ES2882881T3

ES2882881T3 - Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para promover la neurogénesis tras un ictus

Info

Publication number: ES2882881T3
Application number: ES13787931T
Authority: ES
Inventors: Ernest S Smith; Maurice Zauderer
Original assignee: Vaccinex Inc
Current assignee: Vaccinex Inc
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: EP2846831A4; JP6218810B2; WO2013170221A1; EA201492067A1; US10494440B2; BR112014028160B1; JP2015517502A; AU2013259192A1; US20130302320A1; AU2013259192B2; DK2846831T3; CA2872928A1; PT2846831T; IL235603A0; ZA201501674B; CN104619341A; SG11201407416XA; KR102105436B1; EP2846831B1; EA030796B1

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D) para su uso en un procedimiento de tratamiento de ictus en un sujeto humano, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra en una cantidad eficaz y comprende una VH que comprende las secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente; y una VL que comprende las secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para promover la neurogénesis tras un ictus

Antecedentes de la invención

La semaforina-4D (SEMA4D), también conocida como CD100, es una proteína transmembrana (p. ej., SEQ ID NO: 1 (humana); SEQ ID NO: 2 (murina)) que pertenece a la familia del gen de la semaforina. SEMA4D se expresa sobre la superficie celular como un homodímero, pero tras la activación celular, SEMA4D puede ser liberada de la superficie celular mediante escisión proteolítica para generar SEMA4Ds, una forma soluble de la proteína, que también es biológicamente activa. Véase Suzuki y col., Nature Rev. Immunol. 3:159-167 (2003); Kikutani y col., Nature Immunol.

9:17-23 (2008).

SEMA4D se expresa a altos niveles en órganos linfoides, que incluyen el bazo, timo y ganglios linfáticos, y en órganos no linfoides, tales como el cerebro, corazón y riñón. En órganos linfoides, SEMA4D se expresa abundantemente en linfocitos T en reposo, pero solo se expresa débilmente en linfocitos B en reposo y células presentadoras de antígenos (CPA), tales como células dendríticas (CD). Su expresión, sin embargo, está regulada positivamente en estas células tras la activación por diversos estímulos. La liberación de SEAM4D soluble desde las células inmunitarias también aumenta por la activación celular.

SEMA4D se ha implicado en el desarrollo de enfermedades desmielinizantes autoinmunes como la esclerosis múltiple y ciertos cánceres. La incapacidad del sistema nervioso de los mamíferos para regenerarse por completo después de una lesión es un problema clínico importante. El daño neuronal como resultado de un ictus o un traumatismo cerebral, así como las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, son una de las principales causas de muerte y discapacidad. Si bien el papel de la señalización de SEMA4D a través de sus receptores, por ejemplo, Plexina-B1, en la angiogénesis es bien reconocido, el efecto de la señalización de SEMA4D en la promoción de la neurogénesis sigue sin estar claro. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de proporcionar una solución a la necesidad médica no satisfecha de medios terapéuticos de neurorregeneración.

Breve sumario de la invención

Los métodos para usar moléculas de unión de Semaforina-4D para la promoción de la neurogénesis se describen en el presente documento. Se presenta evidencia que demuestra que SEMA4D puede comprometer la capacidad de regeneración de las células neurales.

De acuerdo con la invención, se proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D) para su uso en un procedimiento de tratamiento de ictus en un sujeto humano, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra en una cantidad eficaz y comprende una VH que comprende las secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3, SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente; y una VL que comprende las secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3, SEQ iD NO: 8, 9 y 10, respectivamente.

En una primera realización de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de acuerdo con la invención se administra en la parte de la sangre o en la parte del cerebro de la barrera hematoencefálica del sujeto.

En una segunda realización de la invención, la VH comprende la SEQ ID NO: 1 y la VL comprende la SEQ ID NO: 2.

En una tercera realización de la invención, la VH comprende la SEQ ID NO: 3 y la VL comprende la SEQ ID NO: 4.

En una cuarta realización de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de acuerdo con la invención es para el uso en un procedimiento de tratamiento del infarto cerebral.

En una quinta realización de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de acuerdo con la invención es un anticuerpo IgG para dicho uso.

Breve descripción de los dibujos/figuras

FIGURA 1: Esquema del protocolo experimental para la oclusión de la arteria cerebral media (ACM) descrito en los Ejemplos. FIGURAS 2A-2E: Muestra las células madre neurales/precursoras en muestras de cerebro teñidas para Nestina/Sox2 en las áreas indicadas en 2E después de la oclusión de la arteria cerebral media (OACM) y el tratamiento con control de isotipo ("IgG de control", 2A y 2C ) o MAb 67-2 ("Anti-Sema4D-Ab", 2B y 2D). Las muestras de cerebro se prepararon 7 días después de la OACM. FIGURAS 3A-3D: Muestra (A) expresión de ARNm por RT-PCR con análisis cuantitativo para (B) Sox2, (C) nestina y (D) PLP en relación con el control de actina en tejido cerebral de ratones con OACM tratados con control de isotipo ("IgG de control") o MAb 67-2 ("Anti-SEMA4D"). Se aisló tejido cerebral 7 días después de la OACM. Nestina y Sox2 son marcadores de células madre precursoras neurales. PLP es un marcador de mielinización.

FIGURAS 4A-4D: Muestra el volumen total relativo de cerebro y cuerpo estriado en hemisferios tratados y no tratados en ratones con OACM tratados con control de isotipo o MAb 67-2. Las mediciones se tomaron 30 días después de la OACM. Las FIG. 4A-4B muestran secciones de cerebro teñidas con NeuN de (A) 1 ratón de control de isotipo representativo ("IgG de control") y (B) 1 ratón representativo tratado con anticuerpo anti-SEMA4D ("Anti-SEMA4D"). El volumen del cerebro está representado por el volumen del cuerpo estriado (línea continua) y el hemisferio (línea de puntos). Las FIG. 4C-4D muestran la proporción calculada (I/D) de cuerpo estriado y volumen hemisférico, respectivamente, para el ratón de control de isotipo ("IgG") y el ratón tratado con anticuerpo anti-SEMA4D ("SEMA").

FIGURAS 6A-C: Muestra la actividad locomotora de campo abierto de fase de luz y oscuridad de ratones después de la OACM y tratamiento con control de isotipo ("IgG") o MAb 67-2 ("SEMA4D") 30 días después de la OACM, o ratones tratados con cirugía de simulación ("SIMULACIÓN"). La FIG. 6A-6B muestran la actividad locomotora en fase de luz y en fase de oscuridad, respectivamente. La FIG. 6C muestra la proporción de fase de oscuridad/luz (O/L) en la actividad de locomoción.

FIGURA 7: Muestra un esquema del protocolo experimental descrito en el Ejemplo 6.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Debe observarse que el término "un" o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "un anticuerpo anti-SEMA4D" representa uno o más anticuerpos anti-SEMA4D. Como tales, los términos "un"(o "una"), "uno o más", y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en el presente documento.

La expresión "neurogénesis" se define en el presente documento como proliferación, diferenciación, migración y/o supervivencia de una célula neural in vivo o in vitro. En diversas realizaciones, la célula neural es una célula madre neural adulta, fetal o embrionaria o una población de células. Las células pueden estar ubicadas en el sistema nervioso central o en cualquier otro lugar de un animal o ser humano. Las células también pueden estar en un tejido, como tejido neural. En algunas realizaciones, la célula neural es una célula progenitora adulta, fetal o embrionaria o una población de células, o una población de células que comprende una mezcla de células madre y células progenitoras. Las células neurales incluyen todas las células madre del cerebro, todas las células progenitoras del cerebro y todas las células precursoras del cerebro. La neurogénesis incluye la neurogénesis que se produce durante el desarrollo normal, así como la regeneración neural que se produce después de una enfermedad, daño o intervención terapéutica, como por el tratamiento descrito en el presente documento.

La expresión "célula neural", "célula madre", "célula madre neural", "célula precursora", "células madre/precursoras neurales" (NSPC) o "células madre/progenitoras neurales" (NSPC) se utilizan indistintamente para referirse a una célula indiferenciada que es capaz de autorrenovarse y diferenciarse en neuronas, astrocitos y/u oligodendrocitos.

La expresión "célula progenitora" (por ejemplo, célula progenitora neural), como se usa en el presente documento, se refiere a una célula derivada de una célula madre que no es en sí misma una célula madre. Algunas células progenitoras pueden producir una progenie capaz de diferenciarse en más de un tipo celular. Las células progenitoras neurales incluyen células progenitoras neurales, que producen neuronas, y células progenitoras gliales que producen células astrogliales y/u oligodendrogliales.

Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno del sistema nervioso central" o un "trastorno del SNC" se refiere a un trastorno neurodegenerativo, lesión cerebral aguda (por ejemplo, accidente cerebrovascular, lesión en la cabeza, parálisis cerebral, infarto cerebral, lesión de la médula espinal, lesión traumática), y ciertas disfunciones del sistema nervioso central “SNC” (por ejemplo, depresión, epilepsia y esquizofrenia).

Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno neurodegenerativo" se refiere a la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple. Cabe señalar que un trastorno del SNC también puede ser un trastorno neuroinflamatorio. Debe apreciarse que un trastorno neurodegenerativo puede incluir neuroinflamación. Sin embargo, es posible que exista un trastorno neurodegenerativo en ausencia de una neuroinflamación obvia. Este es el caso, por ejemplo, de la esclerosis múltiple secundaria progresiva en etapa tardía.

Como se usa en el presente documento, la expresión "lesión cerebral aguda" se refiere a apoplejía, lesión en la cabeza, parálisis cerebral, infarto cerebral, lesión de la médula espinal y lesión traumática.

Como se usa en el presente documento, la expresión "disfunciones del SNC" se refiere a depresión, epilepsia y esquizofrenia.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un anticuerpo, polipéptido, polinucleótido, molécula orgánica pequeña, u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso de un trastorno neuroinflamatorio, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede promover la neurogénesis aumentando, por ejemplo, la proliferación, diferenciación, migración y/o supervivencia de células madre/precursoras naurales; reducir, retardar o detener una reducción de las células neurales; inhibir, por ejemplo, suprimir, retardar, prevenir, detener o revertir una reducción en las células neurales; aumentar el número, la densidad y/o la concentración de células neurales; aumentar el número, la densidad y/o la concentración de células neurales; cambiar la morfología o la función de células neurales; o un cambio en las interacciones entre células neurales; aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con una reducción en células neurales, por ejemplo, trastornos neuroinflamatorios; reducir la morbilidad y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; una combinación de tales efectos.

Términos tales como "tratar" o "tratamiento" o "para tratar" o "aliviar" o "para aliviar" se refieren a tanto 1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas de, invierten y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado y 2) medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico diana. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno; y aquellos en los que el trastorno va a prevenirse. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, alivio de síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeora), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la afección o trastorno, además de aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que la afección o trastorno va a prevenirse.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se indica cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que se desea diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos, animales domésticos, animales de granja, y animales de zoológico, para deportes, o mascotas, tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado vacuno, vacas, osos,, etc.

Como se usa en el presente documento, expresiones tales como "un sujeto que se beneficiaría de la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D" y "un animal en necesidad de tratamiento" incluyen sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiarían de la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D u otra molécula de unión a SEMA4D usada, por ejemplo para la detección de un polipéptido de SEMA4D (por ejemplo, para un procedimiento de diagnóstico) y/o para el tratamiento, es decir, la paliación o la prevención de una enfermedad, con un anticuerpo anti-SEMA4D u otra molécula de unión a SEMA4D.

Una "molécula de unión" o "molécula de unión al antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. En una realización, la molécula de unión se une específicamente a SEMA4D, p. ej., a un polipéptido SEMA4D transmembrana de aproximadamente 150 kDa o un polipéptido SEMA4D soluble de aproximadamente 120 kDa (comúnmente denominado SEMA4Ds). En otra realización, una molécula de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En otra realización, una molécula de unión comprende al menos una RDC de cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión comprende al menos dos RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión comprende al menos tres RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión comprende al menos cuatro RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión comprende al menos cinco RDC de una o más moléculas de anticuerpo. En otra realización, una molécula de unión comprende al menos seis RDC de una o más moléculas de anticuerpo.

A menos que se haga específicamente referencia a anticuerpos de tamaño completo tales como los anticuerpos de origen natural, la expresión "anticuerpo anti-SEMA4D" abarca anticuerpos de tamaño completo, así como fragmentos de unión al antígeno, variantes, análogos, o derivados de tales anticuerpos, p. ej., anticuerpo de origen natural o moléculas de inmunoglobulina o moléculas de anticuerpo genomanipuladas o fragmentos que se unen al antígeno de una manera similar a las moléculas de anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe más adelante y, por ejemplo, en la patente de e E.UU. n.° 5.939.598 de Kucherlapati y col. Anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" también incluyen anticuerpos que comprenden al menos el dominio variable de una cadena pesada, o al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera, en el que el (los) dominio(s) variable(s) tienen la secuencia de aminoácidos del (los) dominio(s) variable(s) de inmunoglobulinas humanas.

Anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" también incluyen anticuerpos "humanos" o "completamente humanos", como se ha descrito anteriormente, que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, variantes (incluyendo derivados) de moléculas de anticuerpo (p. ej., las regiones VH y/o regiones VL) descritas en el presente documento, cuyos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido SEMA4D o fragmento o variante del mismo. Pueden usarse técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-SEMA4D humano, incluyendo, entre otros, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por p Cr que produce sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la región VH de referencia, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, región VL, VLCDR1, VLCDR2, o VLCDR3.

En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas, discutidas adicionalmente a continuación. Como alternativa, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden identificarse selectivamente para actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad (p. ej., la capacidad de unirse a un polipéptido SEMA4D, p. ej., humana, murina, o tanto humana como murina SEMA4D). Tales variantes (o derivados de los mismos) de anticuerpos "humanos" o "completamente humanos" también pueden denominarse anticuerpos humanos o completamente humanos que son "optimizados" u "optimizados para unión al antígeno" e incluyen anticuerpos que tienen afinidad mejorada hacia el antígeno.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo o inmunoglobulina comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en los sistemas de vertebrado son relativamente bien entendidas. Véase, p. ej., Harlow y col. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoglobulina" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Aquellos expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (p. ej., Y1-y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG, o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) p.ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente perceptibles para el experto en la materia en vista de la presente divulgación y, por consiguiente, están dentro del ámbito de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulina están claramente dentro del ámbito de la presente invención, la siguiente discusión generalmente se dirigirá a la clase de IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina convencional comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos con peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos con peso molecular de 53.000-70.000. Las cuatro cadenas normalmente se unen por enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en la que las cadenas ligeras unen las cadenas pesadas empezando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras se clasifican o bien como kappa o bien como lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con cualquiera de una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan o bien por hibridomas, linfocitos B o bien por células huésped genomanipuladas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van de un extremo N-terminal en los extremos ahorquillados de la configuración en Y al extremo C-terminal en el final de cada cadena.

Las cadenas ligeras y pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente. En este sentido, se apreciará que los dominios variables de tanto las porciones de cadena ligera (VL o VK) como pesada (VH) determinan el reconocimiento del antígeno y la especificidad. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor de Fc, unión al complemento, y similares. Convencionalmente, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales desde el sitio de unión al antígeno o extremo amino-terminal del anticuerpo. La porción del extremo N-terminal es una región variable y en la porción del extremo C-terminal está una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden realmente el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se ha indicado anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos sobre antígenos. Es decir, se combinan el dominio VL y el dominio VH, o el subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (RDC) dentro de estos dominios variables, de un anticuerpo para formar la región variable que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de unión al antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno se define por tres RDC sobre cada una de las cadenas VH y VL. En algunos casos, p. ej., ciertas moléculas de inmunoglobulina derivadas de especies de camélido o genomanipuladas basándose en inmunoglobulinas de camélido, una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir en cadenas pesadas solo, sin cadenas ligeras. Véase, p. ej., Hamers-Casterman y col., Nature 363:446-448 (1993).

En anticuerpos que de origen natural, las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "RDC" presentes en cada dominio de unión al antígeno son secuencias no contiguas cortas de aminoácidos que están específicamente situadas para formar el dominio de unión al antígeno a medida que el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión al antígeno, denominados regiones "marco conservadas", muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco conservadas adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las RDC forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. De este modo, las regiones marco conservadas actúan formando un armazón que proporciona el posicionamiento de las RDC en orientación correcta por interacciones intercatenarias, no covalentes. El dominio de unión al antígeno formado por las RDC colocadas define una superficie complementaria al epítopo sobre el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo cognado. Los aminoácidos que comprenden las RDC y las regiones marco conservadas, respectivamente, pueden ser fácilmente identificadas para cualquier dominio variable de la cadena pesada o ligera dado por un experto en la materia, ya que han sido definidas con precisión (véase más adelante).

En el caso en el que haya dos o más definiciones de un término que se usa y/o está aceptado dentro de la materia, la definición del término como se usa en el presente documento tiene por objeto incluir todos los significados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de la complementariedad" ("RDC") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de tanto polipéptidos de cadena pesada como ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat y col. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" y por Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), en el que las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de restos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquier definición para referirse a una RDC de un anticuerpo o variantes del mismo tiene por objeto estar dentro del ámbito del término que se define y se usa en el presente documento. Los restos de aminoácidos apropiados que abarcan las RDC como se define por cada una de las referencias anteriormente citadas se exponen a continuación en la Tabla 1 como una comparación. Los números exactos de restos que abarcan una RDC particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la RDC. Los expertos en la materia pueden determinar rutinariamente qué restos comprenden una RDC particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla 1. Definiciones de RDC1

Kabat y col. también definieron un sistema de numeración para secuencias del dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia del dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat y col. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest". A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de las posiciones de restos aminoácidos específicos en un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo son según el sistema de numeración de Kabat.

Anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados del mismo incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, anticuerpos humanos, humanizados, primatizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de unión al epítopo, p. ej., Fab, Fab' y F(ab')², Fd, Fvs, Fv monocatenarios (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden ya sea un dominio VL o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, p. ej., anticuerpos anti-Id para los anticuerpos anti-SEMA4D desvelados en el presente documento). Las moléculas de scFv son conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en la patente de EE.UU. n.° 5.892.019. Las moléculas de inmunoglobulina o de anticuerpo pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2, etc.), o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de la inmunoglobulina. En ciertas realizaciones, un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio VH, un dominio CH1, un dominio bisagra (p. ej., región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento de los mismos. Por ejemplo, un polipéptido de unión puede comprender una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH2; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH3, o una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido comprende una cadena de polipéptidos que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (p. ej., la totalidad o parte de un dominio CH2). Como se ha expuesto anteriormente, un experto en la materia entenderá que estos dominios (p. ej., las porciones de cadena pesada) pueden modificarse de forma que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de origen natural.

En ciertos anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos desvelados en el presente documento, las porciones de cadena pesada de una cadena de polipéptidos de un multímero son idénticas a aquellas en una segunda cadena de polipéptidos del multímero. Como alternativa, los monómeros que contienen una porción de cadena pesada no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión a diana diferente que forma, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico.

Las porciones de cadena pesada de una molécula de unión para su uso en los procedimientos desvelados en el presente documento pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio Ch¹derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de la inmunoglobulina, p. ej., una cadena ligera kappa o lambda. Preferentemente, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio VL o CL.

Anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos desvelados en el presente documento pueden describirse o especificarse en términos del (de los) epítopo(s) o porción(es) de un antígeno, p. ej., un polipéptido diana desvelado en el presente documento (p. ej., SEMA4D) que reconocen o al que se unen específicamente. La porción de un polipéptido diana que interacciona específicamente con el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo es un "epítopo", o un "determinante antigénico". Un polipéptido diana puede comprender un único epítopo, pero normalmente comprende al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier número de epítopos, dependiendo del tamaño, conformación y tipo de antígeno. Además, debe observarse que un "epítopo" sobre un polipéptido diana puede ser o puede incluir elementos no polipeptídicos, p. ej., un epítopo puede incluir una cadena lateral de carbohidrato.

Se cree que el tamaño mínimo de un epítopo de péptido o polipéptido para un anticuerpo tiene aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos de péptido o polipéptido preferentemente contienen al menos siete, más preferentemente al menos nueve y, lo más preferentemente, entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Ya que una RDC puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan ser contiguos, y en algunos casos, incluso pueden no estar en la misma cadena de péptido. Un epítopo de péptido o polipéptido reconocido por los anticuerpos anti-SEMA4D puede contener una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferentemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de SEMA4D.

Por "se une específicamente a" significa generalmente que un anticuerpo se une a un epítopo mediante su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica una determinada complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. Según esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, mediante su dominio de unión al antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo no relacionado aleatorio. El término "especificidad" se usa en el presente documento para limitar la afinidad relativa por la que un cierto anticuerpo se une a un cierto epítopo. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo "A" tiene una especificidad más alta para un epítopo dado que el anticuerpo "B", o puede decirse que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una especificidad más alta que la que tiene para el epítopo "D" relacionado.

Por "se une preferentemente", significa que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo, o análogo. De este modo, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado se uniría más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, incluso cuando tal anticuerpo puede reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado.

A modo de ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une a dicho primer epítopo con una constante de disociación (Kd) que es inferior a la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud inferior a la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior a la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo.

En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una constante de disociación (k(dis)) que es inferior a la (k(dis)) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud inferior a la (k(dis)) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud inferior a la (k(dis)) del anticuerpo para el segundo epítopo. Se puede decir que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en el presente documento se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento (por ejemplo, SEMA4D, por ejemplo, SEMA4D humano, murino o tanto humano como murino) o un fragmento o variante del mismo con una tasa de disociación (k(dis) menor o igual a 5 X 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5 X 10-3 seg-1 o 10-3 seg-1. Más preferentemente, se puede decir que un anticuerpo se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento (por ejemplo, SEMA4D, por ejemplo, SEMA4D humano, murino o tanto humano como murino) o un fragmento o variante del mismo con una tasa de disociación (k(dis)) menor que o igual a 5 X 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 X 10-5 seg-1, o 10-5 seg-1, 5 X 10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 X 10-7 seg-1 o 10-7 seg-1.

Se puede decir que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en el presente documento se une a un polipéptido diana descrito el presente documento (por ejemplo, SEMA4D, por ejemplo, SEMA4D humano, murino o SEMA4D tanto humano como murino) o un fragmento o una variante del mismo con una tasa de asociación (k(as)) mayor o igual a 103 M-1 seg-1, 5 X 103 M-1 seg-1, 104 M-1 seg-1 o 5 X 104 M-1 seg-1. Más preferiblemente, se puede decir que un anticuerpo se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento (por ejemplo, SEMA4D, por ejemplo, SEMA4D humano, murino o tanto humano como murino) o un fragmento o variante del mismo con una tasa de asociación (k(as)) mayor igual o superior a 105 M-1 seg-1, 5 X 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, o 5 X 106 M-1 seg-1 o 107 M-1 seg-1.

Se dice que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferencialmente a ese epítopo hasta el punto que bloquee, en cierta medida, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competición. Puede decirse que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos 90 %, al menos 80 %, al menos 70 %, al menos 60 % o al menos 50 %.

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a una medida de la resistencia de la unión de un epítopo individual con la RDC de una molécula de inmunoglobulina. Véase, p. ej., Harlow y col. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed.) páginas 27-28. Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la estabilidad total del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la resistencia de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulinas con el antígeno. Véase, p. ej., Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos, como también las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería una de alta avidez.

Los anticuerpos anti-SEMA4D o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en el presente documento, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, para reaccionar con un segundo antígeno; una medida de conexión entre dos sustancias antigénicas diferentes. De este modo, un anticuerpo es reactivo de forma cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo reactivo de forma cruzada contiene generalmente muchas de las mismas características estructurales complementarias al igual que el epítopo inductor, y en algunos casos, puede en realidad adaptarse mejor que el original.

Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen un determinado grado de reactividad cruzada, porque se unen a epítopos relacionados, pero no idénticos, p. ej., epítopos con al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 65 %, al menos 60 %, al menos 55 %, y al menos 50 % de identidad (como se calcula usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopos con menos de 95 %, menos de 90 %, menos de 85 %, menos de 80 %, menos de 75 %, menos de 70 %, menos de 65 %, menos de 60 %, menos de 55 %, y menos de 50 % de identidad (como se calcula usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede ser considerado "altamente específico" para un cierto epítopo, si no se une a ningún otro análogo, ortólogo, u homólogo de ese epítopo.

Las moléculas de unión anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos, también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un polipéptido, p. ej., SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 * 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 * 10-5 M, 10-5 M, 5 * 10-6 M, 10-6 M, 5 * 10-7 M, 10-7 M, 5 * 10-8 M, 10-8 M, 5 * 10-9 M, 10-9 M, 5 * 10-10 M, 10-10 M, 5 * 10-11 M, 10-11 M, 5 * 10-12 M, 10-12 M, 5 * 10-13 M, 10-13 M, 5 * 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, o 10 15 M. En ciertas realizaciones, la molécula de unión anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, se une a SEMA4D humana con una Kd de aproximadamente 5 x 10-9 a aproximadamente 6 x 10 9 En otra realización, la molécula de unión anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, se une a SEMA4D murina con una Kd de aproximadamente 1 x 10-9 a aproximadamente 2 x 10-9.

Como se usa en el presente documento, se mantendrá que el término "anticuerpo quimérico" significa cualquier anticuerpo en el que la región inmunorreactiva o sitio se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, parcial o modificada de acuerdo con la presente invención) se obtiene de una segunda especie. En algunas realizaciones, la región de unión diana o sitio será de una fuente no humana (p. ej., ratón o primate) y la región constante es humana.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo genomanipulado" se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable en cualquiera de la cadena pesada o ligera o ambas está alterado por un reemplazo al menos parcial de una o más RDC de un anticuerpo de especificidad conocida y, si es necesario, por reemplazo de la región marco conservada parcial y cambio de secuencia. Aunque las RDC pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que se derivan las regiones marco conservadas, se prevé que las RDC se deriven de un anticuerpo de clase diferente y preferentemente de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo genomanipulado en el que una o más RDC "donantes" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida se injertan en una región marco conservada de la cadena pesada o ligera humana se denomina en el presente documento "anticuerpo humanizado". Puede no ser necesario reemplazar todas las RDC con las RDC completas del dominio variable del donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, puede ser necesario solo transferir aquellos restos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a diana.

Se reconoce además que las regiones marco conservadas dentro del dominio variable en una cadena pesada o ligera, o ambas, de un anticuerpo humanizado pueden comprender únicamente restos de origen humano, en cuyo caso estas regiones marco conservadas del anticuerpo humanizado se denominan "regiones marco conservadas completamente humanas" (por ejemplo, MAb XV15/2503, desvelado en la publicación de solicitud de patente de EE. Uu. n.° US 2010/0285036 A l como AM 2503). Como alternativa, uno o más restos de la(s) región(es) marco conservada(s) del dominio variable del donante pueden genomanipularse en la posición correspondiente de la(s) región(es) marco conservada(s) de un dominio variable en una cadena pesada o ligera, o ambas, de un anticuerpo humanizado si fuera necesario para mantener la unión apropiada o para mejorar la unión al antígeno SEMA4D. Una región marco conservada humana que ha sido genomanipulada de esta manera comprendería por tanto una mezcla de restos de la región marco conservada humanos y de donante, y se denomina en el presente documento "región marco conservada parcialmente humana".

Por ejemplo, la humanización de un anticuerpo anti-SEMA4D puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo RDC de roedor o de roedor mutante o secuencias de RDC con las secuencias correspondientes de un anticuerpo anti-SEMA4D humano. Véanse también las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. El anticuerpo anti-SEMA4D humanizado resultante comprendería al menos una RDC de roedor o de roedor mutante dentro de las regiones marco conservadas completamente humanas del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo humanizado. En algunos casos, restos dentro de las regiones marco conservadas de uno o más dominios variables del anticuerpo anti-SEMA4D humanizado están sustituidos con restos no humanos correspondientes (por ejemplo, de roedor) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370), en cuyo caso el anticuerpo anti-SEMA4D humanizado resultante comprendería regiones marco conservadas parcialmente humanas dentro del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera.

Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo (p. ej., para obtener afinidad deseada). En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las RDC se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones marco conservadas son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones y col., Nature 331:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" pueden incluir anticuerpos en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de RDC y posiblemente algunos restos de la región marco conservada están sustituidos con restos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Véanse también la patente de EE. UU. n.° 6.180.370 y la publicación internacional n.° WO 01/27160, en la se desvelan anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos humanizados que tienen afinidad mejorada para un antígeno predeterminado.

II. Células madre/precursoras neurales o células madre/progenitoras neurales (NSPC)

La neurogénesis se refiere generalmente a la producción de nuevas neuronas. Tradicionalmente, se pensaba que la neurogénesis ocurría solo durante los períodos embrionario y postnatal temprano y que no tenía un papel significativo en el cerebro adulto. En años recientes, sin embargo, se ha postulado que la neurogénesis ocurre en regiones seleccionadas del cerebro de mamíferos adultos y puede ser estimulada en estas y otras regiones en respuesta a una lesión.

Durante el desarrollo del sistema nervioso central y del sistema nervioso periférico, las células madre neurales proliferan y se dividen en células progenitoras que eventualmente se diferencian en tipos de células que componen el cerebro adulto. Las células derivadas del tubo neural dan lugar a las neuronas y la glía del SNC, mientras que las células derivadas de la cresta neural dan lugar a las células del sistema nervioso periférico (SNP).

Las células madre/progenitoras neurales y su uso terapéutico se han descrito en la técnica, por ejemplo, véase la patente de EE.UU. N.° 6.638.501, Bjornson y col.; la Patente de EE.UU. N.° 6.541.255, Snyder y col.; la Patente de EE.UU. N.° 6.498.018, Carpenter; la solicitud de patente de EE.UU. 20020012903, Goldman y col.; Palmer y col. (2001) Nature 411 (6833): 42-3; Palmer y col. (1997) Mol Cell Neurosci. 8 (6): 389-404; Svendsen y col. (1997) Exp. Neurol.

148 (1): 135-46 y Shihabuddin (1999) Mol Med Today. 5 (11): 474-80. También se conocen en la técnica procedimientos para el aislamiento y cultivo de células madre neurales, véase la patente de EE.UU. N.° 6.777.233; la Patente de EE.UU. N.° 6.497.872 y la Solicitud de patente de EE.UU. 20030143737A1.

Las células madre y precursoras neurales participan en el desarrollo normal a través de la migración a lo largo de rutas migratorias bien establecidas hacia regiones diseminadas del SNC, la diferenciación en tipos de células en respuesta a señales microambientales y la interrelación con los progenitores del hospedador y su progenie. Las células madre neurales humanas son capaces de expresar transgenes extraños in vivo en estos lugares diseminados. Como tales, estas células tienen el potencial de usarse para tratar una variedad de afecciones que afectan al SNC, incluidos trastornos degenerativos (por ejemplo, Alzheimer y Parkinson), lesión cerebral aguda (por ejemplo, ictus, lesión en la cabeza, parálisis cerebral) y una gran cantidad de enfermedades del SNC. disfunciones (por ejemplo, depresión, epilepsia y esquizofrenia).

En los últimos años, la enfermedad neurodegenerativa se ha convertido en una preocupación importante debido a la creciente población de ancianos que tiene un mayor riesgo de padecer estos trastornos. Estas enfermedades, que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Parkinson, se han relacionado con la degeneración de las células neurales en ubicaciones particulares del SNC, lo que lleva a la incapacidad de estas células o de la región del cerebro para llevar a cabo su función prevista.

La degeneración en una región del cerebro conocida como ganglios basales puede conducir a enfermedades con diversos síntomas cognitivos y motores, dependiendo de la ubicación exacta. Los ganglios basales constan de muchas regiones separadas, incluido el cuerpo estriado (que consta del caudado y el putamen), el globo pálido, la sustancia negra, la sustancia innominada, el paladio ventral, el núcleo basal de Meynert, el área tegmental ventral y el núcleo subtalámico.

En la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, hay degeneración celular del prosencéfalo y la corteza cerebral. Además, parece haber una degeneración localizada en un área de los ganglios basales, el núcleo basal de Meynert. Este núcleo normalmente envía proyecciones colinérgicas a la corteza cerebral que se cree que participan en funciones cognitivas, incluida la memoria. En la Corea de Huntington, por otro lado, hay degeneración de neuronas en el cuerpo estriado, lo que conduce a movimientos espasmódicos involuntarios en el hospedador. En la enfermedad de Parkinson, además, se observa degeneración en otra área de los ganglios basales, la sustancia negra par compacta. Esta área normalmente envía conexiones dopaminérgicas al cuerpo estriado dorsal que son importantes para regular el movimiento. La terapia para la enfermedad de Parkinson se ha centrado en restaurar la actividad dopaminérgica en este circuito. También es posible la degeneración de otras regiones de los ganglios basales. Por ejemplo, la degeneración de una pequeña región llamada núcleo subtalámico se asocia con movimientos violentos de empuje de las extremidades en una afección llamada balismo, mientras que la degeneración en el putamen y el globo pálido se asocia con una afección de movimientos de contorsión lentos o atetosis.

Además de las enfermedades neurodegenerativas, las lesiones cerebrales agudas a menudo dan como resultado la pérdida de células neurales, funcionamiento inadecuado de la región cerebral afectada y anomalías de comportamiento posteriores. Además de la pérdida de células, un individuo puede sufrir un funcionamiento anormal de las células neurales existentes. Esto puede deberse a una activación inapropiada de neuronas o a la síntesis, liberación y procesamiento anormales de neurotransmisores. Estas disfunciones pueden ser el resultado de trastornos bien estudiados y caracterizados, como la depresión y la epilepsia, o trastornos menos comprendidos, como la neurosis y la psicosis. Otras formas de deterioro neurológico pueden ocurrir como resultado de la degeneración neural, como la esclerosis lateral amiotrófica y la parálisis cerebral, o como resultado de un traumatismo más agudo del SNC, como el que ocurre en la lesión cerebral traumática (TBI) y el ictus.

III. Descripción de polipéptidos diana

Como se usa en el presente documento, los términos "semaforina-4D", "SEMA4D" y "polipéptido SEMA4D"se usan indistintamente, como son "SEMA4D" y "Sema4D". En ciertas realizaciones, SEMA4D es expresada sobre la superficie de o es secretada por una célula. En otra realización, SEMA4D está unida a una membrana. En otras realizaciones, SEMA4D es soluble, p. ej., SEMA4Ds. En otras realizaciones, SEMA4D puede incluir una SEMA4D de tamaño completo o un fragmento del mismo, o un polipéptido de variante SEMA4D, en el que el fragmento de SEMA4D o polipéptido de variante SEMA4D retiene alguna o todas las propiedades funcionales de SEMA4D de tamaño completo.

La proteína humana SEMA4D de tamaño completo es una proteína transmembrana homodimérica que consiste en dos cadenas de polipéptidos de 150 kDa. SEMA4D pertenece a la familia de la semaforina de los receptores de la superficie celular y también se denomina CD100. Tanto SEMA4D/Sema4D humana como de ratón son escindidas proteolíticamente de su forma transmembrana para generar formas solubles de 120 kDa, lo que indica la existencia de dos isoformas de Sema4D (Kumanogoh y col., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)). Las semaforinas consisten en proteínas solubles y unidas a membrana que fueron originalmente definidas como factores de guía axonal durante el desarrollo que desempeñan un papel importante en el establecimiento de conexiones precisas entre neuronas y su diana apropiada. Estructuralmente considerada una semaforina de clase IV, la SEMA4D consiste en una secuencia señal del extremo amino-terminal seguida de un dominio "Sema" característico, que contiene 17 restos de cisteína conservados, un dominio similar a Ig, un tramo rico en lisina, una región transmembrana hidrófoba, y una cola citoplásmica.

Cada cadena polipeptídica de SEMA4D incluye una secuencia señal de aproximadamente 13 aminoácidos seguida por un dominio de semaforina de aproximadamente 512 aminoácidos, un dominio similar a inmunoglobulina (similar a Ig) de aproximadamente 65 aminoácidos, un tramo rico en lisina de 104 aminoácidos, una región transmembrana hidrófoba de aproximadamente 19 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 110 aminoácidos. Un sitio consenso para la fosforilación de tirosina en la cola citoplásmica soporta la asociación prevista de SEMA4D con una tirosina quinasa (Schlossman, y col., Eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford).

Se sabe que SEMA4D tiene al menos tres receptores: plexina-B1, plexina-B2 y CD72. Uno de los receptores, plexina-B1, se expresa en tejidos no linfoides y se ha mostrado que es un receptor de alta afinidad (1 nM) para SEMA4D (Tamagnone y col., Cell 99:71-80 (1999)). En ciertas realizaciones, las células endoteliales expresan plexina-B1. Se ha mostrado que la estimulación por SEMA4D de la señalización de plexina-B1 induce el colapso del cono de crecimiento de neuronas, e induce el colapso de la extensión del proceso y la apoptosis de oligodendrocitos (Giraudon y col., J. Immunol. 172:1246-1255 (2004); Giraudon y col., NeuroMolecular Med. 7:207-216 (2005)). Después de la unión a SEMA4D, la señalización de plexina-B1 media en la inactivación de R-Ras, dando lugar a una disminución en la fijación mediada por integrina a la matriz extracelular, y también puede dar como resultado la activación de RhoA, dando lugar a un colapso celular por la reorganización del citoesqueleto. Véase Kruger y col., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64 (2005)). La plexina-B2 tiene una afinidad intermedia con SEMA4D un informe reciente indica que la PLXNB2 se expresa en queratinocitos y activa los linfocitos T y6 positivos en SEMA4D para contribuir a la reparación epitelial (Witherden y col., Immunity. 24 de agosto de 2012; 37(2):314-25).

En tejidos linfoides se usa CD72 como un receptor de baja afinidad (300 nM) de SEMA4D (Kumanogoh y col., Immunity 13:621-631 (2000)). Los linfocitos B y las CPA expresan CD72, y los anticuerpos anti-CD72 tienen muchos de los mismos efectos que SEMA4Ds, tales como el potenciamiento de las respuestas de linfocitos B inducidas por CD40 y la liberación de linfocitos B de CD23. Se cree que CD72 actúa como regulador negativo de las respuestas de linfocitos B reclutando la tirosina fosfatasa SHP-1, que puede asociarse con muchos receptores inhibidores. La interacción de SEMA4D con CD72 da como resultado la disociación de SHP-1, y la pérdida de esta señal de activación negativa. Se ha demostrado que SEMA4D promueve la estimulación de linfocitos T y la agregación de linfocitos B y la supervivencia in vitro. La adición de células que expresan SEMA4D o SEMA4Ds potencia la proliferación de linfocitos B inducida por CD40 y la producción de inmunoglobulina in vitro, y acelera las respuestas de anticuerpos in vivo (Ishida y col., Inter. Immunol. 15:1027-1034 (2003); Kumanogoh y H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)). La SEMA4Ds potencia la maduración inducida por CD40 de CD, que incluye la regulación positiva de moléculas coestimuladoras y el aumento de la secreción de IL-12. Además, SEMA4Ds puede inhibir la migración de células inmunitarias, que puede invertirse mediante la adición de anticuerpos de bloqueo anti-SEMA4D (Elhabazi y col., J. Immunol. 166:4341-4347 (2001); Delaire y col., J. Immunol. 166:4348-4354 (2001)).

Sema4D se expresa a altos niveles en órganos linfoides, que incluyen el bazo, timo y ganglios linfáticos, y en órganos no linfoides, tales como el cerebro, corazón y riñón. En órganos linfoides, Sema4D se expresa abundantemente en linfocitos T en reposo, pero solo se expresa débilmente en linfocitos B en reposo y células presentadoras de antígenos (CPA), tales como células dendríticas (CD).

La activación celular aumenta la expresión superficial de SEMA4D, así como la generación de SEMA4D soluble (SEMA4Ds). El patrón de expresión de SEMA4D sugiere que desempeña un papel fisiológico importante, así como patológico en el sistema inmunitario. Se ha mostrado que SEMA4D promueve la activación, agregación y supervivencia de linfocitos B; potencia la proliferación inducida por CD40 y la producción de anticuerpos; potencia la respuesta de anticuerpos a antígenos dependientes de linfocitos T; aumenta la proliferación de linfocitos T; potencia la maduración de células dendríticas y la capacidad para estimular linfocitos T; y está directamente implicada en la desmielinización y degeneración axonal (Shi y col., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh y col., J Immunol 169:1175-1181 (2002); y Watanabe y col., J Immunol 167:4321-4328 (2001)).

Los ratones nuligénicos SEMA4D (SEMA4D-/-) han proporcionado evidencia adicional de que SEMA4D desempeña un papel importante tanto en las respuestas inmunitarias humorales como celulares. No se conocen anomalías importantes de tejidos no linfoides en ratones SEMA4D-/-. Las células dendríticas (CD) de los ratones SEMA4D-/-tienen una capacidad aloestimulante deficiente y muestran defectos en la expresión de moléculas coestimuladoras, que pueden ser rescatadas mediante la adición de SEMA4Ds. Los ratones deficientes en SEMA4D (SEMA4D-/-) dejan de desarrollar encefalitis autoinmunitaria experimental inducida por el péptido de glicoproteína de oligodendrocito de mielina, puesto que los linfocitos T específicos de la glicoproteína de oligodendrocito de mielina son deficientemente generados en ausencia de SEMA4D (Kumanogoh y col., J Immunol 169:1175-1181 (2002)). También se detecta una cantidad significativa de SEMA4D soluble en los sueros de ratones MRL/lpr propensos a la autoinmunidad (modelo de enfermedades autoinmunitarias sistémicas tales como LES), pero no en ratones normales. Además, los niveles de SEMA4Ds se correlacionan con niveles de auto-anticuerpos y aumentan con la edad (Wang y col., Blood 97:3498-3504 (2001)). También se ha mostrado que SEMA4D soluble se acumula en el líquido cefalorraquídeo y los sueros de pacientes con enfermedad desmielinizante, y SEMA4Ds induce la apoptosis de precursores neurales pluripotentes humanos (células de Dev), e inhibe tanto la extensión del proceso como induce la apoptosis de oligodendrocitos de rata in vitro (Giraudon y col., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)). Esta apoptosis fue bloqueada por un AM anti-SEMA4D.

IV. Anticuerpos anti-SEMA4D

Se han descrito en la materia anticuerpos que se unen a SEMA4D. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.496.938, las publicaciones estadounidenses n.° 2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1, y US 2006/0233793 A1, las solicitudes de patente internacional WO 93/14125, WO 2008/100995, y WO 2010/129917, y Herold y col., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995).

La divulgación generalmente se refiere a un procedimiento de promoción de la neurogénesis en un sujeto que tiene trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC, p. ej., un paciente humano, que comprende la administración de un anticuerpo que se une específicamente a SEMA4D, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo bloquea la interacción de SEMA4D con uno o más de sus receptores, p. ej., plexina-B1. Los anticuerpos anti-SEMA4D que tienen estas propiedades pueden usarse en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los anticuerpos que pueden usarse incluyen, entre otros, AM VX15/2503, 67, 76 y fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos que se describen completamente en el documento US 2010/0285036 A1. Anticuerpos adicionales que pueden usarse en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen el anticuerpo BD16 y BB18 descrito en el documento US 2006/0233793 A1, así como fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos; o cualquiera de AM 301, AM 1893, AM 657, AM 1807, AM 1656, AM 1808, AM 59, AM 2191, AM 2274, AM 2275, AM 2276, AM 2277, AM 2278, AM 2279, AM 2280, AM 2281, AM 2282, AM 2283, AM 2284, y AM 2285, así como cualquier fragmento, variante o derivado de los mismos como se describen en el documento US 2008/0219971 A1. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento se une a anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D. También son útiles anticuerpos que se unen al mismo epítopo como cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente y/o anticuerpos que inhiben competitivamente cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

A continuación se muestran las secuencias de aminoácidos de los genes de VH y VK del AM 67, con las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas.

VH de AM 67:

OVOLOOSGPELVKPGASVKISCKASGYSFSDYYMHWVKOSPENSLEWIGOINPTT GGASYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMOLKSLTSEESAVYYCTRYYYGRHFDVW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO; 1)

VK de AM 67:

d iv m t q s p a s l a v s l g q r a t is c k a s q s v d y d g d s y m n w y q q k p g q p p k l l iy a ASNLESGIPARFSGSGSCiTDFTLNI I i PVEEEDAATYYCOOSNEDPYTFGGGTKLEI K (SEQ ID NO: 2)

A continuación se muestran las secuencias de aminoácidos de VH (H2160) y VK (L553) del AM 67 con las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas.

Secuencia de H2160:

OVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFSDYYMHWVROAPGOGLEWMGOIN PTTGGASYNONFKGKATITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAYYYCARYYYGRHFD

yWGQG ITVTVSS (SEQ ID NO: 3)

Secuencia de L553:

DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKASOSVDYDGDSYMNWYOQKPGOPPKLLIYA

ASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOOSNEDPYTFGOGTKLEI

K (SEQ ID NO: 4)

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 89 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, o aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos para una molécula de anticuerpo anti-SEMA4D de referencia, por ejemplo VX15/2503 y 67 descritos anteriormente. En una realización adicional, la molécula de unión comparte al menos aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o 100 % de identidad de secuencia con un anticuerpo de referencia.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (dominio VH), en la que al menos una de las RDC del dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a c Dr 1, CDR2 o CDR3 de SEQ ID NO: 1 o 3.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (dominio VH), en la que al menos una de las RDC del dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (dominio VH), en la que al menos una de las RDC del dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto para 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos conservadas, con SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, en la que el anticuerpo anti-SEMA4D que comprende el dominio VH codificado se une específicamente o preferentemente a SEMA4D.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (dominio VL), en la que al menos una de las RDC del dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a CDR1, CDR2 o CDR3 de SEQ ID NO: 2 o 4.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (dominio VL), en la que al menos una de las RDC del dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o idéntica a la SEQ ID NO: 8, o la SEQ ID NO: 10.

En otra realización, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (dominio VL), en la que al menos una de las RDC del dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto para 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos conservadas, con SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID No : 10.

En una realización adicional, un anticuerpo anti-SEMA4D o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en la que el anticuerpo anti-SEMA4D que comprende el dominio VL codificado se une específicamente o preferentemente a SEMA4D.

También se incluyen para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento polipéptidos que codifican anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos descritos en el presente documento, polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, vectores que comprenden tales polinucleótidos, y células huésped que comprenden tales vectores o polinucleótidos, todo ello para producir anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento.

Variantes biológicamente activas adecuadas de los anticuerpos anti-SEMA4D pueden usarse en los procedimientos. Tales variantes retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti-SEMA4D parental. Procedimientos de producción de variantes de anticuerpo están generalmente disponibles en la técnica.

Procedimientos de mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel y col., Methods Enzymol.

154:367-382 (1987); Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); patente de EE.UU. n.° 4.873.192; y las referencias citadas en los mismos. La guía con respecto a sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés pueden encontrarse en el modelo de Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), págs. 345-352. El modelo de Dayhoff y col. usa la matriz de similitud de aminoácidos de mutación puntual aceptada (MPA) (matriz MPA 250) para determinar sustituciones de aminoácidos conservadoras adecuadas. Pueden ser preferibles las sustituciones conservadoras, tales como intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras como se enseñan por la matriz MPA 250 del modelo de Dayhoff y col., incluyen, entre otros, G ly^A la, Val^Ile^-Leu, Asp^G lu, Lys^Arg, Asn-^-Gln, y Phe^Trp^-Tyr.

En la construcción de variantes de la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, polipéptidos de interés, se hacen modificaciones de manera que las variantes continúan poseyendo las propiedades deseadas, p. ej., son capaces de unirse específicamente a una SEMA4D, p. ej., anticuerpos humanos, murina, o tanto humana como murina SEMA4D, p. ej., expresada sobre la superficie de o secretada por una célula y que tiene actividad de bloqueo de SEMA4D, como se describe en el presente documento. Obviamente, cualquier mutación realizada en el ADN que codifica el polipéptido de variante no debe colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no creará regiones complementarias que pudieran producir una estructura de ARNm secundaria. Véase la publicación de solicitud de patente EP n.° 75.444.

Procedimientos de medición de la especificidad de unión de la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, incluyen, entre otros, ensayos de unión competitiva convencionales, ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulinas por linfocitos T o linfocitos B, ensayos de proliferación de linfocitos T, ensayos de apoptosis, ensayos de ELISA, y similares. Véanse, por ejemplo, tales ensayos desvelados en el documento WO 93/14125; Shi y col., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh y col., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe y col., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang y col., Blood 97:3498-3504 (2001); y Giraudon y col., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004).

Cuando se discute el tema en el presente documento si cualquier polipéptido particular, que incluye las regiones constantes, RDC, dominios VH, o dominios VL desvelados en el presente documento, es al menos aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99%, o incluso aproximadamente 100% idéntico a otro polipéptido, el % de identidad puede determinarse usando procedimientos y programas informáticos/software conocidos en la técnica tales como, pero no se limitan a, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489, para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de polipéptidos de referencia y que se permiten huecos en la homología de hasta 5 % del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.

Para los fines de la presente divulgación, el porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afín con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferenciarse de un anticuerpo anti-SEMA4D de referencia (p. ej., AM VX15/2503, 67 o 76) en tan solo 1 a 15 restos de aminoácidos, en tan solo 1 a 10 restos de aminoácidos, tales como 6-10, en tan solo 5, en tan solo 4, 3, 2, o incluso 1 resto de aminoácido.

La región constante de un anticuerpo anti-SEMA4D puede ser mutada para alterar la función efectora de varias formas. Por ejemplo, véanse la patente de EE.UU. n.° 6.737.056B1 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132101A1, que desvelan mutaciones de Fc que optimizan la unión del anticuerpo a receptores de Fc.

En ciertos anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos útiles en los procedimientos proporcionados en el presente documento, la porción Fc puede ser mutada para reducir la función efectora usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de la región constante puede reducir la unión al receptor de Fc del anticuerpo modificado circulante aumentando así la localización tumoral. En otros casos, modificaciones de la región acorde con la presente invención moderan la unión del complemento y reducen por tanto la semivida en suero. Pueden usarse otras modificaciones de la región constante para modificar los enlaces disulfuro o fracciones de oligosacárido que permiten la localización mejorada debido a la elevada especificidad por antígenos o flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización del tumor, biodistribución y semivida en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente usando técnicas inmunológicas muy conocidas sin experimentación indebida.

Los anticuerpos anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen derivados que se modifican, p. ej., por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de modo que la unión covalente no prevenga que el anticuerpo se una específicamente al epítopo cognado. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificado, p. ej., mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, entre otros, escisiones químicas específicas, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden identificarse selectivamente para actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad (p. ej., la capacidad de unirse a un polipéptido anti-SEMA4D, para bloquear la interacción de SEMA4D con su receptor, o para promover la neurogénesis en un sujeto).

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solo en regiones marco conservadas o solo en regiones RDC de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones sustitutivas silenciosas o neutras, es decir, no tienen, o tienen poco efecto sobre la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones, o mejorar la producción de anticuerpos del hibridoma. Como alternativa, mutaciones sustitutivas no neutras pueden alterar la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Un experto en la materia sería capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como sin alteración en la actividad de unión al antígeno o alteración en la actividad de unión (p. ej., mejoras en la actividad de unión al antígeno o cambio en la especificidad del anticuerpo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse rutinariamente y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada, (p. ej., la capacidad para unirse inmunoespecíficamente a al menos un epítopo de un polipéptido SEMA4D) puede determinarse usando técnicas descritas en el presente documento o modificando rutinariamente técnicas conocidas en la técnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (RDC) optimizada. Por "RDC optimizada" se tiene por objeto que la RDC se haya modificado y optimizado para mejorar la afinidad de unión y/o actividad anti-SEMA4D que se imparte a un anticuerpo anti-SEMA4D que comprende la RDC optimizada. "Actividad anti-SEMA4D" o "actividad de bloqueo de SEMA4D" puede incluir actividad que modula una o más de las siguientes actividades asociadas con SEMA4D: activación, agregación y supervivencia de linfocitos B; proliferación inducida por CD40 y la producción de anticuerpos; respuesta de anticuerpos a antígenos dependientes de linfocitos T; proliferación de linfocitos T u otras células inmunitarias; maduración de células dendríticas; desmielinización y degeneración axonal; apoptosis de precursores neurales pluripotentes y/u oligodendrocitos; inducción de migración de células endoteliales; inhibición de la migración espontánea de monocitos; unión a plexina-BI de la superficie celular u otro receptor; o cualquier otra asociación de actividad con SEMA4D soluble o SEMA4D que se expresa sobre la superficie de células SEMA4D+. La actividad anti-SEMA4D también puede atribuirse a una disminución en la incidencia o gravedad de enfermedades asociadas con la expresión de SEMA4D, incluyendo, entre otros, ciertos tipos de cánceres, incluyendo linfomas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, que incluyen enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central (SNC) y del sistema nervioso periférico (SNP), rechazos de trasplantes y angiogénesis invasiva. Ejemplos de anticuerpos optimizados basados en los AM anti-SEMA4D BD16 y BB18 murinos, se describieron en la publicación de EE. UU. n.° 2008/0219971 A1, solicitudes de patente internacional WO 93/14125 y Herold y col., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995). Las modificaciones pueden implicar el reemplazo de restos de aminoácidos dentro de la RDC de modo que un anticuerpo anti-SEMA4D retiene la especificidad para el antígeno SEMA4D y tiene afinidad de unión mejorada y/o actividad anti-SEMA4D mejorada.

En determinadas realizaciones, la molécula de unión de la divulgación, por ejemplo, un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la actividad de SEMA4D y/o la interacción de SEMA4D con un receptor de SEMA4D o una parte del mismo. En determinadas realizaciones, la actividad de SEMA4D inhibida incluye uno o más de los siguientes: activación, agregación y/o supervivencia de linfocitos B; Proliferación inducida por CD40 y/o producción de anticuerpos; respuesta de anticuerpos a antígenos dependientes de linfocitos T; Proliferación de linfocitos T u otras células inmunes; maduración de células dendríticas; desmielinización y degeneración axonal; apoptosis de precursores neurales pluripotentes y/u oligodendrocitos; inducción de la migración de células endoteliales; inhibición de la migración espontánea de monocitos; dimerización de SEMA4D; unión a la superficie celular de Plexina-B1 u otro receptor, o cualquier otra actividad asociada con SEMA4D o SEMA4D soluble que se exprese en la superficie de las células SEMA4D+.

"Inhibidores", como se usa en el presente documento, puede incluir el bloqueo parcial o completo de, por ejemplo, unión, actividad, función, interacción u otra característica medible.

V. Procedimientos de tratamiento utilizando anticuerpos terapéuticos anti-SEMA4D

Los procedimientos de la divulgación están dirigidos al uso de moléculas de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, anticuerpos, que incluyen fragmentos de unión a antígeno, variantes y derivados de los mismos, para promover la neurogénesis en un sujeto que tiene trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC. Aunque la siguiente discusión se refiere a la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D, los procedimientos desvelados en el presente documento son también aplicables a los fragmentos de unión a antígeno, variantes y derivados de estos anticuerpos anti-SEMA4D que conservan las propiedades deseadas de los anticuerpos anti-SEMA4D, por ejemplo, capaces de unirse específicamente a SEMA4D, por ejemplo, SEMA4D humano, de ratón o humano y de ratón, que tiene actividad neutralizante de SEMA4D y/o bloquea la interacción de SEMA4D con su receptor, por ejemplo, plexina-B1.

En una realización, el tratamiento incluye la aplicación o administración a un paciente de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se describe en el presente documento a un paciente, en el que el paciente tiene, o tiene el riesgo de desarrollar trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas, y ciertas disfunciones del SNC. En otra realización, el tratamiento también pretende incluir la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo a un paciente, en el que el paciente tiene, o tiene el riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC.

En una realización, la composición farmacéutica que comprende la molécula de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a un paciente, puede administrarse en cualquier forma convencional, incluida cualquier forma conocida en la técnica en la que pueda pasar a través de la barrera hematoencefálica (es decir, actúa en el lado del cerebro). Debido a la interacción de SEMA4D con un receptor en los astrocitos, que son células residentes en el cerebro importantes para el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica, la aplicación o administración de la molécula de unión anti-SEMA4D puede ocurrir en el lado del cerebro de la barrera hematoencefálica. para bloquear la interacción de SEMA4D con su receptor en los astrocitos. Los procedimientos para permitir que los factores atraviesen la barrera hematoencefálica incluyen minimizar el tamaño del factor, proporcionar factores hidrófobos que pueden atravesar más fácilmente, conjugar el agente modulador con una molécula de vehículo que tiene un coeficiente de permeabilidad sustancial a través de la barrera hematoencefálica.

En otra realización, la composición farmacéutica que comprende la molécula de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un paciente, puede administrarse en cualquier forma convencional, incluida cualquier forma conocida en la técnica en la que pueda hacer un bypass de la barrera hematoencefálica (es decir, actúa en el lado de la sangre). Debido a la interacción de SEMA4D con un receptor en las células endoteliales, la aplicación o administración de una molécula de unión anti-SEMA4D puede ocurrir en el lado de la sangre de la barrera hematoencefálica. Administrando una molécula de unión anti-SEMA4D por una ruta que la expone al lado de la sangre, por ejemplo incluyendo, pero sin limitarse a, administración intravenosa, se permitirá que la molécula de unión anti-SEMA4D inhiba la interacción de SEMA4D con el receptor SEMA4D o una porción del receptor que es expresada por las células endoteliales. En otra realización, la barrera hematoencefálica puede evitarse, por ejemplo, mediante la transfección in vivo de células con vectores de expresión que contienen genes que codifican factores de crecimiento, de modo que las propias células produzcan el factor. Cualquier modificación genética útil de las células está dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, además de la modificación genética de las células para expresar factores de crecimiento, las células pueden modificarse para expresar otros tipos de agentes neurológicos tales como neurotransmisores. Preferiblemente, la modificación genética se realiza por infección de las células que recubren las regiones ventriculares con retrovirus recombinantes o por transfección usando procedimientos conocidos en la técnica.

Las moléculas de unión a anti-SEMA4D, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos como se describe en el presente documento, son útiles para el tratamiento de diversos trastornos del sistema nervioso central, tales como trastornos del sistema nervioso central, tal como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuoinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC. En algunas realizaciones, el tratamiento de los trastornos del sistema nervioso central tales como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC está pensado para incluir la promoción de la neurogénesis. En otras realizaciones, el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central tales como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC pretende incluir una proliferación en aumento de células progenitoras. En otras realizaciones, el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central tales como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC pretende potenciar la diferenciación de células progenitoras. el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central tales como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC pretende aumentar la supervivencia de células precursoras o progenitoras.

En una realización, la divulgación se refiere al uso de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos, como un medicamento, en particular para su uso en el tratamiento o la profilaxis de trastornos del sistema nervioso central, tales como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC para promover la neurogénesis aumentando la proliferación, potenciando la diferenciación, y/o aumentando la supervivencia de células precursoras o progenitoras. En ciertas realizaciones, el procedimiento de la solicitud aumenta el número de, potencia la diferenciación de y/o aumenta la supervivencia de células progenitoras.

Según los procedimientos de la presente divulgación, al menos una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante, o derivado del mismo, tal como se define en alguna parte del presente documento, puede usarse para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto a trastornos del sistema nervioso central tales como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC.

Una "respuesta terapéutica positiva" con respecto al trastorno del sistema nervioso central pretende incluir una mejora en la enfermedad en asociación con la actividad antiinflamatoria, la actividad antiangiogénica, la actividad antiapoptótica o similares, de estos anticuerpos y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, se puede observar un efecto antiproliferativo, la prevención de una mayor proliferación de la célula que expresa SEMA4D o el receptor que expresa la célula para SEMA4D, una reducción en la respuesta inflamatoria que incluye, entre otros, la reducción de la secreción de citocinas inflamatorias, moléculas de adhesión, proteasas, inmunoglobulinas (en los casos en que la célula portadora del receptor SEMA4D o SEMA4D es un linfocito B), combinaciones de las mismas y similares, aumento de la producción de proteínas antiinflamatorias, reducción del número de células autorreactivas, aumento de la tolerancia inmunitaria, inhibición de la supervivencia de las células autorreactivas, la reducción de la apoptosis, la reducción de la migración de células endoteliales, el aumento de la migración espontánea de monocitos, la reducción y/o la disminución de uno o más síntomas mediados por la estimulación de células que expresan sSEMA4D o SEMA4D. Dichas respuestas terapéuticas positivas no se limitan a la vía de administración y pueden comprender la administración al donante, el tejido del donante (como por ejemplo la perfusión de órganos), el huésped, cualquier combinación de los mismos y similares. En particular, los procedimientos proporcionados en el presente documento están dirigidos a inhibir, prevenir, reducir, aliviar o disminuir el desarrollo de un trastorno neuroinflamatorio en un paciente. Así, por ejemplo, una mejora en la enfermedad puede caracterizarse como una ausencia de síntomas clínicamente observables, un aumento en la proliferación, diferenciación y/o supervivencia de las células precursoras o progenitoras. Las moléculas de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de las mismas, pueden usarse en combinación con al menos uno o más de otros tratamientos para trastornos neuroinflamatorios; cuando la terapia adicional se administra antes, durante o después de la molécula de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, la terapia de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado de la misma. Por lo tanto, cuando las terapias combinadas comprenden la administración de una molécula de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, en combinación con la administración de otro agente terapéutico, los procedimientos de la divulgación abarcan la coadministración, utilizando formulaciones o una sola formulación farmacéutica, con administración simultánea o consecutiva en cualquier orden,

VI. Composiciones farmacéuticas y procedimientos de administración

Los procedimientos de preparación y administración de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos a un sujeto en necesidad de los mismos son muy conocidos o son fácilmente determinados por aquellos expertos en la materia. La vía de administración de la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye, p. ej., administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Un ejemplo de una forma para administración sería una solución para inyección, en particular para inyección intravenosa o intraarterial o goteo. Una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (p. ej., tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (p. ej., polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (p. ej., albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros procedimientos compatibles con las enseñanzas en el presente documento, pueden administrarse moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos directamente al sitio de la población celular adversa, aumentado así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

Como se analiza en el presente documento, pueden administrarse moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes, o derivados de los mismos pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de trastornos neuroinflamatorios. En este sentido, se apreciará que las moléculas de unión desveladas pueden formularse para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas según la presente divulgación comprenden un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable, no tóxico, tal como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Para los fines de la presente divulgación, debe mantenerse una cantidad farmacéuticamente eficaz de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, que significa una cantidad suficiente para lograr la unión eficaz a una diana y para lograr un beneficio, por ejemplo, para promover la neurogénesis en un sujeto que tiene trastornos del sistema nervioso central tales como trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, lesiones cerebrales agudas y ciertas disfunciones del SNC.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente divulgación comprenden vehículos farmacéuticamente, que incluyen, p. ej., intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como seroalbúmina humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen, p. ej., agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y medios tamponados. En la divulgación en cuestión, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir, entre otros, 0,01-0,1 M, y preferentemente tampón fosfato 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato, o aceites no volátiles. Vehículos intravenosos incluyen recargadores de fluidos y de nutrientes, recargadores de electrolitos, tales como aquellos a base de dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en las que son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En tales casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenaje y preferentemente se preservará contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento como la lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos. Las formulaciones adecuadas para su uso en los procedimientos terapéuticos desvelados en el presente documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16a ed. (1980).

La prevención de la acción de microorganismos pueden lograrse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando un compuesto activo (p. ej., un anticuerpo anti-SEMA4D, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, por sí mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son el secado al vacío o la liofilización, que produce un polvo de un principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se envasan en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan bajo condiciones asépticas según procedimientos conocidos en la técnica. Además, Las preparaciones pueden envasarse y venderse en forma de un kit. Tales artículos de fabricación pueden tener etiquetas o prospectos que indican que las composiciones asociadas son útiles para tratar un sujeto que padece, o está predispuesto a una enfermedad o trastorno.

Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis en bolo única, una infusión o una dosis de bolo de carga seguida de una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse a intervalos fijos o variables específicos, p. ej., una vez al día, o en una base "según sea necesario".

Ciertas composiciones farmacéuticas usadas en la presente divulgación pueden administrarse por vía oral en una forma de dosificación aceptable que incluye, p. ej., cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

La cantidad de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, a combinar con los materiales de vehículo para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. La composición puede administrarse como una dosis única, dosis múltiple o durante un periodo de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación también se pueden ajustar para proporcionar la óptima respuesta deseada (p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica).

En consonancia con el ámbito de la presente divulgación, pueden administrarse anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos a un ser humano u otro animal según los procedimientos mencionados anteriormente de tratamiento en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Los anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos pueden administrarse a tal ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional según técnicas conocidas. Un experto en la materia reconocerá que la forma y carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable están dictados por la cantidad de principio activo con la que va a combinarse, la vía de administración y otras variables muy conocidas. Los expertos en la materia apreciarán además que puede usarse un cóctel que comprende una o más especies de moléculas de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos.

Por "dosis o cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se tiene por objeto una cantidad de molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, que cuando se administra provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con una enfermedad a tratar, por ejemplo, aumentar la proliferación, potenciar la diferenciación y/o aumentar la supervivencia de células precursoras o progenitoras.

Las dosis terapéuticas eficaces de las composiciones para la promoción de la neurogénesis varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En ciertas realizaciones, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos. Pueden valorarse dosificaciones de tratamiento usando procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y eficacia.

La cantidad de al menos una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión, variante o derivado del mismo, que se va a administrar es fácilmente determinada por un experto en la materia sin experimentación indebida dada la divulgación de la presente invención. Los factores que influyen en el modo de administración y la cantidad respectiva de al menos una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo, fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo incluyen, entre otros, la gravedad de la enfermedad, el historial de la enfermedad, y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo que recibe la terapia. De la misma forma, la cantidad de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo, a administrar dependerá del modo de administración y si el sujeto recibirá una dosis única o dosis múltiples de este agente.

La divulgación también proporciona el uso de una molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar un sujeto para tratar un trastorno neuroinflamatorio, en la que el medicamento se usa en un sujeto que ha sido pretratado con al menos otra terapia. Por "pretratado" o "pretratamiento" se tiene por objeto que el sujeto haya recibido una o más de otras terapias (p. ej., ha sido tratado con al menos otra terapia neuroinflamatoria) antes de recibir el medicamento que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. "Pretratado" o "pretratamiento" incluye sujetos que han sido tratados con al menos otra terapia en el plazo de 2 años, en el plazo de 18 meses, en el plazo de 1 año, en el plazo de 6 meses, en el plazo de 2 meses, en el plazo de 6 semanas, en el plazo de 1 mes, en el plazo de 4 semanas, en el plazo de 3 semanas, en el plazo de 2 semanas, en el plazo de 1 semana, en el plazo de 6 días, en el plazo de 5 días, en el plazo de 4 días, en el plazo de 3 días, en el plazo de 2 días, o incluso en el plazo de 1 día antes del inicio del tratamiento con el medicamento que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal VX15/2503 desvelado en el presente documento, o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. No es necesario que el sujeto sea un respondedor al pretratamiento con la terapia o terapias previas. De este modo, el sujeto que recibe el medicamento que comprende la molécula de unión a anti-SEMA4D, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo podría haber respondido, podría haber dejado de responderal pretratamiento con la terapia previa, o a una o más de las terapias previas en las que el pretratamiento comprendió terapias múltiples.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las habilidades en la técnica. Tales técnicas se explican detalladamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, Sambrook y col., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook y col., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DnA Cloning, Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis y col., patente de EE. UU. n.° 4.683.195; Hames y Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (iRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu y col., eds., Methods in Enzymology, Vols. 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir y Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel y col. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley y Sons, Baltimore, Md.).

Principios generales de la genomanipulación de anticuerpos se exponen en Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2a ed.; Oxford Univ. Press). Principios generales de la genomanipulación de proteínas se exponen en Rickwood y col., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Principios generales de anticuerpos y unión de anticuerpo-hapteno se exponen en: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman y Hall, Nueva York, N.Y.). Adicionalmente, los procedimientos convencionales en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente son generalmente seguidos como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites y col., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8a ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) y Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman y Co., NY).

Los trabajos de referencia convencionales que exponen principios generales de inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett y col., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden y col., (Elsevere, Ámsterdam); Goldsby y col., eds. (2000) Kuby Immunology (4a ed.; H. Freemand & Co.); Roitt y col. (2001) Immunology (6a ed.; Londres: Mosby); Abbas y col. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlang); Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

Los siguientes ejemplos se presentan como ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos

Ejemplo IDiseño experimental.

El diseño experimental básico se muestra en la FIG. 1. Se utilizaron ratones CB-17/lcr-1/1Jcl macho de 6 semanas de vida ("ratones CB-17") para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-SEMA4D sobre la neurogénesis después de una lesión por ictus. Los ratones se sometieron a oclusión de la arteria cerebral media (ACM) (OACM). En resumen, los animales se colocaron bajo anestesia profunda inducida con halotano al 4 % en una mezcla de oxígeno al 30 % / óxido nitroso al 70 %, y el plano anestésico se mantuvo con halotano al 1-2 %. La isquemia cerebral focal permanente se produjo por ligadura y desconexión de la porción distal de la arteria cerebral media izquierda (ACM) como se describe en otra parte (Taguchi y col., 2004, 2007). La ACM izquierda fue aislada, electrocauterizada y desconectada justo distal para cruzar el tracto olfatorio (porción distal M1) con animales bajo anestesia con halotano. Se controló el flujo sanguíneo cerebral (FSC) en el área de la ACM como se describió anteriormente (Matsushita y col., 1998). El infarto cerebral producido en esta cepa de ratón es altamente reproducible y se limita a la corteza cerebral ipsolateral (Taguchi y col., 2004, 2007).

Después de la oclusión, los ratones se dividieron en dos grupos: el grupo de tratamiento se inyectó con el anticuerpo AM anti-SEMA4D 67-2 y el grupo de control se inyectó con el AM de isotipo IgG de control 2B8. Los ratones recibieron 0,6 mg/kg de anticuerpo monoclonal mediante inyección intraperitoneal (IP) 1 hora, 3 horas, 3 días, 7 días, 14 días y 21 días después de la OACM.

El día 7 después de la OACM, se sacrificó un subconjunto de animales de cada cohorte inyectada con anticuerpos, se extrajeron los cerebros y se analizaron los tejidos mediante inmunohistoquímica y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).

Para los análisis inmunohistoquímicos de secciones de cerebro, los animales se perfundieron con un fijador de paraformaldehído-lisina-periodato (PLP) al 2 % (0,75 M de lisina-HCl / 0,01 M de periodato / 0,075 M de tampón de fosfato), y los cerebros se cortaron en secciones seriadas de 20 mm de espesor en un criostato. Las secciones de cerebro se trataron con H²O²al 0,1 % para la inactivación, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante la noche con uno o más de los siguientes anticuerpos primarios: anti-NeuN para las neuronas, anti-Nestin y anti-Sox2 para células madre/precursoras en tampón de dilución (Triton-X-100 al 0,3% / suero de caballo al 5% / PBS). Después de lavarse tres veces en PBS, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados durante 3 horas, y para la tinción con NeuN, luego se visualizaron mediante la reacción ABC utilizando el kit peroxidasa ABC Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA) con diaminobenzidina (DAB; Sigma). Para la doble inmunocitoquímica de Nestina/Sox2, se utilizaron anticuerpos secundarios marcados con FITC- (Sox2) y Cy3 (Nestina). Se obtuvieron microfotografías fluorescentes con un microscopio confocal láser. Los resultados se muestran en la Figura 2A-E y se analizan en detalle a continuación.

Para los análisis de RT-PCR, se aisló el ARN total del tejido cerebral microdiseccionado el día 7 después de la OACM y se preparó el ADNc. El ADNc se amplificó por PCR en las siguientes condiciones: 15 s a 94 °C, 30 s a 56 °C y 1 min a 68 °C (40 ciclos). Las secuencias del cebador fueron las siguientes: nestina, directo, CACTAGAAAGCAGGAACCAG (SEQ ID NO: 11) y nestina, inverso, AGATGGTTCACAATCCTCTG (SEQ ID NO: 12) (tamaño de amplicón, 307 pb); Sox2, directo, TTGGGAGGGGTGCAAAAAGA (SEQ ID NO: 13) y Sox2, inverso, CCTGCGAAGCGCCTAACGTA (SEQ ID NO: 14) (tamaño de amplicón, 312 pb); proteína proteolípida (PLP) directa, TGAGCGCAACGGTAACAGG (SEQ ID NO: 15) y PLP inversa, GGGAGAACACCATACATTCTGG (SEQ ID NO: 16) (tamaño de amplicón, 295 pb); y p-actina, directo, GCTCGTCGTCGACAAG-GGCTC (S^eQ ID NO: 17) y p-actina, inverso, CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC (SEQ ID NO: 18) (tamaño de amplicón, 353 pb). Los resultados se muestran en la Figura 3A-D y se analizan en detalle a continuación.

Se realizaron evaluaciones de comportamiento en las cohortes restantes de ratones los días 14 y 30 después de la OACM. Para evaluar la función cortical, los ratones se analizaron mediante pruebas de comportamiento utilizando la tarea de campo abierto. Brevemente, se permitió que los animales buscaran libremente en una caja acrílica cuadrada (30 x 3 x 30 cm) durante 20 minutos. Una fuente de luz en el techo del recinto estuvo encendida durante los primeros 10 minutos (período de luz) y apagada durante un período posterior de 10 minutos (período de oscuridad). En los bancos X e Y del campo abierto, se montaron dos rayos infrarrojos a 2 cm por encima del piso, espaciados a intervalos de 10 cm, formando un circuito flip-flop entre ellos. El número total de cruces de rayos por el animal se contó y se puntuó como comportamiento de viaje (locomoción). Los resultados se muestran en la Figura 6A-C y se analizan en detalle a continuación.

El día 30 después de la OACM, se sacrificaron las cohortes restantes de ratones y se procesaron los cerebros para inmunohistoquímica de NeuN. Los ratones se perfundieron transcardialmente con paraformaldehído al 4 %, se extrajeron cerebros y se tiñeron secciones coronales (14 mm) con anticuerpo de ratón contra NeuN, seguido de reacción con anti-IgG de ratón en cabra biotinilada (Chemicon, Temecula, CA; 1/500), Kit ABC Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y DAB (Sigma) como cromógeno. El área del hemisferio cerebral ipsilateral y contralateral ocupada por el marcador nuclear neuronal NeuN se midió usando Image J. El volumen del hemisferio cerebral ipsolateral y contralateral se calculó integrando el área del hemisferio cerebral ipsilateral y contralateral orientada coronalmente. La involución del volumen del hemisferio cerebral ipsilateral se calculó como (volumen del hemisferio cerebral ipsilateral/contralateral). Los resultados se muestran en la Figura 4A-D y la Figura 5A-B y se comentan en detalle a continuación.

Ejemplo 2: Efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre la presencia de células madre/precursoras neurales en la OACM del cerebro

A los 7 días después de la OACM, se examinó el efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre la presencia de células madre/precursoras neurales. La FIG. 2 muestra imágenes de tinción inmunocitoquímica de tejido isquémico de 2 áreas representativas en el borde del infarto (simbolizado en la Figura 2E) del control de isotipo (paneles izquierdos, A y C) y ratones tratados con anticuerpos anti-SEMA4D (paneles derechos, B y D). Estos resultados muestran que los ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D tienen una expresión aumentada de proteínas marcadoras de células madre/progenitoras neurales en comparación con los ratones tratados con anticuerpo de control. Estos datos sugieren que el anticuerpo anti-SEMA4D puede proteger poblaciones de células madre/precursoras neurales y/o inducir neurogénesis en el cerebro isquémico.

La expresión de ARNm de células madre neurales/precursoras en ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D y control de isotipo se detectó mediante RT-PCR convencional en el tejido isquémico el día 7 después de la OACM. Estos resultados se muestran en las Figs. 3A-D. Los resultados muestran un aumento significativo (p <0,05) en la expresión de Sox2, nestina y PLP en relación con el gen constitutivo, p-actina, en ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D en comparación con los tratados con anticuerpo de control de isotipo. Dado que Sox2 y nestina son marcadores de células madre/precursoras neurales, el aumento de la expresión de estos marcadores después del tratamiento con anticuerpo anti-SEMA4D sugiere que el anticuerpo anti-SEMA4D puede promover la neurogénesis. Un aumento en la neurogénesis observado después del tratamiento anti-SEMA4D en el cerebro isquémico podría ser el resultado de una mayor proliferación de células madre/precursoras neurales y/o una mayor supervivencia de células madre/precursoras neurales recién formadas.

Ejemplo 3: Efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre el volumen cerebral después de un infarto cerebral

30 días después de la OACM, se examinó el efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre el volumen del cerebro. Las FIG. 4A-4B muestran secciones de cerebro teñidas con un anticuerpo específico para el marcador neuronal maduro, NeuN, de 1 ratón de control de isotipo representativo (izquierda, 4A) y 1 ratón representativo tratado con anticuerpo anti-SEMA4D (derecha, 4B). El volumen del cerebro está representado por el volumen del cuerpo estriado (línea continua) y el hemisferio (línea de puntos). Las FIG. 4C-4D muestran la proporción calculada (I/D) de volumen del cuerpo estriado y del hemisferio, respectivamente, para cada grupo de ratones tratados. Si bien no hay una diferencia estadísticamente significativa en el volumen hemisférico total de los cerebros (línea discontinua) entre los ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D y los tratados con control de isotipo, los ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D tienen un volumen de cuerpo estriado significativamente mayor (línea continua) que los ratones tratados con anticuerpo de control. Estos datos sugieren que las regiones de cuerpo estriado próximas a la lesión isquémica focal pueden protegerse mediante el tratamiento con anticuerpos anti-SEMA4D.

Ejemplo 4: Efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre la presencia de neuronas en la OACM del cerebro

30 días después de la OACM, se examinó el efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre la presencia de neuronas en el cerebro. La FIG. 5 muestra imágenes teñidas con NeuN de tejido cerebral isquémico de 1 ratón de control de isotipo representativo (paneles inferiores, 5B) y 1 ratón representativo tratado con anticuerpo anti-SEMA4D (paneles superiores, 5A). Estos resultados muestran que los ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D tienen una mayor expresión del marcador de células neuronales maduras, NeuN, en el cuerpo estriado en el borde del infarto cerebral (flechas), en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control. Estos datos sugieren que el tratamiento con anticuerpos anti-SEMA4D promueve el desarrollo de neuronas maduras, potencialmente protegiendo poblaciones de células madre/precursoras neurales y/o induciendo neurogénesis en el cerebro isquémico.

Ejemplo 5: Efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre la actividad conductual de ratones con OACM

30 días después de la OACM, se examinó el efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre la actividad conductual. Los ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D e IgG de control se sometieron a una prueba de campo abierto durante 10 minutos en un ambiente con luz y oscuridad. Las FIG. 6A-6B muestran cómo los ratones sometidos a OACM (ratones tratados con anticuerpos IgG de control y anti-SEMA4D) tienen una actividad significativamente mayor en la fase de luz (p <0,05) en comparación con los ratones tratados de forma simulada, pero no en la fase de oscuridad.

Por lo general, los ratones tienen una mayor actividad cuando se los coloca en la oscuridad desde un ambiente iluminado. La FIG. 6C muestra que la relación de actividad de locomoción de fase de oscuridad/luz mejoró significativamente en ratones tratados con anticuerpo anti-SEMA4D, comparable a los ratones tratados de forma simulada, en contraste con los ratones tratados con anticuerpo de control (p <0,05). Las relaciones de fase oscuridad/luz no fueron significativamente diferentes entre el grupo anti-SEMA4D y el grupo de cirugía simulada. Estos resultados sugieren que el tratamiento con anticuerpos anti-SEMA4D de ratones lesionados con OACM puede actuar para normalizar sus respuestas a los estímulos de oscuridad/luz, mientras que los ratones que reciben IgG de control parecen mantener una actividad oscuridad/luz anormal típicamente exhibida por ratones lesionados con OACM.

Ejemplo 6: Efecto del anticuerpo anti-SEMA4D sobre la integridad y neurogénesis de la barrera hematoencefálica

Se llevará a cabo otro estudio para evaluar el(los) efecto(s) de anti-SEMA4D sobre la barrera hematoencefálica (integridad BHE) y la neurogénesis en un modelo de rata de oclusión permanente de la arteria cerebral media (OACM).

El diseño experimental básico se muestra en la FIG. 7. Las ratas se someterán a oclusión de la arteria cerebral media (ACM) (OACM). Después de la oclusión, las ratas se dividirán en tres grupos de 15 ratas: a un grupo de tratamiento se le inyectará el anticuerpo AM anti-SEMA4D 67-2, a un grupo de control se le inyectará AM 2B8 de control de isotipo IgG y a un grupo no OACMC se inyectará AM 2B8 de control de isotipo IgG. Las ratas recibirán 15,0 mg/kg de anticuerpo monoclonal mediante inyección intraperitoneal (IP) 1 hora, 3 días, 7 días, 14 días y 21 días después de la OACM. Se tomarán muestras de sangre periódicamente para una evaluación posterior de los niveles de fármaco. Las

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a semaforina-4D (SEMA4D) para su uso en un procedimiento de tratamiento de ictus en un sujeto humano, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra en una cantidad eficaz y comprende una VH que comprende las secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente; y una VL que comprende las secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de la reivindicación 1, que se administra en el lado de la sangre o en el lado del cerebro de la barrera hematoencefálica del sujeto.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la VH comprende la SEQ ID NO: 1 y la VL comprende la SEQ ID NO: 2.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la VH comprende la SEQ ID NO: 3 y la VL comprende la SEQ ID NO: 4.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es para su uso en un procedimiento de tratamiento de infarto cerebral.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo IgG.