KR102105436B1 - 뇌졸중 후 신경발생을 촉진시키는 세마포린-４d 결합 분자의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에서 신경발생 촉진을 필요로 하는 피험체에게 유효량의, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 중추 신경계 장애의 1 이상의 증상을 보이는 환자의 신경 조직에서 신경발생을 촉진시키는 방법을 제공한다.

Description

뇌졸중 후 신경발생을 촉진시키는 세마포린-４D 결합 분자의 용도{USE OF SEMAPHORIN-4D BINDING MOLECULES TO PROMOTE NEUROGENESIS FOLLOWING STROKE}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2013년 3월 15일 출원된 미국 정규 출원 번호 제13/842,523호, 및 2012년 5월 11일 출원된 미국 가출원 번호 제61/646,119호의 우선권을 주장하며, 상기 두 출원의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록에 관한 언급

본원과 함께 출원된 ASCII 텍스트 파일(파일명: "1843072PC01_SequenceListing.txt"; 파일 크기: 7,562 바이트; 및 작성일: 2013년 5월 10일)의 전자적으로 제출된 서열의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

CD100으로도 알려져 있는 세마포린 4D(SEMA4D)는 세마포린 유전자 패밀리에 속하는 막횡단 단백질(예컨대, 서열 번호 1(인간); 서열 번호 2(뮤린))이다. SEMA4D는 동종이량체로서 세포 표면 상에서 발현되지만, 세포 활성화시 SEMA4D는 단백질 분해성 절단을 통해 세포 표면으로부터 유리되어, 생물학적으로 활성인 가용성의 형태의 단백질인 sSEMA4D로 생성될 수 있다. 문헌 [Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 5: 159-167 (2003)]; [Kikutani et al., Nature Immunol. 9: 17-23 (2008)]을 참조할 수 있다.

SEMA4D는 비장, 흉선, 및 림프절을 비롯한 림프계 기관에서, 및 비림프계 기관, 예컨대, 뇌, 심장, 및 신장에서 고수준으로 발현된다. 림프계 기관에서, SEMA4D는 휴지기 T 세포 상에서 풍부하게 발현될 뿐만 아니라, 휴지기 B 세포 및 항원 제시 세포(APC), 예컨대, 수지상 세포(DC) 상에서 약하게 발현된다. 그러나, 그의 발현은 다양한 자극에 의한 활성화 이후에 상기 세포에서 상향조절된다. 면역 세포로부터의 가용성 SEMA4D의 유리는 또한 세포 활성화에 의해서도 증가된다.

SEMA4D는 자가면역 탈수초성 질환, 예컨대, 다발성 경화증 및 특정 암의 발병과 연루되어 있다. 포유동물의 신경계가 손상 후 완전하게 재생하지 못하는 것이 주요 임상적 문제가 된다. 뇌졸중 또는 뇌 외상 뿐만 아니라, 신경퇴행성 질환, 예컨대, 알츠하이머 병의 결과로서 신경 손상은 사망과 장애의 주된 원인이다. 혈관신생에서 SEMA4D의 수용체, 예컨대, 플렉신(Plexin)-B1을 통한 그의 신호 전달 역할은 주지되어 있지만, SEMA4D 신호 전달이 신경발생을 촉진시키는 데 미치는 효과는 여전히 불명확하다. 그러므로, 신경재생에 대한 치료학적 수단에 대하여 충족되지 못한 의학적 요구에 대한 해결 방안이 여전히 요구되고 있다.

본 발명의 간단한 요약

본원에서는 신경발생을 촉진시키기 위하여 세마포린-4D 결합 분자를 사용하는 방법을 개시한다. SEMA4D가 신경 세포의 재생 능력을 손상시킬 수 있다는 것을 입증하는 증거가 제시된 바 있다. 본원에 예시된 본 발명의 측면에 따라, 신경발생 촉진을 필요로 하는 피험체에게 유효량의, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하고/하거나, 그를 억제시키는 단리된 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 중추 신경계 장애의 1 이상의 증상을 보이는 환자의 신경 조직에서 신경발생을 촉진시키는 방법을 제공한다.

본원에 예시된 본 발명의 측면에 따라, 중추 신경계 장애를 앓는 피험체에게 유효량의, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, SEMA4D에의 결합이 전구 세포의 개수를 증가시키는 작용을 하는 것인, 중추 신경계 장애를 앓는 피험체에서 전구 세포의 개수를 증가시키는 방법을 제공한다.

본원에 예시된 본 발명의 측면에 따라, 피험체에게 유효량의, SEMA4D에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 결합 분자는, VX15/2503 또는 67로 이루어진 군으로부터 선택되는 참조 단일클론 항체가 SEMA4D에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것인, 중추 신경계 장애의 1 이상의 증상을 보이는 환자의 신경 조직에서 신경발생을 촉진시키는 방법을 제공한다.

본원에 예시된 본 발명의 측면에 따라, 피험체에게 유효량의, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하고/하거나, 그를 억제시키는 단리된 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, SEMA4D에의 결합이 증상을 완화시키는 작용을 하는 것인, 환자에서 중추 신경계 질환 또는 장애, 예컨대, 뇌졸증의 증상을 완화시키는 방법을 제공한다.

도 1은 본 실시예에 기술되어 있는 중간 대뇌 동맥(MCA) 폐색에 대한 실험 프로토콜의 개략도이다.
도 2A-2E는 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO) 및 이소형 대조군("대조군 IgG," 2A 및 2C) 또는 MAb 67-2("항Sema4D-Ab," 2B 및 2D)으로의 처리 후의, 2E에 명시되어 있는 부위내 네스틴/Sox2로 염색된 뇌 시료 중의 신경 줄기/전구체 세포를 보여주는 것이다. 뇌 시료는 MCAO 후 7일째 제조하였다.
도 3A-3D는 이소형 대조군("대조군 IgG") 또는 MAb 67-2("항SEMA4D")로 처리된 MCAO 마우스의 뇌 조직 중의 액틴 대조군에 대해 상대적인 (B) Sox2, (C) 네스틴, 및 (D) PLP에 관한 정량적 분석과 함께, (A) RT-PCR에 의한 mRNA 발현을 보여주는 것이다. 뇌 조직을 MCAO 후 7일째에 단리시켰다. 네스틴 및 Sox2는 신경 줄기 전구체 세포의 마커이다. PLP는 수초 형성의 마커이다.
도 4A-4D는 이소형 대조군 또는 MAb 67-2로 처리된 MCAO 마우스의 처리 및 비처리된 반구에서 뇌 및 선조체의 상대적인 전체 부피를 보여주는 것이다. MCAO 후 30일째에 측정하였다. 도 4A-4B는 NeuN으로 염색된, (A) 1마리의 대표 이소형 대조군("대조군 IgG") 마우스 및 (B) 1마리의 대표 항SEMA4D 항체로 처리된("항SEMA4D") 마우스로부터의 뇌 단면을 보여주는 것이다. 뇌 부피는 선조체(실선) 및 반구(점선)의 부피로 나타낸 것이다. 도 4C-4D는 이소형 대조군("IgG") 마우스 및 항SEMA4D 항체로 처리된("SEMA") 마우스에 대한 선조체 및 반구 부피의 비(L/R) 계산치를 각각 나타낸 것이다.
도 5A-5B는 MCAO 후 30일째의 MCAO 마우스(A) MAb 67-2("Sema4D-Ab") 또는(B) 이소형 대조군("대조군 IgG")에서의 성숙한 뉴런 세포 마커인 NeuN의 발현을 보여주는 것이다. 대뇌 경색 경계부의 선조체는 화살표로 표시되어 있다.
도 6A-C는 MCAO 및 MCAO 후 30일째에 이소형 대조군("IgG") 또는 MAb 67-2("SEMA4D") 처리 후 마우스, 또는 모의 수술("SHAM") 처리를 받은 마우스의 명기 단계 및 암기 단계의 오픈 필드 보행 활동량을 보여주는 것이다. 도 6A-6B는 각각 명기 단계 및 암기 단계에서의 보행 활동량을 보여주는 것이다. 도 6C는 보행 활동량의 명기 단계/암기 단계 비(D/L)를 보여주는 것이다.
도 7은 실시예 6에 기술된 실험 프로토콜의 개략도이다.

본 발명의 상세한 설명

I. 정의

"하나"("a" 또는 "an")의 실체라는 용어는 하나 이상의 상기 실체를 의미하며; 예를 들어, "하나의 항SEMA4D 항체"는 하나 이상의 항SEMA4D 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, "하나"("a"(또는 "an")), "하나 이상의," 및 "1 이상의"라는 것은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에서 "신경발생"이라는 어구는 생체내 또는 시험관내 신경 세포의 증식, 분화, 이동 및/또는 생존으로 정의된다. 다양한 실시양태에서, 신경 세포는 성인, 태아, 또는 배아 신경 줄기 세포 또는 세포의 집단이다. 세포는 동물 또는 인간의 중추 신경계 또는 다른 어느 부위에도 위치할 수 있다. 세포는 또한 조직, 예컨대, 신경 조직에 존재할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 신경 세포는 성인, 태아, 또는 배아 전구 세포 또는 세포의 집단, 또는 줄기 세포 및 전구 세포의 혼합물을 포함하는 세포 집단이다. 신경 세포는 모든 뇌 줄기 세포, 모든 뇌 전구 세포, 및 모든 뇌 전구체 세포를 포함한다. 신경발생은 정상적인 발생 동안 이루어지는 신경발생 뿐만 아니라, 예컨대, 본원에 기술된 치료에 의해 질환, 손상 또는 치료학적 개입 이후에 이루어지는 신경 재생도 포함한다.

"신경 세포," "줄기 세포," "신경 줄기 세포," "전구체 세포," "신경 줄기/전구체 세포"(NSPC: neural stem/precursor cell) 또는 "신경 줄기/전구 세포"(NSPC: neural stem/progenitor cell)는 상호교환적으로 사용되며, 이는 자가 재생, 및 뉴런, 성상세포, 및/또는 희소돌기아교세포로의 분화가 가능한 미분화된 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "전구 세포"(예컨대, 신경 전구 세포)라는 용어는 그 자체는 줄기 세포가 아닌, 줄기 세포로부터 유래된 세포를 의미한다. 일부 전구 세포는 1 초과의 세포 유형으로 분화될 수 있는 자손을 생산할 수 있다. 신경 전구 세포는 뉴런을 생산하는 뉴런 전구 세포, 및 성상세포 및/또는 희소돌기아교세포를 생산하는 아교세포의 전구 세포를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "중추 신경계 장애" 또는 "CNS 장애"라는 용어는 신경퇴행성 장애, 급성 뇌 손상(예컨대, 뇌졸중, 두부 손상, 뇌성마비, 대뇌 경색, 척수 손상, 외상 손상) 및 특정 중추 신경계 "CNS" 기능장애(예컨대, 우울증, 간질, 및 정신분열병)를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "신경퇴행성 장애"라는 용어는 알츠하이머 병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 및 다발성 경화증을 의미한다. CNS 장애는 또한 신경염증성 장애일 수 있다는 것에 주의하여야 한다. 신경퇴행성 장애는 신경염증을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 신경퇴행성 장애는 명백한 신경염증 없이도 일어날 수 있다. 이는 예를 들어, 말기 속발성 진행성 다발성 경화증에서의 사례이다.

본원에서 사용되는 바, "급성 뇌 손상"이라는 용어는 뇌졸중, 두부 손상, 뇌성마비, 대뇌 경색, 척수 손상, 및 외상 손상을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "CNS 기능장애"라는 용어는 우울증, 간질, 및 정신분열병을 의미한다.

"치료적 유효량"이라는 용어는 피험체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소형 유기 분자, 또는 다른 약물의 양을 의미한다. 신경염증성 장애의 경우, 치료적 유효량의 약물은 예를 들어, 신경 줄기/전구체 세포의 증식, 분화, 이동 및/또는 생존을 증가시킴으로써 신경발생을 촉진시킬 수 있거나; 신경 세포 감소를 감소, 지연 또는 중단시킬 수 있거나; 신경 세포 감소를 억제, 예컨대, 저해, 지연, 방지, 중단, 또는 역전시킬 수 있거나; 신경 세포의 개수, 밀도 및/또는 농도를 증가시킬 수 있거나; 신경 세포의 형태 또는 기능을 변화시킬 수 있거나; 또는 신경 세포 간의 상호작용을 변화시킬 수 있거나; 예컨대, 신경염증성 장애와 같은, 신경 세포 감소와 관련된 증상 중 하나 이상을 어느 정도까지 경감시킬 수 있거나; 이환율 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선시킬 수 있거나; 또는 상기 효과의 조합을 이루어낼 수 있다.

예컨대, "치료하는" 또는 "치료," 또는 "치료하기 위해" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위해"라는 용어는 1) 진단받은 병적 병증 또는 장애를 치유하고/하거나, 저속화시키고/시키거나, 그의 증상을 감소시키고/시키거나, 그를 역전시키고/시키거나, 그의 진행을 중단시키는 치료학적 조치, 및 2) 표적화된 병적 병증 또는 장애의 발병을 예방 및/또는 저속화시키는 예방적 또는 예방 조치, 2가지 모두를 의미한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상으로는 상기 장애를 이미 앓고 있는 대상; 상기 장애에 걸리기 쉬운 대상; 및 그 대상에서의 장애를 예방하고자 하는 것인 대상을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과로는 증상 완화, 질환 정도 감소, 질환 상태 안정화(즉, 더 이상, 악화되지 않음), 질환 진행 지연 또는 저속화, 질환 상태 호전 또는 완화, 및 검출가능 여부와 상관 없이 (부분적이든 또는 전체이든 간에) 관해를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "치료"란 치료받지 않았을 경우의 예상 생존 기간과 비교하여 생존 기간 연장을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상으로는 병증 또는 장애를 이미 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 병증 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상 또는 및 그 대상에서의 병증 또는 장애를 예방하고자 하는 것인 대상을 포함한다.

"피험체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"이란, 진단, 예후, 또는 요법을 필요로 하는 임의의 피험체, 특히, 포유동물 피험체를 의미한다. 포유동물 피험체로는 인간, 가축, 경작용 동물, 및 동물원 동물, 스포츠용 동물 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소, 곰 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 예컨대, "항SEMA4D 항체 투여가 도움이 되는 피험체" 및 "치료를 필요로 하는 동물"이라는 어구는 예컨대, SEMA4D 폴리펩티드의 검출을 위해(예컨대, 진단 절차를 위해) 사용된 항SEMA4D 항체 또는 다른 SEMA4D 결합 분자의 투여 및/또는 항SEMA4D 항체 또는 다른 SEMA4D 결합 분자를 이용한 질환의 치료, 즉, 완화 또는 예방이 도움이 되는 피험체, 예컨대, 포유동물 피험체를 포함한다.

본 발명의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 그의 가장 광범위한 의미에서 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 SEMA4D, 예컨대, 약 150 kDa의 막횡단 SEMA4D 폴리펩티드, 또는 (보통 sSEMA4D로 지칭되는) 약 120 kDa의 가용성 SEMA4D 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 분자의 1개 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자의 2개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자의 3개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자의 4개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자의 5개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자의 6개 이상의 CDR을 포함한다.

본 발명은 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 앓는 피험체에게 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 앓는 피험체에서 신경발생을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 전장의 항체, 예컨대, 자연적으로 발생된 항체를 지칭하지 않는 한, "항SEMA4D 항체"라는 용어는 전장의 항체 뿐만 아니라, 상기 항체의 항원 결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예컨대, 자연적으로 발생된 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작된 항체 분자 또는 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 하기, 및 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,939,598호((Kucherlapati) 등)에 기술되어 있는 바와 같이, "인간" 또는 "완전 인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함하며, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 트랜스제닉성이고, 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. 또한 "인간" 또는 "완전 인간" 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인, 또는 적어도 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서, 가변 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 가진다.

"인간" 또는 "완전 인간" 항체는 또한 상기에 기술된 바와 같이. 본원에 기술된 항체 분자(예컨대, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체를 포함)를 포함하거나, 그로 본질적으로 구성되거나, 또는 그로 구성된 "인간" 또는 "완전 인간" 항체를 포함하며, 이 항체 또는 그의 단편은 SEMA4D 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다. 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 인간 항SEMA4D 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 돌연변이를 도입할 수 있는데, 상기 기술은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개된 돌연변이 유발을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아니며, 상기 돌연변이 유발들은 아미노산 치환을 생성한다. 바람직하게, 변이체(유도체 포함)는 참조 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3과 비교하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 코딩한다.

특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 하기에 추가로 논의되는 보존적 아미노산 치환이다. 별법으로, 돌연변이는 예컨대, 포화 돌연변이 유발에 의해 코딩 서열 전체 또는 일부를 따라 무작위적으로 도입될 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 활성(예컨대, SEMA4D 폴리펩티드, 예컨대, 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 및 뮤린 둘 모두의 SEMA4D에 결합할 수 있는 능력)을 유지하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. "인간" 또는 "완전 인간" 항체의 상기와 같은 변이체(또는 그의 유도체)는 또한 "최적화"되거나, 또는 "항원 결합에 대하여 최적화되고," 항원에 대한 친화성이 개선된 항체를 포함하는 인간 또는 완전 인간 항체로서 지칭될 수 있다.

"항체" 및 "면역글로불린"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하며, 보통 적어도 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 척추 동물 시스템에 있어서의 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]를 참조할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "면역글로불린"이라는 용어는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 폴리펩티드 부류를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며, 그 중 일부는 하위부류(예컨대, γ1-γ4)를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정하는 것은 상기 쇄의 성질이다. 면역글로불린 하위부류(이소형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 특징이 잘 규명되어 있으며, 기능 분화를 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이들 부류 및 이소형 각각의 변형된 버전은 본 발명의 개시 내용을 고려하면 숙련가가 쉽게 분간할 수 있으며, 따라서 본 발명의 범주 내에 포함된다. 모든 면역글로불린 부류는 명확하게 본 발명의 범주 내에 포함되며, 하기 논의는 일반적으로 IgG 부류의 면역글로불린 분자에 관한 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 분자량이 53,000-70,000인 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 상기 4개의 쇄는 전형적으로 "Y"의 배열로 이황화 결합에 의해 연결되어 있으며, 여기서, 경쇄는 "Y"의 마우쓰(mouth) 부분에서 출발하여 가변 영역으로 이어지는 중쇄를 브래킷(bracket)한다.

경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ) 중 어느 하나로 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄 중 어느 하나와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 2개의 중쇄들의 "테일" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포 중 어느 하나에 의해 생성될 때 공유적 이황화 결합 또는 비공유적 결합에 의해 서로에게 결합된다. 중쇄에 있어서, 그 아미노산 서열은 Y 배열의 포크형 말단의 N 말단으로부터 각 쇄의 기저부의 C 말단으로 진행된다.

경쇄 및 중쇄, 둘 모두는 구조적 및 기능적으로 상동성인 영역으로 나눈다. "불변" 및 "가변"이라는 용어는 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL 또는 VK) 및 중쇄(VH) 부분의 가변 도메인이 항원의 인식 및 특이성을 결정함이 인정된다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대, 분비, 경태반적 이동, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 통상, 불변 영역 도메인들의 번호 매김은 이들이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노 말단으로부터 더욱 멀어짐에 따라 증가하게 된다. N 말단 부분은 가변 영역이며, C 말단 부분에는 불변 영역이 있고; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단을 포함한다.

상기 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하여 상기 에피토프에 특이적으로 결합하게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 내의 상보성 결정 영역(CDR)의 서브세트는 조합되어 3차원 항원 결합 부위를 규정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4원 항체 구조체는 Y의 각각의 아암의 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 더욱 구체적으로, 항원 결합 부위는 VH 및 VL 쇄 각각에서의 3개의 CDR에 의해 규정된다. 일부 경우에서, 예컨대, 낙타과 종으로부터 유래된 특정한 면역글로불린 분자 또는 전체 면역글로불린 분자인 낙타과 면역글로불린을 기반으로 하여 조작된 특정한 면역글로불린 분자는 경쇄를 포함하지 않고, 단지 중쇄로만 이루어질 수 있다. 예컨대, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]을 참조할 수 있다.

자연적으로 발생된 항체에 있어서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 그의 3차원 배열을 취함에 따라 항원 결합 도메인이 형성되도록 특이적으로 배치된 아미노산들의 짧은 비인접한 서열이다. "골격" 영역으로 지칭되는, 항원 결합 도메인 내의 아미노산들의 나머지 부분은 더욱 적은 분자간 가변성을 나타낸다. 골격 영역들은 대부분 β 시트 입체형태를 취하며, CDR은 상기 β 시트 구조를 연결하는, 및 일부 경우에는, 상기 β 시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 골격 영역은 쇄 간의 비공유적 상호작용에 의해 올바른 배향으로 CDR들을 배치하는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR들에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 대하여 상보적인 표면을 규정한다. 이러한 상보성 표면은 항체가 그의 동족 에피토프에 비공유적으로 결합하는 것을 촉진한다. 각각 CDR 및 골격 영역을 포함하는 아미노산은 당업계의 숙련가에 의해 임의의 주어진 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대하여 쉽게 확인될 수 있는데, 그 이유는 상기 아미노산이 정확하게 규정되어 있기 때문이다(하기 참조).

당업계에서 사용되고/되거나, 허용되는 용어에 대하여 2가지 이상으로 정의되는 경우, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 명백하게 반대로 진술되지 않는 한, 모든 그러한 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예로는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드, 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접한 항원 조합 부위를 기술하기 위해 "상보성 결정 영역"("CDR")이라는 용어를 사용하는 것이 있다. 이러한 특정 영역은 문헌 [Kabat et al.. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"] 및 [Chothia and Lesk, J Mol. Biol . 795:901-917 (1987)](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있으며, 여기서, 정의는 서로에 대하여 비교될 때 중첩 아미노산 잔기들 또는 아미노산 잔기들의 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체의 CDR 또는 그의 변이체를 정의하기 위한 어느 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범주 범위 내에 포함되는 것으로 한다. 상기에 인용된 참고 문헌들 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 개재되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기의 번호들은 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라진다. 당업계의 숙련가는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어질 경우 어느 잔기들이 특정 CDR에 포함되는지를 통상적으로 결정할 수 있다.

카바트 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호 매김 체계를 정의하였다. 당업계의 숙련가는 서열 그 자체 이상의 어떤 실험 데이터에 의존하지 않고도, 상기 "카바트 번호 매김" 체계를 임의의 가변 도메인 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "카바트 번호 매김"은 문헌 [Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"]에 기재된 번호 매김 체계를 나타낸다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체에서의 특정 아미노산 잔기 위치의 번호 매김에 대한 언급은 카바트 번호 매김 체계에 따른 것이다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체로는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 다중특이성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 영장류화된 항체, 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 에피토프 결합 단편, 예컨대, Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항이디오타입(항Id) 항체(예를 들어, 본원에 개시된 항SEMA4D 항체에 대한 항Id 항체 포함)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, 미국 특허 제5,892,019호에 기술되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 등) 또는 면역글로불린 분자의 하위부류일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "중쇄 부분"이라는 용어는 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(예컨대, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편 중 1 이상을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄; 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 추가로, 본 발명에서 사용하기 위한 결합 폴리펩티드에는 CH2 도메인의 적어도 일부(예컨대, CH2 도메인 모두 또는 일부)가 결실된 것일 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 당업계의 숙련가는 상기 도메인(예컨대, 중쇄 부분)은 아미노산 서열에 있어서 자연적으로 발생된 면역글로불린 분자와 다르게 변형될 수 있음을 이해할 것이다.

본원에 개시된 항SEMA4D 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 한 폴리펩티드 쇄의 중쇄 부분들은 다량체의 제2 폴리펩티드 쇄 상의 것과 동일하다. 별법으로, 본 발명의 중쇄 부분 함유 단량체들은 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는 예를 들어 이중특이성 항체를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 결합 분자의 중쇄 부분들은 상이한 면역글로불린 분자들로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 및 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 및 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "경쇄 부분"이라는 용어는 면역글로불린 경쇄, 예를 들어, 카파 또는 람다 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 1 이상을 포함한다.

본원에 개시된 항SEMA4D 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 그가 인식하거나, 특이적으로 결합하는 항원, 예컨대, 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예컨대, SEMA4D)의 에피토프(들) 또는 일부분(들)에 의해 기술되거나 구체화될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩티드의 부분이 "에피토프" 또는 "항원 결정기"이다. 표적 폴리펩티드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 2개 이상의 에피토프를 포함하며, 항원의 크기, 입체형태, 및 유형에 따라 임의 개수의 에피토프를 포함할 수 있다. 추가로, 표적 폴리펩티드 상의 "에피토프"는 비폴리펩티드 요소일 수 있거나 또는 비폴리펩티드 요소를 포함할 수 있으며, 예컨대, 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다는 것에 주의하여야 한다.

항체에 있어서의 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개의 아미노산인 것으로 여겨진다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 바람직하게는 7개 이상, 더욱 바람직하게는 9개 이상, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 15 내지 약 30개 아미노산을 함유한다. CDR은 3차 형태의 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산들은 인접되어 있을 필요는 없으며, 일부 경우에, 심지어 동일 펩티드 쇄 상에 존재하지 않을 수 있다. 본 발명의 항SEMA4D 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 SEMA4D의 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 더욱 바람직하게, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 또는 약 15 내지 약 30개의 인접한 또는 비인접한 아미노산으로 된 서열을 함유할 수 있다.

"특이적으로 결합한다"라는 것은 일반적으로 항체가 그의 항원 결합 도메인을 통하여 에피토프에 결합하며 상기 결합은 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 일부 상보성을 수반함을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 그의 항원 결합 도메인을 통하여, 상기 항체가 관련없는 무작위 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 그 에피토프에 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. "특이성"이라는 용어는 본원에서 특정한 항체가 특정한 에피토프에 결합하는 상대적인 친화성을 정질화하는 데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대하여 더욱 높은 특이성을 가지는 것으로 간주될 수 있거나, 항체 "A"는 이것이 관련된 에피토프 "D"에 대하여 가지는 것보다 더욱 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.

"우선적으로 결합하다"라는 것은 항체가 관련 에피토프, 유사한 에피토프, 상동성 에피토프 또는 비슷한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 소정 에피토프에 특이적으로 결합함을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 상기 항체가 관련 에피토프와 교차 반응할 수 있음에도 불구하고, 관련 에피토프에 결합하는 것보다 그 에피토프에 결합할 가능성이 더 크다.

비제한적 예로서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수(K _D)보다 더 작은 해리 상수(K_D)로 제1 에피토프에 결합할 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체 K_D보다 10배 이상의 크기인 친화도로 제1 에피토프에 결합할 경우, 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체 K_D보다 10²배 이상의 크기인 친화도로 제1 에피토프에 결합할 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.

또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체 오프 속도(k(오프))보다 더 작은 k(오프)로 제1 에피토프에 결합할 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체 k(오프)보다 10배 이상, 더 작은 크기인 친화도로 제1 에피토프에 결합할 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체 k(오프)보다 10²배 이상, 더 작은 크기인 친화도로 제1 에피토프에 결합할 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 SEMA4D 및 뮤린 SEMA4D 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체)에 5 X 10^-2sec^-1, 10^-2sec^-1, 5 X 10^-3sec^-1 또는 10^-3sec^-1 이하인 오프 속도(k(오프))로 결합한다고 할 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 SEMA4D 및 뮤린 SEMA4D 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체)에 5 X 10^-4sec^-1, 10^-4sec^-1, 5 X 10^-5sec^-1, 또는 10^-5sec^-1, 5 X 10^-6sec^-1, 10^-6sec^-1, 5 X 10^-7sec^-1 또는 10^-7sec^-1 이하인 오프 속도(k(오프))로 결합한다고 할 수 있다.

본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 SEMA4D 및 뮤린 SEMA4D 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체)에 10³ M^-1sec^-1, 5 X 10³ M^-1sec^-1, 10⁴ M^-1sec^-1 또는 5 X 10⁴ M^-1sec^-1 이상의 온 속도(K(온))로 결합한다고 할 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 SEMA4D 및 뮤린 SEMA4D 둘 모두) 또는 그의 단편 또는 변이체)에 10⁵ M^-1sec^-1, 5 X 10⁵ M^-1sec^-1, 10⁶ M^-1sec^-1, 또는 5 X 10⁶ M^-1sec^-1 또는 10⁷ M^-1sec^-1 이상의 온 속도(K(온))로 결합한다고 할 수 있다.

항체가 참조 항체의 주어진 에피토프에의 결합을 어느 정도 차단하는 정도까지 상기 항체가 상기 에피토프에 우선적으로 결합한다면, 이때 항체는 참조 항체의 상기 주어진 에피토프에의 결합을 경쟁적으로 억제시킨다고 한다. 경쟁적 억제는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁적 ELISA 검정법에 의해 측정될 수 있다. 항체는 참조 항체의 주어진 에피토프에의 결합을 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상만큼 경쟁적으로 억제시킨다고 할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "친화도"라는 용어는 개별 에피토프와 면역글로불린 분자의 CDR과의 결합 강도의 척도를 나타낸다. 예컨대, 문헌 [Harlow et al., (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28]을 참조할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "친화력"이라는 용어는 면역글로불린 집단과 항원 사이의 복합체의 전반적인 안정성, 즉, 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적인 조합 강도를 나타낸다. 예컨대, 문헌 [Harlow at pages 29-34]를 참조할 수 있다. 친화력은 집단 중 개별 면역글로불린 분자와 특이 에피토프와의 친화도, 및 또한 면역글로불린과 항원의 결합가, 둘 모두와 관련이 있다. 예를 들어, 2가 단일클론 항체와, 예컨대, 중합체와 같이 고도로 반복하는 에피토프의 구조를 가지는 항원 사이의 상호작용은 친화력이 높은 것이 된다.

본 발명의 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 그의 교차 반응성 면에서 기술되거나, 구체화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "교차 반응성"이라는 용어는 한 항원에 대하여 특이적인 항체가 제2 항원과 반응할 수 있는 능력으로서, 2종의 상이한 항원성 물질들 사이의 관련성의 척도를 나타낸다. 따라서, 항체는 이것이 그의 형성을 유도한 것 이외의 에피토프에 결합할 경우 교차 반응성이다. 일반적으로 교차 반응성 에피토프는 유도 에피토프와 동일한 상보성 구조 특징부들 중 다수를 함유하며, 일부 경우에, 실제로 원래의 것보다 더욱 잘 피팅될 수 있다.

예를 들어, 특정 항체는 이것이 관련된, 그러나 동일하지 않은 에피토프들, 예컨대, (당업계에 공지 및 본원에 기술된 방법을 사용하여 계산할 때) 참조 에피토프에 대하여 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 및 50% 이상 동일한 에피토프들에 결합한다는 면에서 어느 정도의 교차 반응성을 가진다. 항체는 참조 에피토프와 (당업계에 공지 및 본원에 기술된 방법을 사용하여 계산할 때) 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만으로 동일한 에피토프들에 결합하지 않을 경우, 이는 교차 반응성이 거의 없거나 전혀 없다고 할 수 있다. 항체는 이것이 특정 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르토로그 또는 상동체에 결합하지 않을 경우, 그 에피토프에 대하여 "고도로 특이적인" 것으로 간주될 수 있다.

또한, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 SEMA4D 및 뮤린 SEMA4D 둘 모두에 대한 그의 결합 친화도 면에서 기술되거나 구체화될 수 있다. 바람직한 결합 친화도는 해리 상수 또는 Kd가 5 x 10^-2 M, 10^-2 M, 5 x 10^-3 M, 10^-3 M, 5 x 10^-4 M, 10^-4 M, 5 x 10^-5 M, 10^-5 M, 5 x 10^-6 M, 10^-6 M, 5 x 10^-7 M, 10^-7 M, 5 x 10^-8 M, 10^-8 M, 5 x 10^-9 M, 10^-9 M, 5 x 10^-10 M, 10^-10 M, 5 x 10^-11 M, 10^-11 M, 5 x 10^-12 M, 10^-12 M, 5 x 10^-13 M, 10^-13 M, 5 x 10^-14 M, 10^-14 M, 5 x 10^-15 M, 또는 10^-15 M 미만인 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 5 x 10^-9 내지 약 6 x 10^-9인 Kd로 인간 SEMA4D에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약 1 x 10^-9 내지 약 2 x 10^-9인 Kd로 뮤린 SEMA4D에 결합한다.

본원에서 사용되는 바, "키메라 항체"라는 용어는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득되거나 유래되고, 불변 영역(이는 본 발명에 따르면 온전한 것이거나, 부분적이거나, 또는 변형된 것일 수 있다)은 제2 종으로부터 수득되는 임의의 항체를 의미하는 것으로 여겨진다. 바람직한 실시양태에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비인간 공급원(예컨대, 마우스 또는 영장류)로부터의 것이며, 불변 영역은 인간 불변 영역이다.

본원에서 사용되는 바, "조작된 항체"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나 또는 그 둘 모두에서의 가변 도메인이 공지된 특이성의 항체로부터의 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해, 그리고 필요할 경우, 부분적인 골격 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변경된 항체를 나타낸다. 골격 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위 부류의 항체로부터 CDR들이 유래될 수 있지만, CDR들은 상이한 부류의 항체로부터 및 바람직하게는 상이한 종으로부터의 항체로부터 유래될 수 있다고 구상된다. 공지된 특이성의 비인간 항체로부터의 하나 이상의 "공여체" CDR들이 인간 중쇄 또는 경쇄 골격 영역 내에 그래프팅된 조작된 항체는 본원에서 "인간화된 항체"로 지칭된다. CDR들 전부를 공여체 가변 도메인으로부터의 전 CDR들로 대체하여 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 것으로 이전시키는 것이 필요없을 수도 있다. 오히려, 표적 결합 부위의 활성을 유지하는 데 필요한 잔기들을 이전시키는 것만이 필요할 수 있다.

인간화된 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 그 둘 모두에서의 가변 도메인 내의 골격 영역들은 오직 인간 기원의 잔기를 포함할 수 있다는 것 또한 인식되며, 이 경우, 인간화된 항체의 이들 골격 영역은 "완전 인간 골격 영역"으로 지칭된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US 제2010/0285036 A1호(이 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 MAb 2503으로 개시된 MAb VX15/2503). 별법으로, 공여체 가변 도메인의 골격 영역(들)의 하나 이상의 잔기는 필요할 경우 인간화된 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 그 둘 모두에서의 가변 도메인의 인간 골격 영역(들)의 상응하는 위치 내에서 조작되어 SEMA4D 항원에의 적당한 결합성을 유지하거나 또는 SEMA4D 항원에의 결합성을 증진시킬 수 있다. 따라서 이러한 방식으로 조작된 인간 골격 영역은 인간 및 공여체 골격 잔기의 혼합물을 포함하며, 본원에서 "부분적 인간 골격 영역"으로 지칭된다.

예를 들어, 본질적으로 항SEMA4D 항체의 인간화는 (Winter)와 동료들의 방법에 따라, 설치류 또는 돌연변이 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항SEMA4D 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다(문헌 [Jones et al., Nature 527:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)]). 또한, 미국 특허 번호 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호(상기 특허들은 본원에서 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다. 생성된 인간화된 항SEMA4D 항체는 인간화된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인의 완전 인간 골격 영역 내에 1 이상의 설치류 또는 돌연변이 설치류 CDR을 포함할 것이다. 일부 경우에, 인간화된 항 SEMA4D 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 골격 영역 내의 잔기는 상응하는 비인간(예를 들어, 설치류) 잔기로 대체되며(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 및 제6,180,370호를 참조), 이 경우, 생성된 인간화된 항SEMA4D 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인 내에 부분적 인간 골격 영역을 포함할 것이다.

추가로, 인간화된 항체는 수용체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 (예컨대, 원하는 친화도를 얻기 위하여) 추가로 항체 성능을 개량하기 위하여 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 1 이상의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 모두를 포함하며, 여기서, CDR 모두, 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 면역글로불린의 것에 상응하며, 골격 영역 모두, 또는 실질적으로 모든 골격 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한 인간화된 항체는 임의적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 설명을 대해 문헌 [Jones et al., Nature 357:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 552:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op . Struct . Biol 2:593-596 (1992)](상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. 따라서, 상기와 같은 "인간화된" 항체는 온전한 것보다 실질적으로 더 적은 인간 가변 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 항체를 포함할 수 있다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기와, 가능하게는 일부 골격 잔기가 설치류 항체에서의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조할 수 있다. 또한, 사전 결정된 항원에 대하여 개선된 친화도를 가지는 인간화된 항체, 및 인간화된 항체를 제조하는 기법이 개시되어 있는, 미국 특허 번호 제6,180,370호, 및 국제 공개 번호 WO 01/27160도 참조할 수 있다.

II. 신경 줄기/전구체 세포 또는 신경 줄기/전구 세포(NSPC)

신경발생이란 일반적으로 새 뉴런이 생산되는 것을 의미한다. 전통적으로 신경발생은 오직 배아기 및 출생 후 초기에만 발생하며, 성인 뇌에서는 어떤 중요한 역할도 하지 않는 것으로 여겨져 왔다. 그러나, 최근, 신경발생이 성체인 포유동물의 뇌의 선택된 영역에서도 발생할 수 있고, 상기 영역 뿐만 아니라, 손상에 대한 반응으로 다른 영역에서도 자극을 받을 수 있다는 가설이 주장되고 있다.

중추 신경계 및 말초 신경계 발생 동안, 신경 줄기 세포는 증식하고, 전구 세포로 분열하여, 최종적으로는 성인 뇌를 구성하는 세포 유형으로 분화된다. 신경관으로부터 유래된 세포는 CNS의 뉴런 및 아교세포를 생기게 하는 반면, 신경능으로부터 유래된 세포는 말초 신경계(PNS)의 세포를 생기게 한다.

신경 줄기/전구 세포 및 그의 치료학적 용도는 당업계에 기술되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,638,501호(Bjorason 등); 미국 특허 번호 제6,541,255호(Snyder 등); 미국 특허 번호 제6,498,018호(Carpenter); 미국 특허 출원 20020012903(Goldman 등); 문헌 [Palmer et al., (2001) Nature 411(6833):42-3]; [Palmer et al., (1997) Mol Cell Neurosci. 8(6):389-404]; [Svendsen et al., (1997) Exp. Neurol. 148(1): 135-46]; 및 [Shihabuddin (1999) Mol Med Today. 5(11):474-80]을 참조할 수 있다. 신경 줄기 세포를 단리 및 배양하는 방법 또한 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 제6,777,233호; 미국 특허 번호 제6,497,872호, 및 미국 특허 출원 20030143737 A1을 참조할 수 있다. 상기 참조 문헌들 모두 본원에서 참조로 구체적으로 포함된다.

신경 줄기 및 전구체 세포는 잘 확립된 이동 경로를 따라 이루어지는 파종 CNS 영역으로의 이동을 통한 정상적인 발생, 미세환경 신호에 대한 반응으로 이루어지는 세포 유형으로의 분화, 및 숙주 선조 및 그의 자손과의 산재에 참여한다. 인간 신경 줄기 세포는 상기 파종 위치에서 외래 생체내 트랜스진을 발현할 수 있다. 따라서, 상기 세포는 퇴행성 장애(예컨대, 알츠하이머병 및 파킨슨병), 급성 뇌 손상(예컨대, 뇌졸중, 두부 손상, 뇌성마비) 및 다수의 CNS 기능장애(예컨대, 우울증, 간질, 및 정신분열병)를 비롯한, CNS에서 이환되는 다양한 병증을 치료하는 데 사용될 수 있는 잠재능을 가진다.

최근, 신경퇴행성 질환은 상기 장애에 대한 위험이 가장 큰 노인 집단이 팽창하고 있는 바, 중요한 관심사가 되어 가고 있다. 알츠하이머 병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병을 비롯한, 상기 질환은 CNS의 특정 위치의 신경 세포 퇴행과 연관이 있으며, 이는 상기 세포 또는 뇌 영역이 그의 의도된 기능을 수행할 수 있는 능력을 불능으로 만든다.

기저핵으로서 알려져 있는 뇌 영역의 퇴행은 정확한 위치에 따라 다양한 인지 및 운동 증상을 동반한 질환으로 이어질 수 있다. 기저핵으로서 알려져 있는 뇌 영역의 퇴행은 정확한 위치에 따라 다양한 인지 및 운동 증상을 동반한 질환으로 이어질 수 있다. 기저핵은 선조체 (미상 및 피각으로 구성), 창백핵, 흑색질, 무명질, 배쪽 창백핵, 마이너트(Meynert) 기저핵, 배쪽 피개부 및 시상하부를 비롯한, 다수의 개별 영역으로 구성된다.

예를 들어, 알츠하이머 병에서는 전뇌 및 대뇌 피질의 세포 퇴행이 존재한다. 추가로, 기저핵의 부위인 마이너트 기저핵에서 국부화된 퇴행이 나타난다. 상기 핵은 보통 콜린성 투사로를, 기억을 비롯한 인지 기능에 참여하는 것으로 여겨지는 대뇌 피질로 보낸다. 헌팅턴 무도병에서, 한편, 선조체내 뉴런의 퇴행이 이루어지는데, 이로 인해 숙주에서 불수의 율동성 운동이 일어난다. 추가로, 파킨슨병에서는, 기저핵의 또 다른 부위인 흑색질 치밀부에서 퇴행이 관찰된다. 이는 보통 운동 조절에 중요한 등쪽 선조체로 도파민 연결부를 보낸다. 파킨슨병에 대한 요법에서는 도파민성 활성을 상기 회로로 수복시키는 데 주점을 도고 있다. 기저핵의 다른 영역 퇴행도 가능하다. 예를 들어, 시상하부로 명명되는 소형 영역의 퇴행은 무도병라 불리능 병증에서 사지를 난폭하게 플링잉하는(flinging) 운동과 관련이 있으며, 피각 및 창백핵의 퇴행은 느린 연동 운동 또는 무정위 운동증의 병증과 관련이 있다.

신경퇴행성 질환 이외에도, 급성 뇌 손상은 종종 신경 세포 손실, 이환된 뇌 영역의 부적절한 기능, 및 후속된 거동 이상을 일으킨다. 세포 손실 이외에도, 개체는 기존 신경 세포의 비정상적인 기능으로 고생할 수도 있다. 이는 뉴런의 부적절한 발화, 또는 신경전달물질의 비정상적인 합성, 방출, 및 프로세싱에 기인하는 것일 수 있다. 이러한 기능장애는 잘 연구되고, 특징이 규명되어 있는 장애, 예컨대, 우울증 및 간질, 또는 덜 이해되는 장애, 예컨대, 신경증 및 정신병의 결과일 수 있다. 다른 형태의 신경계 장애, 예컨대, 근위축성 측삭 경화증 및 뇌성마비가 신경 퇴행의 결과로서 발생할 수 있거나, 외상 뇌 손상(TBI) 및 뇌졸중에서 발생하는 것이 더욱 급성인 CNS 외상의 결과로서 발생할 수 있다.

III. 표적 폴리펩티드 설명

본원에서 사용되는 바, "세마포린-4D," "SEMA4D" 및 "SEMA4D 폴리펩티드"라는 용어는 "SEMA4D" 및 "Sema4D"와 같이 상호교환적으로 사용된다. 특정 실시양태에서, SEMA4D는 세포의 표면 상에서 발현되거나, 세포에 의해 분비된다. 또 다른 실시양태에서, SEMA4D는 막 결합형이다. 또 다른 실시양태에서, SEMA4D는 가용성이며, 예컨대, sSEMA4D이다. 다른 실시양태에서, SEMA4D는 전장의 SEMA4D 또는 그의 단편, 또는 SEMA4D 변이체 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 여기서, SEMA4D의 단편 또는 SEMA4D 변이체 폴리펩티드는 전장의 SEMA4D의 기능적 특성 중 일부 또는 그 모두를 유지하는 것이다.

전장의 인간 SEMA4D 단백질은 150 kDa인 2개의 폴리펩티드 쇄로 구성된 동종이량체 막횡단 단백질이다. SEMA4D는 세포 표면 수용체의 세마포린 패밀리에 속하고, 이는 또한 CD100으로도 지칭된다. 인간 및 마우스 SEMA4D/Sema4D, 단백질 분해 방식으로 둘 모두 그의 막횡단 형태로부터 절단되어 120 kDa 가용성 형태로 생성되는데, 이는 2개의 Sema4D 이소폼이 존재한다는 것을 나타낸다 (문헌 [Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)]). 세마포린은 뉴런과 그의 적절한 표적 사이에 정확한 연결을 확립하는 데 있어서 중요한 역할을 하는, 발생 동안의 축색 유도 인자로 원래 정의되었던 가용성 및 막 결합 단백질로 구성된다. 구조상 고려되는 부류 IV 세마포린인 SEMA4D는 아미노 말단 신호 서열, 이어서, 17개의 보존된 시스테인 잔기를 함유하는 특징적인 'Sema' 도메인, Ig 유사 도메인, 리신이 풍부한 스트레치, 소수성 막횡단 영역 및 세포질 테일로 구성된다

SEMA4D의 각각의 폴리펩티드 쇄는 약 13개 아미노산으로 된 신호 서열, 이어서, 약 512개 아미노산으로 된 세마포린 도메인, 약 65개 아미노산으로 된 면역글로불린 유사(Ig 유사) 도메인, 104개 아미노산으로 된 리신이 풍부 스트레치, 약 19개 아미노산으로 된 소수성 막횡단 영역, 및 110개 아미노산으로 된 세포질 테일을 포함한다. 세포질 테일 내의 티로신 인산화를 위한 컨센서스 부위는 SEMA4D와 티로신 키나아제와의 예상되는 회합을 지지한다(문헌 [Schlossman, et al., Eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford]).

SEMA4D는 3가지 이상의 수용체: 플렉신-B1, 플렉신-B2, 및 CD72를 가지는 것으로 알려져 있다. 상기 수용체 중 하나인 플렉신-B1은 비림프계 조직에서 발현되고, SEMA4D에 대한 고친화성(1 nM) 수용체인 것으로 나타났다(문헌 [Tamagnone et al., Cell 99:71-80 (1999)]). 특정 실시양태에서, 내피 세포는 플렉신-B1을 발현한다. 플렉신-B1 신호 전달의 SEMA4D 자극이 뉴런의 성장 원추 붕괴를 유도하고, 희소돌기아교세포의 돌기 연장 붕괴 및 아포프토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Giraudon et al., J Immunol . 772:1246-1255 (2004)]; [Giraudon et al., NeuroMolecular Med . 7:207-216 (2005)]). SEMA4D에의 결합 후, 플렉신-B1 신호전달은 R-Ras의 불활성화를 매개함으로써 세포외 기질에의 인테그린 매개된 부착을 감소시키며, 이는 또한 RhoA를 활성화시켜 세포골격을 재조직화함으로써 세포를 붕괴시킬 수 있다. 문헌 [Kruger et al., Nature Rev . Mol . Cell Biol. (5:789- 800 (2005)]; [Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 75:61-64 (2005)]를 참조할 수 있다. 플렉신-B2는 SEMA4D에 대해 중간 정도의 친화성을 가지며, PLXNB2는 각질세포에서 발현되고, SEMA4D 양성 γδ T 세포를 활성화시켜 상피 수복에 기여한다는 것이 최근 보도를 통해 나타났다(문헌 [Witherden et al., Immunity. 2012 Aug 24;37(2):314-25]).

림프계 조직에서, CD72는 저친화성(300 nM) SEMA4D 수용체로서 사용된다(문헌 [Kumanogoh et al., Immunity 75:621-631 (2000)]). B 세포 및 APC는 CD72를 발현하고, 항CD72 항체는 예컨대, CD40 유도성 B 세포 반응의 증진 및 CD23의 B 세포 박리(shedding) 증진과 같은, sSEMA4D와 동일한 효과 다수를 가진다. CD72는 많은 억제성 수용체와 회합할 수 있는 티로신 포스파타제 SHP-1을 동원함으로써 B 세포 반응의 음성 조절자로서 작용하는 것으로 여겨진다. SEMA4D와 CD72와의 상호작용은 SHP-1을 해리시키고, 이러한 음성 활성화 신호를 손실시킨다. SEMA4D는 시험관내에서 T 세포 자극 및 B 세포 응집 및 생존을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. SEMA4D 발현 세포 또는 sSEMA4D의 첨가는 시험관내에서 CD40 유도성 B 세포 증식 및 면역글로불린 생산을 증진시키고, 생체내 항체 반응을 가속화시킨다 (문헌 [Ishida et al., Inter . Immunol. 75:1027-1034 (2003)]; [Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol 22:670-676 (2001)]). sSEMA4D는 공동 자극 분자들의 상향 조절 및 IL-12의 분비의 증가를 비롯한, DC의 CD40 유도성 성숙을 증진시킨다. 추가로, sSEMA4D는 면역 세포 이동을 억제시킬 수 있으며, 이는 차단 항SEMA4D 항체의 첨가에 의해 역전될 수 있다(문헌 [Elhabazi et al., J Immunol . 166:4341-4347 (2001)]; [Delaire et al., J. Immunol 166:4348-4354 (2001)]).

Sema4D는 비장, 흉선, 및 림프절을 비롯한, 림프계 기관, 및 예컨대, 뇌, 심장 및 신장과 같은 비림프계 기관에서 고수준으로 발현된다. 림프계 기관에서, Sema4D는 휴지기 T 세포 상에서 풍부하게 발현되지만, 휴지기 B 세포 및 항원 제시 세포(APC), 예컨대, 수지상 세포(DC) 상에서는 단지 약하게 발현된다. 세포 활성화는 SEMA4D의 표면 발현 뿐만 아니라, 가용성 SEMA4D(sSEMA4D)의 생성도 증가시킨다.

SEMA4D의 발현 패턴은 SEMA4D가 면역계에 있어서의 중요한 생리학적 역할 뿐만 아니라, 병리학적 역할도 한다는 것을 시사한다. SEMA4D는 B 세포의 활성화, 응집 및 생존을 촉진시키고; CD40 유도성 증식 및 항체 생산을 증진시키며; T 세포 의존성 항원에 대한 항체 반응을 증진시키고; T 세포 증식을 증가시키며; 수지상 세포의 성숙 및 수지상 세포가 T 세포를 자극시킬 수 있는 능력을 증진시키는 것으로 밝혀졌으며; 이는 탈수초화 및 축색 퇴행과 직접적으로 연루된다(문헌 [Shi et al., Immunity 75:633-642 (2000)]; [Kumanogoh et al., J Immunol 7(59:1 175-1 181 (2002)]; 및 [Watanabe et al., J Immunol 7(57:4321-4328 (2001)]).

SEMA4D 넉아웃(SEMA4D-/-) 마우스는, SEMA4D가 체액성 및 세포성 면역 반응, 둘 모두에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증하는 추가의 증거를 제공하였다. SEMA4D-/- 마우스에서 비림프계 조직의 이상에 대해서는 알려져 있는 것이 없다. SEMA4D-/- 마우스로부터의 수지상 세포(DC)는 불량한 동종이계 자극 (allostimulatory) 능력을 가지며, 공동 자극성 분자의 발현에 결함을 나타내는데, 이는 sSEMA4D의 첨가에 의해 구제될 수 있다. SEMA4D 결함 마우스(SEMA4D-/-)에서는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩티드에 의해 유도되는 실험적 자가면역 뇌척수염이 발병되지 않는데, 그 이유는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 특이 T 세포가 SEMA4D의 부재하에서는 충분히 생성되지 못하기 때문이다(문헌 [Kumanogoh et al., J Immunol 7(59: 1175-1181 (2002)]). 정상적인 마우스가 아닌, 자가 면역에 걸리기 쉬운 MRL/lpr 마우스(예컨대, SLE와 같은 전신성 자가면역 질환의 모델)의 혈청에서 상당량의 가용성 SEMA4D 또한 검출된다. 추가로, sSEMA4D의 수준은 자가 항체의 수준과 상관 관계가 있으며, 노화됨에 따라 증가한다(문헌 [Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001)]). 또한 가용성 SEMA4D는 탈수초성 질환을 앓는 환자의 뇌척수액 및 혈청에 축적되는 것으로 밝혀졌으며, sSEMA4D는 인간 전능성 신경 전구체(Dev 세포)의 아포프토시스를 유도하며, 이들 둘 모두는 돌기 연장을 억제시키고, 시험관내에서 래트 희소돌기아교세포의 아포프토시스를 유도한다(문헌 [Giraudon et al., J Immunol 772(2):1246-1255 (2004)]). 이러한 아포프토시스는 항SEMA4D MAb에 의해 차단되었다.

IV. 항SEMA4D 항체

SEMA4D에 결합하는 항체는 당업계에서 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 제2008/0219971호 A1, US 2010/0285036 A1, 및 US 2006/0233793 A1, 국제 특허 출원 WO 93/14125, WO 2008/100995, 및 WO 2010/129917, 및 문헌 [Herold et al., Int . Immunol. 7(1): 1-8 (1995)](이들 각각은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다.

본 발명은 일반적으로 SEMA4D, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 앓는 피험체, 예컨대, 인간 환자에서 신경발생을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 SEMA4D와 그의 수용체들 중 하나 이상, 예컨대, 플렉신-B1과의 상호작용을 차단한다. 이들 특성을 가지는 항SEMA4D 항체는 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 항체로는 US 2010/0285036 A1에 상세하게 기술되어 있는 MAb VX15/2503, 67 및 76, 및 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 제공된 방법에서 사용될 수 있는 추가의 항체로는 US 2006/0233793 A1에 기술되어 있는 BD16 및 BB18 항체 뿐만 아니라, 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체; 또는 US 2008/0219971 A1에 기술되어 있는 바와 같은 MAb 301, MAb 1893, MAb 657, MAb 1807, MAb 1656, MAb 1808, Mab 59, MAb 2191, MAb 2274, MAb 2275, MAb 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284, 및 MAb 2285 중 임의의 것 뿐만 아니라, 그의 임의의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 항SEMA4D 항체는 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 SEMA4D 및 뮤린 SEMA4D 둘 모두에 결합한다. 상기 언급한 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및/또는 상기 언급한 항체 중 임의의 것을 경쟁적으로 억제시키는 항체 또한 유용하다.

MAb 67 VH 및 VK 유전자의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있으며, 여기서, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄체로 표시되어 있다.

인간화된 MAb 67 VH(H2160) 및 VK(L553)("MAb VX15/2503")의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있으며, 여기서, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄체로 표시되어 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 참조 항SEMA4D 항체 분자, 예를 들어, 상기 기술된 VX15/2503 및 67에 대한 아미노산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가진다. 추가의 실시양태에서, 결합 분자는 참조 항체와 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 이상의 서열 동일성을 공유한다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)의 CDR 중 1 이상이 서열 번호 1 또는 3의 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상, 동일하거나, 또는 그와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)의 CDR 중 1 이상이 서열 번호 5, 서열 번호 6, 또는 서열 번호 7과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상, 동일하거나, 또는 그와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)의 CDR 중 1 이상이 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하면, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 또는 서열 번호 7과 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 이상, 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어지며, 여기서, 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항SEMA4D 항체는 SEMA4D에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)의 CDR 중 1 이상이 서열 번호 2 또는 4의 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상, 동일하거나, 또는 그와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)의 CDR 중 1 이상이 서열 번호 8, 서열 번호 9, 또는 서열 번호 10과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상, 동일하거나, 또는 그와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)의 CDR 중 1 이상이 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하면, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 또는 서열 번호 10과 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어진다.

추가의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 유용한 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 이상, 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어지며, 여기서, 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항SEMA4D 항체는 SEMA4D에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.

본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 것으로는 모두는 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 항SEMA4D 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제조하기 위한 것인, 본원에 기술된 항SEMA4D 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 또한 포함한다.

본 발명의 항SEMA4D 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 상기 변이체는 모체 항SEMA4D 항체의 원하는 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체의 제조 방법은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다.

돌연변이 유발 방법 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)]; [Kunkel, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 52:488-492 (1985)]; [Kunkel et al., Methods Enzymol . 754:367-382 (1987)]; [Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.)]; 미국 특허 번호 제4,873,192호; 및 상기 문헌에서 인용된 참고 문헌들(이들은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 적절한 아미노산 치환에 관한 가이던스는 문헌 [Dayhoff et al., (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352](상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)의 모델에서 살펴볼 수 있다. 문헌 [Dayhoff et al.]의 모델은 점 허용 돌연변이(PAM: Point Accepted Mutation) 아미노산 유사성 매트릭스 (PAM 250 매트릭스)를 사용하여 적합한 보존적 아미노산 치환을 결정한다. 보존적 치환, 예컨대, 하나의 아미노산을 유사한 특성을 가진 또 다른 것과 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 문헌 [Dayhoff et al.]의 모델의 PAM 250 매트릭스에 의해 교시되는 바와 같은 보존적 아미노산 치환의 예로는 Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln, 및 Phe↔Trp↔Tyr을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 변이체 구성에 있어서, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드의 변형은 본원에 기술된 바와 같이, 변이체가 원하는 특성, 예컨대, 세포의 표면 상에서 발현되거나 세포에 의해 분비되는 SEMA4D, 예컨대, 인간 SEMA4D, 뮤린 SEMA4D, 또는 인간 및 뮤린 둘 모두의 SEMA4D에 특이적으로 결합할 수 있고, SEMA4D 차단 활성을 가지는 특성을 계속하여 보유하도록 이루어진다. 명확하게는 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에서 이루어진 임의의 돌연변이는 그 서열을 리딩 프레임 밖에 배치해서는 안되며, 2차 mRNA 구조체를 생성할 수 있는 상보성 영역을 생성하지 않는 것이 바람직할 것다. 유럽 특허 출원 공개 번호 제75,444호를 참조할 수 있다.

항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 결합 특이성을 측정하는 방법은 표준 경쟁 결합 검정법, T 세포 또는 B 세포에 의한 면역글로불린 분비를 모니터링하는 검정법, T 세포 증식 검정법, 아포프토시스 검정법, ELISA 검정법 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, WO 93/14125; 문헌 [Shi et al., Immunity 75:633-642 (2000)]; [Kumanogoh et al., J Immunol 769: 1175-1181 (2002)]; [Watanabe et al., J Immunol 767:4321-4328 (2001)]; [Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001)]; 및 [Giraudon et al., J Immunol 772(2):1246-1255 (2004)](상기 문헌들은 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 검정법을 참조할 수 있다.

본원에 개시된 불변 영역, CDR, VH 도메인 또는 VL 도메인을 포함하는 임의의 특정 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드와 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 심지어 약 100% 이상, 동일한지 여부에 관한 쟁점에 대해 본원에서 논의할 때, 동일성(%)는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, BESTFIT 프로그램(위스콘신 시퀀스 애널리스 패키지서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 유닉스용 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group: 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크))와 같은 당업계에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 이용하여 측정될 수 있다. BESTFIT는 두 서열 사이의 상동성이 최상인 세그먼트를 찾기 위해 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]의 국소적 상동성 알고리즘을 사용한다. 특정 서열이 본 발명에 따른 참조 서열과 예를 들어, 95% 동일한지 여부를 측정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 파라미터는 물론 동일성(%)이 참조 폴리펩티드 서열 전장에 걸쳐서 계산되도록, 및 상동성에서 참조 서열내 아미노산의 총 개수의 최대 5% 이하의 갭이 허용되도록 설정된다.

본 발명의 목적상, 서열 동일성(%)는 갭 개방 패널티 = 12 및 갭 연장 패널티 = 2, BLOSUM 매트릭스 = 62와 함께 어핀(affine) 갭 검색을 사용하여 (Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘을 이용함으로써 측정될 수 있다. (Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘은 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]에 교시되어 있다. 예를 들어, 변이체는 1 내지 15개만큼의 아미노산 잔기, 1 내지 10개만큼의 아미노산 잔기, 예컨대, 6-10개만큼의 아미노산 잔기, 5개만큼의 아미노산 잔기, 4, 3, 2개만큼의 아미노산 잔기, 또는 심지어 1개만큼의 아미노산 잔기가 참조 항 SEMA4D 항체(예컨대, MAb VX15/2503, 67 또는 76)와 상이할 수 있다.

다수의 방식으로 효과기 기능을 변경시키기 위해 항SEMA4D 항체의 불변 영역을 돌연변이화시킬 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체에의 항체 결합을 최적화하는 Fc 돌연변이를 개시하는, 미국 특허 번호 제6,737,056호 B1 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2004/0132101호 A1을 참조할 수 있다.

본원에 제공된 방법에서 유용한 특정한 항SEMA4D 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 당업계에 공지된 기법을 이용하여 효과기 기능이 감소되도록 돌연변이화시킬 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해 이루어진 것)는 순환 변형 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시켜 혈청 반감기를 감소시킨다. 또한, 불변 영역의 다른 변형은 증가된 항원 특이성 또는 항체 가요성으로 인하여 향상된 국소화를 허용하는 올리고당 모이어티 또는 이황화 결합을 변형시키기 위하여 사용될 수 있다. 생성된 생리학적 프로필, 생체이용률 및 상기 변형의 다른 생화학적 영향, 예컨대, 종양 국소화, 생체내 분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 주지된 면역학적 기법을 이용하여 용이하게 측정 및 정량화될 수 있다.

본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항SEMA4D 항체는, 항체가 그의 동족 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 공유적 부착이 방지하지 않도록, 예컨대, 임의 유형의 분자의 항체에의 공유적 부착에 의해 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 항체 유도체는, 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 분해적 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합 등에 의해 변형된 항체를 포함한다. 임의의 다수의 화학적 변형이 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 유도체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.

"보존적 아미노산 치환"은 그 아미노산 잔기가 유사한 전하를 포함하는 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 전하를 포함하는 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는 아미노산을 포함한다. 별법으로, 돌연변이는 예컨대, 포화 돌연변이 유발에 의한 것과 같이 코딩 서열 모두 또는 그 일부를 따라서 무작위적으로 도입될 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 활성(예컨대, 항SEMA4D 폴리펩티드에 결합하거나, SEMA4D와 그의 수용체와의 상호작용을 차단하거나, 또는 피험체에서 신경발생을 촉진시킬 수 있는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

예를 들어, 돌연변이를 오직 항체 분자의 골격 영역 내에만 또는 오직 CDR 영역에만 도입할 수 있다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성 미스센스 돌연변이일 수 있으며, 즉, 항체가 항원에 결합하는 능력에 대하여 어떤 영향도 미치지 않거나, 영향을 거의 미치지 않을 수 있다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 사용 빈도를 최적화하는 데, 또는 하이브리도마의 항체 생산을 개선시키는 데 유용할 수 있다. 별법으로, 비중성 미스센스 돌연변이는 항체가 항원에 결합하는 능력을 변경시킬 수 있다. 당업자는 예컨대, 항원 결합 활성 변경되지 않은, 또는 결합 활성이 변경된(예컨대, 항원 결합 활성이 개선된 또는 항체 특이성이 변화된) 것과 같은 원하는 특성을 가지는 돌연변이체 분자를 디자인 및 테스트할 수 있다. 돌연변이 유발 후, 코딩된 단백질은 통상적으로 발현될 수 있으며, 코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예컨대, SEMA4D 폴리펩티드의 1 이상의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 능력)은 본원에 기술된 기법을 이용하여 또는 당업계에 공지된 기법을 통상적으로 변형시킴으로써 측정될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항SEMA4D 항체는 1 이상의 최적화된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. "최적화된 CDR"이란 최적화된 CDR을 포함하는 항SEMA4D 항체에 부여된 항SEMA4D 활성 및/또는 결합 친화성을 개선시키도록 CDR이 변형 및 최적화된 것으로 의도된다. "항SEMA4D 활성" 또는 "SEMA4D 차단 활성"은 SEMA4D와 관련된 하기 활성들 중 하나 이상의 것을 조정하는 활성을 포함할 수 있다: B 세포의 활성화, 응집 및 생존; CD40 유도성 증식 및 항체 생산; T 세포 의존성 항원에 대한 항체 반응; T 세포 또는 다른 면역 세포의 증식; 수지상 세포의 성숙; 탈수초화 및 축색 퇴행; 전능성 신경 전구체 및/또는 희소돌기아교세포의 아포프토시스; 내피 세포 이동 유도; 자발적 단핵구 이동 억제; 세포 표면 플렉신-B1 또는 다른 수용체에의 결합, 또는 가용성 SEMA4D 또는 SEMA4D+ 세포의 표면 상에서 발현되는 SEMA4D와 관련된 임의의 다른 활성. 항SEMA4D 활성은 또한 림프종을 비롯한 특정 유형의 암, 자가면역 질환, 중추 신경계(CNS) 및 말초 신경계(PNS) 염증성 질환을 비롯한, 염증성 질환, 이식 거부, 및 침윤성 혈관신생을 포함한, 이에 한정되지 않는, SEMA4D 발현과 관련된 질환의 발병 또는 중증도 감소의 원인이 될 수 있다. 뮤린 항SEMA4D MAbs BD16 및 BB18에 기초한 최적화된 항체의 예는 미국 공개 번호 제2008/0219971호 A1, 국제 특허 출원 WO 93/14125 및 문헌 [Herold et al., Int . Immunol. 7(1): 1-8 (1995)](상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 변형은, 항SEMA4D 항체가 SEMA4D 항원에 대한 특이성을 보유하도록, 및 개선된 결합 친화성 및/또는 개선된 항SEMA4D 활성을 가지도록 CDR 내의 아미노산 잔기를 대체하는 것을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 출원의 결합 분자, 예컨대, 항SEMA4D 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SEMA4D 활성, 및/또는 SEMA4D와 SEMA4D 수용체 또는 그의 일부와의 상호작용을 억제시킨다. 특정 실시양태에서, 억제된 SEMA4D 활성은 하기 중 하나 이상의 것을 포함한다: B 세포의 활성화, 응집 및/또는 생존; CD40 유도성 증식 및/또는 항체 생산; T 세포 의존성 항원에 대한 항체 반응; T 세포 또는 다른 면역 세포의 증식; 수지상 세포의 성숙; 탈수초화 및 축색 퇴행; 전능성 신경 전구체 및/또는 희소돌기아교세포의 아포프토시스; 내피 세포 이동 유도; 자발적 단핵구 이동 억제; SEMA4D 이량체화; 세포 표면 플렉신-B1 또는 다른 수용체에의 결합, 또는 가용성 SEMA4D 또는 SEMA4D+ 세포의 표면 상에서 발현되는 SEMA4D와 관련된 임의의 다른 활성.

본원에서 사용되는 바, "억제시키다"라는 것은 예컨대, 결합, 활성, 기능, 상호작용 또는 다른 측정가능한 특징을 부분적으로 또는 완전하게 차단하는 것을 포함할 수 있다.

V. 치료학적 항SEMA4D 항체를 이용한 치료 방법

본 발명의 방법은 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 앓는 피험체에서 신경발생을 촉진시키는 데 있어서 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체와 그의 항원 결합 단편, 변이체, 및 유도체의 용도에 관한 것이다. 하기 논의는 항SEMA4D 항체의 투여를 언급하지만, 본원에 기술된 방법은 본 발명의 항SEMA4D 항체의 바람직한 특성, 예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간, 마우스, 또는 인간 및 마우스 SEMA4D에 특이적으로 결합할 수 있고/있거나, SEMA4D 중화 활성을 가지고/가지거나, SEMA4D와 그의 수용체, 예컨대, 플렉신-B1의 상호작용을 차단할 수 있는 특성을 보유하는 상기 항SEMA4D 항체의 항원 결합 단편, 변이체, 및 유도체에도 또한 적용가능하다.

한 실시양태에서, 치료는 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 앓거나, 그가 발병될 위험이 있는 환자에게 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 적용시키거나, 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 치료는 또한 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 앓거나, 그가 발병될 위험이 있는 환자에게 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 적용시키거나, 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도된다.

한 실시양태에서, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 환자에게 혈뇌 장벽을 통과할 수 있는 (즉, 뇌 측에서 작용할 수 있는) 임의의 형태를 비롯한, 임의의 종래 형태로 전달될 수 있다. SEMA4D와, 혈뇌 장벽 완전성을 유지하는 데 중요한 뇌 상주 세포인 성상세포 상의 수용체와의 상호작용으로 기인하여, 항SEMA4D 결합 분자를 혈뇌 장벽의 뇌 측에 적용시키거나 또는 투여함으로써 SEMA4D와 성상세포 상의 수용체와의 상호작용을 차단시킬 수 있다. 인자가 혈뇌 장벽을 통과할 수 있도록 하는 방법으로는 인자의 크기를 축소시키거나(소수성 인자일 경우, 이는 더욱 쉽게 통과할 수 있다), 조절제를, 혈뇌 장벽을 통과하는 실질적으로 투과 계수를 가지는 운반체 분자를 컨쥬게이트시키는 것을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 환자에게 혈뇌 장벽을 우회할 수 있는 (즉, 혈액 측에서 작용할 수 있는) 임의의 형태를 비롯한, 임의의 종래 형태로 전달될 수 있다. SEMA4D와 내피 세포 상의 수용체와의 상호작용으로 기인하여, 항SEMA4D 결합 분자를 혈액 측에 적용시키거나 또는 투여할 수 있다. 항SEMA4D 결합 분자를, 그를 혈액 측에 노출시키는 경로, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 정맥내 투여에 의해 투여함으로써, 항SEMA4D 결합 분자를 통해 SEMA4D와, 내피 세포에 의해 발현된 SEMA4D 수용체 또는 그 수용체의 일부와의 상호작용을 억제시킬 수 있도록 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 생체내에서, 성장 인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 세포를 형질감염시킴으로써 세포 그 자체가 상기 인자를 생산할 수 있도록 함으로써 혈액 장벽을 우회할 수 있다. 세포를 변형시키는 임의의 유용한 유전적 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 예를 들어, 성장 인자를 발현하도록 세포를 유전적으로 변형시키는 것 이외에도, 다른 유형의 신경계 작용제, 예컨대, 신경전달물질을 발현하도록 세포를 변형시킬 수 있다. 바람직하게, 뇌실 영역에 내층을 형성하는 세포를 재조합 레트로바이러스로 감염시키거나, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 형질감염시킴으로써 유전적으로 변형시킬 수 있다.

항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 본원에 기술된 항체 또는 그의 결합 단편은 다양한 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애 치료는 신경발생 촉진을 포함하는 것으로 의도된다. 다른 실시양태에서, 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애 치료는 전구 세포의 증식을 증가시키는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 다른 실시양태에서, 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애 치료는 전구 세포 분화를 증진시키는 것으로 의도된다. 다른 실시양태에서, 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애는 전구체 또는 전구 세포의 생존을 증가시키는 것으로 의도된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 특히 증식을 증가시키고/시키거나, 분화를 증진시키고/시키거나, 전구체 또는 전구 세포의 생존을 증가시킴으로써 신경발생을 촉진시켜 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 의약으로서의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 적용 방법은 전구 세포의 개수를 증가시키고/시키거나, 그의 분화를 증진시키고/시키거나, 그의 생존을 증가시킨다.

본 발명의 방법에 따라, 본원 다른 곳에서도 정의되어 있는 바와 같이, 1 이상의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애와 관련하여 긍정적인 치료 반응을 촉진시키는 데 사용될 수 있다.

중추 신경계 장애와 관련하여 "긍정적인 치료 반응"은 이들 항체의 항염증성 활성, 항형관신생 활성, 항아포프토시스 활성 등과 관련된 질환의 개선 및/또는 상기 질환과 관련된 증상의 개선을 포함하는 것으로 의도된다. 즉, 항증식성 효과인, SEMA4D를 발현하는 세포 또는 SEMA4D에 대한 수용체를 발현하는 세포의 추가 증식 방지, 염증성 시토카인, 부착 분자, 프로테아제, 면역글로불린(SEMA4D 또는 SEMA4D 수용체를 보유하는 세포가 B 세포일 경우), 그의 조합 등의 분비 감소를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 염증성 반응 감소, 항염증성 단백질 생산 증가, 자가반응성 세포의 개수 감소, 면역 내성의 증가, 자가반응성 세포의 생존 억제, 아포프토시스의 감소, 내피 세포 이동 감소, 자발적 단핵구 이동 증가, sSEMA4D 또는 SEMA4D 발현 세포의 자극에 의해 매개되는 하나 이상의 증상의 감쇠 및/또는 감소가 관찰될 수 있다. 상기와 같은 긍정적인 치료학적 반응은 투여 경로에 한정되는 것은 아니며, 공여체, 공여체 조직(예컨대, 기관 관류), 숙주, 그의 임의 조합 등에의 투여를 포함할 수 있다. 특히, 본원에 제공된 방법은 환자에서의 신경염증성 장애의 발병을 억제, 예방, 감소, 완화 또는 경감시키는 것에 관한 것이다. 따라서, 예를 들어, 질환 개선은 임상적으로 관찰가능한 증상의 부재, 전구체 또는 전구 세포의 증식, 분화 및/또는 생존 증가를 특징으로 할 수 있다. 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 적어도 하나 이상의 신경염증성 장애 치료법과 함께 병용되어 사용될 수 있으며; 추가 요법은 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체 요법 이전에, 그 동안, 또는 그 이후에 수행된다. 따라서, 병용 요법이 또 다른 치료제 투여와 병용하여 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 투여하는 것을 포함하는 경우, 본 발명의 방법은 별개의 제제 또는 단일 약학 제제를 사용하여 동시에 또는 임의 순서로 연속 투여로 수행되는 공동 투여를 포함한다.

VI. 약학 조성물 및 투여 방법

항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제조하고, 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 방법은 당업계에 주지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구 투여, 흡입에 의한 것 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비경구라는 용어는 예컨대, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 모든 이러한 형태의 투여는 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 명백하게 고려되지만, 투여 형태의 예로는 주사용 액제, 특히, 정맥내 또는 동맥내 주사용 또는 점적용 액제가 있다. 주사용으로 적합한 약학 조성물은 완충제(예컨대, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트), 임의적으로 안정제(예컨대, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시와 양립가능한 다른 방법에서, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 해로운 세포 집단의 부위에 직접적으로 전달함으로써 이환된 조직의 치료제에의 노출을 증가시킬 수 있다.

본원에서 논의된 바와 같이, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 신경염증성 장애의 생체내 치료를 위한 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 결합 분자는 활성제의 투여를 돕고 활성제의 안정성을 촉진하도록 제제화될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 비독성 멸균 담체, 예컨대, 생리식염수, 비독성 완충제, 보존제 등을 포함한다. 본 출원의 목적상, 약학적 유효량의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 표적에의 유효한 결합을 달성하고, 이득을 달성하기에 충분한 양, 예컨대, 중추 신경계 장애, 예컨대, 신경퇴행성 장애, 신경염증성 장애, 급성 뇌 손상, 및 특정 CNS 기능장애를 앓는 피험체에서 신경발생을 촉진시키는 데 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명에서 사용되는 약학 조성물은 예컨대, 이온 교환체, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 식물성 포화 지방산들의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염, 또는 전해질, 예컨대, 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기재 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 양모지를 비롯한, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일, 및 주사가능 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체로는 예컨대, 물, 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 이는 염수 및 완충 매질을 포함한다. 본 발명에서, 약학적으로 허용되는 담체는 0.01-0.1 M, 바람직하게는 0.05 M의 포스페이트 완충제 또는 0.8% 염수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 일반적인 비경구용 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산화 링거, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내용 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대, 링거 덱스트로스를 기재로 하는 것 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제 또한 존재할 수 있다.

더욱 특히, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성일 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 욕액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 상기 경우에, 조성물은 멸균성이어야 하며, 주사가 용이하게 이루어질 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건하에서 안정하여야 하며, 예컨대, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되는 것이 바람직할 것이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액인 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에서 사용하기에 적합한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기술되어 있다.

미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 주사가능 조성물이 장기간 동안 흡수되게 할 수 있다.

임의의 경우에, 멸균 주사가능 용액은 활성 화합물(예컨대, 항SEMA4D 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체 단독 또는 다른 활성제와 조합하여)을 본원에 열거된 성분들 중 하나 또는 상기 성분들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시키고, 이어서, 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조되고, 멸균 주사가능 용액 제조용 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이를 통해 이전의, 그의 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말이 생성된다. 주사용 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 프로세싱되고, 용기, 예컨대 앰플, 백, 병, 시린지 또는 바이알 내로 충전되고, 무균 조건하에서 실링된다. 추가로, 상기 제제는 키트의 형태로 패키징되어 판매될 수 있다. 이러한 제조 물품은 관련된 조성물이 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 질환 또는 장애에 걸리기 쉬운 피험체를 치료하는 데 유용함을 나타내는 라벨 또는 패키지 인서트를 가질 수 있다.

비경구용 제제는 1회 볼루스 용량, 주입 또는 로딩 볼루스 용량, 이어서, 유지 용량일 수 있다. 이들 조성물은 특정한 고정된 간격 또는 가변적 간격으로, 예컨대, 1일 1회, 또는 "필요한 경우"를 바탕으로 하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 특정 약학 조성물은 예컨대, 캡슐제, 정제, 수성 현탁제 또는 액제를 비롯한, 허용되는 투여 형태로 경구적으로 투여될 수 있다. 특정 약학 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 그러한 조성물은 벤질 알콜 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 다른 종래 가용화제 또는 분산화제를 이용하여 염수 중 액제로서 제조될 수 있다.

담체 물질과 조합되어 1회 투여 형태를 생성하기 위한 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 1회 용량, 다회 용량으로 투여되거나, 주입에 있어서 확립된 기간의 시간에 걸쳐서 투여될 수 있다. 투여 요법은 또한 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.

본 발명의 범주에 따르면, 항SEMA4D 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료 효과를 생성하기에 충분한 양으로 상기 언급된 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 항SEMA4D 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 공지된 기법에 따라 본 발명의 항체를 종래 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합함으로써 제조되는 종래 투여 형태로 상기 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 당업자는 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 그와 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로, 및 다른 주지된 변수에 의해 결정됨을 인식할 것이다. 당업자는 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체 중 하나 이상의 종을 포함하는 본 발명의 칵테일이 사용될 수 있다는 것 또한 이해할 것이다.

"치료학상 유효 용량 또는 치료적 유효량" 또는 "유효량"이란, 투여되었을 때, 치료하고자 하는 질환을 앓는 환자의 치료와 관련하여 긍정적인 치료 반응, 예컨대, 전구체 또는 전구 세포의 증식을 증가시키고/시키거나, 분화를 증진시키고/시키거나, 생존을 증가시키는 반응을 일으키는, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 양인 것으로 의도된다.

신경발생을 촉진시키기 위한, 본 발명의 조성물의 치료학상 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자가 인간이든 동물이든 간에 상관없이, 환자의 생리학적 상태, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 비롯한, 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유류를 포함하는 비인간 포유동물도 치료될 수 있다. 치료제 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위하여 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 이용하여 적정될 수 있다.

1 이상의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여량은 본 발명의 개시 내용이 주어질 경우 과도한 실험 없이 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 결정된다. 1 이상의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 방식 및 각각의 양에 영향을 주는 인자로는 질환의 중증도, 질환 병력, 및 요법을 받고 있는 개체의 연령, 신장, 체중, 건강, 및 신체 상태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유사하게, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체의 투여량은 투여 방식 및 피험체가 1회 용량으로 또는 다회 용량으로 상기 작용제를 받는지 여부에 따라 달라진다.

본 발명은 또한 의약은 1 이상의 다른 요법으로 예비치료를 받은 피험체에서 사용되는 것인, 신경염증성 장애 치료를 위한 피험체 치료용 의약의 제조에 있어서의 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공한다. "예비치료를 받은" 또는 "예비치료"라는 것은 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 의약을 받기 이전에 피험체가 하나 이상이 다른 요법을 받았음을(예컨대, 1 이상의 다른 신경염증 요법으로 치료받았음을) 의도한다. "예비치료를 받은" 또는 "예비치료"는 항SEMA4D 결합 분자, 예를 들어, 본원에 개시된 단일클론 항체 VX15/2503, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 의약을 이용한 치료의 개시 이전 2년 이내, 18개월 이내, 1년 이내, 6개월 이내, 2개월 이내, 6주 이내, 1개월 이내, 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내, 1주 이내, 6일 이내, 5일 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일, 또는 심지어 1일 이내에 1 이상의 다른 요법으로 치료를 받은 피험체를 포함한다. 피험체는 이전의 요법 또는 요법들을 이용한 예비치료에 대한 반응자일 필요는 없다. 따라서, 항SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 의약을 받는 피험체는 이전의 요법을 이용한 예비치료에 대하여 또는 예비치료가 다중 요법을 포함한 경우, 이전의 요법들 중 하나 이상에 대하여 반응하였을 수 있거나 반응하지 못하였을 수 있다.

본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 포함되어 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래 기법을 이용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)]; [D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 미국 특허 번호 제4,683,195호(Mullis 등); [Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization]; [Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation]; [Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)]; [Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)]; [Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155]; [Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)]; [Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV]; [Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)]; 및 [Ausubel et al., (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]를 참조할 수 있다.

항체를 조작하는 일반 원리는 문헌 [Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)]에 기재되어 있다. 단백질을 조작하는 일반 원리는 문헌 [Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)]에 기재되어 있다. 항체 및 항체-합텐 결합에 관한 일반 원리는 문헌 [Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.)]; 및 [Steward (1984) Antibody, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)]에 기재되어 있다. 추가로, 문헌 [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York]; [Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)] 및 [Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)]에서와 같이, 당업계에 공지된, 및 구체적으로 기술되지 않은 면역학의 표준 방법을 일반적으로 따른다.

면역학의 일반 원리를 기재하는 표준 참조 문헌으로는 문헌 [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY)]; [Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY)]; [Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam)]; [Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; H. Freemand & Co.)]; [Roitt et al., (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby)]; [Abbas et al., (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division)]; [Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan)]; [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)]; [Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003)]; [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)]; [Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)]를 포함한다.

상기에 인용된 모든 참고 문헌 뿐만 아니라, 상기 참고 문헌에서 인용된 모든 참고 문헌도 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

하기 실시예는 한정하는 것이 아니라, 예시로서 제공된다.

실시예

실시예 1: 실험 디자인

기본 실험 디자인은 도 1에 제시되어 있다. 수컷, 6주령된 CB-17/lcr-1/1Jcl 마우스("CB-17 마우스")를 사용하여 항SEMA4D 항체가 뇌졸중 손상 후 신경발생에 미치는 효과에 대해 평가하였다. 마우스가 중간 대뇌 동맥(MCA) 폐색(MCAO)에 걸리게 하였다. 간략하면, 동물을 30% 산소/70% 아산화질소 혼합물 중 4% 할로탄을 이용하여 깊은 마취 상태에 빠지도록 배치하고, 마취 계획은 1-2% 할로탄을 이용하여 유지시켰다. 어디에나 기술되어 있는 바와 같이(문헌 [Taguchi et al., 2004, 2007]), 좌측 중간 대뇌 동맥(MCA)의 원위부를 결찰시키고, 단절시킴으로써 영구적인 국소 대뇌 허혈을 유발하였다. 동물을 할로탄 마취하에 놓은 상태에서 좌측 MCA를 단리시키고, 전기로 소작시키고, 후각로 교차 지점에 대해 가장 먼 쪽 원위부(원위부 M1)를 단절시켰다. 앞서 기술된 바와 같이(문헌 [Matsushita et al., 1998]) MCA 부위의 대뇌 혈류량(CBF)을 모니터링하였다. 상기 마우스 계통에서 발생된 대뇌 경색은 고도로 재현가능하고, 동측 대뇌 피질로 제한된다(문헌 [Taguchi et al., 2004, 2007]).

폐색 후, 마우스를 2개의 군으로 나누었다: 치료군에는 항SEMA4D 항체 MAb 67-2를 주사하고, 대조군에는 IgG 이소형 대조군 MAb 2B8을 주사하였다. 마우스는 MCAO후 1시간, 3시간, 3일, 7일, 14일 및 21일째에 복강내(IP) 주사를 통해 0.6 mg/kg의 단일클론 항체를 받았다.

MCAO 후 7일째, 각 항체 주사 코호트로부터의 동물의 서브세트를 희생시키고, 뇌를 추출하고, 면역조직화학법 및 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 조직을 분석하였다.

뇌 절편의 면역조직화학적 분석을 위해, 2% 파라포름알데히드-리신-페리오데이트(PLP) 고정제(0.75 M 리신-HCl/0.01 M 페리오데이트/0,075 M 포스페이트 완충제)를 이용하여 동물에 관류시키고, 저온 유지 장치 상에서 뇌를 20 ㎛ 두께의 절편으로 절단하였다. 퀀칭을 위해 뇌 절편을 0.1% H₂O₂로 처리하고, 포스페이트 완충처리된 염수(PBS) 중에서 세척하고, 희석용 완충제(0.3% 트리톤(Triton)-X-100/5% 말 혈청/PBS) 중 하기 1차 항체들 중 하나 이상의 것과 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다: 뉴런에 대한 항NeuN, 신경 줄기/전구체 세포에 대한 항네스틴 및 항Sox2. PBS로 3회에 걸쳐 세척한 후, 절편을 3시간 동안 적절한 2차 항체와 함께 인큐베이션시킨 후, 이어서, NeuN 염색에 대해서는 디아민 벤지딘(DAB; diamine benzidine, 시그마(Sigma))과 함께 퍼옥시다제 ABC 엘리트 키트(Elite Kit)(벡터 라보라토리즈(Vector Laboratories: 미국 캘리포니아주 벌링게임))를 이용하여 ABC 반응에 의해 시각화하였다. 네스틴/Sox2 이중 면역 세포 화학법을 위해서는 FITC-표지화(Sox2) 및 Cy3-표지화된(네스틴) 2차 항체를 사용하였다. 레이저 동일초점 현미경을 이용하여 형광 현미경사진을 수득하였다. 본 결과는 도 2A-E에 제시되어 있고, 하기에서 상세하게 논의한다.

RT-PCR 분석을 위해, MCAO 후 7일째 전체 RNA를 현미 해부된 뇌 조직으로부터 단리시키고, cDNA를 제조하였다. 하기 조건하에서 cDNA를 PCR 증폭시켰다: 94℃에서 15 s, 56℃에서 30 s, 및 68℃에서 1 min(40 사이클). 프라이머 서열은 하기와 같았다:

본 결과는 도 3A-D에 제시되어 있고, 하기에서 상세하게 논의한다.

CAO 후 14일 및 30일째 남은 코호트 마우스에서 행동 평가를 수행하였다. 피질 기능을 평가하기 위해, 오픈 필드 과제를 이용하여 행동 검사에 의해 마우스를 분석하였다. 간략하면, 동물이 사각 아크릴 박스(30 x 3 x 30 cm)에서 20분 동안 자유롭게 탐색할 수 있게 하였다. 인클로저의 천장에 있는 광원은 처음 10 min 동안에는 전원을 켜고(광주기), 이어서 후속된 10 min 간의 기간 동안에는 전원을 꺼두었다(암주기). 오픈 필드의 X 및 Y 뱅크 상에서 2개의 적외선 빔을 10 cm의 간격을 두고 이격된 상태로 바닥으로부터 2 cm 위쪽에 탑재하여 그들 사이에 플립 플롭 회로를 형성하였다. 동물에 의한 빔 교차의 총 횟수를 계수하고, 통행 행동(보행)으로서 점수화하였다. 본 결과는 도 6A-D에 제시되어 있고, 하기에서 상세하게 논의한다.

MCAO 후 30일째, 남은 코호트 마우스를 희생시키고, NeuN 면역조직화학법을 위해 뇌를 프로세싱하였다. 4% 파라포름알데히드를 이용하여 경심관류로 마우스에 관류시키고, 뇌를 제거하고, 관상 절편(14 ㎛)을 NeuN에 대한 마우스 항체로 염색한 후, 비오티닐화된 염소 항마우스 IgG(케미콘(Chemicon: 미국 캘리포니아주 테메큘라); 1/500), ABC엘리트 키트(벡터 라보라토리즈: 미국 캘리포니아주 벌링게임), 및 발색체로서 DAB(시그마)와의 반응을 수행하였다. 이미지 J(Image J)를 이용하여 뉴런 핵 마커 NeuN이 점유하고 있는 동측 및 반대측 대뇌 반구의 면적을 측정하였다. 관상 배향의 동측 및 반대측 대뇌 반구 면적을 적분함으로써 동측 및 반대측 대뇌 반구 부피를 계산하였다. 동측 대뇌 반구 부피의 대합은 (동측/반대측 대뇌 반구 부피)로 계산하였다. 본 결과는 도 4A-D 및 도 5A-B에 제시되어 있고, 하기에서 상세하게 논의한다.

실시예 2: 항 SEMA4D 항체가

뇌 중 신경 줄기/전구체 세포의 존재에 미치는 효과

MCAO 후 7일째, 항SEMA4D 항체가 신경 줄기/전구체 세포의 존재에 미치는 효과를 연구하였다. 도 2에는 이소형 대조군으로 처리된 마우스(좌측 패널, A 및 C) 및 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스(우측 패널, B 및 D)의 경색 경계부(도 2E에서 기호로 표시) 중의 2개의 대표적인 부위로부터의 허혈성 조직의 면역 세포 화학 염색의 영상이 제시되어 있다. 본 결과는 대조군 항체로 처리된 마우스와 비교하여 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스에서 신경 줄기/전구 세포 마커 단백질의 발현이 증가되었다는 것을 나타낸다. 본 데이터는 항SEMA4D 항체가 허혈성 뇌에서 신경 줄기/전구체 세포 집단을 보호할 수 있고/있거나, 신경발생을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.

MCAO 후 7일째 허혈성 조직에서 종래 RT-PCR에 의해 항SEMA4D 항체 및 이소형 대조군으로 처리된 마우스에서 신경 줄기/전구체 세포의 mRNA 발현을 검출하였다. 본 결과는 도 3A-D에 제시되어 있다. 본 결과에서는 이소형 대조군 항체로 처리된 마우스와 비교하여 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스에서 Sox2, 네스틴 및 PLP의 발현이 하우스키핑 유전자인 β 액틴에 비하여 유의적으로 증가(p<0.05)한 것으로 나타났다. Sox2 및 네스틴은 신경 줄기/전구체 세포에 대한 마커인 바, 항SEMA4D 항체로 처리한 이후의 상기 마커의 발현 증가는 항SEMA4D 항체가 신경발생을 촉진시킬 수 있다는 것을 시사한다. 허혈성 뇌에서 항SEMA4D 처리 후에 관찰되는 신경발생 증가는 신경 줄기/전구체 세포 증식 증가, 및/또는 새로 형성된 신경 줄기/전구체 세포의 생존 증가의 결과일 수 있다.

실시예 3: 항SEMA4D 항체가

대뇌 경색 후 뇌 부피에 미치는 효과

MCAO 후 30일째, 항SEMA4D 항체가 뇌의 부피에 미치는 효과를 연구하였다. 도 4A-4B에는 1마리의 대표 이소형 대조군 마우스(좌측, 4A) 및 1마리의 대표 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스(우측, 4B)로부터의 성숙한 뉴런 마커인 NeuN에 대해 특이적인 항체로 염색된 뇌 절편이 제시되어 있다. 뇌 부피는 선조체(실선) 및 반구(점선)의 부피로 나타낸 것이다. 도 4C-4D에는 각각의 마우스 처리군에 대한 선조체 및 반구 부피의 비(L/R) 계산치를 각각 나타낸 것이다. 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스와 이소형 대조군으로 처리된 마우스 사이에는 뇌의 전체 반구 부피에 있어서 어떤 유의적인 차이도 없는 반면(파선), 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스는 대조군 항체로 처리된 마우스보다 유의적으로 더 큰 선조체 부피(실선)를 가졌다(실선). 본 데이터는 국소 허혈성 손상부에 인접한 선조체 영역이 항SEMA4D 항체 치료에 의해 보호될 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 4: 항SEMA4D 항체가

MCAO 뇌 중 뉴런의 존재에 미치는 효과

MCAO 후 30일째, 항SEMA4D 항체가 뇌 중 뉴런의 존재에 미치는 효과를 연구하였다. 도 5에는 1마리의 대표 이소형 대조군 마우스(하단 패널, 5B) 및 1마리의 대표 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스(상단 패널, 5A)로부터의 허혈성 뇌 조직의 NeuN 염색된 영상이 제시되어 있다. 본 결과에는 대조군 항체로 처리된 마우스와 비교하였을 때, 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스에서는 대뇌 경색의 경계부(화살표 표시) 중 선조체에서의 성숙한 뉴런 세포 마커인 NeuN의 발현 증가가 이루어진 것으로 나타났다. 상기 데이터는 항SEMA4D 항체 처리가 허혈성 뇌에서 잠재적으로는 신경 줄기/전구체 세포 집단을 보호하고/하거나, 신경발생을 유도함으로써 성숙한 뉴런의 발생을 촉진시킨다는 것을 시사한다.

실시예 5: 항SEMA4D 항체가

MCAO 마우스의 행동적 활동에 미치는 효과

MCAO 후 30일째, 항SEMA4D 항체가 행동적 활동에 미치는 효과를 연구하였다. 항SEMA4D 항체 및 대조군 IgG로 처리된 마우스에 대해 명암 환경하에서 10분 동안 오픈 필드 테스트를 수행하였다. 도 6A-6B에는 MCAO를 앓는 마우스(대조군 IgG 처리된 마우스 및 항SEMA4D 항체 처리된 마우스 둘 모두)가 모의 처리된 마우스와 비교하였을 때, 어떻게 암기 단계가 아닌 명기 단계에서 유의적으로 더 높은 활동량(p<0.05)을 보였는지 제시되어 있다. 마우스는 보통 명기 환경으로부터 암기 환경으로 들어갔을 때 활동 증가를 보였다. 도 6C에는 암기 단계/명기 단계 보행 활동의 비는 모의 치료된 마우스와 필적할 정도로, 대조군 항체로 처리된 마우스(p<0.05)와는 대조적으로 항SEMA4D 항체로 처리된 마우스에서 유의적인 개선되었다는 것이 제시되어 있다. 암기 단계/명기 단계 비는 항SEMA4D 군 및 모의 수술군 사이에 어떤 유의적인 차이도 없었다. 본 결과는 MCAO 병변을 가지는 마우스의 항SEMA4D 항체 처리가 암/명 자극에 대한 그의 반응을 정규화시키는 작용을 할 수 있는 반면, 대조군 IgG를 받은 마우스는 전형적으로 MCAO 병변을 가지는 마우스가 비정상적인 암기/명기 활동을 유지하는 것으로 보인다고 시사한다.

실시예 6: 항SEMA4D 항체가

혈뇌 장벽 완전성 및 신경발생에 미치는 효과

영구 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)을 앓는 래트 모델에서 항SEMA4D가 혈뇌 장벽(BBB 완전성) 및 신경발생에 미치는 효과(들)를 평가하기 위해 또 다른 연구를 수행하는 것으로 하였다.

기본 실험 디자인은 도 7에 제시되어 있다. 래트가 중간 대뇌 동맥(MCA) 폐색(MCAO)에 걸리게 하는 것으로 하였다. 폐색 후, 래트를 15마리의 래트로 이루어진 3개의 군으로 나누는 것으로 하였다: 치료군에는 항SEMA4D 항체 MAb 67-2를 주사하고, 대조군에는 IgG 이소형 대조군 MAb 2B8을 주사하고, 비MCAO 군에는 IgG 이소형 대조군 MAb 2B8을 주사하는 것으로 하였다. 래트는 MCAO후 1시간, 3일, 7일, 14일 및 21일째에 복강내(IP) 주사를 통해 15.0 mg/kg의 단일클론 항체를 받도록 하였다. 추후의 약물 수준 평가를 위해 주기적으로 혈액 시료를 채취하는 것으로 하였다. 래트는 예정된 대로 항체 주사를 받도록 하고, 4주 시간프레임에 걸쳐 행동 검사(실린더 테스트 및 체지 배치 테스트)를 받도록 하였다.

자기 공명 영상(MRI)을 사용하여 각 처리군으로부터의 무작위로 선택된 5마리의 래트의 BBB 완전성 평가를 수행하는 것으로 하였다. 또 다른 서브세트의 래트(즉, 5마리의 래트)는 4-6일째에 신경전구 세포를 표지화하기 위해 i.p.로 BrdU 주사를 받도록 하였다. 종료시, BrdU를 받은 래트의 서브세트에 4% 파라포름알데히드를 관류시키고, 뇌를 추출하는 것으로 하였다. 제3의 서브세트의 래트에는 염수를 관류시키고, 뇌를 현미 해부하고, 조직을 급냉시키는 것으로 하였다. 추출된 뇌/현미 해부된 조직에 대해 미세아교세포 활성화 및 신경발생의 면역조직화학적 및 생화학적 평가를 수행하는 것으로 하였다.

본원에 기재된 본 발명의 많은 변형 및 다른 실시양태는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 상기 설명 및 관련된 도면에 제시되어 있는 교시의 이점을 가지는 것으로 여겨질 것이다. 그러므로, 본 발명은 개시된 구체적인 실시양태로 제한하고자 하는 것이 아니며, 변형 및 다른 실시양태도 본원에 개시된 첨부된 특허청구범위 및 실시양태 목록의 범주 내에 포함시키고자 한다는 것을 이해하여야 한다. 비록 본원에서 구체적인 용어가 사용되기는 하였지만, 그러한 용어는 제한 목적이 아닌, 일반적 및 기술적인 의미로 사용된 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Smith, Ernest S. Zauderer, Maurice <120> Use of Semaphorin-4D Binding Molecules to Promote Neurogenesis Following Stroke <130> 1843.072PC01/EJH/BNC <140> To be assigned <141> Herewith <150> US 13/842,523 <151> 2012-03-15 <150> US 61/646,119 <151> 2012-05-11 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAb 67 VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAb 67 VK <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAb 2503 H2160 <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAb 2503 L553 <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH CDR1 <400> 5 Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH CDR2 <400> 6 Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH CDR3 <400> 7 Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL CDR1 <400> 8 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL CDR2 <400> 9 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL CDR3 <400> 10 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nestin forward <400> 11 cactagaaag caggaaccag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nestin reverse <400> 12 agatggttca caatcctctg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 forward <400> 13 ttgggagggg tgcaaaaaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 reverse <400> 14 cctgcgaagc gcctaacgta 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP forward <400> 15 tgagcgcaac ggtaacagg 19 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP reverse <400> 16 gggagaacac catacattct gg 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin forward <400> 17 gctcgtcgtc gacaagggct c 21 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin reverse <400> 18 caaacatgat ctgggtcatc ttctc 25

Claims (23)

1. 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 뇌졸중의 결과로서 신경 재생을 필요로 하는 피험체에서 신경 전구 세포의 증식, 분화 또는 이동 중 하나 이상을 증가시키기 위한 조성물로서,
   항체 또는 그의 단편이, 각각 아미노산 서열의 서열 번호 5, 6 및 7의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3을 포함하는 VH; 및 각각 아미노산 서열의 서열 번호 8, 9 및 10의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 수용체 또는 수용체의 일부와 SEMA4D의 상호작용을 억제할 수 있는 것인 조성물.
3. 제2항에 있어서, 수용체가 플렉신(Plexin)-B1, 플렉신-B2 및 CD72로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 아미노산 서열의 서열 번호 1을 포함하는 VH 및 아미노산 서열의 서열 번호 2를 포함하는 VL을 포함하는 것인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 아미노산 서열의 서열 번호 3을 포함하는 VH 및 아미노산 서열의 서열 번호 4를 포함하는 VL을 포함하는 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 혈뇌 장벽의 혈액 측에 투여되는 것인 조성물.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 혈뇌 장벽의 뇌 측에 투여되는 것인 조성물.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피험체가 인간인 조성물.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 피험체에 대한 항체 또는 그의 단편의 유효량의 투여는 피험체에서 신경 전구체 세포 마커 또는 신경 전구 세포 마커의 발현의 증가를 유도하는 것인 조성물.
10. 제9항에 있어서, 마커는 Sox2 및/또는 네스틴인 조성물.
11. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 IgG 이소형인 조성물.
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