ES2210786T3

ES2210786T3 - Receptor lsr, clonacion y aplicaciones.

Info

Publication number: ES2210786T3
Application number: ES98936611T
Authority: ES
Inventors: Bernard Bihain; Lydie Bougueleret; Frances Yen-Potin
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genset SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1997-08-06
Filing date: 1998-08-06
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: EP0964870A2; EP1003783A2; FR2767135A1; WO1999007736A2; DE69841186D1; WO1999007736A3; DK1003783T3; EP0964870B1; WO1999007737A3; JP2001512746A; ATE443721T1; DE69838720D1; US20090263847A1; US7919091B2; EP1903057B1; JP2005143508A; EP1903057A3; DK0964870T3; US7291709B2; US20040077051A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO POLIPEPTIDO RECEPTOR COMPLEJO LSR (LIPOLYSIS STIMULATED RECEPTOR) CARACTERIZADO POR SUS ACTIVIDADES FUNCIONALES, LA CLONACION DE LOS ADNC COMPLEMENTARIOS DE LOS ARNS MENSAJEROS QUE CODIFICAN CADA UNA DE LAS SUBUNIDADES DEL COMPLEJO MULTINUMERICO, VECTORES Y CELULAS TRANSFORMADAS, PROCEDIMIENTOS DE DIAGNOSTICO Y DE SELECCION DE COMPUESTOS UTILIZABLES COMO MEDICAMENTOS PARA LA PREVENCION Y/O EL TRATAMIENTO DE PATOLOGIAS Y/O DE PATOGENIAS TALES COMO LA OBESIDAD Y LA ANOREXIA, LAS HIPERLIPIDEMIAS, LA DIABETES, LA HIPERTENSION Y MAS CONCRETAMENTE, LAS DIVERSAS PATOLOGIAS ASOCIADAS A ANOMALIAS DEL METABOLISMO DE LAS CITOQUINAS.

Description

Receptor LSR, clonación y aplicaciones.

La invención se refiere a un nuevo polipéptido receptor complejo LSR (Lipolysic Stimulated Receptor), caracterizado por sus actividades funcionales, la clonación de los ADNc complementarios de los ARNs mensajeros que codifican cada una de las subunidades del complejo multinumérico, de los vectores y células transformadas, de los métodos de diagnóstico y selección de compuestos utilizables a título de medicamento para la prevención y/o el tratamiento de patologías y/o de patogenias como la obesidad y la anorexia, las hiperlipidemias, la aterosclerosis, la diabetes, la hipertensión y más generalmente las diferentes patologías asociadas con anomalías del metabolismo de las citoquinas.

La obesidad es un problema de salud pública de carácter tanto grave como generalizado: en los países industrializados, un tercio de la población sufre de un sobrepeso de al menos el 20% con respecto al peso ideal. El fenómeno se acentúa, en las regiones del mundo en donde las economías se modernizan, como las islas del Pacífico, y de manera general. En los Estados Unidos, la tasa de obesidad superaba el 25% a fines de los años 70, y el 33% a principios de los años 90.

La obesidad aumenta de manera considerable el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares o metabólicas. Se estima que si toda la población tuviera un peso ideal, el riesgo de insuficiencia coronaria se vería reducido en un 25% y el de la insuficiencia cardiaca y de accidentes cerebrovasculares en un 35%. La insuficiencia coronaria, la enfermedad ateromatosa y la insuficiencia cardiaca ocupan el primer lugar entre las complicaciones cardiovasculares inducidas por la obesidad. Para una sobrecarga ponderable superior al 30%, la incidencia de las afecciones coronarias se duplica, en el caso de individuos menores de 50 años. Los estudios realizados para otras enfermedades son igualmente elocuentes. Para un sobrepeso del 20%, el riesgo de hipertensión arterial se duplica. Para un sobrepeso del 30%, el riesgo de desarrollar una diabetes no dependiente de insulina se triplica. El de las hiperlipidemias se multiplica por 6.

La lista de enfermedades cuya aparición se ve favorecida por la obesidad es larga: hiperuricemia (11,4% en los individuos obesos, contra 3,4% en la población general), patologías digestivas, anomalías de las funciones hepáticas e incluso algunos tipos de cáncer.

Ya sea que las alteraciones fisiológicas de la obesidad se caractericen por un aumento en el número de las células adiposas, por un aumento de la cantidad de triglicéridos almacenados en cada célula adiposa, o por ambos motivos, esta sobrecarga es principalmente resultado de un desequilibrio entre las cantidades de calorías absorbidas y las de las calorías gastadas por el organismo. Las investigaciones sobre los motivos de este desequilibrio han tomado varias direcciones. Algunas se refirieron al estudio del mecanismo de absorción de los alimentos y, por ende, a las moléculas que controlan la ingesta alimenticia y la sensación de saciedad. Otros estudios se refirieron al metabolismo básico, es decir a la manera en que el organismo hace uso de las calorías absorbidas.

Se han propuesto cuatro tipos de tratamientos de la obesidad. La restricción alimenticia es el utilizado más frecuentemente. Se aconseja a los pacientes obesos que cambien sus hábitos alimenticios, con el fin de absorber menos calorías. Este tipo de tratamiento es eficaz a corto plazo. Sin embargo, existe una tasa de reincidencia muy importante. También se propone el aumento de los gastos calóricos mediante ejercicio físico. La aplicación exclusiva de este tratamiento resulta ineficaz pero sin embargo mejora la pérdida de peso en individuos que siguen un régimen hipocalórico. La cirugía gastrointestinal, que disminuye la absorción de las calorías ingeridas, es eficaz pero ha sido virtualmente abandonada dados sus efectos secundarios. Un enfoque basado en medicamentos implica, ya sea la acción anorexígena de moléculas que intervienen a nivel del sistema nervioso central, o el efecto de moléculas que aumentan el gasto energético aumentando la producción de calor. El prototipo de este tipo de molécula son las hormonas tiroideas que desacoplan las fosforilaciones oxidantes de la cadena respiratoria mitocondrial. Los efectos secundarios y la toxicidad de este tipo de tratamiento hacen que su utilización sea peligrosa. También se practica un enfoque que apunta a disminuir la absorción de los lípidos alimenticios secuestrándolos en la luz del tubo digestivo. Sin embargo, este enfoque induce desequilibrios fisiológicos que son de difícil tolerancia: déficit de absorción de las vitaminas liposolubles, flatulencia y esteatorréa. Cualquiera sea el enfoque terapéutico adoptado, todos los tratamientos de la obesidad se caracterizan por una tasa de reincidencia extremadamente importante.

Los mecanismos moleculares responsables por la obesidad en el ser humano son complejos y recurren a factores genéticos y ambientales. Dada la poca eficacia de los tratamientos conocidos actualmente, resulta urgente definir los mecanismos genéticos que determinan la obesidad, de manera de poder desarrollar medicamentos mejor dirigidos.

Se han estudiado más de 20 genes como posibles candidatos, ya sea que hayan sido involucrados en enfermedades en las que la obesidad es una de las manifestaciones clínicas, ya sea que se trate de homólogos de genes que intervienen en la obesidad en los modelos animales. Situado en la región cromosómica 7q31, el gen OB es uno de los más estudiados. Su producto, la leptina, interviene en los mecanismos de la saciedad. La leptina es una proteína plasmática de 16 kDa producida por los adipositos bajo la acción de diferentes estímulos. Los ratones obesos de tipo ob/ob presentan un déficit del gen de la leptina; esta proteína es indetectable en el plasma de estos animales. La administración de leptina obtenida por ingeniera genética a ratones ob/ob corrige la hiperfagia relativa y permite la normalización del peso de estos animales. El efecto anorexígeno de la leptina pone en acción un receptor del sistema nervioso central: el receptor ob que pertenece a la familia de los receptores de las citoquinas de clase 1. El receptor ob es deficiente en los ratones obesos de la raza db/db. La administración de leptina a estos ratones no tiene efecto sobre su ingesta alimenticia y no permite que se produzca una reducción importante del peso de los mismos. Los mecanismos mediante los cuales los receptores ob transmiten la señal de saciedad no se conocen con precisión. Es posible que el neuropéptido Y participe en esta vía de señalización. Es importante precisar en este estadio que los receptores ob no son los únicos reguladores del apetito. También interviene el receptor Melanocortina 4, dado que los ratones en los que este receptor se hace deficiente son obesos (Gura, 1997).

El descubrimiento de la leptina y la caracterización de la leptina a nivel del sistema nervioso central han dado lugar a una nueva vía de investigación de medicamentos contra la obesidad. Sin embargo, este modelo rápidamente defraudó las expectativas. Efectivamente, con una sola excepción (Montague et al., 1997) los genes que codifican la leptina o su receptor ob resultaron normales en los individuos humanos obesos. Además, paradójicamente, las concentraciones plasmáticas de leptina, hormona de saciedad, son anormalmente elevadas en la mayoría de los individuos humanos obesos. La parte esencial de los esfuerzos de investigación terapéutica en este sentido se refirió a la caracterización del efecto de la leptina a nivel del sistema nervioso central.

Resumen de la invención

La presente invención resulta de una focalización del esfuerzo de investigación sobre el descubrimiento de mecanismos de eliminación de la leptina. La hipótesis de trabajo más generalmente admitida es que las tasas plasmáticas son elevadas en los individuos obesos porque esta hormona se produce en el tejido adiposo y la masa grasa registra un aumento en los individuos obesos. Los inventores formularon una hipótesis diferente y postularon que las concentraciones de leptina se incrementan en los individuos obesos porque el aclaramiento de esta hormona es reducido. Este déficit da lugar a un síndrome de resistencia a la leptina y el individuo obeso desarrolla una respuesta adaptada a las concentraciones elevadas de leptina. Desde esta perspectiva, el tratamiento de los individuos obesos debería consistir no en un aumento de las tasas de leptina, sino en una normalización de las mismas. En este estadio, resulta esencial recordar que los receptores de tipo ob son receptores de este tipo de señalización. Estos receptores pueden fijar la leptina a nivel de la membrana plásmica pero no pueden hacer que la proteína ingrese en el interior de la célula para su posterior degradación. Los receptores ob no son receptores de endocitosis.

Receptor LSR

Los inventores han caracterizado un receptor, principalmente hepático, llamado receptor LSR, cuya actividad es doble. Por una parte, el receptor LSR permite la endocitosis de lipoproteínas, cuando se lo activa mediante ácidos grasos libres, sirviendo de este modo como vía de aclaración de las lipoproteínas. Esta vía sirve principalmente, pero de manera exclusiva, para el aclaramiento de las partículas ricas en triglicéridos de origen intestinal (Mann et al., 1995). Esta actividad, expresada más particularmente a nivel hepático, depende de la presencia de ácidos grasos libres que, al fijarse al receptor, inducen un cambio reversible de la conformación de este complejo y le permiten fijar con una alta afinidad diferentes clases de lipoproteínas, como las que contienen apoproteína B o apoproteína E.

Por otra parte, en condiciones normales, en ausencia de ácidos grasos libres, el receptor complejo LSR no fija las lipoproteínas, pero es capaz de fijar una citoquina, en particular la leptina, para luego internalizarla y degradarla.

Deberá entenderse que la invención no se refiere a los receptores LSR en forma natural, es decir que no se los toma en su entorno natural, sino que se los obtiene mediante purificación a partir de fuentes naturales, o se los obtiene por redominación genética, o por síntesis química pudiendo entonces incluir aminoácidos no naturales, como se describirá en la presente. La producción de un receptor LSR recombinante, que puede realizarse utilizando una de las secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención, es particularmente ventajosa porque permite obtener un nivel de pureza incrementada del receptor.

Más particularmente, la invención se refiere a un receptor LSR de rata purificada, caracterizado porque comprende al menos una subunidad que tiene un peso molecular de aproximadamente 66 kDa y una subunidad que tiene un peso molecular de aproximadamente 58 kDa.

El receptor LSR de rata purificada de la presente invención se caracteriza porque contiene una subunidad \alpha que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 2 o una secuencia homóloga de la misma o una subunidad \alpha' que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID 4 o una secuencia homóloga a la misma, y una, preferentemente tres, subunidades \beta que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 6 o una secuencia homóloga a la misma.

La invención se refiere asimismo a un receptor LSR de ratón purificado, caracterizado porque comprende al menos una subunidad que tiene un peso molecular de aproximadamente 66 kDa y una subunidad que tiene al menos un peso molecular de aproximadamente 58 kDa.

El receptor LSR de ratón purificado de la presente invención se caracteriza porque contiene una subunidad \alpha que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 16 o una secuencia homóloga de la misma o una subunidad \alpha' que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID 17 o una secuencia homóloga a la misma y una, preferentemente tres, subunidades \beta que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID o una secuencia homóloga de la misma.

La invención se refiere asimismo a un receptor LSR humano purificado, caracterizado porque comprende al menos una subunidad que tiene un peso molecular de aproximadamente 72 kDa y una subunidad que tiene un peso molecular de aproximadamente 64 kDa.

El receptor LSR humano purificado de la presente invención se caracteriza porque contiene una subunidad \alpha que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 8 o una secuencia homóloga de la misma o una subunidad \alpha' que comprende la secuencia de ácidos aminos SEQ ID 10 o una secuencia homóloga de la misma y una, preferentemente tres, subunidades \beta que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 12 o una secuencia homóloga de la misma.

Una realización particularmente preferida de los receptores LSR de la presente invención es un receptor LSR recombinante obtenido por la expresión en un receptor recombinante de una o más de las secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención. Este receptor recombinante preferido está constituido por una subunidad \alpha o \alpha' y de una, preferentemente tres, subunidades \beta, principalmente una subunidad \alpha o \alpha' y tres subunidades \beta de un receptor LSR humano.

Secuencias polipeptídicas de LSR

La invención se refiere a polipéptidos, caracterizados porque son un constituyente de un receptor LSR de acuerdo con la invención.

Deberá entenderse que la invención no se refiere a los polipéptidos en forma natural, es decir que no se los toma en su entorno. Efectivamente, la invención se refiere a los péptidos obtenidos mediante purificación a partir de fuentes naturales, u obtenidos mediante recombinación genética, o incluso por síntesis química pudiendo entonces incluir aminoácidos no naturales, como se describirá a continuación. La producción de un polipéptido recombinante, que puede llevarse a cabo utilizando una de las secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención o un fragmento de una de dichas secuencias, puede resultar particularmente ventajosa porque permite obtener un nivel de pureza incrementado del polipéptido deseado.

La invención se refiere entonces a un polipéptido purificado, aislado o recombinante, que comprende una secuencia de al menos 5, preferentemente al menos 10 a 15 aminoácidos consecutivos de un receptor LSR, al igual que homólogos, equivalentes o variantes de dicho polipéptido, o uno de sus fragmentos. Preferentemente, la secuencia de al menos 10 a 15 aminoácidos del receptor LSR es un fragmento biológicamente activo de un receptor LSR.

Más particularmente, la invención se refiere a polipéptidos purificados, aislados o recombinantes, que comprenden una secuencia de al menos 10 a 15 aminoácidos de un receptor LSR de rata, de un receptor LSR de ratón o de un receptor LSR humano.

En la presente descripción, se utilizará el término polipéptido para designar asimismo una proteína o un péptido.

Secuencias nucleotídicas de LSR

La presente invención tiene asimismo por objeto secuencias de ácido nucleico purificadas, caracterizadas porque codifican mediante un receptor LSR o un polipéptido de acuerdo con la invención.

La invención se refiere a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque comprende al menos 8, preferentemente al menos 10 y más particularmente al menos 15 nucleótidos consecutivos del polinicleótido de una secuencia nucleica de un receptor LSR de ratón o de un receptor LSR humano.

La invención se refiere asimismo a secuencias nucleicas variantes, mutadas, equivalentes u homólogas de las secuencias nucleicas de acuerdo con la invención, o uno de sus fragmentos. Se refiere finalmente a las secuencias capaces de hibridarse específicamente con las secuencias nucleicas de acuerdo con la invención.

La invención se refiere asimismo a las secuencias de ácidos nucleicos contenidas en el gen que codifica para el receptor LSR, principalmente cada uno de los exones de dicho gen o una combinación de exones de dicho gen, o incluso un polinucleótido que se extiende sobre una porción de uno o más exones. Preferentemente, estos ácidos nucleicos codifican uno o más fragmentos biológicamente activos del receptor LSR humano.

La presente invención se refiere asimismo a las secuencias de ácidos nucleicos purificadas que codifican uno o más elementos de regulación de la expresión del gen LSR. Están asimismo comprendidas en la invención, las secuencias de ácido nucleico de promotor y/o de regulador de gen codificante para el receptor de acuerdo con la invención, o una o más de sus variantes alélicas, las secuencias mutadas, equivalentes u homólogas, o uno de sus fragmentos.

La invención se refiere asimismo a secuencias nucleicas de hibridación purificadas que comprenden al menos 8 nucleótidos, caracterizadas en que pueden hibridarse específicamente con una secuencia nucleica de acuerdo con la invención.

Preferentemente, fragmentos de ácidos nucleicos o de oligonucleótidos, que tengan como secuencias las secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención, podrán utilizarse como sondas o cebadores.

La invención comprende asimismo métodos para la selección de bancos de ADNc y ADN genómico, para la clonación de ADNc aislados, y/o de genes que codifican el receptor de acuerdo con la invención, y para sus promotores y/o reguladores, caracterizados porque hacen uso de una secuencia nucleica de acuerdo con la invención.

Las secuencias nucleicas caracterizadas porque son susceptibles de obtenerse mediante uno de los métodos anteriores de acuerdo con la invención, o las secuencias capaces de hibridarse con dichas secuencias, forman parte de la invención.

Vectores, células receptoras y animales transgénicos

La invención comprende asimismo los vectores de clonación y/o expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Los vectores de acuerdo con la invención, caracterizados porque incluyen los elementos que permiten la expresión y/o la secreción de dichas secuencias en la célula receptora, forman asimismo parte de la invención.

La invención comprende además las células receptoras, principalmente las células eucariotas y procariotas, transformadas por los vectores de acuerdo con la invención, así como los mamíferos, a excepción del humano, que comprenden una de dichas células transformadas de acuerdo con la invención.

Entre los mamíferos de la invención, se prefieren los animales como los ratones, ratas o conejos, que expresan un polipéptido de acuerdo con la invención, correspondiendo el fenotipo al receptor LSR normal o variante, principalmente mutado de origen animal.

Estas células y animales son utilizables en un método de producción de un polipéptido recombinante de acuerdo con la invención y pueden asimismo servir como modelo de análisis y de selección.

La invención se refiere asimismo a la utilización de células, de mamífero o de polipéptido de acuerdo con la invención, para el estudio de la expresión y la actividad del receptor de acuerdo con la invención, y de las interacciones directas o indirectas entre dicho receptor y los compuestos químicos o bioquímicos que pueden participar en la actividad de dicho receptor.

La invención se refiere asimismo a la utilización de células, de mamífero o de polipéptido de acuerdo con la invención para la selección de compuesto químico o bioquímico que puede interactuar directa o indirectamente con el receptor de acuerdo con la invención, y/o es capaz de modular la expresión o actividad de dicho receptor.

Producción de polipéptidos producidos por el receptor LSR

La invención se refiere asimismo a la síntesis de polipéptidos sintéticos o recombinantes de la invención, principalmente mediante síntesis química o utilización de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química y que pueden incluir aminoácidos no naturales correspondientes a dichos polipéptidos recombinantes, están asimismo comprendidos en la invención.

El método de producción de un polipéptido de la invención en forma recombinante está comprendido en sí mismo en la presente invención, y se caracteriza porque se cultivan las células transformadas en las condiciones que permiten la expresión de un polipéptido recombinante de secuencia polipeptídica de acuerdo con la invención, y porque se recupera dicho polipéptido recombinante.

Los polipéptidos recombinantes, caracterizados porque son susceptibles de obtenerse mediante dicho método de producción, forman también parte de la invención.

Anticuerpos

Los anticuerpos mono o policlonales o sus fragmentos, anticuerpos quiméricos o inmunoconjugados, caracterizados porque son capaces de reconocer específicamente un polipéptido o un receptor de acuerdo con la invención, forman parte de la invención.

Se notará principalmente el interés de anticuerpos que reconocen de manera específica ciertos polipéptidos, variantes, o fragmentos, principalmente biológicamente activos, de acuerdo con la invención.

La invención comprende además polipéptidos purificados, caracterizados porque se obtienen mediante un método de acuerdo con la invención.

Por otra parte, además de su utilización para la purificación de los polipéptidos, los anticuerpos de la invención, en particular los anticuerpos monoclonales, puede también utilizarse para la detección de estos polipéptidos en una muestra biológica.

Más generalmente, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse ventajosamente en cualquier situación en la que la expresión, normal o anormal, de un polipéptido de receptor LSR, normal o mutado, deba observarse.

Detección de variabilidad alélica y diagnóstico

Forman asimismo parte de la invención los métodos de determinación de una variedad alélica, una mutación, una pérdida de heterocigotia o de una anomalía genética, caracterizadas porque ponen en marcha una secuencia de ácido nucleico o un anticuerpo de acuerdo con la invención. Estos métodos apuntan por ejemplo a los métodos de diagnóstico de predisposición a la obesidad, los riesgos asociados, o a las patologías asociadas con anomalías del metabolismo de las citoquinas, determinando a partir de un relevamiento biológico del paciente la presencia de mutaciones en al menos una de las secuencias descritas anteriormente. Las secuencias de ácidos nucleicos analizadas podrán asimismo ser de ADN genómico, de ADNc o de ARNm.

Podrán asimismo utilizarse ácidos nucleicos o anticuerpos basados en la presente invención para hacer posible un diagnóstico positivo y diferencial en un enfermo tomado aisladamente, o un diagnóstico presintomático en un individuo de riesgo, principalmente con antecedentes familiares.

Por otra parte, el evidenciamiento de una mutación específica puede hacer posible un diagnóstico evolutivo, principalmente en referencia a la intensidad de la patología o a la época probable de su aparición.

Selección de los compuestos de interés

Están asimismo incluidos en la invención los métodos de selección de compuestos químicos o bioquímicos capaces de interactuar directa o indirectamente con el receptor o las secuencias polipeptídicas o nucleotídicas de acuerdo con la invención, y/o que permiten modular la expresión o la actividad del receptor LSR.

La invención se refiere principalmente a un método de selección de compuestos químicos o bioquímicos capaces de interactuar con una secuencia de ácidos nucleicos comprendida en un gen codificante para un receptor LSR, caracterizándose dicho método porque comprende poner en contacto una célula receptora que expresa un receptor LSR o un fragmento de dicho receptor con un compuesto candidato susceptible de modificar la expresión o la regulación de la expresión de dicha secuencia nucleica y, la detección directa o indirecta de una modificación de la expresión del receptor LSR.

La invención se refiere también a un método de selección de compuestos químicos o bioquímicos capaces de interactuar con el receptor LSR, caracterizándose dicho método porque comprende poner en contacto un receptor LSR o de un fragmento de dicho receptor, o de una célula receptora que expresa un receptor LSR o un fragmento de dicho receptor, con un compuesto candidato susceptible de modificar la actividad LSR, y, la detección directa o indirecta de una modificación de la actividad del receptor LSR o de la formación de un complejo entre el compuesto candidato y dicho receptor LSR o dicho polipéptido.

La invención comprende los compuestos capaces de interactuar directa o indirectamente con un receptor LSR así como los compuestos susceptibles de interactuar con una o más secuencias nucleicas del receptor LSR. Comprende asimismo los compuestos químicos o bioquímicos que permiten modular la expresión o la actividad del receptor de acuerdo con la invención. Los compuestos, caracterizados porque han sido seleccionados por uno de los métodos de acuerdo con la presente invención, forman asimismo parte de la invención.

En particular, entre los compuestos de la invención, se prefieren los anticuerpos de acuerdo con la invención, los polipéptidos de acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos, oligonucleótidos y vectores de acuerdo con la invención, o una leptina o uno de sus componentes derivados, preferentemente una de sus variantes proteicas, o de las leptinas modificadas químicamente u obtenidas mediante recombinación genética, o la proteína gC1qR o uno de sus análogos, o uno de sus fragmentos.

La invención incluye finalmente composiciones capaces de modular la expresión o la actividad del receptor de acuerdo con la invención, a modo de medicamento para la prevención de patologías y/o patogenias como la obesidad y la anorexia, las hiperlipidemias, la aterosclerosis, la diabetes, la hipertensión y más generalmente las diversas patologías asociadas con anomalías del metabolismo de las citoquinas.

Descripción detallada El receptor LSR

La invención se refiere a un receptor LSR ("Lipolysis Stimulated Receptor") purificado, preferentemente hepático, constituido por al menos una subunidad \alpha o \alpha' y al menos una subunidad \beta. La subunidad \alpha tiene un peso molecular de aproximadamente 66 kDa en la rata y el ratón y de aproximadamente 72 kDa en el hombre. La subunidad \alpha' tiene un peso molecular de aproximadamente 64 kDa en la rata y el ratón y de aproximadamente 70 kDa en el hombre. La subunidad \beta tiene un peso molecular de aproximadamente 58 kDa en la rata y en el ratón y de aproximadamente 64 kDa en el hombre.

Los inventores han formulado una hipótesis según la cual la forma más abundante y seguramente más activa del receptor LSR es aquella en la que se encuentra una subunidad \alpha o \alpha' o al menos tres subunidades \beta. Sin embargo, parece posible que las subunidades \alpha y \alpha' por una parte, y \beta por otra parte tengan funciones biológicas distintas y que dichas funciones puedan ejecutarse en una célula, independientemente de su disposición en forma de receptor.

Los inventores han observado asimismo que puede formarse un complejo entre el receptor LSR y el receptor gC1qR de un peso molecular de aproximadamente 33 kDa, o una proteína homóloga. El receptor gC1qR parece estar asociado de manera temporal con el receptor LSR y la presencia de la proteína C1q o de proteínas homólogas permite no solo disociar a gC1qR del receptor LSR sino además activar el receptor LSR, comprendida la ausencia de ácidos grasos.

Actividad del receptor LSR y aplicaciones

La presente invención se refiere por lo tanto a un receptor, en particular de célula hepática, caracterizado porque es capaz, en presencia de ácidos grasos libres, de fijar lipoproteínas, y en ausencia de ácidos grasos libres, de fijar una citoquina, preferentemente la leptina, incorporándose las lipoproteínas y la citoquina fijadas para luego ser degradadas por la célula, pudiendo dicho receptor además fijar la proteína gC1qR o una de las proteínas análogas.

Aclaramiento de las lipoproteínas

El receptor LSR representa la vía principal de la eliminación de las lipoproteínas de origen intestinal y de las partículas ricas en triglicéridos, principalmente las VLDL y los quilomicrones. El receptor LSR puede también servir de vía de eliminación de las LDL, partículas ricas en colesterol, que mayormente se depuran por la vía de la LDL receptora, pero aproximadamente 30% de las cuales se eliminan a nivel hepático por vías diferentes a la LDL receptora.

Los inventores han en realidad demostrado que el receptor LSR es capaz de fijar las lipoproteínas, principalmente las lipoproteínas ricas en triglicéridos, para luego internalizarlas y degradarlas. Esta actividad de aclaramiento de las lipoproteínas mediante el receptor requiere la presencia de ácidos grasos libres, por ejemplo el oleato, y se inhibe en presencia de anticuerpos dirigidos contra el LSR o contra péptidos que surgen de LSR.

Aclaramiento de las citoquinas

Los inventores han demostrado asimismo que en ausencia de ácido graso libre, por ejemplo el oleato, el receptor LSR es capaz de fijar citoquinas, preferentemente la leptina. Sin embargo, la función de aclaramiento de la leptina es solamente posible si el receptor no ha fijado ácidos grasos producidos por la lipasa hepática o por la lipasa hormono-sensible del tejido adiposo. Una vez fijadas las citoquinas, el receptor LSR las internaliza y las degrada. Esta actividad de degradación de las citoquinas, preferentemente de la leptina, se inhibe mediante anticuerpos dirigidos contra LSR o contra péptidos que surgen de LSR.

Los inventores han demostrado que la subunidad \alpha del receptor LSR es la más particularmente involucrada en la fijación de las citoquinas y preferentemente de la leptina. Además, los inventores han demostrado haciendo uso de ratones que, in vivo, los receptores LSR realizan la captación hepática de citoquinas, preferentemente de la leptina.

Las tasas elevadas de leptina en los humanos obesos pueden explicarse mediante varios mecanismos moleculares que son susceptibles de disminuir el aclaramiento hepático de la leptina, siendo principalmente:

a) una alteración de uno o más genes del LSR, y/o de su o sus promotores;

b) una facilitación, mediante modificaciones post-transcripcionales, de la reorganización alostérica que permite el paso de la conformación citoquina-competente a la conformación de receptor de las lipoproteínas;

c) un déficit de transporte de vesículas que contienen LSR desde o hacia la membrana plásmica (esta función depende de la integridad del citoesqueleto);

d) un aumento de la degradación de LSR;

e) un aumento de la ración calórica lipídica que, desviando al receptor hacia el aclaramiento de las lipoproteínas, reduce en parte su capacidad de reducir la leptina.

Control de la actividad LSR por las citoquinas

Finalmente, los inventores han demostrado que las citoquinas, preferentemente la leptina, modulan la actividad del receptor LSR en presencia de ácido graso libre. Más particularmente, las citoquinas aumentan la actividad de aclaramiento de las lipoproteínas del receptor LSR y más precisamente, la fijación, internalización y degradación de las VLDL y LDL. Este aumento de la actividad LSR podría ser el resultado del aumento del número aparente de receptor LSR en la superficie de las células luego de un aumento de la síntesis proteica y de una movilización de las vesículas de endocitosis. Además, los inventores han demostrado haciendo uso de ratones que, in vivo, las citoquinas, preferentemente la leptina, son capaces de disminuir la respuesta lipémica postprandial.

La leptina y seguramente otras citoquinas son entonces reguladores de la actividad del LSR. Un síndrome de resistencia a la leptina, o a otras citoquinas, puede ocasionar una hipertrigliceridemia, que puede ser permanente o estar limitada a la fase postprandial.

Tratamientos de la obesidad

El papel desempeñado por el LSR en el aclaramiento de la leptina permite formular un modelo fisiopatológico que impone una revisión de las estrategias utilizadas para tratar la obesidad. Efectivamente, resulta esencial reducir las concentraciones de leptina en los individuos humanos obesos, con el fin de restaurar las fluctuaciones fisiológicas de esta hormona.

Por este motivo es posible encarar la utilización de los compuestos para el tratamiento de la obesidad que permitan la modulación del número de receptores LSR, su velocidad de reciclaje o el cambio de su conformación, y/o que permitan principalmente:

1. controlar la leptinemia, y por ende las sensaciones de saciedad y hambre;

2. recuperar concentraciones de leptina normales y permitir la regulación normal del comportamiento alimenticio mediante la percepción normal de las sensaciones de hambre y saciedad:

3. controlar la trigliceridemia;

4. regular las concentraciones plasmáticas de residuos de quilomicrones, partículas muy aterógenas.

El papel que desempeña el receptor LSR en el aclaramiento hepático de las lipoproteínas de origen intestinal permite encarar la utilización de compuestos capaces de modular la expresión y/o la actividad del LSR con el fin de modular la repartición de los lípidos de origen alimenticio entre los tejidos periféricos, principalmente los tejidos adiposos y el hígado. Un tratamiento de la obesidad consistirá en favorecer la degradación hepática de las lipoproteínas, y de este modo disminuir su almacenamiento en el tejido adiposo y regular sus concentraciones plasmáticas. Este último efecto permite encarar la utilización de dichos compuestos con el fin de reducir los riesgos asociados con la obesidad, principalmente los riesgos aterógenos.

Tratamientos de la anorexia y la caquexia

Es posible encarar la utilización de los métodos de regulación de las actividades del LSR para establecer tratamientos que permitan vencer el círculo vicioso que caracteriza a la anorexia nerviosa. Reduciendo el número de receptores, debería favorecerse el aumento de peso en individuos anoréxicos o desnutridos.

En estas condiciones, resulta interesante inhibir selectivamente el aclaramiento de la leptina utilizando péptidos sintéticos o moléculas farmacológicas que, o bien disminuyen la síntesis del LSR, o bloquean su capacidad de fijar la leptina y/o las lipoproteínas, o aumentan el catabolismo del receptor.

Tratamientos de las anomalías del metabolismo de las citoquinas

El análisis de la estructura primaria de la subunidad á del LSR, tal como se describe más adelante, evidencia un sitio homólogo a los sitios de fijación de las citoquinas presentes en sus receptores, así como dos señales de direccionamiento que permiten la endocitosis y la rápida degradación de los ligandos en los lipozomas. Esta observación es original en que los receptores de las citoquinas no permiten la internalización y la degradación de los ligandos. Estos receptores se han caracterizado en base a su propiedad de señalización intracelular.

De este modo, además de presentar la propiedad de permitir la degradación proteolítica de las lipoproteínas y la leptina, es altamente probable que el receptor LSR realice también la degradación de otras citoquinas. Esta función podrá estudiarse gracias a los anticuerpos anti-LSR y a las células CHO transfectadas que expresan la subunidad \alpha del LSR como las descritas en el ejemplo 4. La participación del LSR en el aclaramiento de las citoquinas es esencial porque las moléculas desempeñan un papel importante en la regulación del metabolismo de los lípidos, del metabolismo de la glucosa y en la regulación de la ingesta alimenticia y el aumento de peso.

Los mecanismos moleculares mediante los cuales las citoquinas modulan las funciones fisiológicas que participan en la obesidad y sus complicaciones son de carácter variado y complejo. Sin embargo, se pondrá el énfasis en el hecho de que las anomalías del metabolismo de las citoquinas están asociadas con la hipertrigliceridemia que a menudo acompaña a las infecciones virales, bacterianas o protozoarias. Además, las citoquinas y más particularmente el Tumor Necrosis Factor (TNF) [factor de necrosis tumoral], inducen una hipertrigliceridemia transitoria similar a la observada en ciertas formas de diabetes asociadas a la obesidad.

La reducción del número de receptores LSR expresados a nivel del hígado podría explicar un déficit de la eliminación de ciertas citoquinas, ocasionando este déficit trastornos metabólicos como los que se constatan en la obesidad. La utilización de células hepáticas en cultivo, y de los diferentes modelos de animales obesos citados anteriormente, permitirá determinar, entre todas las citoquinas y más particularmente las que inducen una pérdida de peso (IL-6, LIF, OSM, CNTF, IL-11, IL-12\alpha, al igual que TNF\alpha y TNF\beta), que modulan la expresión y/o la actividad del LSR. La determinación de dichas citoquinas puede por ejemplo conducirse utilizando métodos como los presentados en los Ejemplos 4 a 6.

Finalmente, el análisis de la estructura primaria del LSR \alpha evidencia sitios potenciales de fosforilación. Esto abre la perspectiva de una regulación de la actividad celular a través del receptor LSR. Un ejemplo particularmente importante sería la implicación del LSR en la regulación de la producción de "Proteínas de Fase Aguda", bajo el impulso de diferentes estímulos, entre los que se cuentan las citoquinas.

La participación del LSR en el aclaramiento y la degradación de las citoquinas podría además no estar limitada al hígado. Efectivamente, a pesar de que se ha demostrado que la expresión del LSR es predominantemente hepática, es asimismo seguro que la expresión de este receptor no se limita a dicho órgano. Un análisis preliminar en Northern blot en diferentes tejidos humanos logró determinar, además de los productos hepáticos, productos de expresión a nivel del riñón y el testículo. Un análisis más completo permitirá determinar los diferentes tejidos que expresan el LSR en el ser humano. Desde esta perspectiva, el LSR podría intervenir en la degradación de citoquinas no solamente a nivel hepático, sino también a nivel de los tejidos periféricos. Un déficit de esta actividad podría estar involucrado en la patogenia de enfermedades autoinmunes, esclerosis en placas y artritis reumatoide. Frecuentemente, se encuentra una acumulación de citoquinas en la patogenia de estas enfermedades.

Secuencias polipeptídicas del receptor LSR

La invención se refiere a polipéptidos, caracterizados porque son un constituyente de un receptor LSR de acuerdo con la invención. La invención se refiere más particularmente a los polipéptidos caracterizados porque constituyen subunidades \alpha, \alpha' o \beta del receptor LSR.

La invención se refiere más particularmente a un polipéptido purificado, aislado o recombinante, que comprende una secuencia de al menos 5, preferentemente al menos 10 a 15 aminoácidos consecutivos de un receptor LSR, así como los homólogos, equivalentes o variantes de dicho polipéptido o de uno de sus fragmentos. Preferentemente, la secuencia de al menos 10 a 15 aminoácidos del receptor LSE es un fragmento biológicamente activo de un receptor LSR.

De manera preferida, la invención se refiere a polipéptidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de al menos 10 a 15 aminoácidos de un receptor LSR de rata, un receptor LSR de ratón o un receptor LSR humano.

En una primera realización preferida de la invención, el polipéptido se caracteriza porque comprende una secuencia de al menos 10 a 15 aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de SEQ ID 2, SEQ ID 4 y SEQ ID 6, así como las variantes, equivalentes u homólogos de este polipéptido o un fragmento de los mismos. Preferentemente, el polipéptido es un homólogo o un fragmento biológicamente activo de una de las secuencias mencionadas anteriormente.

En una segunda realización preferida de la presente invención, el polipéptido se caracteriza porque comprende una secuencia de al menos 10 a 15 aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de SEQ ID 16, SEQ ID 17 y SEQ ID 18, así como las variantes, equivalentes u homólogos de este polipéptido o un fragmento de los mismos. Preferentemente, el polipéptido es un homólogo o un fragmento biológicamente activo de una de las secuencias mencionadas anteriormente.

En una tercera realización preferida de la presente invención, el polipéptido se caracteriza porque comprende una secuencia de al menos 10 a 15 aminoácidos consecutivos de una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias de SEQ ID 8, SEQ ID 10 y SEQ ID 12, así como las variantes, equivalentes u homólogos de este polipéptido o un fragmento de los mismos. Preferentemente, el polipéptido es un homólogo o un fragmento biológicamente activo de una de las secuencias mencionadas anteriormente.

Entre los polipéptidos preferidos de la invención, se notará principalmente a los polipéptidos de secuencia humana SEQ ID 8, SEQ ID 10 o SEQ ID 12, así como los de secuencia de rata SEQ ID 2, SEQ ID 4 o SEQ ID 6, o aquellos de secuencia de ratón SEQ ID 16, SEQ ID 17 y SEQ ID 18. Los fragmentos correspondientes a los dominios representados en las figuras 1 a 6, cuyas posiciones son las secuencias correspondientes a las SEQ ID 2, 8 ó 16 se indican en las tablas 1, 3 y 4.

Finalmente, la invención se refiere asimismo a los polipéptidos SEQ ID 29 y SEQ ID 30.

La presente invención se refiere asimismo a los polipéptidos que incluyen a los polipéptidos descriptos anteriormente, así como a sus polipéptidos homólogos, equivalentes o variantes, al igual que los fragmentos, de preferencia biológicamente activos, de dichos polipéptidos.

Entre los polipéptidos de acuerdo con la invención, se prefieren asimismo los polipéptidos que incluyen o están constituidos por una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos definida anteriormente, caracterizada en que son un constituyente del receptor de acuerdo con la invención.

Análisis de las secuencias polipeptídicas de las subunidades \alpha, \alpha' y \beta del receptor LSR

El análisis sistemático de los productos de los 3 ADNc de rata descritos en la presente solicitud aparece representado esquemáticamente en la Figura 1. La subunidad \alpha del receptor LSR de rata, proteína codificada por el ADNc de mayor tamaño (LSR-Rn-2097), presenta las siguientes características.

Se hallaron sitios potenciales de glicosilación en las posiciones 12-14 y 577-579. Un sitio potencial de enlace de los glicosaminoglicanos se encuentra en la posición 14-17.

Se localizaron varios sitios de fosforilación a nivel del extremo NH_{2} terminal (en las posiciones 193-196, 597-600, 169-171, 172-174, 401-403, 424-426, 464-466, 467-469, 185-186, 222-225, 436-439, 396-399, 504-507, 530-533, 624-627, 608-615), sugiriendo que está orientado hacia la región celular.

Por otra parte, la proteína presenta, del lado NH_{2} terminal, una secuencia de aminoácidos hidrófobos separada en dos partes por dos aminoácidos que inducen una estructura en forma de broche cuyos brazos estarían constituidos por aminoácidos hidrófobos. Es razonable suponer que esta región representa el sitio de fijación de los ácidos grasos del LSR. La estructura en dedo de guante realizada de esta forma puede acondicionar a una cadena hidrocarbonada alifática. Ambos aminoácidos son, más precisamente en el caso del LSR de rata, dos prolinas, situadas en las posiciones 31 y 33 de la secuencia polipeptídica de la subunidad \alpha.

Siempre del lado NH_{2} terminal, se encuentra una secuencia de consenso de fijación a la clatrina, proteína que recubre la faz interna de los "coated pits" (Chen et al., 1990). Estas regiones específicas de la membrana plásmica permite la endocitosis rápida de las proteínas membranales. Una secuencia de consenso de este tipo se haya a nivel de la LRP-\alpha_{2}-macroglobulina receptor, la CRAM y de la LDL-receptora (Herz et al., 1988; Lee et al., 1990; Goldstein et al., 1995). Una mutación a este nivel tiene como consecuencia un importante retraso de la internalización de las LDL, e induce una hipercolesterolemia familiar (Davis et al., 1986).

El receptor posee entonces una secuencia de aminoácidos hidrófobos que constituye un dominio tansmembrana potencial. El largo de este segmento permite un solo pasaje a través de la doble capa fosfolipídica (Brendel et al., 1992).

Entre esta señal de fijación a la clatrina y la cadena hidrófoba correspondiente al segmento transmembranal único, se encuentran dos fragmentos LI y LL (Letourneur et al., 1992). Ambos fragmentos se encuentran a nivel de las siguientes proteínas: glut 4 transportador de glucosa (Verhey et al., 1994); la cadena invariante y el complejo de histocompatiblidad de clase II (Zhong et al., 1997; Para-Lopez et al., 1997). Las señales controlan la endocitosis y el prefijo postal intracelular de las proteínas en el sistema membranal periférico.

Del lado C-terminal, se encuentra una región rica en cisteína que presenta una homología con los receptores de las citoquinas y más particularmente: los receptores con TNF 1 y 2 (Tumor Necrosis Factor 1 y 2); el receptor con NGF de baja afinidad (Nerve Growth Factor); el receptor soluble con TNF del virus de fibroma de Shope; CD40, CD27 y CD30, receptores para las citoquinas CD40L, CD27L y CD30L; la proteína de célula T 4-1BB, el antígeno FAS (APO1), receptor para la proteína FASL implicada en la apoptosis, el antígeno 0X40 de célula T, receptor para la citoquina 0X40L, y la proteína A53 del virus de la vacuna (Cytokines and their receptors, 1996; Banner et al., 1993).

Además de este segmento rico en cisteína, se encuentra una región de aminoácidos cargados relativamente + y - (Brendel et al., 1992). Esta región proporciona un sitio de fijación potencial para los ligandos apoproteicos Apo B y Apo E.

Esta región contiene además un resto RSRS que se encuentra a nivel de la lamina (Simos et al., 1994) y de SF2' (Krainer et al., 1991).

La forma LSR \alpha' codificada por el ADNc LSR-Rn-2040 posee todos los dominios descritos anteriormente de la secuencia LSR \alpha codificada por el ADNc LSR-Rn-2097, a excepción del elemento LI/LL, cuyo doblete Leucina se encuentra eliminado por corte y empalme alternativo. Si bien poseen secuencias muy cercanas, las subunidades \alpha codificadas por LSR-Rn-2097 y \alpha' codificada por LSR-Rn-2040 podrían entonces diferir en lo que respecta a su velocidad de reciclaje y prefijo postal. La forma \beta codificada por LSR-Rn-1983 no posee dominio transmembranal ni región rica en cisteínas y homologa de los receptores de citoquinas. Sin embargo, posee a nivel de NH_{2}-terminal la región hidrófoba separada por una repetición de prolinas, la región rica en aminoácidos cargados y el fragmento RSR. Este constituyente esta seguramente posicionado enteramente en el exterior de una célula en donde está fijado mediante puentes disulfuros, o bien al producto de LSR-Rn-2040, o al de LSR-Rn-2097.

La tabla 1 que figura a continuación enumera los diferentes dominios o fragmentos descritos más adelante, indica su pertenencia o no a cada una de las subunidades del receptor LSR, así como las posiciones de partida y fin de dichos dominios o fragmentos, o de regiones que portan dichos dominios o fragmentos, como las indicadas en la secuencia de SEC ID 2.

TABLA 1

Dominio o fragmento	Posición sobre SEQ ID 2	Presencia sobre:
	Partida	Fin	A	\alpha'	\beta
Potencial sitio de fijación	23	41	X	X	X
de los ácidos grasos
Potencial sitio de fijación	104	107	X	X	X
a la clatrina
Señal de transporte:
LI	183	184	X	X	X
LL	195	196	X
Dominio transmembrana	204	213	X	X
Potencial sitio receptor de	214	249	X	X
las citoquinas
Resto RSRS	470	473	X	X	X
Potencial sitio de fijación de	544	557	X	X	X
los ligandos lipoproteicos

Comparación de las secuencias polipeptídicas de los receptores LSR de la rata, el ratón y el ser humano

Los largos de las secuencias polipeptídicas, al igual que las SEQ ID de las secuencias respectivas en el listado incluido, de los tres tipos de subunidades de los receptores LSR de acuerdo con la invención en la rata, el ratón y el hombre, se indican en la tabla 2a que figura a continuación.

TABLA 2a

Polipéptido	Rata	Ratón	Ser Humano
Subunidad \alpha	593 aa (SEQ ID 2)	594 aa (SEQ ID 16)	649 aa (SEQ ID 8)
Subunidad \alpha'	574 aa (SEQ ID 4)	575 aa (SEQ ID 17)	630 aa (SEQ ID 10)
Subunidad \beta	525 aa (SEQ ID 6)	526 aa (SEQ ID 18)	581 aa (SEQ ID 12)

Estas secuencias polipeptídicas fueron obtenidas a partir de cada una de las tres secuencias de ADNc correspondientes, en la rata, el ratón y el ser humano, que se describirán de manera más detallada más adelante. La nomenclatura utilizada para designar estas secuencias de ADNc, que refleja su largo en nucleótidos, así como las SEQ ID de sus secuencias respectivas en el listado incluido, se presenta en la tabla 2b que figura a continuación.

TABLA 2b

ADNc	Rata	Ratón	Ser Humano
Subunidad \alpha	LSR-Rn-2097	LSR-Mm-1886	LSR-Hs-2062
	(SEQ ID 1)	(SEQ ID 13)	(SEQ ID 7)
Subunidad \alpha'	LSR-Rn-2040	LSR-Mm-1829	LSR-Hs-2005
	(SEQ ID 3)	(SEQ ID 14)	(SEQ ID 9)
Subunidad \beta	LSR-Rn-1893	LSR-Mm-1782	LSR-Hs-1858
	(SEQ ID 5)	(SEQ ID 15)	(SEQ ID 11)

La secuencia proteica, correspondiente a la subunidad á del receptor LSR, deducida de la secuencia LSR-Hs-2062 tiene un largo de 649 aminoácidos. Está alineada con las secuencias proteicas deducidas de LSR-Mm-1886, de un largo de 594 aminoácidos y de LSR-Rn-2097, de un largo de 593 aminoácidos (Figura 2). La conservación de las secuencias proteicas es muy grande (respectivamente 80,2% y 82,2% de identidad para 591 y 590 aminoácidos superpuestos). Los dominios funcionales determinados en la secuencia proteica del LSR \alpha de rata se encuentran en la secuencia LSR humana, así como en la de LSR \alpha murino (Figura 2).

Las proteínas humanas correspondientes a las formas LSR-Hs-2005 (\alpha') y LSR-Hs-1858 (\beta) tienen un tamaño previsto de 630 y 581 aminoácidos respectivamente. Las proteínas de rata correspondientes a las formas LSR-Rn-2040 (\alpha') y LSR-Rn-1893 (\beta) tienen un tamaño previsto de 575 y 526 aminoácidos respectivamente. El alineamiento de las tres formas humanas (Figura 3), de las tres formas descritas en la rata (Figura 4) y de las tres formas descritas en el ratón (Figura 5), indica que en las tres especies todas las formas proteicas conservan la señal NPGY de fijación a la clatrina y el motivo RSRS. Las formas largas (\alpha) humanas (producto de LSR-Hs-2062), de rata (producto de LSR-Rn-2097) y de ratón (producto de LSR-Mm-1886) presentan el conjunto de características funcionales del LSR. Las tres formas cortas (\beta) (productos específicos de LSR-Hs-1897, LSR-Rn-1893 y LSR-Mm-1682) pierden el dominio dileucina de prefijo postal lisosomal, el dominio transmembranal y la firma del receptor de citoquina. También puede mencionarse que las tres formas intermedias (\alpha') (producto de LSR-Hs-2005, LSR-Rn-2040 y LSR-Mn-1829) pierden el dominio dileucina, conservándose el dominio transmembranal y el dominio correspondiente a la firma del receptor de citoquina (figuras 3, 4 y 5). La figura 6 representa finalmente las proteínas que surgen de tres formas de ADNc que se encuentran en el ser humano, y los fragmentos que porta cada una de ellas como consecuencia del corte y empalme del que surgen.

La tabla 3 que figura a continuación enumera los diferentes dominios o fragmentos descritos anteriormente, así como las posiciones de partida y fin de dichos dominios o fragmentos, o de regiones que portan dichos dominios o fragmentos, como se indican en la secuencia de SEQ ID 16 de ratón.

TABLA 3

Dominio o fragmento	Posición sobre SEQ ID 16	Presencia sobre:
	Partida	Fin	A	\alpha'	\beta
Potencial sitio de fijación	23	41	X	X	X
de los ácidos grasos
Potencial sitio de fijación	104	107	X	X	X
a la clatrina
Señal de transporte:
LI	183	184	X	X	X
LL	195	196	X
Dominio transmembrana	204	213	X	X
Potencial sitio receptor de	214	249	X	X
las citoquinas
Resto RSRS	470	473	X	X	X
Potencial sitio de fijación	544	558	X	X	X
de los ligandos lipoproteicos

La tabla 4 que figura a continuación enumera los diferentes dominios o fragmentos descritos anteriormente, así como las posiciones de partida y fin de dichos dominios o fragmentos, o de regiones que portan dichos dominios o fragmentos, como se indican en la secuencia de SEQ ID 8 humana.

TABLA 4

Dominio o fragmento	Posición sobre SEQ ID 8	Presencia sobre:
	Partida	Fin	A	\alpha'	\beta
Potencial sitio de fijación	76	94	X	X	X
de los ácidos grasos
Potencial sitio de fijación	157	160	X	X	X
a la clatrina
Señal de transporte:
LI	236	237	X	X	X
LL	248	249	X
Dominio transmembrana	257	266	X	X
Potencial sitio receptor de	267	302	X	X
las citoquinas
Resto RSRS	527	530	X	X	X
Potencial sitio de fijación	601	613	X	X	X
de los ligandos lipoproteicos

En conclusión, la similitud de secuencia y estructura de LSR descrita anteriormente permite extrapolar al hombre la observaciones realizadas en la rata y o el ratón.

Por péptido homólogo se designarán los polipéptidos que presentan, con respecto al polipéptido natural, ciertas modificaciones como en particular una deleción, truncamiento, alargue, fusión quimérica y/o mutación, principalmente puntual. Entre los polipéptidos homólogos se prefieren aquellos cuya frecuencia de aminoácidos presenta al menos el 80%, preferentemente el 90%, de identidad con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de acuerdo con la invención.

Por polipéptido equivalente, se designará un polipéptido que tenga al menos una de las actividades del receptor LSR, principalmente la actividad del receptor de lipoproteínas o quilomicrones, la actividad del receptor de citoquina, principalmente de la leptina, o la actividad del receptor de la proteína gC1q-R o una de sus proteínas análogas. Por polipéptido equivalente se designará asimismo a todo polipéptido que resulte del corte y empalme alternativo del la secuencia nucleica genómica codificante para los polipéptidos de acuerdo con la invención.

Se entenderá por polipéptido variante (o variante proteica) al conjunto de polipéptidos mutados que pueden existir, en particular en el ser humano, y que corresponden principalmente a truncamientos, deleciones y/o adiciones de residuos de aminoácidos, sustituciones o mutaciones, principalmente puntuales, así como los polipéptidos variantes artificiales que sin embargo se llamarán polipéptidos variantes. En este caso, los polipéptidos variantes estarán principalmente asociados de manera parcial a la ocurrencia y el desarrollo de obesidad o anorexia. Podrán también asociarse con la ocurrencia y/o desarrollo de los riesgos o complicaciones asociados con la obesidad, principalmente a nivel cardiovascular, y/o de patologías asociadas con anomalías del metabolismo de las citoquinas.

Por fragmento de polipéptido, se entiende un polipéptido o péptido codificado por una secuencia nucleica que incluye al menos 15 nucléotidos o bases, preferentemente 20 bases y 30 bases. Estos fragmentos podrán principalmente incluir una mutación puntual, por comparación con la secuencia de polipéptido normal, o corresponder a secuencia de aminoácidos específicos de polipéptidos variantes, artificiales o existentes en el ser humano, como los vinculados a un polimorfismo vinculado en particular a la obesidad o a las patologías mencionadas anteriormente.

Por fragmento biológicamente activo, se entenderá en particular un fragmento de secuencia de aminoácidos de polipéptidos:

- que presenta al menos una de las actividades del receptor LSR, principalmente la actividad de receptor de lipoproteínas, o de receptor de citoquina, particularmente de leptina y/o de señalización celular, y/o

- capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico de receptor de acuerdo con la invención y/o

\newpage

- capaz de ser reconocido por un compuesto que puede, por ejemplo, neutralizando la fijación de un ligando específico de dicho receptor, modular la actividad del receptor LSR y/o

- capaz de modular el prefijo postal y/o la localización celular del receptor de LSR y/o

- más generalmente que constituye un dominio o fragmento biológicamente activo del receptor LSR.

Entre los fragmentos biológicamente activos preferidos de acuerdo con la invención, se incluyen principalmente:

- los fragmentos que incluyen un sitio de fijación a la clatrina,

- los fragmentos que incluyen un sitio de fijación de ácidos grasos, principalmente un sitio de fijación de los ácidos grasos que incluyen una secuencia de aminoácidos hidrófobos, separada en dos partes por dos prolinas contiguas, que inducen una estructura en broche cuyos brazos están constituidos por aminoácidos hidrófobos,

- los fragmentos que incluyen una región hidrófoba que constituye un dominio transmembrana,

- los fragmentos que incluyen una región capaz de controlar la endocitosis y el corte y empalme intracelular de las proteínas en el sistema membranal periférico, principalmente un fragmento que comprende un sitio que incluye los fragmentos LI y LL,

- los fragmentos que incluyen un sitio de fijación de las citoquinas, principalmente un sitio que comprende una región rica en cisteína,

- los fragmentos que comprenden una región que define un sitio de fijación potencial de ligandos lipoproteicos como ApoB y ApoE, principalmente una región que incluye una secuencia de aminoácidos cargados alternativamente + y -, y

- los fragmentos que incluyen un resto RSRS.

Se encuentra principalmente entre estos fragmentos a los polipétidos como se los define en las tablas 1, 2 y 4, o todos los fragmentos de los nucléotidos de SEQ ID 2, 8 ó 16, que incluyen dichos polipéptidos y todos los fragmentos equivalentes, homólogos o variantes.

Secuencias nucleotídicas del receptor LSR

La presente invención tiene por objeto secuencias de ácido nucleico aisladas, caracterizadas porque codifican un receptor LSR o un polipéptido de acuerdo con la invención.

Más particularmente, la invención se refiere a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque comprende al menos 8, preferentemente 10, y más particularmente al menos 15 nucleótidos consecutivos de polinucleótidos de SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado caracterizado porque comprende al menos 8, preferentemente al menos 10, y particularmente al menos 15, nucleótidos consecutivos del polinucleótido de SEQ ID 41, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado que codifica al receptor LSR humano, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 1898 a 21094, particularmente a los nucleótidos 2001 a 20979, más particularmente a los nucleótidos 2145 a 20979 de SEQ ID 19, así como a las secuencias de ácido nucleico complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a la secuencia de ácidos nucleicos contenidas en el gen que codifica el receptor LSR humano, principalmente cada uno de los exones de dicho gen o una combinación de exones de dicho gen, o incluso un polinucleótido que se extiendo sobre una poción de uno o varios exones. Preferentemente, estos ácidos nucleicos codifican uno o varios fragmentos biológicamente activos del receptor LSR humano.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 1 a 1897 de SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 21095 a 22976 de SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que incluye las secuencias de SEQ ID 7, SEQ ID 9 y SEQ ID 11, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que incluye las secuencias de SEQ ID 1, SEQ ID 3 y SEQ ID 5, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que incluye las secuencias de SEQ ID 13, SEQ ID 14 y SEQ ID 15, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 1898 a 2001 de SEQ ID 19, o de manera preferente a los nucleótidos 1898 a 2144 de la SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque incluye una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 20980 a 21094 de SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarias de este ácido nucleico.

Entre los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, se prefieren los ácidos nucleicos de secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que incluye las secuencias de SEQ ID 7, SEQ ID 9 y SEQ ID 11, las secuencias SEQ ID 1, SEQ ID 3 y SEQ ID 5, así como las secuencias de SEQ ID 13, SEQ ID 14 y SEQ ID 15, al igual que sus secuencias complementarias.

También forman parte de la invención las secuencias variantes, mutadas, equivalentes u homólogas de las secuencias de acuerdo con la invención, así como sus fragmentos y las secuencias nucleicas capaces de hibridarse específicamente con las secuencias de la invención.

Secuencia genómica humana

La invención se refiere entonces a la secuencia genómica del receptor LSR humano, preferentemente la secuencia SEQ ID 19, así como a sus secuencias complementarias, o una de sus variantes alélicas, las secuencias mutadas, equivalentes u homólogas, o uno de sus fragmentos.

El gen del LSR humano (SEQ ID 19) incluye 10 exones repartidos sobre 21094 pb. El tamaño de los exones es respectivamente: 356, 345, 120, 57, 147, 174, 60, 132, 626 y 141 pb (Tabla 5).

TABLA 5

EXON	PARTIDA	FIN	5' EPIS.	BL 5'	3' EPIS	BL 3'
Ex1	1898	2253	- - -	- - -	CTACGG	+2
Ex2	3437	3781	CAG	+1	GTATGT	+1
Ex3	12067	12186	CAG	+2	GTGAGT	+1
Ex4	15047	15103	CAG	+2	GTACGG	+1
Ex5	15668	15814	CAG	+2	GTAAGT	+1
Ex6	19481	19654	CAG	+2	GTGAGG	+1
Ex7	19801	19860	CAG	+2	GTGAGA	+1
Ex8	19958	20089	TAG	+2	GTAAGC	+1
Ex9	20231	20856	CAG	+2	GTGAGG	0
Ex10	20946	21094	CAG	0	- - -

La columna EXÓN indica los exones numerados de 1 a 10 en el orden 5'-3' de su posición sobre la secuencia genómica. Las columnas PARTIDA y FIN indican respectivamente la posición del primer y el último nucleótido del exón considerado. En las columnas 5'EPIS y 3'EPIS se indican las secuencias del sitio de corte y empalme que linda con el exón 5' y 3'. Las columnas BL 5' y BL 3' indican el número de bases respectivamente en 5' y 3' de un exón que solo formarán parte de la fase de lectura del mensajero después del corte y empalme. Por ejemplo, si el exón 7 tiene una base libre en 3', este exón puede unirse al extremo 5' del exón 8 que tiene dos bases libres en 5'. El conjunto 1 base + 2 bases reconstituye el codón que fue destruido por el intron en la secuencia genómica. El exón 7 puede unirse por el extremo 3' con cualquier exón que tenga dos bases libres en 5'; si el nuevo codón creado no corresponde a un codón de parada, la fase abierta de lectura se conserva.

Los exones 1 y 2, al igual que 9 y 10 necesariamente se cortan y empalman conjuntamente, formando de este modo un bloque 5' correspondiente a los exones 1 y 2 y un bloque 3' correspondiente a los exones 9 y 10. El mensajero mínimo funcional, correspondiente al producto de estos cuatro exones, tendría de este modo un tamaño de aproximadamente 1331 pb. Para los demás exones, todas las combinaciones posibles permiten conservar la fase abierta de lectura.

El tamaño de los exones no codificantes en 5' no ha podido ser determinado con precisión. Efectivamente, las secuencias 5'UTR de rata son demasiado divergente con respecto a las del ser humano como para finalizar el análisis de estas secuencias e identificar el extremo real 5' del ADNc de LSR humano. Este puede conducirse gracias al aislamiento de la extremidad 5' de los mensajeros LSR humanos mediante los métodos de captura de extremo 5' desarrollados por los inventores (WO 96/34981). El sitio de poliadenilación descrito a continuación es el único en esta presente antes del gen USF2, situado en 3' del gen LSR humano. Resulta por lo tanto muy probable que la región 3' no traducida de este gen sea muy corta (de un tamaño estimado de aproximadamente 100 pb). Todos los tamaños dados, referentes a las moléculas de ADNc de LSR humano deberán ajustarse en función del tamaño del extremo 5'- no traducido. La secuencia de ADNc humano obtenido teniendo en cuenta el conjunto de los exones deducidos del análisis de la secuencia genómica tiene un tamaño de 2158 pb. Esta forma correspondería a la forma LSR-Rn-2097.

La localización de ciertas señales de expresión de la secuencia nucleotídica de SEQ ID 19 está presente en la tabla 6 que figura a continuación.

TABLA 6

Señal	Partida	Fin
ATG preferido	2145	2147
Otro ATG posible	2001	2003
PARADA	20977	20979
POLI Ad	21065	21070

En la columna Señal se describen los elementos característicos de la molécula de ARN mensajero: Iniciación de la traducción (ATG), fin de la traducción (PARADA) y señal de poliadenilación (POLI Ad). Las columnas Partida y Fin indican la posición en el nucléotido de partida y fin de estas señales sobre la secuencia genómica SEQ ID 19. Una señal ATG de inicio de la traducción se prefiere a la otra porque esta presenta un entorno más propicio al inicio.

La presente invención se refiere asimismo a las secuencias de ácidos nucleicos purificados que codifican uno o más elementos de regulación de la expresión del gen LSR humano. También están incluidas en la invención las secuencias de ácido nucleico de promotor y/o de regulador del gen codificante para el receptor de acuerdo con la invención o una de sus variantes alélicas, las secuencias mutadas, equivalentes u homólogas, o uno de sus fragmentos.

La invención se refiere más particularmente a un ácido nucleico purificado situado en 5' de la secuencia codificante del gen LSR. Este ácido nucleico se caracteriza porque comprende una secuencia nucleotídica de ácidos nucleicos complementarios de este ácido nucleico. Fragmentos más cortos de este ácido nucleico pueden asimismo utilizarse a modo de promotores de expresión del gen LSR o de cualquier otra secuencia que codifique un polipéptido heterólogo.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado situado en 3' de la secuencia transcrita del gen LSR. Este ácido nucleico se caracteriza porque comprende una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 21095 a 22976 de SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarios de este ácido nucleico. Pueden asimismo utilizarse fragmentos más cortos de este ácido nucleico a modo de reguladores de expresión de genes.

Finalmente, la invención se refiere también a la secuencia genómica del receptor LSR humano, preferentemente la secuencia de SEQ ID 41, así como a sus secuencias complementarias, o una de sus variantes alélicas, las secuencias mutadas, equivalentes u homólogas, o uno de sus fragmentos.

Comparación de las organizaciones genómicas en el ser humano, la rata y el ratón

Es interesante notar que una sintenia (conservación de la organización de ciertas regiones cromosómicas entre especies) entre la región del cromosoma 7 del ratón en donde está localizado el gen de Lisch7, de proximidad inmediata con respecto a USF2, y la región 19q13 del cromosoma 19 humano, que incluye el LSR, aparece bien descrita. La organización de ambos genes Lisch7/LSR y USF2 se conserva entre especies. Asimismo, con una localización más centromérica con respecto a estos genes, Apo E se halla tanto en el ratón como en el hombre. Es de notar que el receptor de las lipoproteínas LSR y uno de sus ligando ApoE estén localizados en una misma región cromosómica. Efectivamente, resulta frecuente que el receptor y el ligando a menudo se regulen conjuntamente. Una situación de este tipo permitiría considerar que fenómenos observados en el ratón pueden ser transferibles al ser humano.

Secuencias de ADNc humanas, de rata y de ratón

La invención se refiere además a 3 ADNc diferentes que surgen del gen del receptor LSR por corte y empalme alternativo. Estos 3 ADNc han sido identificados en el ser humano, la rata y el ratón (Tabla 2b). Codifican los tres tipos de subunidades del receptor LSR, \alpha (larga), \alpha' (intermedia) y \beta (corta). El ADNc más largo contiene la totalidad de los 10 exones del gen. El ADNc intermedio no incluye al exón 4. Finalmente, el ADNc más corto no contiene a los exones 4 y 5.

La secuencia nucleotídica de ADNc LSR-Hs-2062 humana, que codifica la subunidad \alpha del receptor LSR, y la secuencia nucleotídica de ADNc LSR-Rn-2097 de rata son idénticas en un 78,6% sobre 1.955 pb superpuestas. Estas cifras ascienden respectivamente al 78% y 1.851 pb cuando la secuencia de LSR-Mm-1886 murino (forma larga) está alineada con la secuencia humana. Esto se traduce en una conservación muy importante de las secuencias nucleicas entre especies. Las divergencias más importantes se observan en el extremo 5' no traducido (cuando está disponible la secuencia), en el primer exón codificante y en el extremo 3' no traducido (figura 7).

La invención se refiere entonces asimismo a un ácido nucleico purificado, caracterizado porque se lo selecciona entre el grupo que incluye las secuencias SEQ ID 7, SEQ ID 9 y SEQ ID 11, las secuencias SEQ ID 1, SEQ ID 3 y SEQ ID 5, y las secuencias SEQ ID 13, SEQ ID 14 y SEQ ID 15, así como las secuencias de ácido nucleicos complementarios de este ácido nucleico, o una de sus variantes alélicas, las secuencias mutadas, equivalentes u homólogas, o uno de sus fragmentos.

Los ácidos nucleicos que constituyen las fases codificantes de los ácidos nucleicos anteriormente mencionados, entre los codones de partida y de fin de traducción, forman también parte de la invención.

Los ácidos nucleicos que codifican fragmentos polipeptídicos de acuerdo con la presente invención también forman parte de la misma. Se notarán particularmente los ácidos nucleicos que codifican los fragmentos descritos en las Tablas 1, 3 y 4.

De este modo, la tabla 7 describe el posicionamiento de dichos fragmentos de ácido nucleico sobre la secuencia humana SEQ ID 7.

TABLA 7

Dominio o fragmento	Posición sobre el ADNc de SEQ ID 7
	Partida	Fin
Potencial sitio de fijación de los ácidos grasos	329	385
Potencial sitio de fijación a la clatrina	572	583
Señal de transporte:
LI	809	814
LL	845	850
Dominio transmembrana	872	901
Potencial sitio receptor de las citoquinas	902	1009
Resto RSRS	1682	1693
Potencial sitio de fijación de los ligandos lipoproteicos	1904	1942

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado correspondiente a la secuencia del 5'UTR de los ADNc que codifican el receptor LSR humano. Este ácido nucleico se caracteriza porque comprende una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 1898 a 2001 de SEQ ID 19 o de manera preferente a los nucleótidos 1898 a 2144 de SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarios de este ácido nucleico. Pueden utilizarse asimismo fragmentos más cortos de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico purificado correspondiente a la secuencia del 3'UTR de los ADNc que codifican el receptor LSR. Este ácido nucleico se caracteriza porque comprende una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 20980 a 21094 de SEQ ID 19, así como las secuencias de ácidos nucleicos complementarios de este ácido nucleico. Pueden utilizarse asimismo fragmentos más cortos de este ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo ácidos nucleicos purificados correspondientes respectivamente a las secuencias de las 5'UTR o de las 3'UTR de los ADNc que codifica el receptor LSR de rata o de ratón. Pueden utilizarse asimismo fragmentos más cortos de este ácido nucleico.

Los 5'UTR y 3'UTR pueden contener elementos ("responsive elements" y "enhancers") que participan en la regulación de la trascripción y la traducción. Estas regiones desempeñan principalmente un papel en la estabilidad del ARNm. Además, el 5'UTR incluye el fragmento Shine-Delgamo que es indispensable para la traducción del ARNm.

Por ácido nucleico, secuencia nucleica o ácido nucleico, se entiende un fragmento de ADN o ARN natural aislado, o de síntesis, que incluye o no nucleótidos no naturales, que designe un encadenamiento preciso de los nucleótidos, modificados o no, que permita definir un fragmento, segmento o región de un ácido nucleico.

Por secuencias nucleicas equivalentes, se entienden las secuencias nucleicas que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención, habida cuenta de la degeneración del código genético, las secuencias de ADN complementario y las secuencias de ARN correspondiente, así como las secuencias nucleicas que codifican los polipéptidos equivalentes.

Por secuencias nucleicas homólogas, se entienden las secuencias nucleicas que codifican los polipéptidos homólogos y/o las secuencias nucleicas que presentan una tasa de identidad de al menos el 80%, preferentemente el 90%. De acuerdo con la invención, la identidad es únicamente de tipo estadístico, significa que las secuencias presentan al menos el 80%, y preferentemente el 90% de los nucleótidos en común. Se trata preferentemente de secuencias susceptibles de hibridarse específicamente con una de las secuencias de la invención. Preferentemente, las condiciones de hibridación específicas serán tal como se define en los ejemplos, o de modo tal que aseguren al menos un 95% de homología.

El largo de estas secuencias nucleicas de hibridación puede variar de 8, 10, 15, 20 ó 30 hasta 200 nucleótidos, particularmente de 20 a 50 nucleótidos, más particularmente de 20 a 30 nucleótidos.

Se entenderá por alelo o variante alélica las secuencias mutadas naturales correspondientes a polimorfismos presentes en el ser humano y, principalmente, a polimorfismos que pueden conducir a la ocurrencia y/o el desarrollo de obesidad o anorexia. Estos polimorfismos podrán asimismo conducir a la ocurrencia y/o el desarrollo de los riesgos o complicaciones asociadas con la obesidad, principalmente a nivel cardiovascular, y/o de patologías asociadas con anomalías del metabolismo de las citoquinas.

Se entiende por secuencias nucleicas mutadas a las secuencias nucleicas que incluyen al menos una mutación puntual por comparación con la secuencia normal.

Si las secuencias de acuerdo con la invención son en general las secuencias normales, también lo son las secuencias mutadas en la medida en que incluyen al menos una mutación puntual y preferentemente un máximo de 10% de mutaciones con respecto a la secuencia normal.

Preferentemente, la presente invención se refiere a secuencias nucleicas mutadas en las que las mutaciones puntuales son mudas, es decir que conducen a una modificación del aminoácido codificado con respecto a la secuencia normal. De manera aun más preferente, estas mutaciones se incluyen sobre aminoácidos que estructuran el receptor y/o el complejo LSR o los dominios y fragmentos correspondientes del mismo. Estas mutaciones pueden incluso referirse a aminoácidos incluidos en las regiones correspondientes a los sitios receptores, a las lipoproteínas o a las citoquinas, principalmente a la leptina, o a los sitios de fijación de los cofactores, principalmente de los ácidos grasos libres, o incluso a los sitios de fosforilación. Estas mutaciones pueden asimismo referirse a las secuencias implicadas en el transporte, el prefijo postal y el anclaje membranal del LSR.

De manera general, la presente invención se refiere tanto a los polipéptidos LSR normales como los polipéptidos LSR mutados, al igual que sus fragmentos y a las secuencias de ADN y ARN correspondientes, designando los polipéptidos LSR los polipéptidos del receptor de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la invención, los fragmentos de secuencias nucleicas pueden principalmente codificar dominios de los receptores y polipéptidos que poseen una función o una actividad biológica tal como se define anteriormente, incluir dominios o regiones ubicados por encima o por debajo de la secuencia codificante y que contengan elementos reguladores de la expresión del gen LSR o que posean una secuencia que permita su utilización como sonda o cebador en los procedimientos de detección, identificación o amplificación de secuencia nucleica. Estos fragmentos presentan preferentemente un tamaño mínimo de 8 ó 10 bases y se preferirán los fragmentos de 20 bases, preferentemente de 30 bases.

Entre los fragmentos que pueden resultar interesantes, principalmente para el diagnóstico, es necesario citar por ejemplo las secuencias genómicas intrónicas del gen del complejo LSR, como principalmente las secuencias de unión entre los intrones y los exones, normales o mutadas.

Las secuencias de ácido nucleico utilizables como olignucleótidos sentido o antisentido, caracterizadas porque sus secuencias se eligen entre las secuencias de acuerdo con la invención, forman parte de la misma.

Entre los fragmentos de ácidos nucleicos interesantes, cabe citar en particular a los oligonucleótidos antisentido, es decir cuya estructura asegura, mediante hibridación con la secuencia diana, una inhibición de la expresión del producto correspondiente. Es necesario mencionar asimismo a los oligonucleótidos sentido que, por interacción con proteínas involucradas en la regulación de la expresión del producto correspondiente, inducirán o bien una inhibición o una activación de esta expresión.

Las secuencias portadoras de mutaciones que pueden intervenir en las secuencias promotoras y/o reguladoras de los genes del complejo LSR, que pueden tener efectos sobre la expresión de las proteínas correspondientes, principalmente sobre su nivel de expresión, forman asimismo parte de las secuencias anteriores de acuerdo con la invención.

Las secuencias nucleicas utilizables como cebador o sonda, caracterizadas porque su secuencia nuclear es una secuencia de la invención, forman también parte de la invención.

La presente invención se refiere al conjunto de cebadores que pueden deducirse de las secuencias de nucleótidos de la invención y que pueden permitir la determinación de dichas secuencias nucleotídicas de la invención, en particular las secuencias mutadas, utilizando un método de amplificación como el método PCR, o un método relacionado.

La presente invención se refiere al conjunto de sondas que pueden deducirse de las secuencias de nucleótidos de la invención, particularmente las secuencias capaces de hibridarse mutuamente, y que pueden permitir la determinación de dichas secuencias nucleotídicas de la invención, en particular discriminar las secuencias normales de las secuencias mutadas.

La invención se refiere asimismo a la utilización de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención como sonda o cebador, para la detección y/o amplificación de secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

El conjunto de las sondas y cebadores de acuerdo con la invención podrán marcarse mediante métodos muy conocidos para el experto en la técnica, con el fin de obtener una señal detectable y/o cuantificable.

La presente invención se refiere asimismo a las secuencias nucleotídicas que pueden incluir nucleótidos no naturales, principalmente nucleótidos sulfurados, por ejemplo, o de estructura \alpha o \beta.

La presente invención se refiere, claramente, tanto a las secuencias de ADN como de ARN que se hibridan mutuamente, al igual que los ADNs de cadena doble correspondientes.

A continuación, se nombrarán las secuencias de ADN precedentes genes del complejo LSR, ya sea que se trate de secuencias normales o patológicas.

Deberá entenderse que la presente invención no se refiere a las secuencias nucleotídicas genómicas en su entorno cromosómico natural, es decir al estado natural. Se trata de secuencias que han sido aisladas, es decir que ha sido tomadas directa o indirectamente, por ejemplo por copia (ADNc), habiéndose modificado su entorno al menos parcialmente.

De este modo, puede tratarse tanto de ADNc como de ADN genómico parcialmente modificado o incluido en secuencias al menos parcialmente diferentes a la secuencias que las incluyen naturalmente.

Estas secuencias podrán asimismo ser calificadas como no naturales.

La invención incluye también métodos para la selección de bancos de ADNc y ADN genómico, para la clonación de los ADNc aislados, y/o genes codificantes del receptor de acuerdo con la invención, y para sus promotores y/o reguladores, caracterizados porque ponen en funcionamiento una secuencia nucleica de acuerdo con la invención. Entre estos métodos, puede citarse principalmente:

- la selección de los bancos de ADNc y la clonación de los ADNc aislados (Sambrook et., 1989; Suggs et., 1981; Woo et al., 1979), con ayuda de las secuencias nucleicas de acuerdo con la invención;

- la selección de bancos de etiquetas de extremos 5' (WO 96/34981) para secuencias nucleicas de acuerdo con la invención, aislando así etiquetas que permitan la clonación de ADNc completos y promotores correspondientes a partir de bancos de ADN genómico;

- la selección de bancos genómicos, por ejemplo de BACs (Chumakov et., 1992; Chumakov et al., 1995) y eventualmente un análisis genético en FISH (Cherif et al., 1990) con ayuda de secuencias de acuerdo con la invención, que permite el aislamiento y la localización cromosómica, luego la secuenciación completa de los genes que codifican el receptor LSR.

También está comprendida en la invención una secuencia, principalmente una secuencia genómica para un receptor o un polipéptido de acuerdo con la invención, o una secuencia de ácido nucleico de promotor y/o de regulador de gen codificante para un receptor o un polipéptido de acuerdo con la invención, o una de sus variantes alélicas, una secuencia mutada, equivalente u homóloga, uno de sus fragmentos, caracterizada porque es susceptible de obtenerse mediante los métodos precedentes de acuerdo con la invención o una secuencia capaz de hibridarse con dichas secuencias.

Vectores, células receptoras y animales transgénicos

Los vectores de acuerdo con la invención, caracterizados porque incluyen los elementos que permiten la expresión y/o la secreción de dichas secuencias a una célula receptora, forman también parte de la invención.

Los vectores caracterizados porque incluyen una secuencia de promotor y/o regulador de acuerdo con la invención, o una secuencia de prefijación celular de acuerdo con la invención, o uno de sus fragmentos, forman asimismo parte de la invención.

Dichos vectores incluirán preferentemente un promotor, señales de iniciación y terminación de la traducción, al igual que regiones apropiadas de regulación de la trascripción. Deben poder mantenerse de manera estable en la célula y eventualmente pueden poseer señales particulares que especifiquen la secreción de la proteína traducida.

Estas señales de control diferentes se seleccionan en función del receptor celular utilizado. A estos efectos, las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden insertarse en los vectores de replicación autónoma en el seno del receptor seleccionado, o de los vectores integradores del receptor seleccionado.

Entre los sistemas de replicación autónoma, se utilizarán preferentemente en función de la célula receptora sistemas de tipo plasmídico o viral, pudiendo los virus vectores ser principalmente adenovirus (Epstein et al., 1992). El experto en la técnica conoce las tecnologías utilizables para cada uno de estos sistemas.

Cuando se desee la integración de la secuencia en los cromosomas de la célula receptora, se podrán utilizar por ejemplo sistemas de tipo plasmídico o viral; los virus de este tipo serán, por ejemplo, los retrovirus (Temin, 1986), o los AAV (Carter, 1993).

Dichos vectores se prepararán de acuerdo con los métodos utilizados corrientemente por el experto en la técnica, y los clones resultantes pueden introducirse en un receptor apropiado mediante métodos estándar, como por ejemplo la lipofección, la electroporación y el choc térmico.

La invención incluye además a las células huésped, principalmente las células eucariotas y procariotas, transformadas por los vectores de acuerdo con al invención, así como los animales transgénicos, excluido el ser humano, comprendiendo una de dichas células transformadas de acuerdo con la invención.

Entre las células utilizables para estos fines, se pueden mencionar las células bacterianas (Olins et Lee, 1993), pero también las células de levadura (Buckholz, 1993), así como las células animales, en particular los cultivos de células de mamíferos (Edwards et Aruffo, 1993), y principalmente las células de ovario de hámster chino (CHO), además de las células de insectos en las que se pueden utilizar procedimiento utilizando baculovirus, por ejemplo (Luckow, 1993). Un receptor celular preferido para la expresión de las proteínas de la invención está constituido por las células CHO.

Entre los mamíferos de acuerdo con la invención, se preferirán los animales como los ratones, ratas y conejos, que expresen un polipéptido de acuerdo con la invención, correspondiendo el fenotipo al receptor LSR normal o variante, principalmente mutado de origen humano.

Entre los modelos de animales que resultan más particularmente interesantes en la presente, se encuentra principalmente:

- los animales transgénicos que presentan un déficit de uno de los componentes de LSR. Se obtienen mediante recombinación homóloga sobre células madres embrionarias, transferencia de estas células madres a embriones, selección de las quimeras afectadas a nivel de las líneas reproductoras y cultivo de dichas quimeras;

- los ratones transgénicos que sobreexpresan uno o más de los genes del complejo LSR de origen murino y/o humano. Los ratones se obtienen por transfección de copias múltiples de los genes del complejo LSR bajo control de un promotor poderoso de naturaleza ubicua o selectiva de un tipo de tejido, preferentemente el hígado;

- los animales (preferentemente ratones) transgénicos que se tornan deficientes mediante uno o más genes del complejo LSR, por inactivación con ayuda del sistema LOXP/CRE recombinasa (Rohlmann et al., 1996) o mediante cualquier otro sistema de inactivación de la expresión de un gen a una edad precisa del animal;

- los animales (preferentemente ratas, conejos y ratones) que sobreexpresan uno o varios genes del complejo LSR, luego de la trascripción viral o de terapia génica;

- las cruzas de animales deficientes de LSR (principalmente ratones), con animales deficientes en, o que sobreexpresen:

> la LDL receptora (Herz et al., 1995; Ishibashi et al., 1993),

> la lipasa hepática (Homanics et al., 1995; Kobayashi et al., 1996),

> la apoproteína B (Purcellhuynh et al., 1995; Fan et al., 1995),

> la apoproteína E (Plump et al., 1992; Zhang et al, 1992; Huang et al., 1996),

> la apoCIII (Aalto-Setala et al., 1992; Ito et al., Maeda et al., 1994).

La obtención de animales transgénicos y las transfecciones, virales o no, se llevarán a cabo preferentemente sobre las siguientes líneas de ratas o ratones:

- rata Zucker (fa/fa) (Iida et al., 1996),

- ratón AKR/J (West et al., 1994),

- ratón ob/ob (Zhang et al., 1994),

- ratón ob2j/ob2j (ibid),

- ratón tubby (Kleyn et al., 1996; Nobben-Trauth et al., 1996),

- fat/fat agouti (Lu et al., 1994; Manne et al., 1995),

- ratón db/db (Chen et al., 1996).

Las células y mamíferos de acuerdo con la invención son utilizables en un método de producción de un polipéptido de acuerdo con la invención, como se describe a continuación, y pueden asimismo servir a modo de modelo de análisis y selección.

Las células o mamíferos transformados como se describe anteriormente pueden utilizarse de este modo como modelos para el estudio de las interacciones entre los polipéptidos del complejo LSR, entre ellos mismos y sus compañeros, compuesto químico o proteicos, involucrados directa o indirectamente en las actividades de receptor de lipoproteínas o de receptor de citoquinas, y principalmente de leptina, y con el fin de estudiar los diferentes mecanismos e interacciones que entran en juego de acuerdo con el tipo de actividad, o en función de que se trate de un complejo normal, o de los cuales al menos uno de los dominios es una variante.

Sobre todo, pueden utilizarse para la selección de productos que interactúen con el complejo LSR, o uno de sus dominios, normal(es) o variante(s), a modo de cofactor o inhibidor, principalmente competitivo, o que tiene incluso una actividad agonista o antagonista sobre los cambios conformacionales del complejo LSR. Preferentemente, se utilizarán dichas células transformadas a modo de modelo que permite, principalmente, la selección de productos que hagan posible luchar contra la obesidad o las patologías mencionadas anteriormente. Dichas células podrán incluso servir para la determinación de los riesgos potenciales de ciertos compuestos.

Producción de polipéptidos que surgen del receptor LSR

La invención se refiere asimismo a la síntesis de polipéptidos sintéticos o recombinantes de la invención, principalmente por síntesis química o mediante la utilización de una secuencia nucleica de acuerdo con la invención.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse mediante síntesis química utilizando cualquiera de las diferentes síntesis peptídicas conocidas, por ejemplo las técnicas que hacen uso de fases sólidas o de técnicas que utilizan fases sólidas parciales, por condensación de fragmentos o mediante una síntesis en solución clásica.

Cuando los compuestos de acuerdo con la presente invención se sintetizan mediante el método en fase sólida, el aminoácido C-terminal está fijo sobre un soporte sólido inerte e incluye grupos protectores de su grupo amino en alfa (y, en caso de ser necesario, protecciones sobre sus grupos funcionales laterales).

Para los propósitos de esta etapa, el grupo protector del grupo amino terminal se elimina y se fija el segundo aminoácido que incluye también las protecciones necesarias.

Los grupos protectores N-terminales se eliminan luego de que cada aminoácido se ha fijado, pero se mantiene, evidentemente, la protección sobre las cadenas laterales. Cuando la cadena polipeptídica está completa, se escinde el péptido de su soporte y se eliminan los grupos de protección laterales.

La técnica de síntesis en fase sólida es muy conocida para el experto en la técnica. Ver principalmente Stewart et al. (1984) y Bodansky (1984).

Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química y que pueden incluir aminoácidos no naturales correspondientes están asimismo incluidos en la invención.

El método de producción de un polipéptido de la invención bajo forma recombinante está también comprendido en la presente invención, y se caracteriza en que se cultivan las células transformadas, principalmente células o mamíferos de la presente invención, en condiciones que permiten la expresión de un polipéptido recombinante mediante una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, y que se recupera dicho polipéptido recombinante.

También forma parte de la invención un método de producción de polipéptido heterólogo, caracterizado porque pone en funcionamiento un vector o una célula receptora que incluye al menos una de las secuencias de prefijo postal celular de acuerdo con la invención, o uno de sus fragmentos.

Los polipéptidos recombinantes, caracterizados porque son susceptibles a ser obtenidos mediante dicho método de producción, también forman parte de la invención.

Los polipéptidos recombinantes obtenidos como se indica anteriormente, pueden tanto presentarse bajo forma glicosilada como no glicosilada y pueden presentar o no una estructura terciaria natural.

Estos polipéptidos pueden producirse a partir de las secuencias de ácido nucleico definidas anteriormente, de acuerdo con técnicas de producción de polipéptidos recombinantes conocidas por el experto en la técnica. En este caso, la secuencia de ácido nucleico utilizada se coloca bajo el control de señales que permiten su expresión en un receptor celular.

Un sistema eficaz de producción de un polipéptido recombinante necesita disponer de un vector y de una célula receptora de acuerdo con la invención.

Pueden obtenerse células mediante la introducción en las células receptoras de una secuencia nucleotídica insertada en un vector como el que se define anteriormente, para luego cultivar dichas células en las condiciones que permitan la replicación y/o la expresión de la secuencia nucleotídica transfectada.

Los procedimientos de purificación de polipéptido recombinante utilizados son conocidos por el experto en la técnica. El polipéptido recombinante puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares, sobrenadante del medio de cultivo, mediante métodos utilizados individualmente o en combinación, como el fraccionamiento, métodos de cromatografía, técnicas de inmunoafinidad con ayuda de anticuerpos mono o policlonales, etc...

Una variante preferida consiste en la producción de un polipéptido recombinante fusionado con una proteína "portadora" (proteína quimera). La ventaja de este sistema radica en que permite obtener una estabilización y una disminución de la proteolisis del producto recombinante, un aumento de la solubilidad en el curso de la renaturalización in vitro y/o una simplificación de la purificación cuando el compañero de la fusión posee una afinidad con un ligando específico.

Anticuerpo

Pueden obtenerse anticuerpos policlonales específicos a partir del suero de un animal inmunizado contra, por ejemplo:

- el receptor LSR purificado a partir de membranas de células que presentan dicho receptor LSR, mediante métodos muy conocidos por el experto en la técnica como la cromatografía por afinidad utilizando por ejemplo leptina recombinante como ligando específico o

- un polipéptido de acuerdo con la invención, principalmente producido mediante recombinación genética o mediante síntesis peptídica, de acuerdo con los modos de operación habituales, a partir de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Se subraya el interés de anticuerpos que reconocen específicamente ciertos polipéptidos, variantes o fragmentos biológicamente activos, de acuerdo con la invención.

Los anticuerpos monoclonales específicos pueden obtenerse de acuerdo con el método clásico de cultivo de hibridomas descrito por Köhler y Milstein, 1975.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención son, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos Fab o F(ab')_{2}. Pueden asimismo presentarse bajo forma de inmunoconugados o anticuerpos marcados con el fin de obtener una señal detectable y/o cuantificable.

La invención se refiere asimismo a métodos para la detección y/o la purificación de un polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizados porque hacen uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Además de su utilización para la purificación de los polipéptidos, los anticuerpos de la invención, en particular los anticuerpos monoclonales, pueden también utilizarse para la detección de estos polipéptidos en una muestra biológica.

Constituyen de este modo un medio de análisis inmunocitoquímico o inmunohistoquímico de la expresión de polipéptido del receptor LSR sobre cortes de tejidos específicos, por ejemplo por inmunofluorescencia, marcado con oro, inmunoconjugados enzimáticos.

Permiten sobre todo determinar una expresión anormal de estos polipéptidos en los tejidos o muestras biológicas, lo cual los hace útiles para la detección de la expresión anormal del receptor LSR o para el seguimiento de la evolución del método de prevención o tratamiento.

Más generalmente, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse de manera ventajosa en toda situación en la que la expresión de un polipéptido de receptor LSR, normal o mutado, deba observarse.

Detección de variabilidad alélica y diagnóstico

Forman también parte de la invención los métodos de determinación de una variabilidad alélica, de una mutación, deleción, pérdida de heterocigotia o una anomalía genética, caracterizadas porque hacen uso de una secuencia de ácido nucleico o un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Estos métodos apuntan por ejemplo a los métodos de diagnóstico de predisposición a la obesidad, a los riesgos asociados, o a las patologías asociadas con anomalías del metabolismo de las citoquinas, determinando a partir de una muestra biológica del paciente la presencia de mutaciones en al menos una de las secuencias descritas anteriormente. Las secuencias de ácidos nucleicos analizados podrán pertenecer al ADN genómico, ADNc o ARNm.

Podrán asimismo utilizarse ácidos nucleicos o anticuerpos basados en la presente invención para permitir un diagnóstico positivo y diferencial en un enfermo tomado en aislamiento. Las secuencias nucleicas se utilizarán preferentemente para un diagnóstico presintomático en un sujeto en riesgo, principalmente con un antecedente familiar. Es también posible prever un diagnóstico prenatal.

Además, la determinación de una mutación específica puede permitir un diagnóstico evolutivo, principalmente en referencia a la intensidad de la patología o a la época probable de su aparición.

Los métodos que permiten determinar una mutación en un gen con respecto al gen natural son, claramente, muy numerosos. Es posible dividirlos esencialmente en dos grandes categorías. El primero tipo de método es aquel en el que la presencia de una mutación se detecta por comparación de la secuencia mutada con la secuencia correspondientes natural no mutada, y el segundo tipo es aquel en el cual la presencia de una mutación se detecta de manera indirecta, por ejemplo por evidencia de desapareamientos ocasionados por la presencia de la mutación.

Estos métodos pueden hacer uso de sondas y cebadores de la presente invención descritos anteriormente. Se trata generalmente de secuencias nucleicas de hibridación purificadas que comprenden al menos 8 nucleótidos, caracterizadas porque pueden hibridarse específicamente con una secuencia nucleica seleccionada del grupo formado por SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 7, SEQ ID 9, SEQ ID 11, SEQ ID 13, SEQ ID 14, SEQ ID 15, SEQ ID 19 y SEQ ID 41. Preferentemente, las condiciones de hibridación específicas son las definidas en los ejemplos, o las que aseguren al menos el 95% de homología. El largo de estas secuencias de hibridación puede variar de 8, 10, 15, 20 ó 30 a 200 nucleótidos, particularmente 20 a 50 nucleótidos, más particularmente de 20 a 30 nucleótidos.

Entre los métodos de determinación de una variante alélica, una mutación, deleción, pérdida de heterocigotia o anomalía genética, se prefieren los métodos que comprenden al menos una etapa de amplificación conocida como por PCR (reacción en cadena por la polimerasa) o por PCR-like de la secuencia diana de acuerdo con la invención susceptible de presentar una anomalía con ayuda de un par de cebadores de secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención. Los productos amplificados podrán tratarse con ayuda de enzima de restricción apropiada antes de proceder a la detección o a la dosificación del producto al que se apunta.

Por PCR-like se entenderá todos los métodos que hagan uso de reproducciones directas o indirectas de secuencias de ácidos nucleicos, o bien en los cuales los sistemas de marcado han sido amplificados; estás técnicas son claramente conocidas, en general se trata de la amplificación del ADN mediante una polimerasa; cuando la muestra de origen es un ARN conviene previamente efectuar una trascripción inversa. Existen actualmente muchos procedimientos que permiten efectuar esta amplificación, por ejemplo los métodos llamados NASBA "Nucleic Acid Séquense Based Amplification" (Compton, 1991), TAS "Transcription based Amplification Sistema" (Guatelli et al., 1990), LCR "Ligase Chain Reaction" (Landergren et al., 1988), "Endo Run Amplification" (ERA), "Cycling Probe Reaction" (CPR), y SDA "Strand Displacement Amplification" (Walker et al., 1992), muy conocidas para el experto en la técnica.

La invención comprende asimismo los métodos de diagnóstico de patologías y/o de patogenias correlacionadas a una expresión anormal de polipéptido y/o de receptor de acuerdo con la invención, caracterizados porque se pone en contacto un anticuerpo de acuerdo con la invención con el material biológico que se evaluará, en condiciones que permitan la formación eventual de complejos inmunológicos específicos entre dicho polipéptido y dicho anticuerpo, y donde se detectan los complejos inmunológicos que se forman eventualmente.

Las mutaciones de uno o más genes del complejo LSR pueden ser responsables por diferentes modificaciones de su o sus productos, modificaciones que pueden utilizarse para un enfoque diagnóstico. Efectivamente, las modificaciones de antigenicidad pueden permitir la puesta a punto de anticuerpos específicos. La discriminación de las diferentes conformaciones del LSR puede realizarse siguiendo estos métodos. Todas estas modificaciones pueden utilizarse en un enfoque diagnóstico gracias a varios métodos muy conocidos basados en la utilización de anticuerpo mono o policlonales que reconocen el polipéptido normal o las variantes mutadas, como por ejemplo mediante RIA o ELISA.

Estos métodos de diagnóstico apuntan asimismo a los métodos de diagnóstico mediante imágenes in vivo o ex vivo utilizando los anticuerpos monoclonales o policlonales de acuerdo con la invención, particularmente los marcados y que corresponden de manera integral o parcial de los polipéptidos mutados (imágenes con ayuda de anticuerpos acoplados a una molécula detectable en imágenes de tipo PET-scan, por ejemplo).

Selección de compuestos de interés

También están incluidos en la invención los métodos de selección de compuestos químicos o bioquímicos capaces de interactuar, de manera directa o indirecta, con el receptor de acuerdo con la invención, y/o que permitan modular la expresión o actividad de dicho receptor, caracterizados porque hacen uso de un receptor, un ácido nucleico, un polipéptido, una célula o un mamífero de acuerdo con la invención.

Selección de compuestos que modifican la actividad del receptor LSR

La invención se refiere a un método de selección de compuestos que modifican la actividad del receptor de LSR que consiste en la medida del efecto de compuestos candidatos sobre diferentes parámetros que reflejan, directa o indirectamente, tomados independientemente o en asociación, una actividad del receptor LSR.

Por selección de compuestos capaces de modular la actividad LSR de aclaramiento de las lipoproteínas, el efecto principal preferido es el efecto del compuesto sobre la actividad de fijación, internalización y degradación de las lipoproteínas por parte del receptor LSR.

Este efecto podrá analizarse en ausencia o en presencia de ácidos grasos libres, o de cualquier otro agente conocido para inducir o inhibir la actividad del LSR sobre el aclaramiento de las lipoproteínas, o en ausencia o presencia de leptina, o de cualquier otro agente capaz de inducir o inhibir la función LSR de aclaramiento de las citoquinas. Podrá además medirse en ausencia o presencia de agentes capaces de favorecer o reducir las actividades lipasas, ya sea intracelulares o extracelulares, así como en presencia o ausencia de vías alternativas de degradación de las lipoproteínas.

Asimismo, pueden medirse diferentes parámetros indirectos, entre los cuales se cuentan:

- el cambio de peso inducido por la administración del compuesto

- la ingesta de alimentos inducida por la administración del compuesto

- la respuesta lipidémica postprandial inducida por la administración del compuesto anterior, durante o luego de la ingestión de una comida, por ejemplo rica en grasas.

Se preferirá la selección de compuestos capaces de influir las concentraciones plasmáticas en triglicéridos, y/o la fijación, internalización y degradación hepáticas de lipoproteínas o partículas ricas en triglicéridos.

Para la selección de compuestos capaces de modular la actividad de LSR de aclaramiento de las citoquinas, principalmente la leptina, el efecto principal preferido es el efecto del compuesto sobre la actividad de fijación, internalización y degradación hepáticas de las citoquinas por parte del receptor LSR, en ausencia o presencia de ácidos grasos libres.

La medida de la fijación, internalización y/o degradación de lípidos o citoquinas puede realizarse por ejemplo sobre hepatocitos o fibroblastos en cultivo, o sobre cualquier otra célula que exprese en su superficie el receptor LSR. Las células serán preferentemente células que expresen un receptor LSR recombinante, más particularmente células que expresen un receptor LSR recombinante y cuyo receptor LSR endógeno estaría inactivado o ausente. Las células podría expresar o no el receptor LDL.

La selección del compuesto que modula la actividad LSR hace uso preferentemente de células o animales modelos de acuerdo con la invención, principalmente de ratones, ratas o seres humanos, más particularmente los descritos anteriormente o en los ejemplos que figuran a continuación.

Selección de compuestos que modifican la expresión del receptor LSR

La selección puede utilizarse para evaluar compuestos capaces de modificar el nivel y/o especificidad de expresión del receptor LSR, ya sea ligándose competitivamente a los sitios de enlace de los factores de trascripción situados en el promotor de LSR, o ligándose directamente a los factores de trascripción.

El nivel de expresión del receptor LSR y su localización pueden analizarse mediante hibridación en solución con grandes sondas como se indica en la patente PCT WO 97/05277, cuya información se incorpora a la presente a modo de referencia. Brevemente, un ADNc o el ADN genómico del receptor LSR o incluso un fragmento de los mismos se inserta a un sitio de clonación situación inmediatamente por debajo de un promotor de RNA polimerasa de bacteriófago (T3, T7 o SP6) para producir un ARN antisentido. Preferentemente, el inserto incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia genómica del receptor LSR o de uno de los ADNc de la presente invención, más particularmente uno o varios de los ADNc de SEQ ID 9, SEQ ID 11 o SEQ ID 13. El plásmido se lineariza y transcribe en presencia de ribonucleótidos que incluyen ribonucleótidos modificados como Biotine-UTP y Digoxigenina-UTP. Un exceso de este ARN marcado se híbrida en solución con los ARNm aislados de células o tejidos de interés. Las hibridaciones se realizan bajo condiciones severas (40-50ºC durante 16 h en una solución al 80% de formamida, 0,4 M NaCl, pH 7-8). La sonda no hibridada se elimina por digestión con ribonucleasas específicas de los ARN de cadena simple (Rnasas CL3, T1, Phym, U2 o A). La presencia de nucleótidos modificados biotina-UTP permite la captura de los híbridos sobre placas de microtitulación que incluyen estreptavidina. La presencia de la modificación DIG permite la detección y la cuantificación de los híbridos mediante ELISA utilizan anticuerpos anti-Dig acoplados a la fosfatasa alcalina.

Un análisis cuantitativo de la expresión del gen del receptor LSR puede también realizarse utilizando matrices de ADN, designando el término de matriz de ADN un arreglo monodimensional, bidimensional o multidimensional de una pluralidad de ácidos nucleicos que presentan un largo suficiente para permitir una detección específica de la expresión de los ARNm capaces de hibridarse. Por ejemplo, las matrices de ADN pueden contener una pluralidad de ácidos nucleicos derivados de genes de los cuales se quiere estimar el nivel de expresión. Las matrices de ADN pueden incluir las secuencias genómicas de LSR, la de un ADNc de la presente invención, más particularmente uno o varios ADNc de SEQ ID 9, SEQ ID 11 o SEQ ID 13, todas las secuencias complementarias de las mismas o todos los fragmentos de los mismos. Preferentemente, los fragmentos comprenden al menos 15, al menos 25, al menos 50, al menos 100 o al menos 500 nucleótidos consecutivos de las secuencias nucleicas de los que surgen.

Por ejemplo, un análisis cuantitativo de la expresión del receptor LSR puede realizarse con una matriz de ADN que presenta el ADNc del receptor LSR como se describe en Schena et al. (1995 y 1996). ADNc del receptor LSR o fragmentos de los mismos se amplifican mediante PCR y se fijan en forma de matriz a partir de una microplaca de 96 pocillos sobre una lámina para microscopio silado utilizando una robótica muy veloz. La matriz de ADN preparada de esta manera se incuba en una cámara húmeda para permitir su rehidratación. Luego se la aclara una vez en 0,2% SDS durante 1 minuto, dos veces con agua durante 1 min y una vez durante 5 min en una solución de borohidruro de sodio. La matriz se sumerge entonces en agua durante 2 min a 95ºC, se transfiere a 0,2% SDS durante 1 min, se aclara dos veces con agua, se seca y almacena a la oscuridad a 25ºC.

Los ARNm de las células o de tejidos se aíslan u obtienen de una fuente comercial, por ejemplo de la sociedad Clontech. Las sondas se preparan mediante un ciclo de trascripción inversa. Las sondas se hibridan luego en la matriz de ADN de 1 cm^{2} sobre una lámina de 14x14 durante 6-12 horas a 60ºC. La matriz se lava durante 5 min a 25ºC en un tampón de lavado de baja severidad (1 x SSC/0,2% SDS), pero durante 10 min a temperatura ambiente en un tampón de alta severidad (0,1 x SSC/0,2% SDS). La matriz se analiza en 0,1 x SSC utilizando un microscopio de fluorescencia láser con un juego de filtros adecuados. Se obtienen medidas de expresión diferencial precisas tomando el promedio de las relaciones de dos hibridaciones independientes.

Puede también realizarse un análisis cuantitativo de la expresión del receptor LSR con ADNc del receptor LSR o fragmentos de los mismos sobre matrices de ADN de acuerdo con la descripción de Pietu et al. (1996). Los ADNc del receptor LSR o de los fragmentos de los mismos se amplifican mediante PCR y se fijan sobre membranas. Los ARNm que proviene de diferentes tejidos o células se marcan con nucleótidos radiactivos. Luego de la hibridación y el lavado en condiciones controladas, los ARNm hibridados se detectan con un Phosphor Imager o mediante autoradiografía. Los experimentos se llevan a cabo por duplicado y puede efectuarse un análisis cuantitativo de los ARNm expresados diferencialmente.

De manera alternativa, el análisis de la expresión del receptor LSR puede realizarse con matrice de ADN de alta densidad como describen Lockhart et al. (1996) y Sosnowski et al. (1997). Se sintetizan oligonucleótidos de 15 a 50 nucleótidos, preferentemente aproximadamente 20 nucleótidos, extraídos de las secuencias de ADN genómico o de ADNc del receptor LSR o de sus secuencias complementarias, directamente sobre una plaqueta o se sintetizan para colocarse luego en la plaqueta.

Se sintetizan sondas de ADNc de LSR marcadas con un compuesto apropiado como biotina, digoxigenina o una molécula fluorescente, a partir de una población de ARNm, y se fragmentan en oligonucleótidos de 50 a 100 nucleótidos en promedio. Las sondas obtenidas de este modo se hibridan entonces en plaqueta. Luego de un lavado como el descrito en Lockhart et al (1996) y una aplicación de diferentes campos eléctricos (Sosnowski et al., 1997), los compuestos marcados se detectan y cuantifican. Se duplican las hibridaciones. Un análisis comparativo de la intensidad de las señales generadas por las sondas sobre un mismo oligonucleótido diana en diferentes muestras de ADNc indica una expresión diferencial de los ARNm del receptor LSR.

Las técnicas mencionadas anteriormente permiten el análisis de los niveles de expresión del receptor LSR, en una misma célula o un mismo tejido según diferentes condiciones, por ejemplo de inducción o no inducción, pero también el análisis de la especificidad tisular de esta expresión, en condiciones que pueden asimismo variar. Gracias a estas técnicas será posible analizar la expresión de una u otra subunidad del receptor LSR, y más generalmente de diferentes formas que surgen de corte y empalme alternativo, definiendo las sondas de manera adecuada.

El efecto de compuestos candidatos a la modulación del nivel o la especificidad de la expresión, o del corte y empalme de las diferentes formas del receptor LSR, podrá de este modo analizarse a gran escala exponiendo las células fuente de ARN mensajero, principalmente las células modelo de acuerdo con la invención, ya sea que expresan el LSR naturalmente o que se trate de células recombinantes, de dichos compuestos candidatos.

Selección de compuestos que interactúan con el receptor LSR

Otro aspecto de la presente invención consiste en métodos de identificación de moléculas capaces de vincularse al receptor LSR. Dichas moléculas pueden utilizarse para modular la actividad del receptor LSR. Por ejemplo, las mismas pueden utilizarse para estimular o reducir la degradación de las lipoproteínas, preferentemente lipoproteínas ricas en triglicéridos, o citoquinas, preferentemente leptina. Tales moléculas pueden asimismo utilizarse para inhibir la activación mediante la leptina o la activación mediante los ácidos grasos libres de la actividad LSR.

Existen varios métodos para identificar los ligandos del receptor LSR. Uno de estos métodos se describe en la patente US 5,270,170, cuya información se incorpora a modo de referencia. Brevemente, se construye un banco de péptidos aleatorios, que comprenden una pluralidad de vectores que codifican cada uno una fusión entre un péptido candidato para una fijación al receptor lacl. Los vectores del banco de péptidos aleatorios contienen también sitios de fijación para las proteínas que se fijan al ADN como el sitio LacO cuando la proteína es el represor Lac. El banco de péptidos aleatorios se introduce en una célula receptora en la que la proteína de fusión se expresa. La célula receptora se lisa luego en condiciones que permiten la fijación de la proteína de fusión con los sitios del vector.

Los vectores que fijaron la proteína de fusión se ponen en contacto con el receptor LSR inmovilizado, una subunidad del receptor LSR inmovilizada o un fragmento del receptor LSR inmovilizado en condiciones que permiten que los péptidos se fijen específicamente. Por ejemplo, el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos, puede inmovilizarse mediante fijación a una superficie como una placa o una partícula plástica.

Los vectores que codifican los péptidos capaces de fijarse al receptor LSR se retendrán específicamente sobre la superficie mediante interacciones entre el péptido y el receptor LSR, una subunidad del receptor o un fragmento del mismo.

De manera alternativa, pueden identificarse moléculas capaces de interactuar con el receptor LSR utilizando un sistema de doble híbridos como el Matchmaker Two Hybrid System 2. De acuerdo con las instrucciones del manual que acompaña al Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catálogo Nº K1604-1, Clontech), cuya información se incorpora a modo de referencia, los ácidos nucleicos que codifican el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos, se insertan en un vector de expresión de manera tal que queden en fase con el ADN que codifica el dominio de enlace de ADN del activador de trascripción de levadura GAL 4. Los ácidos nucleicos de un banco que codifican proteínas o péptidos susceptibles de interactuar con el receptor LSR se insertan en un segundo vector de expresión de manera tal que estén en fase con el ADN que codifica el dominio de activación del activador GAL4. Las levaduras se transforman mediante los dos plásmidos de expresión y se ubican en un medio que permite seleccionar las células que expresan marcadores contenidos en cada uno de los vectores, al igual que las que expresan el gen HIS3 cuya expresión depende de GAL4. Las células transformadas capaces de crecer sobre un medio denudado de histidina se analizan mediante la expresión de LacZ bajo dependencia de GAL4. Las células que crecen en ausencia de histidina y expresan LacZ contienen un plásmido que codifican para proteínas o péptidos que interactúan con el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos del mismo.

Para estudiar la interacción del receptor LSR, de una subunidad del mismo o de un fragmento del mismo que incluya al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos con moléculas pequeñas como las generadas por química combinatoria, es posible utilizar una microdiálisis acoplada con una HPLC tal como se describe en Wang et al. (1997), o una electroforesis capilar de afinidad como se describe en Busch et al. (1997), cuyas informaciones se incorporan al presente a modo de referencia.

En otros métodos, los péptidos o las moléculas pequeñas susceptibles de interactuar con el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos pueden estar enlazados con marcadores detectables como marcadores radiactivos, fluorescentes o enzimáticos. Estas moléculas marcadas se ponen en contacto con el receptor LSR inmovilizado, una subunidad del mismo inmovilizada o un fragmento del mismo inmovilizado que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos en condiciones que permiten una interacción específica. Luego de la eliminación de las moléculas no fijadas específicamente, las moléculas enlazadas se detectan mediante medios apropiados.

Estos métodos podrán principalmente permitir la identificación de ácidos grasos o análogos capaces de fijarse al sitio de fijación de los ácidos grasos sobre el LSR, de lipoproteínas o análogos, capaces de fijarse al sitio de fijación de las lipoproteínas sobre el receptor LSR, de derivados de la leptina o análogos capaces de enlazarse al sitio de fijación de la leptina sobre el LSR, y de derivados del receptor gC1qR o análogos capaces de fijarse al sitio de fijación de gC1qR sobre el LSR.

Asimismo, los péptidos o las moléculas pequeñas que se enlazan al LSR, preferentemente a los sitios de fijación sobre el receptor LSR de los ácidos grasos, lipoproteínas, citoquinas, principalmente la leptina, o de gC1qR o una de sus proteínas análogas, pueden identificarse mediante experimentos competitivos. En estos experimentos, el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos se inmoviliza sobre una superficie como la de un soporte plástico. Se ponen en contacto cantidades crecientes de péptidos o de moléculas pequeñas con el receptor LSR inmovilizado, una subunidad del mismo inmovilizada o un fragmento del mismo inmovilizado que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos en presencia del ligando marcado del receptor, pudiendo este ligando ser por ejemplo leptina, oleato, LDL o gC1qR. El ligando del receptor LSR puede estar marcado con un marcador reactivo, fluorescente o enzimático. La capacidad de la molécula probada para interactuar con el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos se determina midiendo la cantidad de ligando marcado enlazado en presencia de la molécula evaluada. Una disminución de la cantidad de ligando enlazada cuando la molécula de prueba está presente indica que la misma es capaz de interactuar con el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos.

Estos métodos pueden permitir principalmente la identificación de ácidos grasos o análogos capaces de fijarse al sitio de fijación de los ácidos grasos sobre LSR, de lipoproteínas o análogos, capaces de fijarse al sitio de fijación de las lipoproteínas sobre el receptor LSR, de derivados de la leptina o análogos capaces de enlazarse al sitio de fijación de la leptina sobre LSR, y de derivados del receptor gC1qR o análogos capaces de fijarse al sitio de fijación de gC1qR sobre LSR. Se podrá particularmente medir la capacidad de dichos compuestos, y de cualquier otro compuesto candidato, para impedir el enlace de oleatos, lipoproteínas, leptina o de gC1qR a LSR.

La tecnología de BIACORE puede asimismo utilizarse para efectuar la selección de los compuestos capaces de interactuar con el receptor LSR. Esta tecnología aparece descrita en Szabo et al. (1995) y en Edwards et Leatherbarrow (1997), cuya información se incorpora a modo de referencia, y permite detectar interacciones entre las moléculas en tiempo real sin utilización de marcado. Se basa en el fenómeno de SPR (surface plasmon resonance). Brevemente, la molécula que se analizará se fija sobre una superficie (utilizando típicamente una matriz de carboximetil dextrano). Se dirige un rayo de luz desde la faz de la superficie que no contiene muestra y se releja en la misma. El fenómeno de SPR provoca una reducción de la intensidad de la luz reflejada con una combinación específica de ángulo y largo de onda. Los acontecimiento de fijación de moléculas provocan un cambio del índice de refracción en la superficie que se detecta como una modificación de la señal SPR. Para efectuar una selección de compuestos capaces de interactuar con el receptor LSR, se inmoviliza sobre una superficie el receptor LSR; una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos. Esta superficie constituye una faz de una célula en la cual pasa la molécula a evaluar. La fijación de la molécula sobre el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, o más de 30 aminoácidos consecutivos se detecta mediante un cambio de la señal SPR. Las moléculas evaluadas pueden ser proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos o moléculas pequeñas generadas, por ejemplo, por química combinatoria. Las proteínas candidato pueden extraerse de cualquier tejido, tomado de cualquier especie. La tecnología de BIACORE puede también utilizarse inmovilizando células eucariotas o procariotas o vesículas lipídicas que presentan un receptor LSR endógeno o recombinante en su superficie.

Una de las principales ventajas de este método es que permite la determinación de constantes de asociación entre el receptor LSR y las moléculas que interactúan. De este modo, es posible seleccionar específicamente las moléculas que interactúan con constantes de asociación fuertes o débiles.

Las proteínas u otras moléculas que interactúan con el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos pueden identificarse utilizando columnas de afinidad que contienen el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos. El receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más 30 aminoácidos consecutivos puede enlazarse a la columna utilizando técnicas convencionales que incluyen el acoplamiento químico a una matriz de columna apropiada como la agarosa, Affi Gel, u otras matrices conocidas por el experto en la técnica. En otro aspecto de la invención, la columna de afinidad puede contener proteínas quiméricas en las que el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos estaría fusionado por ejemplo con la glutation S-transferasa. Las moléculas a evaluar descritas anteriormente se colocan entonces sobre la columna. Las moléculas que interactúan con el receptor LSR, una subunidad del mismo o un fragmento del mismo que comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30 o más de 30 aminoácidos consecutivos, se retienen por la columna y pueden aislarse por elusión. En el caso en que las moléculas evaluadas fueran proteínas, las mismas puede luego ser analizadas sobre un gel de electroforesis 2-D como se describe en Ramunsen et al., (1997), cuya información se incorpora a modo de referencia. De manera alternativa, las proteínas o las demás moléculas retenidas por la columna de afinidad pueden purificarse por electroforesis y secuencias. Un método similar también puede utilizarse para aislar anticuerpos, para realizar la selección en los productos de "phage display" o de anticuerpos humanos que surgen de "phage display."

Selección de compuestos que interactúan con las secuencias promotoras y/o reguladoras de receptor LSR

La invención se refiere asimismo a un método de selección de compuestos que interactúan con las secuencias promotoras y/o reguladoras del receptor LSR.

Los ácidos nucleicos que codifican proteínas que interactúan con las secuencias promotoras y/o reguladoras del gen receptor LSR, más particularmente una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 1 a 1897 de SEQ ID 19 o un fragmento del mismo, pueden identificarse utilizando un sistema de híbrido simple como el descrito en el manual que acompaña al kit Marchmaker One-Hybrid System de Clontech (Catálogo Nº K1603-1), cuya información se incorpora a modo de referencia. Brevemente, la secuencia nucleotídica diana se clona por encima de un gen marcador seleccionable e integrado en un genoma de levadura. Las levaduras que contienen el gen marcador integrado se transforman mediante un banco que contiene fusiones entre ADNc que codifican la proteína candidata a la fijación sobre las regiones promotoras y/o reguladoras del gen del receptor LSR y el dominio activador de un factor de trascripción de levadura como GAL4. Las levaduras se colocan en un medio que permite seleccionar las células que expresan el gen marcador. Las levaduras seleccionadas contienen una proteína de fusión capaz de fijarse sobre la región diana promotora y/o reguladora. Los ADNc de los genes que codifican las proteínas de fusión se secuencian entonces. Los insertos correspondientes pueden clonarse entonces en los vectores de expresión o de trascripción in vitro. El enlace de los polipéptidos codificados de este modo con las secuencias diana del promotor pueden confirmarse mediante técnicas conocidas para el experto en la técnica, como los experimentos de retardo sobre gel o de protección en la DNAsa.

La selección de compuestos capaces de modificar la expresión un receptor LSR fijándose a sus secuencias reguladoras y/o promotoras puede entonces realizarse con ayuda de genes "reporter". Por ejemplo, una región genómica situada en 5' de la secuencia codificante del receptor LSR, más particularmente una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 1 a 1897 de SEQ ID 19, o un fragmento de la misma, puede clonarse en un vector como pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, p\betagal-Basic, p\betagal-Enhancer, o pEGFP-1 disponibles de Clontech. Brevemente, cada uno de los vectores contiene sitios múltiples de clonación situados por encima de un gen marcador que codifica una proteína fácilmente detectable como la fosfatasa alcalina, la \beta galactosidasa, o la GFP (green fluorescent protein). Luego de la inserción de la región genómica situada en 5' de la secuencia codificante del receptor LSR, más particularmente una secuencia nucleotídica correspondiente a los nucleótidos 1 a 1987 de SEQ ID 19 o un fragmento de la misma, el nivel de expresión de las proteínas marcador se mide y compara con un vector que no contenga inserto. El efecto de los compuestos candidatos sobre la expresión que surge de las secuencias reguladoras y/o promotoras del LSR puede evaluarse de este modo.

La selección de los compuestos capaces de fijarse en las regiones reguladoras y/o promotoras del gen del receptor LSR puede efectuarse asimismo mediante experiencias de retraso sobre gel, muy conocidas para el experto en la técnica y descritas en Freíd y Crothers (1981), Garner y Revzin (1981) y Dent y Latchman (1993), cuya información se incorpora a modo de referencia. Estas experiencias se basan en el principio de que un fragmento de ADN enlazado con una proteína migra más lentamente que el mismo fragmento sin proteína. Brevemente, la secuencia nucleotídica diana está marcada. Luego se presenta ya sea en presencia de un extracto nuclear o total de células preparado de manera tal que contenga los factores de trascripción, o diferentes compuestos a evaluar. La interacción entre la región reguladora y/o promotora del gen del receptor LSR y el compuesto o factor de trascripción se detecta luego de electroforesis con un retardo de migración.

Compuestos

Los compuestos químicos o bioquímicos, caracterizados porque permiten modular la expresión o la actividad del receptor de acuerdo con la invención, forman asimismo parte de la invención.

Los compuestos químicos o bioquímicos, caracterizados porque son capaces de interactuar, directa o indirectamente, con el receptor de acuerdo con la invención, forman parte de la invención.

Los compuestos químicos o bioquímicos caracterizados porque se seleccionan mediante dichos métodos definidos anteriormente, también forman parte de la invención.

Particularmente, entre estos compuestos de acuerdo con la invención se prefiere la leptina o uno de sus compuestos derivados, preferentemente una de sus variantes proteicas, o leptinas modificadas químicamente u obtenidas por recombinación genética, o uno de sus fragmentos.

Por compuestos que permiten modular la expresión o actividad del receptor, se entienden los compuestos que permiten principalmente reducir, estabilizar o aumentar el número, la velocidad de reciclaje y/o el cambio de conformación del receptor según la invención, o favorecer o inhibir la actividad global o la actividad de uno de los dominios de dicho receptor, o incluso restablecer la expresión normal de dicho receptor en el caso, por ejemplo, en que se constate una anomalía genética. Estos compuestos podrán por ejemplo interactuar como ligandos específicos de dicho receptor o de uno de sus dominios a modo de cofactor, o de inhibidor, altamente competitivo, o incluso que tiene una actividad agonista o antagonista sobre los cambios de conformación del complejo. Estos compuestos podrán actuar asimismo neutralizando los ligandos específicos naturales de dicho receptor e inhibiendo de este modo la actividad del receptor inducida por estos ligandos.

Entre estos compuestos, se prefieren los compuestos que permiten modular el número de polipéptidos de dicho receptor, su velocidad de reciclaje y/o la selectividad de su actividad.

Se prefieren asimismo los compuestos de acuerdo con la invención caracterizados porque permiten un aumento de la actividad total o de la expresión del receptor de acuerdo con la invención y/o un aumento específico de la actividad de aclaramiento de las citoquinas, principalmente la leptina, de dicho receptor, y/o un aumento específico y de la actividad de aclaramiento de las lipoproteínas, de dicho receptor.

Se prefieren asimismo los componentes caracterizados porque permiten una disminución de la actividad total o una expresión del receptor de acuerdo con la invención, y/o una modulación de la eliminación de las lipoproteínas, de los residuos de quilomicrones y/o de los triglicéridos.

La invención comprende asimismo los compuestos de acuerdo con la misma, caracterizados en que permiten una modulación de la tasa de citoquinas, principalmente de la leptina, y/o una modulación de la tasa de lipoproteínas, residuos de quilomicrones y/o triglicéridos.

Se prefieren más particularmente los compuestos de acuerdo con la invención, caracterizados porque permiten una modulación de la tasa de citoquinas, principalmente de la leptinemia, y/o una modulación de la tasa de lipoproteínas, una disminución de la concentración plasmática de residuos de quilomicrones y/o una disminución de trigliceridemia.

Entre los compuestos más preferidos, se prefieren los que se caracterizan por lo siguiente:

a) un anticuerpo de acuerdo con la invención;

b) un polipéptido de acuerdo con la invención;

c) un polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque corresponde a una forma soluble del receptor según la invención;

d) un vector de acuerdo con la invención;

e) un vector de acuerdo con la invención, caracterizado porque presenta en su superficie exterior un sitio de reconocimiento específico de las células hepáticas;

f) un vector de acuerdo con la invención, caracterizado porque el producto de expresión del ácido nucleico inserto por el vector en la célula diana o bien está anclado, o es secretado por dicha célula diana transformada;

g) un oligonucleótido sentido o antisentido de acuerdo con la invención;

h) una leptina, o una de sus variantes proteicas, o una leptina modificada químicamente o por recombinación genética, o uno de sus fragmentos.

La invención se refiere finalmente a los compuestos de acuerdo con la invención a modo de medicamento.

Se prefieren principalmente los compuestos de acuerdo con la invención a modo de medicamento para la prevención y/o el tratamiento de patologías y/o patogenias vinculadas con los trastornos del comportamiento alimenticio.

Se prefieren asimismo los compuestos de acuerdo con la invención a modo de medicamento para la prevención y/o el tratamiento de patologías y/o patogenias vinculadas con los trastornos del metabolismo de las citoquinas.

Preferentemente, la invención se refiere asimismo a compuestos de acuerdo con la invención a modo de medicamento para la prevención o el tratamiento de la obesidad o la anorexia.

Los compuestos de acuerdo con la invención, a modo de medicamento para la prevención y/o el tratamiento de patologías y/o de patógenas asociadas o inducidas por la obesidad, son los compuestos preferidos.

En particular, se prefieren los compuestos de acuerdo con la invención, a modo de medicamento para la prevención y/o el tratamiento de insuficiencia cardiaca, insuficiencia coronaria, accidentes cerebrovasculares, enfermedad ateromatosa, aterosclerosis, hipertensión arterial, diabetes no insulo dependiente, hipelipidemia y/o hiperuricemia.

Los más preferidos son los compuestos de acuerdo con la invención, a título de medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad ateromatosa y/o de la aterosclerosis.

Finalmente, la invención comprende compuestos de acuerdo con la invención para la prevención y/o el tratamiento por terapia génica de patologías y/o patogenias vinculadas con los trastornos del comportamiento alimenticio, la obesidad y/o patologías y/o patogenias asociadas o inducidas por la obesidad.

Los compuestos de la invención como principios activos de medicamento estarán preferentemente en forma soluble, asociados con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tales compuestos utilizables a modo de medicamento ofrecen un nuevo enfoque para prevenir y/o tratar las patologías y/o patogenias vinculadas con los trastornos del comportamiento alimenticio como la obesidad o la anorexia, y los riesgos y/o complicaciones asociadas.

Preferentemente, estos compuestos se administrarán por vía sistémica, en particular por vía intravenosa, vía intramuscular, intradérmica o vía oral.

Sus modos de administración, posologías y formas farmacéuticas óptimas pueden determinarse de acuerdo con los criterios generalmente adoptados en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente como por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundario constatados, etc...

Como se mencionara anteriormente, en función del caso, podrá resultar conveniente amplificar la actividad de LSR, promoviendo por ejemplo la expresión de sus genes u aumentando la actividad de sus productos de expresión, en los casos patológicos con raíz en el hecho de que al menos uno de estos genes no está expresado, está insuficientemente expresado o está expresado en una forma anormal que no permite que el producto de expresión cumpla con sus funciones, o al contrario reprima una sobreexpresión o una expresión anormal de estos genes. Conviene entonces paliar de manera general la carencia o sobreexpresión de productos de expresión de este gen mediante una terapia llamada "de reemplazo" que permita la amplificación o disminución de las actividades del complejo LSR.

La terapia de reemplazo podrá efectuarse mediante terapia génica, es decir introduciendo las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o los genes correspondientes con los elementos que permiten su expresión in vivo y/o los genes correspondientes con los elementos que permiten su expresión in vivo, en el caso en que uno de los genes esté insuficientemente expresado por ejemplo, o cuando está expresado de manera anormal.

Los principios de la terapia génica son conocidos, se pueden utilizar vectores virales de acuerdo con la invención; es asimismo posible prever vectores no virales, es decir sintéticos, que imitan a las secuencias virales o que están constituidos por el ADN o el ARN desnudo de acuerdo con la técnica desarrollada principalmente por la sociedad VICAL.

En la mayoría de los casos, será necesario prever elementos de focalización que aseguren una expresión específica del hígado de manera de poder limitar las zonas de expresión de las proteínas que participan en el aclaramiento de la leptina y el de las lipoproteínas. En ciertos casos es incluso interesante disponer de vectores de expresión transitoria o al menos de expresión controlada que se podrán bloquear cuando ello resulte necesario.

Otras características de la invención figuran en la continuación de la descripción con los ejemplos y figuras cuyas leyendas se representan más adelante.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de las tres formas de la proteína LSR de rata: LSR 66 (subunidad \alpha), LSR 64 (subunidad \alpha') y LSR 58 (subunidad \beta).

Figura 2: Alineamiento de las secuencias proteicas de las formas largas (subunidades \alpha) del LSR humano (LSR1.
Hs) de rata (LSR1.Rn) y de ratón (LSR1.Mm). Los símbolos (*) ubicados bajo las alineaciones indican los aminoácidos conservados, los símbolos (.) indican las sustituciones conservadoras de aminoácidos. Encuadrado, desde el extremo NH2-terminal hasta el extremo COOH-terminal, el sitio potencial de fijación de los ácidos grasos (FFA) encuadrado, el sitio de enlace a la clatrina [NPGY], el consenso de prefijo postal liposomal: di-leucina LI-X10-LL, el dominio transmembranal TM con sobrelínea, la fracción [RSRS], el sitio de fijación potencial de las lipoproteínas (++-) encuadrado. En sobrelínea, la firma del receptor de TNF con (flecha); indicados, los aminoácidos conservados en la firma. El dominio transmembranal se sitúa entre el último dileucina y la firma del TNF.

Figura 3: Alineamiento de las secuencias proteicas de los tres tipos de subunidades de LSR humano (\alpha: LSR1.Hs; \alpha': LSR2.Hs; \beta: LSR3.Hs). La significación de los símbolos, los encuadres y las sobrelíneas es la misma que en la figura 2.

Figura 4: Alineamiento de las secuencias proteicas de tres tipos de subunidades de LSR de rata. La significación de los símbolos, encuadres y sobrelíneas es la misma que en el figura 2.

Figura 5: Alineamiento de las secuencias proteicas de los tres tipos de subunidades del LSR de ratón. La significación de los símbolos, encuadres y sobrelíneas es la misma que en la figura 2.

Figura 6: Representación esquemática de las tres formas de LSR puestas en evidencia en el hombre, que indican los motivos conservados sobre cada una de ellas.

A: Representación esquemática de la organización genómica del LSR humano partir del primer exón codificante. Los exones se indican mediante recuadros, los intrones mediante barras entrecortadas. El tamaño de los nucleótidos de los exones e intrones está indicado sobre los mismos. Los elementos que caracterizan al mensajero y la proteína codificada se presentan sobre esta figura. El cuadro que aparece a la derecha proporciona el significado de los símbolos utilizados.

B: Estructura de la forma LSR-Hs-2062 de LSR humano. Esta forma codifica una proteína de 649 aminoácidos.

C: Estructura de la forma LSR-Hs-2005 de LSR humano. Esta forma codifica una proteína de 630 aminoácidos.

D: Estructura de la forma LSR-Hs-1858 de LSR humano. Esta forma codifica una proteína de 581 aminoácidos.

Figura 7: Alineamiento de las secuencias nucleotídicas de las formas largas de ADNc (codificantes para la subunidad \alpha) del LSR humano (Isr1.Hs), de rata (Isr1.rRn) y de ratón (Isr1.Mm). Los nucleótidos conservados en las tres secuencias se indican mediante un símbolo * ubicado bajo las secuencias. Se agregan guiones en el interior de las secuencias cuando el alineamiento óptimo de las secuencias no puede realizarse sin crear microdeleciones.

Figura 8: Identificación del receptor LSR mediante ligando y Transferencia Western sobre proteína solubilizadas de membranas de hígado de rata (líneas 1, 2 y 4) o sobre la proteína parcialmente purificada de 240 kD (línea 3).

Líneas 1, 2 y 3: Ligando blotting. Línea 1: en ausencia de oleato y de ^{125}I-LDL; línea 2: en presencia de oleato y de ^{125}I-LDL; línea 3: en presencia de oleato y de ^{125}I-LDL. Línea 4: Transferencia Western con anticuerpos anti-LSR.

Figura 9: Efecto de anticuerpo anti-LSR sobre la actividad LSR.

A. Fijación de ^{125}I-LDL sobre las membranas plásmicas de hepatocitos de rata en presencia de oleato y de concentraciones crecientes de anticuerpos anti-LSR (\blacksquare) o anticuerpos control (\Box), expresada en % de la cantidad total de ^{125}I-LDL fija en ausencia de anticuerpo.

B. Fijación, incorporación y degradación de ^{125}I-LDL en los hepatocitos de rata en cultivo primario en presencia de oleato y de anticuerpo anti-LSR (\blacksquare) o de anticuerpo control (\Box), expresadas respectivamente en % de la fijación, incorporación y degradación total de ^{125}I-LDL en presencia de anticuerpo no específico.

Figura 10: Identificación del receptor LSR por inmunoprecipitación de lisados de hepatocitos marcados en la ^{35}S metionina y ^{35}S cisteína, en presencia de anticuerpos control (línea 1), o anticuerpos anti-LSR (líneas 2 a 4), luego de separación por electroforesis en condiciones no reductoras (líneas 2 y 3) o reductoras (línea 1 y 3).

Figura 11: Clonación del ADNc codificante par LSR \alpha y \beta.

A. Análisis en Northern blot que muestra diferentes tamaños del ARN mensajero de LSR.

B. Análisis en Northern blot multitisular del ARNm de LSR con una sonda específica del LSR y una sonda controlada específica de la \beta-actina.

C. Análisis del ARNm del LSR en RT-PCR utilizando 5 pares de cebadores que cubren la secuencia entera y determinación de tres formas surgidas del corte y empalme alternativo en el fragmento de amplificación obtenido gracias a un par de cebadores bc'. El esquema representa los resultados de análisis de las tres formas correspondientes de ADNc de LSR: la región cuadriculada está ausente de las dos formas cortas, la región rayada está ausente únicamente de la forma más corta.

Figura 12: Traducción in vitro de los dos ADNc completos codificantes para las formas más larga (66 kDa, línea 2) y la más corta (58 kDa, línea 3) del LSR de rata, y de un ADNc control, antisentido de ADNc que codifica la forma más larga del LSr (línea 1).

Los productos de traducción in vitro, marcados con ^{35}S-metionina, se analizan luego de electroforesis en condiciones no reducidas.

Figura 13: Identificación de las subunidades LSR \alpha y \beta como responsables de la actividad LSR.

A. Esquema que muestra la localización y la secuencia del péptido N-terminal de LSR empleado para generar anticuerpos anti-péptido LSR.

B. Transferencia Western y transferencia de ligando de las subunidades \alpha y \beta del LSR. La transferencia Western se lleva a cabo utilizando el anticuerpo anti-LSR (línea 1) o anti-péptido LSR (línea 1). La transferencia de ligando se efectúa en presencia de ^{125}I-LDL con (línea 4) o sin (línea 3) oleato.

C. Efecto de anticuerpos dirigidos contra un péptido LSR sintético sobre la actividad LSR de membranas plásmicas de hígado de rata. La actividad LSR se mide en presencia de un anticuerpo control (\Box) o del anticuerpo antipéptido LSR (\blacksquare).

Figura 14: Identificación de las subunidades del receptor LSR y efecto inhibidor de anticuerpos dirigidos contra un péptido sintético C-terminal que surge de LSR.

A- Esquema que muestra la localización y la secuencia del péptido sintético 170.

B- Transferencia Western de lisados de hepatocitos de rata utilizando los anticuerpos dirigidos contra el péptido sintético 170 (línea 2) o un anticuerpo control (línea 1); línea 3: marcadores de peso molecular.

C- Fijación de ^{125}I-LDL por el receptor LSR en presencia de oleato y anticuerpo control o dirigidos contra el péptido 170 de LSR.

Figura 15: Efecto de una transfección transitoria de células CHO-K1, expresando los plásmidos las subunidades \alpha y \beta del receptor LSR sobre la fijación de las LDL en presencia o ausencia de oleato. Concentración creciente de plásmido \alpha solamente (\circ\Box); concentración fija de plásmido \alpha y concentración creciente de plásmido \beta (\bullet\blacksquare).

Figura 16: Efecto de una transfección transitoria de células CHO-K1 expresando los plásmidos las subunidades \alpha y \beta del receptor LSR sobre la internalización y degradación de las LDL. Concentración creciente de plásmido \alpha solamente (\blacksquare); concentración fija de plásmido \alpha y concentración creciente de plásmido \beta (\bullet). Los resultados se expresan como la diferencia de las medidas en presencia y ausencia de oleato.

Figura 17: Caracterización de la actividad LSR obtenida en las células CHO-K1 transfectadas transitoriamente con las secuencias nucleicas que codifican las subunidades \alpha y \beta del receptor LSR, comparada con la actividad LSR obtenida en las mismas células no transfectadas (control).

A- Fijación de ^{125}I-LDL en presencia de un anticuerpo control o de un anticuerpo anti-LSR.

B- Fijación de ^{125}I-LDL en presencia de concentraciones crecientes de lipoproteínas no marcadas; quilomicrones de rata (\blacklozenge). VLDL humana (\blacksquare), LDL (\Box), HDL (\blacktriangle), LDL tratadas con pronasa (\circ) o LDL modificadas con cuclohexanodiona (LDL-chd, \bullet).

Figura 18: Efecto del oleato, de RAP-39, de los anticuerpos anti-LSR y de la cloroquina sobre la degradación específica de la leptina de hígado de rata retenida sobre columna de cromatografía de afinidad que contiene leptina.

Figura 20: Aclaramiento de la ^{125}I-leptina sobre ratones testigo (\Box), ob/ob (\blacksquare) y db/db (

\tre

) en el hígado y el riñón. Los resultados se expresan como la diferencia entre las cantidades de ^{125}I-leptina y ^{125}I-\beta2-microglobulina que se encuentran en el hígado y el riñón.

Figura 21: Número aparente de receptores LSR expresados en el hígado de ratones testigo, ob/ob, y db/db.

Figura 22: Efecto de los anticuerpos anti-LSR sobre la proporción entre las cantidades de ^{125}I-leptina distribuidas en el hígado y el riñón.

Figura 23: Efecto de concentraciones crecientes de leptina sobre la actividad LSR de hepatocitos de rata en cultivo primario. Los resultados representan las diferencias de actividad obtenidas entre las células incubadas y sin oleato en presencia, ya sea de ^{125}I-LDL o de ^{125}I-VDL.

Figura 24: Capacidad de inducción por parte de la leptima de la actividad LSR de hepatocitos de rata en cultivo primario.

A. Número aparente de receptores expresado en la superficie de los hepatocitos en presencia o ausencia de leptina, estimado por la medición de la cantidad de ^{125}I-LDL fija en presencia de oleato.

B. Efecto de la cicloheximida, la colchicina y la citocalastina B sobre la inducción mediante leptina de la actividad LSR.

Figura 25: Efecto de la leptina sobre la respuesta lipémica postprandial en los ratones testigo (\circ), ob/ob (\blacksquare) y db/db (\Box), reflejada por la evolución de la concentración plasmática en triglicéridos (TG) luego de la ingesta de una comida rica en grasas, con (B) y sin (A) una inyección de leptina recombinante murina.

Figura 26: Efecto de la leptina, en presencia y ausencia de lactoferrina, sobre la respuesta lipémica postprandial de ratón ob/ob, expresada por la medida de la concentración plasmática en triglicéridos (TG) luego de la ingesta de una comida rica en grasas.

Figura 27: Efecto de la inyección de leptina sobre el número aparente de receptores LSR expresados en el hígado de ratón ob/ob y db/db.

Figura 28: Respuesta lipémica postprandial y actividad LSR en los ratones testigo (C57BL6), ob/ob y db/db.

A- Peso de los ratones macho, ob/ob y db/db.

B- Respuesta lipémica postprandial de ratón testigo, ob/ob y db/db.

C- Número aparente de receptor LSR estimado para la medida de fijación de LDL y expresado en unidad arbitraria por comparación con la actividad 5'-nucleosidasa en cada preparación de membrana plásmica.

D- Northern blot sobre un extracto de ARN totales de hígado. El GAPDH se utiliza como control.

Figura 29: Efecto de un tratamiento a largo plazo con leptina sobre ratones ob/ob.

A- Cambio de peso en 30 días.

B- Respuesta lipémica postprandial al día 29 del tratamiento.

C- Número aparente de receptores LSR al día 30, estimado por medición de fijación de LDL y expresado en unidad arbitraria por comparación con la actividad 5'-nucleotidasa en cada preparación de membrana plásmica.

Figura 29: Efecto de un tratamiento a largo plazo por leptina a ratones ob/ob.

A- Cambio de peso en 30 días.

B- Respuesta lipémica postprandial al día 29 del tratamiento.

D- Análisis en Northern blot de la expresión de LSR establecida sobre un extractor total de ARN de hígado. GAPDH y actina se utilizan como controles.

Figura 30: Efecto de los oleatos de fijación e internalización de los ^{125}I-LDL en fibrolastos humanos normales, en condiciones normales.

Figura 31: Efecto de concentraciones crecientes de leptina sobre la actividad LSR de fibroblastos humanos FH (hipercolesterolemia familiar).

Figura 32: Efecto inhibidor de anticuerpos dirigidos contra un péptido NH_{2}-terminal (\blacksquare), o COOH-terminal (\circ) de gC1qR o de anticuerpos controlados (\Box) sobre la actividad de LSR de membranas plásmicas de hepatocitos de rata, expresada en porcentaje de la cantidad de ^{125}I-LDL fijada en ausencia de anticuerpo.

\newpage

Figura 33: Efecto de concentraciones crecientes de C1q sobre la fijación, internalización y degradación de ^{125}I-LDL sobre los hepatocitos de rata en cultivo primario, en presencia (\blacksquare) o ausencia (\Box) de oleato.

Figura 34: Efecto de 25 ng/ml de AdipoQ recombinante sobre la actividad LSR en un cultivo primario de hepatocitos de rata.

Figura 35: Efecto de dos inyecciones sucesivas de 1 mg de AdipoQ sobre la respuesta lipémica postprandial en la rata luego de la ingestión de una comida rica en grasas.

Figura 36: Efecto de una administración intraperitoneal de AdipoQ durante 3 días sobre el peso y las concentraciones en triglicéridos plasmáticos de ratas bajo régimen normal o régimen graso.

Figura 37: Efecto de una inyección diaria de 100 \mug de AdipoQ durante 5 días, sobre la ingesta de alimentos en ratones obesos ob/ob y db/db.

Ejemplos Procedimientos experimentales Material

Se obtiene Na^{125}I de Amersham (Les Ulis, Francia). El ácido oleico, la albúmina bovina sérica (A 2153) (BSA) y el Triton X-100 provienen de Sigma (St Quentin Fallavier, Francia). La lactoferrina humana (Serva) y la heparina sódica fueron proporcionadas por Biowhittaker (Fontenay sous Bois, Francia) y los laboratorios Choay (Gentilly, Francia), respectivamente. Los kits enzimáticos para la determinación de triglicéridos fueron suministrados por Boehringer Mannheim (Meylan, Francia). La suramina sódica se obtuvo de CBC Chemicals (Woodburg, CT). El medio Dulbecco, Eagle modificado (DMEM), la tripsina y el suero bovino fetal se adquirieron de Life Technologies, Inc. (Eragny, Francia).

Animales

Los ratones C57BL/6J tipo salvaje, C57BL/6J ob/ob, C57BL/Ks tipo salvaje y C57BL/Ks db/db se obtuvieron de R. Janvier Breeding Center (Le Genest St. Isle, Francia).

Células

Los fibroblastos normales (GMO8333) y FH (GM00486A, GM007001B, GM00488C) fueron proporcionados por NIGMS human genetic mutant cell repository (Camden, NJ). Las células se disponen en cajas de Petri de 36 mm como se describe anteriormente (300.000 fibroblastos normales por pocillo, 150.000 fibroblastos FH por pocillo) y se cultivan en una incubadora a CO_{2} humidificada, en medio DMEM que contiene 10% (fibroblastos normales) o 20% (fibroblastos FH) de suero bovino fetal, 2mM glutmanina, 100 u/ml de penicilina y 100 u/ml de estreptomicina.

Los hepatocitos en cultivo primario se obtienen siguiendo el protocolo descrito anteriormente (Mann et al., 1995). Las células se disponen entonces a 900.000 células por pocillo o 22x10^{6} células por vial de 165 cm^{2}. Las células se utilizan para los estudios después de 48 horas en cultivo.

Preparación y radiomarcado de las lipoproteínas

Las VLDL (d < 1,006 g/ml) y LDL (1,025 < d < 1,055 g/ml) se aíslan mediante ultracentrifugación secuencial de plasma fresco de voluntarios (Bihain et Yen, 1992; Golstein, et al., 1983) y se utilizan antes de 2 semanas. Las lipoproteínas se radioetiquetan (Bilheimer et al., 1972) y se utilizan menos de una semana luego del marcado. Se filtran ^{125}I-LDL y ^{125}I-VDL (membrana de 0,22 \mum, Gelman) inmediatamente antes de la utilización.

Preparación y radiomarcado de la leptina recombinante de ratón

El ADNc de leptina se obtiene a partir del ARNm de tejido adiposo de ratón C57BL/6J por PCR. El cebador 5' de PCR introduce un codón de iniciación luego de la secuencia señal que se somete a deleción y una secuencia que codifica una terminación hexahistidina. La secuencia modificada que codifica la leptina murina se clona en un vector de expresión pSE280 (Invitrogen, Francia) y se expresa en E.Coli. El secuenciamiento del ADN del plásmido confirma la secuencia codificante. Las bacterias se cultivan a 37ºC y la síntesis de la proteína se induce mediante 1mM de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida. Las bacterias, recuperadas luego de una suave centrifigación, se someten a lisis por congelación-descongelación y se digiere el ADN mediante una desoxiribonucleasa I. Las membranas celulares se extraen con ayuda de detergente y los cuerpos de inclusiones se separan luego de la centrifugación. Luego de 3 lavados en desoxicolato de sodio al 1% en PBS, los cuerpos de inclusión se solubilizan en una solución de guanidina-HCl 6M. La renturalización de la proteína recombinante se realiza por dilución al 1/100 en PBS. La proteína renaturalizada se purifica entonces y se concentra sobre columna de cromatografía de afinidad metal quelato al níquel (Probond, Invitrogen). La elusión se lleva a cabo mediante imidazol. Se controla la pureza de la leptina recombinante mediante electroforeris SDS-PAGE y su actividad para la evaluación de la saciedad en los ratones C57BL/6J ob/ob luego de la inyección intraperitoneal de 25 \mug de leptina. La leptina recombinante se radiomarca utilizando lodo-Beads (Pierce) y de acuerdo con el método indicado por el fabricante.

Clonación del ARNm de AdipoQ. Producción y purificación de proteínas AdipoQ recombinante Clonación del ADNc en un vector de expresión

Se obtiene tejido adiposo de ratón a partir de un ratón C57BI/6J y se extrae el ARNm con ayuda de polydT fijados sobre cuentas magnéticas (Dynabeads, Dynal, Francia). Se construye un banco de ADNc a partir del tejido adiposo de ratón por trascripción inversa 40ºC utilizando un kit comercial (Superscript Life Technologies) siguiendo las instrucciones del vendedor. Se amplifica el ADNc específico de AdipoQ utilizando los dos cebadores siguientes:

5' CTACATGGATCCAGTCCATGCCGAAGAT 3' (SEQ ID 37)

5' CGACAACTCGAGTCAGTTGTTATCATGG 3' (SEQ ID 38)

El producto de amplificación se digiere entonces por las enzimas de restricción BamH1 y Xho1 y se inserta en un vector de expresión pTRC HisB (Invitrogen, Francia) en los sitios correspondientes. La versión B de pTRC permite la expresión de secuencias heterogenias por debajo de un péptido hexahistidina que incluye un sitio de reconocimiento para una Enteroquinasa y un epítope para el anticuerpo anti-Xpress.

Transfección bacteriana y verificación de la construcción

El plásmido obtenido de esta forma se transfecta en E. Coli DII \alpha. Además, el ADN del plásmido se extrae y el inserto heterólogo se secuencia.

Cultivo celular, extracción y purificación de la proteína recombinante

Las células bacterianas recombinantes se cultivan a 37ºC en un medio LB que contiene antibióticos hasta que la DO a 600 nm alcance 0,2. La producción de proteína recombinante se induce entonces agregando 1 mM de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida al medio de cultivo. El cultivo bacteriano se extiende durante 16 h a 37ºC. Las células se recuperan mediante centrifugación. La lisis de las células se efectúa utilizando lisozima en un tampón Tris pH 7,4 en presencia de NaCl PMSF y desoxicolato de sodio. El ADN se degrada por sonicación. Luego de centrifugar, la proteína recombinante se separa del sobrenadante mediante una columna Probond (Invitrogen, Francia). Esta columna presenta níquel cargado que tiene una afinidad para los péptidos hexahistidina. La elusión se efectúa en presencia de imidazol. La concentración proteica se estima por el método de Lowry luego de haber dializado el producto de elusión. La pureza de la proteína obtenida se evalúa mediante electroforesis SDS PAGE, que revela una banda única.

Ejemplo 1 Identificación del complejo proteico responsable de la actividad LSR: purificación parcial y caracterización al medio de anticuerpos policlonales

La técnica de los ligandos blottinh se utilizó para determinar el complejo proteico responsable de la actividad LSR. Esta técnica, descrita detalladamente por Mann et al., 1995, se detalla a continuación.

Transferencia de ligando

La técnica consiste en aislar por centrifugación diferencial (Belcher et al., 1987) las membranas de hígado de rata y solubilizar las proteínas membranales en una solución que contiene 125 mM de octilglucosida, 200 mM Tris y 2 mM EDTA pH8. Las proteínas solubilizadas de esta forma se separan en condiciones no desnaturalizantes sobre un gel (espesor de 5 mm) SDS preparativo formado de un gradiente de 4 a 12% de poliacrilamida (35-50 mg de proteína por gel). Para una parte del gel, las proteínas se electrotransfieren (transferencia semiseca, 21V, 45 min, Biorad) sobre una membrana de nitrocelulosa. Luego del bloqueo de los sitios libres de esta membrana en una solución de PBS que contenía albúmina al 3%, la membrana se incuba con 40 \mug/ml en ^{125}I-LDL en presencia (Figura 8, línea 2) o ausencia (Figura 8, línea 1) de oleato a 0,8 mM. La membrana se lava entonces cinco veces 10 min en PBS que contenía aproximadamente 0,5% (v/v) de TritonX100, y se expone sobre una pantalla de Phosphor Imager.

El análisis de la imagen obtenida en presencia (Figura 8, línea 2) o ausencia (Figura 8, línea 1) de oleato evidencia la presencia de 3 bandas principales que fijaron la LDL. El PM aparente de la primera banda es de aproximadamente 240 kDa, el de la segunda es de 115 kDa y el de la tercera es de 90 kDa. Sobre la base de estas observaciones, se proponen dos hipótesis: por una parte la actividad LSR está vinculada a la presencia de varias proteínas distintas; por otra parte, el mismo tipo de imagen puede explicarse mediante una organización multinumérica de un complejo proteico.

Con el fin de verificar esta hipótesis, los inventores emprendieron la purificación de la banda que presenta el peso molecular aparente más elevado (240 kDa). La purificación parcial de este proteína designada como "banda A" se realiza por electroforesis preparativa como se indica a continuación.

Purificación parcial del LSR

La técnica consiste en aislar por centrifugación diferencial (Belcher et al., 1987) las membranas de hígado de rata y en solubilizar las proteínas membranarias en una solución que contenía 125 mM de octilglucosida, 20 mM Tris y 2mM EDTA pH8. Las proteínas solubilizadas de este modo se separan en condiciones no desnaturalizantes sobre un gel (espesor de 5 mm) SDS preparativo formado de un gradiente de 4 a 12% de poliacrilamida (35-50 mg por gel). Para una parte del gel, las proteínas se electrotransfieren (transferencia semiseca, 21 V, 45 min, Biorad) sobre una membrana de nitrocelulosa. Luego de bloquear los sitios libres de esta membrana en una solución de PBS que contiene albúmina al 3%, la membrana se incuba con 40 \mug/ml de ^{125}I-LDL en presencia (Figura 8, línea 1) de oleato a 0,8 mM. La membrana se lava entonces cinco veces 10 min en PBS que contenía 0,5% (v/v) de Triton x100 y se expone sobre una pantalla de Phosphor Imager. Las proteínas de interés se someten a electroelusión (Eletroeluter, Biorad).

Las proteínas de membrana plásmica de hígado se prepararon y separaron sobre gel de poliacrilamida como se explica anteriormente. La localización precisa de la banda A se estableció mediante transferencia de ligando realizada luego de electrotransferencia de muestra de gel preparativo tomado de diferentes niveles.

Los fragmentos de gel que contenían la banda A se recogen, se someten a electroelusión y se concentran (sppedvac), luego se los evalúa para medir su capacidad de fijarse en presencia de oleato luego de electroforesis y transferencia a membranas de nitrocelulosa (Figura 8, línea 3, 80 \mug de proteína/línea).

Las proteínas obtenidas de este modo también han sido utilizadas para producir anticuerpos policlonales, cuya especificidad fue evaluada por Transferencia Western (Figura 8, línea 4).

Preparación de anticuerpos policlonales

Las proteínas LSR utilizadas como antígenos para la producción de los anticuerpos anti-LSR se prepararon como se indica anteriormente.

La preparación de antígeno se inyecta en un conejo por vía subcutánea en presencia de adyuvante de Freund completo seguido por un protocolo clásico de inmunización. El título de anticuerpo dirigido contra la proteína de rata se determina regularmente (técnica por dot blot). Cuando se lo juzga suficiente, se evalúa la especificidad de los anticuerpos obtenidos mediante Transferencia Western sobre una preparación de proteínas solubilizadas de membranas de hígado de rata como las descritas anteriormente, con anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo marcados con yodo I^{125} como segundo anticuerpo.

Los resultados de Transferencia Western luego de la electroforesis en condiciones no reductoras indican que los anticuerpos producidos a partir de las proteínas de la banda A se fijan sobre 3 bandas proteicas principales (240 kDa, 115 kDa y 90 kDa) que fijan las ^{125}I-LDL en presencia de oleato (Figura 8, línea 4). Con el fin de verificar el enlace entre estos complejos proteicos y la actividad LSR, se ha evaluado el efecto de estos anticuerpos policlonales sobre la actividad LSR.

Los métodos utilizados se describen detalladamente a continuación (Mann et al., 1995; Troussard et al., 1995). La actividad de LSR se estima por medición de la fijación de las lipoproteínas sobre las membranas plásmicas y por medición de la fijación, internalización y degradación de las lipoproteínas sobre cultivos primarios de hepatocitos de rata.

Medición de la fijación de las lipoproteínas sobre membranas plásmicas

La actividad de LSR se evalúa sobre una preparación de membranas plásmicas de hígado de rata (Bartles y Hubbard, 1990). Estas membranas presentan un enriquecimiento en 5-nucleotidasa (marcador específico de las membranas plásmicas) de 10 a 15 veces. Se incuban alícuotas de 100 \mug de proteínas durante 30 minutos a 37ºC en presencia o ausencia de 0,8 mM de oleato en un volumen final de 250 \mul completado por PBS 100 mM, EDTA 2 mM, NaCl 350 mM, pH 8 (tampón A). Se agrega el oleato en un volumen de 5 a 10 \mul de isopropanol. El oleato en exceso y no fijado se elimina entonces mediante 6 lavados. Se resuspenden los residuos con 250 \mul de tampón de incubación, se sonica durante 5 segundos, a una potencia de 1,90% del ciclo activo, luego se centrífuga durante 15 min a 18.000 rpm. Las membranas activadas se incuban luego durante 1 hora a 4ºC con las diferentes concentraciones de anticuerpos y luego con 5 \mug/ml de ^{125}I-LDL (1 hora a 4ºC). Se agregan 25 \mul de BSA al 2% a la mezcla de incubación. La cantidad de ^{125}I-LDL ligadas a las membranas se mide sedimentando las membranas por centrifugación luego de haber agregado 200 \mul de la mezcla de incubación sobre una capa de 5% (P/V) de BSA en el tampón A. Los sobrenadantes se eliminan por aspiración, los fondos de los tubos se cortan y la radioactividad se mide en un medidor \gamma.

El efecto inhibidor de anticuerpo anti-LR sobre la actividad LSR, compara con el de una preparación cualquiera de inmunoglobulinas de conejo se muestra en la Figura 9 A. La inhibición de la actividad LSR por los anticuerpos anti-LSR confirma que el complejo multinumérica descrito anteriormente es responsable por la actividad del receptor y valida la técnica de transferencia de ligando utilizada para identificarlo. El efecto de los anticuerpos anti-banda A ha sido además evaluado en las otras etapas de la actividad del receptor: internalización y degradación de las lipoproteínas por el LSR expresado en la superficie de hepatocitos en cultivo primarios.

Medida de la fijación, internalización y degradación de las lipoproteínas por los hepatocitos

La actividad LSR en los cultivos primarios de hepatocitos de rata se evalúa mediante la fijación, internalización y degradación ^{125}I-LDL y ^{125}I-VLDL (LDL: lipoproteína de baja densidad; VDL: lipoproteína de muy baja densidad), como lo describen Bihain y Yen, 1992 y Mann et al., 1995.

Para medir el efecto de los anticuerpos anti-LSR sobre la fijación, internalización y degradación de las LDL por LSR, se incubaron culturas primarias de hepatocitos de rata (48 h luego de colocación) en presencia de 20 ng de leptina/pocillo durante 30 minutos a 37ºC, seguido por la adición de anticuerpo anti-LSR en presencia o ausencia de oleato. Luego de incubación a temperatura ambiente durante 30 min, se agrega ^{125}I-LDL (20 \mug/ml), y luego se incuban las células a temperatura ambiente durante 4 h a 37ºC. La fijación, incorporación y degradación de ^{125}I-LDL se evalúan como se describe en Biahin y Yen, 1992, y Mann et al., 1995.

Los datos de la Figura 9 B muestran que los anticuerpos anti-banda A inhiben la mayor parte de la actividad de fijación de las LDL con LSR presentes a nivel de los hepatocitos. Esta inhibición induce una disminución en las mismas proporciones de internalización y degradación proteolítica de las proteínas.

Los anticuerpos anti-banda A se caracterizan de este modo como anti-LSR. Su especificidad ha sido definida por un método de inmunoprecipitación selectiva. Extractos de hepatocitos en cultivos primarios se inmunoprecipitan mediante los anticuerpos anti-LSR descritos anteriormente, de acuerdo con el protocolo que figura a continuación.

Inmunoprecipitación de extractos de hepatocitos en presencia de anticuerpos específicos

Se incuban cultivos primarios de hepatocito de rata (Oukka et al., 1997) durante 60 min a dos h en presencia de una mezcla de ^{35}S metionina y ^{35}S cisteína (Promix, Amersham). Se retira el medio y se lavan las células, se las incuba en PBS que contenía 1% de Triton X100. Este lisado celular se incuba entonces en presencia de anticuerpos no específicos y luego de proteína A. Un equivalente a 40 \mug de anticuerpos específicos anti-LR se agrega entonces y los complejos LSR-anticuerpos se precipitan con ayuda de una segunda preparación de proteína A. Luego del lavado, los complejos se disocian en presencia de 1% SDS suplementado y no por 5% de \beta-mercaptoetanol, incubados a 100ºC durante 5-10 minutos y separados sobre gel de 10% de acrilamida. Los geles se secan y exponen sobre una pantalla de Phosphor Imager. Cada una de las líneas contiene el equivalente de un frasco de 165 cm^{2} o 22 X 10^{6} células.

El análisis de los resultados de inmunoprecipitación indica que en condiciones no reducidas (Figura 10, líneas 2 -sin incubación a 100ºC- y 3 -con incubación a 100ºC-), los anticuerpos revelan 3 bandas proteicas principales: 2 de peso molecular aparente 240 kDa y 180 kDa, 1 de peso molecular aparente de 68 kDa. Se notarás asimismo la presencia de 2 bandas de menor intensidad correspondiente a un peso molecular de 115 kDa y 90 kDa. Este enfoque experimental demuestra esencialmente los mismos elementos proteicos que aquellos identificados mediante el método de transferencia de ligando. Se observa además que en condiciones reducidas (Figura 10, líneas 1 y 4), los elementos de alto peso molecular se disocian en 3 elementos de pesos moleculares aparentes respectivos de 68 kDa, 56 kDa y 35 kDa.

La intensidad relativa de las bandas de 68 kDa y 56 kDa está cercana en tanto que la de la banda de 35 kDa es aproximadamente ¼ de las demás.

Ejemplo 2 Clonación del ADNc codificante de LSR \alpha y \beta

Se realizó la selección de un banco de expresión mediante anticuerpos anti-LSR descritos precedentemente, tal como se indica a continuación.

Selección de un banco de expresión

Luego de infectar bacterias mediante bacteriófagos lambda GT11 que contenían el ADNc de hígado de rata (obtenido comercialmente de Clontech Laboratories Inc (5' Strech Plus c-DNA Library), las células se colocaron en el medio LB MgSO4. Luego de 4 horas de cultivo a 42ºC, se colocó en las cajas de petri una membrana de nitrocelulosa que previamente se había incubado en una solución de IPTG 10 mM. Cuatro horas más tarde, la primera membrana se retira y se aplica una segunda membrana a la caja.

Cada membrana es sumerge en una caja de petri que contenía tampón bloqueador bajo agitación durante una hora. Luego, se agrega anticuerpo a una concentración final de 10 \mug/ml de tampón bloqueador /Huynh et al., 1984; Young et Davis, 1983a y 1983b). Las membranas se lavan luego tres veces durante 10 minutos con TNT (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 a 0,05%).

Las membranas se incuban en presencia de anticuerpo secundario (alkaline phosphatase-conjugated affinipure
F(ab')2 Fragment Goat anti-rabbit IgG; Immunotech) a una concentración final de 0,08 \mug/ml de tampón bloqueador (TNT + 5% de leche descremada en polvo, maca Pâturage).

Luego de lavar las membranas en el TNT, las mismas se incuban en presencia de BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) y de NBT (nitro-blue-tetrazolium) hasta la obtención de una coloración.

Los clones positivos se recuperan entonces en las cajas y se someten al mismo procedimiento de inmunoselección con el fin de confirmar que se trata de verdaderos positivos (selección secundaria). Eventualmente, puede efectuarse una selección terciaria. El ADN fágico de los clones retenidos, aislado a partir de un lisado bacteriano (protocolo Clontech) y digerido por la enzima de restricción EcoR1 se inserta en el sitio EcoRI del plásmido pBluescript SK+.

De este modo, se obtienen dos clones que contienen un insertor de 1,8 kb, los cuales resultaron tener secuencias idénticas. La hibridación de ARNm de hígado de rata (2 \mug de ARNm poliA+) con una sonda correspondiente al fragmento BgIII-Xbal de este inserto puso en evidencia dos bandas de tamaños respectivos de 1,9 kb y 2,1 kb (figura 11 A). El análisis por Nothern blotting, con una sonda correspondiente al fragmento Xbal-Xba de este inserto, de la distribución tisular de los mensajeros correspondientes a demostrado que se expresan preferentemente en el hígado (Figura 11 B). El Northern blotting se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo.

Northern blotting

Las membranas que contenían ARNm de diferentes tejidos de rata (Clontech) se hibridaron con fragmentos del ADNc del gen LSR y ADNc de \beta-actina humana (Clontech), marcados en dCTP[^{33}P], en tampón 5xSSPE, 10xDenhardt, 0,5% SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, 50% de formamida desionizada, a 42ºC durante 16 horas. Las membranas se lavan entonces en 2xSSC, 0,5% SDS a temperatura ambiente y en 1xSSC, 0,1% SDS a 65ºC, luego se exponen al Phosphor Imager (Molecular Dynamics).

Se reconstruyó un ADNc correspondiente a la banda de 1,9 kb por 5'RACE PCR a partir del fragmento de 1,8 kb y se secuenció.

Con el fin de dilucidar la presencia de bandas múltiples en Northern blotting, se sintetizaron varios pares de cebadores que definían los fragmentos de una secuencia de ADNc de rata, para utilizarlos como cebadores para una ampliación en PCR (Figura 11 C). Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados se enumeran a continuación:

. a: 5'-GTTACAGAATTCGCCGCGATGGCGCCGGCG-3'	(SEQ ID 20)
. b: 5'-GCCAGGACAGTGTACGCACT-3'	(SEQ ID 21)
. c: 5'-ACCTCAGGTGTCCCGAGCAT-3'	(SEQ ID 22)
. d: 5'-GAAGATGACTGGCGATCGAG-3'	(SEQ ID 23)
. e: 5'-ACCTCTATGACCCGGACGAT-3'	(SEQ ID 24)
. b': 5'-CACCACCCTGACAGTGCGT-3'	(SEQ ID 25)
. c': 5'-CTGGGGGCATAGATGCTCGG-3'	(SEQ ID 26)
. d': 5'-GCCCTGGAAGGCCTCGATCG-3'	(SEQ ID 27)
. e': 5'-CAAGTCCCTAGGATCGTCCG-3'	(SEQ ID 28)

Mientras que cada par de cebadores evidencia un fragmento único, el par bc' permite amplificar tres fragmentos de diferentes tamaños. El análisis de las secuencias de estos fragmentos permite reconstituir la secuencia de tres ADNc completos de LSR de rata, que tienen por tamaños respectivos 2097 pb (SEQ ID 1), 2040 pb (SEQ ID 3) y 1893 ob (SEQ ID 5), correspondiendo los tres a un mismo mensajero precursor por corte y empalme alternativo.

Estos tres ADNc contienen un cuadro abierto de lectura que comienza por un codón AUG en posición 219 de una secuencia de consenso Kozak (Kozak, 1987 y 1990). Los pesos moleculares previstos de las proteínas codificadas por estos tres ADNc son de respectivamente 66 kDa, 64 kDa y 58 kDa.

Los dos ADNc que codifican respectivamente las formas más larga y la más corta de LSR de rata se tradujeron luego in vitro, como se indica a continuación.

Traducción in vitro

Los ADNc están subclonados en el plásmido pcADN3; la trascripción y la traducción se llevan a cabo utilizando el kit TNT de Promega. Los productos de traducción, marcados con ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína se visualizan luego de la electroforesis en gel gradiente de poliacrilamida (10%) y exposición al Phosphor Imager.

Los pesos moleculares de los productos obtenidos, es decir 68 kDa y 56 kDa (Figura 12), corresponden de manera cercana a los de la subunidades \alpha y \beta de LSR.

Para definir si los productos de estos ARNm son responsables de la actividad del receptor, se han utilizado tres enfoques experimentales diferentes.

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Primeramente, dos péptidos correspondientes a los residuos 169-186 (SAGDLDGNNEAYAELIVLGR: SEQ ID 29) de LSR producto del ARNm con un tamaño de 2097 pb y con residuos 556-570 (EEGQYPPAPPPYSET: SEQ ID 30) se sintetizaron. Se obtuvieron anticuerpos dirigidos contra estos péptidos sintéticos de acuerdo con los protocolos indicados anteriormente. Las Figuras 13 C y 14 C muestran que estos anticuerpos antipéptido LSR presentan un efecto inhibidor sobre la fijación de las LDL a los LSR presentes en las membranas plásmicas de la rata, medida de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1.

En segundo término, una purificación parcial de las subunidades \alpha y \beta se ha obtenido por solubilización selectiva con ayuda de sarcosilo; un estudio en Transferencia Western y transferencia de ligando demostró que los elementos \alpha y \beta fijan los anticuerpos policlonales antipéptido LSR (Figura 13 B, línea 2 y Figura 14 B, línea 2) y las LDL luego de la incubación con oleatos (Figura 13 B, línea 4). La transferencia de ligando se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1; la transferencia Western se llevó a cabo como se indica a continuación.

Transferencia Western

Se prepararon cultivos primarios de hepatocitos como se indica en "Procedimientos experimentales". Las células recogidas luego de 48 horas de cultivo se lavan y lisan con PBS que contenía 1% de Triton X100. Los lisados se colocaron sobre gel SDS-PAGE 10% en estas condiciones reductoras (2% SDS, 5% \beta-mercaptoetanol y 20 mM DTT, a 56ºC durante 1 h). Luego de la transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa, se realizó la transferencia Western con anticuerpos IgC dirigidos contra el receptor LSR.

En tercer lugar, las proteínas LSR 66 y 58 marcadas obtenidas por traducción in vitro a partir de los ADNc LSR-Rn-2097 y LSR-Rn-1893 se utilizan para estimar el efecto del oleato sobre la fijación de las LDL de acuerdo con el protocolo detallado a continuación.

Fijación de las LDL sobre las proteínas de LSR expresadas in vitro ("flotación")

Los productos de traducción in vitro (17 \mul) marcados en la ^{35}S-cisteína o ^{35}S-metionina se incuban durante una hora a 37ºC en presencia de 100 \mug/ml de LDL, 1 mM de oleato en tampón A, en un volumen final de 400 \mul. Se agrega un volumen igual de BSA 8% (p/v). La densidad se ajusta a 1,21 g/ml (asumiendo una densidad original de 1,025 g/ml), con bromuro de sodio. Las muestras se colocan entonces sobre una solución de bromuro de sodio a 1,063 g/ml, luego se centrifugan durante 20 horas a 4ºC (rotor Beckman SW41). Un volumen de 1 ml se recoge en la superficie, se dializa con un tampón de elusión de electroforesis y se cuenta la radioactividad (contador \beta Beckman).

El oleato aumenta la fijación de la LDL a los LSR 56 (respectivamente LSR 68) por un factor 2 (5 respectivamente). De este modo se demuestra que las subunidades \alpha y \beta del LSR de rata codificadas respectivamente por los ADNc LSR-Rn-2097 y LSR-Rn-1893 (LSR 56 y LSR 68), fijan las LDL preferentemente luego de la incubación con oleato.

El conjunto de estos resultados indica que los ADNc LSR-Rn-2097 y LSR-Rn-2040 codifican dos proteínas indistinguibles por electroforesis y cuyo peso molecular aparente es de 68 kDa; estas proteínas corresponden a la banda que incluye a las subunidades \alpha a y \alpha' de LSR identificadas luego de inmunoprecipitación en condiciones reducidas. La subunidad \beta de LSR es probablemente el producto de traducción del ADNc LSR-Rn-1893. Los análisis de estequiometría luego de la inmunoprecipitación indican que el complejo multinumérico de peso molecular aparente de 240 kDa es el resultado de una unión de una subunidad \alpha con tres subunidades \beta. El análisis de los diferentes dominios de la proteínas correspondientes a los LSR \alpha y \beta es compatible con una función de receptor lipoproteico.

Ejemplo 3 Análisis de la actividad de un receptor LSR recombinante y de sus subunidades, en células transfectadas

Los inventores han asimismo realizado la expresión de un receptor LSR recombinante en las células CHO de acuerdo con el siguiente protocolo.

Transfección por las secuencias de ADNc que codifican al receptor LSR

Con el fin de estudiar la actividad de cada una de las subunidades recombinantes de LSR, así como la actividad de un receptor reconstituido, los inventores utilizaron el plásmido de expresión pcDNA3 (No et al., 1996) para estudiar la expresión, en células animales, ya sea de ADNc que codifica la subunidad \alpha (plásmido \alpha), o de ADNc que codifica la subunidad \beta (plásmido \beta), de LSR de rata. Los cDNA de LSR se subclonaron al interior del plásmido pcDNA3 (Invitrogen), utilizando los sitios de restricción EcoRI y/o Notl. Una vez obtenidas estas construcciones se las utilizó para transfectar las células animales CHO (célula de ovario de hámster). Luego de 48 horas de cultivo, se distribuyeron células CHO (ovario de hámster chino) (CHO-K1, CCL-61, ATCC, Rockville, MD) en una placa de pocillos (Falcon) a 2,5-2,75 x 105 células/pocillo. Después de 24 h de cultivo en un medio Ham F-12 que contenía 10% (v/v) FBS, se transfectaron 2 mM de glutamina y 100 unidades/ml de penicilina y estreptomicina, un máximo de 2 \mug de plásmido/pocillos utilizando Superfect (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del proveedor (10 \mul Superfect/pocillos, 2 h a 37ºC en un medio Ham F-12 desprovisto de suero). Las placas se lavaron entonces en PBS para eliminar los reactivos de transfección, y se cultivaron las células en un medio Ham F-12 que contenía suero. La actividad LSR se midió 48 h después de la transfección de acuerdo con los protocolos detallados en el ejemplo 1. Los inventores evaluaron el efecto de una co-transfección mediante los plásmidos \alpha y \beta con respecto al de una transfección mediante el plásmido \alpha solo, o el plásmido \beta solo, en tres etapas de la actividad del receptor LSR de acuerdo con los protocolos detallados a continuación. Las Figuras 15 y 16 muestran las comparaciones entre las actividades LSR obtenidas en las células recombinantes que expresan la subunidad \alpha solamente, o ambas \alpha y \beta; se obtuvieron resultados similares en el caso de la comparación de \beta con a + \beta, lo cual es compatible con el análisis comparable de cada una de las subunidades (cada una de las cuales incluye los sitios de fijación potenciales de los ligandos lipoproteicos y de los ácidos grasos, como el oleato).

Efecto de una transfección con el plásmido LSR (\alpha) solo, o de una cotransfección los plásmidos LSR (\alpha) y LSR (\beta), sobre la fijación, internalización y degradación de las LDL

Las células CHO-K1 se transfectaron transitoriamente con concentraciones crecientes de plásmido \alpha o se cotransfectaron con 0,4 \mug de plásmido \alpha y concentraciones crecientes de plásmido \beta. Luego de 48 h de cultivo, las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron 3 h a 37ºC con 20 \mug/ml ^{125}I-LDL en presencia o ausencia de 1 mM de oleato en DMEM que contenía 0,2% BSA, 5 mM Hepes, y 2 mM CaCl2, pH 7,5. Luego, las células se lavaron como se describe anteriormente y se incubaron a 4ºC durante 1 h con 10 mM de suramina en PBS. Para medir la fijación de las LDL (Figura 15), el medio se recuperó y se hizo pasar por un contador \gamma para evaluar la cantidad de ^{125}I-LDL enlazada. Los resultados son promedio en ambas mediciones. Para la medición de la internalización y la degradación de las LDL (Figura 16), la cantidad de ^{125}I-LDL internalizada degrada se midió de acuerdo con los protocolos detallados en el ejemplo 1.

La co-transfección con plásmidos \alpha y \beta permite establecer las tres etapas de la actividad LSR (Figuras 15 y 16).

Los inventores han asimismo observado que co-transfección con los dos plásmidos \alpha y \beta aumenta la actividad LSR con respecto a una transfección por solamente el plásmido \alpha. El hecho de que los resultados sugieran una actividad más eficaz de LSR cuando la relación rapp ([\beta]/[\alpha]) entre las concentraciones de subunidades \beta y \alpha expresada crece, es compatible con la observación de que el receptor LSR estaría constituido por la unión de una subunidad \alpha (o \alpha'), y de varias, probablemente tres, subunidades \beta.

Los resultados muestran que solamente la co-transfección de las subunidades \beta y \alpha permite la sobreexpresión de un receptor LSR totalmente funcional, en el sentido de que permite la degradación proteolítica completa de la proteína. Con el fin de caracterizar la actividad de degradación de las lipoproteínas obtenidas anteriormente en células transfectadas por los ADNc de LSR, los inventores finalmente evaluaron la capacidad de los anticuerpos anti-LSR para inhibir la fijación de las LDL tal como se mide anteriormente, así como el sustrato especificado de la misma.

Caracterización de la actividad de degradación de las lipoproteínas obtenidas en células transfectadas que expresan un receptor LSR recombinante

Las células CHO se transfectaron con los plásmidos \alpha y \beta, en una relación de concentración de 1 a 3. La Figura 17A muestra que la actividad de fijación de las LDL obtenida en las células transfectadas (expresada con respecto a la misma actividad observada en células control no transfectadas), se inhibe de manera específica mediante los anticuerpos anti-LSR. La Figura 17B muestra la actividad de fijación de las LDL obtenida en las células transfectadas, en presencia de diversas lipoproteínas no marcadas, actuando como ligandos competitivos. Los resultados muestran una especificidad de ligando similar a la observada por la actividad LSR endógena en la rata (Mann et al., 1995); los quilomicrones de rata son los sustratos preferidos del LSR recombinantes de rara; detrás están, por orden de especificidad decreciente, las VLDL y las LDL.

Ejemplo 4 Participación de LSR en el aclaramiento de las citoquinas

El análisis de la subunidad de LSR evidencia una región rica en cisteína, que corresponde a una firma de receptor con citoquinas de tipo Tumor Necrosis Factor. El LSR se distingue sin embargo de los receptores de citoquinas por la presencia de señales que permiten la endocitosis rápida del complejo receptor/ligando (motivo clatrina). Los inventores formularon la hipótesis de que este receptor podría servir para la depuración de las citoquinas, y principalmente de la leptina; con el fin de verificar esta hipótesis, analizaron la degradación la leptina recombinante mediante hepatocitos en cultivo primario de acuerdo con el protocolo que figura a continuación.

Degradación de la leptina por hepatocitos en cultivo primario

Las células primarias de hepatocito de rata se incuban durante 4 horas a 37ºC con 20 ng/ml de ^{125}I-leptina en ausencia o presencia de 0,5 mM de oleato de 75 \mug/ml de RAP, de 200 \mug/ml de anticuerpos no específicos o anti-LSR específicos, o de 50 \muM de cloroquinina. Se recupera entonces el medio y se mide la cantidad de ^{125}I-leptina degradada.

Como lo indica la Figura 18, la degradación de la leptina mediante hépatocitos en cultivo primario se inhibe por:

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a) los anticuerpos policlonales dirigidos contra el LSR. Estos anticuerpos inhiben asimismo en las mismas proporciones la actividad LSR

b) la 39 kD Receptor Associated Protein (RAP); esta proteína bloquea la actividad LSR in vitro y retarda el aclaramiento de los quilomicrones in vivo (Troussard et al. 1995; Willow et al., 1994)

c) la cloroquina; este veneno celular impide la acidificación de las vesículas de endocitosis e inhibe la actividad de las proteasas lisosomales

d) el oleato; este ácido graso libre induce el cambio de conformación del LSR, que desenmascara el sitio de fijación de las des lipoproteínas. Esto indica que la conformación FAF (Fatty Acid Free) del LSR es probablemente solo compatible con la función de fijación seguida por degradación de la leptina. Las inmunoglobulinas no específicas no tienen efecto sobre la degradación la leptina (Figura 18).

Con el fin de verificar la fijación de la leptina a LSR, las proteínas de membrana plásmica de hígado de rata se colocaron en una columna de cromatografía de afinidad que contiene la leptina recombinante, de acuerdo con el protocolo detallado a continuación.

Cromatografía de afinidad leptina

Se utiliza una columna Hi-trap (Pharmacia): 5 mg de leptina se fijan sobre 1 ml de columna, de acuerdo con los métodos indicados por el fabricante. Las proteínas de membrana plásmica se solubilizan a partir de hígados de rata como se indica anteriormente (Mann et al., 1995), luego se someten a diálisis una noche en PBS pH 7,41 0,1% Tween 20. La columna se lava en el mismo tampón, y el extracto proteico se coloca a 0,2 ml/minuto. La columna se lava con 8 ml del mismo tampón. Paso seguido se la somete a elusión utilizando el mismo tampón suplementado de 100 mM de glicina pH 3; se neutralizan entonces 20 funciones de 500 \mul utilizando 5 \mul de PBS, 0,1% Tween 20 pH 8. Se colocan 50 \mul de cada fracción sobre la membrana de nitrocelulosa para análisis en Dot blot mediante el anticuerpo anti-LSR. Las fracciones positivas (1, 3, 4, 7 y 8) se someten a diálisis en bicarbonato de amonio 24 mM, Tween 20 0,01%, y se combinan en un speed vac en un volumen final de 300 \mul. Se analizan 40 \mul del producto final en Transferencia Western mediante el anticuerpos anti-LSR.

La Figura 19 muestra que los anticuerpos anti-LSR reconocen específicamente la subunidad \alpha que, luego de fijarse a la leptina, se recupera en el tampón glicina.

Experimentos de transfección estable de la subunidad \alpha permitirán medir la afinidad de la leptina para este nuevo receptor.

El conjunto de estos resultados sugieren que LSR representa una de las vías de degradación y eliminación de la leptina. La inyección in vivo de leptina recombinante radiomarcada demostró, tanto en ratones obesos como en ratones controlados, una velocidad de aclaramiento y una captación preferencial de la leptina en el hígado y el riñón: 50% de la dosis inyectada se encuentra a los 10 minutos en estos dos órganos. Para analizar los mecanismos de captación selectiva de la leptina, los inventores compararon las cantidades de leptina y de \beta2 microglobulina (proteína soluble de peso molecular cercano al de la leptina, seleccionada como control) presentados en el riñón y el hígado de ratones normales y de dos líneas de ratones obesos 5 minutos luego de la inyección de una misma dosis de rastreo de estas dos proteínas radio-marcadas.

Medición del aclaramiento de la leptina en los ratones

Se anestesian ratones (6-8 semanas) hembras testigo, ob/ob, o db/db, en ayuno, y reciben por la vena safena una inyección de 80 ng de ^{125}I-leptina recombinante murina o de ^{125}I-\beta2-microglobulina (Sigma, marcada para el método lodobeads, como la leptina). Cinco minutos más tarde, los animales se prefusionan con una solución salino fisiológica (15 ml, a 4ºC). Se recogen los tejidos y se cuentan para evaluar su radioactividad (contador Gamma). En algunos casos, se inyectan un anticuerpo anti-LSR o una proteína de control 30 minutos antes de la inyección de ^{125}I-leptina. Es de notar que el marcado de la leptina I^{125}I no tiene efecto sobre su actividad biológica.

Los resultados presentados en la Figura 20 muestran que la cantidad de leptina captada selectivamente por el hígado disminuye en los ratones obsesos con respecto a los de control; además, no se detectan diferencias entre las diferentes líneas en lo que respecta a la captación renal de la leptina. Los inventores midieron entonces el número de los receptores LSR en los ratones testigo, ob/ob y db/db de acuerdo con el siguiente protocolo.

Medida del número aparente de receptores LSR sobre membranas plásmicas

El número aparente de receptores LSR en membranas plásmicas se mide como lo describen anteriormente (Mann et al, 1995) por estimación de la cantidad de LDL fijada sobre una preparación de membrana plásmica. Las membranas plásmicas (100 \mug) se incuban con 1 mM oleato; luego se lavan tres veces como se indica anteriormente, se incuban 1 hora a 37ºC con 40 \mug/ml de ^{125}I-LDL. La cantidad de ^{125}I-LDL fijados a las membranas plásmicas se determina luego por conteo. Se establece un promedio sobre 3 mediciones por animal para 3 animales diferentes en cada uno de los grupos.

La Figura 21 muestra que el número de receptores LSR en animales obesos que presentan ya sea un déficit en leptina (ob/ob), es decir un déficit de ob receptor (db/db), disminuye significativamente. La disminución de la captación hepática selectiva en los ratones obesos coincide con la disminución en estos animales del número aparente de receptores LSR.

Los inventores finalmente evaluaron, de acuerdo con el protocolo mencionado a continuación, el efecto del anticuerpo anti-LSR sobre la distribución de la leptina entre hígado y riñón, 5 minutos después de la inyección de una dosis de rastreo.

Medición de la distribución de la Leptina entre hígado y riñón en presencia de anticuerpo anti-LSR

Se anestesian ratones testigo y se los inyecta intravenosamente 1 mg de anticuerpo IgG no especificado o de anticuerpo IgG anti-LSR. Luego de 30 minutos, se inyectan 80 ng de ^{125}I-leptina y, transcurridos 5 minutos, una perfusión de solución salina fisiológica a 4ºC. Se recogen los tejidos inmediatamente y se mide la radioactividad. Los resultados representan el promedio y la desviación estándar obtenidos para 3 animales en cada uno de los grupos.

Como lo muestra la Figura 22, la captación hepática de la leptina disminuye, y la captación renal aumenta a través del anticuerpo anti- LSR, en comparación immunoglobulinas de control.

Estos resultados indican entonces que LSR es responsable de la captación hepática selectiva de la leptina y que una disminución del número de receptores se observa en los animales obesos. Una disminución de este tipo puede explicar el síndrome de resistencia a la leptina y el aumento de la concentración plasmática de la leptina que se observa en la mayoría de los sujetos humanos obesos.

Asimismo, es posible que el receptor LSR sirva de vía de degradación para otras citoquinas, principalmente las producidas por el tejido adiposo. Se tendrá particularmente en cuenta la importancia del Tumor Necrosis Factor \alpha y del Nerve Growth Factor. Estas dos citoquinas ejercen un efecto adelgazante importante cuando se las inyecta en individuos humanos (Citokines and their receptors, 1996).

Ejemplo 5 Control de la actividad LSR por las citoquinas

La subunidad \alpha del receptor LSR fija la leptina y posee sitios potenciales de fosforilación. Esto produce un receptor que no solo media la endocitosis sino que podría servir además en la señalización celular.

Los inventores han evaluado la hipótesis de acuerdo con la cual la leptina modula la actividad del LSR, tal como se describe anteriormente.

Medición de la actividad LSR de fijación, internalización y degradación de las lipoproteínas en presencia de leptina

Los hépatocitos de rata en cultivo primario se incuban a 37ºC durante 30 min a una concentración creciente de leptina, luego se incuban a 37ºC durante 4 horas con ya sea 50 \mug/ml de ^{125}I-LDL (actividad específica: 209 c\muM/ng) o 50 \mug/ml de ^{125}I-VLDL (actividad específica: 157 c\muM/ng) en ausencia o en presencia de 500 \muM de oleato. Se lavan entonces las células y se miden las cantidades de ^{125}I-lipoproteínas fijadas, incorporadas y degradadas como se describe precedentemente en el ejemplo 1 (Bihain et Yen, 1992). Los resultados de la Figura 23 representan las diferencias obtenidas entre las células incubadas con o sin oleato. Cada punto representa el promedio de 3 mediciones. La desviación estándar de cada punto esta comprendida en el símbolo.

El agregado de concentraciones crecientes de leptina a hepatocitos en cultivo aumenta la fijación, internalización y degradación de las VLDL y LDL (Figura 23).

Análisis de la capacidad de inducción por la leptina de la actividad LSR Medición, en presencia de leptina, del número aparente de receptores LSR expresados en la superficie de hepatocitos de rata en cultivo primario

Se incubaron cultivos primarios de hepatocitos de rata durante 30 min a 37ºC en presencia o ausencia de 20 ng/ml de leptina, 10 min a 37ºC en presencia de 0,8 mM de oleato. Las células se lavan con tampón PBS enfriado previamente a 4ºC, luego se incuban 2 horas a 4ºC en presencia de concentraciones crecientes de ^{125}I-LDL. Luego se lavan las células, se la lisa se miden la cantidad de ^{125}I-LDL fijada.

Efectos comparados de la leptina en presencia de cicloheximida, colchina y citocalasina B

Las condiciones iniciales son idénticas a las descritas anteriormente; luego de incubar con la leptina, se incuban las células durante 30 min a 37ºC con 5 \muM de cicloheximida, 5 \muM de colchina o 2,5 \muM de citocalasina B. Las células se incuban entonces 10 min a 37ºC en presencia de 0,8 mM de oleato. Las células se lavan con tampón PBS enfriado previamente a 40ºC, luego se incuban 2 horas a 4ºC en presencia de 50 \mug/ml de ^{125}I-LDL. Se toman dos mediciones y se presentan los resultados promedio.

De este modo se demuestra que el aumento de la actividad LSR mediante la leptina se obtiene mediante un aumento del número de receptores expresados en la superficie obtenido mediante un aumento del numero aparente de receptores expresados en la superficie de los hépatocitos (Figura 24 A). Este aumento resulta por una parte de un incremento de la síntesis proteica (está parcialmente inhibida por la cicloheximida, inhibidor de la síntesis proteica). Implica por otra parte la movilización de vesículas de endocitosis por parte del sistema de microtúbulos (está efectivamente inhibida por la citocalasina B que bloquea el transporte microtubular) (Figura 24 B).

Con el fin de verificar in vivo el efecto de la leptina sobre la actividad LSR, los inventores han caracterizado la respuesta trigliceridémica postprandial de los ratones de control, ob/ob y db/db, luego de una comida de pruebas por sonda de acuerdo con los protocolos siguientes.

Medición de la respuesta lipémica postprandial en el ratón

Ratones controlados, ob/ob y db/db en ayunas desde la noche anterior se alimentan con sondas utilizando una comida muy rica en grasa [60% de grasa (ácidos grasos saturados 37%, monoinsaturados 27% y poliinsaturados 36%), 20% de proteínas y 20% de hidrato de carbono] que proporciona 56 kcal de energía / kg de peso del animal. Inmediatamente después de la ingesta (tiempo = 0 hora) se inyecta por vía intravenosa a los ratones 200 \mul de solución salina fisiológica. A diferente tiempo, se recoge en tubos que contienen 90 \mug de EDTA disódico, 20 \mul de sangre por la vena caudal, y luego de la separación del plasma por centrifugación se determina la concentración plasmática en triglicéridos con ayuda de un kit de dosificación enzimática. Cada punto de las curvas presentadas corresponde al promedio con separación-tipo obtenido para 3 mediciones por animal y para 3 animales diferentes.

Medición del efecto de la leptina sobre la respuesta lipidémica postprandial en los ratones

El procedimiento es el mismo que se indica más arriba, a excepción de que inmediatamente luego de la ingesta (tiempo = 0 hora), se inyecta por vía intravenosa a los ratones, ya sea 200 \mul de solución salina fisiológica, o 200 \mul de una solución que contenía 50 \mug de leptina recombinante murina.

Medición de la respuesta lipímica postprandial en los ratones en presencia de lactoferrina y/o de leptina

Ratones ob/ob, en ayuno desde la noche anterior, se sondan con una comida idéntica a la descrita anteriormente. Inmediatamente después de la ingesta (tiempo = 0 hora), se inyecta a los ratones por vía intravenosa 200 \mul de solución salina que contenía ya sea suplemento, o 0,5 \mug de leptina, o 2,5 mg de lactoferrina o una mezcla de 0,5 \mug de leptina y de 2,5 mg de lactoferrina. La sangre se recoge entre 2 y 3 horas después de la comida y la concentración plasmática en triglicéridos (TG) se mide. Los valores obtenidos representaban el promedio con separación-tipo obtenido para 4 mediciones por animal y para 2 animales diferentes [p < 0,02 (ob/ob comparado con ob/ob + leptina), p <0,01 (ob/ob comparado con ob/ob + lactoferrina), NS (ob/ob + lactoferrina comparado con ob/ob + leptina + lactoferrina)].

De acuerdo con la reducción del número de receptores LSR observado en los ratones obesos, una amplificación de la respuesta lipidémica postprandial se observa asimismo en los ratones obesos no tratados. La administración de leptina por vía intravenosa al mismo tiempo que la comida de pruebas permite reducir la respuesta lipémica postprandial en las dos líneas de ratones obesos y en los ratones de control (Figura 25).

La disminución de la respuesta lipémica por parte de la leptina se suprime mediante la administración de lactoferrina (Figura 26), que bloquea la actividad del LSR (Yen et al., 1994; Mann et al., 1995). Ello sugiere fuertemente que la disminución de la respuesta se explica por un aumento de la actividad LSR.

Finalmente, también in vivo, la administración de la leptina induce un aumento del número aparente de receptores LSR expresados a nivel de la superficie de los hépatocitos. Este aumento es importante, tanto en los ratones ob/ob como en los ratones db/db (Figura 27).

La leptina y probablemente otras citoquinas son entonces reguladores de la actividad de LSR. Un síndrome de resistencia a la leptina, o a otras citoquinas puede ocasionar una hipertrigliceridemia, ya sea permanente o limitada a la fase postprandial.

Ejemplo 6 Efecto de la leptina sobre la expresión del LSR; incidencias terapéuticas

Con el fin de reforzar la correlación entre la administración de leptina, la disminución de la respuesta lipémica postprandial, y una expresión o actividad incrementada del receptor LSR, y considerar mejor las implicaciones eventuales terapéuticas de la inducción de la actividad de aclaramiento hepático de las lipoproteínas por la leptina, los inventores complementaron los análisis precedentes con un seguimiento de la evolución del peso, la actividad LSR y la expresión de ARNm de LSR, en los animales de control u obesos, tratados o no con leptina.

Respuesta lipémica postprandial y actividad LSR en los ratones testigos y obesos

Ratones machos de control (C57BL6) (n=8), y obesos (ob/ob, n=8 animales deficientes a nivel del gen de la leptina y db/db, re=8 -animales deficientes a nivel del gen del receptor a la leptina-) (de 17 semanas de edad) se pesaron con el fin de establecer de manera cuantitativa las diferencias en peso entre las líneas (Figura 28A). Las respuestas lipémicas postprandiales de los animales de cada línea se midieron en ausencia de tratamiento por la leptina como se describe anteriormente. El número aparente de receptores LSR expresado en la superficie de las células hepáticas se midió para 4 animales de cada línea, como se describe anteriormente, y expresado en comparación con la actividad 5'-nucléotidasa (medida enzimáticamente de manera selectiva a nivel de las membranas plásmicas; kit Sigma). Finalmente un Northern blotting ha permitido estimar el nivel de expresión del receptor LSR en tres animales de cada línea, siguiendo el protocolo descrito anteriormente.

La respuesta lipémica postprandial más elevada en los animales obesos (Figura 28B) está de acuerdo con el número aparente más bajo de receptores LSR hepáticos en estos mismos animales (Figura 280). Además, los resultados de Northern blotting (Figura 28D) indican que esta disminución del número aparente de receptores LSR en los animales obesos se acompaña de una disminución de la tasa de expresión de dicho receptor en los mismos animales. Los inventores han demostrado que efectivamente, se constata una disminución del número de ARNm que codifica el receptor LSR en los ratones obesos ob/ob y db/db.

Los inventores han estudiado asimismo el efecto de un tratamiento a largo plazo de la leptina en ratones ob/ob (Figura 29).

Efecto de un tratamiento a largo plazo de leptina en ratones ob/ob

Los ratones obesos ob/ob reciben una inyección diaria, ya sea de leptina, ya sea por un volumen equivalente de PBS estéril, durante 30 días. Las dosis inyectadas son de 50 \mug/animal del día 0 al 4, 100 \mug/animal del día 5 al 17, y 150 \mug/animal del día 18 al 30. Se midieron varios parámetros indicados a continuación:

- el peso (Figura 29 A): el cambio de peso se mide para 6 animales, sobre la duración de dicho tratamiento;

- la respuesta lipémica postprandial (Figura 29 B): se mide de acuerdo con el protocolo detallado en el ejemplo 5 en 3 animales en cada grupo, al día 29.

- el número aparente de receptores LSR (Figura 29 C): se mide de acuerdo con el protocolo detallado en el ejemplo 4 en tres animales de cada grupo, al día 30.

- la cantidad de ARNm de LSR (Figura 23 D): se estima por Northern blot como se indica en el protocolo del ejemplo 2.

Los inventores han constatado de este modo una pérdida muy importante de peso en los ratones obesos ob/ob tratados 30 días con leptina. Además, el tratamiento con leptina provoca una disminución neta de la respuesta lipémica postprandial. Esta disminución de la respuesta lipémica está correlacionada con un aumento del número aparente de receptores LSR en la superficie de las células y con un aumento de la cantidad de ARNm que codifica las subunidades del receptor LSR.

Estos resultados establecen in vivo que LSR representa la etapa limitante de la depuración de los lípidos alimenticios. Además, el tratamiento de la obesidad que induce una pérdida de peso, provoca un aumento de la actividad de degradación hepática de los lípidos alimenticios, y una disminución de la respuesta lipémica postprandial.

Ejemplo 7 Caracterización del receptor LSR humano Análisis en Northern blot

Se utilizaron sondas nucleicas de LSR de rata para llevar a cabo Northern blots con una membrana (Human Multiple Tissue Northern Blot, -Clontech #7760-1) que incluían ARNs poli A de Corazón, Cerebro, Placenta, Pulmón, Hígado, Músculo esquelético, Riñón y Pancréas humanos. Una banda de aproximadamente 2 kpb se pone en evidencia en hígado y el riñón. La cuantificación aproximativa de los resultados de hibridación indica que el receptor LSR se expresó en el hígado al menos 5 veces más que en el riñón.

Clonación del cDNA; estudio de la zona de corte y empalme

Las experiencias de transcripción inversa-PCR sobre ARNm han permitido determinar con mayor precisión el tamaño del exón 1 del lado 5' y los sitios de corte y empalme entre los exones 1 y 2. Sin embargo, no es seguro que este extremo constituya el comienzo del exón. Además, existe un segundo sitio de iniciación en el exón 1 que se encuentra más arriba del primero y que presenta una probabilidad mayor que este. El corte y empalme entre los exones 1 y 2 era diferente entre el ARN humano y de la rata.

La amplificación se realizó con varios pares de cebadores:

a: 5'-ATGCAACAGGACGGACTTGGA-3'	exón 1	(SEQ ID 31)
b :5'-TCAGACGACTAAACTTTCCCGACTCAGG-3'	exón 10	(SEQ ID 32)
c: 5'-CTACAACCCCTACGTTGAGT-3'	exón 2	(SEQ ID 33)
d: 5'-TCGTGACCTGACCTTTGACCAGAC-3'	exón 3	(SEQ ID 34)
e: 5'-CCTGAGCTACTCCTGTCAACGTCT-3'	exón 6	(SEQ ID 35)
f: 5'-AGGCCGAGATCGCCAGTCGT-3'	exón 9	(SEQ ID 36)

La amplificación realizada con el par de cebadores ab condujo a dos productos de tamaño 1,8 kb y 2 kb luego de la separación sobre gel de electroforesis. Pudiéndose explicar el tamaño de estos productos mediante un corte y empalme alternativo similar al descrito en la rata, se dibujaron los demás cebadores de amplificación. Estos cebadores permitieron evidenciar las tres formas de ADNc resultante del corte y empalme del ARN.

El primer ADNc que contiene la totalidad de los diez exones se llama LSR-Hs-2062 y corresponde a la SEQ ID 7. Corresponde al ADNc de rata LSR-Rn-2097. El segundo ADNc contiene los exones 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, y se denomina LSR-HS-2005. Corresponde a la SEQ ID 9. Este ADNc corresponde al ADNc de rata LSR-Rn-2040. Finalmente, el ADNc que contiene los exones 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 y 10 se llama LSR-Hs-1858 y su secuencia está listada en la SEQ ID 11. Corresponde al ADNc de rata LSR-Rn-1893.

Deberá notarse que un desliz del sitio corte y empalme puede ponerse en evidencia en la frontera del exón 8. Este desliz del sitio de corte y empalme puede ponerse en evidencia en la frontera del exón 8. Este desliz, del triplete TAG en la posición 19953-19955 de SEQ ID 19 al triplete contiguo AAG en posición 19956-19958 de SEQ ID 19, resulta en la parida del residuo Glu en la posición 386 del ADNc de SEQ 108.

Las secuencias de las proteínas codificadas por los ADNc LSR-Hs-2062, LSR4Is-2005 y LSR-Hs-1858 corresponden respectivamente a las SEQ ID 8, 10 y 12. Las secuencias proteicas biológicas pueden comenzar en el primer codón ATG observado en la fase de lectura (posición 35 de la secuencia proteica). Sin embargo, el codón de iniciación de la traducción preferido se encuentra más por debajo de la posición 83 de la secuencia proteica. Además, es completamente posible que el codón iniciador esté por encima de la región 5' del exón 1 no determinado aún o en un exón eventual precedente al mismo.

Finalmente, la Figura 3 presenta una representación esquemática de las diferentes formas de proteínas evidenciadas en el hombre indicando los restos conservados.

Este análisis permite concluir que existen, en el hombre, tres unidades \alpha, \alpha' y \beta de LSR equivalentes a las formas LSR 66, LSR 64 y LSR 58 de rata.

Identificación y aislamiento de la secuencia genómica LSR humana

Una selección de los bancos de datos de secuencias nucléicas públicas (Genebank, version 101) al igual que la secuencia de Iisch7 de ratones (Nº Acceso:U49507) que la de LSR-2097 de rata aislado por los inventores permitió aislar dos secuencia de ADN genómico humano. Se trata de cósmidos cuyos números de acceso son AC002128 y AD000684, de tamaños respectivos 45.328 pb y 41.936 pb. Estos dos cósmicos se recubren parcialmente. El extremo 3' del cósmido AC002128 se superpone con 12838 pb en el extremo 5' del cósmico AD000684. Sobre la porción 12.838 pb, las secuencias son idénticas a 100%, dejando de lado dos deleciones en las posiciones 822 y 3170 del cósmico AD00684. El gen de LSR humano se reparte sobre los dos cósmidos. Para facilitar el estudio de este renglón, se ha reconstituido una secuencia completa: los 45 328 pb del cósmico AC002128 se han agregado a la secuencia del cósmico AD000684 comprendida entre la base 12 839 y la base 41 936. En conjunto constituye una secuencia de
74 426 pb. Se extrajo una secuencia genómica que cubre el gen de LSR (SEQ ID 19).

Los exones putativos del gen LSR se determinaron luego del alineamiento de la secuencia descrita anteriormente con las secuencias de los ARNs de Lisch7 de ratón y de LSR de rata. La validez de los sitios de corte y empalme de parte y de otro de los exones se ha verificado.

Por otra parte, un banco genómico humano constituido por BACs se ha seleccionado siguiendo los métodos descritos por Chumakov et al., 1995; los clones así aislado eran contiguos y subclonados, para secuenciarse luego con el fin de obtener la secuencia genómica humana que codifica el LSR (SEQ ID 41).

Ambas secuencias así obtenidas (SEQ ID 19 y 41) portan divergencias menores, mencionadas en los listados adjuntos.

Ejemplo 8 Actividad en el hombre

Se obtuvieron cultivos primarios de fibroblastos humanos aislados a partir de individuos que presentan una deleción que afecta al promotor y el primer exón del gen del receptor DLD.

La incubación de estas células en presencia y ausencia de oleato muestra que el mismo indujo una actividad de fijación, internalización y degradación de las LD, que sigue una cinética de saturación (Bihain et Yen, 1992). La afinidad de este receptor intuida por el oleato es máxima para las partículas ricas en triglicéridos (VLDL y quilomicrones) así como para partículas de trioleína y fosfatidilcolina suplementadas con la apoproteína E recombinante. La afinidad de las LDL con el receptor es menor a la de las VLDL y los quilomicrones pero sin embargo es más elevada que la de las partículas de trioleína, fosfatidilcolina que no contiene ApoE, o las de VLDL aisladas a partir de un individuo que presenta una hiperlipidemia de tipo III y el fenotipo E2/2 de Apo E (Yen et al., 1994).

La actividad del LSR pudo asimismo medirse en los fibroblastos humanos normales (Figura 30), siguiendo el protocolo que figura a continuación.

Medición de fijación, internalización y degradación de las LDL mediante fibroblastos

Los fibroblastos se cultivan durante una semana como se describe anteriormente, salvo que el medio contiene 20% de suero bovino fetal (Goldstein et al., 1983). Luego se los incuba con concentraciones crecientes de ^{125}I-LDL en ausencia o presencia de 1 mM oleato. Las células se lavan, lisan y cuentan para evaluar su radioactividad.

Ejemplo 9 Efecto de la leptina sobre la actividad LSR en el hombre

La actividad LSR de fibroblastos humanos FH (familial hypercholesterolemia) se aumenta asimismo luego de incubación con leptina (Figura 31), lo cual sugiere que al igual que la rata, LSR participa en el hombre en la aclaración de las citoquinas, modulando su actividad a través de las mismas. Se efectuaron las mediciones correspondientes tal como se indica a continuación.

Efecto de la leptina sobre la actividad LSR en fibroblastos humanos

Los fibroblastos FH se incuban 30 minutos a 37ºC con concentraciones crecientes de leptina, luego 2 horas a 37ºC con 50 \mug/ml de ^{125}I-LDL en presencia de 500 \muM de oleato. La fijación, internalización y degradación de las LDL se evalúan tal como se indica en el ejemplo 1.

Ejemplo 10 Clonación del ADNc de LSR en ratón; análisis de los productos de corte y empalme alternativo

La clonación del ADNc de LSR de ratones se llevó a cabo a partir de un banco de ARNm de hígado de ratones. El método clonación utilizado es el mismo que para el ADNc de LSR humano. Los ARNm se purificaron y se efectuó una amplificación por trascripción inversa mediante PCR con los cebadores de ADN específicos. El fragmento de amplificación se presentó en un vector de clonación TA (Introgene).

Se efectuó asimismo un estudio de los productos de corte y empalme alternativo con cebadores ubicados situados en el exón 2 y el exón 9, procediendo de manera similar a la utilizada en el caso del LSR humano.

Se observaron tres productos de corte y empalme alternativos: LSR-Mm-1886, LSR-Mm-1829 y LSR-Mm-1682. LSR-Mm-1886 contiene todos los exones de 1 a 10. LSR-Mm-1829 y LSR-Mm-1682 carecen de los exones 4 y de los exones 4 y 5, respectivamente. Estas tres formas biológicas de ADNc corresponden a las observaciones realizadas en el ser humano y la rata. Las secuencias nucleotídicas de los ADNc LSR-Mm-1886, LSR-Mm-1829 y LSR-Mm-1682 se ilustran en las SEQ ID 13, 14 y 15, respectivamente. Las secuencias proteicas codificadas por los ADNc ISR-Mm1886, ISR-Mm-1829 y LSR-Mm-1682 se ilustran en las SEQ ID 16,17 y 18.

Ejemplo 11 Identificación de la subunidad \gamma de LSR

Las subunidades \alpha y \beta de LSR se identificaron como se establece a continuación. El análisis de los productos de traducción de los ARNs que codifican estas dos subunidades no permite explicar la presencia de una tercera subunidad de peso molecular \approx 35 kDa. Está última es detectable solamente luego de la reducción del complejo LSR (Figura 10, línea 4).

Hemos purificado y obtenido la secuencia NH_{2} terminal de esta subunidad \gamma.

La purificación se realizó mediante cromatografía de inmunoafinidad siguiendo el procedimiento que figura a continuación.

Purificación de la subunidad \gamma de LSR

Se acoplaron anticuerpos anti-LSR (banda A) con una resina [2,5 mg de IgG para 3,5 ml de resina affi-gel Hz immunoaffinity kit (Biorad 153-6060)] que se incubó entonces con proteínas solubilizadas a partir de membranas totales de hígado de rata (tampón Tris 20 mM, EDTA 2mM, octilglucósido 0,125 M (5 X CMC), inhibidor cóctel 1%, PH 7,4: 160 mg de proteínas membranales proporcionan 41,3 mg de proteínas solubilizadas (PS) en un volumen de 17 ml.

- La incubación se realiza durante 12 horas: 17 ml complementados con 50 ml con tampón Tris 20 mM, EDTA 2 mM, pH 7,4 con los 3,5 ml de resina, bajo agitación rotativa, a temperatura ambiente. Se lavó la resina con 40 ml de tampón Tris 20 mM, EDTA 2 mM, pH 7,4, para luego eluirse con tampón Tris 20 mM, EDTA 2 mM, glicina 200 mM, pH 2,5 en 30 fracciones de 500 \mul. El pH de cada fracción se neutraliza con 100 \mul por tubo de tampón de Tris 1 M, EDTA 2 mM, pH 9. Se coloraron 50 \mul de cada fracción sobre una membrana de nitrocelulosa para realizar un análisis en dot blot: incubación con el anticuerpo anti-LSR, luego con un segundo anticuerpo acoplado a la fosfatasa alcalina.

- Las fracciones positivas de 7 a 28 se reunieron 2 por 2 y se concentraron 2,5 veces en un Speedvac. Se realiza una Transferencia Western sobre las fracciones reunidas y separadas, sobre un gel PAGE-SDS al 10%. Se observaron bandas en las fracciones 7 a 14 (se reunieron las fracciones).

- Ambas reuniones se someten a diálisis en bicarbonato de amonio 24 mM, se liofilizan en un Speedvac. El polvo se retoma en 80 \mul de tampón Tris 20 mM, EDTA 2 mM, SDS 2%, Urea 3%, pH 7,4 reducido en presencia de 5% \beta-mercaptoetanol 30 minutos a 100ºC.

- Luego de migración y transferencia húmeda en Tris 50 mM, Borato 50 mM sobre una membrana de secuenciamento (PVDF) a 30 mA, la membrana se colorea con Amido black.

Una banda de PM aparente de aproximadamente 35 kDa se identificó asimismo y envió por secuenciación de acuerdo con el método Edman.

La secuencia es LHTGDKAFVEFLTDEIKEE. Esta secuencia corresponde a la idéntica de una proteína de peso molecular 33 kDa identificado anteriormente como una proteína de la superficie celular que fija las cabezas globulares de C1q (gC1qR)(Ghebrehiwet et al., 1994). Una observación más reciente indica que el receptor potencial de C1q se localiza asimismo en las vesículas situadas bajo la superficie celular (van den Berg et al., 1997). Esta proteína corresponde asimismo a una proteína identificada anteriormente como p34, que se asocia con un receptor de la lamina. Este receptor posee un segmento NH_{2} terminal largo orientado hacia el interior del núcleo celular así como 8 dominios transmembrana. Este receptor se fija a la lamina de manera que depende del grado de fosforilación. Finalmente, gC1q-R se asocia con el "splicing factor 2" (Honoré et al., 1993). El receptor de la lamina y el "splicing factor 2" presentan en común la característica de contener una secuencia repetida de serina y arginina (RSRS) ubicada a nivel del segmento NH_{2} terminal en el caso del receptor de la lamina y a nivel carboxi terminal en el caso de SF2.

Es importante constatar que tanto LSR \alpha como LSR \beta presentan segmentos repetidos ricos en serina y arginina (Figura 1). Nuestra hipótesis consiste en que la proteína LSR \gamma representa un chaperón molecular que se asocia a las subunidades \alpha y \beta de LSR a través de su dominio RSRS.

Con el fin de verificar esta hipótesis, obtuvimos anticuerpos policlonales dirigidos contra dos péptidos sintéticos, cuya secuencia estaría situada en el extremo carboxi o NH_{2} terminal de la proteína gC1q-R:

- péptido NH_{2}-terminal de gC1q-R: LRCVPRVLGSSVAGY* (aminoácidos de 5 a 19 de gC1q-R) (SEQ ID 39)

- péptido COOH-terminal de gC1qR C*YITFLEDLKSFVKSQ (aminoácidos de 268 a 282 de gC1q-R) (SEQ ID 40).

*: aminoácidos que difieren de la secuencia proteica, con el fin de optimizar la antigenicidad de los péptidos.

La Figura 32 muestra que estos anticuerpos inhiben específicamente la actividad de LSR. El anticuerpo dirigido con el extremo COOH terminal parece ser el más eficaz. Estos resultados indican que gC1q-R, o uno de sus homólogos estructuralmente cercano, representa un chaperón molecular asociado de manera no covalente al complejo multinumérico LSR.

Ejemplo 12 Regulación de la actividad LSR por el C1q y sus homólogos

Se ha demostrado que gC1q-R era capaz de fijar la cabeza globular del factor 1 del COmplemento. Intentamos utilizar esta propiedad de C1q para desplazar gC1q-R asociado con LSR, y medimos el efecto de dosis crecientes sobre la fijación, internalización y degradación de las LDLs por hepatocitos en cultivo primario. La Figura 33 muestra un aumento de la captación y degradación de las LDLs inducido por el C1q humano, incluso en ausencia de oleato.

Un aumento menos importante pero sin embargo significativo se observa igualmente en presencia de oleato. Sin embargo, en estas condiciones, el efecto máximo se obtiene mediante concentraciones más bajas de C1q.

Parece entonces que gC1q-R ejerce con respecto de LSR un efecto inhibidor comparable con el inducido por 39 kD RAP con respecto a LRP, del LDL-receptor y de LSR (Troussard et al., 1995). El desplazamiento del chaperón gC1q-R, utilizando su capacidad para fijarse al complemento C1q permite el levantamiento del efecto inhibidor. El análisis de la secuencia gC1q-R indica que no puede tratarse de un receptor de membrana típico. Efectivamente, la proteína no posee ninguna secuencia hidrófoba susceptible de atravesar la doble capa fosfolipídica.

El efecto de complemento C1q sobre la actividad LSR abre perspectivas importantes en el marco de la genética de la obesidad. Es posible que mutaciones que afecta al gen de C1q, el de gC1q-R, sea también el de sus análogos como por ejemplo AdipoQ, cerebelina, colágeno alfa 1-10, SPA y SPD (proteínas del surtactante pulmonar), ligándose la proteína al manano, y el receptor scavenger o su homólogo LRP (Hu et al., 1996; Drickamer et al, 1986; Krieger et Herz, 1994; Elomaa et al., 1995) modulan la actividad de LSR, tanto con respecto al aclaramiento de las lipoproteínas, como con respecto al de la leptina.

Varias proteínas pueden interactuar con gC1q-R porque presentan homologías con el complemento C1q. Particularmente, dos proteínas aisladas en el ratón, AdipoQ (Hu et al., 1996) y acrp30 (Scherer et al., 1995), y una proteína humana APM1 (Maeda et al, 1996) presentan importantes homologías. Estas tres proteínas, como los elementos del complemento dii complément C1q (C1q A, B, C) son proteínas secretadas; tienen un extremo NH_{2}-terminal similar al colágeno (repetición de restos Gly-X-Y) y un extremo COOH-terminal correspondiente al dominio globular del complemento C1q. Estas tres proteínas se expresan preferentemente en el tejido adiposo. Hay tan solo 3 aminoácidos de diferencia entre AdipoQ y acrp30. APM1, proteína cuyo mensajero se ha caracterizado como expresado en adipocitos, presenta una identidad del 79,7% en ácido nucleico y de 80,6% en aminoácido con AdipoQ. APM1 es por lo tanto seguramente el homólogo humano de AdipoQ.

Ejemplo 13 Selección de compuestos que modifican la actividad del receptor LSR

Tal como se describiera anteriormente, los inventores plantearon la hipótesis de que la "banda \gamma" de LSR, proteína muy homóloga a gC1qR, interactuaría con el receptor LSR como chaperón molecular y formaría así un "complexo LSR", que comprende a las subunidades \alpha, \alpha' y \beta del receptor LSR y una molécula de tipo gC1qR. gC1qR se identificó anteriormente como una proteína de la superficie celular que fija las cabezas globulares del factor de complemento C1q. Además de C1q, varias proteínas presentaron homologías con las proteínas C1q, principalmente AdipoQ y acrp30 en el ratón y APM1 en el ser humano, son susceptibles de interactuar con la proteína homóloga con gC1qR en el complejo LSR y modificar la actividad de LSR.

Parámetros de la selección

La selección de un compuesto como C1q o AdipoQ se realizó mediante la medición de diferentes parámetros siendo el principal la medición del efecto del compuesto sobre la actividad del receptor LSR. Los diferentes parámetros son los siguientes:

- cambio de peso

- ingesta de alimentos

- respuesta lipémica postprandial

- fijación, internalización y/o degradación de las lipoproteínas como las LDL

El cambio de peso

Se insertaron bombas osmóticas quirúrgicamente en las cavidades abdominales de 12 ratas macho Sprague-Drawley de 400-450 g. Las bombas osmóticas que contenían ya sea 2 ml de PBS (phosphate buffer saline), pH 7,4 (control, 6 ratas), o 2 ml de proteína AdipoQ recombinante (5 mg/ml PBS, 6 rats). Estas bombas fueron diseñadas para una producción de 10 \mul/h (50 \mug AdipoQ/h). Se pesan los animales y se los aloja individualmente en jaulas de metabolismo. 3 animales de cada grupo se someten ab libitum ya sea con un régimen normal o con uno graso (día 0). El régimen graso consiste en un régimen normal suplementado con 2% (p/w) de colesterol, 10% (p/w) de ácido graso saturado bajo forma de vegetalina, % (plw) de aceite de girasol al 15% (p/w) de sacarosa. Al día 3, los animales se pesaron y se tomaron muestras de sangre por la vena caudal. La cantidad de triglicéridos plasmáticos se midió utilizando un kit enzimático.

Ingesta de alimentos

La proteína AdipOQ recombinante (100 \mug) o PBS se inyectaron diariamente durante 5 días por la vena caudal de ratones ob/ob o db/db colocadas en jaulas metabólicas. Se pesaron los ratones cada día y la cantidad de alimento consumido se midió igualmente. Los resultados corresponden a una ingesta de alimentos promedio y una desviación estándar para 4 ratones en cada grupo.

La respuesta lipémica postprandial

Se sondaron ratas Sprague-Drawley machos (400-450 g) en ayuno desde el día anterior con una comida muy rica en grasa (1=0) (60% de ácido graso del cual 37% era saturado, 27% monoinsaturado y 36% poliinsaturado, 20% de proteína y 20% de hidrato de carbono, proporcionando el total 56 kcal/kg de peso corporal) y recibieron inmediatamente después una inyección intravenosa (vena femoral) de ya sea 300 \mul de PBS solo o de un mismo volumen que contenía 1 mg de proteína AdipoQ recombinante de ratón. Se tomaron muestras de sangre en diferentes momentos (0, 2, 4 y 6 h). Se midió la cantidad de triglicéridos plasmáticos utilizando un kit enzimático. Los resultados se presentaron como promedios y desviaciones estándar en 3 animales.

Actividad LSR o fijación, internalización y degradación de las lipoproteínas

Se prepararon cultivos primarios de hepatocitos de rata y se los distribuyó en placas de 6 pocillos (9.000.000 células/pocillo). Luego de 48 h, se lavaron las células una bis vez con PBS (2 ml/pocillo) y se incubaron 30 min con 20 ng/ml de leptina murina recombinante. Luego se incubaron las células durante 4 h a 37ºC con concentraciones crecientes de proteínas AdipoQ murinas recombinantes y 20 \mug/ml ^{125}I-LDL en presencia o ausencia de 0,5 mM de oleato. La fijación, internalización y la degradación de las lipoproteínas se midieron como se indica en el ejemplo 1.

C1q

El compuesto C1q se evaluó para medir su capacidad de modular la actividad del receptor LSR (fijación, internalización y degradación de las lipoproteínas). La figura 33 muestra que el compuesto presenta la propiedad de aumentar la actividad en presencia y ausencia de oleato. De este modo, este compuesto C1q pudo seleccionarse como modulador de la actividad LSR a través del test de actividad descrito anteriormente.

AdipoQ

El compuesto AdipoQ se evaluó de acuerdo con los cuatro parámetros expuestos anteriormente.

La figura 34 muestra que el compuesto AdipoQ modula la actividad LSR en presencia de oleato. En efecto, a una concentración de 25 ng/ml, aumenta la actividad de LSR.

La figura 35 muestra que la administración de AdipoQ permite reducir masivamente la respuesta lipidémica postprandial.

La figura 36 muestra que un tratamiento ip infusión de 3 días mediante AdipoQ ocasiona una pérdida de peso que es mucho más importante cuando se somete al ratón a un régimen graso. Asimismo, los inventores constataron que la tasa de triglicéridos plasmáticos se reduce en los animales tratados con AdipoQ.

La figura 37 muestra que una inyección de AdipoQ disminuye la ingesta de alimentos en los animales obesos.

El aumento de la actividad LSR inducida por 25 ng/ml de AdipoQ puede explicar la disminución de la respuesta lipémica postprandial y la pérdida de peso.

De este modo, la proteína AdipoQ es un compuesto muy interesante que podría utilizarse principalmente en el tratamiento de la obesidad. La selección de esta proteína como molécula candidato para el tratamiento de la obesidad convalida los parámetros de selección del compuesto de interés que modulan la actividad LSR, consistiendo el parámetro más importante en la medición de la actividad LSR.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Genset SA

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(B): DIRECCIÓN: 24, RUE ROYALE

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: PARIS

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(E): PAÍS: Francia

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(F): CÓDIGO POSTAL : 75008

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptor LSR.

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 41

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(v): FORMATO LEGIBLE POR COMPUTADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): COMPUTADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: Win95

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Word

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2097 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

3

4

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 593 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2040 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

9

10

11

12

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 574 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1893 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 525 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2158 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posible sitio de empalme AAG

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1259..1261

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posible inserción de una AGG

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1657

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

25

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 649 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posible eliminación de un glu

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 386

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posible inserción de una arg

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 518

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2101 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

34

35

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 630 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

42

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1954 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 581 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

48

49

50

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1886 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

51

52

53

54

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1829 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

57

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1682 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

60

61

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 594 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

64

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 575 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

67

68

69

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 526 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

72

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22976 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: DOBLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.333000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon1

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1898..2253

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon2

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3437..3781

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon3

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12065..12184

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon4

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15045..15101

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon5

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15666..15812

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon6

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19479..19652

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon7

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19799..19858

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon8

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19956..20087

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon9

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 20229..20854

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon10

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 20944..21094

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posible sitio de empalme variante AAG

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19956..19958

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTACAGAAT TCGCCGCGAT GGCGCCGGCG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGGACAG TGTACGCACT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCTCAGGTG TCCCGAGCAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATGACT GGCGATCGAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCTCTATGA CCCGGACGAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCACCCTG ACAGTGCGTA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGGGGCAT AGATGCTCGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTGGAAG GCCTCGATCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGTCCCTA GGATCGTCCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posición en SEQID2

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 169..188

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ala Gln Asp Leu Asp Gly Asn Asn Glu Ala Tyr Ala Glu Leu Ile}

\sac{Val Leu Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posición en SEQID2

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 556..570

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Gly Gln Tyr Pro Pro Ala Pro Pro Pro Tyr Ser Glu Thr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGCAACAGG ACGGACTTGG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGACGACT AAACTTTCCC GACTCAGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACAACCCC TACGTTGAGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTGACCTG ACCTTTGACC AGAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGAGCTAC TCCTGTCAAC GTCT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCCGAGAT CGCCAGTCGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACATGGAT CCAGTCATGC CGAAGAT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGACAACTCG AGTCAGTTGG TATCATGG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Idéntica a 5 .. 18 en ref swissprot :Q07021

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..14

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Cys Val Pro Arg Val Leu Gly Ser Ser Val Ala Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: SIMPLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Idéntica a 268 .. 282 en ref swissprot :Q07021

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 2..15

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Ile Thr Phe Leu Glu Asp Leu Lys Ser Phe Val Lys Ser Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21721 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: DOBLE

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon1

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1898..2253

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon2

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3438..3782

\vskip0.666000\baselineskip

(ix) CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon3

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 12064..12183

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon4

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15049..15105

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon5

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 15670..15816

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon6

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19486..19659

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon7

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19806..19865

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon8

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19963..20094

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon9

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 20236..20864

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exon10

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 20954..21094

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AC002128

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 715

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: inserción divergente, G en ref genbank:AC002128

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1229

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, T en ref genbank:AC002128

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3676

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 5039

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, C en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 5118

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, C en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 7337

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 8294

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, C en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 8604

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, A en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 8928

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9021

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: inserción divergente, GAATGAAA en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9851

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, C en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 9878

\vskip0.666000\baselineskip

(ix) CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, T en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 11478

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, C en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 11577

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, T en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 11779

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, T en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 13411

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 13538

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 13896

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, A en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 14912

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, C en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 16732

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 17169

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 18946

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19474

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 20500

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 20501

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, A en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 20502

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 21270

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: inserción divergente, T en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 21356

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: nucleótido divergente, A en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 21476

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: inserción divergente, C en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 21588

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: eliminación divergente, T en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 21601

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: inserción divergente, G en ref genbank:AD000684

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 21635

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Posible sitio de empalme variante AAG

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19963..19965

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

94

95

96

97

98

99

100

101

157

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

Claims

1. Polipéptido purificado o recombinante del receptor LSR de secuencia seleccionada entre las secuencias SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 17 y 18, presentando las secuencias al menos 90% de identidad con respecto a las secuencias SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 17 y 18, o entre los fragmentos biológicamente activos de al menos cinco aminoácidos consecutivos de los polipéptidos de secuencia SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 17 y 18.

2. Polipéptido purificado o recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho fragmento biológicamente activo se selecciona de un sitio de fijación de los ácidos grasos, un sitio de fijación de la clatrina, un sitio de fijación de una citoquina, un sitio de fijación de ligandos apoproteicos, un resto LI/LL, un resto RSRS y una región hidrófoba.

3. Anticuerpos caracterizados porque son capaces de reconocer específicamente un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2.

4. Hibridoma caracterizado porque expresa anticuerpos monoclonales capaces de reconocer específicamente un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2.

5. Ácido nucleico purificado, aislado o recombinante, caracterizado porque codifica una secuencia de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6. Ácido nucleico purificado, aislado o recombinante, caracterizado porque comprende la secuencia complementaria de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Vector recombinante, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 6.

8. Célula recombinante caracterizada porque expresa un polipéptido recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2.

9. Célula recombinante, caracterizada porque comprende un ácido nucleico recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 y 6.

10. Célula recombinante, caracterizada porque comprende un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7.

11. Mamífero, excluido el ser humano, caracterizado porque comprende un ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, o un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 7.

12. Método de detección de la expresión de un polipéptido del receptor LSR, caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto de una muestra biológica con un anticuerpo capaz de reconocer específicamente un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2; y

b) detectar complejos inmunológicos entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido como medio de detección de dicha expresión.

13. Método de diagnóstico de un trastorno o enfermedad vinculado con la obesidad, caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo capaz de reconocer específicamente un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2; y

b) detectar complejos inmunológicos entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido como medio de diagnóstico de dicho trastorno o enfermedad.

14. Método de diagnóstico de un trastorno o enfermedad vinculado con la obesidad, caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto de una muestra biológica con un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 y 6; y

b) detectar mutaciones en un ácido nucleico de dicha muestra biológica como medio de diagnóstico de dicho trastorno o enfermedad.

\newpage

15. Método de diagnóstico de un trastorno o enfermedad vinculado con la obesidad, caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto una muestra biológica con un ácido nucleico que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID Nº 19; y

16. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque dicha muestra biológica proviene de un mamífero.

17. Método de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque dicho mamífero es un ser humano.

18. Método de selección de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de un trastorno o enfermedad, caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2 con un compuesto candidato;

b) detectar un complejo entre dicho compuesto candidato y dicho polipéptido como medio de selección de dicho compuesto útil para el tratamiento o la prevención de dicho trastorno o enfermedad vinculado con la obesidad.

19. Método de selección de un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de un trastorno o enfermedad vinculado con la obesidad, caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 con un compuesto candidato;

b) detectar un resultado seleccionado entre una interacción de dicho compuesto candidato con dicha célula recombinante, una modulación de la actividad del receptor LSR y una modulación de la expresión del receptor LSR como medio de selección de dicho compuesto útil para el tratamiento o la prevención de dicho trastorno o enfermedad vinculada con la obesidad.

20. Método de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque dicha puesta en contacto se realiza en presencia de un ligando de dicho receptor LSR.

21. Método de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque dicho ligando se selecciona entre el grupo que consiste en una citoquina, oleato, LDL y gC1qR.

22. Método de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado porque dicha citoquina es la leptina.

23. Método de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque dicha actividad se selecciona entre la fijación de lipoproteínas, su internalización y degradación, y la fijación de la leptina, su internalización y degradación.

24. Método de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque dicho compuesto candidato se selecciona entre péptidos, ácidos grasos, lipoproteínas, fármacos y moléculas pequeñas.

25. Método según una de las reivindicaciones 13, 15, 18 y 19, caracterizada porque dicho trastorno o enfermedad vinculado con la obesidad se selecciona entre el grupo formando por obesidad, anorexia, caquexia, insuficiencia cardíaca, insuficiencia coronaria, accidentes vasculares cerebrales, enfermedad ateromatosa, aterosclerosis, hipertensión arterial, diabetes no dependiente de insulina, hiperlipidemia e hiperuricemia.