta en medio (Env soluble; 100 ng/ml; figura 3 A), recubierta sobre cajas de cultivo de células (Env sólida; figura 3B) o sobre-expresada en la superficie de células de glioblastoma U343 transfectadas (pV14Env; figura 3C-E’) llevó a un fuerte incremento de transcripción de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) así como la inducción de citocinas pro inflamatorias tales como TNFa, IL-I b e IL-6 (figura 21-K) en comparación con las condiciones de control (tratadas con regulador de pH o con vector vacío). A su vez, una expresión de iNOS incrementada llevó a una elevación dependiente de concentración de Env de su producto inductor de estrés nitrosante óxido nítrico (NO) en los sobrenadantes de células (figura 3H). De manera interesante, la morfología de OPC de rata permaneció sin alterar durante la estimulación de Env como se muestra por tinciones de con 04 de oligodendroglias llevada a cabo después de un día y cinco días de la exposición a Env (figura 3F-G’). OPCs GalC Humana-positivas también se encontró que expresaban TLR4 (figura 5B,B’) y la estimulación con Env recombinante (tanto en solución así como recubierta sobre la superficie de la caja) indujo similarmente transcripción de iNOS (figura 5A). Además, observamos que la estimulación de Env no afectó la supervivencia de OPC (según se revela por túnel y por cuantificación de números de células totales; datos no mostrados) ni indujo fenotipo de OPC senescente (investigado por tinciones con b-galactosidasa; datos no mostrados). La estimulación por Env de OPCs de rata maduras (matOPCs; mantenidas en medio de diferenciación durante seis días) llevó a una reacción pro inflamatoria sustancialmente más débil determinada por niveles de transcripción de iNOS, TNFa, IL-lb e IL-6, en comparación con los efectos en OPCs inmaduras (figura 4). Esta observación concuerda con los niveles de expresión de TLR4 más bajos encontrados en OPCs maduras (figura 2) y sugiere una superior sensibilidad de las células inmaduras hacia Env estableciendo un paralelo con el nivel de expresión de TLR-4. 1.2.4 Env media sus efectos por medio de TLR4 y la respuesta pro-inflamatoria incluye IRAK-1/4. TRIF y NFKB Para poder probar especificidad de Env hacia TLR4 y para arrojar más luz en la señalización descendente llevamos a cabo un número de experimentos de control (figura 6). La inactivación con calor de Env recombinante antes de la estimulación de OPC llevó a una reducción altamente significativa de la inducción de iNOS en comparación con controles (figura 6A). Una reducción significativa similar de transcripción de iNOS podría observarse usando bloqueo mediado por anticuerpos de TLR4 conformando así la especificidad de Env hacia este receptor y su relevancia con respecto a los efectos descendentes pro-inflamatorios observados (figura 6D). Para arrojar luz sobre las vías intracelulares después de la activación de TLR4 por Env investigamos los papeles de las dos vías descendentes conocidas después de la activación por TLR4, la vía dependiente de MyD88 que incluye IRAk-1/4 (cinasa-1/4 asociada al receptor de interleucina 1) y la vía independiente de MyD88 que incluye TRIF (interferón b inductor del adaptador que contiene dominio TRIF). La aplicación del inhibidor 1 de IRAK-1/4 o un péptido inhibidor de TRIF dio como resultado en niveles de expresión de iNOS reducidos significativamente en presencia de Env (figura 6B,C) demostrando que la activación mediada por Env de TLR4 lleva a la activación tanto de una vía de transducción de señales dependiente de MyD88 como de la independiente de MyD88. Ambas vías pueden convergen en la translocación nuclear del NFKB (potenciador de la cadena ligera k de factor nuclear de células B activadas). Usando anticuerpos anti-NFxB confirmamos que la estimulación con Env lleva a un fuerte incremento de OPCs con localización de NFKB nuclear (figura 6E-G’) proporcionando una explicación de la sobrerregulación transcripcional observada de las citocinas pro inflamatorias. 1.2.5 Inducción mediada por Env del marcador de estrés nitrosante nitrotirosina NO, el cual se incrementó significativamente después de la estimulación de Env (véase figura 3H), es una especie de nitrógeno reactiva (RNS). NO Puede reaccionar con una multitud de moléculas intracelulares incluyendo proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, lo cual resulta en la formación de residuos de 3-nitritirosina (3-NT). Encontramos que la exposición de OPCs de rata a proteína Env recombinante llevó a un fuerte incremento de células 3-NT-positivas en comparación con controles de regulador de pH (figura 7B,B’ y C,C’) indicando una inducción de estrés nitrosante mediada por NO. Sin embargo, después de pre-incubación con la molécula inhibidora de iNOS L-NAME (éster metílico de L-NG-nitroarginina) se encontró que la producción de NO era reducida significativamente (datos no mostrados), al igual que la formación de OPCs positivos para 3-NT (figura 7D,D’). Cuando D-NAME, el enantiómero inactivo de L-NAME, se usó como un control negativo, la formación de 3-NT mediada por Env no fue afectada (figura 7E,E’). Por otro lado, la aplicación de SNAP (S-nitroso-N-acetilpenicilamina), un fuerte donador de NO, sirvió como control positivo y se tradujo en nitrotirosinilación de casi todas las OPCs (figura 7F, F’). Importantemente, OPCs positivas para 3-nitrotirosina, reveladas por su expresión del marcador precursor PDGFRa, también pudieron ser detectadas en la NAWM de cerebros de pacientes con MS (figura 7G-G’”) indicando que este mecanismo de estrés es de relevancia patológica en MS. 1.2.6 Env afecta la expresión de mielina de OPCs Después de estas observaciones investigamos si la proteína Env puede afectar los procesos de diferenciación oligodendrogliales que se ha demostrado son necesarios para actividades de reparación de mielina. Para este propósito, OPCs de rata estimuladas con Env fueron evaluadas para la expresión de proteínas de mielina CNPase (nucleótido 3’-fosfodiesterasa 2’ , 3’-cíclica) después de tres días de estimulación con Env y MBP (proteína básica de mielina) después de seis días de estimulación, respectivamente. Los resultados revelaron que Env redujo fuertemente el número de células positivas a CNPase y MBP (figura 8A-D”’) a diferencia de la expresión sin cambios del marcador precursor 04 (figura 3F-G’). Esto demostró una reacción de diferenciación celular significativamente deteriorada en presencia de la proteína Env. Sin embargo, la adición de L-NAME pero no de D-NAME en paralelo con la estimulación con Env pudo rescatar la expresión de MBP (figura 8E-H’), evidenciando así un enlace directo entre la formación de 3-NT por medio de estrés nitrosante y una capacidad de diferenciación de OPC reducida. 1.3 Análisis de resultados La remielinización de NS eficiente en enfermedades desmielinizantes neuroinflamatorias tales como MS se cree que es causada principalmente por una capacidad reducida de OPCs residentes para diferenciarse adecuadamente y para remielinizar axones desmielinizados1 * 13, pero ninguna molécula patógena mayor y corriente arriba mostró causar este bloqueo de remielinización. Estudios previos han demostrado ya que la proteína de envoltura Env de HERV-W, también llamado “elemento retroviral asociado a esclerosis múltiple” (MSRV) cuando se obtiene de partículas retrovirales correspondientes14, ejerce un efecto pro-inflamatorio en el sistema inmunológico innato activando células mononucleares que, a su vez, producen citocinas pro-inflamatorias mayores10. Sin embargo, un enlace directo entre Env y una capacidad de diferenciación de OPC reducida hasta el momento no ha podido ser, y podría no ser, contemplado. Demostramos aquí que esta proteína Env puede ser detectada en tejido de NS afectado por MS y que Env es capaz de interferir con la diferenciación de OPC a través de una presencia previamente desconocida del receptor de Env, TLR4, en OPCs en ciertas etapas de diferenciación. Este efecto dañino es causado por medio de iNOS. Esta respuesta de estrés se traduce en formación de nitrotirosina y afecta directamente la expresión de proteínas de mielina. Interesantemente, la estimulación de Env no afectó las tasas de supervivencia de células OPC y las morfologías celulares permanecieron sin alteración sugiriendo que las señales mediadas por Env no se dirigen a elementos citoesqueléticos. De importancia y confirmando la novedad de los presentes descubrimientos inesperados, estudios previos han asegurado en ausencia de TLR4 en células oligodendrogliales en el cerebro humano15. Sin embargo, en contraste con este conocimiento previo del dominio, pudimos demostrar claramente que TLR4 no sólo es expresado en OPCs primarias cultivadas (tanto de origen de rata como humano) sino también en OPCs humanas residentes PDGFRa-positivas en tejido MS. Estas diferencias podrían derivarse del hecho de que Lehnhardt y colegas usaron el marcador más general 04 para la detección de células oligodendroglias mientras nosotros nos basamos en el marcador precursor recién aceptado PDGFR-a en su lugar. No obstante, hemos por lo tanto evidenciado este patrón peculiar de expresión de TLR4 en OPCs por primera vez, cuando esto aún se creía que no existía. Además, observamos una fuerte subregulación de TLR4 durante la maduración de OPC sugiriendo que la expresión del receptor y, en consecuencia la susceptibilidad a Env, está restringida a células inmaduras. No obstante, este descubrimiento es de relevancia patológica toda vez que hace a estas células capaces de interactuar directamente con la proteína Env que muestra ser expresada y liberada en lesiones de MS. En vista de estos descubrimientos concluimos que la proteína MSRV/HERV-W Env no sólo es un componente inmunopatológico de MS sino que también puede ejercer un impacto negativo significativo en actividades de reparación de mielina endógena. Se concluye por lo tanto que una capacidad de reparación reducida como la observada en muchos pacientes de MS durante el curso de la enfermedad se debe a la activación de los elementos MSRV/HERV-W2. Cabe mencionar que un estudio previo describió los efectos experimentales de una proteína HERV-W Env codificada por una copia defectuosa (incapaz de producir actividad RT ni partículas toda vez que carecía de secuencias de codificación en los genes gag y pol) con inserción estable en el cromosoma 716. Esta proteína Env puede ser expresada por el único gen codificador del elemento HERV-W 7q (env, o locus ERVW-E1), tiene una supresión de cuatro aminoácidos en la parte C-terminal de su dominio de superficie que causa aparentemente un peculiar enrutamiento celular y se sabe que tiene expresión in vivo al nivel de proteína restringidas de placenta17, 18. Esta proteína es de hecho un ejemplo de una proteína HERV “domesticada”17, que juega ahora un papel fisiológico en la formación de tejido sincitiotrofoblasto y por lo tanto llamada “Sincitina”19. El dominio fusogénico correspondiente en HERV-W Env, así como el dominio de unión a TLR4, pueden ser más o menos conservados entre los subtipos de HERV-W (por ejemplo, MSRV-Env o Sincitina). Su disponibilidad como una proteína de superficie o extracelular con exposición conformacional de un dominio activo es altamente regulada y el papel fisiológico de sincitina sigue oculto en sincitiotrofoblasto y limitado a la presencia de una placenta. Así, una patogenicidad asociada parece ser la característica de una activación no fisiológica, por ejemplo, por ciertos agentes infecciosos ambientales20,21 en humanos, o de condiciones in vitro o in vivo transgénicas experimentales. Se reportó que sincitina se encontraba en astroglia NS de individuos con esclerosis múltiple (MS), pero usando un anticuerpo reportado en cualquier lado para detectar el subtipo MSRV-Env de HERV-W y no sincitina22. La secuencia sincitina no obstante podría ser expresada por transgénesis en astrocitos de ratón causando la liberación de citosinas dañinas para oligodendrocitos16, pero los ratones transgénicos revelaron no ser viables (C. Power’s personal communication to H. Perron, Neurovirology symposium, San diego, 2007). Sin embargo, aunque Antony y colegas encontraron oligodendrocitos mielinizantes positivos para adomatosis poliposis coli (APC) como vulnerables a la citotoxicidad mediada por sincitina en tales cerebros de ratón transgénicos, fuimos capaces de demostrar que sólo OPCs inmaduras son significativamente propensas a claves pro-inflamatorias mediadas por Env cuando las células maduras no. Por lo tanto, los resultados de este estudio son ahora atractivos para los resultados a partir de condiciones experimentales artifactuales ligadas a sus condiciones de expresión forzada transgénica de una proteína placentaria en células cerebrales. A diferencia de estos resultados deducido de condiciones artificiales, hemos ahora revelado un mecanismo dañino que resuelve la capacidad de reparación endógena del sistema del sistema nervioso (NS) adulto y no la patología de MS como tal, la cual incorpora prominentemente una pérdida mediada inmunológicamente de oligodendrocitos y de vainas de mielina con daño axonal. De hecho, los efectos mediados por Env en células inmunes en asociación con lesiones inflamatorias de NS están ahora bien documentados7’10’23 25, pero ningún estudio previo había evidenciado tal patogenicidad directa de HERV-W Env en células gliales con una implicación en el bloqueo de remielinización de placas MS por OPCs. Los presentes resultados que asocian inmunohistología cerebral MS que muestran una extensa expresión de proteína de Env en placas de MS activas o en el borde de lesiones menos activas soportan ahora tal papel en el defecto conocido en remielinización por OPC en lesiones de MS.

Ejemplo 2: El bloqueo de remielinización inducida por la proteína de envoltura de la familia HERV-W se trata eficientemente con anticuerpo específico anti-Env La proteína de envoltura de la envoltura de la familia HERV-W (Env, en particular del subtipo de retrovirus asociado a esclerosis múltiple, MSRV-Env) es un potente inhibidor de la capacidad de OPC no remielinizante para diferenciarse en oligodendrocitos maduros productores de mielina, lo cual parece ser una etapa crítica en el proceso de remielinización. Hemos investigado el efecto de la proteína MSRV-Env en la expresión de dos marcadores diferentes de la diferenciación de oligodendrocitos: CNPase (nucleótido-3’-fosfohidrolasa 2’,3’-cíclica) representa 4% de las proteínas de mielina totales y está presente en el citoplasma del envainamiento oligodendroglial no compactado de axones. CNPase Es la proteína específica de mielina más recientemente conocida que es sintetizada por oligodendrocitos en desarrollo.

- MBP (proteína básica de mielina) constituye tanto como 30% de las proteínas de mielina y juega un papel principal en la compactación de mielina en los sistemas nervioso central y periférico. Aparece secuencialmente después de CNPase tanto in vivo como in vitro y es un marcador específico de oligodendrocitos maduros. El objetivo del presente estudio era determinar si el anticuerpo anti-Env específico tal como GNbACl , un anticuerpo monoclonal anti-Env IgG4 humanizado recombinante, puede bloquear la inhibición de la maduración de OPC inducida por MSRV-Env. De hecho, tal efecto de GNbACl podría ser indicador de propiedades “anti-bloqueo de células remielinizantes” del anticuerpo. Para probar esta hipótesis, OPCs humanas en cultivo primario se incubaron con MSRV-Env, con o sin GNbACl , ya sea por recubrimiento de la proteína recombinante en la superficie de cultivo o al añadir la proteína en el medio de cultivo. Las expresiones de CNPase (como un marcador de maduración temprano) y MBP (como un marcador de maduración tardío), fueron evaluadas por inmunocitoquímica después de uno o tres días de estimulación, respectivamente.

En el presente ejemplo, MSRV-Env se refiere a la proteína MSRV-Env recombinante de longitud completa que contiene dominios intracelulares, transmembrana y extracelulares de la proteína de envoltura HERV-W.

Los resultados representados aquí demuestran que OPC humana expresa específicamente TLR4 sobre su membrana de plasma y demuestran que la proteína recombinante MSRV-Env reduce específica y significativamente el número de células positivas a CNPase y MBP. Estas observaciones están en línea con aquellas del ejemplo 1 en OPC humana y de rata. Además, nuestros experimentos demuestran por primera vez que la inhibición (bloqueo) de la maduración de OPC humana inducida por MSRV-Env es completamente invertida por un tratamiento con GNbACl, demostrando sus novedosas y previamente inesperadas propiedades terapéuticas. Esto proporciona en consecuencia indicación adicional en el tratamiento de formas progresivas de esclerosis múltiple. 2.1 Materiales y métodos 2.1.1 Materiales Materiales usados para cultivo primario de OPC humana Materiales usados para la evaluación de la expresión de marcadores de maduración en OPC humana Materiales usados para la estimulación de OPC con MSRV-Env, GNbACl y regulador de pH MSRV-Env 2.2.2 Protocolos Incubación de OPC humana con MSRV-Env, regulador de pH de MSRV-Env y GNbACl MSRV-Env Recombinante de longitud completa se produjo y purificó por PX’Therapeutics (548 aa; 61 ,44 Kda) (lote 110719-1). La concentración inicial fue 0.6 mg/ml (9.76 mM). Regulador de pH MSRV-Env (20 mM de Trizma-HCl, pH 7.5, 150 mM de NaCl, 1.5% de SDS, 10 mM de DTT) fue proporcionado por PX’Therapeutics. Esta solución se usó como un control negativo. GNbACl (lote T96/bACl/Bl ; producción de GMP) se produjo y purificó por Polymun Scientific, Vienna, Austria. La concentración inicial fue 10 mg/ml (68.03 mM).

OPC humanas fueron estimuladas con los diferentes tratamientos ya sea al recubrir soluciones en la superficie de la placa de cultivo de células antes de la siembra de células o al añadirlas en el medio de cultivo de células después de la siembra de las células. En cualquier caso, portaobjetos de cámaras de 8 pocilios labtek (Nunc) fueron previamente recubiertos con poli-L-lisina (Sgima-Aldrich) durante la noche a 37°C.

Recubrimiento de portaobjetos de cámaras de 8 pocilios Labtek Los tratamientos diferentes fueron diluidos en PBS bajo una campana de flujo laminar estéril (Fischer Bioblock, Francia) y los portaobjetos de cámaras de 8 pocilios Labtek (Nunc; 250 ml por pocilio) fueron recubiertos como sigue: - MSRV-Env (1 mg/ml) recubierto durante 2 horas a 37°C - Regulador de pH MSRV-Env (misma dilución que MSRV-Env) recubierto durante 2 horas a 37°C - MSRV-Env + GNbACl Al : MSRV-Env (1 pg/ml) y GNbACl (7.35 pg/ml = 50 nM) mezcla recubierta durante 2 horas a 37°C - MSRV-Env + GNbACl B l : MSRV-Env (1 g/ml) recubierta durante 2 horas a 37°C, lavada con PBS y posteriormente recubierta con GNbACl (7.35 pg/ml = 50 nM) durante 1 hora a 37°C - MSRV-Env + GNbACl B2: MSRV-Env (1 pg/ml) revestido durante 2 horas a 27°C, lavada con PBS y posteriormente recubierta con GNbACl (29.4 pg/ml = 200 nM) durante 1 hora a 37°C.

- GNbACl Al solo: GNbACl (7.35 pg/ml = 50 nM) recubierto durante 2 horas a 37°C.

- GNbACl A2 solo: GNbACl (29.4 pg/ml = 200 nM) recubierto durante 2 horas a 37°C.

- GNbACl B1 solo: PBS durante 2 horas a 37°C, luego recubierto con GNbACl (7.35 mg/ml = 50 nM) durante 1 hora a 37°C.

- GNbACl B2 solo: PBS durante 2 horas a 37°C, luego recubierto con GNbACl (29.4 pg/ml = 200 nM) durante 1 hora a 37°C.

- BSA (1 pg/ml) recubierto durante 2 horas a 37°C.

- BSA + GNbACl Al : BSA (1 pg/ml) y GNbACl (7.35 pg/ml = 50 nM) mezcla recubierta durante 2 horas a 37°C.

- BSA + GNbACl A2: BSA (1 pg/ml) y GNbACl (29.4 pg/ml = 200 nM) mezcla recubierta durante 2 horas a 37°C.

- BSA + GNbAC l Bl : BSA (1 pg/ml) recubierto durante 2 horas a 37°C, lavado con PBS y posteriormente recubierto con GNbACl (7.35 pg/ml = 50 nM) durante 1 hora a 37°C.

- BSA + GNbACl B2: BSA (1 pg/ml) recubierto durante 2 horas a 37°C, lavado con PBS y posteriormente recubierto con GNbACl (29.4 pg/ml = 200 nM) durante 1 hora a 37°C.

Cultivo de células precursoras de oligodendrocitos humanos OPC, Aisladas de tejido cerebral humano, se compraron de ScienCell Research Laboratories (a través de 3H Biomedical, Suecia). Cada vial contiene >1 x 106 células en 1 mi. El medio de cultivo OPC completo (OPCM) fue reconstituido mediante la adición de solución de crecimiento de OPC (OPCGS), y penicilina/estreptomicina (P/S) a un OPCM de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

El vial que contenía las OPC humanas fue puesto en un baño de agua a 37°C y agitado suavemente mediante rotación hasta que el contenido se descongelara completamente. Las células fueron resuspendidas suavemente con una pipeta Gilson de 1 mi. Luego, fueron diluidas en OPCM completo, y sembradas en los recipientes de cultivo labtek de 8 pocilios (7,000 células/cm2 = 10,000 células por pocilio) previamente recubiertos con poli-L-lisina (0.01 %, Sigma) y con (o sin) los tratamientos descritos arriba (véase 3.2.1.1) bajo una campana de flujo laminar estéril (Fischer Bioblock, Francia). Los cultivos se incubaron a 37°C; 5% de CO2 hasta experimentos de inmunocitoquímica subsecuentes. El medio de crecimiento se cambió al día siguiente para retirar el DMSO residual y las células no fijadas en los cultivos se trataron durante 72 horas.

Incubación con MSRV-Env en el medio de cultivo Después de 3 horas de pre-cultivo (véase 3.2.1.2) de las OPC humanas en los recipientes de cultivo labtek de 8 pocilios, las células fueron incubadas a 37°C durante 24 horas o 72 horas en los labteks de 8 pocilios (250 ml/pocillo) con la adición de las siguientes soluciones: - Regulador de pH MSRV-Env, usado como un control negativo, añadido en medio de cultivo de células completo - MSRV-Env añadido a 3 nM (0.184 mg/ml) en medio de cultivo de células completo - MSRV-Env (3 nM) + GNbAC 1 (200 nM; 29.4 mg/ml) mezcla añadida en medio de cultivo de células completo - GNbAC 1 (200 nM) solo añadido en medio de cultivo de células completo Expresión de marcadores de TLR4 y mielinización en OPC in vitro Después de 24 ó 72 horas de incubación, el medio de cultivo de células fue retirado y OPC humanas estimuladas por tratamientos descritos arriba (véase 3.2.1) se fijaron en solución de paraformaldehído (4% de PFA en PBS, 250 ml por cámara) a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, fueron lavados tres veces en PBS (3 x 250 ml por cámara) y los sitios de unión no específica fueron saturados por incubación con un suero de bovino fetal al 10% (FBS) en solución de PBS que contenía 0.1 % de Tritón X100 (250 m? por cámara) durante 1 hora a 37°C. En el caso de la tinción con TLR4, las células fueron incubadas con 10% de FBS en PBS únicamente (250 m? por cámara). Después de la saturación, los cultivos de OPC fueron incubados con soluciones de anticuerpo primario durante la noche a 4°C, diluidas en 10% de FBS en solución de PBS (200 m? por cámara), como sigue: - Anticuerpos anti-TLR4 de ratón a 1/1000 (después de 24 y 72 horas de cultivo) - Anticuerpos anti-CNPase de ratón a 1/200 (después de 24 horas de estimulación) - Anticuerpos anti-MBP de ratón a 1/100 (después de 72 horas de estimulación) Las células fueron lavadas 3 veces en PBS (3 x 250 ml por cámara), e incubadas con soluciones de anticuerpo secundario durante 1 hora a 37°C (250 ml por cámara), como sigue: - Anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados a FITC a 1/200 Después de 3 lavados en PBS (3 x 300 m? por cámara) a temperatura ambiente, las cámaras de plástico se separaron de los portaobjetos. Los portaobjetos fueron luego montados en medio de montaje Vectastain® que contenía DAPI (Vectashield). Las tinciones se visualizaron mediante microscopía fluorescente usando un microscopio Axioscope (Zeiss).

Análisis de datos Después de 24 horas de estimulación con MSRV-Env-T (o control), células inmunorreactivas a CNPase fueron contadas en 10 campos por cámara seleccionada aleatoriamente. El porcentaje de células positivas a CNPase se calculó como: 100 x n CNPase + n CNPase + = número de OPC inmunorrectivas nDAPI para CNPase Después de 72 horas de estimulación con MSRV-Env-T (o control), células inmunorreactivas a MBP se contaron en 10 campos por cámara seleccionada aleatoriamente. El porcentaje de células positivas a MBP se calculó como: 100xnMBP + n MBP + = número de OPC inmunorreactivas para nDAPI MBP Los datos se presentaron como media ± SEM de porcentaje de células positivas a CNPase o MBP. Se hicieron gráficos usando software GraphPad, versión 5.00 para Windows (San Diego California, E.U.A.). Las pruebas estadísticas no paramétricas se llevaron a cabo usando Sigma Stat (Chicago, IL, E.U.A.).

Los siguientes resultados fueron recolectados durante tres series independientes de experimentos, cada una de ellas llevada a cabo con un nuevo vial de OPC: OPC ICC 01 , OPC ICC 02 y OPC ICC 03. 2.2 Resultados 2.2.1 Expresión de receptores de TLR4 en OPC humanas La expresión de TLR4 se evaluó mediante microscopía de inmunofluorescencia. La etapa de saturación llevada a cabo sin ningún detergente permite la detección de TLR4 en la superficie celular únicamente. Este experimento confirmó la presencia del receptor objetivo de MSRV-Env en la superficie celular de OPC humanas después de 24 y 72 horas de cultivo primario (no mostrado). 2.2.2 Expresión de CNPase y MBP en OPCs humanas in vitro La morfología de OPCs humanas in vitro se visualizó con microscopía de campo brillante. OPCs Presentaron un cuerpo celular y generalmente dos extensiones celulares. Las expresiones de CNPase y MBP se confirmaron mediante microscopía de inmunofluorescencia después de 24 horas y 72 horas en cultivo, respectivamente (no mostrado). 2.2.3 Efectos de MSRV ENV con o sin GNbACl en la diferenciación de OPCs humanas Efecto de MSRV-Env recubierto en la expresión de marcadores de maduración en OPCs humanas en cultivo primario (OPC ICC 01) Los objetivos de este primer conjunto de experimentos (OPC ICC 01 ) fueron establecer condiciones de cultivo primarias para OPC humanas, así como el pre-recubrimiento de portaobjetos de cámaras labteks con protocolos de inmunotinción con MSRV-Env y CNPase y MBP.

Los recipientes de cultivo labtek fueron recubiertos con 1 gg/ml de MSRV-Env antes de sembrar las OPC humanas. Como un control negativo (regulador de pH), los recipientes de cultivo fueron incubados con las mismas condiciones con regulador de pH MSRV-Env únicamente.

El porcentaje de células positivas a CNPase se reduce significativamente de 85 ± 4% en la condición de control (regulador de pH) a 69 ± 6% en las OPC humanas estimuladas durante 24 horas en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env (* ^<0.05; prueba t) (figura 9A).

Después de 72 horas de cultivo, el porcentaje de células positivas a MBP se reduce significativamente de 74 ± 7% en la condición de control (regulador de pH) a 25 ± 3% en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env (+Env-T) (* ¿><0.001 prueba de suma de clasificaciones de Mann-Whitncy) (figura 9B). Estos resultados demuestran que MSRV-Env inhibe la maduración de OPCs humanas en células mielinizantes in vitro.

Efecto de GNbACl en la inhibición de la maduración de OPC inducida por MSRV-Env (OPC ICC 02) Los objetivos de este segundo conjunto de experimentos (OPC ICC 02) fueron confirmar el efecto de MSRV-Env en la diferenciación de OPCs humanas, y determinar si MSRV-Env también puede inhibir la diferenciación de OPCs humanas cuando la proteína se añade directamente al medio de cultivo de células. Además, también hemos probado si GNbACl puede inhibir los efectos de MSRV-Env en este modelo.

En el caso de la estimulación de OPCs humanas en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env, los tratamientos con GNbACl fueron evaluados en dos protocolos diferentes. Primero, portaobjetos de cultivo labtek fueron pre-incubados con una mezcla de MSRV-Env (1 mg/mL) y GNbACl (50 nM o 200 nM) antes de sembrar las OPCs (condición GNbACl -A). El segundo protocolo consistió en un recubrimiento secuencial con MSRV-Env (1 mg/mL) seguido por un recubrimiento con GNbACl (50 nM o 200 nM) antes de sembrar las OPC (condición GNbACl-B).

Efectos de MSRV-Env y GNbACl en la expresión de CNPase en OPCs humanas Después de 24 horas de estimulación, una reducción significativa del porcentaje de células positivas a CNPase de 75 ± 2% en la condición de control (regulador de pH) a 55 ± 2% se observa en labteks pre-recubiertos con 1 mg/ml MSRV-Env (*p<0.001 vs. regulador de pH; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc LSD de Fisher). Además, la estimulación en labteks pre-recubiertos con 1 pg/ml de BSA no tuvo efecto en la expresión de CNPase (71 ± 2%), demostrando que el efecto observado con MSRV-Env es específico toda vez que no se observó con una proteína de control (figura 10A).

GNbACl Inhibe significativamente la reducción de células positivas a CNPase inducidas en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env (figura 10A). El efecto de GNbACl se observa a 50 nM y 200 nM, y en los dos protocolos de tratamiento probados: (i) condición GNbACl-A, 50 nM (69 ± 4%), 200 nM (80 ± 2%); (ii) condición GNbACl -B 50 nM (96 ± 3%) y 200 nM (76 ± 4%) (y <0.001 , ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc Fisher LSD). Además, el efecto de GNbACl parece ser dependiente de concentración (figura 10A).

Experimentos de control adicionales demostraron que OPCs humanas estimuladas durante 24 horas en labteks pre-recubiertos con GNbACl solo (50 nM o 200 nM), o con una mezcla de GNbACl (50 nM o 200 nM) + BSA (1 mg/ml) no tuvo efecto en la expresión de CNPase cuando se comparó con la condición de control (regulador de pH) (p > 0.05; ANOVA de una vía) (figura 10B). Estas observaciones se hicieron con los dos protocolos de tratamiento GNbACl descritos previamente (GNbACl -A 50 nM, GNbACl A 200 nM y GNbACl -B 50 nM).

Este experimento también demuestra que incluso bajas concentraciones de MSRV-Env en solución inducen una reducción significativa del porcentaje de células positivas a CNPase después de 24 horas, de 78 ± 2% en la condición de control (regulador de pH) a 57 ± 2% en el grupo MSRV-Env (*p<0.001 vs. regulador de pH; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc Fischer LSD) (figura 11). Además, el tratamiento con GNbACl (200 nM) antagoniza completamente la reducción de la expresión de CNPase inducida por MSRV-Env (76 ± 2%; yp<0.001 vs. Env-T; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc Fischer LSD). Es interesante notar que 200 nM de GNbACl solo (74 ± 2%) no tiene efecto en la expresión de CNPase cuando se compara con la condición de control (regulador de pH) (figura 11).

Efectos de MSRV-Env y GNbACl en la expresión de MBP en OPC humana Después de 72 horas de estimulación, una reducción significativa del porcentaje de células positivas a MBP de 76 ± 2% en controles (regulador de pH) a 57 ± 1% se observa en labteks pre-recubiertos con 1 mg/ml de MSRV-Env (**¿><0.001 vs. regulador de pH; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc de Fischer LSD) (figura 12A). En este experimento, el cultivo de OPC en látex pre-recubiertos con BSA (1 pg/ml) muestra un porcentaje de células positivas para MBP ligeramente diferente del control (regulador de pH) (69 ± 2%). Sin embargo, el efecto de BSA también es significativamente diferente del efecto de MSRV-Env (¿><0.001 vs. Env-T; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc Fischer LSD), y de esta manera revela que es aislada y un efecto no influenciante en esta serie de experimentos únicamente, toda vez que no se observan otros experimentos o con CNPase en la misma serie.

GNbACl Inhibe significativamente la reducción de células positivas a MBP inducidas en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env (figura 12A). Se observa un efecto parcial de GNbACl a 50 nM, y se logra una inhibición completa a 200 nM, y en ambos protocolos de tratamiento probados: (i) BNbACl -A 50 nM (69 ± 2%) y 200 nM (73 ± 2%) y, (ii) GNbACl -B 50 nM (68 ± 2%) y 200 nM (74 ± 2%) (y <0.001 vs. Env-T; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc de Fischer LSD). Además, el efecto de GNbAC l parece ser dependiente de concentración (figura 12 A).

Este experimento también demuestra una reducción significativa del porcentaje de células positivas a MBP de 76 ± 2% en la condición de control (regulador de pH) a 55 ± 2% en las células estimuladas por MSRV-Env añadido en el medio de cultivo (3 nM) durante 72 horas (*p<0.001 vs. regulador de pH; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc de Fischer LSD) (figura 12B). Más aún, el tratamiento con GNbACl (GNbACl 200 nM) inhibe completamente la reducción de expresión de MBP inducida por MSRV-Env (76 ± 2%, y ?<0.001 vs. Env-T; ANOVA de una vía seguida por análisis post-hoc de Fischer LSD) (figura 12B).

Confirmación de los efectos de BNbACl en la inhibición de la diferenciación de OPC inducida por MSRV-Env (OPC ICC 03) Aunque los resultados descritos arriba fueron emitidos a partir de una considerable cantidad de datos recabados, el objetivo de este tercer conjunto de experimentos (OPC ICC 03) fue la replicación completa del efecto de GNbACl en una serie de experimentos totalmente independientes.

Efectos de las expresiones de MSRV-Env y GNbACl en las expresiones de CNPase y MBP en cultivos de OPC humanas Después de 24 horas de estimulación, una reducción significativa del porcentaje de células positivas a CNPase de 90 ± 1 % en la condición de control (regulador de pH) a 71 ± 1 % se observa en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env (1 mg/ml) (*p<0.05; ANOVA-1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguida por análisis post-hoc de Newman Keuls de estudiante) (figura 13A). Como se describió previamente, GNbACl (200 nM) revierte completamente la inhibición de la expresión de CNPase inducida por MSRV-Env en los dos protocolos del tratamiento con GNbACl probados (GNbACl -A: 90 ± 2%, GNbACl -B: 91 ± 4%) (yp<0.05 vs. Env-T; AANOVA-1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguida por análisis post-hoc de Dunn) (figura 13A).

Después de 72 horas de estimulación, una reducción significativa del porcentaje de células positivas a MBP de 78 ± 2% en la condición de control (regulador de pH) a 55 ± 3% es observada en labteks pre-recubiertos con MSRV-Env (1 pg/ml) durante 72 horas (*p<0.05 vs. regulador de pH; ANOVA-1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguida por análisis post-hoc de Dunn) (figura 13B). Como se describió previamente, GNbACl (200 nM) revierte completamente la inhibición de la expresión de MBP inducida por MSRV-Env en los dos protocolos de tratamiento con GNbACl probados (GNbACl-A: 80 ± 2%, GNbACl-B: 75 ± 2%) (yp<0.05 vs. Env-T; ANOVA-1 de Kruskal-Wallis en clasificaciones seguida por análisis post-hoc de Dunn) (figura 13B).

Datos recabados a partir de experimentos OPC ICC 02 y OPC ICC 03 Resultados obtenidos en las dos series de experimentos diferentes (OPCICC02 y OPCICC03) presentados arriba, fueron recabados en el mismo análisis. Así, los datos graficados de la figura 14 representan 8 a 14 experimentos independientes para CNPase (figura 14A) y MBP (figura 14B). Este análisis demuestra que los efectos de MSRV-Env y GNbACl en la diferenciación de OPC humanas son altamente reproducibles y coherentes.

Para poder normalizar la expresión de los datos, la condición de control (regulador de pH) se usó como referencia y se consideró como 100%. En resumen, estos resultados demuestran que las concentraciones de MSRV-Env usadas en la presente serie inhiben en 24% el número de células positivas a CNPase (CTRL: 100 ± 1 %; ENV: 76 ± 1%) y en 27% el número de células positivas a MBP (CTRL: 100 ± 2%; ENV: 73 ± 2%). GNbACl (200 nM) Revierte completamente el efecto de MSRV-Env en la expresión de CNPase (GNbACl-A: 102 ±1 %; GNbACl -B 101 ± 1 %) (figura 15A), pero también el efecto en la expresión de MBP (GNbACl -A: 101 ± 2%; GNbACl -B 97 ± 2%) (figura 15B). 2.3 Análisis de resultados En consecuencia, datos del presente ejemplo demuestran que MSRV Env inducen una reducción robusta y altamente reproducible en la expresión de dos marcadores específicos de maduración de oligodendrocitos. Así, MSRV Env inhibe la diferenciación de precursores de oligodendrocitos humanos en células mielinizantes. Más aún, demostramos claramente aquí que GNbACl revierte completamente este dañino efecto de MSRV Env, y restablece los niveles normales de CNPase y MBP en este modelo. Estos resultados demuestran que GNbACl trata el bloqueo de diferenciación de OPC inducido por HERV-W/MSRV-Env. Por lo tanto, estos resultados apoyan fuertemente una indicación innovadora de GNbACl para tratar lesiones desmielinizadas inducidas por proteínas de envoltura HERV-W. Esto aplica particularmente a las formas progresivas de esclerosis múltiple para las cuales la remielinización es crítica pero no se presenta a partir de OPC que rodea lesiones MS, debido a células positivas a Env persistentes y secreción como se muestra en el ejemplo 1.

Ejemplo 3: Estudio de los efectos terapéuticos de anticuerpo GNbACl, L-NAME, SMT, DMF o fumarato de sodio en un modelo en murino de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) inducida con glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) y la proteína de envoltura MSRV/HERV-W (Env). 3. A Comparación entre moléculas individuales (monoterapia) y asociaciones de un anticuerpo anti-Env con moléculas pequeñas que inhiben los efectores inducidos por Env en el bloqueo de OPC (terapia combinada). 3.A.I. Material Ratones C57BL/6 de Charles River.

MOG 35-55 Espikem, Srl (Polypeptide company); referencia: SC1272.

GNbAcl ; Lote T950111-8 (anticuerpo IgG4 humanizado anti MSRV/HERV-W que comprende cada una de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) establecidas en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

L-NAME (Ester metílico de NG-nitro-L-arginina) Sigma; referencia: N5751 -5G lote BCBF4375V.

SMT (S) Hemisulfato de metilisotiurea (Sigma); referencia: M84445-100G lote STBC 1003V.

Fumarato de dimetilo (DMF) Sigma; referencia: 242926-100G lote 2507VBCBH.

Methocel MC Sigma; referencia: 64605-100G lote BCBD9989V.

IFA (Sigma) referencia Sigma: F5506-10ML lote: 061M8728. PTX (Toxina de tosferina; Calbiochem); referencia: 516561 lote D00128881.

PBS (Solución salina de pH regulado con fosfato; Lonza); referencia: 516561 ; lote; D00128881.

Env (P’X Therapeutics); lotes de producción de proteína validados como libres de endotoxinas (prueba LDL < 5 Ul/ml) y bioactivos (pruebas QC internas de Geneuro).

Aparato Rotarod (LE8200); Bioseb France). 3. A.2. Métodos Ratones C57BL/6 hembra libres de patógenos (6-8 semanas de edad) se compraron de los laboratorios Charles River y se mantuvieron en las instalaciones para animales durante una semana antes de la inmunización. Un día antes de la inmunización, todos los ratones habían sido pesados y luego evaluados en la prueba Rotarod. Rotarod: Días de entrenamiento : 9 y 8 días antes de la inmunización. La transferencia de ratones, en sus jaulas de casa, de la habitación de retención a la habitación experimental. Los ratones son habituados a la habitación experimental durante 15 minutos. Durante el periodo de entrenamiento, cada ratón se puso en el Rotarod a una velocidad constante (4 rpm) si un ratón caía, se subía de nuevo al rotarod, cuando los ratones estaban cómodos en el rotarod, los ratones estuvieron corriendo durante 120 segundos. Todos los ratones fueron regresados a su jaula, la velocidad se incrementó a 13 rpm y los ratones se volvieron a poner en el rotarod durante 120 segundos. Todos los ratones fueron regresados a su jaula, la velocidad se incrementó a 19 rpm y los ratones fueron puestos de nuevo en el rotarod durante 120 segundos. El ambiente de la habitación experimental se mantuvo constante entre sesiones de prueba con respecto a temperatura e intensidad de luz.

Días de prueba : Un día antes de cada inmunización, los ratones fueron transferidos en sus jaulas de casa, de la habitación de retención a la habitación experimental. Los ratones fueron habituados a la habitación experimental durante 15 minutos. Los ratones recibieron después diez pruebas a 10 niveles de velocidad cada vez más altos, que variaban de 7 a 40 rpm. Retrasos individuales entre caída del rotarod (para las dos pruebas a cada nivel de velocidad) se registraron hasta 60 segundos. Así, el entrenamiento y rendimiento en el sistema rotarod se determinaron para cada animal.

Los resultados de la prueba ROTAROD se expresan como cinética de la media de puntuaciones individuales para cada grupo con SEM indicada por barras, para cada día de prueba y para cada velocidad de prueba dentro del intervalo discriminador para el deterioro neuromotor en las presentes condiciones (16 a 29 rpm).

Se calcula para cada ratón individual, para cada día de prueba y para cada valor de velocidad, como la ganancia relativa o pérdida de tiempo en rotarod (antes de caer), en comparación con el primer día de prueba a la misma velocidad (D-7, antes de iniciar la inducción de enfermedad en grupos relevantes). El valor se calcula como “Tiempo en Rotarod en día X” - “Tiempo en Día 7 para el mismo ratón a la misma velocidad”. Las figuras ilustran las cinéticas para los diferentes grupos en el periodo de estudio completo, para valores de velocidad discriminadores representativos cuando se validan para diferenciar animales enfermos de sanos en nuestras condiciones (por ejemplo, valores de velocidad demasiado altos o demasiado bajos hicieron ya sea que los saludables cayeran inmediatamente o que los enfermos fueran capaces de sostener un movimiento lento).

Los pesos iniciales y datos de rendimiento sirvieron como nuestras referencias, en un entorno en el que cada animal tenía su propio control, antes de que se calcularan los valores medios y las desviaciones estándar por grupo. Diferentes grupos de animales fueron alojados homogéneamente en cada jaula, de acuerdo con la información correspondiente proporcionada antes de cada serie de experimentos.

Evaluación clínica Los animales fueron pesados y calificados clínicamente 5 días a la semana de acuerdo con los siguientes criterios: 0 = sin signos; 1 = parálisis de la cola o hiper-reflejo de extremidades traseras o debilidad de extremidades traseras unilaterales; 2 = debilidad de extremidades caseras o extremidades delanteras bilaterales; 3 = más parálisis unilateral o déficit mayor; 4 = parálisis completa de extremidades delanteras o extremidades posteriores; 5 = más parálisis parcial o déficit mayor de extremidades opuestas; 6 = moribundo o muerto. Estos fueron adaptados a partir de criterios estándares, para reflejar la inducción más rápida de lesiones en cerebro y médula espinal con este modelo.

Los ratones fueron pesados 3 veces a la semana el lunes, miércoles y viernes durante todo el experimento.

Para la serie experimental del ejemplo 3. A, los grupos se definieron como sigue.

Todos los grupos de 6 (seis) ratones habían sido primero inyectados s.c. en el cuello el día 0 y luego en los flancos dorsales el día 7 y 14; con 200 mg de MOG/ratón + 60 pg de MSRV-Env + IFA.

El grupo A fue el grupo de control positivo de EAE inducida por MSRV-Env sin ningún tratamiento.

Para los grupos G a H, los tratamientos con GNbACl , L-NAME, SMT y DMF solos o junto con GNbACl con las dosis indicadas abajo, han sido iniciados el día 12 después de la inmunización cuando ya se había observado la progresión de los síntomas clínicos de EAE. Anticuerpo humanizado GNbACl fue administrado una vez, pero L-Name o SMT se administraron cada 4 días hasta la terminación del estudio el día 29. Con respecto a los grupos E y H, atribuidos para el tratamiento con DMF, hemos determinado previamente el volumen de consumo diario de agua por cada ratón y se ha determinado que (en nuestra condición), cada ratón consumió alrededor de 3.5 mi de agua potable al día. Así, sobre la base de esta medición, una dosis de 1 mg de MDF + 0.08% de Methocel por ratón se añadieron a 3.5 mi de agua potable diariamente.

Se inyectaron 350 ng de toxina de tosferina (PTX) por animal (i.p.) en todos los grupos el mismo día después de cada inyección de inmunógeno, y se replicó 2 días más tarde, como es usual en los protocolos de EAE para poder facilitar la migración de linfocitos a través de la barrera hematoencefálica.

Presentación resumida de los grupos experimentales del ejemplo 3. A. 3. A.3. Resultados: Observaciones clínicas: La puntuación de signos clínicos y peso se evaluaron regularmente como se describió arriba. La cinética de la puntuación EAE durante el periodo de estudio se representa en las figuras 16, 17 y 18.

Una evolución regular y persistente de las puntuaciones clínicas de EAE tales como hiper-reflexia, parálisis de cola, extremidad posterior, debilidad de extremidad delantera y parálisis parcial podría ser registrada en todos los ratones hasta el final de la experiencia en el grupo A (control positivo a EAE) y hasta el día 12 en otros grupos que han sido tratados el día 12 con anticuerpo humanizado GNbAcl (grupo B) o radicales anti-libres (grupos C, D, E) solos o los grupos que han sido tratados simultáneamente con GNbAcl y los radicales anti-libres (grupos F, G, H).

Observaciones post-tratamiento: Los signos clínicos en el grupo B tratado únicamente 1 vez con GNbAcl se redujeron ligeramente hasta el día 29. En los grupos tratados sólo con L-NAME, SMT, se pudo observar una recuperación irregular, pero con una reducción de la progresión de EAE. Debe mencionarse que, el día +16, la inyección de SMT fue interrumpida.

Con respecto a los grupos F, G y H tratados simultáneamente con GNbAcl y L-NAME, SMT y DMF respectivamente, la recuperación fue mucho más significativa y particularmente en los grupos G y H. Estos resultados sugieren que efectos sinérgicos aceleran significativamente e incrementan la recuperación de los síntomas de EAE. También cabe mencionar que el tratamiento con estas sustancias no causó ninguna anormalidad en ningún grupo de ratones (incluyendo ratones de control probados por separado).

De acuerdo con los resultados presentados en las figuras 16, 17 y 18, podemos resumir que: - la puntuación clínica más elevada (peor evolución de enfermedad) es evidenciada en los animales no tratados (grupo A). Los animales tratados con gNbACl solamente (grupo B) mejoran después de su inyección (iniciando a partir del día 12). - los grupos tratados con L-Name o SMT únicamente tuvieron puntuaciones de recuperación más bajas y cinética que el grupo B. - el grupo E tratado con DMF y grupo F tratado con anticuerpo GNbACl (dosis individual de 200 pg) combinado con L-NAME tuvo recuperación equivalente al final del estudio. - el grupo G tratado con anticuerpo GNbAC l combinado con SMT y el grupo H tratado con anticuerpo GNbACl combinado con DMF tuvo una recuperación significativamente mejor al final del estudio y cinética de mejora clínica más temprana que todos los demás grupos. Esto demuestra la ganancia sinérgica de combinar GNbACl y SMT o GNbACl y DMF, para un resultado terapéutico mejorado significativamente.

Pruebas en rotarod Se debe explicar primero que los grupos marcados “1 inj” y “2 inj” en la figura 19 corresponden a animales de control inyectados sólo una vez (1) o dos veces (2) con proteína Env y antígeno MOG, en comparación con las tres inyecciones con proteína Env y antígeno MOG requeridas para inducir clínicamente EAE adicional como en todos los demás grupos. Representan ratones de control expuestos a Env debajo del umbral patogénico y sin inducción de enfermedad clínica. Confirman que se puedan probar todos los animales con diferentes tratamientos inducidos para desarrollar una sintomatología y evolución de EAE aguda y severa, se requiere este patrón de tres inyecciones. Por lo tanto, los efectos terapéuticos observados en animales tratados son relevantes para una eficacia de tratamiento en condiciones de enfermedad continuas y progresivas.

De acuerdo con los resultados presentados en la figura 19 con puntuación de rotarod a 23 rpm, podemos observar que: - El esfuerzo físico a 23 rpm ha alcanzado un umbral suficiente para revelar importantes disfunciones sensoriales y motrices en animales; el grupo A no tratado tiene el peor resultado y cinética, mientras que los animales inyectados sólo una vez o dos veces (“linj o 2inj”) tienen síntomas significativamente más leves y una mucho mejor evolución. El déficit clínico pcyorativo y progresivo del grupo B no tratado confirma que la enfermedad y lesiones de NS correspondientes fueron muy activas con 3 inyecciones de Env. Por lo tanto, todos los demás grupos con varios tratamientos fueron sujetos a una inducción de enfermedad potente similar por Env.

- El grupo B con EAE tratado por una sola inyección de 200 \ig de GNbACl ha recuperado una puntuación similar a la de los ratones de control sin inducción de enfermedad con baja exposición a Env, al final del periodo de estudio.

- El efecto que cabe más mencionar, bajo estas condiciones, es evidenciado para el grupo G tratado con anticuerpo GNbACl combinado con SMT que parece tener una curva de cinética de recuperación sorprendente que concluye con la mejor puntuación de todos los grupos al final del estudio. Esto demuestra la ganancia sinérgica de combinar GNbACl y SMT para un resultado terapéutico mejorado significativamente.

- El grupo D tratado con SMT solo tiene también cinética y resultado mejorado (último punto del periodo de estudio), aunque en un menor grado.

De acuerdo con los resultados presentados en la figura 20 con puntuación de rotarod a 26 rpm, podemos ver que: - El esfuerzo físico a 26 rpm confirma que estas condiciones están por arriba del umbral requerido dentro del presente experimento para revelar disfunciones sensoriales y motrices mayores en animales: el grupo no tratado A tiene el peor resultado y cinética, mientras que los animales inyectados sólo una vez o dos veces (“linj o 2inj”) tienen síntomas significativamente más leves y mejor evolución (calificaciones muy buenas al final del periodo de estudio para el grupo “linj”).

- El grupo B con EAE tratado por una sola inyección de 200 pg de GNbACl ha recuperado una puntuación similar a los grupos D, G, C, E y H y a los controles “2inj”, al final del periodo de estudio.

- El efecto más notorio, bajo estas condiciones, es evidenciado para el grupo F tratado con anticuerpo GNbACl combinado con L-NAME que parece tener buena curva de cinética de recuperación concluyendo con la mejor puntuación de todos los grupos al final del estudio. El grupo C tratado con L-NAME únicamente, tiene también cinética y resultado mejorados, aunque no en menor grado. Esto demuestra la ganancia sinérgica de combinar GNbACl y L-NAME para un resultado terapéutico mejorado significativamente.

De acuerdo con los resultados presentados en la figura 21 con puntuación de rotarod a 29 rpm, podemos ver que: - El esfuerzo físico a 29 rpm aún confirma que estas condiciones están por arriba del umbral requerido para revelar disfunciones sensoriales y motrices mayores en animales: el grupo no tratado A tiene el peor resultado y cinética, mientras que los animales inyectados sólo una vez o dos veces (“linj o 2inj”) tienen síntomas significativamente más leves y mejor evolución con calificaciones buenas similares al final del estudio.

- El grupo B con EAE tratado por una sola inyección de 200 pg de GNbACl ha recuperado una puntuación similar a la de los ratones de control sin inducción de enfermedad con baja exposición a Env, al final del periodo de estudio.

- El efecto más notorio, bajo estas condiciones, se pone en evidencia para el grupo F tratado con un anticuerpo GNbACl combinado con L-NAME que aún parece tener buena curva de cinética de recuperación concluyendo con la mejor puntuación de todos los grupos (fin del estudio. El grupo C tratado con L-NAME únicamente tiene cinética y resultados mejorados, aunque en un menor grado.

- Otro resultado notorio general es la mejora regular de los ratones del grupo B tratado con GNbACl solamente, los cuales siempre mostraron calificaciones ampliamente estabilizadas y/o mejoradas en comparación con los animales no tratados (grupo A) en todas las condiciones (pruebas a 16 a 29 rpm).

No obstante, esta obvia eficacia reveló ser ampliamente enfatizada por la combinación de GNbACl con L-NAME o SMT. También mejoró por la combinación con DMF, pero con cinética más lenta. De cualquier modo, esto no impide una mejor mejoría con dosis optimizadas y en tratamiento a plazo más largo.

Así, en todas las condiciones de prueba (incluyendo puntuación clínica), la combinación de SMT, L-NAME o DMF con GNbACl proporcionó una ventaja significativa para recuperación clínica y funcional, versus el uso de cualquier molécula terapéutica dad sola. Tomadas solas las moléculas pequeñas parecen tener efectos menores y bastante transitorios, mientras que el GNbACl tiene efectos de mayor duración proporcionando la mejor recuperación al final del estudio en comparación con estos fármacos pequeños, demostrando así eficacia prolongada.

La cinética y la amplitud de la recuperación final se mejoran significativamente con las combinaciones, una ventaja de usar una combinación de los presentes agentes terapéuticos para sus efectos sinérgicos y dirigidos en la recuperación funcional es ahora mostrada in vivo. Esto demuestra una indicación para una eficacia clínica más temprana y más potente en enfermedad humana. 3.B. Comparación de la eficiencia terapéutica de dos dosis de anticuerpo anti-Env dadas solas como monoterapia, o en combinación con fármacos anti-NO. 3.B.1 Materiales y métodos Cuando no se especifique, todos los materiales y métodos fueron como los descritos para el ejemplo 3A.

Grupos experimentales Presentación resumida de los grupos experimentales del ejemplo 3.B Todos los ratones recibieron tres inyecciones s.c. en el cuello en DO, en el flanco dorsal en D7 y D14. Aquí, los ratones del grupo A fueron inyectados con 200 mg/ratón de MOG e IFA únicamente, sin Env, constituyendo así un grupo de control negativo sin EAE en la presente serie (ctrl -). El grupo de control positivo con EAE no tratada en la presente serie es representado por el grupo B (ctrl +). Otros grupos fueron inyectados con 200 mg de MOG/ratón + MSRV-ENV (60 pg) + IFA, con tratamientos como se indicó en la presentación resumida anterior. Los tratamientos han sido iniciados el día 12 después de la inmunización en sus grupos correspondientes.

Los grupos C, E, G recibieron 200 pg de GnbAcl en J12; los grupos D, F, H recibieron 500 pg de GnbAcl en J12; el grupo B recibió sólo solución reguladora de pH de GNbACl.

Los grupos E y F recibieron inyección I.P. de SMT (200 mg/ratón) dos veces a la semana en J12, J14, J19, J21, J26 y J28.

Para los grupos G y H que recibieron DMF, hemos determinado previamente el volumen de consumo de agua diario por cada ratón y se ha identificado que (en nuestra condición), cada ratón consumió alrededor de 3.5 mi de agua potable al día. Así, con base en esta medición, una dosis de 2 mg de DMF + 0.08% de methocel por ratón se añadió a 3.5 mi de agua potable diariamente.

Para cada velocidad de prueba de rotarod, los resultados fueron validados cuando curvas que correspondían a ratones no tratados con EAE inducida por Env (grupo B, que representa controles positivos con EAE no tratada) demostraron un déficit significativo en comparación con los controles simulados (grupo A, inmunizado con MOG diluido en IFA sin proteína Env). Los resultados se consideraron como “no interpretables” siempre que este criterio no fue igualado, ya que las correspondientes condiciones téenicas y experimentales por lo tanto no pasaron el control de calidad con base en esta divergencia significativa de curvas a partir de grupos “EAE” positivo versus negativo”.

Después del 20, una inyección intravenosa (I.V.) con 20 gg de MSRV-Env en solución salina fisiológica se hizo para crear un desafío agudo sistémico por proteína MSRV-Env en todos los ratones, cuando se había obtenido una mejoría clínica significativa (tipo remisión) con la mayoría de los tratamientos en ratones de EAE. Esto se hizo el día D21 , para los ratones de los grupos B, D, F y H, o el día D22, para ratones de los grupos A, C, E y G. Esto se llevó a cabo para poder estudiar la respuesta de los diferentes grupos a una antigenemia por Env aguda y para evaluar diferencias eventuales en la eficiencia protectora de varios tratamientos. 3.B.2 Resultados: Observaciones clínicas La puntuación de signos clínicos y peso se evaluaron regularmente como se describió arriba. La cinética de la puntuación clínica de EAE durante el periodo de estudio se representa en las figuras 22, 23 y 24. Las curvas de peso, que indican ganancia de peso relativa en comparación con el día antes de la primera inyección de inmunógenos, se presentan en las figuras 25, 26 y 27.

Pruebas en Rotarod Resultados de las pruebas en rotarod se presentan a diferentes velocidades (16; 26; 29 rpm) en las figuras 28, 29 y 30.

Esta serie de experimentos abordó la influencia de una cantidad media (200 pg) versus alta (500 pg) de anticuerpo GNbACl terapéutico como una monoterapia e hizo comparaciones similares cuando se combinó con SMT y DMF.

La comparación global de las curvas de puntuación clínicas durante el periodo de estudio ha sido validada toda vez que (i) el EAE inducido por Env no tratado (grupo B) tiene la evolución más pcyorativa y (ii) los controles inmunizados en falso sin EAE (grupo A) no tienen signos clínicos detectables durante el periodo que precede a la inyección intravenosa (I.V.) de Env el día 20.

Hasta esta inyección I.V. el día 20, todos los grupos tratados eran significativamente y marcadamente diferentes del EAE inducido por Env no tratado. El día 20, los grupos tratados con diferentes cinéticas de enfermedad durante el periodo de estudio tuvieron puntuación comparable con un valor medio debajo de 0.5, indicando un periodo de remisión en todos los grupos tratados. Esto confirmó una eficacia de todas las dosis de anticuerpo y de todas las combinaciones probadas ya sea con DMF o SMT.

Posteriormente, el ataque con inyección intravenosa (iv) de proteína Env el día 20, imitó un pico de expresión de Env y su liberación en el torrente sanguíneo, como se esperaba durante el inicio de una nueva y severa recaída de la enfermedad de origen natural. Como se muestra en las figuras 22, 23 y 24, se revelaron diferencias significativas en la potencia terapéutica de los diferentes productos y dosis: 1) GNbACl reveló ser muy eficiente en conferir resistencia a este pico de antigenemia por Env a una dosis de 500 mg (grupo D), pero un deterioro clínico transitorio fue observado con la dosis de 200 pg (grupo C). 2) En el caso de la combinación con SMT, variaciones no significativas de la puntuación clínica fueron observadas a ambas dosis de GNbACl (grupos E y F). SMT Confirió entonces una resistencia incrementada al ataque con MSRV-Env IV a ratones tratados con la dosis de GNbACl más baja (200 pg) en comparación con ratones tratados con el anticuerpo solo a esta dosis más baja (grupo C). 3) Ratones tratados con DMF mostraron resistencia clínica a este pico de antigenemia cuando se trataron también con la dosis de GNbACl más alta (grupo H) pero no pudieron evitar el deterioro clínico a la dosis más baja (grupo G). DMF Entonces no confirió una resistencia incrementada al ataque intravenoso con MSRV-Env de ratones tratados con la dosis de GNbAC l más baja (200 pg). Los ratones tratados con DMF y dosis de GNbACl más alta (500 mg, en grupo H) tuvieron resistencia comparable que los ratones tratados con GNbACl solo a la misma dosis (grupo D). 4) Las curvas que indican la ganancia de peso durante el periodo de estudio en todos los grupos muestran sorprendentemente que el grupo D, tratado con GNbACl a 500 mg, tuvo el mejor criterio. 5) GNbACl a 200 mg (grupo C) o DMF con GNbACl a una dosis más alta únicamente (grupo H), produjeron criterios equivalentes a los controles en falso.

Esto indica que, más allá de una eficacia relativa de varios tratamientos mostrados con cinéticas de puntuación clínica: - el anticuerpo GNbACl a dosis más alta (500 pg) presentó la mejor eficiencia clínica. También tuvo un efecto positivo en la salud global de animales según se revela por la cinética de ganancia de peso. - cuando se combina con gNbACl a dosis más baja (200 pg), SMT reveló conferir eficiencia incrementada significativamente al tratamiento, con resistencia completa al ataque intravenoso con MSRV-Env IV final.

Esto indica que GNbACl revela el tratamiento más potente, ya que proporciona mejores resultados con la dosis más alta (500 pg) pero que, a esta dosis más baja (200 pg), es potenciado fuertemente por la combinación con SMT que previno eficientemente la agravación clínica. La agravación clínica siguiendo después del pico de antigenemia por Env creada por inyección iv al final del estudio.

Más aún, estos resultados también sugieren que dosis más altas de GNbACl , solo o en combinación con la presente dosis de DMF, podrían proporcionar una ganancia significativa en la eficiencia terapéutica en salud general (de acuerdo con curvas de ganancia de peso).

No obstante, una sinergia eventual de SMT o DMF con GNbACl a dosis más alta, si existe, no se puede ver toda vez que el anticuerpo solo ya proporciona una eficiencia terapéutica máxima en las presentes condiciones de inducción de enfermedad y actividad en ratones EAE.

En paralelo, los análisis en rotarod confirman de manera objetiva, a todas las velocidades relevantes (figuras 28A, 29A y 30A), que una dosis más alta de GNbACl (500 mg/ratón) es significativamente el producto más eficiente (dado solo) en mejorar el déficit neurológico de ratones EAE inducidos por Env tratados.

Las pruebas en rotarod también confirman los efectos sinérgicos de SMT con GNbACl , demostrando al mismo tiempo una mejora neurológica de los animales tratados con la dosis más baja de GNbACl combinada con SMT demostrando una mejora neuromotriz áignificativa a 26 y 29 rpm (figuras 29B y 30B). A 16 rpm (figura 28B), la velocidad más baja no pareció proporcionar potencia discriminadora suficiente para evidenciar esta ganancia de peso durante el periodo estudiado.

Finalmente, los resultados de Rotarod demuestran una mejora de ratones EAE inducidos por Env con DMF a ambas dosis de GNbACl, pero esto se vuelve claramente significativo a 29 rpm únicamente (figura 30C).

En consecuencia, tomando en cuenta los resultados de esta prueba objetiva y automática que evalúa el desempeño neurológico de los animales, GNbACl parece claramente ser un tratamiento robusto cuando se da sobre una base monoterapéutica como actualmente, en el ejemplo 3.B. Los efectos sinérgicos con moléculas anti-NO, según se observa con GNbACl a dosis más bajas con SMT, también son claramente evidenciados e indican una potente ganancia terapéutica. Esto debe existir con varias dosis de GNbAC l , pero no podría verse en las presentes condiciones con efectos ya máximos de 500 mg de GNbACl . 3.C. Comparación entre anticuerpo anti-Env o fumarato de sodio solos (monoterapia), y anticuerpo anti-Env con fumarato de sodio (terapia combinada). 3.C.1 Materiales y métodos Material Grupos experimentales 3. C.2 Resultados: Observaciones clínicas: La puntuación de signos clínicos y peso se evaluaron regularmente como se describió arriba. Las cinéticas de puntuación EAE durante el periodo de estudio se representan en la figura 31.

El grupo A que representa controles negativos inyectados con IFA, MOG sin proteína Env y una inyección placebo de anticuerpo que consistía en regulador de pH de sus diluyentes, nunca presentó síntomas clínicos significativos durante el periodo de estudio.

Una evolución de las calificaciones clínicas de EAE pudo registrarse hasta el día 12 en los grupos que habían sido tratados el día 12 con anticuerpo humanizado GNbACl (grupo C) o con fumarato de sodio, un anticuerpo anti-radicales libres de óxido nítrico relacionado con DMF (anti-NO), solo en el grupo D o simultáneamente con GNbACl en el grupo E.

Interesantemente aquí, sólo los grupos que habían recibido alta dosis de anticuerpo GNbACl (C y E) han mostrado una reversión significativa de sus curvas de puntuación clínica y un criterio mejorado significativamente al final del estudio. El grupo D tratado con fumarato de sodio únicamente no reveló ninguna mejora clínica significativa en comparación con el grupo B tratado con un anticuerpo de control de isotipo ineficiente (barras de error superpuestas en las curvas). Una evolución regular y persistente de las calificaciones clínicas de EAE pudo registrarse en todos los ratones hasta el final de la experiencia en el grupo B (EAE inducida por Env) tratado con el anticuerpo de control de isotipo sin especificidad para la proteína Env. Esto indica que los efectos terapéuticos observados con GNbACl son específicos de este anticuerpo particular y no están relacionados con inyección de ningún anticuerpo humanizado o con el mismo isotipo que, por ejemplo, no se dirigiría al mismo epitopo.

Este último ejemplo demuestra entonces que: - El grupo de control A sin inyección de proteína Env se comportó como controles saludables sin signos clínicos, a pesar de una inyección de todos los demás componentes requeridos para simular en la EAE inducida por Env (IFA y MOG) así como para simular la inyección de anticuerpo (diluyentes del anticuerpo); el suministro simulado de fumarato de sodio hidrosoluble se proporciona implícitamente por el agua potable normal.

- La puntuación clínica más elevada (peor evolución de enfermedad) se evidencia en animales tratados con el anticuerpo de control de isotipo irrelevante (grupo B). Esta inyección de anticuerpo de isotipo simulada en presencia de proteína Env reveló entonces producir un control de EAE positivo con evolución de EAE típica.

- El grupo D tratado con fumarato de sodio únicamente tuvo un mal resultado al final del estudio, similar al grupo B tratado con un anticuerpo de control ineficiente.

- Los grupos C y E tratados con alta dosis de anticuerpo GNbACl solo o combinado con fumarato de sodio tuvieron una recuperación equivalente y significativamente buena al final del estudio. Una mejora clínica apareció a partir del día 15, una vez que el tratamiento había sido iniciado.

Aquí, ya que el fumarato de sodio solo no tuvo efecto y que las cinéticas de curva de los grupos C y E parecen ser equivalentes, el efecto terapéutico observado en estos dos grupos debe ser completa y únicamente causado por GNbAC l mientras que fumarato de sodio revela ser ineficiente. 3.D Análisis de los resultados generales del ejemplo 3 En conclusión, solos o combinados, los tratamientos con anticuerpo específico anti-Env, tal como GNbACl y compuestos anti radicales libres de óxido nítrico (anti-NO), tales como DMF, SMT o L- Ñame, son adecuados toda vez que tratan y previenen el bloqueo de la actividad potencial de remielinización inducida por la proteína de envoltura HERV-W, en particular MSRV-Env, in vitro e in vivo.

GNbACl A alta dosis (500 mg/ratón de aproximadamente 20-25 g) también reveló tener una eficiencia particular en comparación con la dosis más baja (200 pg), cuando se dio sólo como una monoterapia en los presentes ejemplos.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ligando anti-HERV-W Env para su uso en la prevención y/o tratamiento del bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

2. El ligando anti-HERV-W Env de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en esclerosis múltiple (MS), más particularmente esclerosis múltiple remisiva-recidivante (RRMS), la esclerosis múltiple progresiva tal como esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) o esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), psicosis como la esquizofrenia o el trastorno bipolar y otras enfermedades desmielinizantes asociadas con la expresión de la proteína de envoltura (Env) HERV-W, en particular de su subtipo MSRV.

3. El ligando anti-HERV-W Env de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque es un scFv, un fragmento Fab o un anticuerpo, más particularmente un anticuerpo quimérico, manipulado o humanizado, e incluso más particularmente una IgG, tal como una IgGl o una IgG4.

4. El ligando anti-HERV-W Env de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque comprende al menos una y más preferiblemente cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) establecidas en SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6.

5. Un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

6. El fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en esclerosis múltiple (MS), más particularmente esclerosis múltiple remisiva-recidivante (RRMS), la esclerosis múltiple progresiva tal como esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) o esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), psicosis como la esquizofrenia o el trastorno bipolar y otras enfermedades desmielinizantes asociadas con la expresión de la proteína de envoltura (Env) HERV-W, en particular de su subtipo MSRV.

7. El fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado además porque se selecciona de éster metílico de Ng-nitro-L-arginina (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT), ácido fumárico o fumarato de dimetilo (DMF).

8. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un ligando anti-MSRV/HERV-W Env de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque es para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque es para su uso en la prevención y/o el tratamiento del bloqueo de remielinización en esclerosis múltiple (MS), más particularmente esclerosis múltiple remisiva-recidivante (RRMS), la esclerosis múltiple progresiva tal como esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) o esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), psicosis como la esquizofrenia o el trastorno bipolar y otras enfermedades desmielinizantes asociadas con la expresión de la proteína de envoltura (Env) HERV-W, en particular de su subtipo MSRV.

11. Un método para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV, caracterizado porque comprende la administración de al menos un ligando anti-HERV-W Env a un ser humano.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque es para prevenir y/o tratar el del bloqueo de remielinización en esclerosis múltiple (MS), más particularmente esclerosis múltiple remisiva-recidivante (RRMS), la esclerosis múltiple progresiva tal como esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) o esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), psicosis como la esquizofrenia o el trastorno bipolar y otras enfermedades desmielinizantes asociadas con la expresión de la proteína de envoltura (Env) HERV-W, en particular de su subtipo MSRV.

13. El método de conformidad con la reivindicación l i o 12, caracterizado además porque el ligando anti-HERV-W Env es un scFv, un fragmento Fab o un anticuerpo, más particularmente un anticuerpo quimerico, manipulado o humanizado, e incluso más particularmente una IgG, tal como una IgGl o una IgG4.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el ligando anti-HERV-W Env comprende cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) establecidas en SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado además porque comprende además la administración de al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico se selecciona de éster metílico de Ng-nitro-L-arginina (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT), ácido fumárico o fumarato de dimetilo (DMF).

17. Un método para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV, caracterizado porque comprende administrar al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico a un ser humano.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque es para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en esclerosis múltiple (MS), más particularmente esclerosis múltiple remisiva-recidivante (RRMS), la esclerosis múltiple progresiva tal como esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) o esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), psicosis como la esquizofrenia o el trastorno bipolar y otras enfermedades desmielinizantes asociadas con la expresión de la proteína de envoltura (Env) HERV-W, en particular de su subtipo MSRV.

19. El método de conformidad con la reivindicación 17 o 18, caracterizado además porque el fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico se selecciona de éster metílico de Ng-nitro-L-arginina (L-NAME), S-metil-isotiourea (SMT), ácido fumárico o fumarato de dimetilo (DMF).

20. Un producto farmacéutico caracterizado porque contiene: - al menos un ligando anti-HERV-W Env como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 4; y - al menos un fármaco inhibidor de radicales de óxido nítrico como el definido en una de las reivindicaciones 5, 6 o 7 como un producto combinado para administración simultánea, separada o extendida en tiempo para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en enfermedades asociadas con la expresión de la proteína de envoltura HERV-W (ENV), en particular de su subtipo MSRV.

21. El producto farmacéutico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque es para prevenir y/o tratar el bloqueo de remielinización en esclerosis múltiple (MS), más particularmente esclerosis múltiple remisiva-recidivante (RRMS), la esclerosis múltiple progresiva tal como esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) o esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), psicosis como la esquizofrenia o el trastorno bipolar y otras enfermedades desmielinizantes asociadas con la expresión de la proteína de envoltura (Env) HERV-W, en particular de su subtipo MSRV.