CN103641918A

CN103641918A - Ox40/trail融合蛋白

Info

Publication number: CN103641918A
Application number: CN201310512014.7A
Authority: CN
Inventors: M·L·泰科辛斯基
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2009-03-13
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2014-03-19
Also published as: EP2406388B1; IL215005A0; EP2406388A4; ES2609333T3; AU2010224094A1; US20120121640A1; US9221895B2; EP2406388A1; CA2755198A1; WO2010105068A1; CN102421913A

Abstract

本发明提供了作用于OX40/TRAIL信号轴的融合蛋白。该蛋白用于治疗或改善自身免疫性疾病，特别是多发性硬化，以及同种免疫疾病和癌症。

Description

OX40/TRAIL融合蛋白

本申请是申请日为2010年3月11日、申请号为201080020665.9、题为“OX40/TRAIL融合蛋白”的专利申请的分案申请。

发明背景

正信号和负信号的复杂相互作用调控T细胞活化和T细胞效应子功能的维持。TNF配体/TNF受体超家族的成员在这种信号矩阵中显示重要作用，桥连（bridging）免疫系统的细胞与其他器官系统的细胞。这样做，TNF超家族成员通过影响细胞存活和死亡、细胞分化以及炎症，有助于组织稳态和致病机制。从自身免疫致病机制的角度看，引起关注的TNF配体超家族成员是TNF相关诱导凋亡配体（TRAIL）和OX40配体。

TRAIL结合数种不同的TNF受体超家族的关联受体，一些受体导致触发细胞内信号通路，而其他受体仅仅充当诱饵受体。人类中的触发受体是TRAIL-R1、TRAIL-R2和护骨蛋白，而在小鼠中，唯一的触发受体是DR5。实际上，免疫系统的所有细胞（T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞）响应于干扰素和其他活化信号，上调表面TRAIL和/或释放储存在分泌小泡中的可溶性TRAIL。TRAIL在多种动物模型中抑制自身免疫。TRAIL抑制实验性自身免疫性脑炎（EAE）——多发性硬化（MS）的小鼠模型——的能力的证据来自对TRAIL-/-敲除小鼠调用可溶性TRAIL受体（sDR5），或中和能阻断TRAIL功能的抗-TRAIL mAb以及共表达TRAIL和致病性MOG（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽）的源自胚胎干细胞的树突细胞的实验。引人注意的是，在MS患者中，可溶性TRAIL表现为IFN-β治疗的响应标记，，并且最可能响应治疗的那些可溶性TRAIL在治疗后表现出早期和持续的可溶性TRAIL诱导。然而，TRAIL对MS/EAE的影响可能更复杂，例如，TRAIL可能促进脑细胞凋亡的暗示。TRAIL和FasL都与T细胞抑制和T细胞凋亡的诱导有关。

CD134，又称为OX40受体，是TNF受体超家族的成员，主要被发现于活化的T细胞（Lamb等，1999Cytometry38:238-243），而其配体OX40L（也是TNF受体超家族的成员）在活化的B细胞、树突细胞和内皮细胞上表达。OX40L:OX40信号转导也与效应记忆细胞存活和功能相关(Gramaglia et a.,2000J Immunol165:3043-3050);(Soroosh等，2006J Immunol176:5975-5987);(Soroosh等，2007J Immunol179:5014-5023)。

多发性硬化是一种衰弱性神经病，尽管治疗选择不断扩大，对更有效的治疗药剂的仍然具有迫切需要。尽管MS的确切病因未知，其致病机理和临床发展的关键特征正在显现。致病性效应T细胞被认为是导致该疾病的关键，因此许多治疗途径集中在这些细胞上，目标是例如阻断这些细胞活化和再活化、从较大的T细胞库中除去这些细胞以及干扰它们转移到CNS内的致病部位。

中枢神经系统（CNS）的自身免疫脱髓鞘型疾病的局部基因治疗在数年内已经极大发展。由于这些疾病的损害遍布整个CNS，MS和EAE的局部免疫基因治疗已变成可行的选择。与全身递送途径相比，将免疫基因局部施用到CNS更有效。在整合入阳离子脂质后注射裸DNA导致瞬时表达。复制缺陷型病毒载体例如腺病毒载体或HSV载体的使用导致可靠的蛋白质表达和成功的EAE治疗。因此基因转移成为一种可行的选择，特别是在需要免疫基因的局部表达时，例如在关节、CNS和其他身体空间/分区中。

需要的是提供与每个重要信号轴相关的活性兴奋丛的融合蛋白，用于治疗自身免疫性疾病，包括多发性硬化，用于全身性或局部施用。

发明内容

因此，在一方面，本发明提供包括第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是与OX40配体结合的多肽，而第二结构域是与TRAIL受体结合的多肽。

在另外的方面，本发明涉及包含上述融合蛋白的药物组合物，以及通过施用本发明的融合蛋白治疗或改善需要这种治疗的患者中的自身免疫性疾病、同种免疫性疾病或癌症的方法。

在进一步的方面，本发明涉及抑制患者中T细胞增殖和分化的方法，所述方法包括将OX40/TRAIL融合蛋白施用给需要这种治疗的患者的步骤。

在另一方面，本发明提供包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是结合OX40配体的多肽，而第二结构域是具有抑制功能的多肽。

本发明也提供通过向患者施用有效量的编码本发明融合蛋白的基因序列，治疗或改善患者中自身免疫性疾病、同种免疫性疾病或癌症的方法。

根据以下的附图、详细说明和所附的权利要求书，本发明的这些和其他方面会更加显而易见。

附图简述

结合附图阅读时将更好地理解以下的本发明的优选实施方式的详细说明。为说明本发明，附图中示意了目前优选的实施方式。然而应当理解，本发明不限于图中所示的实施方式的精确排列和手段。

图1是显示在注射各自的表达质粒后72h鞘内递送pLuc/ND（左图）和基于转位子的pLuc/SBC21（中图）后检测CNS内的鞘内和皮肤基因转移荧光素酶表达验证的图片。在皮肤内注射pLuc/ND后24h检测足垫中的荧光素酶的表达（右图）。

图2，包括图2A和图2B，是一系列显示并入OX40的嵌合蛋白的组装和表达的图片。

图2A是人OX40-TRAIL和人OX40-Fγ1的编码序列的示意图。P1-P4代表用于OX40-TRAIL组装的引物的位点，而P1和P5-P7代表用于OX40-Fγ1组装的引物。将各嵌合编码序列亚克隆到pND表达载体中，二者都并入OX40前导序列，用于体内表达。在用于体外表达OX40-TRAIL和OX40-Fγ1的LGFP载体中，P8引物代替P1用于组装。

图2B是描述转染子中OX40-TRAIL蛋白表达的蛋白质印迹分析的图片。为此，将从稳定转染有pOX40.TRAIL/SecTag（左列）或pOX40.Fcγ1/SecTag（右列）的细胞产生的条件培养液在12%丙烯酰胺凝胶上电泳（run），并转移到硝酸纤维膜上。用抗-人IgG抗体直接探测这些膜（上行），然后，将膜洗脱并用抗-人OX4-抗体重新探测（下行）。

图3，包括图3A至3C，是一系列显示OX40-TRAIL和X40-Fcγ1抑制接触性超敏反应的图片。

图3A是总结实验结果的图，在这些实验中，用NP-O-Su通过皮下使小鼠过敏，在5天后通过向右足皮内注射单独的媒介物（2×PBS）、单独的pND载体、pOX40-Fcγ1/ND或pOX40-TRAIL/ND进行处理。24h后，在全部小鼠的右足用NP-O-Su，左足仅用媒介物（DMSO）进行激发。另外24h后，测量足垫。y轴显示左足和右足之间的足垫厚度的平均差异，每组N≧5。*与空载体组有显著差异（P≦0.05），**与空载体组和媒介物处理组都有显著差异，二者都是使用单因素方差分析检验确定。

图3B是一系列描述对经处理动物足垫的组织病理学分析的图片。在只用pND载体注射的右足垫（右上图）或没有注射质粒的右足垫（左下）中有明显的水肿（箭头），而用pOX40-TRAIL/ND注射的右足垫中没有显示明显的水肿（右下）。由于在未激发的左足中没有观察到炎性浸润或水肿（左上），所以观察到的炎症是抗原特异性的。图中所示标尺代表50μm。

图3C是总结皮肤表达的OX40-TRAIL的局部免疫调节效果的图。致敏和激发如上面图3A所述进行。如所示的，只有小鼠的右足接受了pOX40-TRAIL/ND或pND，而左右足都用NP-O-su进行激发。在用致敏剂激发24h后测量足垫厚度。y轴显示足垫厚度的平均差异（使用未受试小鼠的足垫厚度作为基线），每组N≧5。*在pND（空）和pOX40-TRAIL/ND处理动物的左右足之间有显著差异（P≦0.05），每组5只动物，使用单因素方差分析检验。

图4，包括图4A至4D，是一系列显示通过鞘内表达OX40-TRAIL抑制EAE的图片。

图4A的图描述来自对MOG_38-50激发的小鼠在激发后第8天以单次鞘内注射质粒脂质-DNA复合物处理的结果。每天确定动物的临床评分。y轴表示仅有pND载体（n=9）组和pOX40-TRAIL/ND处理（n=8）组的平均临床评分。

图4B的图描述如图4A所述的实验中，将每一单只小鼠的每日临床评分加和然后平均，得到的平均累积临床评分。*在pND空载体组和pOX40-TRAIL/ND处理组之间有显著差异（P≦0.05）。

图4C的图描述来自如上述图4A激发和处理动物，但仅使用pSBC21载体（n=21；3组实验合并）和pOX40-TRAIL/SBC21（n=25；3组实验合并）的结果。显示平均临床评分。插入：用抗人OX40抗体探测的膜的蛋白质印迹分析，如材料和方法中所述，显示了来自pOX40-TRAIL/LGFP转染的CHO-S细胞的条件培养液中（第1列）和来自鞘内注射有pOX40-TRAIL/SBC21的动物的脑脊液（第二列）中含OX40的融合蛋白的表达。

图4D是描述上面所述4C中的实验计算的平均累积临床评分的图。*用单因素方差分析检验确定两组之间存在显著差异（P≦0.05）。

图5，包括图5A至5C，是一系列显示与OX40-TRAIL嵌合相关的增强的抑制功能的图片。

图5A是描述来自对MOG_38-50激发的小鼠在激发后第8天单次鞘内注射仅pSBC21载体（n=10）、pOX40/SBC21（n=9）、pTRAIL/SBC21（n=9）或pOX40-TRAIL/SBC21（n=7）处理的结果的图。根据处理后17天的观察计算平均累积临床评分。*在不同处理组和仅有pSBC21载体组之间存在显著差异（p<0.05）。**用单因素方差分析检验确定在不同处理组和仅有SBC21载体组之间存在显著差异（p<0.005）。

图5B的图描述将图5A所述的小鼠（n=3）在第17天处死，依次用PBS和磷酸盐缓冲的福尔马林经心脏（transcardially）灌流，回收其脊髓和脑，用于组织病理学分析的结果。对用H&E染色的切片进行盲检，对脱髓鞘、单核细胞/淋巴细胞浸润和化脓评分，并给出损伤评分，如材料和方法中所述。

图5C是罗克沙尔固蓝（luxol fast blue）染色的切片的图片，显示与仅用pSB21C载体处理的小鼠（左图）相比，pOX40.TRAIL/SBC21处理的小鼠（右图）中具有减少的炎性浸润（箭头）。在两幅图中都有大量的髓鞘脱失（星号）。图中所示标尺代表50μm。

发明详述

本发明涉及OX40/TRAIL和相关的融合蛋白，以及用这些蛋白质治疗自身免疫性疾病和癌症的方法。

在一方面，本发明提供融合蛋白，其包含第一结构域和第二结构域，其中第一结构域是结合OX40配体的多肽，而第二结构域是结合TRAIL受体的多肽。

定义

除非另有限定，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员的一般理解相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或检验中，但是描述了优选的方法和材料。

如本文所述，以下每个术语在本部分具有与其相关的含义。

本文所述的冠词“一（a）和“一（an）””指一个或多于一个（即，至少一个）语法对象。例如，“元件（an element）”指一个元件或多于一个元件。

本文所述的“大约”在涉及可测量值例如量，持续时间等时，意指包含给定值的±20%或±10%，更优选地±5%，更优选地±1%，以及还更优选地±0.1%的偏差，因为这种偏差适于完成所公开的方法。

如本文使用，术语“融合蛋白”指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序列的嵌合蛋白。通常，融合蛋白由本领域熟知的体外重组技术产生。

如本文使用的，“生物学活性的或免疫学活性的”指根据本发明的融合蛋白具有与作为本发明融合蛋白构造单元的各种野生型蛋白类似的结构功能（但不一定达到相同的程度），和/或类似的调控功能（但不一定达到相同的程度），和/或类似的生化功能（但不一定达到相同的程度）和/或免疫活性（但不一定达到相同的程度）。

如本文使用的，“缺失”被定义为氨基酸序列的变化，其中与野生型蛋白相比，缺少一个或多个氨基酸残基。

如本文使用的，“插入”或“增加”是与野生型蛋白相比，导致增加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的变化。

如本文使用的，“替换”由与野生型蛋白相比一个或多个氨基酸分别被不同的氨基酸代替产生。

如本文使用，术语“变体”指与野生型蛋白相比，序列具有一个（或多个）氨基酸的替换、缺失或者增加——包括等位基因变异——的任何多肽，只要得到的变体融合蛋白与本发明中使用的野生型蛋白相比，保留至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多的生物学或免疫学活性。此外，尽管通常需要变体显示增强的结合给定分子的能力，但是在一些实施方式中，变体可以被设计为与本发明的其他融合蛋白相比具有稍微减低的活性，例如，在其中有意想要减弱活性的实例中，例如，以降低神经毒性。此外，可以产生对TRAIL受体变体（人类中有三种TRAIL受体）的一种的结合更具选择性的变体或衍生物。此外，可以产生具有改变的多聚性质的变体或衍生物。改造变体时，这可以针对整个TRAIL胞外结构域或并入融合蛋白本身的胞外结构域的组分进行。

优选地，本发明融合蛋白的变体或衍生物维持氨基酸序列的疏水性/亲水性。可以进行保守氨基酸替换，例如从1、2或3到10、20或30个替换，条件是经修饰的序列保留了充当根据本发明的融合蛋白的能力。氨基酸替换可以包括使用非天然存在的类似物，例如以增加血浆半衰期。

保守替换在本领域是熟知的，例如根据下表。第二列中同一格内的以及优选地在第三列同一行内的氨基酸可以互相替换：

如本文使用的，与氨基酸序列相关的术语“衍生物”意指本发明融合蛋白的化学修饰。

“编码”指多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列的固有性质，以充当生物学过程中合成具有确定的核苷酸序列（即，rRNA、tRNA和mRNA）或确定的氨基酸序列，以及由此获得的生物学性质的其它聚合物和大分子的模板。因此，如果在细胞或其它生物学系统内对应于基因的mRNA的转录和翻译产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链——与mRNA序列一致并且通常在序列表中提供的核苷酸序列，和非编码链，其用作基因或cDNA转录的模板，都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。

如本文所用，“内源的”指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内的任何材料。

如本文所用，“外源的”指自生物体、细胞、组织或系统外引入或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何材料。

如本文所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“表达载体”指这样的载体，其包含编码至少部分能被转录的基因产物的核酸序列。在一些情况下，RNA分子随后被翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可以包含多个控制序列，控制序列指在特定宿主生物体中转录以及可能地翻译可操作连接的编码序列必须的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列，载体和表达载体也可以包含起到其它作用的核酸序列。

“分离的核酸”指从自然存在的状态下侧翼核酸段或片段的序列中分离出的该核酸段或片段，即从通常邻近DNA片段的序列移除的所述DNA片段，即在其中自然发生的基因组中与该片段相邻的序列。该术语也适用于从自然伴随核酸的其它组分——即在细胞中自然伴随该核酸的RNA或DNA或蛋白质中——基本纯化的核酸。因此该术语包含例如重组DNA，其并入载体，并入自主复制质粒或病毒，或并入原核或真核细胞基因组DNA，或作为独立于其它序列地单独分子存在（即，作为由PCR或限制性酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段）。它也包括作为编码额外的多肽序列的杂合基因（hybrid gene）的部分的重组DNA。

在本发明的上下文中，使用以下通常存在的核酸碱基缩写。“A”指腺嘌呤，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟嘌呤，“T”指胸腺嘧啶，“U”指尿嘧啶。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白或RNA的核苷酸序列也可以包括内含子，在这个意义上，编码蛋白质的核苷酸序列可以以某些形式含有内含子。

如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用，核酸和多核苷酸可以互换。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸，其可以被水解为“核苷酸”单体的常识。单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于，用本领域可用的任何方法——包括但不限于重组方法，即，使用常用克隆技术和PCR^TM等，从细胞基因组重组文库克隆核酸序列，以及通过合成方法，获得的所有核酸序列。

如本文所用，术语“多肽”定义为氨基酸残基链，通常具有确定的序列。如本文所用，术语多肽与术语“肽”和“蛋白”互相包含。

如本文所用，术语“启动子”定义为被细胞合成机构，或引入的合成机构识别的DNA序列，其是开始多核苷酸序列的特异性转录所需要的。

如本文所用，术语“启动子/调控序列”指表达与启动子/调控序列可操作连接的基因产物所需的核酸序列。在一些实例中，该序列可以是核心启动子序列，而在其他实例中，该序列也可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是，例如，以组织特异的方式表达基因产物的启动子/调控序列。

“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，导致在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。

“诱导型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，只有在与启动子对应的诱导物存在于细胞内时，在细胞内大量产生基因产物的核苷酸序列。

“组织特异性”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，只有在细胞是与启动子对应的组织类型的细胞的情况下，在细胞中大量产生基因产物的核苷酸序列。

如本文所用，术语“RNA”定义为核糖核酸。

如本文所用，术语“重组DNA”被定义为通过将不同来源的DNA片段连接产生的DNA。

如本文所用，术语“重组多肽”定义为使用重组DNA方法产生的多肽。

如本文所用，“治疗有效量”是足以向施用组合物的哺乳动物提供有益效果的治疗组合物的量。

如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代对象细胞及其后代。

如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和定向，以控制RNA聚合酶转录的起始和多核苷酸的表达。

如本文所用，术语“疫苗”定义为用于在向哺乳动物施用材料后引起免疫应答的材料。

“载体”是包含分离的核酸并且可以用于递送分离的核酸到细胞内部地物质的组合物。本领域已知多种载体，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。术语也应当被理解为包括促进核酸转移进入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

如本文所用，术语“病毒”定义为由包含在蛋白质衣壳内的核酸(RNA或DNA)组成的颗粒，具有或不具有外层脂质包膜，它能在完整的细胞内复制。

如本说明书和权利要求书所用，包括在实施例中使用，除非另有说明，所有数字都应当被理解为有词语“约”前缀，即使没有明确出现该术语。此外，本文列举的任何数字范围意在包括其中包含的所有子范围。任何通过Swiss Prot.或NCBI登录号涉及的氨基酸序列通过引用并入本文。

范围：贯穿本公开，本发明的多个方面可以以范围的格式表示。应当理解，范围格式的说明只是为了方便和简洁，不应当被理解为对本发明范围不可变更的限制。因此，对范围的说明应当被认为具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，对范围的说明例如从1到6应当被理解为具体公开了子范围例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在该范围内的单个数值例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这适用而不考虑范围的宽度。

说明

在一方面，本发明提供了作用于OX40L和TRAIL信号轴的融合蛋白，例如具有包括结合OX40配体的多肽的第一结构域和包括结合RAIL受体的多肽的第二结构域的融合蛋白。

具体地，第一结构域是能够干扰OX40配体通过其OX40受体的引发能力的多肽，而第二结构域是能引导抑制信号通过带有TRAIL受体的T细胞或其它细胞上的上的关联受体的多肽。

在OX40L/TRAIL信号轴的情况下，适当的第一结构域包括例如,OX40蛋白本身、野生型OX40蛋白的变体或衍生物，或特别适于结合OX40配体并阻止该配体通过其OX40受体传导信号的其它多肽或蛋白质，例如结合OX40配体的抗体，结合OX40配体的抗体的部分，以及被改造以结合OX40配体的脂笼蛋白衍生物。优选地，本实施方式的融合蛋白的第一结构域是OX40蛋白胞外结构域的至少一部分，特别是结合OX40配体以及干扰其结合和触发膜结合的OX40受体的能力所必须的胞外结构域的部分。野生型胞外结构域的变体或者负责OX40L结合的胞外结构域的部分的变体也包含在本发明内，只要该变体提供与野生型蛋白类似水平的生物学活性。

因此，如本文所用，术语“结合OX40配体的多肽”包括OX40蛋白；OX40蛋白的胞外结构域；作为OX40蛋白胞外结构域至少一部分的多肽，该部分负责结合OX40配体；OX40配体的抗体；改造为结合OX40配体的脂笼蛋白；以及上述任一种的变体和/或衍生物。术语“OX40”被理解为包含是OX40蛋白全部氨基酸序列的多肽，包括胞质、跨膜和胞外结构域，以及是该蛋白的较小部分的多肽，例如胞外结构域，或胞外结构域的部分。在一个实施方式中，OX40/TRAIL信号对中的第一结构域是人OX40受体胞外结构域的至少一部分。

在OX40L/TRAIL信号轴的情况下，适当的第二结构域包括例如，TRAIL蛋白本身，TRAIL蛋白的变体或衍生物，或被专门设计为抑制T细胞或其它细胞活化和/或通过TRAIL受体诱导凋亡的其它多肽或蛋白，例如拮抗性抗TRAIL抗体及它们的变体和/或衍生物。优选地，该实施方式中融合蛋白的第二结构域是TRAIL蛋白胞外结构域的至少部分，特别是结合TRAIL受体必须的部分。TRAIL蛋白胞外结构域的野生型形式的变体，或负责TRAIL受体结合的胞外结构域部分的变体也包含在本发明内，只要变体提供与野生型蛋白类似水平的生物学活性。

因此，如本文所用，术语“结合TRAIL受体的多肽”包括TRAIL蛋白；TRAIL蛋白的胞外结构域；作为TRAIL蛋白胞外结构域至少一部分的多肽，该部分负责结合TRAIL受体；TRAIL受体的抗体；改造为结合TRAIL受体的脂笼蛋白；以及上述任一种的变体和/或衍生物。术语“TRAIL”被理解为包含对应于TRAIL蛋白完整氨基酸序列的多肽，包括胞质、跨膜和胞外结构域，以及对应于蛋白的较小部分的多肽，例如胞外结构域或胞外结构域的部分。在一个实施方式中，OX40/TRAIL信号对的第二结构域是人TRAIL蛋白胞外结构域的至少部分。

在一个实施方式中，本发明包括OX40/TRAIL融合蛋白。在另一实施方式中，术语“OX40/TRAIL融合蛋白”指由SEQ.ID.NO.:1确定的特定融合蛋白：

SEQ.ID.NO.1HUMAN OX40-TRAIL

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHE

CRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR

SGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPG

DNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGP

PARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAETISTVQEKQQNISPL

VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRS

GHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQ

MVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELK

ENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

在另一实施方式中，术语“0X40/TRAIL融合蛋白”指由SEQ.ID.NO.:2确定的特定融合蛋白：

SEQ.ID.NO.2HUMAN OX40-TRAIL

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHE

CRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR

SGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPG

DNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGP

PARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRARGPQRVAAHITGTR

GRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIH

EKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLM

KSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMD

HEASFFGAFLVG

SEQ.ID NO.1和SEQ.ID.NO.2都包括原始信号肽；如本领域技术人员将会理解的，这些信号肽可以根据使用者的需要、表达系统和其它因素改变。信号肽在本领域内是熟知的，并且可以使用任何期望的信号肽，包括本领域技术人员已知的由公众可得的信号肽识别软件识别/预测的信号肽。

在另外的实施方式中，OX40/TRAIL融合蛋白是SEQ.ID.NO.1所示氨基酸序列的变体和/或衍生物。

在本发明的另外的方面，本文所述融合蛋白的任一种的TRAIL组分可以用另一抑制性蛋白替换，所述抑制性蛋白即抑制免疫应答活化和/或诱导凋亡、T细胞或其它细胞类型中无反应性和/或任何其它形式的不应答的蛋白，所述其它细胞类型诸如B细胞、天然杀伤（NK）细胞、NKT细胞、淋巴样祖细胞、树突细胞、单核细胞/巨噬细胞、具有抗原呈递能力基于组织的巨噬细胞系细胞以及多种非专门抗原呈递细胞的任一种，例如内皮细胞。抑制性蛋白的实例包括但不限于，FasL、TNF、PDL-1、PDL-2、B7x、B7-H3和CD31。

例如,BTLA是重要的抑制性受体，B7x可以是配体，此外还有尚未发现的其它配体。类似地，CTLA-4是另一种重要的抑制性受体，驱动此抑制性CTLA-4受体的配体包括某些B7分子以及拮抗性抗体。在这种情况下，融合蛋白分别是OX40/B7x和OX40/B7拮抗性融合蛋白。

逐渐认识到B细胞也可以是驱动自身免疫的关键。另外的驱动B细胞抑制性受体的抑制性配体(与Fn14融合)，例如CD100(结合CD72)，CD5(也结合CD72)，CD72(结合CD5)，Ep-CAM(结合LAIR-1)，Fc-γ-RII、CD22、PDL-1、PDL-2、CD66a和PIR-B的拮抗剂也包含在本发明的范围内。

文献中有很多额外的实例，例如在Sinclair,N.“Why so ManyCoinhibitory Receptors?,Scand.J.Immunol.50,10-13(1999);Melero,I.et al.“Immunostimulatory monoclonal antibodies for cancer therapy”,Nature Rev.Cancer7:95-106(2007)和Zang,X等，“The B7Family andCancer Therapy:Costimulation and Coinhibition”,Clin.Cancer Res.13:5271-5279(2007)中所列出的，全部通过引用并入本文。任何上述抑制性蛋白都包含于本发明的融合蛋白和方法中，本文中统称为“具有抑制功能的多肽”。

因此，在另外的实施方式中，本发明提供OX40/抑制性蛋白融合对，例如OX40/FasL、OX40/PDL-1、OX40/PDL-2、OX40/TNF、OX40/CD100、OX40/CD5、OX40/CD72、OX40/Ep-CAM、OX40/Fc-γ-RII、OX40/CD22、OX40/CD66a、OX40/PIR-B、OX40/B7x、OX40/B7-H3和OX40/CD31。在OX40/TRAIL信号轴的情况下，上述第一结构域的任一种，例如，结合OX40配体的多肽，都将是这些实施方式中的合适的第一结构域。

在一个实施方式中，本发明的融合蛋白通过阻止或减少髓鞘特异性T细胞的增殖和分化抑制免疫系统活化。在一些实施方式中，本发明的融合蛋白抑制促炎细胞因子和趋化因子例如IL-6、IL-8、RANTES、IP-10和MCP-1的产生，或抑制其它细胞因子/趋化因子例如TNF-α和IL-1β的增强；或抑制基质金属蛋白酶例如MMP-1和MMP-9的诱导；或抑制前列腺素E2从成纤维细胞和滑膜细胞的分泌。本发明包含抑制/下调任何和所有由OX40配体促进或由TRAIL配体下调的细胞因子。

在其它实施方式中，本发明的融合蛋白抑制自身反应性T细胞增殖、自身反应性抗体产生和炎症反应。

大部分(尽管不是全部)TNF受体(TNFR)超家族成员是II型跨膜蛋白。这些蛋白质包含这样的胞外结构域，其结构特征为存在1至6个富半胱氨酸结构域(CRDs)。典型的CRD长度为约40个氨基酸，包含形成3个链间二硫键的6个保守半胱氨酸残基。CRD本身通常由两个不同的结构模块组成。

TRAIL

TRAIL是具有291个氨基酸的II型膜蛋白，已在多个物种中被测序，所述物种包括但不限于，小鼠：Swiss Prot.登录号P50592；人：SwissProt.登录号P50591;褐家鼠：NCBI Accession NP_663714；鳜：NCBIAccession AAX77404；原鸡（鸡）：NCBI Accession BAC79267；野猪：NCBI Accession NP_001019867；草鱼：NCBI Accession AAW22593和黄牛：NCBI Accession XP_001250249。

根据TNF同源模型，TRAIL的胞外结构域包括氨基酸39–281，负责受体结合的TNF结构域是氨基酸121-280。已确定对赋予活性特别重要的蛋白质的部分。参见，例如“Triggering cell death:The crystalstructure of Apo2L/TRAIL in a complex with death receptor”,HymowitzSG,等，Am.Mol.Cell.1999Oct;4(4):563-71)，其通过引用并入本文，它报道了对于TRAIL结合其受体和活性最重要的氨基酸是在锌区域附近的氨基酸例如aa(191-201-205-207-236-237)和氨基酸(150-216)，通过引用并入本文。还参见1)Krieg A等，2003Br.J of Cancer88:918-927，其描述两种没有凋亡活性的人TRAIL变体，TRAIL-γ和TRAILβ；2)“Enforced covalent trimerization increases the activity of the TNFligandfamily members TRAIL and CD95L”,D Berg等，cell death anddifferentiation(2007)14,2021-2034;和3)“Crystal Structure of TRAIL-DR5complex identifies a critical role of the unique frame insertion in conferringrecognition specificity”,S.Cha等，J.Biol.Chem.275:31171-31177(2000),全部通过引用并入本文。

OX40

OX40是TNFR超家族成员，它是长度为277个氨基酸的多肽。胞外区是氨基酸29-214，其中氨基酸31-166是TNFR同源区，具有三个CRD。已经确定了OX40和OX40配体的结构和一些关键结合位点。Compaan,D.等，“The crystal structure of the Costimulatory OX40-0X40Lcomplex”,Structure14:1321-1330(2006)，其同引用并入本文。OX40的CRD似乎对OX40配体——包括CRD1、aa30-65；CRD2、aa67-81和CRD3、aa109-125——的受体结合非常重要。

已在多个不同物种中测序OX40，包括但不限于，小鼠：Swiss Prot.登录号P47741；人：Swiss Prot.登录号P43489；和大鼠：Swiss Prot.登录号15725。

修饰

本发明涉及OX40/TRAIL和相关的融合蛋白。本发明也包括融合蛋白的变体。尽管通常需要对给定分子显示增强的结合能力的变体，在一些实施方式中，变体可以被设计为具有与本发明的其它融合蛋白相比稍微降低的活性，例如，在其中有意地减弱活性的实例中。此外，可以产生与TRAIL受体变体（人类中有三种TRAIL受体）的一种更具选择性地结合的变体或衍生物。此外，可以产生具有改变的多聚性质的变体或衍生物。改造变体时，可以对整个TRAIL胞外结构域或并入融合蛋白本身的胞外结构域的组分进行。

优选地，本发明融合蛋白的变体或衍生物保持氨基酸序列的疏水性/亲水性。

本发明也提供对本发明融合蛋白的化学修饰。这种修饰的非限制性实例可以包括但不限于，具有羰基末端或具有含有羰基侧链的残基的脂肪族酯或酰胺，，具有含有羟基残基的O-酰基衍生物，以及氨基末端氨基酸或含氨基的残基例如赖氨酸或精氨酸的N-酰基衍生物。

额外的修饰可以包括例如，产生与聚乙二醇（PEG）缀合的融合蛋白，或在化学合成本发明的多肽期间加入PEG。对多肽或其部分的修饰也可以包括还原/烷基化；与适当的载体化学耦合或温和福尔马林处理。

本发明融合蛋白的其它衍生物包括非天然氨基酸残基，或者磷酸化的氨基酸残基如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的掺入。其它可能的修饰包括磺化，生物素化或加入其它基团，特别是具有与磷酸基团相似的分子形状的那些。

衍生物也包括糖基化修饰的多肽。这些可以通过在多种可选真核宿主表达系统中合成和处理过程中，或在进一步的处理步骤期间通过改变糖基化模式进行。产生糖基化修饰的方法包括将该融合蛋白暴露于从天然进行这种加工的细胞获得的糖基化酶，例如哺乳动物糖基化酶。可选地，可以使用去糖基化酶除去在真核表达系统生产过程中连接的糖类。此外，也可以修饰编码序列，以便加入糖基化位点（一个或多个），或删除糖基化位点或使糖基化位点无效。此外，如果不需要糖基化，可以在原核宿主表达系统内产生蛋白质。

本发明融合蛋白的变体和/或衍生物可以通过化学合成或使用位点定向诱变[Gillman等，Gene,8:81(1979);Roberts等，Nature328:731(1987)或Innis(Ed.),1990,PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Academic Press,New York,N.Y.]，或使用聚合酶链式反应方法[PCR;Saiki等，Science239:487(1988)],如Daugherty等示例的，[Nucleic Acids Res.19:2471(1991)]来制备，以修饰编码完整受体的核酸。

可以引入另外的修饰，例如进一步稳定TRAIL三聚体和/或增加结合TRAIL受体亲和性的那些修饰；可以加入间隔区/连接体以改变融合蛋白两个结构组分之间的距离，并改变该区的灵活性。

在另外的实施方式中，本发明的融合蛋白可以进一步包括一个或多个额外加入的多肽结构域，以便于蛋白质纯化，增加该重组蛋白的表达，或增加该重组蛋白的溶解性。这种促进纯化/表达溶解性的结构域包括但不限于，金属螯合肽例如允许在固定金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(Porath J(1992)Protein Expr Purif3-.263281),允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp,Seattle,Wash.)的结构域。在纯化结构域和OX40/TRAIL之间包括可裂开的连接体序列例如因子Xa或肠激酶(Invitrogen,San Diego,Calif.)用于促进纯化。

另外的融合表达载体包括pGEX(Pharmaci,a Piscataway,N.J.)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRITS(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，它们分别将谷胱甘肽转移酶（GST）、麦芽糖B结合蛋白或蛋白A融合到靶重组蛋白。也可以使用EBV、BKV和其他游离型表达载体(Invitrogen)。此外，也可以使用逆转录病毒和慢病毒表达载体。此外，可以使用多种设计用于在生物体内高水平表达重组蛋白的体内表达系统的任一种，用以生产本文所述的融合蛋白。

在另一个实施方式中，本发明融合蛋白可以在其N端包含异源信号序列。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细)中，通过使用异源信号序列，可以提高融合蛋白的表达和/或分泌。信号序列通常以疏水性氨基酸核心为特征，该疏水性氨基酸核心通常在分泌过程中在一个或多个切除事件中被从成熟蛋白质切除。这种信号肽包含加工位点，允许在其通过分泌通路时从成熟蛋白质切除信号序列。因此，本发明涉及描述的具有信号序列的多肽，以及涉及已蛋白水解切除信号序列的多肽(即该切割产物)。

为增强稳定性和/或反应性，本发明的融合蛋白也可以被修饰以在氨基酸序列中包含一个或多个由天然等位基因变异导致的多态性。此外，D-氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸类似物可以被取代或加入，以产生本发明范围内的修饰的融合蛋白。

本发明的氨基酸序列可以通过在适当的表达系统中表达编码该氨基酸序列的核苷酸序列产生。

此外，或可选择地，融合蛋白本身可以使用化学方法生产，以全部或部分合成所需氨基酸序列。例如，可以用固相技术合成多肽，从树脂上切除，通过制备型高效液相色谱（例如Creighton(1983)ProteinsStructures And Molecular Principles,WH Freeman and Co,New YorkN.Y.）纯化。合成多肽的组成可以通过氨基酸分析或测序（例如Edman降解法)确认。此外，本发明融合蛋白的氨基酸序列或其任何部分可以在直接合成过程中改变，和/或使用化学方法与来自其他亚单位的序列或其任意部分结合，以产生变体多肽。

测量本发明任何融合蛋白的任何同源物、衍生物或变体的免疫学活性的分析在本领域内是熟知的。

例如，可以使用用于监测细胞因子产生的数种常规分析中的任何一种，作为免疫细胞活化和分化的测量。例如，为跟踪T细胞活化，可以使用白介素-2作为标记，白介素-2可以如Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:1333(1989)中所述分析，其相关部分通过引用并入本文。也可以从Genzyme Corporation(Cambridge,Mass.)得到用于分析干扰素产生的试剂盒。也可以使用免疫荧光和流式细胞术在细胞基础上监测细胞因子的产生，并监测反映细胞活化和/或分化状态的细胞表面标记。已知这种标记的宿主，检测抗体是普遍商业可得的并且标记是本领域熟知的。

普通T细胞增殖分析需要测量氚化胸腺嘧啶的掺入。T细胞的增殖可以通过测定掺入到培养细胞复制的DNA中的³H标记胸腺嘧啶的量在体外进行测量。因此，DNA合成速率以及依次地细胞分裂速率可以被定量。

另一种监测T细胞增殖的分析基于负载有CFSE染料的T细胞，然后通过流式细胞术监测该染料随着细胞连续分裂的稀释。此外，为监测对T细胞增殖的抑制，也可以通过评估其在TRAIL受体阳性肿瘤细胞系中诱导凋亡的能力来监测融合蛋白的生物学活性，其中所述细胞系中TRAIL受体触发导致凋亡。通过将这些细胞与其他表面上具有OX40L的细胞组合，能够评估新的融合蛋白衍生物是否锚定到OX40L上，以及因此以这种方式具有其促凋亡的TRAIL驱动的活性。

药物学组合物和给药方案

本发明的组合物的施用通常是肠胃外的，通过静脉注射、皮下注射、肌肉内注射或腹膜内注射，或者通过输注或其它任何可接受的全身方法。优选通过静脉输注施用，通常在约1至5小时的时间期间内。此外，有多种口服递送方法用于施用治疗蛋白，并且这些方法可应用于本发明的治疗融合蛋白。

通常，从低水平向上滴定治疗剂量以优化安全性和效力。一般地，每日剂量在约0.01至20mg蛋白质每千克体重的范围内。通常，剂量范围是约0.1至5mg蛋白质每千克体重。

可以制备多种融合蛋白的修饰或衍生物，例如加入聚乙二醇链(PEG化)，以影响其药代动力学和/或药效学性质。

为通过肠胃外施用以外的方式施用融合蛋白，用防止其失活的材料包被蛋白质或与蛋白质共同施用可能是必要的。例如，蛋白质可以在不完全佐剂中施用，或与酶抑制剂共同施用或者在脂质体中施用。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、异氟磷(Diisopropylfluorophosphate，DEP)和抑肽酶。脂质体包括水包油包水CGF乳剂和常规脂质体(Strejan等，(1984)J.Neuroimmunol.7:27)。

本发明的组合物的“有效量”是减轻表征由自身免疫性疾病例如多发性硬化引起的医学状况的熟知的参数中一个或多个的量。已经描述了多种这样的参数和状况。在多发性硬化的情况下，有效量是足以实现以下一项或多项的融合蛋白的量：降低症状的严重性；减少疾病恶化的持续时间；增加疾病减轻/无症状期的频率和持续时间；防止固定伤害和残疾；和/或防止/减弱疾病的慢性发展。临床上，这会导致改善视觉症状(视力丧失，复视)，步态障碍(虚弱，轴不稳定，感觉丧失，痉挛，反射亢进，灵巧性丧失)，上肢功能障碍(虚弱，痉挛，感觉丧失)，膀胱功能障碍(尿急，失禁，排尿踌躇，不完全排空)，抑郁，情绪不稳和认知障碍。病理学上，用本发明的融合蛋白治疗减少以下一项或多项：例如髓磷脂丧失，血脑屏障损坏，单核细胞血管周围浸润，免疫异常，胶质疤形成和星细胞增殖，金属蛋白酶产生，以及传导速度受损。

尽管本方面的组合物可以以真溶液施用，它们更通常地与其它材料例如载体，优选地药学载体组合使用。有用的药学载体可以是任何适于向患者递送本发明组合物的相容的无毒性材料。载体可以包括无菌水、醇、脂肪、蜡和惰性固体。药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)也可以掺入药物组合物。一般地，用于肠胃外施用这种药物的组合物是已知的，例如Remington’s Pharmaceutical Science,17th Ed.(MackPublishing Company,Easton,Pa.,1990)。可选地，本发明的组合物可以通过可植入药物递送系统[Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199(1984)]引入患者体内。

可以以多种常规剂量制剂施用治疗制剂。制剂通常包含至少一种活性成分，以及一种或多种药学上可接受的载体。制剂可以包括适于口服、直肠、鼻或肠胃外（包括皮下、肌肉内、静脉内和皮肤内）施用的那些制剂。

制剂可以方便地以单位剂量形式提供，可以通过制药领域熟知的任何方法制备。参见，例如Gilman等，(eds.)(1990),The PharmacologicalBases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press；和Remington’sPharmaceutical Sciences,supra,Easton,Pa.；Avis等(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,N.Y.；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:TabletsDekker,N.Y.；以及Lieberman等(eds.)(1990),Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems Dekker,N.Y.

在另外的实施方式中,本发明考虑通过基因治疗方法施用融合蛋白，例如施用编码目标融合蛋白的分离的核酸。就编码蛋白质的核酸序列和得到的蛋白质的氨基酸序列而言，本发明融合蛋白的蛋白构件（building blocks）(例如第一和第二结构域)都已经被充分表征。通过重组DNA方法改造这种分离的核酸在本领域技术人员的能力之内。为了在特定细胞背景中最大化重组蛋白产量而进行密码子优化也在本领域技术人员的能力之内。表述“施用治疗有效量的本发明的融合蛋白”包括施用编码融合蛋白的分离的核酸。基因治疗方法在本领域是熟知的。参见，例如WO96/07321，其公开了使用基因治疗方法产生胞内抗体。基因治疗方法也在人患者内成功显示。参见，例如Baumgartner等，Circulation97:12,1114-1123(1998),以及最近的Fatham,C.G.‘A genetherapy approach to treatment of autoimmune diseases’,Immun.Res.18:15-26(2007)；以及美国专利第7,378089号，二者都通过引用并入本文。还参见Bainbridge JWB等，“Effect of gene therapy on visual functionin Leber’s congenital Amaurosis”.N Engl J Med358:2231-2239,2008；和Maguire AM等，“Safety and efficacy of gene transfer for Leber’sCongenital Amaurosis”.N Engl J Med358:2240-8,2008。

有两种将编码融合蛋白的核酸（可选地包含于载体内）引入患者细胞的主要方法；体内和先体外后体内。对体内递送，核酸被直接注入患者，通常在需要融合蛋白的部位。对先体外后体内治疗，取出患者的细胞，将核酸引入这些分离的细胞，并将修饰的细胞直接施用到患者体内，或者例如封入多孔膜，植入患者体内（参见，例如美国专利第4,892,538和5,283,187号）。有多种可用的将细胞引入活细胞的技术。根据核酸是被体外转移到培养的细胞还是体内转移到预期宿主的细胞，技术有所不同。适于将核酸体外转移到哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀等方法。用于先体外后体内递送基因的常用载体是逆转录病毒载体和慢病毒载体。

优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体（如腺病毒、1型单纯疱疹病毒、腺病毒相关病毒）、基于脂质的系统(用于脂质介导的基因转移的有用脂质是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)、裸DNA以及基于转座子的表达系统转染。目前已知的基因标记和基因治疗程序的综述参见Anderson等，Science256:808-813(1992)。也参见WO93/25673及其引用的参考文献。

“基因治疗”包括通过单次治疗实现持续效果的常规基因治疗，以及涉及一次或重复施用治疗有效的DNA或mRNA的基因治疗药剂的施用。寡核苷酸可以被修饰以增强其摄取，例如，通过用不带电基团替代其带负电磷酸二酯基团。本发明的OX40/TRAIL融合蛋白可以使用基因治疗方法递送，例如在瘤床局部、鞘内或全身递送（例如，通过选择性靶向特定组织类型的载体，例如组织特异性腺相关病毒载体)。在一些实施方式中，可以用编码本发明的任何融合蛋白的基因先体外后体内转染来自个体的初级细胞(例如淋巴细胞或干细胞)，然后使转染的细胞返回个体的身体。

在一些实施方式中，本发明的融合蛋白适于治疗免疫系统疾病或病症，包括但不限于，自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性新生儿血小板减少症、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性嗜中性白血球减少症、自身免疫性血球减少症、溶血性贫血、抗磷脂综合征、皮炎、麸质敏感性肠病、过敏性脑脊髓炎、心肌炎、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、肾小球肾炎（例如，IgA肾病）、多发性硬化、神经炎、眼葡萄膜炎、多内分泌腺病（polyendo-crinopathy）、紫癜(例如过敏性紫癜（Henloch-Scoenlein purpura）)、莱特尔氏病、僵人综合症、自身免疫性肺炎、心肌炎、IgA肾小球肾炎、致密沉积物病、风湿性心脏病、格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome）、胰岛素依赖性糖尿病、和自身免疫性眼炎、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺机能减退症(即桥本氏甲状腺炎)、系统性红斑狼疮、盘状狼疮、肾炎-肺出血综合征、天疱疮、受体自身免疫例如(a)格雷夫斯氏病，(b)重症肌无力和(c)胰岛素耐受、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、风湿性关节炎、由于抗胶原抗体的硬皮症、混合结缔组织疾病、多肌炎/皮肌炎、恶性贫血、原发性爱迪生病、不育症、肾小球肾炎例如初级肾小球肾炎和IgA肾病、大疱性类天疱疮、干燥综合征（Sjogren’s syndrome）、糖尿病和肾上腺素能药物抗性(包括有利于哮喘或囊性纤维化的肾上腺素能药物抗性)、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性硬化、其它内分泌腺体衰竭（endocrine gland failure）、白癜风、脉管炎、心切开术综合征、风疹、过敏性皮炎、哮喘、炎性肌病、和其它炎性、肉芽肿性、退化性和萎缩性病症）。

在一个实施方式中，本发明的融合蛋白用于治疗多发性硬化。

在另外的实施方式中，本发明的融合蛋白可用于治疗各种类型的癌症。可溶性TRAIL与某些类型的肿瘤细胞中凋亡的诱导有关。此外，对某些肿瘤类型，炎症可能实际上是原致癌性的（pro-tumorigenic）。因此，TRAIL融合蛋白可用于直接杀死肿瘤细胞，阻断原致癌性炎症，此外可以用于阻断血管发生。在这种情况下，OX40组分(第一结构域)将TRAIL定位到OX40配体阳性细胞(例如肿瘤内皮上和/或肿瘤细胞本身)。

术语“癌”或“癌的”指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理状态。癌的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症更具体的实例包括肾或肾脏癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌——包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞状癌、鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃（gastric）或胃（stomach）癌包括胃肠道癌、胃肠道基质瘤（GIST）、胰腺癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤、卵巢男性细胞瘤、肝瘤、恶性血液病包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)（NHL)，多发性骨髓瘤和急性恶性血液病、子宫内膜或子宫癌、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌（vulval cancer）、甲状腺癌、食道癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤（Schwannoma）、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲状腺癌、胚胎性癌内瘤（Wilm’s tumor）、以及B-细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；中度弥散性NHL；高度成免疫细胞性NHL；高度成淋巴细胞性NHL；高度小无裂细胞性NHL；大包块病变性NHL（bulky duisease NHL）；套细胞性淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和瓦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及移植后淋巴组织增生疾病(PTLD)，和与瘢痣病相关的异常血管增殖，水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)，以及梅格斯氏综合征。如本文所用，“肿瘤”指所有恶性或良性生长和增殖的瘤细胞，以及所有原癌性或癌性细胞和组织。

“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”或“减轻”指治疗性处理和预防性（prophylactic或preventative）措施，其中目标是预防或减慢（减少）靶向的病理性状况或病症。如果在根据本发明的方法接收治疗量的本发明融合蛋白后，对象表现出可观察和/或可测量的特定疾病一个或多个体征和症状的减少或消失，则该对象被成功“治疗”。例如对于癌症，癌细胞数量的减少或癌细胞的消失；肿瘤尺寸的减小；对肿瘤转移的抑制(即减慢到一定程度并优选地停止)；对肿瘤生长一定程度的抑制；与特定癌症相关的一个或多个症状的减轻的时间长度增加，和/或缓解至一定程度；发病率和死亡率降低，以及生活质量方面的改善。疾病的体征和症状的减轻也可以由患者感觉到。治疗可以实现完全响应，定义为癌症的所有症状消失，或实现部分响应，其中肿瘤尺寸减小，优选地减小多于50%，更优选地减小75%。如果患者经历稳定的疾病，则该患者也被认为被治疗。在优选的实施方式中，癌症患者在一年后，优选地在15个月后仍然没有癌症的发展。评价成功治疗和改善疾病的这些参数可以通过具有适当的本领域技术的内科医生熟悉的常规手段容易地测量。

在进一步的实施方式中，本发明的融合蛋白可用于治疗同种免疫性疾病，例如移植排斥或移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应疾病。

实施例

现在结合以下实施例说明本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，本发明不限于这些实施例，而是包含明显由本文提供的教导产生的所有改变。

现在说明本文所公开的实验中使用的材料和方法。

质粒构建：

在阅读框内将人OX40胞外结构域(29-214)的编码序列连接到人TRAIL胞外结构域(98-281)的编码序列。这种嵌合通过PCR组装完成，使用来自ATCC的EST克隆作为模板(Huang等，2001Int Immunol13:529-539)。该组装使用的引物如下：

P1:GGGTTACCAGGATGTGCGTGGGGGC(SEQ ID NO:3)

P2:GTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGAAACCATTTCTACAGTT(SEQ ID NO:4)

P3:AACTGTAGAAATGGTTTCCGCACGGCCCCCGGGGACCTCCAC(SEQ ID NO:5)

P4:ATTTGCGGCCGCTTATTAGCCAACTAAAAAGGC(SEQ ID NO:6)

P5:GTGAGTTTTGTCAGATTTGGGCTCAGGGCCCTCAGGAGTCACCA(SEQ ID NO:7)

P6:TGGTGACTCCTGAGGGCCCTGAGCCCAAATCTGACAAAACTCAC(SEQ ID NO:8)

P7:ATTTGCGGCCGCTTATCATTTACCCGGCAGAGAGGAGAG(SEQID NO:9)

P8:ATAGGCGCGCCCATCATCACCATCATCTCCACTGTGTCGGGGACA(SEQ ID NO:10)

对于体内表达，使用pND质粒和基于转座子的“睡美人”SBC21质粒系统(Ivics等，1997Cell91:501-510)。如上述引物序列所示，KpnI限制性酶位点被并入P1引物，而NotI位点被并入在P4和P7引物中，用于pND亚克隆。对于pSBC21亚克隆，在P4和P7引物中HindIII位点被替换为NotI位点。通过TA克隆(Invitrogen,Carlsbad,CA)将PCR产物连接到pCR2.1质粒。用KpnI和NotI消化构造物，并且将移动的（切下的，moblizided）的盒连接到相应的pND位点。pND载体最初是来自Gary Rhodes(UC-Davis)的赠品，它具有pUC19骨架，包括内含子A的CMV启动子(Chapman等，1991Nucleitic Acids Res19:3979-3986)以及亚克隆的BGH内含子。为进行pSBC21亚克隆，将KpnI/HindIII消化而移动的OX40-TRAIL编码序列连接到pMF载体的相应位点，pMF包含EF1α启动子。然后，EF1α-OX40-TRAIL盒用NotI消化后被亚克隆到pSBC21。

对于验证pND和pSBC21表达质粒的鞘内活性，用类似的亚克隆策略产生荧光素酶报告基因构造物pLuc/ND和pLuc/SBC21。具体地，对pND表达载体，从pG12(Promega,Madison,WI)亚克隆萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶的编码序列，并使用SalI和NotI位点连接到pND内。对基于pSBC21的荧光素酶表达构造物，用HindIII和BamHI从pTAL-Luc(BD Biosciences;San Jose,CA)移动荧光素酶编码序列，并亚克隆到pMFneo的各自位点，并且依次用NotI移动包含EFlα启动子和荧光素酶编码序列的表达盒并亚克隆到pSBC21中。

对于体外表达和纯化蛋白质，使用_LGFP表达质粒的改变形式，pIRES2-EGFP(Clontech)，其中顺序插入全长Kozak序列(GCCGCCACC)和Igκ信号（前导）序列(位于多克隆位点、来自脑心肌炎病毒（ECMV）的内部核糖体进入位点和GFP编码序列的上游)。为此目的，利用P8寡核苷酸引物内的AscI位点和6×组氨酸编码序列，以及P4和P7引物内的XhoI位点。亚克隆将OX40·TRAIL或OX40·Fcγ1编码序列放入该载体的多克隆位点、编码的双顺反子mRNA内的Igκ前导序列下游和框内和GFP报告序列的上游(以便于识别产生重组蛋白的细胞)。在大肠杆菌中增殖质粒DNA并用DNA分离试剂盒(Endofree Maxi Kit,Qiagen)分离除去内毒素。

生物发光成像

使用结核菌素注射器在每只小鼠的背侧右足进行裸DNA鞘内注射。每只小鼠接受20μg溶解在2×PBS中，总体积为20μl的DNA。对于CNS表达，在激发后第8天，使用Hamilton注射器，向小鼠单次缓慢鞘内注射3μg在9μl脂质(MLRI)中的DNA到小脑延髓池。DNA:MLRI混合物在注射前在37℃温育30min。在小鼠接受荧光素酶表达构造物的情况下，在24或72h后进行成像。在以150μg/kg体重静脉注射磷酸盐缓冲液中的D-荧光素后，立即用克他命和甲苯噻嗪(Sigma Aldrich)麻醉。使用冷却的电荷耦合装置照相机(Xenogen,Hopkinton,MA)成像，采样时间为1min，在施用D-荧光素6min后开始成像。

蛋白质印迹

在12%丙烯酰胺凝胶上电泳pOX40·TRAIL/SecTag或pOX40Fcγ1/SecTag稳定转染体产生的条件培养液的20μl等分样品并转印到硝酸纤维膜上。用过氧化物酶啜合的多克隆抗-人IgG抗体(JacksonImmunoResearch,Inc.;1:6,000)直接探测膜。使用ChemiluminescenceReagent Plus(PerkinElmer Life Sciences,Inc.)显影印迹。然后用蛋白质印迹剥离缓冲液(Pierce,Inc)剥离膜的抗IgG抗体，然后用多克隆兔抗人OX40抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.;1:5,000)作为初级抗体，过氧化物酶啜合的多克隆羊抗兔抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.;1:10,000)作为二抗探测，并按上述说明显影。

接触性超敏反应

用DMSO中的NP-O-Su(Biosearch Technologies,Inc)皮下致敏从Jackson Laboratories获得的四周大雌性C57BL/6小鼠，如前所述(Yellayi等，2000Endocrine12:207-213)。在致敏5天后，使用结核菌素注射器，在背侧右足进行裸DNA皮内注射。每只右足接受20μg溶解在2×PBS中，总体积为20μl的DNA，如前所述(Chesnoy S等，2002Mol Ther5:57-62)，而左足只注射2×PBS。24h后，用NP-O-Su在小鼠右足再致敏，而左足只接受DMSO。再致敏后24h测量足垫厚度，处死小鼠，收集足用于切片和组织病理学分析。分析左足和右足之间的厚度差异。在这种情况下，未测试小鼠的足厚度用作基线。

为证实抑制是局部的而非全身性的，右足注射有DNA而左足只注射2×PBS，双足都用抗原激发。在这种情况下，确定左足和右足之间足垫厚度的差异。

EAE诱导和鞘内基因施用：用300μg MOG肽(38-50)：不完全弗氏佐剂为1:1的200μl PBS（含有2.5mg/ml结核分支杆菌H37RA，终浓度）——分成两份，每份100μl——皮下免疫八周大雌性C57BL/6小鼠，每侧注射一份。立即腹腔内施用百日咳毒素(100ng于200μl PBS中)，并在48h后再次施用。对于治疗，在激发8天后，动物被施用单次鞘内注射（使用Hamilton注射器，将10μl混合物缓慢注射到小脑延髓池）脂质-DNA复合物，其包含3μg在9μl脂质(MLRI)中的DNA，在注射前在37℃预温育30分钟。

每天观察小鼠并基于以下方案给出临床评分：0，没有临床迹象；1，尾软弱；2，后肢虚弱；3，后肢瘫痪；4前肢虚弱，后肢瘫痪；5垂死或死亡。评分等于或大于3的小鼠被供以用于水合作用的transgel(Charles River,Wilmington,MA)，以防止由于脱水死亡，并在每只鼠笼的地面提供食物。

组织病理学

将足在中性缓冲的福尔马林中固定并脱钙24小时，然后石蜡包埋。大脑和脊髓在10%磷酸盐缓冲盐水中固定过夜，石蜡包埋。根据标准程序，将切片(4μm)装到载玻片上，脱蜡，再水化并用苏木精和曙红或罗克沙尔固蓝和甲酚紫染色。

评估了骨髓中的组织病理学特征。对脊髓的髓鞘脱失进行评分，并对切片中炎症损伤的细胞组分按0-3分等级。使用髓鞘特异性罗克沙尔固蓝染色脊髓白质，用以下评分评估切片中的髓鞘脱失：0，没有明显的髓鞘脱失；1，0-10%的白质髓鞘脱失；2，10-30%的白质髓鞘脱失；3，>30%髓鞘脱失。根据形态学识别H&E染色的切片中髓鞘脱失损伤内的单核细胞和淋巴细胞，并按以下标准评分：0，没有明显的单核细胞；1，每个低倍视野（10×）<50个单核细胞；2，每个低倍视野（10×）50-100个单核细胞；3，每个低倍视野（10×）>100个单核细胞。关于化脓评分，根据形态学识别H&E染色的切片中髓鞘脱失损伤内的嗜中性粒细胞，并按以下标准评分：0，没有嗜中性粒细胞；1，每个低倍视野（10×）<5个嗜中性粒细胞；2，每个低倍视野（10×）5-10个嗜中性粒细胞；3，每个低倍视野>10个嗜中性粒细胞。损伤评分是综合髓鞘脱失评分，单核细胞/淋巴细胞评分和化脓评分得到的总体评分。

现在说明本实施例中实验的结果。

通过生物发光成像验证体内基因转移方法

第一步，确定使用分别并入CMV和EF1α启动子的pND和SBC21载体进行皮肤基因转移的可行性。将荧光素酶报告基因编码序列插入这两个表达载体中各自启动子的下游，产生pLuc/ND和pLuc/SBC21。将20μg pLuc/ND表达构造物鞘内注射到小鼠右足。可用生物发光成像容易地检测注射pLuc/ND的（右）足内的荧光素酶表达（图1，右图），在72h时表达略有减少（与注射后24小时相比，数据未示出）。在任何未注射的左足中未检测到荧光素酶表达（图1，右图）。

也评估了这些荧光素酶报告基因构造物在CNS中驱动表达的能力。将pLuc/ND和pLuc/SBC21载体-脂质体复合物髓内注射，在注射后72h两个表达构造物都可重复地观察到强CNS表达（图1，左图和中图），并持续达一周（数据未示出）。

OX40-TRAIL降低局部接触超敏反应

在用荧光素酶报告基因证明了pND和pSBC21载体用于局部（皮肤和鞘内）基因递送的效用后，载体被应用于局部的免疫调节蛋白表达。为此目的，设计了新的TSCP、OX40·TRAIL(图2A，上图)，其中OX40(I型膜蛋白)的胞外结构域被连接到TRAIL(II型膜蛋白)的胞外结构域。这种融合蛋白的嵌合编码序列，以及OX40-Fcγ1的编码序列(图2A，下图)被亚克隆到表达载体pLGFP中。反过来，得到的pOX40·TRAIL/LGFP和pOX40·Fcγ1,/LGFP表达构造物被稳定地转染到CHO-S细胞中。如图2B所示，两种编码的蛋白都能在来自转染体的条件培养液中容易地检测到，在还原变性凝胶的蛋白质印迹上验证预期的大小(OX40·TRAIL为44KD；OX40-Fcγ1为49kD)。

为允许体内表达，将相同的OX40·TRAIL和OX40·Fcγ1编码序列连接到CMV启动子下游的pND表达盒中，产生pOX40·TRAIL/ND和pOX40·Fcγ1/ND。在NP-O-Su致敏后5天，将各20μg上述产物皮内注射到小鼠右足垫。在表达构造物施用后24h，用NP-O-Su再致敏这些足，并在再致敏24h后测量足垫厚度。与只有载体或没有载体的对照组相比，两种含OX40的表达构造物都产生显著的(p<0.05)足垫厚度减小(图3A)。值得注意的是，组织病理学评估显示接受免疫抑制性融合蛋白的足水肿显著减少，尽管有持续的单核细胞浸润(图3B)。在注射媒介物、没有致敏的左足中没有发现炎症。

为确定在皮肤基因递送后是否有免疫抑制的全身化，在再致敏双足前24小时向右足垫皮内注射pOX40·TRAIL/ND(20μg)。只在注射质粒的（右）足中明显有显著的足垫厚度减小(图3C)，说明免疫抑制主要是局部性的，并且皮肤表达的重组蛋白没有显著的全身性效果。

OX40-TRAIL比其分离的OX40和TRAIL组分更有效地减轻EAE 严重程度

在经典接触超敏反应模型中，通过皮肤基因转移验证OX40-TRAIL的免疫抑制效力后，评估了OX40·TRAIL在另一局部基因递送情况下，即在EAE背景下鞘内基因转移的效力。具体地，在MOG激发后第8天，向小鼠鞘内注射3μg与9μl MLRI混合的(总体积为10μl)pOX40·TRAIL/ND或仅pND质粒载体。如图4A和4B所示，单次鞘内注射pOX40·TRAIL/ND显著地减轻了小鼠中EAE的严重程度。

在使用并入EF1α启动子进行基因表达的pSBC21载体中甚至观察到更大的抑制(图4C，4D)。来自接受pOX40·TRAIL/SBC21表达构造物的动物的脑脊液的蛋白质印迹分析显示在鞘内注射10天后可易于检测量的蛋白质(图4C，插图)。

通过比较嵌合OX40·TRAIL蛋白与各自分离表达的其组分部分(OX40，TRAIL)的功能，将另一因素（dimension）加入本分析。为此目的，构建了两个另外的表达构造物pOX40/SBC21和pTRAIL/SBC21。重要地，与用pOX40/SBC21、pTRAIL/SBC21、或仅pSBC21载体处理相比，在MOG激发后8天（即，在EAE的临床症状出现之前）鞘内施用pOX40·TRAIL/SBC21显著地减小了EAE评分，长达第17天。与其组分部分相比，融合蛋白更强功能的发现与另一融合对CTLA-4·FasL(Huang和Tykocinski,2001)类似。

pOX40-TRAIL/SBC21处理的小鼠的组织病理学

在来自OX40·TRAIL处理小鼠外周的淋巴细胞中MOG特异性增殖和细胞因子产生没有显著差异（数据未给出）。随后考查了用OX40·TRAIL或融合蛋白的分离的组分元件处理的EAE模型小鼠的组织病理学特征。为此实验，我们在第17天从每组选择临床评分为2.0-2.5的小鼠。考查了脑和脊髓的组织病理学特征并根据组织病理学特征给出评分：髓鞘脱失、单核细胞浸润、化脓以及基于其他评分总和的综合评分。即使对临床评分和髓鞘脱失水平相近的两组小鼠，对OX40-TRAIL处理的小鼠，其他组织病理学特征的评分显著不同。与载体处理的小鼠相比，在第17天处死的OX40-TRAIL处理的动物中，严重的化脓性脊髓白质炎和血管附近淋巴细胞浸润较少(图5C)。此外，pOX40·TRAIL/SBC21处理的动物单核细胞/淋巴细胞浸润、化脓和综合组织病理学评分显著低于用pOX40/SBC21或pTRAIL/SBC21处理的那些(图5B)。

图5C显示了与对照组小鼠相比，OX40·TRAIL处理的小鼠髓鞘脱失和炎症的代表性的组织学特征。来自用OX40·TRAIL和仅用载体处理的小鼠的脊髓存在相同程度的髓鞘脱失。然而，与仅用空载体处理的小鼠相比，OX40-TRAIL处理的小鼠中的髓鞘脱失损伤中存在明显的细胞性减少(图5B和5C)。具体地，在OX40-TRAIL处理组的髓鞘脱失损伤中有减少的单核细胞/淋巴细胞和粒细胞内容物。这些数据说明与没有接受OX40-TRAIL的小鼠相比，OX40·TRAIL处理的小鼠中有不同的损伤发展结果。OX40·TRAIL处理的小鼠中单核细胞/淋巴细胞评分的减小和粒细胞数量的减少说明OX40-TRAIL对CNS浸润细胞的多种细胞组分具有差异的作用。

尽管为说明目的，描述了本发明的具体实施方式，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离如所附权利要求中限定的本发明的条件下对本发明的细节作出多种变化。

Claims

1.融合蛋白，包含第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域是结合OX40配体的多肽，所述第二结构域是具有抑制功能的多肽。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述具有抑制功能的多肽包括防止免疫应答活化的蛋白质。

3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述具有抑制功能的多肽包括进行如下一种或多种的蛋白质：诱导凋亡、在选自T细胞、B细胞、天然杀伤（NK）细胞、NKT细胞、淋巴样祖细胞、树突细胞、单核细胞/巨噬细胞、具有抗原呈递能力基于组织的巨噬细胞系细胞或其它抗原呈递细胞的细胞类型中无反应性。

4.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其中具有抑制功能的多肽选自FasL、TNF、PDL-1、PDL-2、B7x、B7-H3、B7拮抗物、CD100、Cd5、Cd72、Ep-CAM、Fcγ-RII、CD22、CD66a、PIR-B和CD31。

5.权利要求4所述的融合蛋白，其中所述抑制性蛋白是FasL。

6.药物组合物，其包括上述权利要求任一项所述的融合蛋白。

7.上述权利要求任一项所述的融合蛋白或药物组合物在抑制免疫系统活化中的应用。

8.权利要求7所述的融合蛋白或药物组合物用于进行如下的一种或多种中的应用：阻止或减少髓鞘特异性T细胞的增殖和分化；抑制促炎细胞因子和趋化因子的产生；抑制其它细胞因子/趋化因子的增强；抑制基质金属蛋白酶的诱导；或抑制前列腺素E2从成纤维细胞和滑膜细胞的分泌。

9.权利要求7所述的融合蛋白或药物组合物用于抑制如下的一种或多种中的应用：抑制自身反应性T细胞增殖、自身反应性抗体产生、或炎症反应。

10.权利要求7-9任一项所述的融合蛋白或药物组合物用于施用给个体以治疗选自如下的疾病的应用：自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性新生儿血小板减少症、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性嗜中性白血球减少症、自身免疫性血球减少症、溶血性贫血、抗磷脂综合征、皮炎、麸质敏感性肠病、过敏性脑脊髓炎、心肌炎、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、肾小球肾炎（例如，IgA肾病）、多发性硬化、神经炎、眼葡萄膜炎、多内分泌腺病（polyendo-crinopathies）、紫癜(例如过敏性紫癜（Henloch-Scoenlein purpura）)、莱特尔氏病、僵人综合症、自身免疫性肺炎、心肌炎、IgA肾小球肾炎、致密沉积物病、风湿性心脏病、格林-巴利综合征、胰岛素依赖性糖尿病、和自身免疫性眼炎、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺机能减退症(即桥本氏甲状腺炎)、系统性红斑狼疮、盘状狼疮、肾炎-肺出血综合征、天疱疮、格雷夫斯氏病、重症肌无力、胰岛素耐受、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、风湿性关节炎、由于抗胶原抗体的硬皮症、混合结缔组织疾病、多肌炎/皮肌炎、恶性贫血、原发性爱迪生病、不育症、初级肾小球肾炎、IgA肾病、大疱性类天疱疮、干燥综合征（Sjogren’ssyndrome）、糖尿病和肾上腺素能药物抗性、具有哮喘或囊性纤维化的肾上腺素能药物抗性、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性硬化、其它内分泌腺体衰竭、白癜风、脉管炎、post-MI、心切开术综合征、风疹、过敏性皮炎、哮喘、和炎性肌病。

11.权利要求1-6任一项所述的融合蛋白或药物组合物用于施用给个体以治疗选自如下的疾病的应用：自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性新生儿血小板减少症、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性嗜中性白血球减少症、自身免疫性血球减少症、溶血性贫血、抗磷脂综合征、皮炎、麸质敏感性肠病、过敏性脑脊髓炎、心肌炎、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、肾小球肾炎（例如，IgA肾病）、多发性硬化、神经炎、眼葡萄膜炎、多内分泌腺病（polyendo-crinopathies）、紫癜(例如过敏性紫癜（Henloch-Scoenlein purpura）)、莱特尔氏病、僵人综合症、自身免疫性肺炎、心肌炎、IgA肾小球肾炎、致密沉积物病、风湿性心脏病、格林-巴利综合征、胰岛素依赖性糖尿病、和自身免疫性眼炎、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺机能减退症(即桥本氏甲状腺炎)、系统性红斑狼疮、盘状狼疮、肾炎-肺出血综合征、天疱疮、格雷夫斯氏病、重症肌无力、胰岛素耐受、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、风湿性关节炎、由于抗胶原抗体的硬皮症、混合结缔组织疾病、多肌炎/皮肌炎、恶性贫血、原发性爱迪生病、不育症、初级肾小球肾炎、IgA肾病、大疱性类天疱疮、干燥综合征（Sjogren’ssyndrome）、糖尿病和肾上腺素能药物抗性、具有哮喘或囊性纤维化的肾上腺素能药物抗性、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性硬化、其它内分泌腺体衰竭、白癜风、脉管炎、post-MI、心切开术综合征、风疹、过敏性皮炎、哮喘、和炎性肌病。