ES2609333T3

ES2609333T3 - Proteínas de fusión OX40/TRAIL

Info

Publication number: ES2609333T3
Application number: ES10751427.5T
Authority: ES
Inventors: Mark L. Tykocinski
Original assignee: Center for Technology Transfer of Penn
Current assignee: Center for Technology Transfer of Penn
Priority date: 2009-03-13
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2030-03-11
Also published as: US20120121640A1; CA2755198A1; CN103641918A; IL215005A0; EP2406388A1; WO2010105068A1; AU2010224094A1; CN102421913A; US9221895B2; EP2406388A4; EP2406388B1

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, donde el primer dominio es un polipéptido que se une a un ligando OX40 y el segundo dominio es un polipéptido que se une a un receptor TRAIL y dirige señales inhibidoras por medio de los receptores equivalentes en las células T u otras células que albergan el receptor TRAIL, a) donde el primer dominio es al menos una parte del dominio extracelular de OX40 y el segundo dominio es al menos una parte del dominio extracelular de TRAIL; o b) donde el primer dominio es OX40 y el segundo dominio es FasL.

Description

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A menos de que se especifique otra cosa, una “secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas de otra y que codifica la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótido que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones hasta el punto que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede en alguna

5 versión contener un intrón(es).

El término “polinucleótido” como se utiliza en el presente documento se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, ácidos nucleicos y polinucleótidos se utilizan en el presente documento de manera intercambiable. Un experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que se pueden hidrolizar en “nucleótidos” monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar en nucleósidos. Como se utiliza en el presente documento los polinucleótidos incluyen, peor no se limitan a, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por medios disponibles en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico a partir de una biblioteca recombinante o un genoma celular, utilizando tecnología de

15 clonación convencional y PCR™, y similares, y por medios sintéticos.

El término “polipéptido” como se utiliza en el presente documento se define como una cadena de restos de aminoácido, que tienen habitualmente una secuencia definida. Como se utiliza en el presente documento el término polipéptido incluye mutuamente los términos “péptido” y “proteína”.

El término “promotor” como se utiliza en el presente documento se define como una secuencia de ADN que es reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o la maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótido.

25 Como se utiliza en el presente documento, la expresión “secuencia promotora/reguladora” significa una secuencia de ácido nucleico que es necesaria para la expresión de un producto genético unida operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos, esta secuencia puede incluir una secuencia amplificadora y otros elementos reguladores que se necesitan para la expresión del producto genético. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, la que expresa el producto genético de una manera específica de tejido.

Un promotor “constitutivo” es una secuencia de nucleótidos, que cuando está unida operativamente a un polinucleótido que codifica o especifica un producto genético, hace que el producto genético se produzca en una célula en la mayoría o todas las condiciones fisiológicas de la célula.

35 Un promotor “inducible” es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente a un polinucleótido que codifica o especifica un producto genético, hace que el producto genético se produzca en una célula sustancialmente cuando está presente en la célula un inductor que se corresponde con el promotor.

Un promotor “específico de tejido” es una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente a un polinucleótido que codifica o especifica un producto genético, hace que el producto genético se produzca en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo tisular correspondiente al promotor.

El término “ARN” como se utiliza en el presente documento se define como el ácido ribonucleico.

45 La expresión “ADN recombinante” como se utiliza en el presente documento se define como un ADN que se produce uniendo piezas de ADN de diferentes orígenes.

La expresión “polipéptido recombinante” como se utiliza en el presente documento se define como un polipéptido producido utilizando métodos de ADN recombinante.

Como se utiliza en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” es la cantidad de una composición terapéutica suficiente para proporcionar un efecto beneficioso a un mamífero al que se administra la composición.

55 El término “transfectado” o “transformado” o “transducido” como se utiliza en el presente documento se refiere a un proceso por el cual se transfiere o introduce un ácido nucleico exógeno en la célula huésped. Una célula “transfectada”, “transformada” o “transducida” es la que ha sido transfectada, transformada o transducida con un ácido nucleico exógeno. La célula incluye el sujeto primario y su progenie.

La frase “bajo el control transcripcional” o “unido operativamente” como se utiliza en el presente documento significa que el promotor está en la localización y orientación correctas en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción por ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

65 El término “vacuna” como se utiliza en el presente documento se defina como un material que se utiliza para provocar una respuesta inmunitaria tras la administración del material a un mamífero.

Un “vector” es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede utilizar para suministrar el ácido nucleico asilado en el interior de una célula. Se conocen en la técnica muchos vectores que incluye, pero no se limitan a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuesto iónicos o anfifílicos, plásmidos, y virus. Por lo tanto, el término “vector” incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. También

5 se tiene que considerar que el termino incluye compuestos no plasmídicos y no víricos que facilitan la transferencia de un ácido nucleico a las células, tal como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas, y similares. Ejemplos de vectores víricos incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados, vectores retrovíricos, y similares.

El término “virus” como se utiliza en el presente documento se define como una partícula que consiste en un ácido nucleico (ARN o ADN) encerrado en una cubierta proteica, con o sin una envoltura lipídica externa, que es capaz de replicarse en una célula completa.

Como se utiliza en el presente documento en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo como se

15 utilizan en los ejemplos y a menos de que se especifique expresamente otra cosa, todos los números se deben leer como si estuvieran precedidos por la palabra “aproximadamente”, incluso si el término no aparece expresamente. También, cualquiera de los intervalos mencionados en el presente documento tiene la intención de incluir todos los sub-intervalos incluidos en los mismos.

Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, varios aspectos de la invención pueden presentarse en forma de formato. Se debería entender que la descripción en formato rango es simplemente por conveniencia y brevedad y no se debería considerar como una limitación inflexible de la invención. En consecuencia, la descripción de un intervalo debería considerarse que se desvelan específicamente todos los sub-intervalos posibles así como los valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como desde 1 a 6 se debería

25 considerar que se desvelan específicamente sub-intervalos tales como desde 1 a 3, desde 1 a 4, desde 1 a 5, desde 2 a 4, desde 2 a 6, desde 3 a 6, etc., así como los números individuales en ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3, y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

La presente invención proporciona, en un aspecto, una proteína de fusión que actúa en el eje de señalización OX40 y TRAIL, por ejemplo, una proteína de fusión que tiene un primer dominio que comprende un polipéptido que se une a un ligando OX40; y un segundo dominio que comprende un polipéptido que se une a un receptor TRAIL y dirige las señales inhibidoras por medio de receptores equivalentes en las células T u otras células que albergan el receptor

35 TRAIL,

a) donde el primer dominio es al menos una parte del dominio extracelular de OX40 y el segundo dominio es al menos una parte del dominio extracelular de TRAIL; o

b) donde el primer dominio es OX40 y el segundo dominio es FasL. En particular el primer dominio es un polipéptido que tiene la capacidad de interferir la capacidad del ligando OX40 para la activación por medio de su receptor OX40, y el segundo dominio es un polipéptido que puede dirigir señales inhibidoras por medio de receptores equivalentes en las células T y otras células que albergan el receptor TRAIL.

45 Los primeros dominios adecuados en el contexto del eje de señalización OX40/TRAIL incluye, por ejemplo, la propia proteína OX40, variantes o derivados de la proteína OX40 de tipo silvestre, u otros polipéptidos y proteínas específicamente hechas a medida para unirse al ligando OX40, y evitar la señalización de este ligando por medio de su receptor OX40, tales como anticuerpos que se unen al ligando OX40, partes de anticuerpos que se unen al ligando OX40, y derivados de lipocalina modificados para unirse al ligando OX40. Preferentemente, el primer dominio de la proteína de fusión de esta realización es al menos una parte del dominio extracelular de la proteína OX40, específicamente la parte del dominio extracelular que es necesaria para la unión del ligando OX40 y la interferencia con su capacidad para inhibir y activar un receptor OX40 unido a una membrana. Las variantes de la forma de tipo silvestre del dominio extracelular también se incluyen en la presente invención, o la parte del dominio extracelular responsable de la unión con OX40, siempre que la variante proporcione un nivel similar de actividad

55 biológica que la proteína de tipo silvestre.

En consecuencia, el término “polipéptido que se une a un ligando OX40” como se utiliza en el presente documento incluye la proteína OX40; el dominio extracelular de la proteína OX40; un polipéptido que es al menos una parte del dominio extracelular de la proteína OX40, la parte responsable para la unión a un ligando OX40; anticuerpos contra el ligando OX40; lipocalinas modificadas para unirse al ligando OX40; y variantes y/o derivados de estos. Se entiende que el término “OX40” engloba un polipéptido que es la secuencia de aminoácidos completa de la proteína OX40, que incluye los dominios citoplasmático, transmembrana y extracelular, así como los polipéptidos que son porciones más pequeñas de la proteína, tales como el dominio extracelular o una parte del dominio extracelular. En una realización el primer dominio en el par de señalización OX40/TRAIL es al menos una parte del dominio

65 extracelular de un receptor OX40 humano.

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incluyendo los reconocidos/previstos por el software de reconocimiento de péptidos de señal disponible públicamente que conocen los expertos en la técnica.

En realizaciones adicionales, la proteína de fusión OX40/TRAIL es una variante y/o un derivado de la secuencia de

5 aminoácidos que se presenta en SEQ.ID.NO. 1. En un aspecto adicional más de la presente invención, el componente TRAIL de cualquiera de las proteínas de fusión descritas en el presente documento se pueden sustituir con otra proteína inhibidora, es decir, una proteína que evita la activación de una respuesta inmunitaria y/o induce apoptosis, anergia, y/o cualquier otra forma de no respuesta en células T u otros tipos celulares, tales como células B, células citolíticas naturales (NK), células NKT, células linfoides progenitoras, células dendríticas, monocitos/macrófagos, células del linaje de macrófagos basadas en tejidos con capacidad de presentación de antígenos, y cualquiera de varias células presentadoras de antígeno no profesionales, por ejemplo, las células endoteliales. Ejemplos de proteínas inhibidoras incluyen, pero no se limitan a FasL, TNF, PDL-1, PDL-2, B7x, B7-H3 y CD31.

15 Por ejemplo, BTLA es un importante receptor inhibidor, B7x puede ser el ligando, además de otros ligandos que están por descubrir. DE manera similar CTLA-4 es otro receptor importante, y los ligandos que dirigen este inhibidor del receptor CTLA-4 incluyen algunas de las moléculas B7, así como Ac agonistas. En este caso las proteínas de fusión serían proteínas de fusión OX40/B7x y OX40/B7, respectivamente.

Existe la apreciación creciente de que las células B también pueden ser claves para dirigir la autoinmunidad. También se desvelan inhibidores adicionales de ligandos (fusionados con FnI4) que dirigen los receptores inhibidores de células B, tales como CD100 (que se une a CD72), CD5 (también se une a CD72), CD72 (que se une a CD5), Ep-CAM (unido a LAIR-1), agonistas de Fc-gamma-RII, CD22, PDL-1, PDL-2, CD66a, y PRI-B.

25 La bibliografía está repleta de ejemplos adicionales, tales como los que se enumeran en Sinclair, N. "Why so Many Coinhibitory Receptors?, Scand. J. Immunol. 50, 10-13 (1999); Melero, I. et al. "Immunostimulatory monoclonal antibodies for cancer therapy", Nature Rev. Cancer 7:95-106 (2007); y Zang, X. et al., "The B7 Family and Cancer Therapy: Costimulation and Coinhibition", Clin. Cancer Res. 13: 5271-5279 (2007). Cualquiera de las proteínas inhibidoras mencionadas anteriormente se desvela por las proteínas de fusión y los métodos de la presente solicitud, y se hace referencia en el presente documento como “polipéptidos que tienen una función inhibidora”.

En consecuencia, la presente invención proporciona inter alia un par de fusión OX40/FasL. La solicitud desvela además OX40/pares de proteína de fusión, tales como OX40/PDL-1, OX40/PDL-2, OX40/TNF, OX40/CD100, OX40/CD5, OX40/CD72, OX40/Ep-CAM, OX40/Fc-gamma-RII, OX40/CD22, OX40/CD66a, OX40/PIR-B, OX40/B7x,

35 OX40/B7-H3 y OX40/CD31. Cualquiera de los primeros dominios descritos anteriormente en el contexto de los ejes de señalización OX40/TRAIL, por ejemplo, polipéptidos que se unen a un ligando OX40, serían primeros dominios adecuados.

En una realización, las proteínas de fusión de la presente invención inhiben la activación del sistema inmunitario evitando o reduciendo la proliferación y diferenciación de células T específicas de mielina. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente invención inhiben la producción de citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias, tales como IL-6, IL-8, RANTES, IP-10 y MCP-1, o inhiben la potenciación de otras citocinas/quimiocinas, tales como TNF-α y IL-1β; o inhibe la inducción de metaloproteinasas de la matriz tales como MMP-1 y MMP-9; o inhiben la secreción de prostaglandinas E2 de fibroblastos y sinoviocitos. La presente invención abarca la inhibición/regulación

45 negativa de cada una de las citocinas que están promovidas por el ligando OX40 o moduladas negativamente por el ligando TRAIL.

En otras realizaciones, las proteínas de fusión de la presente invención inhiben la proliferación de células T autorreactiva, la producción de anticuerpos autorreactiva, y las reacciones inflamatorias.

La mayoría (aunque no todos) los miembros de la familia de los receptores TNF (TNFR) son proteínas transmembrana tipo II. Estas proteínas contienen un dominio extracelular que se caracterizan estructuralmente por la presencia de uno a seis dominios ricos en cisteína (CRD). El CRD típico es aproximadamente de 40 aminoácidos de longitud y contiene seis restos de cisteína conservados que forman tres puentes disulfuro intracatenarios. El

55 propio CRD está compuesto normalmente por dos módulos estructurales distintos.

TRAIL

TRAIL es una proteína de membrana tipo II que tienen 291 aminoácidos y se ha secuenciado para varias especies, incluyendo, peor no limitados a ratón: Swiss Prot. Nº de acceso P50592: human: Swiss Prot. Nº de acceso P50591; Rattus norvegicus: NCBI Acceso NP_663714; Siniperca chuatsi (Perca china): NCBI Acceso AAX77404; Gallus gallus (pollo): NCBI Acceso BAC79267; Sus scrofa (Cerdo): NCBI Acceso NP_001019867; Ctenopharyngodon idella (Carpa forrajera): NCBI Acceso AAW22593; y Bos taurus (ganado bovino): NCBI Acceso XP_001250249.

65 El dominio extracelular de TRAIL comprende los aminoácidos 39-281, y el dominio TNF responsable de la unión con el receptor es del aminoácido 121-280, basándose en los modelos de homología de TNF. La parte de la proteína

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rectal, nasal o parenteral (incluyendo la subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se puede preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press; y Remington’s Pharmaceutical Sciences,

5 supra, Easton, Pa.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, N.Y.; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, N.Y.; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, N.Y.

En realizaciones adicionales, la presente invención contempla la administración de las proteínas de fusión por métodos de terapia genética, por ejemplo, por la administración de un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión de interés. Los bloques que constituyen la proteína (por ejemplo, el primer y segundo dominios) de las proteínas de fusión de la presente invención se han caracterizado bien, tanto las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas como las secuencias de aminoácidos de las proteínas resultantes. La modificación genética de dichos ácidos nucleicos por métodos de ADN recombinante está en la capacidad de un experto en la

15 técnica. La optimización del codón, con el fin de maximizar los rendimientos de proteína recombinante, en escenarios celulares particulares, también está en las capacidades del experto en la técnica. La administración de un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de fusión se engloba en la expresión “administrar una cantidad eficaz de una proteína de fusión de la invención”. Los métodos de terapia genética se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO96/07321 que desvela el uso de métodos de terapia genética para generar anticuerpos intracelulares. Los métodos de terapia genética han sido demostrados satisfactoriamente en pacientes humanos. Véase, por ejemplo, Baumgartner et al., Circulation 97: 12, 1114-1123 (1998), y más recientemente, Fatham, C.G. ’A gene therapy approach to treatment of autoimmune diseases’, Immun. Res. 18:15-26 (2007); y la Patente de EE. UU. Nº 7.378.089. Véase también Bainbridge JWB et al. "Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital Amaurosis". N Engl J Med 358:2231-2239, 2008; y Maguire AM et al. "Safety and efficacy of gene

25 transfer for Leber ’s Congenital Amaurosis". N Engl J Med 358:2240-8, 2008. Hay dos estrategias principales para introducir un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión (opcionalmente contenido en un vector) en las células de los pacientes; in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo se inyecta el ácido nucleico directamente en el paciente, normalmente en el sitio en el que se necesita la proteína de fusión. Para el tratamiento ex vivo, se retiran las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y se administran las células modificadas al paciente sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas en membranas porosas que se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, las Pat de EE. UU. Nº 4.892.538 y 5.283.187). Existe una variedad de técnicas disponibles para la introducción de ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped que se pretende. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro

35 incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, método de precipitación en fosfato cálcico, etc. Normalmente los vectores que se utilizan para suministro ex vivo del gen son los vectores retrovíricos y lentivíricos.

Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo preferidas incluyen la transfección con vectores víricos tales como adenovirus, virus del herpes simple I, virus adeno-asociados), sistemas basados en lípidos (los lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo), ADN desnudo, y sistemas de expresión basados en transposón. Para revisar el marcaje conocido actualmente y los protocolos de terapia genética véase Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Véase también el documento WO 93/25673.

45 “Terapia genética” incluye tanto la terapia genética convencional donde se consigue un efecto duradero por un único tratamiento, y la administración de agentes terapéuticos genéticos, que implican la administración una vez o repetidamente un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los oligonucleótidos se pueden modificar para aumentar su captación, por ejemplo, sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos sin carga. Las proteínas de fusión OX40/TRAIL de la presente invención pueden suministrarse utilizando métodos de terapia genética, por ejemplo localmente en lechos tumorales, por vía intratecal, o sistémica (por ejemplo, por medio de vectores que se dirigen a tipos de tejido específicos, por ejemplo, vectores víricos adeno-asociados específicos de tejido). En algunas realizaciones, las células primarias (tales como linfocitos o células madre) de un individuo se pueden transfectar ex vivo con un gen que codifique cualquiera de las proteínas de fusión de la presente invención, y luego devolviendo las células transfectadas al cuerpo del individuo.

55 En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente invención son adecuadas para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos del sistema inmunitario, que incluyen pero no se limitan a, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, neutropenia autoinmunitaria, autoinmunocitopenia, anemia hemolítica, síndrome anti-fosfolipídico, dermatitis, enteropatía sensible al gluten, encefalomielitis alérgica, miocarditis, policondritis recurrente, enfermedad cardíaca reumática, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatía de IgA), esclerosis múltiple, neuritis, uveítis, oftalmia, poliendocrinopatías, púrpura (por ejemplo púrpura de Henloch-Scoenlein), enfermedad de Reiter, síndrome de Stiff-Man, inflamación pulmonar autoinmunitaria, miocarditis, glomerulonefritis de IgA, enfermedad de depósito denso, enfermedad cardíaca reumática, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus insulinodependiente, y ojo inflamatorio

65 autoinmunitario, tiroiditis autoinmunitaria, hipotiroidismo (es decir, tiroiditis de Hashimoto), lupus eritematoso sistémico, lupus discoide, síndrome de Goodpasture, Pénfigo, autoinmunidades de receptor tales como, por ejemplo,

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Ejemplos

La invención se describe ahora con referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan con fines solamente de ilustración, y la invención no se limita a estos Ejemplos, sino más bien engloba todas las variaciones 5 que son evidentes de las enseñanzas que se proporcionan en el presente documento.

Los materiales y métodos empleados en los experimentos descritos en el presente documento se describen ahora.

Construcciones de plásmido:

La secuencia codificante del dominio extracelular OX40 humano (29-214) se unió en fase al del dominio extracelular del TRAIL humano (98-281). Esta quimerización se consiguió por medio de ensamblaje por PCR, utilizando clones EST de la ATCC como matrices (Huang et al. 2001 Int Immunol 13: 529-539). Los cebadores que se utilizaron para este ensamblaje eran los siguientes:

15 P1: GGGTTACCAGGATGTGCGTGGGGGC (SEQ ID NO: 3) P2: GTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGAAACCATTTCTACAGTT (SEQ ID NO: 4) P3: AACTGTAGAAATGGTTTCCGCACGGCCCCCGGGGACCTCCAC (SEQ ID NO: 5) P4: ATTTGCGGCCGCTTATTAGCCAACTAAAAAGGC (SEQ ID NO: 6) P5: GTGAGTTTTGTCAGATTTGGGCTCAGGGCCCTCAGGAGTCACCA (SEQ ID NO: 7) P6: TGGTGACTCCTGAGGGCCCTGAGCCCAAATCTGACAAAACTCAC (SEQ ID NO: 8) P7: ATTTGCGGCCGCTTATCATTTACCCGGCAGAGAGGAGAG (SEQ ID NO: 9) P8: ATAGGCGCGCCCATCATCACCATCATCTCCACTGTGTCGGGGACA (SEQ ID NO: 10)

25 Para la expresión in vivo, se emplearon el plásmido pND y el plásmido SBC21 ‘sleeping beauty’ basado en transposón (Ivics et al., 1997 Cell 91: 501-510). Como es evidente por las secuencias de cebador anteriores, se incorporó un sitio de enzima de restricción KpnI en el cebador P1, y se incorporó un sitio NotI en los cebadores P4 y P7, para la subclonación en pND. Para la subclonación en pSBC21, se sustituyó un sitio HindIII por el sitio NotI en los cebadores P4 y P7. Los productos de la PCR se unieron en el plásmido pCR2.1 por clonación TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las construcciones se digirieron con KpnI y NotI, y los casetes movilizados se unieron en los sitios correspondientes de pND. El vector pND, originalmente un amable regalo de Gary Rhodes (UC-Davis), tiene un armazón de pUC19, un promotor CMV que incluye un intrón A (Chapman et al., 1991 Nucleic Acids Res 19: 39793986), e intrones BGH subclonados. Para los fines de la subclonación pSBC21, la secuencia codificante OX40-TRAIL, movilizada con digestión KpnI/HindIII, se unió en los sitios correspondientes del vector pMF, que contiene el

35 promotor EF1α. Posteriormente, el casete EF1α-OX40-TRAIL se subclonó en pSBC21, tras la digestión con NotI.

Para verificar la actividad intratecal de los plásmidos pND y pSBC21 de expresión, se produjeron construcciones indicadoras de luciferasa pLUc/ND y pLuc/SBC21 utilizando estrategias de subclonación similares. Específicamente, para el vector de expresión pND, la secuencia codificante para la luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) se subclonó a partir de pGL2 (Promega, Madison, WI) y se ligó en pND utilizando los sitios SaII y NotI. Para la construcción de expresión de luciferasa basada en pSBC21, la secuencia codificante de luciferasa de pTAL-Luc (BD Biosciences; San Jose, CA) se movilizó con HinIII y BamHI, y se subclonó en los sitios respectivos de pMFneo, y a su vez, el casete de expresión que englobaba el promotor EF1α y la secuencia codificante de luciferasa se movilizó con NotI y se subclonó en pSBC21.

45 Para la expresión in vitro y la purificación de la proteína, se empleó una versión modificada del plásmido de expresión LGFP, pIRES2-EGFP (Clontech), en el que se insertó secuencialmente una secuencia Kozak completa (GCCGCCACC) y una secuencia de señal IgK (líder) (posicionada corriente arriba de un sitio de clonación múltiple, el sitio de entrada interna del ribosoma para el virus de la encefalomiocarditis (ECMV) y la secuencia codificante (GFP). En este extremo, se aprovecharon el sitio AscI y una secuencia codificante 6x His en el oligonucleótido cebador P8, y el sitio XhoI en los cebadores P4 y P7. La subclonación colocaba las secuencias codificantes OX40TRAIL u OX40 Fcγ1 en el sitio de clonación múltiple de este vector, corriente abajo y en fase con la secuencia líder IgK, y corriente arriba del indicador GFP en el ARNm bicistrónico codificado (para facilitar la identificación de células que producen la proteína recombinante). El ADN plasmídico se propagó en E. coli y se aisló libre de toxinas

55 en un kit de aislamiento de ADN (Endofree Maxi Kit, Qiagen).

Formación de imágenes de bioluminiscencia:

Se llevó a cabo la inyección intradérmica de ADN desnuco en la parte dorsal del pie derecho de cada ratón, utilizando una jeringa de tuberculina. Cada ratón recibió 20 µg de ADN disuelto en 2x PBS, en un volumen total de 20 µl. Para la expresión en el SNC, los ratones recibieron el día 8 tras el desafío una inyección intratecal lenta en la cisterna magna, utilizando una jeringa Hamilton, de 3 µg de ADN en 9 µl de lípido (MLRI). La mezcla de ADN: MLRI se incubó a 37 ⁰C durante 30 min antes de la inyección. En el caso de los ratones que recibieron las construcciones de expresión de luciferasa, se llevó a cabo la formación de imágenes 24 o 72 h más tarde. Inmediatamente después

65 de la inyección i.v. de 150 µg/kg de peso corporal de D-luciferina en solución salina tampón fosfato, los ratones se anestesiaron con ketamina y xilacina (Sigma Aldrich). La formación de imágenes, utilizando un dispositivo de cámara

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neutrofílicas; 1, < 5 neutrófilos por campo a bajo aumento (10x); 2, 5-10 neutrófilos por campo a bajo aumento; 3, > 10 células neutrofílicas por campo a bajo aumento. La valoración de la lesión es una valoración total que se obtiene sumando las valoraciones de desmielinización, monocitos/linfocitos y supuración.

5 Se describen ahora los resultados de los experimentos presentados en este Ejemplo.

Validación de la estrategia de transferencia genética in vivo por medio de formación de imágenes de luminiscencia

Como una primera etapa, se estableció la fiabilidad de la transferencia genética cutánea utilizando los vectores pND y SBC21, que incorporan los promotores CMV y EF1α, respectivamente. Se insertó la secuencia codificante del indicador luciferasa corriente abajo de los promotores respectivos en dos vectores de expresión, generando pLuc/ND y pLuc/SBC21. Se inyectaron por vía intradérmica 20 µg de la construcción de expresión pLuc/ND en los pies derechos de los ratones. La expresión de luciferasa era fácilmente detectable por formación de imágenes de bioluminiscencia en el pie (derecho) inyectado para pLuc/ND (Fig. 1, panel de la derecha), con una pequeña

15 disminución de la expresión a las 72 h (en comparación con las 24 h post-inyección; datos no mostrados). La expresión de luciferasa no se detectaba en ninguno de los pies izquierdos no inyectados (Fig. 1, panel derecho).

También se evaluó la capacidad de estas construcciones indicadoras de luciferasa para dirigir la expresión en el SNC. Se inyectaron por vía intratecal complejos vector-liposoma pLuc/ND y pLuc/SBC21, y se observaba una fuerte expresión en el SNC reproducible para ambas construcciones de expresión a las 72 h post-inyección (Fig. 1, paneles izquierdo y del medio) y hasta una semana (datos no mostrados).

Disminución local de la hipersensibilidad de contacto por OX40·TRAIL

25 Habiendo documentado la utilidad de los vectores pND y pSBC21 para el suministro genético local (cutáneo e intratecal) utilizando un indicador de luciferasa, se aplicaron los vectores a una expresión proteica inmunomoduladora local. Para este fin, se diseñó un nuevo TSCP, OX40·TRAIL (Fig. 2A, panel superior), en el que el dominio extracelular de OX40 (una proteína de membrana Tipo I) se una al de TRAIL (una proteína de membrana Tipo II). La secuencia codificante quimérica para esta proteína de fusión, así como una secuencia codificante para OX40-Fcγ1 (Fig. 2A, panel inferior) se subclonaron en el vector de expresión pLGFP. A su vez, las construcciones de expresión resultantes pOX40·TRAIL/LGFP y pOX40·Fcγ1/LGFP se transfectaron establemente en células CHO-

S. Como se muestra en la Fig. 2B, ambas proteínas codificadas podían detectarse fácilmente en medios acondicionados de los transfectantes, se verificaron los tamaños esperados (44 kD para OX40·TRAIL; 49 kD para OX40-Fcγ1) en transferencias de Western de geles desnaturalizantes reductores.

35 Para permitir la expresión in vivo, se unieron las mismas secuencias codificantes OX40·TRAIL y OX40·Fcγ1 en el casete de expresión de pND, corriente abajo del promotor CMV, generando pOX40·TRAIL/ND y pOX40·Fcγ1/ND. Se inyectaron 20 µg de cada uno por vía intradérmica en las almohadillas plantares derechas de ratones 5 días tras la sensibilización con NP-O-Su. Estos pies se re-sensibilizaron con NP-O-Su 24 h tras la administración de la construcción de expresión, y se midió el grosor de la almohadilla plantar 24 h tras la re-sensibilización. Ambas construcciones de expresión que contenían OX40 daban como resultado reducciones significativas (p < 0,05) del grosor de la almohadilla plantar en comparación con los grupos de control con el vector solo o sin vector (Fig. 3A). Notablemente, la evaluación histopatológica revelaba una reducción significativa del edema de los pies que recibieron las proteínas de fusión inmunoinhibidoras, sin resistencia de infiltración mononuclear persistente (Fig.,

45 3B). No se veía inflamación en los pies izquierdos no inyectados, no sensibilizados.

Para determinar si se produce una supresión inmunitaria generalizada tras el suministro genético cutáneo, se inyectó por vía intradérmica pOX40·TRAIL/ND (20 µg) en las almohadillas plantares derechas 24 h antes de la resensibilización en ambos pies. Eran evidentes disminuciones significativas del grosor de la almohadilla plantar solamente en los pies (derechos) inyectados con plásmidos (Fig. 3C), sugiriendo que la inmunosupresión es predominantemente local y que no hay un efecto sistémico significativo de la proteína recombinante que se expresa cutáneamente.

OX40·TRAIL disminuye la gravedad de EAE de manera más eficaz que sus componentes OX40 y TRAIL aislados

55 Habiendo validado la eficacia inmunoinhibidora de OX40-TRAIL por transferencia genética vía cutánea en el modelo clásico de hipersensibilidad de contacto, se evaluó la eficacia de OX40·TRAIL en otro contexto de suministro genético local, a saber, la transferencia genética intratecal a nivel de EAE. Específicamente, los ratones se inyectaron por vía intratecal 8 días tras el desafío con MOG con 3 µg de pOX40·TRAIL/ND frente al vector plásmido pND solo, formando un complejo con 9 µl de MLRI (en un volumen total de 10 µl). Como se muestra en las Fig. 4A y 4B, una única inyección intratecal de pOX40·TRAIL/ND reducía significativamente la gravedad de EAE en los ratones.

Se observó una supresión incluso mayor con el vector pSBC21, que incorpora el promotor EF1α para la expresión

65 genética (Fig. 4C, 4D). Los análisis de transferencia de Western del líquido cefalorraquídeo de animales que recibían la construcción de expresión pOX40·TRAIL/SBC21 mostraban cantidades fácilmente detectables de proteína 10 días

Claims

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