KR102098033B1 - Herv-w 외막 단백질의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 치료하는 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 외막 단백질의 발현과 관련된 질환에서 성체 신경계 (NS)의 내인성 마이엘린 회복력을 차단하는, 새롭게 확인된 유해 기전을 예방 및/또는 치료하기 위한 혁신적인 화합물 및 조성물에 관한 것이다.

Description

HERV-W 외막 단백질의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 치료하는 화합물 {COMPOUNDS FOR TREATING THE REMYELINATION BLOCKADE IN DISEASES ASSOCIATED WITH THE EXPRESSION OF HERV-W ENVELOPE PROTEIN}
본 발명은 HERV-W 외막 단백질 (ENV), 특히 MSRV 서브타입의 외막 단백질의 발현과 관련있는 질환에서 성체 신경계 (NS)의 내인성 마이엘린 재생을 차단하는 새롭게 발견된 유해 기전을, 예방 및/또는 치료하기 위한 혁신적인 화합물과 조성물에 관한 것이다.
이러한 새로운 치료 접근 방식은, 현재 신경계에 발병하는 HERV-W 관련 질환에서 마이엘린의 재생을 차단하는 것으로 알려져 있는, OPC 분화시 Env의 최종 하류 병인성 작동자 (NO 라디칼)의 저해를, 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte) 전구 세포 (OPC)에 대한 상류 Env 병인성 효과의 저해를 조합한 것이다.
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본 발명은, HERV-W 외막 단백질 (ENV), 특히 MSRV 서브타입의 외막 단백질의 발현과 관련있는 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, (i) 하나 이상의 항-HERV-W Env 리간드 및/또는 (ii) 하나 이상의 산화 질소 유리 라디칼 (NO) 저해제를 포함하는, 치료 조성물에 관한 것이다.
본 조성물은, 리간드 및 NO 저해제(들)를 조합하여, NS 병변에서 마이엘린의 재생을 차단하는 새롭게 동정된 프로세스에서 상류 Env 유도인자 뿐만 아니라 하류 NO 작동자를 표적으로 한다.
아울러, 2가지 타입의 화합물들 (각각 Env와 NO를 표적으로 함) 간의 상승 작용은, HERV-W (특히, MS 세포1에서 비리온 입자로서 분리된 MSRV 서브타입과 관련된 경우)의 활성화에 의해, 그리고 신경계에서 이의 Env 단백질의 발현에 의해 유도되는 마이엘린 비-재생성 병변을 가진 환자에게서, 치료 효과 및 속도를 높인다.
일 측면에서, 본 발명은 HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 항-HERV-W Env 리간드에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "분화 봉쇄 (differentiation blockade)", "마이엘린 재생 봉쇄" 또는 "마이엘린 재생 차단"은, (i) HERV-W 외막 단백질 (특히 MSRV 서브타입)에 의해 유발되는 희소돌기아교세포의 전구 세포 (OPC)의 분화 저해, (ii) OPC로부터의 NO 발생, 및 (iii) 실시예 1에 기술된 바와 같이, OPC에 의한 마이엘린 생성 저해로 이루어진 새롭게 발견된 현상을 개괄하는 의미이다.
HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 발현과 관련된 질환은 신경계에 발병하는 HERV-W 관련 질환으로서 정의되며, 보다 상세하게는, 마이엘린 손상이 또한 언급된3-5, 다발성 경화증 (MS), 특히 재발-완화형 다발성 경화증 (RRMS), 이차적 진행성 다발성 경화증 (SPMS) 또는 일차적 진행성 다발성 경화증 (PPMS)과 같은 진행성 다발성 경화증, 만성 염증성 탈마이엘린성 다발성 신경병증 (CIDP2), 정신병, 예를 들어 정신분열증 및 조울증6으로 정의되나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
고전적으로, 다발성 경화증 (MS) 병변은 면역-매개의, 희소돌기아교세포의 소실 및 축삭돌기 손상이 수반된 마이엘린 막의 소실로 인한 것이다.
신경계 (NS) 염증성 병변과 관련해, 내인성 레트로바이러스의 HERV-W 패밀리 유래 다발성 경화증 관련 레트로바이러스 (MSRV) 외막 단백질 (Env)에 의해 매개되는, 면역 세포에 대한 효과가 개시된 바 있다7. 그러나, 희소돌기아교세포의 전구 세포 (OPC)에 의한 MS 플라그의 마이엘린 재생 차단에 관여하는, 신경교 세포에 대한 MSRV-Env의 직접적인 병원성은 지금까지 알려진 바 없으며, 입증된 적도 없다.
본 발명의 일 측면에서, 희소돌기아교세포의 전구 세포 (OPC)에 대한 상류 Env 병인성 효과를 저해하는 것은 항-HERV-W Env 리간드를 이용하여 달성된다. 본 발명의 항-HERV-W Env 리간드는 이 리간드의 Env 단백질 결합력으로 규정된다.
리간드의 "결합한다" 또는 "결합"이라는 용어는 에피토프를 함유한 타겟 항원의 단편을 비롯한, 타겟 항원, 예컨대 ENV와 적어도 일시적으로 상호작용하거나, 또는 결합하는 것을 의미한다.
본 발명에서, HERV-W ENV는 MS 유래 레트로바이러스 입자의 RNA에서 동정된 서열로 정의되는, MSRV 서브그룹을 비롯한, HERV 패밀리에 속하는 임의의 env 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다14, 23.
또한, 본 발명의 리간드는 재조합 scFV 단백질, Fab 단편, 항체에 포함되어 있는 것으로서 정의될 수 있으며, 여기서 항체는 다클론, 단일클론, 올리고클론, 키메라 항체, 조작된 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 리간드를 포함하는 항체는 인간화된 IgG 또는 인간 IgG이며, 보다 상세하게는 IgG1 또는 IgG4이다.
보다 상세하게는, 본 발명의 리간드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진, 각각의 상보성 결정 영역 (CDR)들 중 적어도 하나, 바람직하게는 이들 영역 각각을 포함한다.
전술한 리간드는, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30에 의해 코딩되는 각각의 상보성 결정 영역 (CDR)들 중 적어도 하나, 바람직하게는 이들 영역 각각을 포함한다.
전술한 바와 같이, 마이엘린의 재생 차단은, 또한, OPC에서 NO의 생성을 야기한다. 이에, 다른 측면으로, 본 발명은, HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 산화질소 라디칼 저해제에 관한 것이다.
HERVW ENV의 발현과 관련된 질환은 상기에서 언급한 질환들이다.
본 발명에 대한 보다 구체적인 측면에서, 산화 질소 유리 라디칼 (NO) 저해제, 산화질소 라디칼 저해제 또는 NO 저해제는, NO 라디칼이라고도 하는 NO 분자의 생물학적 효과를 저해할 수 있는 임의의 약물이다. NO 저해제는 Ng-니트로-L-아르기닌-메틸에스테르 (L-NAME), S-메틸-이소티오유레아 (SMT), 푸마르산 또는 다이메틸 푸마레이트 (DMF) 중에서 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 적어도 전술한 바와 같이 정의되는 항-MSRV/HERV-W Env 리간드와 전술한 하나 이상의 산화질소 라디칼 저해제를 조합한 약학 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 예방 및/또는 치료하는데 사용되며, 상기 질환은 상기에 언급된 질환들이다.
전술한 항-HERV-W Env 리간드와 전술한 산화질소 라디칼 저해제를 포함하는 약제학적 제품은 HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 예방 및/또는 치료하기 위해, 동시 투여, 분할 투여 또는 경시적으로 확산 투여하는 조합 산물로서 간주된다.
후술한 결과에 따르면, Env에 의해 유발된 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 마우스 실험 모델에서, 항-MSRV/HERV-W Env 리간드와 하나 이상의 NO-저해 분자의 조합이, 이들 치료 물질을 단독으로 제공한 경우와 비교해, 상승 작용을 발휘하였다. 심지어 단독 투여시, 산화질소 라디칼 저해제 또는 항-MSRV/HERV-W Env 리간드는 EAE8에서 마이엘린 병변과 관련있는 것으로 공지된 임상적인 결함에 치료학적 효과를 나타낸다. 그러나, (i) 산화질소 라디칼 저해제 또는 항-MSRV/HERV-W Env 리간드와, (ii) 하나 이상의 산화질소 라디칼 저해제와 하나 이상의 항-MSRV/HERV-W Env 리간드의 조합을 비교해보면, 치료 과정에 이러한 조합을 이용하는 것이 효과가 더 우수한 것으로 나타난다.
그러므로, 염증성 침윤이 없거나 및/또는 염증 활성을 가진 병변이 없다고 해도 (MS의 비활성형 플라그) 환자에서 Env에 의해 유도된 마이엘린의 재생 차단의 치료가 배제되지 않는다. 이는, 대부분의 뇌 및 척수 병변에 대한 자기 공명 이미징에서 가돌리늄 신호 강화를 더 이상 보이지 않는, 염증 활성이 없는 다양한 병변을 가진 것으로 알려진 진행성 MS (일차적 또는 이차적 진행성 형태들)를 앓고 있는 환자에게 특히 해당된다.
또한, 본 발명은 인간에게 하나 이상의 항-MSRV/HERV-W Env 리간드를 투여하는 단계를 포함하는, HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 방법은 하나 이상의 산화질소 라디칼 저해제를 투여하는 단계를 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간에게 하나 이상의 산화질소 라디칼 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, HERV-W 외막 단백질 (ENV)의 발현, 특히 이의 MSRV 서브타입의 발현과 관련된 질환에서 마이엘린의 재생 차단을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1. MS 조직에서 Env 단백질과 TLR4 수용체의 발현 검출. (A,B) 항-Env 면역조직화학적 방법에서, (B) 만성적인 활성형 병변에 가까운 NAWM에서 Env 단백질 (화살 표시)이 확인되었지만, (A) 건강한 뇌 백질에서는 그렇지 않았다. (C) 만성적인 활성형 병변의 가장자리 위치에서 Env-양성의 미세신경교 세포에 근접 Olig2-양성 OPC. (D-D''') TLR4 (화살 표시)를 공동-발현하는 PDGFRα-양성 OPC 특징을 가진 건강한 대조군 뇌 조직. (E-E''') TLR4와 PDGFRα를 발현하는 MS 환자의 활성형 병변 가까이 위치한 NAWM에서의 OPC (화살 표시). 스케일 바: 50 ㎛.
도 2. OPC 분화시 TLR4의 발현 조절. (A) 9일간의 배양시 자발적인 랫 OPC 분화의 진행성 하향 조절을 보여주는 정량적인 RT-PCR. GAPDH 발현을 기준 유전자로서 사용하였다. 데이타는 3번의 독립적인 실험들의 평균 값 ± 표준 편차로 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001). (B,B') 항-TLR4 면역-염색에서, 소형-헤어핀 RNA (shRNA)-매개 TLR4 억제시, 형질감염된 OPC는 TLR4를 발현하지 않는 (화살 표시) 것으로 나타나, 항체의 특이성이 검증되었다. 도시된 OPC는 형질감염 후 3일째에 고정하였으며, 형질감염 세포는 eGFP의 발현으로 표지하였다. 이웃한 비-형질감염 세포는 TLR4 양성인 것으로 나타났다. (C-D') 배양시 자발적으로 분화한지 3일 후에, 갈락토세레브로사이드 (GalC)/TLR4 더블-양성 OPC (C,C') 및 6일 후 마이엘린 베이직 단백질 (MBP)/TLR4 더블-양성 OPC (D,D')의 예. (D)에서 화살 표시는 TLR4 발현 수준의 단순 감소만을 나타내는 보다 고도로 분화된 OPC를 가르키며, 즉 (A)에 나타낸 유전자 발현 데이타를 반영한다. 화살 표시는 고 발현성의 성숙도가 낮은 세포를 가르킨다.
도 3. 배양한 랫 OPC에 대한 재조합 Env의 전염증성 효과. (A, B, C) 용액 중의 재조합 Env (A, Env 용해형), 표면-결합형 재조합 Env (B; Env 고형체), 막-결합형 Env (C)에 의한, pV14Env-형질전환된 U343 교모세포종 세포 (D-D') 상에 발현된 OPC의 자극, 이들 모두 해당 버퍼 대조군 또는 pV14ctrl-형질전환된 U343 교모세포종 세포 (E-E')의 존재 하에 배양된 OPC에 비해, 8시간 자극 후 iNOS 발현을 강하게 유도한다. 재조합 Env 조제물에서, 내독소 수준은 LAL 검사로 측정시 <5 EU/mL이었다. (D-E') pV14Env 및 pV14ctrl 형질전환된 U343 세포에 대한 항-Env 면역염색으로서, Env 표면 발현이 확인된다. (F-G') O4 면역염색에 의해 분석된 바와 같이, 희소돌기신경교 형태는 표면-결합형 재조합 Env를 이용한 자극시, 배양 1일 후 (F,F') 뿐만 아니라 5일 후 (G,G')에도 변형되지 않고 유지된다. (H) NO 분해 산물 아질산염을 측정하는 세포 배양 상층물에 대한 간접 분광측정 분석으로서, 용해형 재조합 Env에 의해 24시간 자극한 OPC 샘플에서 NO가 농도-의존적인 수준으로 현저하게 증가되는 것으로 나타났다. (I-K) TNFα, IL-1β 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인은 표면-결합형 재조합 Env를 이용한 자극시 상향 조절된다. GAPDH는 기준 유전자로서 사용되었다. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 독립적인 실험들 6 (A), 8 (B), 3 (C), 3 (H) 및 8 (I-K) 중 각각 하나를 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001). 스케일 바: 50 ㎛.
도 4. 미성숙 OPC (1일-경과 = OPC) 및 성숙형 랫 OPC (수일 경과; "성숙형 OPC" 또는 희소돌기아교세포 = OL;)에서의 HERV-W Env에 대한 민감성 비교. 양쪽 세포 타입들을 용해형 재조합 Env 100 ng/ml로 자극하였다. OL에서 Env로의 자극시 iNOS와 사이토카인의 상향 조절은 버퍼 대조군과 비교해 현저하였지만, OPC와 비교해 그다지 뚜렷하지 않았다. GAPDH 발현은 기준 유전자로서 사용하였다. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 3번의 독립적인 실험들 중 하나만 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05).
도 5. 인간 OPC의 Env 의존적인 반응. (A) 배양한 인간 OPC를 표면-결합형 (고형체) 및 용해성 재조합 (용해형) Env로 자극하면, 버퍼 처리 세포와 비교해 24시간 자극 후 iNOS 발현을 강하게 유도한다. GAPDH 발현을 기준 유전자로서 사용하였다. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 3번의 독립적인 실험들 중 하나의 것이다. t-검정 (***P < 0.001). (B,B') 배양된 GalC 양성 인간 OPC의 면역형광 염색을 통해 강력한 TLR4 신호가 확인된다 (3일 배양한 후 나타남). 스케일 바: 50 ㎛.
도 6. Env 경로의 중화 실험 (neutralization experiment). (A) 재조합 Env를 열에 의해 불활화하면 OPC로 8시간 자극한 후 네이티브 재조합 Env와 비교해 iNOS 유전자의 유도를 정지시킨다. 네이티브 Env와 변형된 Env (Env 열처리) 모두 1000 ng/ml 농도로 적용되었다. (B,C) IRAK1/4 및 TRIF 각각의 약리학적 저해시 OPC에서의 iNOS 발현 감소. 3200 nM IRAK1/4 저해제 I 또는 50 μM TRIF 저해 펩타이드 OPC와 함께 2시간 예비-배양한 후, 8시간 동안 표면-결합형 (고형체) 재조합 Env으로 자극한 다음 세포용혈시켰다. (D) Env 수용체 TLR4의 항체-매개 차단 후 OPC에서의 iNOS 발현 감소. 37℃에서 15 ㎍/ml 농도로 항-TLR4 항체와 함께 2시간 사전-배양한 후, OPC를 8시간 동안 고형체 rEnv를 이용하여 자극한 다음, 세포용혈시켰다. GAPDH 발현은 기준 유전자로서 사용하였다. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 이는 3번의 각각의 독립적인 실험들 중 대표적인 하나를 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001, **P < 0.01). (E) OPC를 표면-결합형 (고형체) 재조합 Env로 8시간 자극한 후 NFκB의 핵내 국지화가 증가됨. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 이는 3번의 각각의 독립적인 실험들 중 대표적인 하나를 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001). (F-G') 버퍼 (대조군) 및 Env 자극된 OPC의 NFκB 면역염색의 예. 스케일 바: 50 ㎛.
도 7 . 3-니트로티로신 (3-NT) 양성 OPC의 생성. (A) 면역형광 염색을 통해, 24시간 Env 자극 (표면 결합형 재조합 Env)한 후, 버퍼 처리 세포와 비교해, 더 많은 OPC가 현저하게도 NO-의존적인 질산화적 스트레스(nitrosative stress) 마커인 3-NT를 발현하는 것으로 확인됨. 양성 대조군으로서 강력한 NO 도너인 S-니트로소-N-아세틸페니실라민 (SNAP)을 사용하였다. 그러나, OPC를 iNOS 저해 분자인 L-NAME 100 μM과 30분간 37℃에서 Env 자극하기 전에 배양하였을 경우, 3-NT 양성도 (positivity)는 대조군 수준에 비해 감소하였다. 비활성형 거울상 이성질체 D-NAME는 Env 의존적인 3-NT 유도를 무력화할 수 없었다. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 이는 3번의 독립적인 실험들 중 대표적인 하나를 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001). (B-F') 대조군 세포 (B,B'), Env 자극된 OPC (C,C'), L-NAME과 함께 사전-배양한 OPC (D,D'), D-NAME과 함께 사전-배양한 OPC (E,E') 및 SNAP에 노출된 OPC (F,F')의 대표적인 항-3-NT 면역염색. 스케일 바: 50 ㎛. (G-G''') MS 환자의 NAWM 조직 단편의 면역조직형광 염색에서, 상주하는 OPC (이의 전구체 마커 PDGFRα의 발현에 의해 표시됨, 화살표)는 이의 3-NT 양성도에 의해 확인된 바와 같이 질산화적 스트레스를 겪을 수 있는 것으로 확인되었다.
도 8. Env 의존적인 OPC 분화 저해. (A,B) 표면 결합형 재조합 Env를 이용한 자극 1일 후 및 3일 후의, 대조군 세포에 비해 초기 마이엘린 마커 CNPase 뿐 아니라 후기 마이엘린 마커 MBP를 발현하는 OPC의 유의한 수적 감소를 보여주는, 면역형광 분석. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 이는 4번의 독립적인 실험들 중 대표적인 하나를 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001). (C-C''') 및 (D-D''')는 대조군과 Env-자극된 OPC의 대표적인 항-CNPase 및 항-MBP 면역염색 결과를 나타낸다. (E) 3일간 100 μM L-NAME와 표면 결합형 재조합 Env의 조합물과 함께 OPC를 배양하면, 항-MBP 면역염색에서 확인되는 바와 같이 Env-매개 OPC 분화가 중단된다. D-NAME의 적용으로는 마이엘린 발현을 소생시킬 수 없었다. 데이타는 평균 +/- 표준편차로 나타내며, 이는 4번의 독립적인 실험들 중 대표적인 하나를 나타낸다. t-검정 (***P < 0.001; n.s. 유의하지 않음). (F-H') Env 단독, Env + L-NAME 조합 및 Env + D-NAME 조합 각각으로 자극한 OPC의 대표적인 MBP 면역염색 결과. 스케일 바: 50 ㎛.
도 9. MSRV-Env로 미리 코팅된 랩테크에서 24시간 및 72시간 자극한 후 OPC 성숙 마커들의 발현. 코팅된 MSRV-Env (+ Env-T)는, 희석 버퍼 (버퍼)와 비교해, 24시간 자극 후 CNPase 양성 OPC %의 감소 (A) 뿐 아니라 72시간 자극 후 MBP 양성 OPC의 감소를 유도한다 (B). 데이타는 10세트로 분석한 실험에 대한 평균 ± SEM으로 나타낸다 (410 - 563 계수된 세포/그룹; *p<0,05 t-검정 (A), 364 - 491 계수된 세포/그룹; *p<0,001 Mann-Whitney 순위 합계 검정 (B)).
도 10. MSRV-Env 및 GNbAC1에 의한 24시간 자극 후 인간에서의 CNPase 발현. (A) 코팅된 MSRV-Env는 24시간 자극 후 CNPase 양성 OPC %의 감소를 유도한다. GNbAC1은 50 nM 또는 200 nM에서, 테스트한 양쪽 GNbAC1 처리 프로토콜 (GNbAC1-A 또는 GNbAC1-B)에서 MSRV-Env 효과를 완전히 저해한다. 데이타는 2-8세트로 분석한 실험에 대한 평균 ± SEM으로 나타낸다 (705 - 3878 계수된 세포/그룹). (B) 테스트한 양쪽 GNbAC1 처리 프로토콜 (GNbAC1-A 또는 GNbAC1-B)에서, GNbAC1 (50 nM 또는 200 nM) 단독 코팅 또는 BSA와 함께 코팅 (1 ㎍/ml)은 CNPase 양성 OPC %에 영향을 미치지 않는다. 데이타는 10세트로 분석한 실험에 대한 평균 ± SEM으로 나타낸다 (399 - 512 계수된 세포/그룹; p>0,05; 일원식 ANOVA).
도 11. 배양 배지에 첨가된 MSRV-Env 및 GNbAC1에 의한 24시간 자극 후 인간 OPC 배양물에서의 CNPase의 발현. 세포 배양 배지에 희석한 MSRV-Env (3 nM)는 24시간 처리 후 CNPase 발현을 현저하게 감소시킨다. GNbAC1 (200 nM)은 이러한 효과를 완전히 저해하지만, 단독으로는 어떠한 효과도 발휘하지 않는다. 데이타는 2-4 세트로 분석한 실험에 대한 평균 ± SEM으로 나타낸다 (927 - 1913 계수된 세포/그룹); *p<0,001 vs 버퍼; 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석).
도12. MSRV-Env 및 GNbAC1에 의한 72시간 자극 후 인간 OPC 배양물에서의 MBP의 발현. (A) 코팅된 MSRV-Env (Env-T)는 72시간 자극 후 MBP 양성 OPC %의 감소를 유도한다. GNbAC1은, 테스트한 양쪽 GNbAC1 처리 프로토콜 (GNbAC1-A 또는 GNbAC1-B)에서, 50 nM에서 MSRV-Env 효과를 일부 저해하며, 이러한 저해는 200 nM에서 완벽하게 달성된다. (B) 세포 배양 배지에 첨가된 MSRV-Env (3 nM)는 72시간 처리 후 MBP의 발현을 현저하게 감소시킨다. GNbAC1 (200 nM)은 이 효과를 완전하게 저해한다 (B).
데이타는 2-8 세트 (A) (924 - 4156 계수된 세포/그룹) *p<0,05 ; **p<0,001 vs 버퍼; Ψp<0,001 vs Env-T; 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석, 및 (B) 2-4 세트 (1013 - 1834 계수된 세포/그룹; * p<0.001 vs 버퍼; Ψp<0.001 vs Env-T; 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석)로 분석한 실험에 대한 평균 ± SEM으로 나타낸다.
도 13. 코팅된 MSRV-Env 및 GNbAC1에 의한 24시간 및 72시간 자극 후 OPC 성숙 마커의 발현. 코팅된 MSRV-Env는 (A) 24시간 자극 후 CNPase 양성 인간 OPC %의 감소 뿐 아니라 (B) 72시간 자극 후 MBP 양성 인간 OPC %의 감소도 유도한다. (A) GNbAC1 (200 nM)은 테스트한 양쪽 GNbAC1 처리 프로토콜 (GNbAC1-A 또는 GNbAC1-B)에서 이러한 MSRV-Env 효과를 완전히 저해한다. 데이타는 6세트 (2805 - 3039 계수된 세포/그룹; * p < 0,05 vs 버퍼; Ψp<0,05 vs MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Student Newman Keuls post-hoc 분석, 및 (B) 5 - 6 세트 (1671 - 2066 계수된 세포/그룹; *p<0,05 vs 버퍼; Ψp<0,05 vs MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Dunn post-hoc 분석)로 분석한 실험에 대한 평균 ± SEM으로 나타낸다.
도 14. MSRV-Env에 의해 유도된 인간 OPC 성숙의 저해는 GNbAC1에 의해 완전히 회복된다. 코팅된 MSRV-Env (Env)는 (A) 4시간 자극 후 CNPase 양성 인간 OPC %의 감소 뿐 아니라 (B) 72시간 자극 후 MBP 양성 인간 OPC %의 감소도 유도한다. GNbAC1 (200 nM)은 테스트한 양쪽 GNbAC1 처리 프로토콜 (+ GNbAC1 A 또는 + GNbAC1 B)에서 MSRV-Env 효과를 완전히 저해한다. 결과는 CNPase (A) 또는 MBP (B) 양성 세포의 %로서 표시하며, 8-14회의 독립적인 실험들의 평균 ± SEM을 나타낸다 (3600 - 6800 계수된 세포/그룹 (A) 및 2700 - 5800 계수된 세포/그룹 (B)). *p< 0.05 Vs CTRL ; Ψp<0.05 Vs MSRV-Env; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Dunn post-hoc 분석.
도 15. MSRV-Env에 의해 유도된 인간 OPC 성숙의 저해는 GNbAC1에 의해 완전히 회복된다 (표준화된 데이타). MSRV-Env를 OPC 접종 전에 배양 챔버 슬라이드에 코팅하였다. (GNbAC1-A) 코팅 전에 GNbAC1 (200 nM)과 혼합하거나, 또는 MSRV-Env (GNbAC1-B)로 코팅된 배양 챔버에서 배양하였다. 데이타는, (A) CNPase 또는 (B) MBP 양성 세포의 %를 표시하며, CTRL 조건 (MSRV-Env 버퍼)에 대한 변화 %를 나타낸다. 결과는 8-14번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표시한다 (3600 - 6800 계수된 세포/그룹 (A), 및 2700 - 5800 계수된 세포/그룹 (B)). *p< 0.05 Vs CTRL ; Ψp<0.05 Vs MSRV-Env ; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Dunn post-hoc 분석.
도 16. A, B, C 및 F 그룹들의 EAE 임상 스코어 카이네틱스 (A- 무처리한 EAE 양성 대조군, B- GNbAc1 200 ㎍ 처리한 EAE, C- L-NAME 처리한 EAE, F- GNbAc1 + L-NAME 200 ㎍ 처리한 EAE)
도 17. A, B, D 및 G 그룹의 EAE 임상 스코어 카이네틱스 (A- 무처리한 EAE 양성 대조군, B- GNbAc1 200 ㎍ 처리한 EAE, D- SMT 처리한 EAE, G- GNbAc 200 ㎍ + SMT 처리한 EAE)
도 18. A, B, E 및 H 그룹의 EAE 임상 스코어 카이네틱스 (A- 무처리한 EAE 양성 대조군, B- GNbAc1 200 ㎍ 처리한 EAE, E- DMF 처리한 EAE, H- GNbAc 200 ㎍ + DMF 처리한 EAE)
도 19. 23 rpm의 로타로드에서의 체류 시 간 카이네틱스
X축: 프로토콜에 따른 수치 측정일.
Y축: 7일 대비 로타로드에서의 체류 시간 증가 또는 감소.
A: A, B 그룹, Env "1회 주사" 및 "2회 주사"; B: A, B, C 및 F 그룹; C: A, B, D 및 G 그룹; D: A, B, E 및 H.
도 20. 26 rpm의 로타로드에서의 체류 시 간 카이네틱스
X축: 프로토콜에 따른 수치 측정일.
Y축: 7일 대비 로타로드에서의 체류 시간 증가 또는 감소.
A: A, B 그룹, Env "1회 주사" 및 "2회 주사"; B: A, B, C 및 F 그룹; C: A, B, D 및 G 그룹; D: A, B, E 및 H.
도 21. 29 rpm의 로타로드에서의 체류 시 간 카이네틱스
X축: 프로토콜에 따른 수치 측정일.
Y축: 7일 대비 로타로드에서의 체류 시간 증가 또는 감소
A: A, B 그룹, Env "1회 주사" 및 "2회 주사"; B: A, B, C 및 F 그룹; C: A, B, D 및 G 그룹; D: A, B, E 및 H.
도 22. A, B, C 및 D 그룹의 EAE 임상 스코어 카이네틱스 (A-Mock EAE 음성 대조군, B- 무처리한 EAE 양성 대조군, C- GNbAc 200 ㎍ 처리한 EAE, D- GNbAc 500 ㎍ 처리한 EAE)
도 23. A, B, E 및 F 그룹의 EAE 임상 스코어 카이네틱스 (A-Mock EAE 음성 대조군, B- 무처리한 EAE 양성 대조군, D- SMT 처리한 EAE, G- GNbAc 200 ㎍ + SMT 처리한 EAE)
도 24. A, B, G 및 H 그룹의 EAE 임상 스코어 카이네틱스 (A-Mock EAE 음성 대조군, B- 무처리한 EAE 양성 대조군, E- DMF 처리한 EAE, H- GNbAc 200 ㎍ + DMF 처리한 EAE)
도 25. 실험 기간 동안의 체중 증가 카이네틱스 (면역원 1차 주사 전날과 비교해 상대적인 체중 증가): A, B, C 및 D 그룹 (A-Mock EAE 음성 대조군, B- 무처리한 EAE 양성 대조군, C- GNbAc 200 ㎍ 처리한 EAE, D- GNbAc 500 ㎍ 처리)
도 26. 실험 기간 동안의 체중 증가 카이네틱스 (면역원 1차 주사 전날과 비교해 상대적인 체중 증가): A, B, E 및 F 그룹 (A-Mock EAE 음성 대조군, B- 무처리한 EAE 양성 대조군, D- SMT 처리한 EAE, G- GNbAc 200 ㎍ + SMT 처리한 EAE)
도 27. 실험 기간 동안의 체중 증가 카이네틱스 (면역원 1차 주사 전날과 비교해 상대적인 체중 증가): A, B, G 및 H (A-Mock EAE 음성 대조군, B- 무처리한 EAE 양성 대조군, E- DMF 처리한 EAE, H- GNbAc 200 ㎍ + DMF 처리한 EAE)
도 28. 16 rpm의 로타로드에서의 체류 시 간 카이네틱스
X축: 프로토콜에 따른 수치 측정일.
Y축: 7일 대비 로타로드에서의 체류 시간 증가 또는 감소
A: A, B, C 및 D 그룹; B: A, B, E 및 F 그룹; C: A, B, G 및 H 그룹.
도 29. 26 rpm의 로타로드에서의 체류 시 간 카이네틱스
X축: 프로토콜에 따른 수치 측정일.
Y축: 7일 대비 로타로드에서의 체류 시간 증가 또는 감소
A: A, B, C 및 D 그룹; B: A, B, E 및 F 그룹; C: A, B, G 및 H 그룹.
도 30. 29 rpm의 로타로드에서의 체류 시 간 카이네틱스
X축: 프로토콜에 따른 수치 측정일.
Y축: 7일 대비 로타로드에서의 체류 시간 증가 또는 감소
A: A, B, C 및 D 그룹; B: A, B, E 및 F 그룹; C: A, B, G 및 H 그룹.
도 31 . 실험 기간 동안 전체 그룹들에서의 EAE 임상 스코어 카이네틱 (A-Mock EAE 음성 대조군, B- 이소형 항체 모의-처리 (mock-treated)한 EAE 양성 대조군, C- GNbAc 500 ㎍ 처리한 EAE, D- 소듐 푸마레이트 처리한 EAE, 및 E- GNbAc 500 ㎍ + 소듐 푸마레이트 처리한 EAE).
사용되는 약어들에 대한 개괄
약어
3-NT
 3-니트로티로신
ANOVA 변량 분석
APC 선종성 용종 콜리 (Adenomatous polyposis coli)
C57bl/6 블랙 마우스 품종의 명칭
CDR 상보성 결정 영역
CIPD 만성 염증성 탈마이엘린성 다발성 신경병증
CNPase 사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포다이에스테라제
DAPI 다이아미노-2-페닐인돌
DMF 다이메틸 푸마레이트
D-NAME 　D-NG-니트로아르기닌 메틸 에스테르
EAE 실험용 자가면역 뇌척수염
eGFP 강화된 그린 형광 단백질
Env 외막 단백질
FBS 소 태아 혈청
FITC 플루오레세인
GalC 갈락토세레브로사이드
HERV-W 인간 내인성 레트로바이러스 타입 W
huGAPDH 인간　글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제
huiNOS 인간 유발성 산화질소 신타제
HuSH 특정 DNA 구조체에 대한　약칭
IFA 불완전 프레운드 보강제
iNOS 유발성 산화질소 신타제
IRAK1/4 인터루킨-1 수용체-관련-키나제-1/4
iv 정맥내
LAL 리물러스 아메바형세포 라이세이트 (limulus amebocyte lysate)
LDL 　지밀도 지질
L-NAME L-NG-니트로아르기닌 메틸 에스테르
LSD 피셔의 LSD post-hoc 분석 = 통계 검정의 이름
MBP 마이엘린 베이직 단백질
MC 메토셀 (Methocel)
MOG 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질
MS 다발성 경화증
MSRV 다발성 경화증 관련 레트로바이러스
NAWM 정상으로 보이는 백색질
NFκB 활성화된 B 세포의 핵 인자 κ-경쇄-인핸서
NO 질소산화물 분자 또는 질소산화물 라디칼
NS 신경계
O4 희소돌기아교세포에 존재하는 특정 에피토프의 명칭
ODC 오르니틴 데카르복실라제
OPC 희소돌기아교세포의 전구 세포
OPCGS OPC 증식 용액
OPCM OPC 배양 배지
PBS 포스페이트 완충화된 염수
PDGFRα α-타입의 혈소판 유래 성장인자 수용체
PFA 파라포름알데하이드
pGFP 그린 형광 단백질
PTX　 백일해 독소
QC 품질 관리
riNOS 랫 iNOS
RNS 반응성 질소 종
SCID 중증 복합성 면역결힙증
SEM 평균의 표준 편차
shRNA 소형-헤어핀 RNA
SMT S-메틸-이소티오유레아
SNAP S-니트로소-N-아세틸-DL-페니실라민
TLR4 Toll-유사 수용체 4
TNFα α-타입의 종양 괴사 인자
TRIF TIR-도메인-함유 어댑터-유도성 인터페론-β
ㅿㅿCt RNA의 상대적인 정량화를 위한 표준 단위
하기 실시예들이 예시되나, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: HERV-W 패밀리 외막 단백질에 의해 유발되는 마이엘린의 재생 봉쇄 (이는 신경 세포의 탈마이엘린화 병변에서 희소돌기아교세포의 전구 세포 분화를 저해함)
1.1 재료 및 방법
1.1.1 희소돌기아교세포 전구 세포의 배양
랫 희소돌기아교세포의 전구 세포 (OPC)를 기술 방식에 따라 정제하였다22. OPC는 증식 배지에 유지시키거나 (10 ng/ml 재조합 인간 베이직 섬유모세포 성장인자 및 10 ng/ml 재조합 인간 혈소판 유래 성장인자-AA가 첨가된 Sato 배지; R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany), 분화는 0.5% 소 태아 혈청이 첨가된 Sato 배지에서 개시하였다. 인간 태아 희소돌기아교세포의 전구 세포 (hOPC)와 각 배지는 스웨덴 웁살라 3H Biomedical에서 구입하였다. 재조합 Env를 제조하여, 단백질 배치를 공급하는 GeNeuro (Geneva, Switzerland)의 QC 내역에 따라 PX-Therapeutics (Grenoble, France)에서 정제하였다. 내독소 수준은 LAL (limulus amebocyte lysate) 검사에서 측정시 <5 EU/mL이었다. Env 자극은, i) 분화 배지에 10 ng/ml, 100 ng/ml 및 1000 ng/ml로 희석한 재조합 전장 Env 단백질을 이용하거나, ii) 표면 농도 17,53 ng/cm²로 세포 배양 디쉬에 코팅한 재조합 Env 단백질을 이용하거나, iii) Env를 과다발현하는 형질전환된 U343 교모세포종 세포 상에 OPC 접종에 의해, 각각 3가지 다른 방식으로 수행하였다. 대조군 자극 실험들은 동일 희석 비율로 재조합 Env의 버퍼 조제물 (20 mM 히스티딘, 5% (w/v) 슈크로스, 0.01% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.0)을 이용하여 수행하였다. 비색계 질소 산화물 분석 키트 (Merck-Millipore/Calbiochem, Darmstadt, Germany)를 이용한 OPC 상층물에서의 농도 측정은 수행하지 않았으며, Anthos 플레이트 리더 2001 (Anthos labtec instruments, Salzburg, Austria)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. OPC 형태 평가는 세포 직경과 돌기 분지 (process branching) 정도를 고려하여, 항-O4 항체 Merck-Millipore/Chemicon, Darmstadt, Germany)를 이용하여 수행하였다. IRAK-1/4 저해제 I (1-(2-(4-모르폴리닐)에틸)-2-(3-니트로벤조일아미노)벤즈이미다졸, N-(2-모르폴리닐에틸)-2-(3-니트로벤조일아미도)-벤즈-이미다졸; SigmaAldrich, Hamburg, Germany) 실험은 2400 nM 농도에서 수행하였고, TRIF 저해 펩타이드 (Invivogen, San Diego, USA) 실험은 제조사의 프로토콜에 따라 50 μM 농도에서 수행하였다. Env 불활화는, 재조합 Env를 123℃에 1시간 노출시킴으로써 수행하였다. TLR4-항체 수용체 차단 실험은 항체 농도 15 ㎍/ml에서 수행하였다. L-NAME/D-NAME 차단 실험은 각각 100 μM 농도에서 수행하고; S-니트로소-N-아세틸-DL-페니실라민 (SNAP)은 100 ng/ml 농도로 사용하였다.
1.1.2 희소돌기아교세포 전구체 및 U343 교모종 세포 형질전환
OPC를 증식 배지에서 24시간 배양하고, 항-TLR4 항체의 특이성을 입증하기 위해, HuSH 29 pGFP-V-RS 벡터 (OriGene, Rockville, Maryland, USA)를 토대로 한 shRNA 코딩 TLR4 억제 벡터를 채택한 NanoJuice 시약 (Merck-Millipore, Darmstadt, Germany)을 이용하여 수행하였다. U343 교모세포종 세포에서의 막-결합형 Env의 발현을 위해, 형질전환 세포를 가시화하기 위한 시트린 발현 벡터9에 1:5 비율로 Env-과다 발현 (HERV-W MSRV-타입의 env 유전자 코딩 서열의 nt 1 - nt 1629를 가진 pV14 벡터-GenBank AF331500.1- Geneuro SA 사, Switzerland)을 조합시켰다. 대응되는 빈 벡터를 대조군으로서 사용하였다. U343 교모세포종 세포의 형질전환은 리포펙타민을 이용하여 수행하였다 (Life Technologies, Darmstadt, Germany).
1.1.3 다발성 경화증 조직 염색
Olig2/Env 이중 염색을 위해, 포르말린-고정된 파라핀-포매의 인간 MS 조직을 절단하여, 5 ㎛ 단편을 자일렌 중에서 탈파라핀화하고, 등급화된 알코올을 통해 증류수로 재수화하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성은, 메탄올 중의 0.3% 과산화수소에 슬라이드를 인큐베이션하여 퀀칭하였다. 그런 후, 슬라이드를 증류수로 헹구고, 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 9) 용액으로 이동시켜, 열-유발성 항원 회수를 수행하였다. 이후, 슬라이드를 실온으로 냉각시켜, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)로 헹군 다음, 항-Olig2 (1:300; Merck-Millipore) 및 항-Env 항체 3B2H4 (1:500, GeNeuro, Geneva, Switzerland)와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 단편을 Alexa 488-표지된 당나귀-항-토끼 (1:400; Life Technologies/Molecular Probes, Darmstadt, Germany)와 인큐베이션하여, Env를 가시화하기 위해 Olig2와 Alexa 555-표지된 염소-항-마우스를 검출하였다. TLR4/PGRFRα 이중 염색을 위해, 급속-동결시킨 조직을 자르고, 5 ㎛ 단편을 항-TLR4 (1:100; Merck-Millipore) 및 항-PDGFα 항체 (1:50; eBiosciences, San Diego, California, USA)와 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. TLR4는 Alexa 488-표지된 염소-항-마우스 (1:400; Life Technologies/Molecular Probes), 토끼-항-랫으로 바이오틴화된 PDGFRα (1:500; 벡터 Laboratories, Burlingame, CA, USA) 및 Alexa 647-표지된 스트렙타비딘 (1:400; Life Technologies/Molecular Probes)을 각각 이용하여 검출하였다. 핵 염색을 위해, 단편을 Hoechst 염료 용액 (1:100; Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany)과 1분 인큐베이션하고, Vectashield (Vector Laboratories)로 덮었다. 현미경 분석은 Leica TCS SP2 AOBS 공초점 레이터-스캐닝 현미경 (Leica Microsystems, Heidelberg, Germany)을 이용하여 수행하였다.
1.1.4 배양 세포의 염색
파라포름알데하이드로 고정된 배양 세포의 염색은 기존 방식에 따라 수행하였다22. 일차 항체들을 희석하였다: 항-TLR4 항체 (1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Germany), 항-Env 항체 3B2H4 (1/500; GeNeuro, Geneva, Switzerland), 항-2',3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포다이에스테라제 (CNPase) 항체 (1/1000; Covance, Princeton, New Jersey, USA), 단일클론 항-마이엘린 베이직 단백질 (MBP; 1/1000; Convance, Princeton, New Jersey, USA), 다클론 항-마이엘린 베이직 단백질 항체 (1:1000; Millipore, Schwalbach, Germany), 항-갈락트로세레브로사이드 (GalC) 항체, 항-O4 항체 (둘다 1/1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Germany); 항-3-NT 항체 (1/1000; Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 항-NFκB 항체 (1/1000; Abcam, Cambridge, MA, USA). Alexa Fluor 488- 및 Alexa Fluor 594-접합 항체 (둘다 1:500)는 신호 가시화를 위해 사용하였다. 핵은 4',6-다이아미노-2-페닐인돌 (DAPI; Roche, Basel, Switzerland)로 염색하였다.
1.1.5 RNA 준비, cDNA 합성 및 정량적인 역전사 중합효소 연쇄 반응
배양한 세포로부터의 RNA 정제는 RNeasy 공정 (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 수행하였다. 분리한 RNA는 고성능 cDNA 역전사 키트 (Life Technologies/Applied Biosystems)를 이용하여 역전사하였다. 유전자 발현 수준에 대한 정량적인 검출은 Power SybrGreen 유니버셜 마스터 믹스 (Life Technologies/Applied Biosystems)를 이용하여 7900HT 서열 검출 시스템 (Life Technologies/Applied Biosystems)으로 수행하였다. 프라이머 서열은 PrimerExpress 2.0 소프트웨어 (Life Technologies/Applied Biosystems)를 이용하여 결정하고, 특이적인 앰플리콘의 형성을 검사하였다:
TLR4_fwd: CTGGGTTTCTGCTGTGGACA (서열번호 7)
TLR4_rev: AGGTTAGAAGCCTCGTGCTCC (서열번호 8)
riNOS_fwd: CTCAGCACAGAGGGCTCAAAG (서열번호 9)
riNOS_rev: TGCACCCAAACACCAAGGT (서열번호 10)
huiNOS_fwd: TGAGGAGCAGGTCGAGGACT (서열번호 11)
huiNOS_rev: TGATAGCGCTTCTGGCTCTTG (서열번호 12)
huGAPDH_fwd: TGGACCTGACCTGCCGTCTA (서열번호 13)
huGAPDH _rev: AGGAGTGGGTGTCGCTGTTG (서열번호 14)
TNFα_fwd: AGCCCTGGTATGAGCCCATGTA (서열번호 15)
TNFα_rev: CCGGACTCCGTGATGTCTAAG (서열번호 16)
IL1β_fwd: GAAACAGCAATGGTCGGGAC (서열번호 17)
IL1β_rev: AAGACACGGGTTCCATGGTG (서열번호 18)
IL6_fwd: GTTGTGCAATGGCAATTCTGA (서열번호 19)
IL6_rev: TCTGACAGTGCATCATCGCTG (서열번호 20)
GAPDH_fwd: GAACGGGAAGCTCACTGGC (서열번호 21)
GAPDH_rev: GCATGTCAGATCCACAACGG (서열번호 22)
ODC_fwd: GGTTCCAGAGGCCAAACATC (서열번호 23)
ODC_rev: GTTGCCACATTGACCGTGAC (서열번호 24)
GAPDH와 ODC는 기준 유전자로 사용하였으며, 상대적인 유전자 발현 수준은 ㅿㅿCt 방법 (Life Technologies/Applied Biosystems)에 따라 측정하였다. 각 샘플은 4세트로 측정하고; 데이타는 평균 ± 표준 편차로 나타내며, t-검정을 적용하여 통계적인 유의성을 결정하였다.
1.2 결과
1.2.1 만성적인 활성 MS 병변 근처와 상주하는 OPC 부근에서의 Env 단백질의 국지화
면역조직학적 분석을 이용하여, 인간 뇌 조직 샘플에서 Env 단백질의 국지화를 시험하였다. 이로써, 만성적인 활성 MS 병변에 가까운 NAWN (CAL, 도 1B)과 Olig2-양성 OPC (도 1C) 근처 CAL 가장자리에서 Env 단백질이 매우 상당히 존재하는 것으로 확인되었다. 병변에서 더 먼 거리의 NAWM은 식별할 수 있는 Env 면역반응성을 나타내지 않았다 (도 1A). 상주하는 OPC에 대한 Env 단백질의 잠재적인 영향력과 그로 인한 관련 마이엘린 회복에 대한 잠재적인 영향을 추가로 입증하기 위해, TLR4 및 혈소판 유래 성장인자 수용체 alpha (PDGFRα)-더블-양성 OPC를 찾고자 하였다. 이는 건강한 뇌 (도 1D-D''')와 MS 환자의 NAWM (도 1E-E''')에서 검출할 수 있었다. 명백하게도, MS 뇌의 경우, TLR4-양성 OPC는 HERV-W Env 발현 세포 또는 이의 분비되는 단백질 주변에서 검출할 수 있어, 언급된 바와 같이 이 TLR-4 병인성 작용제에 대한 민감성 타겟일 수 있는 것으로 확인되었다10. 그럼에도 불구하고, 이는 예상하지 못한 관찰 결과이며, TLR4는 기존에 이러한 OPC 조건에서의 발현이 공지된 바 없을 뿐만 아니라 아울러 MSRV-Env와 같은 HERV-W 외막 단백질이 마이엘린화 잠재성에 대해 최종적인 드라마틱 효과를 가지며 정확한 분화 단계에서 OPC와 직접 상호작용하리라고는 예견되지 못하였기 때문에, 지금까지 인지하지 못했던 활용 가능성의 지평을 열어준다.
1.2.2 배양한 랫 및 인간 OPC에 의한 TLR4 발현
기존 연구들은 기본적으로 단핵세포와 수지상 세포에 대한 TLR4-의존적인 전-염증성 효과10를 입증하였다. 항-TLR4 면역표지를 통해, 랫 및 인간 희소돌기 신경교 전구 세포 둘다 그 표면에 이 수용체를 발현한다는 것이 검증되었다 (도 2C,C' 및 5B). 아울러, 랫 OPC에서 TLR4의 특이적인 shRNA 매개 낫다운은 기존의 면역표지의 특이성을 확인시켜 주었다 (도 2B,B'). 어린 OPC에서부터 성숙한 OPC 까지의 TLR4 수용체 발현 카이네틱스를 분석하기 위해, 3 및 6일 분화 배양 후, 항-갈락토세레브로사이드 (GalC) 항체와, 그리고 보다 성숙한 OPC에 대한 마커인 항-마이엘린 베이직 단백질 (MBP) 항체를 함께 이용한 공동-염색을 수행하였다 (도 2C-D'). 흥미롭게도, TLR4 수용체의 경시적인 유전자 발현은 세포가 분화되는 동안에 하향 조절되고 (도 2A), 형태학적으로 성숙한 랫 OPC에서 후기 특이적인 TLR4 단백질 검출 신호가 보다 어린 세포와 비교해 약하게 나타났다 (도 2D).
1.2.3 Env에 의한 OPC 자극은 전염증성 사이토카인과 유도성 NO 신타제의 발현을 유도한다
배지에 용해된 재조합 Env 단백질 (Env 용해형; 100 ng/ml; 도 3A), 세포 배양 디쉬에 코팅된 재조합 Env 단백질 (Env 고형체; 도 3B) 또는 형질전환된 U343 교모세포종 세포의 표면 상에 과다 발현된 재조합 Env 단백질 (pV14Env; 도 3C-E')에 의한 랫 OPC 자극은, 대조군 (버퍼 또는 빈 벡터 처리한 경우) 조건과 비교해, 유발성 질소 산화물 신타제(iNOS)의 전사를 크게 증가시킬 뿐 아니라 TNFα, IL-1β 및 IL-6 등의 전염증성 사이토카인을 유도한다 (도 2I-K). 그런 다음, iNOS 발현 증가는 세포 상층물내 Env 농도-의존적인 질산화적 스트레스 유도성 산물, 즉 질소 산화물 (NO)의 생성을 유도하게 된다 (도 3H). 흥미롭게도, 랫 OPC 형태는 Env 노출 1일 및 5일 후에 수행된 희소돌기 신경세포의 O4 염색에서 확인된 바와 같이, Env로 자극하는 동안 변형되지 않고 유지되었다 (도 3F-G'). 또한, 인간 GalC-양성 OPC는 TRL4를 발현하며 (도 5B,B'), 재조합 Env를 이용한 자극 (용액 형태 또는 디쉬 표면에 코팅된 형태)도 마찬가지로 iNOS 전사를 유도하는 것으로 확인되었다 (도 5A). 아울러, Env 자극은 OPC의 생존 (TUNEL에 의해, 그리고 총 세포 주의 정량화에 의해 확인됨; 데이타는 도시 안함)이나 (β-갈락토시다제 염색에 의해 분석함; 데이타는 도시 안함) OPC 노화 표현형 유도에는 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. 성숙한 랫 OPC (matOPCs; 6일간 분화 배지에서 유지됨)를 Env로 자극하면, 미성숙형 OPC에 대한 작용과 비교해, iNOS, TNFα, IL-1b 및 IL-6의 전사 수준에 의해 결정되는 바와 같이, 전염증성 반응이 상당히 약화되었다 (도 4). 이러한 관찰 결과는, 성숙형 OPC에서 나타난 TLR4 발현 수준 저하와 일치하는 것이며 (도 2), 이는 미성숙 세포가 TLR-4 발현과 대응하여 Env에 대한 민감도가 우수하다는 것을 시사해준다.
1.2.4 Env는 TLR4를 통해 그 작용을 매개하며, 전염증성 반응은 IRAK-1/4 , TRIF 및 NFκB를 수반한다
TLR4에 대한 Env의 특이성을 입증하고, 하류 신호전달로 관점을 더욱 넓이기 위해, 대규모의 대조군 실험 (도 6)을 수행하였다. OPC를 자극하기 전에 재조합 Env를 열에 의해 불활화하면, 대조군과 비교해, iNOS 유도가 매우 상당한 수준으로 감소되었다 (도 6A). 이와 비슷한 현저한 iNOS 전사 감소는 TLR4의 항체 매개 차단을 이용하는 경우에 관찰할 수 있었는데, 이로써 이 수용체에 대한 Env의 특이성과 관찰되는 전염증성 하류 작용들에서의 이의 관련성이 검증되었다 (도 6D). Env에 의해 TLR4가 활성화되었을 때 세포내 경로를 조망하기 위해, TLR4 활성화 이후의 2가지 공지된 하류 경로, 즉 IRAK-1/4 (인터루킨-1 수용체-조합된-키나제-1/4)가 참여하는 MyD88-의존적인 경로와 TRIF (TIR-도메인-함유 어댑터-유도성 인터페론-β)가 참여하는 MyD88-비의존형 경로의 역할을 조사하였다. IRAK-1/4 저해제 I 또는 TRIF 저해 펩타이드를 적용하면, Env 존재 하에 iNOS의 발현 수준이 현저하게 감소되었는데 (도 6B,C), 이는 Env-매개 TLR4의 활성화가 MyD88-의존적인 신호전달 경로 뿐만 아니라 MyD88-비의존적인 신호전달 경로 둘다의 활성화를 유도한다는 것을 입증해준다. 이들 양쪽 경로는 NFκB (활성화된 B 세포의 핵 인자 κ-경쇄-인핸서)의 핵 전위 (nuclear translocation)로 수렴될 수 있다. 항-NFκB 항체를 이용하여, Env 자극이 OPC에서 NFκB의 핵 국지화를 크게 증가시킨다는 것을 검증되었으며 (도 6E-G'), 이로써 전염증성 사이토카인에서 관찰되는 전사의 상향 조절이 설명된다.
1.2.5 질산화적 스트레스 마커인 니트로티로신의 Env-매개 유도
Env 자극 후 현저하게 증가되었던 NO (도 3H 참조)는 반응성 질소 종 (RNS)이다. NO는 단백질, 핵산 및 지질 등의 다수의 세포내 분자들과 반응하여, 3-니트로티로신 잔기 (3-NT)를 만들 수 있다. 본 발명자들은, 랫 OPC가 재조합 Env 단백질에 노출되면 버퍼 대조군과 비교해 3-NT-양성 세포를 현저하게 증가시킨다는 것을 알게 되었는데 (도 7B,B' 및 C,C'), 이는 NO-매개 질산화적 스트레스의 유도를 의미한다. 그러나, iNOS 저해 분자인 L-NAME (L-NG-니트로아르기닌 메틸 에스테르)과 미리-인큐베이션하면, NO 생성이 3-NT 양성 OPC의 생성이 그런 것처럼 현저하게 감소되는 것으로 확인되었다 (데이타는 도시 안함) (도 7D,D'). L-NAME의 비활성형 거울상 이성질체인 D-NAME를 음성 대조군으로 사용한 경우, Env-매개 3-NT 형성에는 영향을 나타내지 않았다 (도 7E,E'). 한편, 강력한 NO 도너인 SNAP (S-니트로소-N-아세틸페니실라민)를 양성 대조군으로 사용하였을 때, 거의 모든 OPC들에서 니트로티로신화가 발생하였다 (도 7F,F'). 중요한 점은, 전구체 마커인 PDGFRα의 발현에 의해 드러난 3-니트로티로신 양성 OPC를 또한 MS 환자 뇌의 NAWM에서도 검출할 수 있었는데 (도 7G-G'''), 이는 이러한 스트레스 기전이 MS에서 병인성 관련이 있다는 것을 의미한다.
1.2.6 Env는 OPC의 마이엘린 발현에 영향을 미친다
상기한 사실을 관찰한 후, 본 발명자들은, Env 단백질이 마이엘린 회복 작용에 필수적인 것으로 입증된 희소돌기신경교 분화 과정에 영향을 미칠 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해, Env로 자극한 랫 OPC에서, Env로 3일 자극한 후 마이엘린 단백질 CNPase (2',3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포다이에스테라제)의 발현과, 6일간 자극 후 MBP (마이엘린 베이직 단백질)의 발현을 각각 조사하였다. 결과에 따르면, Env는 CNPase 양성 세포와 MBP 양성 세포를 수적으로 상당히 감소시키는 (도 8A-D''') 반면, 전구체 마커인 O4의 발현에는 변화가 없었다 (도 3F-G'). 이는, Env 단백질의 존재시 세포 분화 반응이 현저하게 저하됨을 의미한다. 그러나, Env 자극과 병행하여, D-NAME이 아닌 L-NAME를 첨가하면 MBP 발현을 회복시킬 수 있었는데 (도 8E-H'), 이는 질산화적 스트레스를 통한 3-NT 형성과 OPC의 분화력 감소 간에 직접적인 연결 관계가 존재한다는 것을 의미한다.
1.3 결과 분석
MS와 같은 신경염증성 탈마이엘린 질환에서 NS의 마이엘린 재생 부진은 상주하는 OPC의 적절한 분화력 감소 및 탈마이엘린화된 엑손의 마이엘린 재생력 감소가 일차적인 원인인 것으로 여겨지지만11-13, 이러한 마이엘린 재생을 차단시키는 주된 상류 병인성 분자는 알려져 있지 않다. 기존 연구들에서, 해당 레트로바이러스 입자로부터 수득하였을 경우14 "다발성 경화증 관련 레트로바이러스 인자 (MRSA)"로도 지칭되는 HERV-W의 외막 단백질 Env가, 선천적인 면역 시스템에 전염증성 효과를 발휘하여 단핵구 세포를 활성화시키고, 그로 인해 주요 전염증성 사이토카인들이 생성된다는 것이 이미 확인된 바 있다10. 하지만, Env와 OPC의 분화력 감소 간의 직접적인 관계는 아직까지 고찰된 바 없으며, 고찰할 수도 없었다. 본원에서는, 본 발명자들은 이 Env 단백질을 MS-발병한 NS 조직에서 검출할 수 있었으며, Env가 특정 분화 단계(들)에서 기존에는 몰랐던 OPC 상에 존재하는 Env 수용체인 TLR4를 통해 OPC 분화를 간섭할 수 있다는 것을 알게 되었다. 이러한 유해한 작용은 iNOS를 통해 유발된다. 이러한 스트레스 반응으로 니트로티로신이 형성되어, 직접적으로 마이엘린 단백질의 발현에 작용하게 된다. 흥미롭게도, Env 자극은 OPC 세포의 생존에는 영향을 미치지 않으며, 세포 형태도 변형되지 않고 유지되는데, 이는 Env-매개 신호가 세포골격 인자들을 타겟팅하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 예기치못한 발견 내용에 대한 신규성에 주목하여 검증해보면, 종래 연구들에서는 인간 뇌의 희소돌기신경교 세포에 TLR4가 없다고 주장하고 있다15. 그러나, 이러한 기존에 이해된 바와는 대조적으로, 본 발명자들은, TLR4가 배양한 일차 OPC (랫 및 인간 오리진 모두)에서 발현될 뿐만 아니라 MS 조직내 PDGFRα-양성의 상주하는 인간 OPC에서도 발현된다는 것을, 명확하게 확인할 수 있었다. 이러한 차이는, 라인하트와 그의 동료들이 희소돌기신경교 세포를 검출하기 위해 보다 일반적인 마커인 O4를 사용하였지만, 본 발명자들은 대신 최근 인정된 전구체 마커인 PDGFR-α를 이용했다는 것에서 발생한 것일 수 있다. 여하튼, 본 발명자들은 OPC에 이러한 TLR4의 고유 발현 패턴이 여전히 존재하지 않는 것으로 간주되는 오늘날에 최초로 이를 입증하게 되었다. 아울러, 본 발명자들은, OPC가 성숙화를 거치는 동안 TLR4의 발현이 현저하게 하향 조절되는 것을 관찰하였는데, 이는 수용체 발현과 그에 따른 Env 감수성이 미성숙형 세포로 국한된다는 것을 시사한다. 하지만, 이런 사실은 이들 세포가 MS 병변에서 발현 및 방출되는 것으로 입증된 Env 단백질과 직접 상호작용할 수 있게 하는 것이므로, 병리학적으로 타당하다. 이러한 사실에 비추어, 본 발명자들은, MSRV/HERV-W Env 단백질이 MS의 면역병리학적 구성 요소일 뿐만 아니라, 내인성 마이엘린 회복 작용에 유의한 부정적인 효과를 발휘할 수 있다고 결론내렸다. 따라서, 질환의 진행 기간 동안 다수의 MS 환자들에서 관찰되는 회복력 감소는 MSRV/HERV-W 인자들의 활성화가 원인이라고 판단하였다2. 특히, 기존 연구는 7번 염색체에 안정적으로 삽입된 (gag 유전자와 pol 유전자에 코딩 서열이 없어 RT-활성을 발휘하거나 입자를 생성할 수 없는) 결합 카피에 의해 코딩된 HERV-W Env 단백질의 실험 결과를 기술하고 있다16. 이 Env 단백질은 오직 HERV-W 7q 인자의 코딩 유전자 (env, 또는 ERVW-E1 유전자 좌)에 의해서만 발현될 수 있으며, 이의 표면 도메인의 C-말단 파트에 아미노산 4개가 결손되어 있어, 명백하게도 고유한 세포 경로를 야기하며, 태반에 국한된 단백질 수준으로 생체내 발현하는 것으로 알려져 있다17, 18. 이 단백질은 실제 "길들여진(domesticated)" HERV 단백질17의 일예로서, 합포체영양모세포 (syncytiotrophoblast) 조직 형성에 생리학적 역할을 수행하며, 따라서 "신사이틴 (Syncytin)"이라고 명명되어 있다19. HERV-W Env에서 해당 융합유도 도메인 (fusogenic domain)과 TLR4-결합 도메인은 HERV-W 서브타입들 (예, MSRV-Env 또는 Syncytin) 간에 다소 보존되어 있을 수 있다. 활성 도메인의 형태적 노출을 이용한 표면 또는 세포외 단백질로서의 이의 이용성은 고도로 조절되며, 신사이틴의 생리학적 역할은 합포체영양모세포에만 한정되어 유지되며, 태반으로 제한된다. 따라서, 관련된 병인성 (pathogenicity)은, 비-생리학적 활성화, 예를 들어, 인간에서 특정 환경적 감염 물질에 의한 비-생리학적 활성화, 또는 형질전환 실험의 시험관내 또는 생체내 조건의 홀마크인 것으로 보인다20, 21. 신사이틴은 다발성 경화증 (MES) 개체의 NS 성상교세포에서 발견되는 것으로 보고되었고, HERV-W MSRV-Env 서브타입은 항체 이용시 도처에서 검출되는 것으로 보고되었지만, 신사이틴은 검출되지 않았다22. 신사이틴은 마우스 성상세포에서 트랜스제네시스에 의해 발현시켜, 희소돌기아교세포에 유해한 사이토카인을 방출하게 할 수 있었지만16, 형질전환된 마우스는 생존할 수 없는 것으로 확인되었다 (C. Power's personal communication to H. Perron, Neurovirology symposium, San Diego, 2007). 그러나, 안토니와 그의 동료들은, 상기한 형질전환 마우스 뇌에서 신사이틴-매개 세포독성에 취약한 APC (adomatosis polyposis coli)-양성의 마이엘린화 희소돌기아교세포를 발견하여, 본 발명자들은 성숙형 세포가 없을 경우 Env-매개 전염증성 신호에 오직 미성숙 OPC만 매우 취약하다는 것을 입증할 수 있었다. 즉, 이러한 연구 결과들은, 뇌 세포에서 태반 단백질의 형질전환에 의한 발현 조건과 연계된 인위적인 실험 조건의 결과들에서 현재 드러나고 있다. 인위적인 조건에서 도출된 이러한 결과들과는 다르게, 본 발명자들은, MS 병리학이 아닌 성체 신경계 (NS)의 내인성 회복력을 설명하는 유해 기전을 발견하게 되었으며, 이는 주로 희소돌기아교세포 및 축삭돌기가 손상된 마이엘린 시트의 면역-매개 감소에 관한 것이다. 실제, NS 염증성 병변과 관련된 면역 세포에 대한 Env-매개 작용들은 현재 충분히 개시되어 있지만7, 10, 23-25, 종래 연구들은 OPC에 의한 MS 플라그 마이엘린의 재생 차단에 관여하는 신경교 세포에 대한 HERV-W Env의 직접적인 병인성을 입증하진 못하였다. 활성형 MS 플라그 또는 보다 활성이 약한 병변의 가장자리에서 광범위한 Env 단백질 발현을 보여주는 MS 뇌 면역조직학 결과에 대한 본 발명의 결과는, MS 병변에서 공지된 OPC에 의한 마이엘린 재생 결함에 있어 상기한 역할을 뒷받침해준다.
실시예 2: HERV-W 패밀리 외막 단백질에 의해 유발되는 마이엘린 재생 봉쇄는 항-Env 특이 항체로 효과적으로 치료된다
HERV-W 패밀리 외막 유래 외막 단백질 (Env, 특히 다발성 경화증 관련 레트로바이러스 서브타입의 것, MSRV-Env)은 마이엘린 재생 공정에서 중요한 단계인 것으로 보이는, 마이엘린 생성형 성숙 희소돌기아교세포로 분화되는 마이엘린 비-생성형 OPC의 분화력에 대한 강력한 저해제이다. 본 발명자들은 희소돌기아교세포 분화에 대한 2종의 마커 발현에 MSRV-Env 단백질이 미치는 영향을 조사하였다:
- CNPase (2',3'-사이클릭 뉴클레오티드-3'-포스포하이드롤라제)는 전체 마이엘린 단백질의 4%에 해당되며, 비-컴팩트형 희소돌기신경교의 축삭돌기 외피화 (ensheathment) 세포질에 존재한다. CNPase는 발생 중인 희소돌기아교세포에 의해 합성되는 가장 빨리 공지된 마이엘린-특이 단백질이다.
- MBP (마이엘린 베이직 단백질)는 마이엘린 단백질의 30% 정도를 차지하며, 중추신경계와 말초신경계에서 마이엘린 압축 (myelin compaction)에 중요한 역할을 수행한다. 이것은 생체내 및 시험관내에서 CNPase 다음으로 순차적으로 나타나며, 성숙한 희소돌기아교세포의 특이 마커이다. 본 연구의 목적은 재조합 인간화된 항-Env IgG4 단일클론 항체인 GNbAC1 등의 특이적인 항-Env 항체가 MSRV-Env에 의해 유발되는 OPC 성숙화의 저해를 차단할 수 있는 지를 확인하기 위한 것이었다. 실제, 이러한 GNbAC1의 작용은 항체의 "항-마이엘린 재생 세포의 차단" 특성을 나타내게 될 것이다. 이러한 가설을 확인하기 위해. 일차 배양한 인간 OPC를 배양 표면을 재조합 단백질로 코팅하거나 또는 배양 배지에 단백질을 첨가함으로써, GNbAC1 첨가 또는 무첨가 하에, MSRV-Env와 함께 인큐베이션하였다. CNPase (초기 성숙 마커) 및 MBP (후기 성숙 마커)의 발현은 자극 1일 또는 자극 3일 후 각각 면역조직화학법에 의해 평가하였다.
본 실시예에서, MSRV-Env는 HERV-W 외막 단백질의 세포내 도메인, 막 관통 도메인 및 세포외 도메인을 포함하는 전장 재조합 MSRV-Env 단백질을 지칭한다.
본원에 제시된 결과들은, 인간 OPC가 이의 플라즈마 막에 특이적인 TLR4를 발현하며, MSRV-Env 재조합 단백질이 특이적이고도 유의하게 CNPase 및 MBP 양성 세포를 수적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 인간 및 랫 OPC에 대한 실시예 1의 결과와 일치한다. 아울러, 본 실험에서는, 최초로, MSRV-Env에 의해 유발되는 인간 OPC 성숙화의 저해 (차단)가 GNbAC1 처리에 의해 완전히 회복된다는 것을 확인하였는데, 이는 새롭고, 기존에는 예상하지 못했던 치료학적 특성을 입증해주는 것이다. 따라서, 진행성 다발성 경화증을 치료하는데 있어 추가적인 처방이 된다.
2.1 재료 및 방법
2.1.1 재료
인간 OPC 일차 배양에 사용되는 재료들
공급사 레퍼런스 배치 번호
세포 배양기 ThermoScientific HePA Class 100 --
무균 후드 Fisher Bioblock Scientific Steril VBH Compact --
인간 OPC 3H Biomedical (ScienCell) 1600 10805
OPC 완전 배지 3H Biomedical (ScienCell) 1601 10887
1652 (OPCGS) 10576
0503 (P/S) 9846
PBS Gibco 10010 954270
T75 플라스크 Corning 2148R 03412012
Labtek 8-웰 Nunc 154534 081711-8-0
081611-8-0
폴리 L-라이신 Sigma-Aldrich P4707 RNBC2451
10 ml 파이펫 Greiner-Bio one 607180 11032401
5 ml 파이펫 Greiner-Bio one 606180 11051101
인간 OPC에서 성숙 마커 발현을 분석하는데 사용되는 재료들
공급사 레퍼런스 배치 번호
PBS Gibco 10010 954270
파라포름알데하이드 Sigma-Aldrich 15,812-7 STBB5309
트리톤 X100 Fluka BP151-100 104484
소 태아 혈청 Sigma-Aldrich F6178-500ML 090M8404
항-CNPase 항체 Eurogentec (Covance) SMI91-R E11BF00277
항-MBP 항체 Eurogentec (Covance) SM99 E12DF00468
항- TLR4 항체 AbNOVA H00007099-M03 11293-1H7
염소 항-마우스 FITC 항체 Millipore AP124F LV1688510
커버슬라이드 Gerhard Menzel B7257M 0290880
Vectashield 탑재 매질 + DAPI Vector Laboratories H1500 X1118
Axioscope 현미경 Zeiss -- --
AxioCam Zeiss -- --
AxioVision 소프트웨어 Zeiss -- --
MSRV-Env, GNbAC1 및 MSRV-Env 버퍼를 이용한 OPC 자극시 사용되는 재료들
공급사 레퍼런스 배치번호
재조합 MSRV-Env PX'Therapeutics ENV-T 110719-1 (22A)
MSRV-Env-T 버퍼 PX'Therapeutics -- --
GNbAC1 Polymun GNbAC1 T96/bAC1/B1
2.1.2 프로토콜
인간 OPC와 MSRV-Env, MSRV-Env 버퍼 및 GNbAC1의 인큐베이션
전장 재조합 MSRV-Env를 제조하여, PX'Therapeutics (548 aa; 61,44 KDa) (batch 110719-1)에서 정제하였다. 초기 농도는 0.6 mg/ml (9,76 μM)이었다. MSRV-Env 버퍼 (20 mM Trizma-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5% SDS, 10 mM DTT)는 PX'Therapeutics로부터 제공받았다. 이 용액을 음성 대조군으로 사용하였다. GNbAC1 (Batch T96/bAC1/B1; GMP production)을 제조하여, 오스트리아 비엔나에 위치한 Polymun Scientific에서 정제하였다. 초기 농도는 10 mg/ml (68,03 μM)이었다.
세포를 접종하기 전에 세포 배양 플레이트 표면에 용액을 코팅하거나 또는 세포 접종 후 세포 배양 배지에 이를 첨가함으로써, 여러가지 처리제로 인간 OPC를 자극하였다. 모든 경우에, labtek 8웰 챔버 슬라이드 (Nunc)를 미리 37℃에서 밤새 폴리-L-라이신 (Sigma-Aldrich)으로 코팅하였다.
Labtek 8웰 챔버 슬라이드의 코팅
여러가지 처리제들은 무균 층류 후드 하에 PBS에 희석하고 (Fischer Bioblock, France), Labtek 8웰 챔버 슬라이드 (Nunc; 250 ㎕/웰)를 아래와 같이 코팅하였다:
- MSRV-Env (1㎍/ml), 37℃에서 2시간 코팅
- MSRV-Env 버퍼 (MSRV-Env과 동일하게 희석) 37℃에서 2시간 코팅
- MSRV-Env + GNbAC1 A1 : MSRV-Env (1㎍/ml) 및 GNbAC1 (7,35 ㎍/ml = 50 nM) 혼합물 37℃에서 2시간 코팅
- MSRV-Env + GNbAC1 A2 : MSRV-Env (1㎍/ml) 및 GNbAC1 (29,4 ㎍/ml = 200 nM) 혼합물 37℃에서 2시간 코팅
- MSRV-Env + GNbAC1 B1 : MSRV-Env (1㎍/ml) 37℃에서 2시간 코팅, PBS로 헹군 후 GNbAC1 (7,35 ㎍/ml = 50 nM)으로 37℃에서 1시간 코팅
- MSRV-Env + GNbAC1 B2 : MSRV-Env (1㎍/ml) 37℃에서 2시간 코팅, PBS로 헹군 후 GNbAC1 (29,4 ㎍/ml = 200 nM)으로 37℃에서 1시간 코팅
- GNbAC1 A1 단독 : GNbAC1 (7,35 ㎍/ml = 50 nM)으로 37℃에서 2시간 코팅
- GNbAC1 A2 단독 : GNbAC1 (29,4 ㎍/ml = 200 nM)으로 37℃에서 2시간 코팅
- GNbAC1 B1 단독 : PBS에서 37℃에서 2시간, GNbAC1 (7,35 ㎍/ml = 50 nM)으로 37℃에서 1시간 코팅
- GNbAC1 B2 단독 : PBS에서 37℃에서 2시간, GNbAC1 (29,4 ㎍/ml = 200 nM)으로 37℃에서 1시간 코팅
- BSA (1㎍/ml) 37℃에서 2시간 코팅
- BSA + GNbAC1 A1 : BSA (1㎍/ml) 및 GNbAC1 (7,35 ㎍/ml = 50 nM) 혼합물 37℃에서 2시간 코팅
- BSA + GNbAC1 A2 : BSA (1㎍/ml) 및 GNbAC1 (29,4 ㎍/ml = 200 nM) 혼합물 37℃에서 2시간 코팅
- BSA + GNbAC1 B1 : BSA (1㎍/ml) 37℃에서 2시간 코팅, PBS로 헹군 후 GNbAC1 (7,35 ㎍/ml = 50 nM)으로 37℃에서 1시간 코팅
- BSA + GNbAC1 B2 : BSA (1㎍/ml) 37℃에서 2시간 코팅, PBS로 헹군 후 GNbAC1 (29,4 ㎍/ml = 200 nM)으로 37℃에서 1시간 코팅
인간 희소돌기아교세포의 전구 세포 배양
인간 뇌 조직으로부터 분리된 OPC를 ScienCell Research Laboratories (through 3H Biomedical, Sweden)으로부터 구입하였다. 각 바이얼에는 1 ml에 세포가 >1 x 106개 포함되어 있다. OPC 배양 배지 (OPCGS)와 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)을 제조사의 권고 (Sciencell)에 따라 OPCM에 첨가함으로써, OPC 완전 배양 배지 (OPCM)를 구축하였다.
인간 OPC가 포함된 바이얼을 37℃ 수조에 두고, 내용물이 완전히 해동될 때까지 회전시켜 서서히 교반하였다. 세포를 1 ml Gilson 파이펫을 사용하여 천천히 재현탁하였다. 그런 후, 이를 완전 OPCM으로 희석하여, 폴리-L-라이신 (0,01%, Sigma)으로 미리 코팅되고 전술한 처리제 (3.2.1.1)가 첨가 (또는 무첨가)된 8웰 labtek 배양 바셀에 무균 층류 후드 (Fischer Bioblock, France) 하에 접종하였다 (7000 세포/cm2 = 10000세포/웰). 배양물은 37℃, 5% CO2에서 후속적인 면역조직화학 실험 전까지 인큐베이션하였다. 배양 배지를 다음날 교체하여 72시간 동안 처리한 배양물에서 잔류하는 DMSO와 무-부착 세포를 제거하였다.
배양 배지에서 MSRV-Env과의 인큐베이션
8-웰 labtek 배양 바셀에서 인간 OPC를 3시간 사전-배양한 후 (3.2.1.2), 세포에 하기 용액을 첨가하여 8-웰 labteks (250 ㎕ /웰)에서 37℃에서 24시간 또는 72시간 동안 인큐베이션하였다:
- MSRV-Env 버퍼, 음성 대조군으로서, 완전 세포 배양 배지에 첨가됨
- MSRV-Env는 완전 세포 배양 배지에 3 nM (0,184 ㎍/ml)로 첨가됨
- MSRV-Env (3 nM) + GNbAC1 (200 nM; 29,4 ㎍/ml) 혼합물이 완전 세포 배양 배지에 첨가됨
- GNbAC1 (200 nM)은 단독으로 완전 세포 배양 배지에 첨가됨
시험관내 OPC에서 TLR4 및 마이엘린화 마커의 발현
24 또는 72시간 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지를 제거한 다음, 전술한 처리 (3.2.1)로 자극한 인간 OPC를 파라포름알데하이드 용액 (PBS 중의 4% PFA, 250 ㎕/챔버)에서 실온에서 1시간 고정하였다. 그런 후, 이를 PBS (3 x 250 ㎕/챔버)로 3번 세척한 다음, 0,1% Triton X100 (250 ㎕/챔버)이 첨가된 10% 소태아 혈청 (FBS)/PBS 용액과 함께 37℃에서 1시간 인큐베이션하여, 비-특이 결합부를 포화시켰다. TLR4 염색의 경우, 세포를 10% FBS/PBS (250 ㎕/챔버)와 함께 인큐베이션하였다. 포화시킨 후, OPC 배양물을 10% FBS/PBS 용액에 희석된 하기 1차 항체 용액과 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다 (200 ㎕/챔버):
- 마우스 항-TLR4 항체, 1/1000 (24시간 및 72시간 배양 후)
- 마우스 항-CNPase 항체, 1/200 (24시간 자극 후)
- 마우스 항-MBP 항체, 1/100 (72시간 자극 후)
세포를 PBS로 3번 헹구고 (3 x 250 ㎕/챔버), 2차 항체 용액과 37℃에서 1시간 하기와 같이 인큐베이션하였다 (250 ㎕/챔버):
- FITC 접합된 염소 항-마우스 항체, 1/200
실온에서 PBS로 3회 세척한 후 (3 x 300 ㎕/챔버), 플라스틱 챔버에서 슬라이드를 분리하였다. 그런 후, 슬라이드에 DAPI (Vectashield)가 함유된 Vectastain® 탑재 매질을 탑재하였다. Axioscope 현미경 (Zeiss)을 이용한 형광 검경으로 염색 결과를 가시화하였다.
데이타 분석
24시간 MSRV-Env-T (또는 대조군) 자극한 후, CNPase 면역반응성 세포를 랜덤 선택한 챔버 당 10 field로 카운팅하였다. CNPase 양성 세포 %를 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112015041410606-pct00001
72시간 MSRV-Env-T (또는 대조군)로 자극한 후, MBP 면역반응성 세포를 랜덤 선택한 챔버 당 10 field로 카운팅하였다. MBP 양성 세포 %를 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112015041410606-pct00002
데이타는 CNPase 또는 MBP 양성 세포의 %로 평균 ± SEM으로 나타낸다. 윈도우용 GraphPad 소프트웨어, version 5.00 (San Diego California USA)을 이용하여 그래프를 작성하였다. 비-모수적 통계 검정을 Sigma Stat (Chicago, IL, USA)를 이용하여 수행하였다.
아래 결과들은 3세트의 독립적인 실험을 수행하는 동안 수집하였으며, 각각 새로운 냉동 시판 OPC 바이얼로 수행하였다: OPC ICC 01, OPC ICC 02, 및 OPC ICC 03.
2.2 결과
2.2.1 인간 OPC에서 시험관내 TLR4 수용체의 발현
TLR4 발현을 면역형광 검경에 의해 분석하였다. 임의의 디터전트 첨가 없이 수행된 포화 단계는 오직 세포 표면에서만 TLR4를 검출할 수 있다. 본 실험으로, 24시간 및 72시간 1차 배양 후, 인간 OPC의 세포 표면에 MSRV-Env의 타겟 수용체가 존재한다는 것이 검증되었다 (도시 안함).
2.2.2 인간 OPC에서 시험관내 CNPase 및 MBP 발현
시험관내 인간 OPC의 형태를 명시야 검경으로 가시화하였다. OPC는 세포 바디에 제시되어 있었으며, 일반적으로 2개의 세포 신장을 나타내었다. CNPase 및 MBP 발현은, 각각 24시간 및 72시간 배양 후 면역형광 현미경 검경에 의해 검증되었다.
2.2.3 인간 OPC 분화에 있어 GNbAC1이 첨가 또는 무첨가시 MSRV ENV의 효과
일차 배양시 인간 OPC에서 성숙 마커 발현에 대한 코팅된 MSRV-Env의 효과 (OPC ICC 01)
제1차 실험 (OPC ICC 01)의 목적은 인간 OPC 일차 배양 조건 뿐만 아니라 MSRV-Env로 미리-코팅된 labteks 챔버 슬라이드 및 CNPase 및 MBP 면역염색 프로토콜을 확립하기 위한 것이었다.
인간 OPC를 접종하기 전에 Labtek 배양 바셀에 MSRV-Env를 1 ㎍/ml로 코팅하였다. 음성 대조군 (버퍼)으로서, 배양 바셀을 오직 MSRV-Env 버퍼와 동일 조건에서 인큐베이션하였다.
CNPase 양성 세포 %는 대조군 조건 (버퍼)의 85 ± 4 %에서 MSRV-Env로 미리-코팅한 labtek에서 24시간 자극한 인간 OPC의 경우 69 ± 6 %로 현저하게 감소하였다 (* p<0,05; t-검정) (도 9A).
72시간 배양한 후, MBP 양성 세포의 %는 대조군 조건 (버퍼)의 74 ± 7 %에서 MSRV-Env로 미리-코팅한 labtek에서의 경우 25 ± 3 %로 현저하게 감소하였다 (* p<0,001 Mann-Whitney 순위 합계 검정) (도 9B). 이들 결과는, MSRV-Env가 인간 OPC의 시험관내 마이엘린 생성 세포로의 성숙화를 저해한다는 것을 보여준다.
MSRV-Env에 의해 유발되는 OPC 성숙화의 저해에 있어 GNbAC1의 효과 (OPC ICC 02)
제2차 실험 (OPC ICC 02)의 목적은 인간 OPC 분화에 있어 MSRV-Env 효과를 검증하고, 단백질을 세포 배양 배지에 직접 첨가하였을 때 MSRV-Env가 인간 OPC 분화를 저해할 수 있는지를 확인하기 위한 것이었다. 아울러, GNbAC1이 이 모델에서 MSRV-Env 효과를 저해할 수 있는지도 테스트하였다.
MSRV-Env로 미리-코팅된 labteks에서 인간 OPC를 자극한 경우, GNbAC1 처리를 2가지의 다른 프로토콜로 분석하였다. 일차로, labtek 배양 슬라이드를, OPC 접종하기 전에, MSRV-Env (1 ㎍/mL) 및 GNbAC1 (50 nM 또는 200 nM)의 혼합물과 예비-인큐베이션하였다 (조건 GNbAC1-A). 두번째 프로토콜은 OPC를 접종하기 전에 순차적인 MSRV-Env (1 ㎍/mL) 코팅과 GNbAC1 (50 nM 또는 200 nM) 코팅으로 구성된다.
인간 OPC에서 CNPase 발현에 대한 MSRV-Env 및 GNbAC1의 효과
24시간 자극한 후, CNP 양성 세포의 %는 대조군 (버퍼) 75 ± 2 %에서, 1 ㎍/ml MSRV-Env으로 사전-코팅된 labteks의 경우 55 ± 2 %로 현저하게 감소되었다 (*p<0,001 vs 버퍼; 일원식 ANOVA 및 이후 Fischer LSD post-hoc 분석). 또한, 1 ㎍/ml BSA로 사전-코팅된 labteks에서의 자극은 CNPase 발현에 효과가 없으며 (71 ± 2 %), 이는 대조군 단백질에서는 관찰되지 않았기 때문에 MSRV-Env에서 관찰되는 효과의 특이성을 확인시켜 준다 (도 10A).
GNbAC1은 MSRV-Env로 미리-코팅된 labteks에서 유도되는 CNPase 양성 세포의 감소를 현저하게 저해한다 (도 10A). GNbAC1의 효과는 50 nM 및 200 nM에서 관찰하며, 2가지 다른 프로토콜에서 테스트하였다: (i) 조건 GNbAC1-A, 50 nM (69 ± 4 %), 200 nM (80 ± 2 %); (ii) 조건 GNbAC1-B 50 nM (96 ± 3 %) 및 200 nM (76 ± 4 %) (Ψp<0,001, 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석). 아울러, GNbAC1의 효과는 농도 의존적인 것으로 보인다 (도 10A).
추가적인 대조군 실험에서는, pre-GNbAC1 단독 (50 nM 또는 200 nM) labteks에서 또는 GNbAC1 (50 nM 또는 200 nM) + BSA (1㎍/ml) 혼합물로 24시간 자극한 인간 OPC는, 대조군 조건 (버퍼)과 비교하여 CNPase의 발현에 영향이 없었다 (p > 0,05; 일원식 ANOVA) (도 10B). 이들 결과는 전술한 2가지 GNbAC1 처리 프로토콜로 관찰하였다 (GNbAC1-A 50 nM, GNbAC1 A 200 nM 및 GNbAC1-B 50 nM).
또한, 본 실험에서, 용액내 매우 낮은 농도의 MSRV-Env도, 24시간 후 CNPase 양성 세포의 %를 대조군 78 ± 2 % (버퍼)에서, MSRV-Env 그룹의 57 ± 2 %로의 현저한 감소를 유도하는 것으로 확인된다 (*p<0,001 vs 버퍼; 일원식 ANOVA 및 이후 Fischer LSD post-hoc 분석) (도 11). 아울러, GNbAC1 (200 nM) 처리는 MSRV-Env에 의해 유도된 CNPase 발현의 감소를 완전히 길항화한다 (76 ± 2 %; Ψp<0,001 vs Env-T; 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석). 흥미롭게도 200 nM GNbAC1 단독 (74 ± 2 %)으로는 대조군 조건 (버퍼)과 비교해 CNPase 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 11).
인간 OPC에서 MBP 발현에 대한 MSRV-Env 및 GNbAC1의 효과
72시간 자극한 후, 1 ㎍/ml MSRV-Env로 미리-코팅된 labteks에서, 대조군 (버퍼) 76 ± 2 %에서 57 ± 1 %로의 MBP 양성 세포 %의 현저한 감소가 관찰되었다 (**p<0,001 vs 버퍼; 일원식 ANOVA 및 이후 Fischer LSD post-hoc 분석) (도 12A). 본 실험에서, BSA (1 ㎍/ml)로 미리-코팅된 labteks에서의 OPC 배양시, MBP 양성 세포의 %는, 대조군 (버퍼) (69 ± 2 %)과 차이가 약간 있었다. 그러나, BSA 효과는 MSRV-Env 효과와 현저한 차이가 있었지만 (p<0,001 vs Env-T; 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석), 다른 실험이나 동일 시리즈로 CNPase를 이용한 경우에는 관찰되지 않아, 본 실험 시리즈에서만 확인된 비-파급적인 효과인 것으로 밝혀졌다.
GNbAC1은 MSRV-Env로 미리-코팅된 labteks에서 유도된 MBP 양성 세포의 감소를 현저하게 저해한다 (도 12A). GNbAC1의 일부 효과는 50 nM에서 확인되며, 완전한 저해는 200 nM에서 달성되는데, 2가지 처리 프로토콜로 테스트하였다: (i) GNbAC1-A 50 nM (69 ± 2 %) 및 200 nM (73 ± 2 %), (ii) GNbAC1-B 50 nM (68 ± 2 %) 및 200 nM (74 ± 2 %) (Ψp<0,001 vs Env-T; 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석). 아울러, GNbAC1의 효과는 농도 의존적인 것으로 보인다 (도 12A).
또한, 본 실험에서는, 배양 배지에 MSRV-Env (3 nM)를 첨가하여 72시간 자극한 세포에서, MBP 양성 세포 %가, 대조군 (버퍼) 76 ± 2 %에서 55 ± 2 %로 현저하게 감소되는 것으로 나타났다 (*p<0,001 vs 버퍼; One way ANOVA 및 이후 Fischer LSD post-hoc 분석) (도 12B). 아울러, GNbAC1 처리 (GNbAC1　200 nM)시 MSRV-Env에 의해 유도되는 MBP의 발현 감소가 완전히 저해되었다 (76 ± 2 %; Ψp<0,001 vs Env-T; 일원식 ANOVA 및 이후 피셔의 LSD post-hoc 분석) (도 12B).
MSRV-Env에 의해 유도된 OPC 분화 저해에 대한 GNbAC1의 효과 검증 (OPC ICC 03)
전술한 결과들은 상당한 규모의 수집 데이타로부터 도출되었지만, 제3차 실험 (OPC ICC 03)의 목적은 전체 독립적인 실험 시리즈로 GNbAC1의 효과를 완전히 재현하는 것이었다.
인간 OPC 배양에서 CNPase 및 MBP 발현에 대한 MSRV-Env와 GNbAC1의 효과
24시간 자극한 후, CNPase 양성 세포 %는, 대조군 조건 (버퍼)의 90 ± 1%에서 MSRV-Env (1 ㎍/ml)로 미리-코팅된 labteks에서 관찰된 71 ± 1%로, 현저하게 감소되었다 (*p<0,05 ; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Student Newman Keuls post-hoc 분석) (도 13A). 앞서 기술한 바와 같이, GNbAC1 (200 nM)은 테스트한 2가지 GNbAC1 처리 프로토콜들에서 MSRV-Env에 의해 유도된 CNPase의 발현 저해를 완전히 회복시켰다 (GNbAC1-A: 90 ± 2 %, GNbAC1-B: 91 ± 4 %) (Ψp<0,05 vs Env-T; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Dunn post-hoc 분석) (도 13A).
72시간 자극 후, MBP 양성 세포 %는, 대조군 조건 (버퍼)의 78 ± 2%에서 72시간 MSRV-Env (1 ㎍/ml)로 미리-코팅된 labteks에서 관찰된 55 ± 3%로 현저하게 감소되었다 (*p<0,05 vs 버퍼; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Dunn post-hoc 분석) (도 13B). 앞서 기술한 바와 같이, GNbAC1 (200 nM)은 테스트한 2가지 GNbAC1 처리 프로토콜들에서 MSRV-Env에 의해 유도된 MBP의 발현 저해를 완전히 회복시켰다 (GNbAC1-A: 80 ± 2 %, GNbAC1-B: 75 ± 2 %) (Ψp<0,05 vs Env-T; Kruskal-Wallis ANOVA-1 on Ranks 및 이후 Dunn post-hoc 분석) (도 13B).
OPC ICC 02 및 OPC ICC 03 실험으로부터 수득한 데이타 풀
전술한 2가지 일련의 실험들 (OPCICC02 및 OPCICC03)에서 입수한 결과를 동일한 분석에서 조합하였다. 즉, 도 14의 그래프로 도시된 데이타는 CNPase (도 14A) 및 MBP (도 14B)에 대한 8-14번의 독립적인 실험들을 나타낸 것이다. 이러한 분석을 통해, 인간 OPC 분화에 대한 MSRV-Env 및 GNbAC1의 효과가 매우 재현성이 높고 일관적이라는 것을 확인하였다.
발현 데이타를 표준화하기 위해, 대조군 조건 (버퍼)을 기준으로 하고, 이를 100%로 설정하였다. 요컨대, 그 결과, 본 시리즈 실험에 사용된 MSRV-Env 농도들은 CNPase 양성 세포의 수를 24　% 감소시키고 (CTRL: 100 ± 1 %; ENV: 76 ± 1 %), MBP 양성 세포의 수를 27% 감소시키는 (CTRL: 100 ± 2 %; ENV: 73 ± 2　%) 것으로 나타났다. GNbAC1 (200 nM)은 CNPase 발현에 미치는 MSRV-Env의 효과를 완전히 회복시켰을 뿐만 아니라 (GNbAC1-A: 102 ± 1 %; GNbAC1-B 101 ± 1 %) (도 15A), MBP 발현에 미치는 효과도 완전히 회복시켰다 (GNbAC1-A: 101 ± 2 %; GNbAC1-B 97 ± 2 %) (도 15B).
2.3 결과 분석
따라서, 본 실시예에서 수득한 데이타는, MSRV Env가 희소돌기아교세포 성숙화의 특이 마커 2종의 발현을 확고하고 매우 재현성이 높은 방식으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 즉, MRSV Env는 인간 희소돌기아교세포 전구체가 마이엘린 생성 세포로 분화되는 것을 저해한다. 아울러, 이러한 유해한 MSRV Env 효과를 GNbAC1이 완전히 회복시키며, 이 모델에서 CNPase 및 MBP가 정상 수준으로 회복된다는 것이 명확하게 확인되었다. 이들 결과에 따라, GNbAC1은 HERV-W/MSRV-Env에 의해 유발되는 OPC 분화 차단을 치료한다. 즉, 이들 결과는 HERV-W 외막 단백질에 의해 유발되는 탈마이엘린화 병변을 치료하는데 있어 GNbAC1의 획기적인 용도를 상당히 뒷받침해준다. 이는 특히 실시예 1에 기술된 바와 같이 Env-양성 세포의 지속성 및 분비로 인해, 마이엘린 재생이 중요하지만 MS 병변 주변의 OPC에서는 발생하지 않는 진행형 다발성 경화증에 해당된다.
실시예 3: 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)과 MSRV/HERV-W 외막 단백질 (Env)을 이용하여 유도된 뮤라인 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 실험 모델에서 GNbAC1 항체, L-NAME, SMT, DMF 또는 소듐 푸마레이트의 치료학적 효능 연구
3.A 단일 분자 (단일요법) 및 항-Env 항체와 Env-유발성 작동자를 저해하는 소형 분자의 조합물 (병용 요법) 간의 OPC 차단 비교
3.A.1. 재료
Charles River 사의 C57BL/6 마우스
MOG 35-55 EspiKem,Srl (Polypeptide company); reference: SC1272.
GNbAc1; batch T950111-8 (서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 기술된 각각의 상보성-결정부 (CDR)를 포함하는 항-MSRV/HERV-W 인간화된 IgG4 항체.
L-NAME (NG-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르) Sigma; reference: N5751-5G batch BCBF4375V
SMT (S) 메틸이소티오유레아 헤미설페이트 (Sigma);reference: M84445-100G batch STBC1003V
다이메틸 푸마레이트 (DMF) Sigma; reference: 242926-100G batch 2507VBCBH
Methocel MC Sigma; reference: 64605-100G batch BCBD9989V
IFA (Sigma) Sigma reference: F5506-10ML batch:061M8728
PTX　(백일해 독소; Calbiochem) ; Reference: 516561 batch D00128881
PBS (포스페이트 버퍼 염수; Lonza); Reference 516561; batch; D00128881
Env (P'X Therapeutics); 내독소-무함유 (LDL test< 5UI/ml) 및 생활성 (Geneuro internal QC tests)으로 검증된 정제된 단백질의 생산 배치
로타로드 장치 (LE8200; Bioseb France)
3.A.2. 방법
비-감염성 (Pathogen free) C57BL/6 암컷 마우스 (6 - 8주령)를 Charles River laboratories에서 구입하여, 면역화하기 전 1주일 동안 동물 시설에서 사육하였다. 면역화 1일 전, 마우스 모두 체중을 측정한 다음, 로타로드 테스트로 평가하였다. 로타로드:
훈련일: 면역화하기 9 및 8일 전에, 홈 케이지 안 마우스를 사육실에서 실험실로 이동시킨다. 마우스는 15분간 실험실에 적응시킨다. 훈련 기간 동안, 각 마우스를 일정 속도 (4 rpm)의 로타로드 위에 놓고, 마우스가 떨어졌을 경우 다시 로타로드에 올라가 로타로드에서 편안하게 있을 경우, 마우스를 120초간 달리게 하였다. 마우스들 모두 케이지에 다시 넣고, 속도를 13 rpm으로 올린 다음 다시 마우스를 120초간 로타로드 위에 두었다. 마우스들 모두 케이지에 다시 넣고, 속도를 19 rpm으로 올린 다음 다시 마우스를 120초간 로타로드 위에 두었다. 실험실 환경은 테스트 회차 별 간에 온도와 조도를 일정하게 유지하였다.
테스트 일:
면역화하기 하루 전날, 홈 케이스 안의 마우스를 사육실에서 실험실로 이동시켰다. 마우스를 실험실에서 15분간 적응시켰다. 그런 후, 마우스를 7 - 40 rpm 범위에서 속도를 증가시킨 10가지 단계별로 2회 테스트하였다. (각 속도에서 2번의 테스트시) 로타로드에서 떨어지기 전까지의 각 체류 시간이 60초가 될 때까지 기록하였다. 각 동물에 대해 로타로드 시스템에서의 훈련 및 능력을 측정하였다.
로타로드 테스트 결과는, 각 테스트 일과 본 조건 (16-29 rpm)에서 신경운동 손상을 식별하는 범위내 각 테스트 속도에서, 각 그룹들의 개개 스코어의 평균과 바로 표시된 SEM 카이네틱스로 나타낸다.
동일 속도에서 1차 테스트 일 (D-7, 해당 그룹들에서 질환 발병 전)의 결과와 비교해, 로타로드에서의 상대적인 체류 시간 (떨어지기 전까지의) 증가 또는 감소로서, 각 테스트 일과 각 속도 값에서, 개개 마우스로부터 계산하였다. 그 값은 "X일의 로타로드 체류 시간" - "동일 마우스의 동일 속도에서의 7일째의 체류 시간"으로서 계산하였다. 도면은, 조건들 (예, 속도가 너무 높거나 낮아 건강한 동물이 즉각적으로 떨어지거나 또는 아픈 동물이 천천히 계속 움직일 수 있는 경우)에서 아픈 동물을 건강한 동물과 구분하기 위해 검증하였을 때 각 개별 속도 값에 대한, 실험 전 기간 동안 여러 그룹들에서의 카이네틱스를 나타낸다.
평균값과 표준편차를 각 그룹들에서 계산하기 전에, 각 동물이 자신의 대조군을 가진 조건에서 기준으로서 사용된 초기 체중과 성능 데이타를 계산하였다. 여러가지 동물 그룹들은 각 실험 시리즈를 수행하기 전에 제공된 해당 정보에 따라 각 케이지에서 동일하게 사육하였다.
임상 평가
동물의 체중을 측정하고, 다음과 같은 기준으로 주당 5일간 임상 스코어를 평가하였다: 0 = 증상 없음; 1 = 꼬리 마비 또는 하지(들)의 과잉-반사 (hyper-reflex) 또는 한쪽 하지의 약화; 2 = 양쪽 뒷다리 또는 앞다리의 약화; 3 = 한쪽 마비 또는 주요 결함 (major deficit)이 추가로 발생; 4 = 뒷다리 또는 앞다리가 완전히 마비됨; 5 = 반대쪽 수족의 부분 마비 또는 주요 결함이 추가로 발생함; 6 = 빈사 또는 사망. 이 모델을 이용하여 뇌 및 척수 병변의 보다 신속한 유발을 반영하기 위해, 이를 표준 척도에서 변형하였다.
마우스는 전체 실험 기간 동안 1주일에 3회, 월, 수 및 금요일에 체중을 측정하였다.
실시예 3.A의 실험 시리즈의 경우, 그룹들을 하기와 같이 규정하였다.
마우스 여섯(6) 마리로 구성된 그룹들 모두 일차로 0일에 목에, 그리고, 7일 및 14일에 등쪽 옆구리에 MOG/mouse 200 ㎍ + MSRV-Env 60 ㎍ + IFA를 s.c.로 조사하였다.
그룹 A는 어떠한 처리도 하지 않은 MSRV-Env 유발성 EAE로 양성 대조군이다.
그룹 G - H의 경우, 하기 나타낸 용량으로 GNbAc1, L-NAME, SMT 및 DMF를 각각 단독으로 또는 GNbAc1와 함께 사용하여, EAE의 임상적인 증상의 진행이 이미 관찰된 면역후 12일째에 일차로 처리하였다. GNbAc1 인간화 항체는 1회 투여하고, L-Name 또는 SMT는 29일에 실험이 종료될 때까지 4일마다 투여하였다. DMF 처리한 그룹 E 및 H의 경우, 각 마우스의 1일 음용하는 물의 양을 미리 확인하였으며, (본 조건에서), 각 마우스는 1일 당 약 3.5 ml을 물을 마시는 것을 확인하였다. 이 측정 결과를 토대로, 마우스 당 용량 1mg DMF+ 0.08% Methocel을 음용수 3.5 ml에 첨가하였다.
혈액-뇌 장벽을 통한 림프구 이동을 돕기 위해 EAE 프로토콜에 따라, 각 면역원을 주사한 당일에 모든 마우스 군들에게 백일해 독소 (PTX)를 마우스 당 350 ng 씩 주사 (i.p.)하고, 2일 후 반복하였다.
실시예 3.A의 실험 그룹들에 대한 요약 개시
그룹 MOG
(mg) 		Env 희석제 PTX GNbAc1 L-NAME SMT DMF n=48
A:
무처리 EAE		 200
+
IFA
+
-
-
-
-		 6
B:
GNbAc1		 200
+
IFA
+
+
-
-
-
6
C:
L-NAME
200
+
IFA
+
-
600 ㎍/500㎕
IP
-
-
6
D:
SMT		 200
+
IFA
+
-
-		 1mg/500㎕, IP
-
6
E:
DMF		 200
+
IFA
+
-
-
-		 1mg+0.08% Methocel /음용수 3.5ml. 매일.
6
F:
GNbAc1+
L-NAME		 200
+
IFA
+
+
600 ㎍/500㎕
IP
-
-
6
G:
GNbAc1+
SMT
200
+
IFA
+
+
-		 1mg/500㎕, IP
-
6
H:
GNbAc1+
DMF
200
+
IFA
+
+
-
-		 1mg+0.08% Methocel / 음용수 3.5ml. 매일
6
3.A.3 결과 :
임상 관찰 결과:
임상 신호 스코어 및 체중은 전술한 바와 같이 정기적으로 평가하였다. 실험 기간 동안의 EAE 스코어 카이네틱스를 도 16, 17 및 18에 나타낸다.
과잉-반사, 꼬리 마비, 뒷다리, 앞다리 약화 및 부분 마비 등의 규칙적이고 지속적인 EAE 발생에 대한 임상 스코어를 그룹 A (EAE 양성 대조군)의 경우 실험 종료시까지, GNbAc1 인간화 항체 (그룹 B) 또는 안티-유리 라디칼 (그룹 C, D, E)을 단독으로 12일에 처리하는 그외 그룹 또는 GNbAc1과 안티-유리 라디칼을 동시 처리하는 그룹 (그룹 F, G, H)의 경우에는 12일까지, 모든 마우스들에서 기록할 수 있었다.
처치 후 관찰 결과: GNbAc1을 1회 처리한 그룹 B의 경우 임상 신호는 최대 29일까지 약하게 감소되었다. L-NAME, SMT 단독 처리군의 경우, 불규칙적인 회복이 관찰되었으며, EAE 진행이 완화되었다. 16일에 SMT 주사를 하지 못했다는 점에 유념하여야 한다.
GNbAc1을 각각 NAME, SMT 및 DMF와 동시 처리한 그룹 F, G 및 H의 경우, 회복은 훨씬 더 유의하였으며, 특히 그룹 G와 H에서 현저하였다. 이러한 결과는, 상승 효과가 유의하게 강화되어, EAE 증상의 회복을 강화한다는 것을 시사한다. 또한, 이들 물질을 이용한 치료가 어떠한 마우스 그룹 (개별 처리한 대조군 마우스 포함)에서도 임의의 이상을 야기하지 않았다는 것은 중요한 사항이다.
도 16, 17 및 18에 제시된 결과에 따르면, 하기와 같이 요약할 수 있다:
- 대부분의 임상 스코어 증가 (질환 악화)는 무처리 동물 (그룹 A)에서 나타난다. GNbAC1 단독 처리 동물 (그룹 B)은 이의 주사 후 (12일부터 시작) 개선된다.
- L-Name 또는 SMT 단독 처리 그룹은 그룹 B 보다 회복 스코어 및 카이네틱스가 낮다.
- DMF를 처리한 그룹 E와 GNbAC1 항체 (200 ㎍ 1회 투약)를 처리한 그룹 F는 실험 종료시에 등가의 회복 수준을 나타낸다.
- GNbAC1 항체를 SMT와 조합하여 처리한 그룹 G와 GNbAC1 항체를 DMF와 조합하여 처리한 그룹 H는 실험 종료시에 현저하게 개선된 회복 수준을 나타내며, 다른 모든 그룹들 중에서 가장 빠른 임상적인 개선 카이네틱스를 나타낸다. 이는, GNbAC1과 SMT, 또는 GNbAC1과 DMF의 조합이 현저하게 개선된 치료학적 성과에 있어 상승 작용을 발휘함을 의미한다.
로타로드 테스트
도 19에서 "1 inj" 및 "2 inj"로 표시된 그룹들은 Env 단백질 및 MOG 항원을 1회 (1) 또는 2회 (2) 주사한 대조군 동물로서, 이는 다른 전체 그룹들에서와 같이 임상적으로 과도한 EAE를 유도하는데 필요한 Env 단백질과 MOG 항원을 3회 주사한 것과 비교해 먼저 설명한다. 이는 병원성 역치 (pathogenic threshold) 미만이며 임상적인 질환을 유도하지 않는 수준으로 Env에 노출시킨 대조군 마우스이다. 다양한 처리제로 테스트한 동물들 모두 급성 및 중증 EAE 증상 및 진행이 발현되도록 유도하기 위해서는, 이러한 3번의 주사 패턴이 필요하다는 것이 확인되었다. 즉, 처리한 동물에서 관찰되는 치료학적 효과는 진행중이며 진전된 질환 병태들에 대한 치료 효능과 관련있다.
23 rpm에서의 로타로드 스코어에 대한 도 19에 나타낸 결과에 따르면, 하기를 알 수 있다:
- 23 rpm에서의 신체 활동은 동물들에서 주요 감각 및 운동 기능부전을 드러내기 위한 충분한 역치에 도달하였다. 무처리 A 그룹은 성과 및 카이네틱스가 좋지 않은 반면, 1회 또는 2회 ("1inj 또는 2inj") 주사한 동물은 증상이 현저하게 약화되고, 변화가 훨씬 우수하였다. 무처리 그룹 B의 악화되는 점진적인 임상 결함은, 질환 및 해당 NS 병변이 3번의 Env 주사로 매우 활성화된다는 것을 입증해준다. 즉, 다양하게 처리한 그외 그룹들 모두 Env에 의해 비슷한 강력한 질환 유도가 이루어졌다.
- GNbAC1 200 ㎍ 1회 주사에 의해 EAE를 치료한 그룹 B는, 실험 종료시에, Env에 낮은 수준으로 노출시켜 질환을 유도하지 않은 대조군 마우스와 비슷한 스코어를 나타내었다.
- 이러한 조건에서, 가장 주목할만한 효과는, GNbAC1 항체를 SMT와 조합 처리한 그룹 G에서 나타났으며, 이 그룹은 실험 종료시 전체 그룹들 중 가장 우수한 스코어로 끝나는 놀라운 회복 카이네틱스 곡선을 나타내는 것으로 보인다. 이는 현저하게 개선된 치료학적 성과에 있어 GNbAC1과 SMT의 조합으로 인한 상승 작용 달성을 의미한다.
- SMT 단독 처리한 그룹 D 역시 낮지만 개선된 카이네틱스와 성과를 나타내었다 (실험 기간의 마지막 시점).
26 rpm에서의 로타로드 스코어에 대해 도 20에 도시된 결과에 따르면, 하기를 알 수 있다:
- 26 rpm에서의 신체 활동은, 이 조건이 동물들에서 주요 감각 및 운동 기능부전을 드러내는데 있어 본 실험에서 필요한 역치 보다 높은 것으로 확인되었다: 무처리 A 그룹은 성과 및 카이네틱스가 좋지 않은 반면, 1회 또는 2회 ("1inj 또는 2inj") 주사한 동물은 증상이 현저하게 약화되고, 변화가 훨씬 우수하였다 ("1inj" 그룹의 경우 실험 기간의 종료시 매우 우수한 스코어를 보임).
- GNbAC1 200 ㎍ 1회 주사에 의해 EAE를 치료한 그룹 B는, 실험 종료시에, 그룹 D, G, C, E 및 H, 그리고 "2inj"대조군 마우스와 비슷한 스코어를 회복하였다.
- 이러한 조건에서, 가장 주목할만한 효과는, GNbAC1 항체를 L-NAME와 조합 처리한 그룹 F에서 나타났으며, 이 그룹은 실험 종료시 전체 그룹들 중 가장 우수한 스코어로 끝나는 우수한 회복 카이네틱스 곡선을 나타내는 것으로 보인다. 이는 현저하게 개선된 치료학적 성과에 있어 GNbAC1과 SMT의 조합으로 인한 상승적인 효과 달성을 의미한다. L-NAME 단독 처리한 그룹 C 역시 낮은 수준이지만 개선된 카이네틱스와 성과를 나타내었다. 이는, 현저하게 개선된 치료학적 성과에 있어 GNbAC1과 L-NAME의 조합으로 인한 상승 작용 달성을 의미한다.
29 rpm에서의 로타로드 스코어에 대해 도 21에 도시된 결과에 따르면, 하기를 알 수 있다:
- 29 rpm에서의 신체 활동은, 이 조건이 동물들에서 주요 감각 및 운동 기능부전을 드러내는데 필요한 역치 보다 높은 것으로 확인되었다: 무처리 A 그룹은 성과 및 카이네틱스가 좋지 않은 반면, 1회 또는 2회 ("1inj 또는 2inj") 주사한 동물은 증상이 현저하게 약화되고, 변화가 훨씬 우수하였으며, 실험 종료시 유사한 우수한 스코어를 나타내었다.
- GNbAC1 200 ㎍ 1회 주사에 의해 EAE를 치료한 그룹 B는, 실험 종료시에, Env에 낮은 수준으로 노출시킨 질환 미유발성 대조군 마우스와 비슷한 스코어를 회복하였다.
- 이러한 조건에서, 가장 주목할만한 효과는, GNbAC1 항체를 L-NAME와 조합 처리한 그룹 F에서 나타났으며, 이 그룹은 (실험 종료시) 여전히 전체 그룹들 중 가장 우수한 스코어로 끝나는 우수한 회복 카이네틱스 곡선을 나타내는 것으로 보인다. L-NAME 단독 처리한 그룹 C 역시 낮은 수준이지만 개선된 카이네틱스와 성과를 나타내었다.
- 전체적으로 유효한 다른 결과는 GNbAC1 단독 처리한 그룹 B의 마우스에서의 일정한 개선으로서, 이는 모든 조건 (16 - 29 rpm 테스트)들에서 무처리 동물 (그룹 A)과 비교해 크게 안정되고 및/또는 개선된 스코어를 항상 나타내었다.
그러나, 이러한 명백한 효능은 GNbAc1을 L-NAME 또는 SMT와 조합시 크게 부각되는 것으로 나타났다. 또한, DMF와의 조합시 개선되었지만, 카이네틱스는 느렸다. 어쨌든 이는 최적화된 용량 및 장기간의 처리에 따른 보다 향상된 개선을 배제하지 않는다.
즉, 전체 테스트 조건 (임상 스코어 평가 포함)에서, GNbAC1과 SMT, L-NAME 또는 DMF의 조합은, 임의의 치료학적 해당 분자의 단독 사용에 비해, 임상적이고 기능적인 회복에 현저한 유용성을 제공한다. 아울러, 소형 분자는 낮고 매우 일시적인 효과를 발휘하는 것으로 보이지만, GNbAC1은 장기-지속적인 효과를 발휘하여, 이들 소형 약물들에 비해 실험 종료시 우수한 회복성을 제공하며, 따라서 장기적인 효능을 나타낸다.
기능 회복에 대한 이들의 상승적이고 타겟화된 효능을 목적으로 본 치료학적 물질들의 조합을 이용함으로써 달성되는 이점인, 카이네틱스와 최종 회복 정도가 조합물의 이용으로 크게 개선되는 것이 생체내에서 입증되었다. 이는 인간 질환에서 보다 빠르며 보다 강력한 임상 효능을 의미한다.
3.B. 단일요법으로 또는 항-NO 약물과의 조합으로 제공되는 항-Env 항체의 2회 투여에 따른 치료학적 효능 비교
3.B.1 재료 및 방법:
명시되지 않은 경우 모든 재료와 방법은 실시예 3A에 기술된 바와 같다.
실험 그룹
실시예 3.B의 실험 그룹에 대한 요약 개시
그룹 MOG
200 ㎍ 		ENV
60 ㎍ 		희석제 PTX 350ng GnbAc1 SMT DMF
A
ctrl - 		+ / IFA + / / /
B
ctrl +		 + + IFA + 위약 / /
C
GNbAc1		 + + IFA + 200 ㎍ / /
D
GNbAc1		 + + IFA + 500 ㎍ / /
E
SMT		 + + IFA + 200 ㎍ + /
F
SMT		 + + IFA + 500 ㎍ + /
G
DMF		 + + IFA + 200 ㎍ / +
H
DMF		 + + IFA + 500 ㎍ / +
마우스들 모두 D0에 목에, D7 및 D17에 등쪽 옆구리에 s.c.로 3회 주사하였다. 여기서, 그룹 A의 마우스에는 Env 없이 MOG 200 ㎍/mouse와 IFA만 주사하여, 본 시리즈에서 EAE를 주사하지 않음 음성 대조군 (ctrl -)을 구축하였다. 본 시리즈에서 EAE 무처리 양성 대조군은 그룹 B (ctrl +)이다. 그외 그룹들에는 200 ㎍ MOG/mouse + MSRV-ENV (60 ㎍) + IFA와, 상기 요약 개시된 바와 같이 처리제를 주사하였다. 처리는 해당 그룹들에서 면역화 후 12일째에 개시하였다.
그룹 C, E, G에는 J12에 GnbAc1　200 ㎍을 제공하였고; 그룹 D, F, H에는 J12에 GnbAc1 500 ㎍을; 그룹 B에는 GNbAc1 버퍼 용액만 제공하였다.
그룹 E와 F에는 일주일에 2번, 즉 J12, J14, J19, J21, J26 및 J28에 SMT (200 mg/mouse)를 I.P.로 주사하였다.
DMF를 제공한 그룹 G와 H의 경우에는, 본 발명자들이 각 마우스가 1일 섭취하는 물의 양을 미리 측정하여, (본 실험의 조건에서) 각 마우스가 매일 약 3.5 ml을 섭취한다는 것을 알게 되었다. 이에, 이 측정 결과를 토대로, 각 마우스 당 용량 2 mg DMF + 0.08% Methocel을 1일 식음수 3.5 ml에 첨가하였다.
각각의 로타로드 테스트 속도에서, Env-유도성 EAE가 나타난 무처리 마우스 (그룹 B, 이는 EAE가 치료되지 않은 양성 대조군임)의 그래프가 모의-대조군 (그룹 A, 이는 Env 단백질 없이 IFA에 희석한 MOG로 면역화됨)과 비교해 현저하게 결함을 나타내었을 때, 결과들을 검증하였다. 상기한 기준에 부합되지 않을 때에는, 대응되는 기술적 및 실험 조건들은 이러한 "양성 대비 음성 EAE" 그룹 유래 그래프들의 유의한 발산 (significant divergence)을 토대로 하는 정성 관리 (quality control)를 통과하지 못하였기 때문에, 결과를 "해석불가"로 간주하였다.
현저한 임상적인 개선 (관해와 같음)이 EAE 마우스에서 대부분의 처리로 수득되었을 경우, 20일 후, MSRV-Env 20 ㎍을 생리식염수에 용해하여 정맥내 (I.V.) 주사하므로써, 전체 마우스들에서 MSRV-Env 단백질에 의한 전신 급성 챌린지를 실행하였다. 이는, 그룹 B, D, F 및 H의 경우에는 D21째에, 그룹 A,C,E 및 G의 경우에는 D22째에 수행하였다. 이는 급성 Env 항원혈증에 대한 여러 그룹들의 반응을 연구하고, 다양한 처리제의 예방 효과에 대한 궁극적인 차이를 평가하기 위한 것이었다.
3.B.2 결과:
임상 결과
임상 신호 스코어와 체중은 전술한 바와 같이 정기적으로 평가하였다. 실험 기간 동안의 EAE 임상 스코어 카이네틱스는 도 22, 23 및 24에 나타낸다. 체중 곡선은 면역원을 1차 조사하기 전날과 비교해 상대적인 체중 증가를 나타낸 것으로서, 이는 도 25, 26 및 27에 나타낸다.
로타로드 테스트
로타로드 테스트 결과는 도 28, 29 및 30에 여러 속도 (16; 26; 29 rpm)에서의 결과로 나타낸다.
이러한 일련의 실험들은 단일요법으로서 GNbAC1 치료 항체의 중간 용량 (200 ㎍) 대 고 용량 (500 ㎍)의 효과를 확인한 것으로서, SMT 및 DMF와 조합하였을 경우 비슷한 비교 결과가 나타났다.
실험 전 기간 동안의 전체적인 임상 스코어 곡선 비교를 검증하였으며, (i) 무처리한 Env-유발성 EAE (그룹 B)가 가장 나쁘게 진행되었으며, (ii) EAE가 없는 모의-면역화한 대조군 (그룹 A)은 20일에 Env를 정맥내 (I.V.) 주사하기 전까지의 전체 기간 동안 검출가능한 임상적인 신호를 나타내지 않았다.
20일에 IV 주사할 때까지, 모든 처리 그룹들은 무처리 Env-유발성 EAE와는 유의하고 현저하게 다른 것으로 나타났다. 20일째에, 실험 전 기간 동안 다른 질환 카이네틱스를 나타낸 처리 그룹들은 평균 값이 0.5 미만으로 유사한 스코어를 나타내었는데, 이는 모든 처리 그룹들이 관해 기간에 있다는 것을 의미한다. 모든 항체 용량 및 DMF 또는 SMT와의 모든 테스트 조합물의 효능이 검증되었다. 그런 후, 20일째의 Env 단백질의 정맥내 (iv) 주사 투여는, 자연적으로 발병하는 질환의 신규 발생 및 중증 재발되는 동안 예상되는 Env 피크 발현과 이의 혈류 방출을 모방한 것이었다. 도 22, 23 및 24에 나타낸 바와 같이, 여러 산물 및 용량들의 치료학적 효능에 현저한 차이는 확인되지 않았다:
1) GNbAC1은 용량 500 ㎍에서 이러한 피크 Env 항원혈증에 대해 내성을 부여하는데 매우 유효하였지만 (그룹 D), 일시적인 임상적인 손상이 용량 200 ㎍에서 관찰되었다 (그룹 C).
2) SMT와 조합한 경우, 임상 스코어에서 무의미한 편차가 GNbAC1 양쪽 투여량 (그룹 E &F)에서 관찰되었다. 즉, SMT는, 최소 용량으로 항체를 단독으로 처리한 마우스와 비교해, GNbAC1을 최소 용량 (200 ㎍)으로 처리한 마우스에 IV MSRV-Env 챌린지에 대해 증가된 내성을 부여하였다 (그룹 C).
3) DMF 처리한 마우스는, 또한 보다 고 용량으로 GNbAC1을 처리하였을 때 이러한 피크 항원혈증에 대해 임상적인 내성을 나타내었지만 (그룹 H), 저 용량에서는 임상적인 결함을 방지하지 못하였다 (그룹 G). 즉, DMF는 GNbAC1을 최소 용량 (200 ㎍)으로 처리한 마우스에 IV MSRV-Env 챌린지에 대해 증가된 내성을 부여하지 못하였다. DMF와 보다 고 용량의 GNbAC1 (500 ㎍, 그룹 H)을 처리한 마우스는 동일 용량으로 GNbAC1을 단독 처리한 마우스 (그룹 D)과 비슷한 내성을 나타내었다.
4) 모든 그룹들에서 실험 전 기간 동안 체중 증가를 나타낸 그래프들은, 놀랍게도 GNbAC1을 500 ㎍으로 처리한 그룹 D가 최상의 엔드포인트 (endpoint)를 나타냄을 보여준다.
5) GNbAC1 200 ㎍ (그룹 C) 또는 DMF + GNbAC1 고용량 (그룹 H)은 모의-대조군과 등가의 엔드포인트를 형성하였다.
이는, 임상 스코어 카이네틱스를 보여준 다양한 처리제들의 상대적인 효능 외에도, 하기한 결과를 보여준다:
- GNbAC1 항체 단독은 고용량 (500 ㎍)에서 최상의 임상적인 효능을 발휘하였다. 또한, 체중 증가 카이네틱스에 의해 확인되는 바와 같이, 동물의 전체 건강 상에도 긍정적인 효과가 있었다.
- SMT는, 저용량 (200 ㎍)의 GNbAC1과 조합시, 처리 효능을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났으며, 최종적인 MSRV-Env IV 챌린지에 완전한 내성을 나타내었다.
이는, 고용량 (500 ㎍)에서 최상의 결과를 제공하고, 저용량(200 ㎍)에서는, 실험 종료시 iv 주사에 의해 Env 피크 항원혈증을 야기한 이후의 임상적인 악화를 효과적으로 방지하는 SMT와의 조합에 의해 현저하게 강화되므로, GNbAC1이 가장 강력한 치료제임을 의미한다.
아울러, 이들 결과는, GNbAC1을 보다 높은 용량으로 단독으로 사용하거나 또는 상기한 용량의 DMF와 조합하여 사용하므로써, (체중 증가 그래프에 따르면) 전반적인 건강에 유의한 치료학적 효능 증가를 제공할 수 있음을 또한 시사해준다.
그러나, SMT 또는 DMF의, 고용량의 GNbAC1과의 궁극적인 상승 작용은, 존재하더라도, 항체 단독으로도 이미 EAE 마우스에서 현재의 질환유발 상태와 활성에 가장 효과적인 치료학적 효능을 제공하기 때문에, 볼 수 없었다.
이와 동시에, 로타로드 분석은 객관적으로 모든 관련 속도들에서 (도 28A, 29A 및 30A)에서, 고용량의 GNbAC1 (500 ㎍/mouse)이 Env-유도된 치료 EAE 마우스의 신경 결함을 개선하는데 유의하게도 가장 효과적인 산물 (단독 제공)이라는 것을 확인시켜 준다.
또한, 로타로드 테스트를 통해, SMT와 GNbAC1의 상승 작용이 검증되었으며, GNbAC1을 저용량으로 사용하여 SMT와 조합 처리한 동물에서도 26 및 29 rpm에서 현저한 신경 운동 개선 (도 29B 및 30B)을 나타내는 신경학적 개선이 확인되었다. 16 RPM (도 28B)에서, 저속은 실험 기간 동안 이러한 임상적인 효능을 입증하는데 충분한 식별력을 제공하지 못하는 것으로 나타났다.
마지막으로, 로타로드 결과는 Env-유도성 EAE 마우스에서 DMF를 2가지 용량의 GNbAC1과 조합하여 처리하였을 때 개선을 나타내었으며, 이는 오직 29 rpm에서 명백하게 유의하였다 (도 30C).
따라서, 동물의 신경 성능을 분석하는 이러한 객관적이고 자동화된 테스트 결과를 고려하면, GNbAC1은 명백하게도 실시예 3.B에 나타낸 바와 같이 단일요법으로 제공시 확실한 치료제인 것으로 보인다. 저용량의 GNbAC1과 SMT를 조합한 경우에 확인되는, 항-NO 분자와의 상승 작용도 명확하게 입증되었으며, 이는 강력한 치료학적 효능을 시사해준다. 이는, 다양한 용량의 GNbAC1을 이용한 경우에도 존재하여야 하지만, 이미 GNbAC1 500 ㎍에서 최대의 효능을 나타내어 본 조건들에서는 볼 수 없었다.
3.C. 항-Env 항체 또는 소듐 푸마레이트 단독 (단일요법)과 항-Env 항체 + 소듐 푸마레이트 (병용 요법)의 비교.
3.C.1 재료 및 방법
재료
항목 공급사 레퍼런스 배치
C57bl/6 Charles River / BEV13587
MOG 폴리펩타이드 SC1272 TD02019C
MSRV-Env PX'Therapeutics 24A 2-20120803
IFA Sigma F5506-10ML 061M8728
PBS Lonza BE17-516F 1MB118
PTX Calbiochem 516561 D00128881
GNbAc1 (Geneuro) T950111-8
다이메틸 푸마레이트 Sigma 242926-100G 2507VBCBH
로타로드 BIOSEB LE8200 /
CIMAher isotype ctrl 911028
실험 그룹
그룹 MOG
(㎍)		 ENV 희석제 PTX GNbAc1 이소형 대조군 항체 소듐 푸마레이트 n =28 처리
A) -ctrl 200 - IFA + 위약 - - 5
B) EAE 200 + IFA + 500 ㎍ 위약/IP - 5
이소형 ctrl
C) EAE 200 + IFA + 500 ㎍ /IP - - 7
GNbAC1
D) EAE 200 + IFA + 위약 - 10 mg 4 Day+12
Na2 fum 식용수 3.5 ml에 첨가, 매일 실험 종료시까지 Na2 fum
E) EAE 200 + IFA + 500 ㎍ /IP - 10 mg 7 Day+12
GNbAC1+ Na2 fum 식용수 3.5 ml에 첨가, 매일 실험 종료시까지 Na2 fum
3.C.2 결과:
임상 결과:
임상 신호 스코어와 체중을 상기와 같이 정기적으로 평가하였다. 실험 전 기간 동안의 EAE 스코어 카이네틱스를 도 31에 제시한다.
Env 단백질 첨가없이 IFA, MOG를 주사한 음성 대조군인 그룹 A와 항체 희석제 버퍼로 구성된 항체 위약을 주사한 경우, 실험 전 기간 동안 유의한 임상 증상은 결코 나타나지 않았다.
EAE 임상 스코어의 진행은, GNbAc1 인간화 항체 (그룹 C)를, 또는 소듐 푸마레이트, 즉 DMF-관련 항-질소 산화물 유리 라디칼 (항-NO)을 그룹 D에서 단독으로, 또는 그룹 E에서 GNbAc1과 동시에 12일째에 처리한, 그룹들에서 12일까지 기록할 수 있었다.
흥미롭게도, 고용량 GNbAC1 항체 (C 및 E)를 제공받은 그룹들에서만 임상 스코어 그래프의 유의한 반전이 나타났으며, 실험 종료시 유의하게 개선된 엔드포인트를 나타내었다. 그룹 D는 오직 소듐 푸마레이트를 처리한 것으로서, 효과없는 이소형 대조군 항체를 처리한 그룹 B와 비교해 어떠한 유의한 임상적인 개선을 나타내지 않았다 (그래프에서 오차 막대가 겹침). 주기적이고 지속적인 EAE 임상 스코어 변화는 Env 단백질에 대한 특이성이 없는 이소형 대조군 항체를 처리한 그룹 B(Env-유도성 EAE)에서 실험을 종료할 때까지 모든 마우스에서 기록할 수 있었다. 이는, GNbAC1에서 관찰되는 치료학적 효과가 이의 특정 항체에 특이적이며, 예를 들어 동일 에피토프를 표적하지 않는 동일 이소형의 임의의 인간화 항체의 주입과는 관련이 없다는 것을 의미한다.
이러한 마지막 실시예에서는 하기한 바가 확인된다:
- Env 단백질을 주입하지 않은 대조군 A는, Env-유도성 EAE를 모방하는데 필요한 다른 구성 성분들 (IFA 및 MOG) 뿐 아니라 항체 주입을 모방하기 위한 성분 (항체의 희석제)을 모두 주사하였고; 수용성 소듐 푸마레이트는 정상 식용수에 함유시켜 전달되도록 제공되었음에도 불구하고, 임상적인 증상이 없는 건강한 개체로 반응하였다.
- 가장 높은 임상 스코어 (최악의 질환 상태)는 무관한 이소형 대조군 항체 (그룹 B)를 처리한 동물에서 나타났다. 즉, Env 단백질 존재 하에 모의-이소형 항체를 주사하면 전형적인 EAE가 발생한 양성 EAE 대조군으로 나타났다.
- 소듐 푸마레이트만 처리한 그룹 D는, 효과가 없는 대조군 항체를 처리한 그룹 B와 유사하게, 실험 종료시 좋지 않은 결과를 나타내었다.
- GNbAC1 항체를 단독으로 또는 이를 소듐 푸마레이트와 조합하여 처리한 그룹 C와 E는 실험 종료시 등가의 유의하게 양호한 회복성을 나타내었다. 임상적인 개선은 치료 개시 후 15일부터 나타났다.
본원에서, 소듐 퓨마레이트 단독이 효과가 없고, 그룹 C와 E의 곡선 카이네틱스가 등가인 것으로 나타나, 이들 2가지 그룹들에서 관찰되는 치료학적 효과는 완전히 오직 GNbAC1에 기인한 것이며, 소듐 푸마레이트는 효과가 없었다.
3.D 실시예 3의 전체 결과 분석
결론적으로, 항-Env 특이 항체를 포함하는 단독 또는 조합된 치료제, 예컨대 GNbAc1 및 항-질소산화물 유리 라디칼 (항-NO) 화합물, 예컨대 DMF, SMT 또는 L-Name는, HERV-W 외막 단백질에 의해 유발되는, 특히 MSRV-Env에 의해 유발되는 시험관내 및 생체내 마이엘린 재생 잠재 활성의 차단을 치료 및 예방하기 때문에, 유용하다.
GNbAc1은 또한 본 실시예에서 단일요법으로 단독 제공하였을 때, 고용량 (500 ㎍ /20-25 g의 마우스)인 경우가 저용량 (200 ㎍)인 경우 보다 효능이 우수한 것으로 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> GeNeuro <120> Compounds for treating the remyelination blockade in diseases associated with the expression of HERV-W envelope protein <130> BR080066/NJO/CCU <150> US 61/708779 <151> 2012-10-02 <150> US 61/746792 <151> 2012-12-28 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Tyr Glu Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ala Val Ala Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 7 ctgggtttct gctgtggaca 20 <210> 8 <211> 21 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<211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 16 ccggactccg tgatgtctaa g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 17 gaaacagcaa tggtcgggac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 18 aagacacggg ttccatggtg 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 19 gttgtgcaat ggcaattctg a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 20 tctgacagtg catcatcgct g 21 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 21 gaacgggaag ctcactggc 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 22 gcatgtcaga tccacaacgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 23 ggttccagag gccaaacatc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 24 gttgccacat tgaccgtgac 20 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for CDR <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 wsngcnwsnw snwsngtnws ntayatgtay 30 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for CDR <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 mgnacnwsna ayytngcnws n 21 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for CDR <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 carcartayc arwsnytncc nytnacn 27 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for CDR <400> 28 gaytaygara tgcay 15 <210> 29 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for CDR <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 gcngtngcnc cngaracngg nggnacngcn tayaaycara arttyaargg n 51 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for CDR <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 acngtngtnc cnttygcnta y 21

Claims (21)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 기재된 각각의 상보성 결정부 (CDR)를 포함하는 항-HERV-W Env 항체를 포함하는,
    마이엘린 재생 (remyelination) 차단을 예방 및/또는 치료함으로써 진행성 다발성 경화증을 예방 및/또는 치료하기 위한, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 scFV, Fab 단편, 키메라 항체, 조작된 (engineered) 항체 또는 인간화 항체인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 IgG인, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 IgG 가 IgG1 또는 IgG4인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 진행성 다발성 경화증이 이차적 진행성 다발성 경화증 (SPMS)인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 진행성 다발성 경화증이 일차적 진행성 다발성 경화증 (PPMS)인, 약학 조성물.
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