JP6218810B2 - 卒中後の神経形成を促進するためのセマフォリン−４ｄ結合分子の使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月15日に出願された米国特許非仮出願第13/842,523号、および2012年5月11日に出願された米国特許仮出願第61/646,119号の優先権恩典を主張し、各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

電子的に提示した配列表の参照
本出願とともに提出したASCIIテキストファイル（名称："1843072PC01_SequenceListing.txt"；サイズ：7,562バイト；および作成日：2013年5月10日）における電子的に提示した配列表の内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
CD100としても公知であるセマフォリン4D（SEMA4D）は、セマフォリン遺伝子ファミリーに属する膜貫通タンパク質である（例えば、SEQ ID NO: 1（ヒト）；SEQ ID NO: 2（マウス））。SEMA4Dは、ホモ二量体として細胞表面上に発現しているが、細胞活性化時に、SEMA4Dは、タンパク質分解性切断を介して細胞表面から放出されて、タンパク質の可溶型であるsSEMA4Dを生成することができ、これもまた生物学的に活性を有する。例えば、Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167 (2003)（非特許文献1）；Kikutani et al., Nature Immunol. 9:17-23 (2008)（非特許文献2）を参照されたい。

SEMA4Dは、脾臓、胸腺、およびリンパ節を含むリンパ系器官において、ならびに、脳、心臓、および腎臓などの非リンパ系器官において高レベルで発現している。リンパ系器官において、SEMA4Dは、休止T細胞上に豊富に発現しているが、休止B細胞、および樹状細胞（DC）などの抗原提示細胞（APC）上には弱くしか発現していない。しかしながら、その発現は、種々の刺激による活性化後にこれらの細胞において上方制御される。免疫細胞からの可溶性SEMA4Dの放出もまた、細胞活性化により増加する。

SEMA4Dは、多発性硬化症などの自己免疫脱髄性疾患およびある特定の癌の発生に関係しているとされている。哺乳動物の神経系が損傷後に完全に再生できないことは、大きな臨床的問題である。卒中または脳への外傷の結果としての神経損傷、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患は、死および能力障害の主要な原因である。その受容体、例えばプレキシン-B1を通したSEMA4Dシグナル伝達の血管形成に対する役割は、よく認識されているが、SEMA4Dシグナル伝達の神経形成の促進に対する効果は、不明のままである。従って、神経再生の治療的手段のためのまだ満たされていない医学的必要性に対して解決策を提供する必要が残されている。

Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167 (2003) Kikutani et al., Nature Immunol. 9:17-23 (2008)

神経形成の促進のためにセマフォリン-4D結合分子を使用する方法を、本明細書において開示する。SEMA4Dが神経細胞の再生する能力を損ない得ることを実証する証拠を提示する。本明細書において例証される本発明の局面に従って、中枢神経系障害の少なくとも1つの症候を呈する患者の神経組織において神経形成を促進するための方法であって、セマフォリン-4D（SEMA4D）に特異的に結合する、および／または阻害する単離された結合分子の有効量を、必要とする対象に投与する段階を含む方法を提供する。

本明細書において例証される本発明の局面に従って、中枢神経系の障害を有する対象において前駆細胞の数を増加させるための方法であって、セマフォリン-4D（SEMA4D）に特異的に結合する単離された結合分子の有効量を該対象に投与する段階を含み、SEMA4Dへの結合が前駆細胞の数を増加させるように作用する方法を提供する。

本明細書において例証される本発明の局面に従って、中枢神経系障害の少なくとも1つの症候を呈する患者の神経組織において神経形成を促進するための方法であって、SEMA4Dに特異的に結合する単離された結合分子の有効量を対象に投与する段階を含み、VX15/2503または67からなる群より選択される参照モノクローナル抗体がSEMA4Dに特異的に結合することを、該結合分子が競合的に阻害する方法を提供する。

本明細書において例証される本発明の局面に従って、患者において卒中などの中枢神経系の疾患または障害の症候を緩和するための方法であって、セマフォリン-4D（SEMA4D）に特異的に結合する、および/または阻害する単離された結合分子の有効量を対象に投与する段階を含み、SEMA4Dへの結合が症候を緩和するように作用する方法を提供する。
[本発明1001]
中枢神経系障害の少なくとも1つの症候を呈する患者の神経組織において神経形成を促進するための方法であって、セマフォリン-4D（SEMA4D）に特異的に結合する単離された結合分子の有効量を、必要とする対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1002]
単離された結合分子がSEMA4D活性を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
阻害されるSEMA4D活性が二量体化である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
単離された結合分子が、受容体または受容体の一部とのSEMA4Dの相互作用を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
受容体が、プレキシン-B1、プレキシン-B2、またはCD72からなる群より選択される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
VX15/2503または67からなる群より選択される参照モノクローナル抗体がSEMA4Dに特異的に結合することを、前記単離された結合分子が競合的に阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
単離された結合分子が、VX15/2503または67からなる群より選択される参照モノクローナル抗体と同一のSEMA4Dエピトープに特異的に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
単離された結合分子が、抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体VX15/2503もしくは67であるか、またはこれらに由来する、本発明1008の方法。
[本発明1010]
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化である、本発明1008の方法。
[本発明1011]
抗体が、モノクローナル抗体VX15/2503または67由来の6個のCDRを含む、本発明1008の方法。
[本発明1012]
中枢神経系障害が、神経変性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
神経変性障害が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、および多発性硬化症からなる群より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
CNS機能不全が、うつ病、てんかん、および統合失調症からなる群より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前駆細胞の数を増加させ、その分化を増強し、および／またはその生存を増大させる、本発明1001の方法。
[本発明1016]
中枢神経系障害を有する対象において前駆細胞の数を増加させるための方法であって、セマフォリン-4D（SEMA4D）に特異的に結合する単離された結合分子の有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1017]
対象において中枢神経系障害の負担を低減させる、本発明1016の方法。
[本発明1018]
患者において卒中を処置するための方法であって、セマフォリン-4D（SEMA4D）に特異的に結合する単離された結合分子の有効量を、必要とする対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1019]
単離された結合分子がSEMA4Dに特異的に結合する、本発明1018の方法。
[本発明1020]
単離された結合分子が、受容体または受容体の一部とのSEMA4Dの相互作用を阻害する、本発明1018の方法。
[本発明1021]
単離された結合分子が、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1018の方法。
[本発明1022]
SEMA4Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO: 1または3に示される配列を有する重鎖可変ドメイン、およびSEQ ID NO: 2または4に示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、本発明1017の方法。
[本発明1023]
急性脳損傷が、卒中、頭部損傷、脳性麻痺、脳梗塞、脊髄損傷、および外傷性損傷からなる群より選択される、本発明1012の方法。

実施例に記載される中大脳動脈（MCA）閉塞についての実験プロトコルの概略図。 中大脳動脈の閉塞（MCAO）およびアイソタイプ対照（「対照IgG」、図2Aおよび図2C）またはMAb 67-2（「抗Sema4D-Ab」、図2Bおよび図2D）のいずれかでの処置後の、図2Eに示された領域においてネスチン／Sox2について染色された脳試料中の神経幹／先駆細胞を示す。脳試料は、MCAOの7日後に調製した。 アイソタイプ対照（「対照IgG」）またはMAb 67-2（「抗SEMA4D」）で処置したMCAOマウスの脳組織における、アクチン対照に対する（B）Sox2、（C）ネスチン、および（D）PLPについての定量解析を伴う、（A）RT-PCRによるmRNA発現を示す。脳組織は、MCAOの7日後に単離した。ネスチンおよびSox2は、神経幹先駆細胞のマーカーである。PLPは、髄鞘形成のマーカーである。 アイソタイプ対照またはMAb 67-2で処置したMCAOマウスにおける、処置したおよび処置していない半球中の脳および線条体の相対総容積を示す。測定は、MCAOの30日後に行った。図4A〜図4Bは、（A）1匹の代表的なアイソタイプ対照（「対照IgG」）マウスおよび（B）1匹の代表的な抗SEMA4D抗体で処置した（「抗SEMA4D」）マウス由来の、NeuNで染色された脳切片を示す。脳容積は、線条体（実線）および半球（点線）の容積により表される。図4C〜図4Dは、アイソタイプ対照（「IgG」）マウスおよび抗SEMA4D抗体で処置した（「SEMA」）マウスについて、それぞれ線条体および半球の容積の計算比（L/R）を示す。 MCAO後30日目の、MCAOマウス（A）MAb 67-2（「Sema4D-Ab」）または（B）アイソタイプ対照（「対照IgG」）における、成熟ニューロン細胞マーカーであるNeuNの発現を示す。脳梗塞の境界の線条体を、矢印で示す。 MCAO後30日目のMCAOおよびアイソタイプ対照（「IgG」）またはMAb 67-2（「SEMA4D」）での処置後のマウス、または偽手術で処置したマウス（「偽」）の、明期および暗期のオープンフィールド運動活性を示す。図6A〜図6Bは、それぞれ明期および暗期における運動活性を示す。図6Cは、運動活性における暗期／明期の比（D/L）を示す。 実施例6に記載される実験プロトコルの概略図を示す。

発明の詳細な説明
I．定義
実体という用語は、1つまたは複数のその実体を指し、例えば、「抗SEMA4D抗体」は、1つまたは複数の抗SEMA4D抗体を表すように理解されることに、注意されたい。そのように、「1つの（「a」または「an」）」、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。

「神経形成」という句は、インビボまたはインビトロでの神経細胞の増殖、分化、遊走、および／または生存として、本明細書において定義される。種々の態様において、神経細胞は、成体、胎児、または胚の神経幹細胞または細胞の集団である。細胞は、動物またはヒトにおいて中枢神経系または他の場所に位置していてもよい。細胞はまた、神経組織などの組織中にあってもよい。いくつかの態様において、神経細胞は、成体、胎児、または胚の前駆細胞もしくは細胞の集団、または、幹細胞および前駆細胞の混合物を含む細胞の集団である。神経細胞は、すべての脳幹細胞、すべての脳前駆細胞、およびすべての脳先駆細胞を含む。神経形成は、正常の発生中に起こる神経形成、および、疾患、損傷、または、本明細書において記載される処置によるなどの治療的介入後に起こる神経再生を含む。

「神経細胞」、「幹細胞」、「神経幹細胞」、「先駆細胞」、「神経幹／先駆細胞」（NSPC）または「神経幹／前駆細胞」（NSPC）という用語は、自己複製、ならびに、ニューロン、アストロサイト、および／またはオリゴデンドロサイトへの分化が可能である未分化細胞を指すように、互換的に使用される。

「前駆細胞」（例えば神経前駆細胞）という用語は、本明細書において使用される際、それ自体は幹細胞ではない、幹細胞に由来する細胞を指す。いくつかの前駆細胞は、1種より多い細胞型へ分化することができる子孫を産生し得る。神経前駆細胞は、ニューロンを産生するニューロン前駆細胞、ならびに、アストログリア細胞および／またはオリゴデンドログリア細胞を産生するグリア前駆細胞を含む。

本明細書において使用される際、「中枢神経系障害」または「CNS障害」という用語は、神経変性障害、急性脳損傷（例えば、卒中、頭部損傷、脳性麻痺、脳梗塞、脊髄損傷、外傷性損傷）、およびある特定の中枢神経系「CNS」機能不全（例えば、うつ病、てんかん、および統合失調症）を指す。

本明細書において使用される際、「神経変性障害」という用語は、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、および多発性硬化症を指す。CNS障害はまた神経炎症性障害であってもよいことに、注意されたい。神経変性障害は神経炎症を含んでもよいことが、認識されるべきである。しかしながら、神経変性障害は、明らかな神経炎症が無く存在することが可能である。例えば、後期の二次進行性多発性硬化症は、この例である。

本明細書において使用される際、「急性脳損傷」という用語は、卒中、頭部損傷、脳性麻痺、脳梗塞、脊髄損傷、および外傷性損傷を指す。

本明細書において使用される際、「CNS機能不全」という用語は、うつ病、てんかん、および統合失調症を指す。

「治療的有効量」という用語は、対象または哺乳動物において疾患または障害を「処置する」ために有効である、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機小分子、または他の薬物の量を指す。神経炎症性障害の場合、治療的有効量の薬物は、例えば、神経幹／先駆細胞の増殖、分化、遊走、および／または生存を増大させることにより神経形成を促進することができ；神経細胞の減少を低減、妨害、または停止することができ；神経細胞の低減を阻害、例えば、抑制、妨害、予防、停止、または逆転することができ；神経細胞の数、密度、および／もしくは濃度；神経細胞の形態もしくは機能における変化；または神経細胞間の相互作用における変化を増大させることができ；神経細胞の低減と関連する1つまたは複数の症候、例えば神経炎症性障害をある程度まで和らげることができ；罹患率および死亡率を低減させることができ；生活の質を改善することができ；またはそのような効果の組み合わせをもたらすことができる。

「処置」（「treating」もしくは「treatment」もしくは「to treat」）または「緩和」（「alleviating」もしくは「to alleviate」）などの用語は、1）診断された病理学的状態または障害を治癒する、それを減速させる、その症候を減少させる、それを逆転する、および／またはその進行を停止させる治療的手段、ならびに2）標的とした病理学的状態または障害を予防する、および／またはその発症を緩徐化する防御的手段または予防的手段の両方を指す。従って、処置を必要とする人々は、既に障害を有する人々；障害を有する傾向がある人々；および障害が予防されるべき人々を含む。有益なまたは望ましい臨床結果は、検出可能であろうとまたは検出不可能であろうと、症候の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち悪化させないこと）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または一時的緩和、および寛解（部分的であろうとまたは全体的であろうと）を含むが、これらに限定されない。「処置」とはまた、処置を受けていない場合に期待される生存と比較した際に延長した生存も意味することができる。処置を必要とする人々は、既に状態もしくは障害を有する人々、および、状態もしくは障害を有する傾向がある人々、または、状態もしくは障害が予防されるべき人々を含む。

「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」により、それについて診断、予後診断、または治療が望ましい任意の対象、特に、哺乳動物対象が意味される。哺乳動物対象は、ヒト、家庭内の動物、農場の動物、および、動物園、スポーツ、またはペットの動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ、クマなどを含む。

本明細書において使用される際、「抗SEMA4D抗体の投与から恩恵を受けるであろう対象」および「処置を必要とする動物」などの句は、例えば、SEMA4Dポリペプチドの検出のために（例えば診断手順のために）使用される抗SEMA4D抗体もしくは他のSEMA4D結合分子の投与から、および／または、抗SEMA4D抗体もしくは他のSEMA4D結合分子での処置、すなわち、疾患の軽減または予防から恩恵を受けるであろう、哺乳動物対象などの対象を含む。

本発明の「結合分子」または「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。1つの態様において、結合分子は、SEMA4Dに、例えば、約150 kDaの膜貫通SEMA4Dポリペプチドまたは約120 kDaの可溶性SEMA4Dポリペプチド（一般的にsSEMA4Dと呼ばれる）に特異的に結合する。別の態様において、本発明の結合分子は、抗体またはその抗原結合断片である。別の態様において、本発明の結合分子は、抗体分子の少なくとも1個の重鎖CDRまたは軽鎖CDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種または複数の抗体分子由来の少なくとも2個のCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種または複数の抗体分子由来の少なくとも3個のCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種または複数の抗体分子由来の少なくとも4個のCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種または複数の抗体分子由来の少なくとも5個のCDRを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、1種または複数の抗体分子由来の少なくとも6個のCDRを含む。

本発明は、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全を有する対象において神経形成を促進するための方法であって、抗SEMA4D結合分子、たとえば抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体、を該対象に投与する段階を含む方法に向けられる。天然に存在する抗体などの完全なサイズの抗体に具体的に言及しない限り、「抗SEMA4D抗体」という用語は、完全なサイズの抗体、およびそのような抗体の抗原結合断片、変異体、類似体、または誘導体、例えば、天然に存在する抗体、または免疫グロブリン分子、または工学により作製された抗体分子、または抗体分子と類似した様式で抗原に結合する断片を包含する。

本明細書において使用される際、「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または、下記および例えばKucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記載されるような、1種または複数のヒト免疫グロブリンの遺伝子導入であり、かつ内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体は、少なくとも重鎖の可変ドメイン、または少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、該可変ドメインがヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体もまた含む。

「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体は、本明細書において記載される抗体分子（例えば、VH領域および／またはVL領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、抗体またはその断片がSEMA4Dポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する、上記のような「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体もまた含む。アミノ酸置換を結果として生じる部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発を含むがこれらに限定されない、当業者に公知である標準的な技術を、ヒト抗SEMA4D抗体をコードするヌクレオチド配列中に変異を導入するために使用することができる。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、参照VH領域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL領域、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3に対して、50アミノ酸未満の置換、40アミノ酸未満の置換、30アミノ酸未満の置換、25アミノ酸未満の置換、20アミノ酸未満の置換、15アミノ酸未満の置換、10アミノ酸未満の置換、5アミノ酸未満の置換、4アミノ酸未満の置換、3アミノ酸未満の置換、または2アミノ酸未満の置換をコードする。

ある特定の態様において、アミノ酸置換は、下記でさらに議論される保存的アミノ酸置換である。あるいは、変異を、飽和変異誘発などにより、コード配列のすべてまたは一部に沿って無作為に導入することができ、結果として生じた変異体を、活性（例えば、SEMA4Dポリペプチド、例えば、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4Dに結合する能力）を保持する変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体のそのような変異体（またはその誘導体）は、「最適化された」または「抗原結合について最適化された」ヒト抗体または完全ヒト抗体と呼ぶこともでき、抗原に対して改善された親和性を有する抗体を含む。

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。

本明細書において使用される際、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、それらの中にいくつかのサブクラス（例えばγ1〜γ4）を伴って分類されることを認識するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA、IgG、またはIgEと決定することが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは、十分に特徴決定されており、機能的特殊化を与えることが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示を考慮して当業者が容易に識別可能であり、従って、本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが、明らかに本発明の範囲内であり、以下の議論は概して、IgGクラスの免疫グロブリン分子に向けられる。IgGに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量およそ23,000ダルトンの2個の同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量53,000〜70,000の2個の同一の重鎖ポリペプチドを含む。4本の鎖は典型的に、ジスルフィド結合により「Y」形態に連結され、軽鎖が、「Y」の口部から始まり可変領域を通して連続して、重鎖をひとまとめにする。

軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖のクラスは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれと結合してもよい。概して、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子工学により作製された宿主細胞のいずれかにより生成される際、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、かつ2個の重鎖の「尾」部分は、共有ジスルフィド結合または非共有結合により互いに結合している。重鎖において、アミノ酸配列は、Y形態の叉状端のN末端から各鎖の底部のC末端までおよぶ。

軽鎖および重鎖の両方は、構造的および機能的な相同性の領域に分割される。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点において、軽鎖の可変ドメイン（VLまたはVK）および重鎖の可変ドメイン（VH）両方の部分は、抗原認識および特異性を決定することが、認識されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（CL）および重鎖の定常ドメイン（CH1、CH2、またはCH3）は、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などのような重要な生物学的特性を与える。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増大する。N末端部分が可変領域であり、C末端部分が定常領域である；CH3ドメインおよびCLドメインは、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。

上記に示されるように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、かつ特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のVLドメインおよびVHドメイン、またはこれらの可変ドメイン内の相補性決定領域（CDR）のサブセットは、組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この4要素からなる抗体構造は、Yの各腕の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VH鎖およびVL鎖の各々上の3個のCDRにより規定される。いくつかの場合には、例えば、ラクダ科の種に由来するかまたはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて工学により作製されたある特定の免疫グロブリン分子は、完全な免疫グロブリン分子が、軽鎖を有さず、重鎖のみからなり得る。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)を参照されたい。

天然に存在する抗体において、各抗原結合ドメイン中に存在する6個の「相補性決定領域」または「CDR」は、抗体が水性環境においてその三次元形態を呈する際に抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置づけられる、アミノ酸の短い非隣接の配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残りの部分は、より低い分子間の可変性を示す。フレームワーク領域は、主としてβシート立体配座を採り、CDRは、βシート構造を連結し、いくつかの場合にはその一部を形成するループを形成する。従って、フレームワーク領域は、CDRを鎖間の非共有相互作用により正確な配向に位置づけることを提供する足場を形成するように作用する。位置づけられたCDRにより形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補性の表面を規定する。この相補性の表面が、抗体のその同起源エピトープに対する非共有結合を促進する。それぞれCDRおよびフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、正確に定義されているため（下記参照）、任意の所定の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて当業者が容易に同定することができる。

当技術分野内で使用される、および／または受け入れられる用語の2つまたはそれより多い定義がある場合には、本明細書において使用される用語の定義は、それとは反対に明示的に述べられない限り、そのような意味のすべてを含むように意図される。具体例は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド両方の可変領域内に見出される非隣接の抗原結合部位を記載するための、「相補性決定領域」（「CDR」）という用語の使用である。この特定の領域は、参照により本明細書に組み入れられる、Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"およびChothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)によって記載されており、定義は、互いに対して比較した際のアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のCDRに言及するためのいずれかの定義の適用は、本明細書において定義されかつ使用される用語の範囲内であることが意図される。上記で引用される参照文献の各々により定義されるCDRを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として下記の表1に示す。特定のCDRを包含する正確な残基の数字は、CDRの配列およびサイズに応じて変動するであろう。当業者は日常的に、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のCDRを構成するかを決定することができる。

（表１）CDRの定義¹

¹表1におけるすべてのCDRの定義のナンバリングは、Kabatらにより示されるナンバリング慣例に従う（下記参照）。

Kabatらはまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列についてのナンバリングシステムも定義した。当業者は、配列自体を超えるいずれの実験データにも頼ることなく、「Kabatナンバリング」のこのシステムを任意の可変ドメイン配列に明白に割り当てることができる。本明細書において使用される際、「Kabatナンバリング」とは、Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest."により示されるナンバリングシステムを指す。別の方法で特定化されない限り、本発明の抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングについての言及は、Kabatナンバリングシステムに従う。

本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab'およびF(ab')₂、Fd、Fv、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、VLドメインまたはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーにより産生された断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本明細書において開示される抗SEMA4D抗体に対する抗Id抗体を含む）を含むが、これらに限定されない。ScFv分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2など）、またはサブクラスであり得る。

本明細書において使用される際、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、重鎖部分を構成するポリペプチドは、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間部、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはその変異体もしくは断片の、少なくとも1つを含む。例えば、本発明における使用のための結合ポリペプチドは、CH1ドメインを構成するポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH2ドメインを構成するポリペプチド鎖；CH1ドメインおよびCH3ドメインを構成するポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH3ドメインを構成するポリペプチド鎖、または、CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを構成するポリペプチド鎖を含んでもよい。別の態様において、本発明のポリペプチドは、CH3ドメインを構成するポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明における使用のための結合ポリペプチドは、CH2ドメインの少なくとも一部（例えば、CH2ドメインのすべてまたは部分）を欠如していてもよい。上記に示されるように、これらのドメイン（例えば重鎖部分）は、アミノ酸配列において天然に存在する免疫グロブリン分子とは異なるように修飾されてもよいことが、当業者に理解されるであろう。

本明細書において開示されるある特定の抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体において、多量体の1本のポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の2本目のポリペプチド鎖上のものと同一である。あるいは、本発明の重鎖部分を含有する単量体は、同一ではない。例えば、各単量体は、例えば二重特異性抗体を形成する、異なる標的結合部位を含んでもよい。

本明細書中で開示される方法における使用のための結合分子の重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、IgG1分子に由来するC_H1ドメインおよびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、部分的にIgG1分子に、および部分的にIgG3分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、部分的にIgG1分子に、および部分的にIgG4分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。

本明細書において使用される際、「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖、例えば、κ軽鎖またはλ軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、VLドメインまたはCLドメインの少なくとも1つを含む。

本明細書において開示される抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、これらが認識するかまたは特異的に結合する抗原、例えば、本明細書において開示される標的ポリペプチド（例えばSEMA4D）のエピトープまたは部分の観点から記載されるか、または特定化されてもよい。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分が、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含むことができるが、典型的には、少なくとも2個のエピトープを含み、かつ、抗原のサイズ、立体配座、およびタイプに応じて、任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチド要素であってもよいか、またはそれを含んでもよく、例えば、エピトープは炭水化物側鎖を含んでもよいことに注意されたい。

抗体のためのペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約4個〜5個のアミノ酸であると考えられている。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは、少なくとも7個、より好ましくは少なくとも9個、および最も好ましくは少なくとも約15個〜約30個の間のアミノ酸を含有する。CDRは、その三次形態において抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができるため、エピトープを構成するアミノ酸は、隣接している必要がなく、いくつかの場合には、同一のペプチド鎖上でなくてさえよい。本発明の抗SEMA4D抗体により認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、より好ましくは、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、または約15個〜約30個の間の、SEMA4Dの隣接または非隣接のアミノ酸の配列を含有してもよい。

「特異的に結合する」により、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を必然的に伴うことが、概して意味される。この定義に従って、抗体が、無作為の関連のないエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する際、抗体はエピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、それによりある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を認定するために、本明細書において使用される。例えば、抗体「A」は、所定のエピトープに対して抗体「B」よりも高い特異性を有すると考えられてもよく、または抗体「A」は、関連するエピトープ「D」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言われてもよい。

「優先的に結合する」により、抗体が、関連する、同様の、相同の、または類似のエピトープに結合するよりも容易に、エピトープに特異的に結合することが意味される。従って、所定のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連するエピトープと交差反応し得るにもかかわらず、関連するエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高いであろう。

非限定的な例として、抗体は、第2のエピトープについての抗体の解離定数（K_D）より低いK_Dで第1のエピトープに結合する場合、該第1のエピトープに優先的に結合すると考えられてもよい。別の非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープについての抗体のK_Dより少なくとも1桁低い親和性で第1のエピトープに結合する場合、第1の抗原に優先的に結合すると考えられてもよい。別の非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープについての抗体のK_Dより少なくとも2桁低い親和性で第1のエピトープに結合する場合、第1のエピトープに優先的に結合すると考えられてもよい。

別の非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープについての抗体のオフ速度（off rate）（k(オフ)）より低いk(オフ)で第1のエピトープに結合する場合、第1のエピトープに優先的に結合すると考えられてもよい。別の非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープについての抗体のk(オフ)より少なくとも1桁低い親和性で第1のエピトープに結合する場合、第1のエピトープに優先的に結合すると考えられてもよい。別の非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープについての抗体のk(オフ)より少なくとも2桁低い親和性で第1のエピトープに結合する場合、第1のエピトープに優先的に結合すると考えられてもよい。本明細書において開示される抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、5×10^-2 秒^-1、10^-2 秒^-1、5×10^-3 秒^-1、または10^-3 秒^-1より低いかまたはそれと同等のオフ速度（k(オフ)）で、本明細書において開示される標的ポリペプチド（例えば、SEMA4D、例えば、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4D）またはその断片もしくは変異体に結合すると言われてもよい。より好ましくは、本発明の抗体は、5×10^-4 秒^-1、10^-4 秒^-1、5×10^-5 秒^-1、または10^-5 秒^-1、5×10^-6 秒^-1、10^-6 秒^-1、5×10^-7 秒^-1、または10^-7 秒^-1より低いかまたはそれと同等のオフ速度（k(オフ)）で、本明細書において開示される標的ポリペプチド（例えば、SEMA4D、例えば、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4D）またはその断片もしくは変異体に結合すると言われてもよい。

本明細書において開示される抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、10³ M^-1秒^-1、5×10³ M^-1秒^-1、10⁴ M^-1秒^-1、または5×10⁴ M^-1秒^-1より高いかまたはそれと同等のオン速度（on rate）（k(オン)）で、本明細書において開示される標的ポリペプチド（例えば、SEMA4D、例えば、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4D）またはその断片もしくは変異体に結合すると言われてもよい。より好ましくは、本発明の抗体は、10⁵ M^-1秒^-1、5×10⁵ M^-1秒^-1、10⁶ M^-1秒^-1、または5×10⁶ M^-1秒^-1、または10⁷ M^-1秒^-1より高いかまたはそれと同等のオン速度（k(オン)）で、本明細書において開示される標的ポリペプチド（例えば、SEMA4D、例えば、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4D）またはその断片もしくは変異体に結合すると言われてもよい。

抗体は、参照抗体のエピトープへの結合をある程度遮断する範囲でそのエピトープに優先的に結合する場合、参照抗体の所定のエピトープへの結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野において公知である任意の方法、例えば、競合ELISAアッセイにより測定されてもよい。抗体は、少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％、参照抗体の所定のエピトープへの結合を競合的に阻害すると言われてもよい。

本明細書において使用される際、「親和性」という用語は、個々のエピトープの免疫グロブリン分子のCDRとの結合の強度の尺度を指す。例えば、Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) の27〜28ページを参照されたい。本明細書において使用される際、「結合力」という用語は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の全体の安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物の抗原との機能的結合強度を指す。例えば、Harlowの29〜34ページを参照されたい。結合力は、集団中の個々の免疫グロブリン分子の特異的なエピトープとの親和性、ならびにまた免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連する。例えば、2価のモノクローナル抗体と、ポリマーなどの高度に反復するエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合力の1つであろう。

本発明の抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、その交差反応性の観点から記載されるか、または特定化されてもよい。本明細書において記載される際、「交差反応性」という用語は、1種の抗原に特異的な抗体の第2の抗原と反応する能力；2種の異なる抗原性物質の間の関連性の尺度を指す。従って、抗体が、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、概して、誘導エピトープと同一の相補的構造特性の多くを含有し、いくつかの場合には、実際に元よりも良好に適合し得る。

例えば、ある特定の抗体は、関連するが同一ではないエピトープ、例えば、参照エピトープと少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％、および少なくとも50％の同一性（当技術分野において公知でありかつ本明細書において記載される方法を用いて算出した際）を有するエピトープに結合する、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープと95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満、および50％未満の同一性（当技術分野において公知でありかつ本明細書において記載される方法を用いて算出した際）を有するエピトープに結合しない場合、ほとんどまたはまったく交差反応性を有さないと言われてもよい。抗体は、そのエピトープの任意の他の類似体、オーソログ、または相同体に結合しない場合、ある特定のエピトープについて「高度に特異的」であると考えられてもよい。

本発明の抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、本発明のポリペプチド、例えば、SEMA4D、例えば、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4Dに対するその結合親和性の観点から記載されるか、または特定化されてもよい。好ましい結合親和性は、5×10^-2 M、10^-2 M、5×10^-3 M、10^-3 M、5×10^-4 M、10^-4 M、5×10^-5 M、10^-5 M、5×10^-6 M、10^-6 M、5×10^-7 M、10^-7 M、5×10^-8 M、10^-8 M、5×10^-9 M、10^-9 M、5×10^-10 M、10^-10 M、5×10^-11 M、10^-11 M、5×10^-12 M、10^-12 M、5×10^-13 M、10^-13 M、5×10^-14 M、10^-14 M、5×10^-15 M、または10^-15 Mより低い解離定数またはKdを有するものを含む。ある特定の態様において、本発明の抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約5×10^-9〜約6×10^-9のKdでヒトSEMA4Dに結合する。別の態様において、本発明の抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約1×10^-9〜約2×10^-9のKdでマウスSEMA4Dに結合する。

本明細書において使用される際、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第1の種から取得されているかまたは由来し、かつ、定常領域（本発明に従って、無傷であるか、部分的であるか、または修飾されていてもよい）が第2の種から取得されている任意の抗体を意味すると考えられるであろう。好ましい態様において、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）由来であると考えられ、かつ、定常領域はヒトである。

本明細書において使用される際、「工学により作製された抗体」という用語は、重鎖または軽鎖のいずれかまたは両方における可変ドメインが、公知の特異性の抗体由来の1個または複数のCDRの少なくとも部分的な置換により、ならびに、必要な場合、部分的なフレーム領域の置換および配列交換により変更されている抗体を指す。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同一のクラスまたはさらにサブクラスの抗体に由来してもよいが、CDRが異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種由来の抗体に由来することが、想定される。公知の特異性の非ヒト抗体由来の1個または複数の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖のフレームワーク領域中に移植されている、工学により作製された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と呼ばれる。1個の可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すために、CDRのすべてをドナー可変ドメイン由来の完全なCDRで置換することは、必要ではない可能性がある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要である残基を移すことが、単に必要である可能性がある。

ヒト化抗体の重鎖または軽鎖または両方における可変ドメイン内のフレームワーク領域は、ヒト起源の残基のみを含んでもよいことがさらに認識され、この場合、ヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は、「完全ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2010/0285036 A1号においてMAb 2503として開示されているMAb VX15/2503）。あるいは、ドナー可変ドメインのフレームワーク領域の1個または複数の残基は、SEMA4D抗原に対する妥当な結合を維持するためまたは結合を増強するために、必要な場合、ヒト化抗体の重鎖または軽鎖または両方における可変ドメインのヒトフレームワーク領域の対応する位置の中で、工学により変更することができる。この様式において工学により変更されているヒトフレームワーク領域は、従って、ヒトおよびドナーのフレームワーク残基の混合物を含み、本明細書において「部分的ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。

例えば、抗SEMA4D抗体のヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法に従って（Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)）、げっ歯類または変異げっ歯類のCDRまたはCDR配列を、ヒト抗SEMA4D抗体の対応する配列と置換することにより、本質的に行うことができる。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,225,539号；米国特許第5,585,089号；米国特許第5,693,761号；米国特許第5,693,762号；米国特許第5,859,205号もまた参照されたい。結果として生じたヒト化抗SEMA4D抗体は、ヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域内に少なくとも1個のげっ歯類または変異げっ歯類のCDRを含むであろう。いくつかの例において、ヒト化抗SEMA4D抗体の1個または複数の可変ドメインのフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト（例えばげっ歯類）残基により置換されており（例えば、米国特許第5,585,089号；米国特許第5,693,761号；米国特許第5,693,762号；および米国特許第6,180,370号を参照されたい）、その場合、結果として生じたヒト化抗SEMA4D抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内に部分的ヒトフレームワーク領域を含むであろう。

さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに磨くために（例えば望ましい親和性を得るために）なされる。概して、ヒト化抗体は、少なくとも1個の、および典型的には2個の可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられ、その中で、CDRのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は任意で、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むであろう。さらに詳細には、参照により本明細書に組み入れられるJones et al., Nature 331:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。従って、そのような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列により置換されているとは実質的に言えない抗体を含んでもよい。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのCDR残基および場合によりいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体中の類似した部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。例えば、米国特許第5,225,539号；米国特許第5,585,089号；米国特許第5,693,761号；米国特許第5,693,762号；米国特許第5,859,205号を参照されたい。また、あらかじめ決定された抗原について改善された親和性を有するヒト化抗体を産生するためのヒト化抗体および技術が開示されている、米国特許第6,180,370号、および国際公開公報第01/27160号も参照されたい。

II．神経幹／先駆細胞または神経幹／前駆細胞（NSPC）
神経形成とは、概して、新たなニューロンの産生を指す。伝統的に、神経形成は、胚期中および出生後早期中のみに起こり、成体脳においては有意な役割を有さないと、考えられていた。しかしながら、近年、神経形成が、成体哺乳動物脳の選択された領域において起こり、これらおよび他の領域において損傷に応答して刺激され得ることが、仮定されている。

中枢神経系および末梢神経系の発生中に、神経幹細胞は、増殖して前駆細胞に分裂し、成体脳を構成する細胞型に最終的に分化する。神経管に由来する細胞は、CNSのニューロンおよびグリアを生じ、他方、神経冠に由来する細胞は、末梢神経系（PNS）の細胞を生じる。

神経幹／前駆細胞およびそれらの治療的使用は、当技術分野において記載されており、例えば、以下を参照されたい：米国特許第6,638,501号、Bjornsonら；米国特許第6,541,255号、Snyderら；米国特許第6,498,018号、Carpenter；米国特許出願公開第20020012903号、Goldmanら；Palmer et al. (2001) Nature 411(6833):42-3；Palmer et al. (1997) Mol Cell Neurosci. 8(6):389-404；Svendsen et al. (1997) Exp. Neurol. 148(1):135-46、およびShihabuddin (1999) Mol Med Today. 5(11):474-80。神経幹細胞の単離および培養のための方法もまた、当技術分野において公知であり、米国特許第6,777,233号；米国特許第6,497,872号、および米国特許出願公開第20030143737A1号を参照されたい。これらの参照文献のすべては、参照により具体的に組み入れられる。

神経幹細胞および先駆細胞は、散在性CNS領域への十分に確立された遊走経路に沿った遊走、微環境の合図に応答した細胞型への分化、ならびに宿主前駆体およびその子孫との相互的散在を通して、正常な発生に関与する。ヒト神経幹細胞は、インビボでこれらの散在性の位置において外来性導入遺伝子を発現することができる。そのように、これらの細胞は、変性障害（例えば、アルツハイマーおよびパーキンソン）、急性脳損傷（例えば、卒中、頭部損傷、脳性麻痺）、ならびに多数のCNS機能不全（例えば、うつ病、てんかん、および統合失調症）を含む、CNSに影響を及ぼす様々な状態を処置するために使用される潜在能力を有する。

近年、神経変性疾患は、これらの障害の最も大きな危険性にさらされている高齢の集団の拡大のために、重要な懸念になってきている。アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病を含むこれらの疾患は、CNSの特定の位置における神経細胞の変性に結び付けられており、変性により、これらの細胞または脳領域はその意図される機能を果たすことができなくなる。

基底核として公知である脳領域における変性により、正確な位置に応じて種々の認知および運動症候を有する疾患がもたらされ得る。基底核は、線条体（尾状核および被殻からなる）、淡蒼球、黒質、無名質、腹側淡蒼球、マイネルト基底核、腹側被蓋領域、および視床下核を含む、多くの別々の領域からなる。

例えば、アルツハイマー病においては、前脳および大脳皮質の細胞変性がある。加えて、基底核の領域であるマイネルト基底核に限局性の変性があるように見える。この核は通常、記憶を含む認知機能に関与していると考えられている大脳皮質にコリン作動性突起を送る。他方、ハンチントン舞踏病においては、線条体中にニューロンの変性があり、これにより宿主における不随意痙動がもたらされる。さらに、パーキンソン病においては、変性が、基底核の別の領域である黒質緻密部中に見られる。この領域は通常、運動を制御する上で重要である背側線条体にドーパミン作動性連結を送る。パーキンソン病のための治療は、ドーパミン作動性活性をこの回路に戻すことに集中している。基底核の他の領域の変性もまた、可能性がある。例えば、視床下核と呼ばれる小領域の変性は、バリスムと呼ばれる状態における四肢の激しい投げつけるような動き（flinging movement）と関連し、他方、被殻および淡蒼球中の変性は、緩徐な身もだえするような動きまたは無定位運動症の状態と関連している。

神経変性疾患に加えて、急性脳損傷が、しばしば、神経細胞の喪失、影響を受けた脳領域の不適切な機能化、およびその後の行動異常を結果としてもたらす。個体は、細胞喪失に加えて、存在する神経細胞の異常な機能化に苦しむ可能性がある。これは、ニューロンの不適切な発射、または神経伝達物質の異常な合成、放出、およびプロセシングのためであり得る。これらの機能不全は、うつ病およびてんかんなどのよく研究されかつ特徴決定されている障害、または、神経症および精神病などのあまり理解されていない障害の結果であり得る。神経学的欠陥の他の形態は、筋萎縮性側索硬化症および脳性麻痺などの神経変性の結果として、または、外傷性脳損傷（TBI）および卒中において起こるような、より急性のCNS外傷の結果として起こり得る。

III．標的ポリペプチドの説明
本明細書において使用される際、「セマフォリン-4D」、「SEMA4D」、および「SEMA4Dポリペプチド」という用語は、「SEMA4D」および「Sema4D」のように、互換的に使用される。ある特定の態様において、SEMA4Dは、細胞の表面上に発現しているか、または細胞により分泌される。別の態様において、SEMA4Dは膜結合性である。別の態様において、SEMA4Dは可溶性、例えばsSEMA4Dである。他の態様において、SEMA4Dは、完全なサイズのSEMA4D、またはその断片、またはSEMA4D変異体ポリペプチドを含んでもよく、該SEMA4Dの断片またはSEMA4D変異体ポリペプチドは、完全なサイズのSEMA4Dのいくつかまたはすべての機能特性を保持している。

完全なサイズのヒトSEMA4Dタンパク質は、150 kDaの2本のポリペプチド鎖からなるホモ二量体膜貫通タンパク質である。SEMA4Dは、細胞表面受容体のセマフォリンファミリーに属し、CD100とも呼ばれる。ヒトおよびマウス両方のSEMA4D／Sema4Dは、それらの膜貫通型からタンパク質分解性に切断されて120-kDaの可溶型を生じ、2種のSema4Dアイソフォームの存在を示す（Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)）。セマフォリンは、ニューロンとその適切な標的との間の正確な連結を確立する際に重要な役割を果たす発生中の軸索ガインダンス因子として元来定義された、可溶性タンパク質および膜結合性タンパク質からなる。SEMA4Dは、構造的にクラスIVセマフォリンと考えられ、アミノ末端のシグナル配列に続いた、17個の保存されたシステイン残基を含有する特徴的な「セマ」ドメイン、Ig様ドメイン、リジンに富んだストレッチ、疎水性膜貫通領域、および細胞質尾部からなる。

SEMA4Dの各ポリペプチド鎖は、約13アミノ酸のシグナル配列の後に、約512アミノ酸のセマフォリンドメイン、約65アミノ酸の免疫グロブリン様（Ig様）ドメイン、104アミノ酸のリジンに富んだストレッチ、約19アミノ酸の疎水性膜貫通領域、および110アミノ酸の細胞質尾部を含む。細胞質尾部中のチロシンリン酸化のためのコンセンサス部位は、SEMA4Dのチロシンキナーゼとの予測される会合を支持する（Schlossman, et al., Eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford)）。

SEMA4Dは、少なくとも3種の受容体を有することが公知である：プレキシン-B1、プレキシン-B2、およびCD72。受容体の1種であるプレキシン-B1は、非リンパ系組織において発現し、SEMA4Dに対する高親和性（1 nM）受容体であることが示されている（Tamagnone et al., Cell 99:71-80 (1999)）。ある特定の態様において、内皮細胞がプレキシン-B1を発現する。プレキシン-B1シグナル伝達のSEMA4D刺激は、ニューロンの成長円錐虚脱を誘導すること、ならびにオリゴデンドロサイトの突起伸長虚脱およびアポトーシスを誘導することが示されている（Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246-1255 (2004)；Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216 (2005)）。プレキシン-B1シグナル伝達は、SEMA4Dへの結合後に、R-Rasの不活性化を媒介して、細胞外マトリクスへのインテグリン媒介性付着の減少をもたらし、また、RhoAの活性化を起こして、細胞骨格の再構成による細胞虚脱をもたらしうる。Kruger et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789-800 (2005)；Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64 (2005)を参照されたい。プレキシン-B2はSEMA4Dに中程度の親和性を有しており、最近の報告により、PLXNB2がケラチノサイト上に発現されており、SEMA4D陽性γδT細胞を活性化して上皮修復に貢献することが示されている（Witherden et al., Immunity. 2012 Aug 24;37(2):314-25）。

リンパ系組織においては、CD72が、低親和性（300nM）SEMA4D受容体として利用されている（Kumanogoh et al., Immunity 13:621-631 (2000)）。B細胞およびAPCがCD72を発現し、抗CD72抗体は、CD40により誘導されるB細胞応答およびCD23のB細胞切断の増強などの、sSEMA4Dと同一の作用の多くを有する。CD72は、多くの抑制性受容体と会合することができるチロシンホスファターゼSHP-1を動員することにより、B細胞応答の負の制御因子として働くと考えられている。SEMA4DのCD72との相互作用は、SHP-1の解離、およびこの負の活性化シグナルの損失を結果としてもたらす。SEMA4Dは、インビトロでT細胞刺激ならびにB細胞の凝集および生存を促進することが示されている。SEMA4D発現細胞またはsSEMA4Dの添加によって、インビトロでCD40により誘導されるB細胞増殖および免疫グロブリン産生が増強され、ならびにインビボの抗体応答が加速化される（Ishida et al., Inter. Immunol. 15:1027-1034 (2003)；Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)）。sSEMA4Dは、共刺激分子の上方制御およびIL-12の分泌の増加を含む、CD40により誘導されるDCの成熟を増強する。さらに、sSEMA4Dは、免疫細胞の遊走を阻害することができ、それは、遮断する抗SEMA4D抗体の添加により逆転させることができる（Elhabazi et al., J. Immunol. 166:4341-4347 (2001)；Delaire et al., J. Immunol. 166:4348-4354 (2001)）。

Sema4Dは、脾臓、胸腺、およびリンパ節を含むリンパ系器官において、ならびに、脳、心臓、および腎臓などの非リンパ系器官において高レベルで発現している。リンパ系器官において、Sema4Dは、休止T細胞上に豊富に発現しているが、休止B細胞、および樹状細胞（DC）などの抗原提示細胞（APC）上には弱くしか発現していない。細胞の活性化により、SEMA4Dの表面発現および可溶性SEMA4D（sSEMA4D）の生成が増加する。

SEMA4Dの発現パターンにより、SEMA4Dが免疫系において重要な生理学的役割および病理学的役割を果たすことが示唆される。SEMA4Dは、B細胞の活性化、凝集、および生存を促進し；CD40により誘導される増殖および抗体産生を増強し；T細胞依存性抗原に対する抗体応答を増強し；T細胞増殖を増加させ；樹状細胞の成熟およびT細胞を刺激する能力を増強し；かつ脱髄および軸索変性に直接関係していることが、示されている（Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000)；Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002)；およびWatanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001)）。

SEMA4Dノックアウト（SEMA4D-/-）マウスは、SEMA4Dが体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方において重要な役割を果たすことの追加的な証拠を提供している。SEMA4D-/-マウスにおいて、非リンパ系組織の異常性は知られていない。SEMA4D-/-マウス由来の樹状細胞（DC）は、不十分な同種刺激能力を有し、sSEMA4Dの添加により救出することができる共刺激分子の発現の欠陥を示す。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質特異的なT細胞が、SEMA4Dの非存在下では十分に生成されないため、SEMA4Dが欠損している（SEMA4D-/-）マウスは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドにより誘導される実験的自己免疫性脳脊髄炎を発症することができない（Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002)）。有意な量の可溶性SEMA4Dがまた、自己免疫の傾向があるMRL/lprマウス（SLEなどの全身性自己免疫疾患のモデル）の血清中に検出されるが、正常マウスにおいては検出されない。さらに、sSEMA4Dのレベルは、自己抗体のレベルと相関し、年齢とともに増加する（Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001)）。可溶性SEMA4Dはまた、脱髄性疾患を有する患者の脳脊髄液および血清中に蓄積することも示されており、sSEMA4Dは、インビトロでヒト多能性神経前駆体（Dev細胞）のアポトーシスを誘導し、かつ、ラットオリゴデンドロサイトの突起伸長を阻害するとともにそのアポトーシスを誘導する（Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)）。このアポトーシスは、抗SEMA4D MAbにより遮断された。

IV．抗SEMA4D抗体
SEMA4Dに結合する抗体は、当技術分野において記載されている。例えば、米国特許出願公開第2008/0219971 A1号、米国特許出願公開第2010/0285036 A1号、および米国特許出願公開第2006/0233793 A1号、国際特許出願である国際公開公報第93/14125号、国際公開公報第2008/100995号、および国際公開公報第2010/129917号、ならびにHerold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995)を参照されたく、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、概して、例えばヒト患者において、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全を有する対象において神経形成を促進するための方法であって、SEMA4Dに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の投与を含む方法に関連する。ある特定の態様において、抗体は、SEMA4Dの1種または複数のその受容体、例えばプレキシン-B1との相互作用を遮断する。これらの特性を有する抗SEMA4D抗体を、本明細書中で提供される方法において使用することができる。使用することができる抗体は、米国特許出願公開第2010/0285036 A1号に完全に記載されているMAb VX15/2503、67、および76、ならびにその抗原結合断片、変異体、または誘導体を含むが、これらに限定されない。本明細書中で提供される方法において使用することができる追加的な抗体は、米国特許出願公開第2006/0233793 A1号に記載されているBD16およびBB18抗体、ならびにその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体；または、米国特許出願公開第2008/0219971 A1号に記載されているMAb 301、MAb 1893、MAb 657、MAb 1807、MAb 1656、MAb 1808、Mab 59、MAb 2191、MAb 2274、MAb 2275、MAb 2276、MAb 2277、MAb 2278、MAb 2279、MAb 2280、MAb 2281、MAb 2282、MAb 2283、MAb 2284、およびMAb 2285の任意、ならびにその任意の断片、変異体、もしくは誘導体を含む。ある特定の態様において、本明細書中で提供される方法における使用のための抗SEMA4D抗体は、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4Dに結合する。また、前述の抗体の任意と同一のエピトープに結合する抗体、および／または前述の抗体のうちの任意のものを競合的に阻害する抗体も有用である。

MAb67 VHおよびVK遺伝子のアミノ酸配列を、下線を引いたCDR1、CDR2およびCDR3領域と共に下に示す。

ヒト化MAb67 VH（H2160）およびVK（L553）（「MAb VX15/2503」）のアミノ酸配列を、下線を引いたCDR1、CDR2およびCDR3領域と共に下に示す。
H2160の配列：

L553の配列：

ある特定の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、参照抗SEMA4D抗体分子、例えば上記のVX15/2503および67と少なくとも約80％、約85％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、または約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらなる態様において、結合分子は、参照抗体と少なくとも約96％、約97％、約98％、約99％、または100％の配列同一性を共有する。

別の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該VHドメインのCDRの少なくとも1個は、SEQ ID NO: 1または3のCDR1、CDR2、またはCDR3と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

別の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該VHドメインのCDRの少なくとも1個は、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 7と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

別の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該VHドメインのCDRの少なくとも1個は、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 7と、1、2、3、4、または5個の保存的アミノ酸置換以外は同一であるアミノ酸配列を有する。

別の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 3と少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有するVHドメインを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該コードされたVHドメインを含む抗SEMA4D抗体は、SEMA4Dに特異的または優先的に結合する。

別の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該VLドメインのCDRの少なくとも1個は、SEQ ID NO: 2または4のCDR1、CDR2、またはCDR3と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

別の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該VLドメインのCDRの少なくとも1個は、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、またはSEQ ID NO: 10と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

別の態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該VLドメインのCDRの少なくとも1個は、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、またはSEQ ID NO: 10と、1、2、3、4、または5個の保存的アミノ酸置換以外は同一であるアミノ酸配列を有する。

さらなる態様において、本明細書中で提供される方法において有用である抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 4と少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有するVLドメインを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、該コードされたVLドメインを含む抗SEMA4D抗体は、SEMA4Dに特異的または優先的に結合する。

また、本明細書中で提供される方法における使用のために、本明細書において記載されるような抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、およびそのようなベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞も含まれ、すべては、本明細書中で記載される方法における使用のために、抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を産生するためのものである。

本発明の抗SEMA4D抗体の適した生物学的に活性を有する変異体を、本発明の方法において使用することができる。そのような変異体は、親抗SEMA4D抗体の望ましい結合特性を保持しているであろう。抗体変異体を作製する方法は、当技術分野において一般的に利用可能である。

変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)；Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)；Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.)；米国特許第4,873,192号；およびこれらにおいて引用される参照文献を参照されたい。関心対象のポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換についての手引きは、全体として参照により本明細書に組み入れられるAtlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)の345-352ページにおけるDayhoffらのモデル（1978）において見出され得る。Dayhoffらのモデルは、適した保存的アミノ酸置換を決定するために、Point Accepted Mutation（PAM）アミノ酸類似度マトリクス（PAM 250マトリクス）を使用する。1個のアミノ酸を類似した特性を有する別のアミノ酸と交換するような、保存的置換が好ましい可能性がある。DayhoffらのモデルのPAM250マトリクスにより教示される保存的アミノ酸置換の例は、Gly⇔Ala、Val⇔Ile⇔Leu、Asp⇔Glu、Lys⇔Arg、Asn⇔Gln、およびPhe⇔Trp⇔Tyrを含むが、これらに限定されない。

関心対象のポリペプチドである、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の変異体を構築する際には、変異体が、例えば、本明細書において記載されるような、例えば、細胞の表面上に発現しているかまたは細胞により分泌されるSEMA4D、例えば、ヒト、マウス、またはヒトおよびマウス両方のSEMA4Dに特異的に結合することができる、およびSEMA4D遮断活性を有する、望ましい特性を保有し続けるように修飾がなされる。明らかに、変異体ポリペプチドをコードするDNA中に作製されるいずれの変異も、配列をリーディングフレームの外に置いてはならず、かつ好ましくは、mRNAの二次構造を生じ得る相補性領域を創出しないであろう。欧州特許出願公開第75,444号を参照されたい。

抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の結合特異性を測定する方法は、標準的な競合結合アッセイ、T細胞またはB細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングするためのアッセイ、T細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、ELISAアッセイなどを含むが、これらに限定されない。例えば、すべてが参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第93/14125号；Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000)；Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002)；Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001)；Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001)；およびGiraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)において開示される、そのようなアッセイを参照されたい。

本明細書において開示される定常領域、CDR、VHドメイン、またはVLドメインを含む任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、またはさらに約100％同一であるか否かを、本明細書において議論する際、％同一性は、BESTFITプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）などの、しかしこれに限定されない、当技術分野において公知である方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定することができる。BESTFITは、2種の配列間の相同性の最も高いセグメントを見出すために、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489の局所相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と95％同一であるか否かを判定するためにBESTFITまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いる際は、パラメータを、当然、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の完全長にわたって計算されるように、かつ参照配列中のアミノ酸の総数の5％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定する。

本発明の目的で、パーセント配列同一性を、Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムを使用して、12のギャップ開始ペナルティおよび2のギャップ伸長ペナルティ、62のBLOSUMマトリクスを有するアフィンギャップ検索を用いて決定してもよい。Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムは、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489において教示される。変異体は、例えば、参照抗SEMA4D抗体（例えば、MAb VX15/2503、67、または76）と、わずか1〜15個のアミノ酸残基、わずか1〜10個のアミノ酸残基、例えば6〜10個、わずか5個、わずか4個、3個、2個、またはさらに1個のアミノ酸残基が異なっていてもよい。

抗SEMA4抗体の定常領域は、多数の方式でエフェクター機能を変化させるように変異させることができる。例えば、Fc受容体に対する抗体結合を最適化するFc変異を開示している、米国特許第6,737,056B1号および米国特許出願公開第2004/0132101A1号を参照されたい。

本明細書中で提供される方法において有用である、ある特定の抗SEMA4D抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体において、Fc部分を、当技術分野において公知である技術を用いてエフェクター機能を低下させるように変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの（点変異または他の手段を通した）欠失または不活性化は、循環する修飾抗体のFc受容体結合を低減させ、それにより腫瘍局在化を増加させることができる。他の場合には、本発明と一致する定常領域修飾は、補体結合を緩和し、従って血清半減期を低減させる。定常領域のさらに他の修飾を、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾して、抗原特異性または抗体柔軟性の増加による局在化の増強を可能にするために、使用することができる。結果として生じた修飾体の生理学的プロフィール、生物学的利用能、および他の生化学的作用、例えば、腫瘍局在化、生体内分布、および血清半減期は、過度の実験を伴わない周知の免疫学的技術を用いて、容易に測定および定量化することができる。本明細書中で提供される方法における使用のための抗SEMA4D抗体は、例えば、共有結合が抗体のその同起源のエピトープに対する特異的結合を妨げないような、任意のタイプの分子の抗体への共有結合により修飾されている誘導体を含む。例えば、しかし限定としてではなく、抗体誘導体は、例えば、グルコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾されている抗体を含む。多数の化学修飾の任意は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化などを含むがこれらに限定されない公知の技術により行うことができる。さらに、誘導体は、1個または複数の非古典的アミノ酸を含有することができる。

「保存的アミノ酸置換」とは、その中でアミノ酸残基が類似した電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。類似した電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。あるいは、変異を、例えば飽和変異誘発により、コード配列のすべてまたは一部に沿って無作為に導入することができ、結果として生じた変異体を、活性（例えば、抗SEMA4Dポリペプチドに結合する能力、SEMA4Dのその受容体との相互作用を遮断する能力、または、対象において神経形成を促進させる能力）を保持する変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。

例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみまたはCDR領域のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレント変異または中立ミスセンス変異である、すなわち、抗原に結合する抗体の能力に対して何も効果を有さないか、またはほとんど効果を有さないことができる。これらのタイプの変異は、コドン使用頻度を最適化するため、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいは、非中立ミスセンス変異は、抗原に結合する抗体の能力を変更してもよい。当業者は、抗原結合活性の無変更または結合活性の変更（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）などの望ましい特性を有する変異体分子を、設計しかつ試験することができるであろう。変異誘発後に、コードされたタンパク質を、日常的に発現させてもよく、コードされたタンパク質の機能的活性および／または生物学的活性（例えば、SEMA4Dポリペプチドの少なくとも1個のエピトープに免疫特異的に結合する能力）を、本明細書において記載される技術を用いて、または当技術分野において公知である日常的な修飾技術により、測定することができる。

ある特定の態様において、本明細書中で提供される方法における使用のための抗SEMA4D抗体は、少なくとも1個の最適化された相補性決定領域（CDR）を含む。「最適化されたCDR」により、CDRが、最適化されたCDRを含む抗SEMA4D抗体に付与される結合親和性および／または抗SEMA4D活性を改善するように、修飾されかつ最適化されていることが意図される。「抗SEMA4D活性」または「SEMA4D遮断活性」は、SEMA4Dと関連する以下の活性の1つまたは複数を調節する活性を含むことができる：B細胞の活性化、凝集、および生存；CD40により誘導される増殖および抗体産生；T細胞依存性抗原に対する抗体応答；T細胞もしくは他の免疫細胞の増殖；樹状細胞の成熟；脱髄および軸索変性；多能性神経前駆体および／もしくはオリゴデンドロサイトのアポトーシス；内皮細胞遊走の誘導；自発性単球遊走の阻害；細胞表面プレキシン-B1もしくは他の受容体に対する結合、または、可溶性SEMA4DもしくはSEMA4D+細胞の表面上に発現しているSEMA4Dと関連する任意の他の活性。抗SEMA4D活性はまた、リンパ腫を含む、ある特定のタイプの癌、自己免疫疾患、中枢神経系（CNS）および末梢神経系（PNS）の炎症性疾患を含む炎症性疾患、移植片拒絶、および侵襲的血管新生を含むが、これらに限定されない、SEMA4Dの発現と関連する疾患の発生率または重症度の低下に帰することができる。マウス抗SEMA4D MAb BD16およびBB18に基づく最適化された抗体の例は、米国特許出願公開第2008/0219971 A1号、国際特許出願である国際公開公報第93/141251号、およびHerold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995)に記載され、これらの各々は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。修飾は、抗SEMA4D抗体が、SEMA4D抗原についての特異性を保持し、かつ改善された結合親和性および／または改善された抗SEMA4D活性を有するように、CDR内のアミノ酸残基の置換を含んでもよい。

ある特定の態様において、本出願の結合分子、例えば、抗SEMA4D抗体またはその抗原結合断片は、SEMA4D活性、および／またはSEMA4DのSEMA4D受容体もしくはその一部との相互作用を阻害する。ある特定の態様において、阻害されるSEMA4D活性は、以下の1つまたは複数を含む：B細胞の活性化、凝集、および／もしくは生存；CD40により誘導される増殖および／もしくは抗体産生；T細胞依存性抗原に対する抗体応答；T細胞もしくは他の免疫細胞の増殖；樹状細胞の成熟；脱髄および軸索変性；多能性神経先駆体および／もしくはオリゴデンドロサイトのアポトーシス；内皮細胞遊走の誘導；自発的単球遊走の阻害；SEMA4Dの二量体化；細胞表面のプレキシン-B1もしくは他の受容体への結合、または、可溶性SEMA4DもしくはSEMA4D＋細胞の表面上に発現しているSEMA4Dと関連する任意の他の活性。

本明細書において使用される「阻害する」とは、例えば、結合、活性、機能、相互作用、または他の測定可能な特徴の、部分的または完全な遮断を含むことができる。

V．治療用抗SEMA4D抗体を用いた処置法
本発明の方法は、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全を有する対象において神経形成を促進するための、抗SEMA4D結合分子、例えば、その抗原結合断片、変異体、および誘導体を含む抗体の使用に向けられる。以下の議論は、抗SEMA4D抗体の投与に言及するが、本明細書において記載される方法はまた、本発明の抗SEMA4D抗体の望ましい特性を保持する、例えば、SEMA4D、例えば、ヒト、マウス、もしくはヒトおよびマウスSEMA4Dに特異的に結合することができる、SEMA4D中和活性を有することができる、ならびに／またはSEMA4Dのその受容体、例えばプレキシン-B1との相互作用を遮断することができる、これらの抗SEMA4D抗体の抗原結合断片、変異体、および誘導体にも適用可能である。

1つの態様において、処置は、本明細書において記載されるような抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全を有するか、またはこれらを発症する危険性を有する患者への適用または投与を含む。別の態様において、処置はまた、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物の、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全を有するか、またはこれらを発症する危険性を有する患者への適用または投与を含むようにも意図される。

1つの態様において、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物は、患者へ、血液脳関門を通過し得る（すなわち、脳側で作用する）当技術分野において公知である任意の形態を含む、任意の従来の形態において送達されてもよい。SEMA4Dの、血液脳関門完全性の維持に重要な脳内在細胞であるアストロサイト上の受容体との相互作用のために、抗SEMA4D結合分子の適用または投与は、SEMA4Dのアストロサイト上のその受容体との相互作用を遮断するように血液脳関門の脳側で起きてもよい。因子に血液脳関門を通過させるための方法は、因子のサイズを最小化すること、より容易に通過し得る疎水性因子を提供すること、血液脳関門を横切る実質的な透過性係数を有する担体分子に調節作用物質を結合させることを含む。

別の態様において、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物は、患者へ、血液脳関門を迂回し得る（すなわち、血液側で作用する）当技術分野において公知である任意の形態を含む、任意の従来の形態において送達されてもよい。SEMA4Dの内皮細胞上の受容体との相互作用のために、抗SEMA4D結合分子の適用または投与は、血液脳関門の血液側で起きてもよい。抗SEMA4D結合分子を、例えば静脈内投与を含むがこれに限定されない、血液側に曝露する経路により投与することによって、抗SEMA4D結合分子は、SEMA4Dの内皮細胞により発現されるSEMA4D受容体または受容体の一部との相互作用を阻害することが可能になるであろう。別の態様において、血液脳関門は、例えば、細胞自体が因子を産生するように、増殖因子をコードする遺伝子を含有する発現ベクターでの細胞のインビボトランスフェクションにより、迂回することができる。細胞の任意の有用な遺伝子修飾が、本発明の範囲内である。例えば、増殖因子を発現するための細胞の遺伝子修飾に加えて、神経伝達物質などの他のタイプの神経学的作用物質を発現するように、細胞を修飾してもよい。好ましくは、遺伝子修飾は、脳室領域を裏打ちする細胞の組み換えレトロウイルスでの感染、または当技術分野において公知である方法を用いたトランスフェクションのいずれかにより行われる。

本明細書において記載されるような抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体またはその結合断片は、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの、種々の中枢神経系障害の処置のために有用である。いくつかの態様において、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの中枢神経系障害の処置は、神経形成の促進を含むように意図される。他の態様において、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの中枢神経系障害の処置は、前駆細胞の増殖の増大を含むように意図される。他の態様において、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの中枢神経系障害の処置は、前駆細胞の分化を増強するように意図される。他の態様において、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの中枢神経系障害の処置は、先駆細胞または前駆細胞の生存を増大させるように意図される。

1つの態様において、本発明は、特に、先駆細胞または前駆細胞の増殖を増大させること、分化を増強すること、および／または生存を増大させることにより神経形成を促進する、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの中枢神経系障害の処置または防御における使用のための薬剤としての、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の使用に関連する。ある特定の態様において、本出願の方法は、前駆細胞の数を増加させ、その分化を増強し、および／またはその生存を増大させる。

本発明の方法に従って、本明細書において他の場所で定義されるような、少なくとも1つの抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの中枢神経系障害に関して正の治療応答を促進するために使用することができる。

中枢神経系障害に関する「正の治療応答」とは、これらの抗体の、抗炎症活性、抗血管新生活性、抗アポトーシス活性などと関連する疾患の改善、および／または、疾患と関連する症候の改善を含むように意図される。すなわち、抗増殖効果、SEMA4D発現細胞またはSEMA4Dの受容体を発現する細胞のさらなる増殖の予防、炎症性サイトカイン、接着分子、プロテアーゼ、免疫グロブリン（SEMA4DまたはSEMA4D受容体を有する細胞がB細胞である場合）、これらの組み合わせなどの分泌の低減を含むがこれに限定されない、炎症性応答の低減、抗炎症性タンパク質の産生の増加、自己反応性細胞の数の低減、免疫寛容の増加、自己反応性細胞の生存の阻害、アポトーシスの低減、内皮細胞遊走の低減、自発性単球遊走の増加、sSEMA4DまたはSEMA4D発現細胞の刺激により媒介される1つまたは複数の症候の低減および／または減少を、観察することができる。そのような正の治療応答は、投与の経路に限定されず、かつ、ドナー、ドナー組織（例えば器官灌流など）、宿主、これらの任意の組み合わせなどへの投与を含んでもよい。特に、本明細書において提供される方法は、患者において神経炎症性障害の発症を阻害すること、予防すること、低減させること、緩和すること、または少なくすることに向けられる。従って、例えば、疾患の改善は、臨床的に観察可能な症候の欠如、先駆もしくは前駆細胞の増殖、分化、および／または生存における増加として特徴づけうる。抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、神経炎症性障害のための少なくとも1つまたは複数の他の処置と組み合わせて使用することができ；追加的な治療は、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の治療の前、その間、またはその後に施される。従って、併用療法が、別の治療剤の投与と組み合わせて、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の投与を含む場合、本発明の方法は、別々の製剤または単一の薬学的製剤を用いる、同時投与またはいずれかの順番での連続的投与での、共投与を包含する。

VI．薬学的組成物および投与法
抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を調製する方法、およびこれらを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、または当業者により容易に決定される。抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の投与の経路は、例えば、経口であるか、非経口であるか、吸入によるか、または局所であることができる。本明細書において使用される非経口という用語は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、または膣投与を含む。投与のこれらの形態のすべてが、本発明の範囲内であると明らかに企図されるが、投与のための形態の例は、注射用、特に、静脈内または動脈内の注射または点滴用の溶液であろう。注射に適した薬学的組成物は、緩衝剤（例えば、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、任意で安定剤（例えばヒトアルブミン）などを含むことができる。しかしながら、本明細書における教示と適合する他の方法において、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、有害な細胞集団の部位に直接送達し、それにより患部組織の治療剤への曝露を増加させることができる。

本明細書において議論される際、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、神経炎症性障害のインビボ処置のための薬学的有効量で投与することができる。この点において、開示される結合分子を、投与を容易にし、かつ活性剤の安定性を促進するように製剤化できることが、認識されるであろう。ある特定の態様において、本発明に従う薬学的組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝剤、保存薬などのような、薬学的に許容される非毒性の滅菌担体を含む。本出願の目的で、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の薬学的有効量は、標的に対する有効な結合を達成するため、および有益性を達成するため、例えば、神経変性障害、神経炎症性障害、急性脳損傷、およびある特定のCNS機能不全などの中枢神経系障害を有する対象において神経形成を促進させるために十分な量を意味するように保たれるべきである。

本発明において使用される薬学的組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含む、薬学的に許容される担体を含む。

非経口投与のための調製物は、滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、例えば、水、食塩水および緩衝媒体を含むアルコール性／水性溶液、乳濁液、または懸濁液を含む。本発明において、薬学的に許容される担体は、0.01〜0.1 Mおよび好ましくは0.05 Mのリン酸緩衝液または0.8％の食塩水を含むが、これらに限定されない。他の一般的な非経口賦形剤は、リン酸ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー溶液、または固定油を含む。静脈内賦形剤は、リンガーデキストロースに基づくものなどのような、流体および栄養補液、電解質補液を含む。例えば、抗微生物薬、抗酸化薬、キレート剤、および不活性ガスなどのような保存薬および他の添加物もまた、存在してもよい。

より詳細に、注射可能な使用に適した薬学的組成物は、滅菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含む。そのような場合に、組成物は滅菌でなければならず、かつ、易注射性（easy syringability）が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、かつ好ましくは、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるであろう。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる。妥当な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。本明細書において開示される治療法における使用に適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)に記載されている。

微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収を、組成物中に吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらすことができる。

いずれの場合にも、滅菌の注射可能な溶液を、活性化合物を（例えば、抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をそれ自体でまたは他の活性剤と組み合わせて）、必要に応じて本明細書において列挙される成分の1つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量組み入れ、その後濾過滅菌することにより、調製することができる。概して、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記で列挙されるもの由来の必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤中に組み入れることにより、調製する。滅菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分に加えて任意の追加的な望ましい成分の粉末を、事前に濾過滅菌したその溶液から生じる。注射用の調製物を、当技術分野において公知である方法に従って無菌的条件下で、加工処理し、アンプル、袋、瓶、シリンジ、またはバイアルなどの容器中に満たし、密封する。さらに、調製物を、キットの形態でパッケージングして、販売してもよい。そのような製造品は、付随する組成物が、疾患または障害を患うかまたはその素因を有する対象を処置するために有用であることを示す、標識またはパッケージ挿入物を有することができる。

非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入、またはその後維持用量が続く負荷ボーラス用量であることができる。これらの組成物は、特異的な固定された間隔もしくは可変の間隔で、例えば1日に1回、または「必要に応じて」随時、投与することができる。

本発明において使用されるある特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む許容される剤形において経口投与することができる。ある特定の薬学的組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によっても投与することができる。そのような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存薬、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、食塩水中の溶液として調製することができる。

単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされるべき抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体の量は、処置される宿主、および投与の特定の様式に応じて変動すると考えられる。組成物は、単一用量として、複数用量として、または確立された期間にわたって注入において投与することができる。投薬レジメンはまた、最適な望ましい応答（例えば、治療応答または防御応答）を提供するように調整することもできる。

本開示の範囲に沿って、抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、前述の処置の方法に従って治療効果を生じるのに十分な量で、ヒトまたは他の動物に投与することができる。抗SEMA4D抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、公知の技術に従って本発明の抗体を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることにより調製された従来の剤形において、そのようなヒトまたは他の動物に投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特徴は、それと組み合わされるべき活性成分の量、投与の経路、および他の周知の変数により規定されることが、当業者により認識されるであろう。当業者はさらに、本発明の抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の1つまたは複数の種を含むカクテルを使用できることを、認識するであろう。

「治療的有効用量もしくは量」または「有効量」により、投与された際に、処置されるべき疾患を有する患者の処置に関して正の治療応答、例えば、先駆もしくは前駆細胞の増殖の増加、分化の増強、および／または生存の増大をもたらす、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の量が意図される。

神経形成の促進のための、本発明の組成物の治療的有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の薬剤、および処置が防御的であるかまたは治療的であるかを含む、多くの異なる要因に応じて変動する。ある特定の態様において、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物もまた、処置することができる。処置投薬量を、安全性および有効性を最適化するように、当業者に公知である日常的な方法を用いて滴定してもよい。

投与されるべき少なくとも1つの抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその結合断片、変異体、もしくは誘導体の量は、本発明の開示を考慮して過度の実験を伴わずに、当業者が容易に決定する。投与の様式、および少なくとも1つの抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、または誘導体のそれぞれの量に影響を及ぼす要因は、疾患の重症度、疾患の履歴、ならびに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康、および身体状態を含むが、これらに限定されない。同様に、投与されるべき抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体の量は、投与の様式、および、対象がこの剤の単一用量を受けるかまたは複数用量を受けるかに依存するであろう。

本発明はまた、神経炎症性障害を処置するために対象を処置する薬剤であって、少なくとも1つの他の療法で前処置されている対象において使用される薬剤の製造における、抗SEMA4D結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の使用も提供する。「前処置される」または「前処置」により、対象が、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む薬剤を受ける前に、1つまたは複数の他の治療を受けている（例えば、少なくとも1つの他の神経炎症性療法で処置されている）ことが意図される。「前処置される」または「前処置」とは、抗SEMA4D結合分子、例えば、本明細書において開示されるモノクローナル抗体VX15/2503、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む薬剤での処置の開始の前の2年以内、18か月以内、1年以内、6か月以内、2か月以内、6週間以内、1か月以内、4週間以内、3週間以内、2週間以内、1週間以内、6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内、またはさらに1日以内に少なくとも1つの他の療法で処置されている対象を含む。対象が、1つまたは複数の先の療法での前処置に対して応答者であったことは必要ではない。従って、抗SEMA4D結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む薬剤を受ける対象は、先の療法での前処置に対して、または前処置が複数の療法を含んだ先の療法の1つもしくは複数に対して、応答していてもよく、または応答できていなくてもよい。

本発明の実施は、別の方法で指示されない限り、当技術分野の技能内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用するであろう。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II；Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis et al. 米国特許第4,683,195号；Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning；論文であるMethods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155；Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照されたい。

抗体工学の一般原理は、Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)に示されている。タンパク質工学の一般原理は、Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)に示されている。抗体および抗体-ハプテン結合の一般原理は、Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.)；およびSteward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)に示されている。さらに、当技術分野において公知であり、かつ具体的に記載されていない免疫学における標準的な方法は、概して、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York；Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)、およびMishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)におけるように従う。

免疫学の一般原理を示す標準的な参照著作物は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York；Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY)；Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY)；Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam)；Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; H. Freemand & Co.)；Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby)；Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan)；Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)；Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003)；Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)を含む。

上記で引用された参照文献のすべて、および本明細書において引用されるすべての参照文献は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

以下の実施例は、例証として提供され、限定としては提供されない。

実施例1：実験設計
基本的な実験設計を、図1に示す。雄、6週齢のCB-17/lcr-1/1Jclマウス（「CB-17マウス」）を使用して、卒中損傷後の神経形成に対する抗SEMA4D抗体の効果を評定した。マウスを、中大脳動脈（MCA）閉塞（MCAO）に供した。簡潔に言うと、動物を、30％酸素／70％亜酸化窒素混合物中の4％ハロタンで誘導される深麻酔下に置き、麻酔段階を1〜2％ハロタンで維持した。他の場所に記載されているように左の中大脳動脈（MCA）の遠位部分の結紮および切断により、永続性局所的脳虚血を生じさせた（Taguchi et al., 2004, 2007）。動物をハロタン麻酔下にして、左のMCAを単離し、電気焼灼して、交差する嗅索のすぐ遠位で（遠位M1部分）切断した。MCA領域における脳血流（CBF）を、以前に記載されたようにモニタリングした（Matsushita et al., 1998）。このマウス系統において作製される脳梗塞は、高度に再現可能であり、同側大脳皮質に限定される（Taguchi et al., 2004, 2007）。

閉塞後にマウスを2群に分け、処置群には抗SEMA4D抗体MAb 67-2を注射し、対照群にはIgGアイソタイプ対照MAb 2B8を注射した。マウスは、MCAO後1時間目、3時間目、3日目、7日目、14日目、および21日目に、腹腔内（IP）注射を介して0.6 mg/kgのモノクローナル抗体を受けた。

MCAO後7日目に、各抗体を注射したコホート由来の動物のサブセットを、屠殺し、脳を抽出し、組織を免疫組織化学および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により解析した。

脳切片の免疫組織化学解析のために、動物に2％パラホルムアルデヒド-リジン-ペリオダート（PLP）固定剤（0.75 Mリジン-HCl／0.01 Mペリオダート／0.075 Mリン酸緩衝液）を灌流し、脳をクリオスタット上で20μmの厚さの連続切片に切った。脳切片を、消光のために0.1％ H₂O₂で処理し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で洗浄し、1つまたは複数の以下の一次抗体と一晩インキュベーションした：希釈緩衝液（0.3％ Triton-X-100／5％ウマ血清／PBS）中のニューロン用の抗NeuN、神経幹／先駆細胞用の抗ネスチンおよび抗Sox2。PBS中で3回洗浄した後、切片を、適切な二次抗体と3時間インキュベーションし、NeuN染色については、その後、ペルオキシダーゼABC Elite Kit（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いたABC反応によりジアミノベンジジン（DAB; Sigma）で視覚化した。ネスチン／Sox2二重免疫細胞化学については、FITC標識（Sox2）およびCy3標識（ネスチン）の二次抗体を使用した。蛍光顕微鏡写真を、レーザー共焦点顕微鏡で取得した。結果を図2A〜図2Eに示し、下記で詳細に議論する。

RT-PCR解析のために、全RNAを、MCAO後7日目に顕微解剖した脳組織から単離し、cDNAを調製した。cDNAを、以下の条件下でPCR増幅した：94℃で15秒、56℃で30秒、および68℃で1分（40サイクル）。プライマー配列は、以下の通りであった：ネスチンフォワード、

およびネスチンリバース、

（単位複製配列サイズ、307 bp）；Sox2フォワード、

およびSox2リバース、

（単位複製配列サイズ、312 bp）；プロテオリピドタンパク質（PLP）フォワード、

およびPLPリバース、

（単位複製配列サイズ、295 bp）；ならびにβ-アクチンフォワード、

およびβ-アクチンリバース、

（単位複製配列サイズ、353 bp）。結果を図3A〜図3Dに示し、下記で詳細に議論する。

行動評価を、MCAO後14および30日目にマウスの残りのコホートに対して行った。皮質機能を評価するために、マウスを、オープンフィールド課題を用いた行動試験により解析した。簡潔に言うと、動物に、正方形のアクリル製ボックス（30×3×30 cm）中を20分間自由に探索させた。囲いの天井の光源を、最初の10分間オンにし（明期間）、その後の10分の期間オフにした（暗期間）。オープンフィールドのX列およびY列に、2本の赤外線ビームを、床から2 cm上に装備し、10-cm間隔で配置して、それらの間にフリップフロップ回路を形成させた。動物によるビーム横断の総数を計数し、移動行動（運動）として記録した。結果を図6A〜図6Cに示し、下記で詳細に議論する。

MCAO後30日目に、マウスの残りのコホートを屠殺し、NeuN免疫組織化学のために脳を加工処理した。マウスに、4％パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流し、脳を取り出して、冠状切片（14μm）をNeuNに対するマウス抗体で染色し、その後、ビオチン化ヤギ抗マウスIgG（Chemicon, Temecula, CA; 1/500）、ABC Elite Kit（Vector Laboratories, Burlingame, CA）、および色原体としてのDAB（Sigma）での反応を行った。ニューロンの核マーカーであるNeuNにより占められた同側および反対側の大脳半球面積を、Image Jを用いて測定した。同側および反対側の大脳半球容積を、冠状に配向された同側および反対側の大脳半球面積を積分することにより計算した。同側大脳半球容積の退縮を、（同側大脳半球容積／反対側大脳半球容積）として計算した。結果を図4A〜図4Dおよび図5A〜図5Bに示し、下記で詳細に議論する。

実施例2：MCAO脳における神経幹／先駆細胞の存在に対する抗SEMA4D抗体の効果
MCAO後7日目に、神経幹／先駆細胞の存在に対する抗SEMA4D抗体の効果を検討した。図2は、アイソタイプ対照（左のパネル、AおよびC）ならびに抗SEMA4D抗体で処置したマウス（右のパネル、BおよびD）の、梗塞の境界における2個の代表的な領域（図2Eに記号で示されている）由来の虚血組織の免疫細胞化学染色の画像を示す。これらの結果により、抗SEMA4D抗体で処置したマウスは、対照抗体で処置したマウスと比較して神経幹／前駆細胞マーカータンパク質の増大した発現を有することが示される。これらのデータにより、抗SEMA4D抗体は、虚血脳において神経幹／先駆細胞集団を保護し得、および／または神経形成を誘導し得ることが示唆される。

抗SEMA4D抗体およびアイソタイプ対照で処置したマウスにおける神経幹／先駆細胞のmRNA発現を、MCAO後7日目に虚血組織において従来のRT-PCRにより検出した。これらの結果を、図3A〜図3Dに示す。結果により、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスと比較して抗SEMA4D抗体で処置したマウスにおいて、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチンに対するSox2、ネスチン、およびPLPの発現の有意な増大（p＜0.05）が示される。Sox2およびネスチンは、神経幹／先駆細胞のマーカーであるため、抗SEMA4D抗体での処置後のこれらのマーカーの発現の増大により、抗SEMA4D抗体が神経形成を促進し得ることが示唆される。虚血脳において抗SEMA4D処置後に観察された神経形成の増大は、神経幹／先駆細胞の増殖の増大、および／または新たに形成された神経幹／先駆細胞の生存の増大の結果である可能性がある。

実施例3：脳梗塞後の脳容積に対する抗SEMA4D抗体の効果
MCAO後30日目に、脳の容積に対する抗SEMA4D抗体の効果を検討した。図4A〜図4Bは、1匹の代表的なアイソタイプ対照マウス（左、図4A）および1匹の代表的な抗SEMA4D抗体で処置したマウス（右、図4B）由来の、成熟ニューロンマーカーであるNeuNに特異的な抗体で染色された脳切片を示す。脳容積は、線条体（実線）および半球（点線）の容積により表される。図4C〜図4Dは、処置したマウスの各群について、それぞれ線条体および半球の容積の計算比（L/R）を示す。抗SEMA4D抗体で処置したマウスとアイソタイプ対照で処置したマウスとの間に、脳の全半球容積（破線）における統計学的に有意な差は無いが、抗SEMA4D抗体で処置したマウスは、対照抗体で処置したマウスよりも有意に大きい線条体容積（実線）を有する。これらのデータにより、局所的虚血傷害の近位の線条体領域は、抗SEMA4D抗体処置により保護され得ることが示唆される。

実施例4：MCAO脳におけるニューロンの存在に対する抗SEMA4D抗体の効果
MCAO後30日目に、脳におけるニューロンの存在に対する抗SEMA4D抗体の効果を検討した。図5は、1匹の代表的なアイソタイプ対照マウス（下のパネル、図5B）および1匹の代表的な抗SEMA4D抗体で処置したマウス（上のパネル、図5A）由来の、虚血脳組織のNeuNで染色された画像を示す。これらの結果により、抗SEMA4D抗体で処置したマウスは、対照抗体で処置したマウスと比較した際に、脳梗塞の境界の線条体（矢印）において、成熟ニューロン細胞マーカーであるNeuNの増大した発現を有することが示される。これらのデータにより、抗SEMA4D抗体処置は、潜在的に、虚血脳において神経幹／先駆細胞集団を保護すること、および／または神経形成を誘導することにより、成熟ニューロンの発生を促進することが示唆される。

実施例5：MCAOマウスの行動活性に対する抗SEMA4D抗体の効果
MCAO後30日目に、行動活性に対する抗SEMA4D抗体の効果を検討した。抗SEMA4D抗体および対照IgGで処置したマウスを、10分間、明および暗環境下でオープンフィールド試験に供した。図6A〜図6Bは、MCAOを受けたマウス（対照IgGおよび抗SEMA4D抗体で処置したマウスの両方）が、偽処置したマウスと比較して有意に高い明期における活性（p＜0.05）を有するが、暗期においては有さない様子を示す。マウスは通常、明環境から暗闇に入れられた際に増大した活性を有する。図6Cは、暗期／明期の運動活性の比が、対照抗体で処置したマウスとは対照的に、抗SEMA4D抗体で処置したマウスにおいて有意に改善され、偽処置したマウスに匹敵したことを示す（p＜0.05）。暗期／明期の比は、抗SEMA4Dと偽手術群との間では有意に異ならなかった。これらの結果により、MCAO障害を有するマウスの抗SEMA4D抗体処置は、暗／明刺激に対するそれらの応答を正常化するように作用し得るが、対照IgGを受けるマウスは、MCAO障害を有するマウスにより典型的に示される異常な暗／明活性を維持するように見えることが示唆される。

実施例6：血液脳関門完全性および神経形成に対する抗SEMA4D抗体の効果
別の研究を、永続性中大脳動脈閉塞（MCAO）のラットモデルにおいて血液脳関門（BBB）完全性および神経形成に対する抗SEMA4Dの効果を評価するために行う。

基本的な実験設計を、図7に示す。ラットを、中大脳動脈（MCA）閉塞（MCAO）に供する。閉塞後に、ラットを15匹のラットの3群に分けて：処置群には抗SEMA4D抗体MAb 67-2を注射し、対照群にはIgGアイソタイプ対照MAb 2B8を注射し、非MCAO群にはIgGアイソタイプ対照MAb 2B8を注射する。ラットは、MCAO後1時間目、3日目、7日目、14日目、および21日目に、腹腔内（IP）注射を介して15.0 mg/kgのモノクローナル抗体を受ける。後の薬物レベルの評価のために、血液試料を定期的に採取する。ラットは、4週間の時間枠にわたって、予定された抗体注射を受け、行動試験（円筒試験および肢の置き直し試験（limb placing test））を受ける。

各処置群から無作為に選択した5匹のラットのBBB完全性を評価するために、磁気共鳴映像法（MRI）を用いる。別のサブセットのラット（すなわち、5匹のラット）は、神経前駆細胞を標識するために、4〜6日目にi.p. BrdU注射を受ける。終了時、BrdUを受けたラットのサブセットに、4％パラホルムアルデヒドを灌流し、脳を抽出する。第3のサブセットのラットには、生理食塩水を灌流し、脳を顕微解剖して、組織を新鮮凍結する。抽出した脳／顕微解剖した組織は、マイクログリアの活性化および神経形成の免疫組織化学的および生化学的評価を受ける。

本明細書において示される本発明の多くの修飾物および他の態様が、前述の説明および関連する図面において提示される教示の恩恵を受ける、本発明が属する技術分野における当業者には、思い浮かぶであろう。従って、本発明は開示される具体的な態様に限定されるべきではないこと、ならびに、修飾物および他の態様は添付の特許請求の範囲および本明細書において開示される態様の列挙の範囲内に含まれるように意図されることが、理解されるべきである。具体的な用語が本明細書において使用されるが、それらは、総称的意味および説明的意味のみで使用され、限定の目的では使用されない。

Claims (13)

1. 卒中の結果として神経再生が必要な対象において、神経前駆細胞の増殖、分化、または遊走のうち1つまたは複数を増大させるための組成物であって、セマフォリン-4D（SEMA4D）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
2. 抗体またはその断片が、受容体または受容体の一部とのSEMA4Dの相互作用を阻害することができる、請求項1記載の組成物。
3. 受容体が、プレキシン-B1、プレキシン-B2、およびCD72からなる群より選択される、請求項2記載の組成物。
4. 抗体またはその断片が：
   （a）アミノ酸配列SEQ ID NO:3を含む重鎖（VH）の可変ドメインおよびアミノ酸配列SEQ ID NO:4を含む軽鎖（VL）の可変ドメインを含む参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する、または
   （b）アミノ酸配列SEQ ID NO:3を含むVHおよびアミノ酸配列SEQ ID NO:4を含むVLを含む参照モノクローナル抗体と同じエピトープに結合する、請求項1記載の組成物。
5. 抗体またはその断片が、
   それぞれアミノ酸配列SEQ ID NO:5、6、および7であるVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3を含むVH；ならびに
   それぞれアミノ酸配列SEQ ID NO:8、9、および10であるVL-CDR1、VL-CDR2、およびVL-CDR3を含むVL
   を含む、請求項4記載の組成物。
6. 抗体またはその断片が、
   アミノ酸配列SEQ ID NO:1を含むVH、および
   アミノ酸配列SEQ ID NO:2を含むVL
   を含む、請求項5記載の組成物。
7. 抗体またはその断片が、
   アミノ酸配列SEQ ID NO:3を含むVH、および
   アミノ酸配列SEQ ID NO:4を含むVL
   を含む、請求項5記載の組成物。
8. 抗体またはその断片が、血液脳関門の血液側に投与される、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
9. 抗体またはその断片が、血液脳関門の脳側に投与される、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
10. 対象がヒトである、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
11. 対象への有効量の抗体またはその断片の投与によって、対象において神経先駆細胞マーカーまたは神経前駆細胞マーカーの発現の増加がもたらされる、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
12. マーカーがSox2および/またはネスチンである、請求項11記載の組成物。
13. 抗体またはその断片がIgGアイソタイプである、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。

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