ES2299267T3 - Nueva proteina extracelular ligante de rage (en-rage) y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Un péptido aislado que tiene la secuencia N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. nº 2).
Description
Nueva proteína extracelular ligante de RAGE
(EN-RAGE) y sus usos.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia
a diversas publicaciones por autor y fecha dentro del texto. Las
citas completas de estas publicaciones se pueden hallar
alfabéticamente enumeradas al final de las secciones de detalles
experimentales para cada experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
El receptor de AGE (RAGE) es un miembro de la
superfamilia inmunoglobulínica de moléculas de la superficie
celular (1-2). Originalmente identificado y
caracterizado como un receptor celular de proteínas modificadas con
glucosa (aldosa), o productos finales de glicosilación avanzada
(AGEs; del inglés, advanced glycation
endproducts) (3-13), del RAGE se ha
comunicado posteriormente que interacciona con otros ligandos, tanto
en escenarios de desarrollo normal como en la enfermedad de
Alzheimer (14-16). En el desarrollo normal, RAGE
interacciona con anfoterina, un polipéptido que media en la
emergencia de neuritas en neuronas embrionarias en cultivo. En
estos estudios, F(ab')_{2} anti-RAGE o RAGE
soluble (sRAGE) inhibía la emergencia de neuritas en matrices
revestidas con anfoterina pero no en matrices revestidas con otras
sustancias tales como laminina y
poli-1-lisina (3). En estudios
posteriores, el RAGE fue identificado como un receptor, presente en
neuronas y microglía, del péptido \beta amiloide, un polipéptido
ligado a la patogénesis de la toxicidad neuronal y la muerte en la
enfermedad de Alzheimer.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente invento proporciona un péptido
EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de
RAGE; en inglés, Extracellular Novel RAGE Binding Protein) humano
aislado. El presente invento también proporciona un método para
determinar si un compuesto es capaz de inhibir la interacción de un
péptido EN-RAGE con un péptido RAGE, que comprende:
(a) mezclar (i) un péptido RAGE o un péptido sRAGE o un fragmento de
cualquiera de los mismos, (ii) un péptido EN-RAGE o
un fragmento del mismo, y (iii) el compuesto; (b) medir el nivel de
interacción entre el péptido de la operación (a) (i) y el péptido
de la operación (a) (ii); y (c) comparar la cantidad de interacción
medida en la operación (b) con la cantidad medida entre el péptido
de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii) en
ausencia del compuesto, determinándose de esta manera si el
compuesto es capaz de inhibir la interacción del péptido
EN-RAGE con el péptido RAGE; en el que una reducción
en la cantidad de interacción en presencia del compuesto indica que
el compuesto es capaz de inhibir la interacción. También se
describe aquí un método para inhibir la inflamación en un sujeto,
que comprende administrar al sujeto un compuesto capaz de
interferir en la interacción entre un péptido
EN-RAGE y el receptor del producto final de
glicosilación avanzada (RAGE) en el sujeto, para de este modo
inhibir la inflamación en el sujeto.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Se obtuvo tejido renal de un paciente con
nefritis por lupus activo y se fijó en formol, y se prepararon
cortes embebidos en parafina. Los cortes fueron teñidos con IgG
anti-RAGE, de conejo. Se advirtió una expresión
aumentada de RAGE en los podocitos del glomérulo.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Se cultivaron durante 24 horas células
endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC; del inglés,
human umbilical vein endothelial
cell) en medio RPMI 1640 exento de suero, sin factor de
crecimiento de células endoteliales, y luego se estimularon con
EN-RAGE o albúmina sérica bovina (BSA; del inglés,
bovine serum albumin), ambos en una
concentración de 10 \mug/ml. Donde se indica, las células fueron
pretratadas con IgG anti-RAGE humano generada en
conejo, o con IgG no inmune de conejo; en ciertos casos, el
EN-RAGE fue pretratado con la concentración indicada
de RAGE soluble (sRAGE) durante 2 horas antes de la estimulación con
EN-RAGE. Después de ocho horas de estimulación con
EN-RAGE, las células fueron fijadas del modo
anteriormente descrito. Se llevó a cabo un ELISA (ensayo de
inmunoabsorción con enzimas ligadas; del inglés,
enzyme-linked immunosorption assay) de
la superficie celular empleando IgG
anti-VCAM-1. En la figura se
muestran consideraciones estadísticas.
\newpage
Figura
3
Se llevó a cabo la valoración de la actividad
funcional de VCAM-1 usando células
Molt-4 (ATCC) marcadas con ^{51}Cr, como se
describió anteriormente. Se trataron HUVECs con BSA (10 \mug/ml) o
EN-RAGE (5 \mug/ml) durante ocho horas. Se
incubaron células Molt-4 (5 x 10^{7}/ml) durante 2
horas en RPMI que contenía ^{51}Cr (3700 kBq). Al final de ese
tiempo, las células fueron lavadas con disolución salina tamponada
con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered
saline) y fueron luego añadidas a la monocapa de HUVECs
tratadas, durante una hora. Las células Molt-4 no
unidas fueron eliminadas mediante tres lavados con PBS. Las células
fueron luego lisadas en tampón que contenía Triton-X
100 (2%) con objeto de liberar la radiactividad que contenían las
células Molt-4. En la figura se muestran
consideraciones estadísticas.
Figura
4
Se sensibilizaron ratones CF-1
con mBSA. Tres semanas más tarde, se inyectó mBSA en la almohadilla
de la pata trasera. Ciertos ratones fueron tratados con las
concentraciones indicadas de albúmina sérica de ratón, sRAGE o los
fragmentos indicados de F(ab')_{2} de anticuerpo
anti-RAGE o
anti-EN-RAGE. La calificación de la
inflamación se definió como antes (escala: 1-9).
Figura
5
Se clonó el cDNA de EN-RAGE
bovino y se depositó en Genbank con el nº de acceso AF 011757. La
secuencia (5' a 3') se muestra en la Figura 5.
Figura
6
(Parte A): La expresión de
EN-RAGE está aumentada en células Jurkat y PBMCs
(células mononucleares de sangre periférica; del inglés,
peripheral blood mononuclear cell)
estimuladas, pero no en HUVECs. Se cultivaron PBMCs, células Jurkat
E6 o HUVECs en medio estándar, solas o en presencia de los estímulos
indicados, durante 12 horas. Las PBMCs y las células Jurkat E6 se
estimularon con
12-miristato-13-acetato
de forbol (PMA; del inglés, phorbol 12-myristate
13-acetate; 10 ng/ml)/ionomicina (100 ng/ml), y las HUVECs se
trataron con TNF-\alpha (10 ng/ml). Al final de
las 12 horas de incubación, se prepararon lisados celulares y se
llevaron a cabo electroforesis/inmunotransferencias del modo
anteriormente descrito empleando IgG
anti-EN-RAGE (2 \mug/ml), de
conejo. Los sitios del anticuerpo primario se visualizaron usando un
anticuerpo contra IgG de conejo, conjugado con peroxidasa, y un
sistema de detección por quimioluminiscencia aumentada (ECL; del
inglés, enhanced chemiluminiscence). Como se
indica, se desarrollaron simultáneamente marcadores de pesos
moleculares. Se muestran los resultados del análisis densitométrico.
Este experimento se repitió dos veces, con resultados análogos.
(Parte B): La infusión de lipopolisacárido (LPS)
a ratones origina la elaboración de EN-RAGE en el
plasma: Se infundió LPS, 30 \mug/kg de peso corporal, a ratones
Balb/c por administración intraperitoneal en presencia o ausencia de
sRAGE (100 \mug; administrados 12 h y 1 h antes de la inyección de
LPS). En el momento indicado, se extrajo sangre y se sometió el
plasma a electroforesis/inmunotransferencia para
EN-RAGE usando IgG
anti-EN-RAGE (2 \mug/ml), como
antes. Se muestran los resultados del análisis densitométrico. Este
experimento se repitió dos veces, con resultados análogos.
(Parte C-D):
EN-RAGE se une a RAGE purificado (C) y células
endoteliales de aorta bovina (BAECs; del inglés, bovine
aortic endothelial cells) (D): En C, se
inmovilizó RAGE humano soluble en las paredes de placas de plástico,
y, en D, se cultivaron BAECs confluentes en pocillos tratados para
cultivo tisular. Se llevaron a cabo ensayos de unión de
radioligandos empleando la concentración indicada de
^{125}I-EN-RAGE en presencia o
ausencia de EN-RAGE no marcado y en exceso (50 veces
más). En C se demuestra la unión específica a RAGE purificado, con
una K_{d} \approx 91 \pm 29 nM y una capacidad \approx 21
\pm 2,9 femtomoles/pocillo. En D se demuestra la unión específica
a BAECs, con una K_{d} \approx 90,3 \pm 34 nM y una capacidad
\approx 163 \pm 26,2 femtomoles/pocillo. Donde se indica, se
incubó EN-RAGE radiomarcado (100 nM) con la cantidad
indicada de sRAGE en exceso dos horas antes del ensayo de unión, o
se preincubaron los pocillos durante dos horas con la concentración
indicada de IgG no inmune de conejo o de IgG
anti-RAGE o IgG
anti-EN-RAGE monoespecíficas y
policlonales de conejo, antes del ensayo de unión, y los resultados
se presentan como % de la unión específica máxima \pm desviación
típica (SD; del inglés, standard deviation) de la
media. Estos experimentos se llevaron al menos cinco veces a cabo,
con resultados análogos.
\newpage
Figura
7
(Parte A): ELISA de la superficie celular para
VCAM-1: Se cultivaron HUVECs en presencia de los
mediadores indicados, durante 8 horas a 37ºC, en presencia o
ausencia de pretratamiento con IgG no inmune, IgG
anti-RAGE o RAGE soluble en exceso durante dos
horas. Luego se fijaron las células y se llevó a cabo un ELISA de la
superficie celular para VCAM-1 empleando IgG
anti-VCAM-1 (4 \mug/ml).
(Parte B): Ensayos de adhesión de
Molt-4: Se cultivaron HUVECs en presencia de los
mediadores indicados durante 8 horas. Para EN-RAGE,
se emplearon concentraciones (zona izquierda del gráfico) y tiempos
de incubación (zona central del gráfico) variables. Después de la
incubación, se dejó durante una hora que las células
Molt-4 marcadas con ^{51}Cr se unieran a la
monocapa. Al final de ese periodo, las células fueron lavadas en
medio y fueron rotas en presencia de Triton-X 100
(1%); el material resultante fue sometido a cuenta en un contador de
radiación beta. En la zona derecha del gráfico, las HUVECs fueron
tratadas con EN-RAGE (5 \mug/ml) en presencia o
ausencia de pretratamiento (2 h) con el indicado
F(ab')_{2}, sRAGE en exceso o BSA en exceso. Los resultados
se presentan como aumento, en número de veces, con respecto al
testigo (tratamiento de las células con BSA, 10 \mug/ml). En
A-B, los resultados se presentan como media \pm SD
de la media. Los experimentos se llevaron al menos tres veces a
cabo.
(Parte C): Ensayo de desplazamiento de la
movilidad electroforética (EMSA; del inglés, electrophoretic
mobility shift assay): Se trataron HUVECs con
los mediadores indicados durante ocho horas.
En ciertos casos, las células fueron pretratadas
con IgG anti-RAGE y, en otros casos, se pretrató
EN-RAGE con sRAGE en exceso (dos horas). Ciertas
HUVECs, antes del tratamiento con EN-RAGE, fueron
transitoriamente transfectadas con una construcción que codificaba
una forma de RAGE humano en que se había suprimido el dominio
citosólico, o con vector solo como testigo (pcDNA3). Se preparó el
extracto nuclear y se llevó a cabo un EMSA del modo descrito más
adelante. Se llevaron a cabo ensayos de superdesplazamiento por
incubación del extracto nuclear con el anticuerpo indicado (2
\mug/ml) durante 45 minutos antes del EMSA. Se adjuntan los
resultados del análisis densitométrico. Este experimento se repitió
dos veces con resultados análogos.
(Parte D): Ensayos de quimiotaxis modificados:
Se llevaron a cabo ensayos de quimiotaxis modificados, como se
describe. Se pusieron mediadores en la cámara superior o inferior y
células Molt-4 (que llevan RAGE en la superficie
celular) durante 4 h a 37ºC, como se muestra. Las células que habían
migrado a través de las membranas fueron teñidas y fueron contadas
en nueve campos de gran aumento. Donde se indica (parte derecha), se
pretrataron las células con los fragmentos F(ab')_{2}
indicados, o se incubó EN-RAGE con sRAGE en exceso
durante dos horas antes del ensayo de quimiotaxis. Se muestra la
media \pm SD de la media. Cada experimento fue llevado dos veces a
cabo; en cada caso, se emplearon seis duplicados por condición.
(Parte E): Generación de
IL-1\beta y TNF-\alpha: Se
incubaron macrófagos BV-2, fueran los transfectados
con una construcción que codificaba el cDNA en que se había
suprimido el dominio citosólico de RAGE o fueran células
simuladamente transfectadas (vector solo), con los mediadores
indicados durante 8 horas a 37ºC. Al final de ese periodo, se
recogió el sobrenadante y se llevó a cabo un ELISA para
IL-1\beta y TNF-\alpha. Se
presentan los resultados como el nº de veces de aumento de inducción
(en comparación con la incubación de las células con BSA sola). Se
muestra la media \pm SD de la media para tres experimentos.
(Parte F): Ensayo de mitogénesis: Se aislaron
PBMCs de sangre completa del modo descrito y se sembraron en
pocillos para cultivo tisular. Las células fueron tratadas con la
concentración indicada de EN-RAGE durante 12 horas
antes de la estimulación con PHA-P. Las células
fueron luego impulsadas con ^{3}H-timidina y
fueron incubadas durante 18 horas adicionales antes de la
recolección y el procesamiento para la cuenta de centelleo en estado
líquido. En ciertos casos, se pretrataron las células con IgG no
inmune o IgG anti-RAGE o se pretrató el
EN-RAGE con sRAGE en exceso.
(Parte G): Generación de IL-2:
Se incubaron células Jurkat E6 con los mediadores indicados durante
8 horas, se recogió el sobrenadante y se llevó a cabo un ELISA para
IL-2. Donde se indica, se pretrataron las células
con la IgG indicada o se pretrató el EN-RAGE con
sRAGE en exceso. Se presentan los resultados como el nº de veces de
aumento de inducción (en comparación con la incubación de las
células con BSA sola). En F-G, se presenta la media
\pm SD de al menos dos experimentos.
(Parte H): S100B activa
NF-\kappaB en HUVECs a través de RAGE. Se trataron
HUVECs con los mediadores indicados durante ocho horas. El
pretratamiento con anticuerpos o con sRAGE y el EMSA se llevaron a
cabo del modo anteriormente descrito en (C).
Figura
8
(Parte A): Expresión de VCAM-1
en el pulmón: Se inyectó intravenosamente EN-RAGE
(30 \mug), BSA (30 \mug) o LPS (500 \mug) a ratones
CF-1 a través de la vena de la cola. Doce horas más
tarde, se recogieron rápidamente los pulmones y se preparó un
extracto del modo descrito más adelante para inmunotransferencia. La
electroforesis y la inmunotransferencia se llevaron a cabo del modo
descrito empleando IgG anti-VCAM-1
(0,4 \mug/ml). Se muestran los resultados del análisis
densitométrico. Este experimento fue llevado dos veces a cabo, con
resultados análogos.
(Parte B): Ensayo de mitogénesis: Se recogieron
esplenocitos de ratones sometidos a hipersensibilidad de tipo
retardado (DTH; del inglés, delayed-type
hypersensitivity) (véase más adelante) y se examinaron ex
vivo en cuanto a la respuesta a PMA, como se describe. Para cada
condición, n = 5 ratones. Se muestra la media \pm SD.
Figura
9
(Parte A): Calificación de la inflamación: Se
sensibilizaron (ingle izquierda) y estimularon (pata trasera
izquierda) ratones CF-1 con BSA metilada (mBSA), del
modo descrito. Donde se indica, los ratones fueron pretratados con
una inyección intraperitoneal de sRAGE, albúmina sérica murina, o
fragmentos F(ab')_{2} inmunes o no inmunes, 24 y 12 horas
antes de, y 6 y 12 horas después de, la estimulación local con mBSA.
24 horas después de la inyección de mBSA en la almohadilla de la
pata, dos investigadores llevaron a cabo a ciegas las calificaciones
clínica e histológica de la almohadilla de la pata, del modo
descrito. En A, la calificación (máxima de 9; sin inflamación = 2)
se define como la suma de las calificaciones clínica e histológica.
Calificación clínica: 1 = ausencia de inflamación (identidad con
respecto a la almohadilla no tratada de la pata derecha); 2 =
rubefacción y edema ligeros; 3 = rubefacción y edema moderados con
arrugas cutáneas; 4 = rubefacción y edema intensos sin arrugas
cutáneas; y 5 = rubefacción y edema intensos con separación de los
dedos a causa de un edema excesivo. Calificación histológica (de
acuerdo con estudios con hematoxilina y eosina): 1 = sin
infiltración leucocitaria y sin edema subcutáneo; 2 = ligera
infiltración leucocitaria perivascular con ligero edema subcutáneo;
3 = intensa infiltración leucocitaria sin granulomas; y 4 = intensa
infiltración leucocitaria con granulomas. En estos experimentos, n =
5/grupo. Se presenta la media \pm SD de la media.
(Partes B-E): Análisis clínico:
Se muestran ratones representativos sensibilizados/estimulados con
mBSA. B = tratamiento con MSA; C = tratamiento con sRAGE, 100 \mug
ip por dosis; D = tratamiento con F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE, 200 \mug ip por
dosis; y E = tratamiento con F(ab')_{2}
anti-RAGE, 200 \mug ip por dosis.
(Partes F-K): Análisis con
hematoxilina y eosina (H&E): Se muestran análisis con H&E de
almohadillas representativas de patas de ratones
sensibilizados/estimulados con mBSA. F = tratamiento con MSA; G =
almohadilla de pata contralateral, sin DTH; H = tratamiento con
sRAGE, 100 \mug ip por dosis; I = F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE, 200 \mug ip por
dosis; J = F(ab')_{2} anti-RAGE, 200 \mug
ip por dosis; y K = F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE +
anti-RAGE, 200 \mug ip por dosis. Barra de escala
= xxx \mum.
(Parte L): EMSA: Se prepararon extractos
nucleares a partir de almohadillas reunidas de patas traseras (n =
3/condición) y se llevó a cabo el EMSA. Se muestran los resultados
del análisis densitométrico.
(Parte M): RT-PCR para
IL-2 y TNF-\alpha: Se llevó a cabo
una transcripción inversa-reacción en cadena de la
polimerasa (RT-PCR; del inglés, reverse
transcription-polymerase chain reaction)
a partir de RNA preparado de almohadillas de patas traseras, como se
indica en la figura, y se llevó a cabo usando cebadores para
TNF-\alpha (carriles 1 y 2) o IL-2
(carriles 4 y 5) o \beta-actina. Se indican
marcadores de pares de bases. El carril 3 representa el testigo
negativo (sin DNA añadido durante la PCR).
Figura
10
(Parte A): EMSA: Se prepararon extractos
nucleares a partir de tejido de colon rectosigmoide de ratones
tratados con sRAGE (carriles 1-6) o MSA (carriles
7-12). Se llevó a cabo un análisis densitométrico
utilizando el software Image Quant de Molecular Dynamics. Los
píxeles unitarios medios de la densitometría de los ratones tratados
con mSA (n = 6) frente a los de los ratones tratados con sRAGE (n =
6) fueron 7121,8 \pm 5359,6 frente a 1911 \pm 1155 unidades; p =
0,04.
(Parte B): Valoración del
TNF-\alpha plasmático: Inmediatamente antes del
sacrificio, re recogió plasma de ratones deficientes en
IL-10 y se sometió a centrifugación a 800 rpm
durante 10 minutos para obtener un sobrenadante exento de células.
Se llevó a cabo un ELISA para TNF-\alpha sobre
este material de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los
valores medios para los ratones tratados con MSA (n = 6) frente a
los de los ratones tratados con sRAGE (n = 6) fueron 190,5 \pm
89,0 frente a 21,9 \pm 63,6 pg/ml; p = 0,02.
Figura
11
Formulamos la hipótesis de que, tras el
reclutamiento a sitios de estimulación inmune/inflamatoria, las
células inflamatorias liberan EN-RAGE y moléculas de
S100/calgranulina similares a EN-RAGE. Estas
moléculas pueden luego unirse al RAGE celular de células tales como
células endoteliales, fagocitos mononucleares (MP; del inglés,
mononuclear phagocytes) y linfocitos, amplificando de
esta manera la respuesta inflamatoria a través de la generación de
mediadores esenciales de la inflamación, tales como moléculas de
adhesión y citocinas.
Aquí se utilizan las abreviaturas siguientes:
CML = carboximetil-lisina, AGE = producto(s)
final(es) de glicosilación avanzada; RAGE = receptor para
producto(s) final(es) de glicosilación avanzada; sRAGE
= receptor soluble para producto(s) final(es) de
glicosilación avanzada; EN-RAGE = nueva proteína
extracelular ligante de RAGE.
El presente invento proporciona un péptido
EN-RAGE humano aislado. En una realización, el
péptido EN-RAGE aislado tiene la secuencia
N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1. El
presente invento describe además una molécula aislada de ácido
nucleico que codifica un péptido EN-RAGE. En una
realización, el péptido EN-RAGE es
EN-RAGE humano. En otra realización, el ácido
nucleico es DNA, cDNA o RNA. En un ejemplo, la secuencia de ácido
nucleico del EN-RAGE es la secuencia mostrada en la
Figura 5 (ID. SEC. nº 1).
El presente invento también proporciona un
vector replicable que comprende la molécula de ácido nucleico de
EN-RAGE. En una realización, el vector replicable es
un vector de expresión procariótico, un vector de expresión de
levadura, un vector de expresión de baculovirus o un vector de
expresión de mamífero.
El presente invento también proporciona una
célula huésped que comprende el vector replicable. En una
realización, la célula huésped es una célula eucariótica, una
célula somática o una célula germinal.
En otra realización, la molécula de ácido
nucleico del invento puede ser marcada con un resto detectable. El
resto detectable puede ser seleccionado del grupo que consiste en un
marcador fluorescente, una digoxigenina, una biotina, una enzima,
un átomo radiactivo, un ion paramagnético y un marcador
quimioluminiscente.
El presente invento también proporciona una
molécula de ácido nucleico que consiste esencialmente en un
fragmento único de una secuencia de ácido nucleico de
EN-RAGE en una orientación 3' a 5', en que la
secuencia es antisentido con respecto a al menos una porción de un
gen que codifica un péptido EN-RAGE presente en la
naturaleza.
El presente invento también proporciona una
composición que comprende un péptido EN-RAGE o un
fragmento del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En
una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un
vehículo para administración intravenosa, oral, tópica o por
aerosol.
También se describe aquí un anticuerpo que
inmunorreacciona con un epítopo que comprende una secuencia única de
EN-RAGE.
También se describe aquí una ribozima que es
capaz de escindir específicamente el mRNA de EN-RAGE
en una célula.
También se describe aquí un mamífero transgénico
no humano cuyas células germinales o somáticas contienen una
molécula de ácido nucleico que codifica un péptido
EN-RAGE o una variante biológicamente activa del
mismo, introducida en el mamífero o en un antepasado del mismo en
una fase embrionaria. En una realización, la molécula de ácido
nucleico que codifica el polipéptido EN-RAGE está
sobreexpresada en las células del mamífero. En otra realización, la
molécula de ácido nucleico codifica un péptido
EN-RAGE humano. En otra realización, la variante
activa comprende un compuesto homólogo de
EN-RAGE.
También se describe aquí un mamífero transgénico
no humano cuyas células germinales o somáticas han sido
transfectadas con un vector adecuado que tiene una apropiada
secuencia destinada a reducir los niveles de expresión del péptido
EN-RAGE por debajo de los niveles de expresión del
mismo en un mamífero originario. En una realización, el vector
adecuado contiene un trozo apropiado de secuencia clonada de ácido
nucleico genómico que permite la recombinación homóloga. En otra
realización, el vector adecuado codifica una ribozima capaz de
escindir una molécula de mRNA de EN-RAGE o una
molécula antisentido que comprende una secuencia antisentido con
respecto a la secuencia de mRNA de EN-RAGE presente
en la naturaleza.
El presente invento también proporciona un
método para determinar si un compuesto es capaz de inhibir la
interacción de un péptido EN-RAGE con un péptido
RAGE, que comprende: (a) mezclar (i) un péptido RAGE o un péptido
sRAGE o un fragmento de cualquiera de ambos, (ii) un péptido
EN-RAGE o un fragmento del mismo, y (iii) el
compuesto; (b) medir el nivel de interacción entre el péptido de la
operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii); y (c)
comparar la cantidad de interacción medida en la operación (b) con
la cantidad medida entre el péptido de la operación (a) (i) y el
péptido de la operación (a) (ii) en ausencia del compuesto,
determinándose de este modo si el compuesto es capaz de inhibir la
interacción del péptido EN-RAGE con el péptido RAGE,
en el que una reducción en la cantidad de interacción en presencia
del compuesto indica que el compuesto es capaz de inhibir la
interacción.
En una realización, el fragmento de la operación
(a) (i) es el dominio V de RAGE. En otra realización, el fragmento
de la operación (a) (i) o (a) (ii) es sintético. En otra
realización, el compuesto comprende al menos una porción de péptido
sRAGE presente en la naturaleza. En otra realización, el compuesto
es un compuesto peptidomimético. En otra realización, el compuesto
es una molécula orgánica. En otra realización, el compuesto es un
péptido, un ácido nucleico o un producto químico inorgánico. En otra
realización, el compuesto es una molécula con un peso molecular
inferior a 10.000 dáltones. En otra realización, el compuesto es un
anticuerpo o un fragmento del mismo. En otra realización, el
compuesto es un péptido RAGE mutado o un fragmento del mismo. En
otra realización, el compuesto es un péptido sRAGE mutado o un
fragmento del mismo. En otra realización, el compuesto es un
péptido EN-RAGE mutado o un fragmento del mismo. En
otra realización, el péptido de la operación (a) (i) es fijado a
una superficie sólida. En otra realización, el péptido de la
operación (a) (ii) es fijado a una superficie sólida. En otra
realización, el péptido de la operación (a) (i) o (a) (ii) es
detectablemente marcado. En otra realización, el marcador detectable
comprende fluorescencia, biotina o radiactividad.
En otra realización, en el método de
exploración, el mezclamiento tiene lugar en una célula. En otra
realización, el mezclamiento tiene lugar en un animal.
También se describe aquí un método para inhibir
la inflamación en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un
compuesto capaz de interferir en la interacción entre el péptido
EN-RAGE y el receptor del producto final de
glicosilación avanzada (RAGE) en el sujeto, inhibiéndose de este
modo la inflamación en el sujeto.
En otra realización, el compuesto es un
anticuerpo anti-EN-RAGE o un
fragmento del mismo, o un anticuerpo anti-RAGE o un
fragmento del mismo. En otra realización, el compuesto es un péptido
sRAGE. En otra realización, el compuesto consiste esencialmente en
el dominio del péptido sRAGE que se une al ligando, o el dominio del
péptido EN-RAGE que se une al ligando. En otra
realización, el compuesto es una molécula de ácido nucleico o un
péptido. En otra realización, el péptido es un anticuerpo o un
fragmento del mismo. En otra realización, la molécula de ácido
nucleico es una ribozima o una molécula de ácido nucleico
antisentido. En otra realización, el compuesto es un compuesto
identificado mediante el método de exploración de la Reivindicación
26.
En otra realización, la inflamación está
asociada con hipersensibilidad retardada, aterosclerosis acelerada
o nefritis por lupus. En otra realización, el sujeto es un ser
humano, un primate, un ratón, una rata o un perro.
En otra realización, la administración comprende
inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o
intravenosa; infusión; distribución mediada por liposomas; o
distribución tópica, intratecal, por el surco gingival, por el
recto, intrabronquial, nasal, oral, ocular u óptica. En otra
realización, el compuesto es administrado horaria, diaria, semanal,
mensual o anualmente. En otra realización, la cantidad eficaz del
compuesto comprende de aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso
corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.
En otra realización, el sujeto está aquejado de
lupus eritematoso sistémico, nefritis inflamatoria por lupus, choque
séptico o endotoxemia. En otra realización, el sujeto está aquejado
de inflamación.
En una realización más, el sujeto está aquejado
de un trastorno autoinmune o inflamatorio en que tiene lugar el
reclutamiento de células inflamatorias que contienen
EN-RAGE. En otra realización, el sujeto está
aquejado de una infección asociada a bacterias o asociada a otros
patógenos.
En otra realización, el método comprende además
administrar al sujeto un vehículo farmacéuticamente aceptable
durante la administración del compuesto. En otra realización, el
vehículo comprende un agente diluyente. En otra realización el
vehículo comprende un virus, un liposoma, una microcápsula, una
célula encapsulada en polímero, o un vector retrovírico. En otra
realización, el vehículo es un vehículo para administración
intravenosa, oral, tópica o por aerosol. En otra realización, el
compuesto se administra desde un implante de liberación
temporal.
También se describe aquí un método para
determinar si un compuesto es capaz de inhibir la capacidad de la
proteína EN-RAGE para unirse a una segunda proteína,
que comprende: (a) mezclar la proteína EN-RAGE, la
segunda proteína y el compuesto; (b) medir la cantidad de unión
entre la proteína EN-RAGE y la segunda proteína; y
(c) comparar la cantidad de unión medida en la operación (b) con la
cantidad de unión entre EN-RAGE y la segunda
proteína en ausencia del compuesto, en que una reducción de la
cantidad de unión indica que el compuesto es capaz de inhibir la
capacidad de la proteína EN-RAGE para unirse a la
segunda proteína.
El cDNA humano de RAGE tiene 1406 pares de bases
y codifica una proteína madura de 404 aminoácidos. Véase la Figura
3 de Neeper et al., 1992. Como se usa aquí, el "dominio V
de RAGE" se refiere al dominio variable de tipo
inmunoglobulínico como el mostrado en la Figura 5 de M. Neeper, A.
M. Schmidt, J. Brett, S. D. Yan, F. Wang, Y. C. Pan, K. Elliston,
D. Stern y A. Shaw, "Cloning and expression of RAGE: a cell
surface receptor for advanced glycosylation end products of
proteins", J. Biol. Chem. 267: 14.998-15.004,
1992. El dominio V incluye los aminoácidos de la posición 23 a la
posición 120, como se muestra en la Figura 4 de Neeper et
al. (1992). La secuencia líder mostrada no es parte del dominio
V y, en el ser humano, el dominio V comienza con los aminoácidos
A-Q-N-I-T...
La secuencia mínima de aminoácidos necesaria para definir el sitio
de unión a AGE en la proteína RAGE puede ser mucho menor de 120
aminoácidos.
Se ha clonado la secuencia de ácido nucleico de
EN-RAGE bovino y se ha depositado en Genbank con el
nº de acceso AF 011757. La secuencia de ácido nucleico de
EN-RAGE se muestra en la Figura 5. Por medio de
métodos conocidos por quien tiene experiencia en la técnica, se
podrían obtener compuestos homólogos de EN-RAGE
presentes en otras especies. Por ejemplo, secuencias únicas con
respecto a la secuencia de cDNA de ácido nucleico de
EN-RAGE bovino pueden ser utilizadas como sondas
para explorar un banco de cDNA humano con objeto de obtener el
compuesto homólogo humano.
Ligandos de RAGE tales como AGEs (AGEs
modificados con CML) y p12, una citocina proinflamatoria, activan
células inflamatorias. Esto se ha mostrado en ratones. Estos
efectos de activación quedan bloqueados en presencia de sRAGE. Por
lo tanto, se describen aquí métodos para bloquear la inflamación
(por ejemplo, la inflamación debida a una estimulación inmune) en
un sujeto mediante la administración de un compuesto que es capaz de
interferir en la interacción entre EN-RAGE y RAGE
en el sujeto. Dicho método sería selectivo para la inflamación. En
un ejemplo, el compuesto es diseñado específicamente como un
inhibidor competitivo de ligandos de RAGE.
El ensayo de exploración puede ser llevado a
cabo de modo que uno de los componentes esté unido o fijado a una
superficie sólida. En una realización, el péptido es fijado a una
superficie sólida. En otra realización, el segundo péptido que
tiene la secuencia del sitio de RAGE que se une a AGE es unido o
fijado a una superficie sólida. Las superficies sólidas útiles en
esta realización serían conocidas por quien tiene experiencia en la
técnica. Por ejemplo, una realización de una superficie sólida es un
glóbulo, una columna, una cubeta de plástico, una placa de
plástico, un portaobjetos de microscopio, una membrana de nailon,
etc. En un ejemplo, el material del que está compuesto la superficie
sólida es sintético.
Uno de los componentes de la operación (a) del
ensayo de exploración puede ser detectablemente marcado. El
componente (sea el compuesto, el péptido o el dominio V, o el
segundo péptido) puede ser marcado con un resto detectable que
incluye un marcador fluorescente, una biotina, una digoxigenina, un
átomo radiactivo, un ion paramagnético y un marcador
quimioluminiscente. El componente puede ser marcado por medios
covalentes, tales como medios químicos, enzimáticos u otros medios
apropiados, con un resto tal como una enzima o un radioisótopo.
En una realización, el sujeto es un mamífero. En
otra realización, el sujeto es un vertebrado. En una realización
preferida, el mamífero es un ser humano. En un ejemplo, el sujeto es
un sujeto diabético. En otro ejemplo del invento, el sujeto está
aquejado de diabetes, insuficiencia renal, amiloidosis,
envejecimiento o inflamación. El sujeto puede ser un sujeto obeso,
según se define mediante los patrones de peso y altura de la
American Medical Association. El sujeto puede ser de edad avanzada.
El sujeto puede ser un ser humano, un primate, un sujeto equino, un
sujeto ovino, un sujeto aviar, un sujeto bovino, un sujeto porcino,
un sujeto canino, un sujeto felino o un sujeto murino.
En una realización, el sujeto está aquejado de
una enfermedad relacionada con AGE. En otra realización, dicha
enfermedad relacionada con AGE se manifiesta en el cerebro, la
retina, el riñón, la vasculatura, el corazón o el pulmón. En otra
realización, el sujeto está aquejado de la enfermedad de Alzheimer o
de una enfermedad que se manifiesta por la acumulación de AGEs en
el sujeto. En otra realización, el sujeto está aquejado de síntomas
de diabetes, tales como lesiones de tejidos blandos, capacidad
reducida para ver, enfermedad cardiovascular, enfermedad renal, etc.
Di chos síntomas serían conocidos por quien tiene experiencia en la
técnica.
El compuesto puede ser un polipéptido. El
polipéptido puede ser un péptido, un compuesto peptidomimético, un
polipéptido sintético, un derivado de un polipéptido natural, un
polipéptido modificado, un polipéptido marcado o un polipéptido que
incluye péptidos no naturales. El compuesto péptidomimético puede
ser identificado mediante la exploración de bancos grandes de
compuestos diferentes que son peptidomiméticos, para determinar un
compuesto que sea capaz de prevenir la aterosclerosis acelerada en
un sujeto predispuesto a ello. El polipéptido puede ser un
polipéptido no natural que tenga una quiralidad no hallada en la
naturaleza, es decir, D-aminoácidos o
L-aminoácidos.
En una realización, el compuesto es un
antagonista, antagonista que es capaz de unirse al RAGE con mayor
afinidad que los AGEs, neutralizando así por competencia los efectos
de la union del AGE .
En otra realización, el compuesto puede ser una
ribozima que es capaz de inhibir la expresión de RAGE. En otra
realización, el compuesto es un anticuerpo
anti-RAGE, un anticuerpo anti-AGE o
un anticuerpo anti-dominio V de RAGE. El anticuerpo
puede ser monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado o
primatizado. El compuesto puede ser un fragmento de dicho
anticuerpo.
También se describe un método para administrar
al sujeto un vehículo farmacéuticamente aceptable durante la
administración del polipéptido. La administración puede comprender
una inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o
intravenosa; una infusión; una distribución mediada por liposomas; o
una distribución tópica, nasal, oral, ocular u óptica. En una
realización más, la administración incluye la administración
intrabronquial, anal o intratecal.
El polipéptido puede ser distribuido horaria,
diaria, semanal, mensual o anualmente (por ejemplo, en una forma de
liberación temporal) o como una distribución de una sola vez. La
distribución puede ser una distribución continua durante un periodo
de tiempo, tal como, por ejemplo, una distribución intravenosa.
La cantidad eficaz del polipéptido puede
comprender de aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal a
aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En una realización, la
cantidad eficaz puede comprender de aproximadamente 0,001 mg/kg de
peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. En otra
realización, la cantidad eficaz puede variar de aproximadamente
0,01 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso
corporal. La cantidad eficaz real se basará en el tamaño del
polipéptido, la biodegradabilidad del polipéptido, la bioactividad
del polipéptido y la biodisponibilidad del polipéptido. Si el
polipéptido no se degrada rápidamente, está biodisponible y es muy
activo, se requerirá una cantidad más pequeña para que sea eficaz.
La cantidad eficaz será conocida por quien tiene experiencia en la
técnica; también dependerá de la forma del polipéptido, el tamaño
del polipéptido y la bioactividad del polipéptido. Quien tuviera
experiencia en la técnica podría llevar rutinariamente a cabo
ensayos empíricos de actividad para un polipéptido, para determinar
la bioactividad en bioensayos y, de este modo, determinar la
cantidad eficaz.
En otra realización, el método puede comprender
además administrar un vehículo farmacéuticamente aceptable al
sujeto durante la administración del compuesto. La administración
puede comprender una inyección intralesional, intraperitoneal,
intramuscular o intravenosa; una infusión; una distribución mediada
por liposomas; o una distribución tópica, nasal, oral, ocular u
óptica.
El compuesto puede ser administrado horaria,
diaria, semanal, mensual o anualmente (por ejemplo, en una forma de
liberación temporal) o como una distribución de una sola vez. La
distribución o administración puede ser una distribución continua
durante un periodo de tiempo, tal como, por ejemplo, una
distribución intravenosa.
El compuesto puede ser un polipéptido sRAGE, tal
como compuestos polipeptídicos análogos de sRAGE. Dichos compuestos
análogos incluyen fragmentos de sRAGE. Siguiendo los procedimientos
de la solicitud publicada de Alton et al. (Documento WO
83/04053), se pueden diseñar y fabricar fácilmente genes que
codifiquen la expresión microbiana de polipéptidos que tienen
conformaciones primarias que difieren de la conformación aquí
especificada en términos de la identidad o posición de uno o más
residuos (por ejemplo, sustituciones, adiciones terminales e
intermedias, y deleciones). Alternativamente, se pueden realizar
fácilmente modificaciones de genes genómicos y de cDNA mediante
técnicas de mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas y se pueden
emplear las modificaciones para generar compuestos análogos y
derivados de un polipéptido sRAGE. Dichos productos comparten al
menos una de las propiedades biológicas de sRAGE pero pueden
diferir en otras. Como ejemplos los productos del invento incluyen
aquellos que están acortados mediante, por ejemplo, deleciones; o
aquellos que son más estables frente a la hidrólisis (y, por lo
tanto, pueden ejercer efectos más pronunciados o duraderos que los
productos presentes en la naturaleza); o que han sido alterados
para suprimir o añadir uno o más sitios potenciales de
O-glicosilación y/o N-glicosilación
o que tienen uno o más residuos de cisteína suprimidos o sustituidos
por, por ejemplo, residuos de alanina o serina y potencialmente son
más fácilmente aislados en forma activa a partir de sistemas
microbianos; o que tienen uno o más residuos de tirosina
reemplazados por fenilalanina y se unen más o menos fácilmente a
proteínas diana o a receptores presentes en células diana. Están
también comprendidos fragmentos polipéptidos que duplican sólo una
parte de la secuencia continua de aminoácidos o de conformaciones
secundarias de sRAGE, fragmentos que pueden poseer una propiedad de
sRAGE y no otras. Es digno de mención que no es necesaria la
actividad para que uno cualquiera o más de los polipéptidos del
invento tengan utilidad terapéutica o utilidad en otros contextos,
tal como en ensayos de antagonismo de sRAGE. Los antagonistas
competitivos pueden ser bastante útiles en, por ejemplo, casos de
sobreproducción de sRAGE.
Los informes de la propiedad inmunológica de
péptidos sintéticos que duplican sustancialmente la secuencia de
aminoácidos existente en proteínas, glicoproteínas y nucleoproteínas
presentes en la naturaleza son aplicables a los compuestos
polipeptídicos análogos del invento. Más específicamente, se ha
mostrado que polipéptidos de peso molecular relativamente bajo
participan en reacciones inmunes que tienen una duración y una
extensión similares a las de las reacciones inmunes de proteínas
fisiológicamente significativas, tales como antígenos víricos,
hormonas polipeptídicas, y similares. Entre las reacciones inmunes
de dichos polipéptidos se incluye la provocación de la formación de
anticuerpos específicos en animales inmunológicamente activos
[Lerner et al., Cell 23, 309-310 (1981);
Ross et al., Nature 294, 654-658 (1981);
Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,
4882-4886 (1.981); Wong et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79, 5322-5326 (1982); Baron et
al., Cell 28, 395-404 (1982); Dressman et
al., Nature 295, 158-160 (1982); y Lerner,
Scientific American 248, 66-74 (1983)]. Véase
también Kaiser et al., [Science 223, 249-255
(1984)] en relación con las propiedades biológicas e inmunológicas
de péptidos sintéticos que comparten aproximadamente las estructuras
secundarias de hormonas peptídicas pero que pueden no compartir su
conformación estructural
primaria.
primaria.
El compuesto aquí descrito puede ser un
compuesto peptidomimético que puede ser al menos parcialmente
artificial. El compuesto peptidomimético puede ser una pequeña
molécula mimética de una porción de la secuencia de aminoácidos de
sRAGE. El compuesto puede tener una estabilidad, una eficacia, una
potencia y una biodisponibilidad aumentadas en virtud del
mimetismo. Además, el compuesto puede tener una toxicidad reducida.
El compuesto peptidomimético puede tener una permeabilidad
aumentada en la mucosa intestinal. El compuesto puede ser preparado
sintéticamente. El compuesto del presente invento puede incluir
aminoácidos L, D o antinaturales, aminoácidos
alfa,alfa-disustituidos,
N-alquil-aminoácidos y ácido láctico
(un compuesto isoelectrónico análogo de alanina). La cadena
peptídica principal del compuesto puede tener al menos un enlace
sustituido por PSI-(CH=CH) (Kempf et al., 1991). El
compuesto puede incluir además trifluorotirosina,
p-Cl-fenilalanina,
p-Br-fenilalanina,
poli-L-propargilglicocola,
poli-D,L-alilglicocola o
poli-L-alilglicocola.
También se describe aquí un compuesto
peptidomimético que tiene un enlace, una cadena peptídica principal
o un aminoácido componente, sustituido por un mimetismo adecuado.
Los ejemplos de aminoácidos antinaturales que pueden ser mimetismos
adecuados de aminoácidos incluyen l-alanina, ácido
L-\alpha-aminobutírico, ácido
L-\gamma-aminobutírico, ácido
L-\alpha-aminoisobutírico, ácido
L-\varepsilon-aminocaproico, ácido
7-aminoheptanoico, ácido
L-aspartico, ácido L-glutámico,
cisteína (acetamidometílica),
N-\varepsilon-Boc-N-\alpha-CBZ-L-lisina,
N-\varepsilon-Boc-N-\alpha-Fmoc-L-lisina,
L-metionina-sulfona,
L-norleucina, L-norvalina,
N-\alpha-Boc-N-\delta-CBZ-L-ornitina,
N-\delta-Boc-N-\alpha-CBZ-L-ornitina,
Boc-p-nitro-L-fenilalanina,
Boc-hidroxiprolina y
Boc-L-tioprolina (Blondelle et
al., 1994; Pinilla et al., 1995).
En otra realización, el compuesto puede ser RAGE
soluble (sRAGE) o un fragmento del mismo. El RAGE soluble no está
situado en la superficie de la célula ni está asociado con una
membrana celular.
El sujeto puede ser un animal mamífero o no
mamífero. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un
ratón, una rata, una vaca, un mono, un caballo, un cerdo o un perro.
El sujeto puede ser un sujeto diabético.
La administración del compuesto puede ser por
inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o
intravenosa; infusión; distribución mediada por liposomas; o
distribución tópica, nasal, oral, anal, ocular u óptica. La
administración puede ser constante durante un cierto periodo de
tiempo, o periódica y a intervalos específicos. El vehículo puede
ser un agente diluyente, un aerosol, un vehículo tópico, una
disolución acuosa, una disolución no acusa o un vehículo sólido.
En la práctica de cualquiera de los métodos aquí
descritos o en la preparación de cualquiera de las composiciones
farmacéuticas, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una
cantidad con la que se puede prevenir la interacción
EN-RAGE/RAGE en un sujeto. En consecuencia, la
cantidad eficaz variará con el sujeto que se trata así como con el
estado que se va a tratar. Para los fines de este invento, los
métodos de administración van a incluir, pero no se limitan a, las
administraciones cutánea, subcutánea, intravenosa, parenteral, oral
y tópica, y mediante un aerosol.
Como se usa aquí, la expresión "vehículo
farmacéuticamente aceptable adecuado" abarca cualesquiera de los
vehículos farmacéuticamente aceptados estándares, tales como
disolución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales
como una emulsión de aceite/agua o una emulsión de triglicéridos,
diversos tipos de agentes humectantes, tabletas, tabletas
revestidas y cápsulas. Un ejemplo de una emulsión de triglicéridos
aceptable, útil para las administraciones intravenosa e
intraperitoneal de los compuestos, es la emulsión de triglicéridos
comercialmente conocida como Intralipid®.
Dichos vehículos contienen típicamente
excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de
arcilla, gelatina, ácido esteárico, talco, aceites o grasas
vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos
vehículos pueden también incluir aditivos saboreadores y colorantes,
u otros ingredientes.
También se describen aquí composiciones
farmacéuticas que incluyen cantidades terapéuticamente eficaces de
compuestos y composiciones polipeptídicas, junto con adecuados
agentes diluyentes, conservantes, agentes solubilizadores, agentes
emulsivos, agentes adyuvantes y/o vehículos. Dichas composiciones
pueden ser líquidos o ser formulaciones liofilizadas o, de lo
contrario, secadas, e incluyen agentes diluyentes de diferentes
tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato y fosfato),
pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina y gelatina para
evitar la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween
20, Tween 80, Pluronic F68, y sales de ácidos biliares), agentes
solubilizadores (por ejemplo, glicerol y polietilenglicol),
antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico y metabisulfito
sódico), conservantes (por ejemplo, Thimerosal, alcohol bencílico y
parabenos), sustancias para dar cuerpo o agentes modificadores de
la tonicidad (por ejemplo, lactosa y manitol), la fijación covalente
del compuesto a polímeros tales como polietilenglicol, la
complejación con iones metálicos, o la incorporación del compuesto
a preparaciones corpusculares de compuestos polímeros tales como
poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc., o a
liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o
multilaminares, fantasmas eritrocitarios o esferoplastos. Dichas
composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la
estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la
velocidad de aclaramiento in vivo del compuesto o la
composición. La elección de las composiciones dependerá de las
propiedades físicas y químicas del compuesto.
Las composiciones de liberación controlada o
continua incluyen la formulación en depósitos lipófilos (por
ejemplo, ácidos grasos, ceras y aceites). También se describen aquí
composiciones corpusculares revestidas con polímeros (por ejemplo,
poloxámeros o poloxaminas), y el compuesto copulado con anticuerpos
dirigidos contra antígenos, ligandos o receptores tisularmente
específicos o copulado con ligandos de receptores tisularmente
específicos. Otras realizaciones de las composiciones del invento
llevan incorporados revestimientos protectores de formas
corpusculares, inhibidores de proteasas o potenciadores de
permeación para las diversas vías de administración, incluyendo las
vías parenteral, pulmonar, nasal y oral.
Una vez administrados, los compuestos son a
menudo aclarados rápidamente de la circulación y, por lo tanto,
pueden generar una actividad farmacológica de duración relativamente
corta. En consecuencia, para mantener la eficacia terapéutica,
puede que sean necesarias inyecciones frecuentes de dosis
relativamente grandes de compuestos bioactivos. Se sabe que
compuestos modificados mediante la fijación covalente de polímeros
solubles en agua, tales como polietilenglicol, copolímeros de
polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa,
dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y
poliprolina, presentan, después de una inyección intravenosa,
semividas sanguíneas sustancialmente más largas que las de los
correspondientes compuestos no modificados (Abuchowski et
al., 1981; Newmark et al., 1982; y Katre et al.,
1987). Dichas modificaciones pueden además aumentar la solubilidad
del compuesto en una disolución acuosa, eliminar la agregación,
potenciar las estabilidades física y química del compuesto, y
reducir en gran medida la inmunogenicidad y la reactividad del
compuesto. Como resultado, se puede alcanzar la deseada actividad
biológica in vivo mediante la administración de dichos
aductos de polímero-compuesto menos frecuentemente o
en dosis menores que con el compuesto no modificado.
La fijación de polietilenglicol (PEG) a
compuestos es particularmente útil porque el PEG tiene una bajísima
toxicidad en mamíferos (Carpenter et al., 1971). Por ejemplo,
en Estados Unidos se aprobó un aducto de PEG y adenosina desaminasa
para uso en seres humanos, para el tratamiento del síndrome de
inmunodeficiencia combinada grave. Una segunda ventaja
proporcionada por la conjugación de PEG es la reducción eficaz de la
inmunogenicidad y la antigenicidad de compuestos heterólogos. Por
ejemplo, un aducto de PEG y una proteína humana podría ser útil
para el tratamiento de una enfermedad en otra especie de mamífero,
sin riesgo de desencadenar una respuesta inmune grave. El
polipéptido o la composición del presente invento se puede
distribuir en un dispositivo de microencapsulación con objeto de
reducir o evitar una respuesta inmune del huésped contra el
polipéptido o contra células que pueden producir el polipéptido. El
polipéptido o la composición del presente invento se puede también
distribuir microencapsulado en una membrana, tal como un
liposoma.
Se pueden fijar convenientemente polímeros tales
como PEG a uno o más residuos de aminoácido reactivos de una
proteína, tales como el grupo alfa-amino del
aminoácido amino-terminal, los grupos
épsilon-amino de cadenas laterales de lisina, los
grupos sulfhidrilo de cadenas laterales de cisteína, los grupos
carboxilo de cadenas laterales de aspartilo y glutamilo, el grupo
alfa-carboxilo del aminoácido
carboxi-terminal, y las cadenas laterales de
tirosina, o a derivados activados de cadenas glicosílicas fijadas a
ciertos residuos de asparagina, serina o treonina.
Se han descrito numerosas formas activadas de
PEG, adecuadas para la reacción directa con proteínas. Los reactivos
útiles para la reacción de PEG con grupos amino de proteínas
incluyen ésteres activos de derivados de ácido carboxílico o
carbonato, particularmente aquellos en que los grupos lábiles son
N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol,
imidazol o
1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato.
Los derivados de PEG que contienen grupos maleimido o haloacetilo
son reactivos útiles para la modificación de grupos sulfhidrilo
proteicos libres. Asimismo, los reactivos para PEG que contienen
grupos amino-hidrazina o hidrazida son útiles para
la reacción con aldehídos generados por la oxidación de grupos
carbohidrato de proteínas con peryodato.
En una realización preferida, el vehículo
farmacéutico puede ser un líquido y la composición farmacéutica
estaría en forma de disolución. En otra realización igualmente
preferida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un sólido y
la composición está en forma de un polvo o una tableta. En una
realización más, el vehículo farmacéutico es un gel y la
composición está en forma de un supositorio o una crema. En una
realización más, el ingrediente activo puede ser formulado como una
parte de un parche transdérmico farmacéuticamente aceptable.
Un vehículo sólido puede incluir una o más
sustancias que pueden también actuar como agentes saboreadores,
lubricantes, agentes solubilizadores, agentes suspendedores, cargas,
agentes mejoradores de la fluencia, agentes auxiliares de la
compresión, aglutinantes o agentes disgregantes de tabletas; también
puede ser un material de encapsulación. En los polvos, el vehículo
es un sólido finamente dividido que está mezclado con el ingrediente
activo finamente dividido. En las tabletas, se mezcla el
ingrediente activo con un vehículo que tiene las propiedades de
compresión necesarias, en las proporciones adecuadas, y se compacta
la mezcla hasta la forma y el tamaño deseados. Los polvos y las
tabletas contienen preferiblemente hasta 99% del ingrediente activo.
Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato
cálcico, estearato magnésico, talco, azúcares, lactosa, dextrina,
almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo
punto de fusión y resinas de intercambio iónico.
Para preparar disoluciones, suspensiones,
emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas, se
utilizan vehículos líquidos. El ingrediente activo puede ser
disuelto o suspendido en un vehículo líquido farmacéuticamente
aceptable, tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de
ambos, o grasas o aceites farmacéuticamente aceptables. El vehículo
líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados, tales
como agentes solubilizadores, agentes emulsivos, tampones,
conservantes, agentes edulcorantes, agentes saboreadores, agentes
suspendedores, agentes espesantes, colorantes, agentes reguladores
de la viscosidad, estabilizantes y osmorreguladores. Los ejemplos
adecuados de vehículos líquidos para administraciones oral y
parenteral incluyen agua (que parcialmente contiene aditivos como
los anteriores, tales como, por ejemplo, derivados de celulosa,
preferiblemente una disolución de
carboxilmetil-celulosa sódica), alcoholes
(incluyendo alcoholes monohidroxilados y alcoholes polihidroxilados
tales como, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por
ejemplo, aceite de cacahuete y aceite de coco fraccionados). Para
administración parenteral, el vehículo puede ser también un éster
oleoso, tal como oleato de etilo o miristato de isopropilo. Los
vehículos líquidos estériles son útiles en las composiciones
estériles en forma líquida para administración parenteral. El
vehículo líquido para composiciones presurizadas puede ser un
hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente
aceptable.
Las composiciones farmacéuticas líquidas que son
disoluciones o suspensiones estériles pueden ser utilizadas, por
ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural,
intraperitoneal o subcutánea. Las disoluciones estériles pueden ser
también administradas intravenosamente. El ingrediente activo puede
ser preparado como una composición sólida estéril que puede ser
disuelta o suspendida en el momento de la administración utilizando
agua o disolución salina estériles, u otro medio inyectable estéril
apropiado. Se considera que los vehículos incluyen los necesarios e
inertes aglutinantes, agentes suspendedores, lubricantes, agentes
saboreadores, edulcorantes, conservantes, colorantes y
revestimientos.
El ingrediente activo del presente invento puede
ser administrado oralmente en forma de una disolución o suspensión
estéril que contiene otros solutos o agentes suspendedores, tales
como, por ejemplo, disolución salina o glucosa suficientes para
hacer isotónica la disolución, sales biliares, goma arábiga,
gelatina, monooleato de sorbitán, Polysorbate 80 (ésteres de oleato
de sorbitol y sus anhídridos, copolimerizados con óxido de etileno)
y similares.
El ingrediente activo puede ser también
administrado oralmente en forma de composición líquida o sólida. Las
composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas
sólidas tales como píldoras, cápsulas, gránulos, tabletas y polvos,
y formas líquidas tales como disoluciones, jarabes, elixires y
suspensiones. Las formas útiles para administración parenteral
incluyen disoluciones, emulsiones y suspensiones estériles.
En otra realización del presente invento, el
sujeto puede tener diabetes. El sujeto puede presentar
complicaciones asociadas con la diabetes. Algunos ejemplos de
dichas complicaciones incluyen la activación de receptores de AGE
de células endoteliales y macrófagos, y proteínas de la membrana
basal, la matriz y lipoproteínas alteradas; contractilidad y
sensibilidad hormonal del músculo liso vascular alteradas;
permeabilidad de células endoteliales alterada; acumulación de
sorbitol; y agotamiento de mioinositol neural o actividad ATPasa
Na-K alterada. Dichas complicaciones se discuten en
una reciente publicación de Porte y Schwartz, "Diabetes
Complications: Why is Glucose potentially Toxic?", Science,
volumen 272, páginas 699-700.
Se describe aquí un método para suprimir la
inflamación en un sujeto al interferir en la interacción
EN-RAGE/
RAGE en la hipersensibilidad de tipo retardado, la colitis inflamatoria, la enfermedad inflamatoria intestinal crónica, la colitis ulcerosa y trastornos inflamatorios crónicos tales como aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, diabetes e insuficiencia renal.
RAGE en la hipersensibilidad de tipo retardado, la colitis inflamatoria, la enfermedad inflamatoria intestinal crónica, la colitis ulcerosa y trastornos inflamatorios crónicos tales como aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, diabetes e insuficiencia renal.
Se describe aquí un método para activar factores
de transcripción a través de la interacción de
EN-RAGE y RAGE. En una realización, el factor de
transcripción es NF-\kappaB. En otra realización,
el factor de transcripción es IL-1\beta. En otra
realización, el factor de transcripción es
TNF-\alpha. En otra realización, el factor de
transcripción es IL-2.
Se describe aquí un método para activar células
esenciales para la respuesta inflamatoria a través de la interacción
entre RAGE y EN-RAGE o moléculas similares a
EN-RAGE.
Se describe aquí un método para alterar el
citoesqueleto y la forma celular, la transducción de señales, y la
modulación de la función fagocítica incluyendo la quimiotaxis, la
fagocitosis, la desgranulación y la generación de productos
reactivos.
Se describe aquí un método para tratar la
enfermedad de Alzheimer al prevenir la interacción entre RAGE y el
péptido \beta amiloide.
Se describe aquí un método para inhibir la
activación celular crónica, que comprende administrar un agente
capaz de inhibir la interacción entre EN-RAGE y RAGE
a un sujeto que padece activación celular crónica. En una
realización, el agente es RAGE soluble, un anticuerpo
anti-RAGE, un anticuerpo
anti-EN-RAGE, o un fragmento de
cualquiera de estos anticuerpos, tal como un fragmento
F(ab').
Se describe aquí un método para la inhibición
del daño tisular debido a la inflamación, que comprende administrar
un agente capaz de inhibir la interacción entre
EN-RAGE y RAGE a un sujeto que padece activación
celular crónica.
Se describe aquí un método para inhibir la
inflamación en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto
aquejado de inflamación un agente capaz de inhibir la interacción
entre EN-RAGE y RAGE en una cantidad suficiente
para inhibir la interacción entre RAGE y EN-RAGE en
el sujeto, inhibiéndose de este modo la inflamación en el sujeto.
En una realización, el agente es RAGE soluble, un anticuerpo
anti-RAGE, un anticuerpo
anti-EN-RAGE, o un fragmento de
cualquiera de estos anticuerpos, tal como un fragmento
F(ab').
El nivel de activación celular en un sujeto
puede ser medido de muchas formas, y dichas formas son conocidas
por quien tiene experiencia en la técnica. Por ejemplo, se podría
medir el nivel de ciertas moléculas que son indicativas de
activación, tales como interleucina 1-beta,
TNF-\alpha y otras citocinas conocidas por ser
indicativas de la presencia de una respuesta inflamatoria.
Se describe aquí un método para tratar la
colitis en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un agente
capaz de inhibir la interacción entre RAGE y EN-RAGE
en el sujeto con objeto de disminuir la inflamación crónica y tratar
de ese modo la colitis en el sujeto.
Se describe aquí un método para inhibir la
inflamación en un sujeto, que comprende administrar al menos un
agente capaz de inhibir la interacción entre RAGE y
EN-RAGE en el sujeto, inhibiéndose de este modo la
inflamación en el sujeto. En una realización, se administran tanto
un anticuerpo anti-RAGE como un anticuerpo
anti-EN-RAGE.
Este invento es ilustrado en la sección
"Detalles Experimentales" que viene a continuación. Estas
secciones se exponen para facilitar la comprensión del invento pero
no están destinadas a limitar, ni se debe considerar que limitan, en
modo alguno el invento como se expone en las reivindicaciones que
vienen más adelante.
Experimento nº
1
El presente invento proporciona una nueva
molécula proinflamatoria de tipo citocina (EN-RAGE)
(que tiene cierta similitud de secuencia con la familia de las
moléculas de calgranulina). EN-RAGE es una proteína
situada dentro de células inflamatorias (tales como neutrófilos) y
que puede ser liberada por dichas células inflamatorias.
EN-RAGE
tiene una actividad biológica que puede ser responsable de la propagación y el mantenimiento de una respuesta inflamatoria al interaccionar con el receptor celular RAGE.
tiene una actividad biológica que puede ser responsable de la propagación y el mantenimiento de una respuesta inflamatoria al interaccionar con el receptor celular RAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de RAGE, el receptor de los
productos finales de glicosilación avanzada, se ve aumentada en el
escenario de la inflamación. Se presenta aquí un nuevo miembro de la
familia calgranulínica de citocinas proinflamatorias, denominado
EN-RAGE (o nueva proteína extracelular ligante de
RAGE), que interacciona con el RAGE de células tales como las
células endoteliales para alterar propiedades celulares de un modo
consistente con la perturbación. En un modelo de hipersensibilidad
retardada, la administración de RAGE soluble (el dominio
extracelular de RAGE que se une al ligando; sRAGE) o fragmentos
F(ab')_{2} anti-RAGE o
anti-EN-RAGE atenuaba notablemente
la inflamación. Estos datos relacionan a RAGE con la respuesta
inflamatoria e identifican a EN-RAGE y RAGE como
nuevas dianas para intervención antiinflamatoria. Por lo tanto, el
RAGE soluble es además una estructura prototípica para el diseño de
una nueva clase de agentes antiinflamatorios.
El receptor de AGE (RAGE) es un miembro de la
superfamilia inmunoglobulínica de moléculas de la superficie
celular (1-2). Originalmente identificado y
caracterizado como un receptor celular de proteínas modificadas con
glucosa (aldosa), o productos finales de glicosilación avanzada
(AGEs) (3-13), de RAGE se ha comunicado
posteriormente que interacciona con otros ligandos, tanto en
escenarios de desarrollo normal como en la enfermedad de Alzheimer
(14-16). En el desarrollo normal, RAGE interacciona
con anfoterina, un polipéptido que media en la emergencia de
neuritas en neuronas embrionarias en cultivo. En estos estudios,
F(ab')_{2} anti-RAGE o RAGE soluble
(sRAGE) inhibía la emergencia de neuritas en matrices revestidas con
anfoterina pero no en matrices revestidas con otros sustratos tales
como laminina y poli-1-lisina (3).
En estudios posteriores, el RAGE fue identificado como un receptor,
presente en neuronas y microglía, del péptido \beta amiloide, un
polipéptido ligado a la patogénesis de la toxicidad neuronal y la
muerte en la enfermedad de Alzheimer.
En observaciones de nuestro laboratorio no
publicadas, se advirtió una expresión aumentada de RAGE en las
células vasculares e inflamatorias de lesiones inflamatorias, tal
como en el tejido renal de pacientes con nefritis por lupus activo
(Figura 1). Por lo tanto, se formuló la hipótesis de que RAGE podría
interaccionar con un(os) ligando(s)
alternativo(s) en ese escenario, quizás con objeto de
participar en la respuesta inflamatoria.
Los hallazgos presentes demuestran que RAGE
interacciona con una molécula que tiene una homología próxima a la
de la calgranulina C. Hemos llamado EN-RAGE (nueva
proteína extracelular ligante de RAGE) a esta molécula y mostrado
que la interacción EN-RAGE:RAGE activa células tales
como células endoteliales, las cuales están importantemente
implicadas en la respuesta inflamatoria. En un modelo de
hipersensibilidad retardada murina, la administración de RAGE
soluble (sRAGE), que contiene el dominio de interacción con el
ligando, inhibe el desarrollo de la activación celular y la
inflamación. Estos hallazgos identifican a RAGE como una nueva diana
para intervención antiinflamatoria.
Se sometió polvo acetónico de pulmón bovino
(SIGMA®) a solubilización en un tampón que contenía Tris (0,02 M,
pH de 7,4), NaCl (0,15 M),
octil-\beta-glucósido (1%) e
inhibidores de proteasas (PMSF y aprotinina). Después de una
cromatografía en serie sobre SP Sepharose (Pharmacia LKB®) y resina
Affi-Gel 10 (BIO-RAD®) a las que se
había adsorbido RAGE soluble humano purificado (preparado a partir
de un sistema de expresión baculovírico), se identificaron
proteínas ligantes de RAGE basándose en un ensayo de exploración en
que se empleaban una fracción inmovilizada de columna (placas Nunc
Maxisorp; NUNC®) y sRAGE marcado con ^{125}I, como antes. Después
de una elución con tampón que contenía heparina (1 mg/ml), se
identificaron las fracciones positivas. Las proteínas ligantes de
RAGE fueron sometidas a un análisis de secuencias.
Clonación de EN-RAGE. El
cDNA de EN-RAGE fue clonado a partir de un banco de
pulmón bovino y fue introducido en un sistema de expresión
baculovírico. En este sistema, se sintetizó EN-RAGE,
que carece de una secuencia líder, dentro de células Sf9. Luego se
purificó EN-RAGE después de una solubilización de
las células en tampón que contenía detergente y una purificación
secuencial en hidroxilapatito y resinas que contenían heparina. El
producto final presentaba una única banda en electroforesis en geles
de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE; del inglés, sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis), teñidos con Coomassie, y estaba
desprovisto de endotoxina tras una cromatografía en columnas
Detoxi-GEL (PIERCE®). La ausencia de endotoxina
detectable fue confirmada utilizando el ensayo de amebocitos de
Limulus (SIGMA®).
Análisis de secuencias. Después de que la
SDS-PAGE permitiera identificar un polipéptido de
\approx 12 kDa con actividad ligante de RAGE, la banda del gel
fue eluida de acuerdo con métodos previamente publicados (17). El
método publicado fue modificado mediante la adición de un lavado
final con dos partes alícuotas (0,1 ml cada una) de guanidina (5,0
M), urea (5,0 M), ácido trifluoroacético (0,2%), acetonitrilo (10%)
y Zwittergent 3-08 (1,0%; Calbiochem) para asegurar
que la proteína era completamente separada del filtro por lavado. Se
llevó a cabo un análisis de la secuencia
amino-terminal. Se llevó a cabo una degradación
automatizada de Edman empleando un secuenciador
HP-G1005A (Hewlett Packard Analytical Instruments).
Con objeto de obtener la secuencia interna, las bandas de los geles
fueron tratadas del modo anterior para la elución salvo porque el
tampón de extracción contenía la mitad de la cantidad habitual de
SDS (1). Se añadió endoproteinasa Lys-C (1 \mug;
Boehringer Mannheim) y se incubó la muestra durante la noche. El
producto de digestión fue luego fraccionado mediante cromatografía
de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high
performance liquid chromatography), de
microcalibre (Michrom Bioresources), en una columna
PLRP-S de 1 mm x 50 mm (Polymer Laboratories, Ltd.).
El gradiente utilizado fue 2% por minuto a partir de acetonitrilo
(5-75%) en ácido trifluoroacético (0,1%), y se
recogieron fracciones a intervalos de 30 segundos. Se verificó la
absorbancia a 214 nm, y las fracciones que correspondían a picos
cromatográficos fueron luego sometidas al análisis de
secuencias.
Activación de células endoteliales. Se
aislaron, caracterizaron y mantuvieron células endoteliales de vena
de cordón umbilical humano de la manera previamente descrita (18).
Se cultivaron las células durante 24 horas en medio RPMI 1640
exento de suero, sin factor de crecimiento de células endoteliales,
y luego se estimularon con las concentraciones indicadas de
EN-RAGE. Donde se indica, las células fueron
pretratadas con IgG anti-RAGE humano generada en
conejo o con IgG no inmune de conejo; en ciertos casos, el
EN-RAGE fue pretratado con la concentración
indicada de RAGE soluble (sRAGE) durante 2 horas antes de la
estimulación con EN-RAGE. Después de ocho horas de
estimulación con EN-RAGE, las células fueron fijadas
con paraformaldehído (2%) durante 30 minutos, lavadas dos veces con
PBS y tratadas con PBS que contenía leche seca sin grasa (5%) y BSA
(2,5%) para bloquear los sitios de unión inespecífica de la
superficie celular. Se llevó a cabo un ELISA de la superficie
celular empleando IgG anti-VCAM-1
(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, California, EE.UU.). La
valoración de la actividad VCAM-1 funcional fue
determinada utilizando células Molt-4 (ATCC)
marcadas con ^{51}Cr, de la manera previamente descrita (10).
Modelo de hipersensibilidad retardada. Se
estableció un modelo murino de hipersensibilidad retardada basándose
en estudios previamente publicados (19). Se sensibilizaron hembras
de ratón CF-1 (Charles River Laboratories), de 6
semanas de edad, mediante una inyección subcutánea de una emulsión
(0,1 ml) que contenía BSA metilada (mBSA; 25 mg/ml; SIGMA®), NaCl
(0,9%), dextrano (peso molecular de 5-40 x 10^{6};
50 mg/ml; SIGMA®) y adyuvante incompleto de Freund (50%; ICN
Biomedical) en el ganglio linfático inguinal izquierdo. Tres semanas
más tarde, se inyectó subcutáneamente mBSA (0,4 mg/ml; 0,050 ml) en
la zona plantar de la pata trasera izquierda. Donde se indica, los
ratones fueron pretratados con una inyección intraperitoneal de
sRAGE (dosis indicada), albúmina sérica de ratón (SIGMA®) o
fragmentos F(ab')_{2} inmunes o no inmunes (preparados
utilizando un sistema de Pierce) 24 y 12 horas antes de, y 6 y 12
horas después de, la estimulación local con mBSA. 24 horas después
de la inyección de mBSA en la almohadilla de la pata, se realizó la
calificación clínica de la almohadilla de la pata. Luego se
sacrificaron humanamente los ratones y se congelaron o fijaron en
formol (10%) las patas para un análisis ulterior. Se llevó a cabo
la calificación histológica sobre cortes de patas teñidos con
hematoxilina y eosina (H&E; SIGMA®). La calificación clínica
fue definida del modo siguiente (escala: 1-5): 1 =
ausencia de inflamación y, por lo tanto, identidad con respecto a
la pata no tratada; 2 = rubefacción y edema ligeros; 3 =
rubefacción y edema intensos con arrugamiento de la piel de la
almohadilla de la pata; 4 = rubefacción y edema intensos sin
arrugamiento de la piel de la almohadilla de la pata; y 5 =
rubefacción y edema intensos que dan lugar a separación de los
dedos. La calificación histológica después de la tinción con
hematoxilina y eosina fue definida del modo siguiente (escala:
1-5): 1 = sin infiltración leucocitaria y con ligero
edema subcutáneo; 2 = ligera infiltración leucocitaria perivascular
con ligero edema subcutáneo; 3 = intensa infiltración leucocitaria
sin granulomas; y 4 = intensa infiltración leucocitaria con
granulomas.
Identificación de
EN-RAGE. Después de una serie de sucesivos
experimentos diseñados para identificar proteínas ligantes de RAGE
procedentes de extracto pulmonar bovino (del que se purificó
originalmente el RAGE), se identificó un polipéptido de \approx
12 kDa. Tras el análisis de la secuencia, se halló que este
polipéptido presenta una homología significativa con respecto a
miembros de la familia proteínica de la calgranulina C (Tabla 1)
(20-21). Esta clase de proteínas existe
intracelularmente en las células inflamatorias. Se formuló el
postulado de que, tras la liberación en loci inflamados, podría ser
capaz a su vez de afectar y activar otras células ya reclutadas en
la respuesta inflamatoria. Por lo tanto, esto podría representar un
medio importante mediante el cual podría propagarse y mantenerse la
respuesta inflamatoria, aumentando por ello la probabilidad de daño
celular.
EN-RAGE activa células
endoteliales de un modo dependiente de RAGE. Para probar esta
hipótesis, se purificó EN-RAGE del modo
anteriormente descrito y se incubó con células endoteliales (EC; del
inglés, endothelial cells). La incubación de
EN-RAGE con HUVECs dio lugar a un aumento de la
molécula 1 de adhesión de células vasculares
(VCAM-1; del inglés, vascular cell
adhesion molecule-1) en la superficie
celular de un modo dependiente de RAGE (Figura 2). Estos datos
sugerían que, en un foco inflamatorio, la interacción de
EN-RAGE con RAGE de EC podría representar un medio
mediante el cual se propagara más una respuesta inflamatoria.
Consecuentemente con el aumento de antígeno VCAM-1
en la superficie de ECs tratadas con EN-RAGE, se
originó una unión aumentada de células Molt-4 (que
contienen el ligando de VCAM-1,
VLA-4) (Figura 3). Mientras que la incubación con
BSA o con IgG no inmune no afectaba a la capacidad de
EN-RAGE para activar VCAM-1 de ECs,
la incubación con sRAGE o F(ab')_{2}
anti-RAGE atenuaba significativamente la capacidad
de EN-RAGE para aumentar la unión de
Molt-4 a HUVECs tratadas.
Se buscó probar estas hipótesis en modelos in
vivo. Se demostró que en ratones diabéticos, en los que es
probable que el ligando de RAGE sea, al menos en parte, productos de
glicosilación/oxidación de proteínas/lípidos, los productos finales
de glicosilación avanzada o AGEs, la administración de la porción
soluble de RAGE que se une al ligando (RAGE soluble o sRAGE)
suprimía la aterosclerosis acelerada en ratones diabéticos
deficientes en apolipoproteína E (12) y mejoraba la cicatrización
de heridas en ratones db+/db+ genéticamente diabéticos (22). De
este modo, en presencia de sRAGE se podrían suprimir los efectos
biológicos de EN-RAGE en focos muy inflamatorios,
tales como los caracterizados por modelos de lesiones inflamatorias
granulomatosas (hipersensibilidad retardada).
Para probar esto, se estudió un modelo de
hipersensibilidad retardada (DH; del inglés, delayed
hypersensitivity) en que primero se sensibilizaban ratones
mediante la inyección de BSA metilada (mBSA, que no se une a RAGE)
en los ganglios linfáticos inguinales de hembras de ratón
CF-1. Tres semanas después de la sensibilización,
los ratones fueron estimulados con mBSA inyectada en la almohadilla
de la pata trasera. Se definió una calificación de inflamación
mediante una escala de 1-9 que incluía tanto la
calificación clínica (1-4) como la calificación
histológica (1-5), como se indica en la Figura
4.
Consecuentemente con nuestra hipótesis, la
administración de sRAGE suprimía la inflamación tras la inyección
de mBSA en la almohadilla de la pata de ratones previamente
sensibilizados con mBSA inyectada en los ganglios linfáticos, de
una manera dependiente de la dosis (Figura 4). Con cerca de 100
\mug de sRAGE, la inflamación resultaba notablemente suprimida (p
< 0,01). Por contraste, la administración de albúmina sérica de
ratón no ejercía efecto alguno sobre el aspecto de la lesión
inflamatoria (Figura 4). Consecuentemente con el importante papel
de EN-RAGE y RAGE en el desarrollo de la inflamación
en este modelo, el tratamiento de los ratones con
F(ab')_{2} anti-EN-RAGE o
F(ab')_{2} anti-RAGE suprimía
considerablemente la inflamación (p < 0,05 en cada caso en
comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune).
Cuando los ratones fueron tratados tanto con F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE como con
F(ab')_{2} anti-RAGE, resultó una supresión
aún mayor de la respuesta inflamatoria (p < 0,05 en comparación
con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune) (Figura
4).
Ciertamente, el fenotipo de inflamación
observado en las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado
representa la culminación de una interacción y una contribución
complejas de múltiples tipos celulares y sus mediadores celulares.
En el desarrollo de la inflamación, una fuente importante de los
estímulos puede proceder de las propias células inflamatorias. Tras
el reclutamiento inicial en un locus inflamatorio, células tales
como neutrófilos y macrófagos pueden liberar mediadores tales como
los de la familia calgranulínica, incluyendo
EN-RAGE, y propagar y mantener la respuesta
inflamatoria. Es probable que dichos mediadores, tales como
EN-RAGE, requieran receptores celulares para iniciar
procesos que culminarán en una expresión génica alterada.
Nuestros datos sugieren acusadamente que la
interacción EN-RAGE/RAGE es un factor importante en
estos procesos. Se advirtió una supresión casi completa de la
inflamación en presencia de sRAGE, de un modo dependiente de la
dosis. Según nuestros estudios, sRAGE puede actuar como un señuelo
en este escenario para unirse a EN-RAGE antes de
que éste pueda interaccionar con células que contienen RAGE,
implicadas en la respuesta inflamatoria. Además, en presencia de
F(ab')_{2}
anti-RAGE/anti-EN-RAGE
o anti-RAGE +
anti-EN-RAGE, se observó una
supresión sustancial de la inflamación, lo que indica además un
papel de estos factores en la modulación de la respuesta
inflamatoria.
Por supuesto, es importante advertir que en
estos escenarios pueden estar operativos mecanismos alternativos
que sirvan de base a los efectos beneficiosos de sRAGE. Sin embargo,
los estudios anteriormente expuestos en que se emplean los
fragmentos F(ab')_{2} indicados implican acusadamente a
EN-RAGE y RAGE en la evolución de la respuesta
inflamatoria en este escenario.
En conclusión, los estudios aquí presentados
implican centralmente a RAGE en la respuesta inflamatoria e
identifican a RAGE soluble como una estructura prototípica para el
desarrollo de nuevos agentes antiinflamatorios.
Nota: la Figura 5 muestra la secuencia de ácido
nucleico (secuencia de cDNA) del EN-RAGE bovino.
La expresión del receptor de AGE (RAGE) está
aumentada en escenarios inflamatorios tales como aterosclerosis y
vasculitis autoinmunes. Proponemos la hipótesis de que, en tales
escenarios, el receptor de AGE (RAGE) podría interaccionar con
ligandos alternativos además de con los productos finales de
glicosilación avanzada (AGEs). Se aisló y purificó un polipéptido
de \approx 12 kDa a partir de extracto de pulmón bovino, que
presentaba homología con respecto a la familia calgranulínica de
mediadores proinflamatorios. Este polipéptido, llamado
EN-RAGE, se une a RAGE inmovilizado y a RAGE de
células endoteliales (EC)/macrófagos (MP) en pocillos de cultivo
con una Kd \approx 75 nM, procesos que resultan bloqueados en
presencia de IgG anti-RAGE o de RAGE soluble
(sRAGE; los dos tercios extracelulares de RAGE). In vitro, la
exposición de ECs cultivadas a EN-RAGE aumentó la
activación de NF-\kappaB, la expresión de
VCAM-1 de la superficie celular (4,3 veces en
comparación con el tratamiento con albúmina sérica bovina, BSA) y
la adhesión de células Molt-4 (que llevan
VLA-4, el contraligando de VCAM-1)
(siete veces en comparación con BSA), todo de una manera inhibida en
presencia de IgG anti-RAGE o sRAGE. La exposición
de macrófagos a EN-RAGE dio lugar a una quimiotaxis
aumentada de un modo dependiente de RAGE. Para probar estos
conceptos in vivo, se utilizó un modelo de hipersensibilidad
retardada en ratones, a los que se indujo una inflamación
localizada mediante inyecciones de BSA metilada (mBSA) en las
almohadillas de las patas. Un pretratamiento (intraperitoneal; ip)
con sRAGE evitó la inflamación mediada por mBSA, de un modo
dependiente de la dosis. Con 100 \mug de sRAGE ip, la pata tratada
con mBSA no manifestó inflamación y presentó una activación
notablemente disminuida de NF-\kappaB en
comparación con la de ratones tratados con vehículo, albúmina
sérica de ratón (MSA); además, se evitó completamente la elaboración
de TNF-alfa en el suero. Se observaron respuestas
antiinflamatorias parciales tras el tratamiento de los ratones con
F(ab')_{2} anti-RAGE o
anti-EN-RAGE. El F(ab')_{2}
no inmune no produjo efecto alguno. Considerados conjuntamente,
estos hallazgos indican que ligandos alternativos a AGEs tales como
EN-RAGE activan ECs y MPs, lo que liga RAGE a la
respuesta inflamatoria generalizada.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de sRAGE o de compuestos que son capaces
de inhibir la interacción de EN-RAGE y RAGE podría
ser útil para el tratamiento del choque séptico o la sepsis en
sujetos. Se ha mostrado que un sujeto que recibe dosis letales de
LPS presenta una mortalidad reducida cuando el LPS se administra en
presencia de sRAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha mostrado que el receptor soluble de AGE
(sRAGE) evita la inflamación en un modelo de hipersensibilidad de
tipo retardado. Se cree que sRAGE, a diferencia de ciertos agentes
de tipo antiinflamatorio, podría ejercer efectos beneficiosos
cuando se administra en el escenario de una endotoxemia, un
resultado prototípico de, por ejemplo, una intensa bacteriemia Gram
negativa.
Cuando se administraron dosis uniformemente
letales de LPS a ratones Balb/C (= 750 \mug), la administración
de sRAGE (antes o después de la inyección de LPS) evitó la muerte en
\approx 50% de los ratones en estudios piloto.
Estos datos subrayan la proposición de que los
potentes efectos antiinflamatorios de sRAGE no están asociados con
una inclinación adversa hacía morbilidad/mortalidad a causa de la
presencia de septicemia/endotoxemia. Por lo tanto, sRAGE puede ser
un agente antiinflamatorio selectivo con efectos protectores
selectivos frente a respuestas inflamatorias mal adaptadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujo artritis en ratones dba mediante
sensibilización con colágeno II bovino. Ciertos ratones (20) fueron
tratados con RAGE soluble murino (100 \mug/día administrados
intraperitonealmente); otros (20) fueron tratados con albúmina
sérica murina, como tratamiento con vehículo. La mitad de los
ratones fue sacrificada 6 semanas más tarde; la mitad restante fue
sacrificada 9 semanas más tarde.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos son los siguientes:
1. Se midió la hinchazón articular en los
ratones tratados con sRAGE frente a los tratados con albúmina. La
hinchazón articular aumentó 2 veces en los ratones tratados con
albúmina frente a los tratados con sRAGE; p < 0,05 en ambos
momentos.
2. En el momento de las 9 semanas, los niveles
plasmáticos del factor alfa de necrosis tumoral eran 3 veces mayores
en los ratones tratados con albúmina frente a los tratados con sRAGE
(p < 0,05).
3. Una inyección local de colágeno II bovino en
la oreja dio lugar a un aumento de 2 veces del espesor de la oreja
en los ratones tratados con albúmina; no se advirtió cambio alguno
de la línea de base en los ratones tratados con sRAGE (p <
0,05).
4. Los niveles de monocitos en sangre periférica
eran 2,5 veces menores en los ratones tratados con sRAGE frente a
los tratados con albúmina (p < 0,05), lo que sugiere una
inflamación disminuida.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Experimento nº
2
Los polipéptidos S100/calgranulina están
presentes en sitios de inflamación, probablemente liberados por
células inflamatorias dirigidas a dichos loci por una diversidad de
señales ambientales. Se comunica aquí que el receptor de AGE (RAGE)
es el receptor de la superficie celular para EN-RAGE
(nueva proteína extracelular ligante de RAGE) y miembros
relacionados de la superfamilia de S100/calgranulina. La interacción
de EN-RAGEs con RAGE celular en el endotelio,
fagocitos mononucleares y linfocitos desencadena una activación
celular, con generación de mediadores proinflamatorios esenciales.
El bloqueo de EN-RAGE/RAGE sofoca la
hipersensibilidad de tipo retardado y la colitis inflamatoria en
modelos murinos al detener la activación de las vías centrales de
señalización y la expresión de genes inflamatorios. Estos datos
destacan un nuevo paradigma en la inflamación e identifican nuevos
papeles para EN-RAGEs y RAGE en la activación
celular y el daño tisular crónicos.
El receptor de los productos finales de
glicosilación avanzada (RAGE), un miembro de la superfamilia
inmunoglobulínica de moléculas de la superficie celular (Schmidt
et al., 1992; Neeper et al., 1992), interacciona con
diferentes ligandos. Aunque el RAGE fue originalmente descrito como
un receptor celular de productos finales de glicosilación avanzada
(AGEs), los productos de glicoxidación que se acumulan en trastornos
tales como la diabetes y la insuficiencia renal (Brownlee et
al., 1988; Sell y Monnier, 1989; Reddy et al., 1995;
Miyata et al., 1996 a,b), datos recientes indican que está
surgiendo un papel importante para RAGE en una diversidad de
escenarios, tanto en la homeostasis como en estados
patofisiológicamente importantes (Hori et al., 1995; Yan
et al., 1996; Yan et al., 1997).
Consecuentemente con un paradigma emergente que
pone en tela de juicio el concepto de un receptor que interacciona
con un ligando, advertimos previamente que RAGE se unía a un
polipéptido de \approx 12 kDa (Hori et al., 1995), un
miembro de la superfamilia S100/calgranulínica de citocinas
proinflamatorias (Zimmer et al., 1995; Schafer y Heinzmann,
1996). Dichas moléculas, probablemente liberadas por células
inflamatorias activadas tales como leucocitos polimorfonucleares,
fagocitos mononucleares procedentes de sangre periférica y
linfocitos, han sido tradicionalmente descritas como moléculas que
se acumulan en estados caracterizados por una inflamación crónica,
tales como conjuntivitis inflamatoria (Gottsch et al., 1997;
Gottsch y Liu, 1998), enfermedad cutánea psoriásica (Madson, 1991),
fibrosis quística (Andersson et al., 1988), enfermedad
inflamatoria intestinal (Lugering et al., 1995; Schmid et
al., 1995), artritis reumatoide (Odink et al., 1987) e
infección parasitaria crónica (Marti et al., 1996). Sin
embargo, hasta la fecha, no se han elucidado medios específicos por
los cuales polipéptidos de la familia de S100/calgranulina modulan
potencialmente el curso de procesos inflamatorios. Se comunica aquí
la caracterización de un polipéptido de 12 kDa, denominado
EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de
RAGE). La ligación de RAGE celular por EN-RAGE y
moléculas similares a EN-RAGE media en la activación
de células endoteliales, macrófagos y linfocitos, células centrales
para el desarrollo del fenotipo inflamatorio. Consecuentemente con
el concepto de que la interacción EN-RAGE/RAGE es
una fase próxima crítica en la cascada de procesos que amplifican
la inflamación, la administración de RAGE soluble o
F(ab')_{2}
anti-RAGE/anti-EN-RAGE
en modelos murinos de hipersensibilidad de tipo retardado y de
enfermedad inflamatoria intestinal crónica suprime el desarrollo de
la inflamación, con una activación suprimida de
NF-\kappaB y mediadores inflamatorios.
Los datos presentes validan así por vez primera
una importante función patogénica para EN-RAGE y
moléculas similares a EN-RAGE en la respuesta
inflamatoria. Se formula la hipótesis de que, tras el reclutamiento
de células inflamatorias a, por ejemplo, sitios de lesiones
autoinmunes, físicas o mediadas por infección, la liberación de
estas moléculas y su subsiguiente interacción con el RAGE celular
pueden propagar una potente serie de agravantes procesos
proinflamatorios. Por lo tanto, estos datos destacan un nuevo
paradigma en la inflamación e identifican nuevas funciones para
EN-RAGEs y RAGE en la activación celular y el daño
tisular crónicos.
Para llevar a cabo el análisis de secuencias,
las bandas (\approx 12 kDa) fueron eluidas de geles de
SDS-PAGE del modo previamente descrito (Hori et
al., 1995). Se llevó a cabo una degradación de Edman
automatizada usando un secuenciador HP-G1005A
(Hewlett Packard Analytical Instruments, Palo Alto, California,
EE.UU.). Se llevó a cabo la secuenciación interna utilizando una
digestión con endoproteinasa Lys-C (Boehringer
Mannheim) seguida de una HPLC de microcalibre, del modo descrito
(Hori et al., 1995).
Se llevó a cabo la clonación molecular
utilizando un banco de pulmón bovino y un banco de pulmón humano
(Clontech, Palo Alto, California, EE.UU.) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, con objeto de obtener el cDNA para
los EN-RAGE bovino y humano. La secuencia que
codifica el cDNA bovino para EN-RAGE tiene la
referencia AF 011757 (Genbank).
El cDNA que codifica EN-RAGE fue
dispuesto en un sistema de expresión baculovírico y fue hecho
expresar en células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9;
Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). El
EN-RAGE fue purificado a partir de sedimentos
celulares de centrifugación mediante cromatografía secuencial en
columnas de heparina e hidroxilapatito (Amersham Pharmacia,
Piscataway, New Jersey, EE.UU.), realizándose la elución con NaCl en
concentraciones crecientes. El EN-RAGE purificado,
una única banda en los geles teñidos con Coomassie, Mr \approx 12
kDa, fue desprovisto de endotoxina antes de los experimentos
mediante cromatografía en columnas Detoxi-Gel
(Pierce, Arlington Heigths, Illinois, EE.UU.). La ausencia de
endotoxina fue confirmada utilizando un sistema de Sigma (St.
Louis, Missouri, EE.UU.) (ensayo de amebocitos de Limulus).
Donde se indica, se empleó S100B purificado procedente de cerebro
humano (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego,
California, EE.UU.).
Estudios in vitro : Se aislaron
células mononucleares humanas procedentes de sangre periférica de
voluntarios normales utilizando Histopaque 1077 (Sigma) y se
obtuvieron células Jurkat E6 de la Corporación Americana de Tejidos
Tipo (Rockville, Maryland, EE.UU.). Donde se indica, las células
fueron estimuladas con PMA (10 ng/ml), ionomicina (100 ng/ml) o
TNF-\alpha (Genzyme, Cambridge, Massachusetts,
EE.UU.) durante 12 horas. Las células (1x10^{7}) fueron sonicadas
(Sonifer 250, Branson, Danbury, Connecticut, EE.UU.) en PBS que
contenía una mezcla de inhibidores de proteasas (Boehringer
Mannheim, Indianápolis, Indiana, EE.UU.) y centrifugadas a 4ºC
durante 30 minutos a 14.000 rpm. Se midió la concentración proteica
del sobrenadante utilizando el ensayo proteico de
Bio-Rad (Hercules, California, EE.UU.). Se añadieron
7 \mug de proteína a cada carril de geles de
Tris-glicocola (Novex, San Diego, California,
EE.UU.). Luego se transfirieron los geles a membranas de
nitrocelulosa (Bio-Rad) y se realizó la
inmunotransferencia usando IgG
anti-EN-RAGE monoespecífica y
policlonal de conejo, preparada contra EN-RAGE
bovino recombinante de longitud completa. Se emplearon IgG
anti-conejo generada en cabra, marcada con
peroxidasa de rábano picante (Sigma), y un sistema de ECL
(Amersham-Pharmacia) para indicar los sitios de la
unión del anticuerpo primario.
Estudios in vivo : Se inyectó
intraperitonealmente LPS (Sigma; 30 \mug/g de peso corporal) a
ratones CF-1. Donde se indica, ciertos ratones
fueron pretratados con sRAGE murino (100 \mug) 12 horas y 1 hora
antes de la inyección de LPS. Se sacrificaron los ratones en los
momentos indicados, y se sometió suero (0,015 ml) a electroforesis
utilizando geles de Tris-glicocola (14%; Novex) y se
realizó la inmunotransferencia del modo anterior. En ambos casos,
se llevó a cabo una densitometría utilizando el software ImageQuant
de Molecular Dynamics (Foster City, California, EE.UU.).
El EN-RAGE purificado fue
radiomarcado utilizando ^{125}I y Iodobeads (Pierce) hasta una
actividad específica de aproximadamente 5000 cpm/ng. Los ensayos de
unión de radioligandos se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos
a los que se había adsorbido RAGE humano purificado (5
\mug/pocillo) o células endoteliales de aorta bovina. En el
primer caso, después de la adsorción de RAGE soluble humano a la
placa de plástico en tampón de carbonato/bicarbonato (pH de 9,3)
durante la noche, los pocillos fueron lavados con PBS que contenía
Tween 20 (0,05%). Los sitios ligantes desocupados de los pocillos
de plástico fueron bloqueados por incubación con PBS que contenía
calcio/magnesio y albúmina sérica bovina (1%) durante dos horas a
37ºC. Tras la aspiración del contenido de los pocillos, se llevó a
cabo un ensayo de unión de radioligandos en presencia de la
concentración indicada de EN-RAGE radiomarcado
\pm un exceso molar de 50 veces de EN-RAGE no
marcado en PBS que contenía calcio/magnesio y BSA, 0,2%, durante 3
horas a 37ºC. Al final de ese tiempo, los pocillos fueron
rápidamente lavados con tampón de lavado como antes. La elución del
material unido se llevó a cabo en una disolución que contenía
heparina, 1 mg/ml. Luego se aspiró la disolución de los pocillos y
se sometió a cuenta en un contador de radiación gamma (LKB,
Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). En los ensayos de unión celular,
se sembraron células endoteliales de aorta bovina (BAECs) en placas
de 96 pocillos para cultivo tisular previamente revestidas con
colágeno I (Biocoat; Becton Dickinson, Bedford, Massachusetts,
EE.UU.). Una vez alcanzada la confluencia, se lavaron las células
con PBS y se llevó a cabo un ensayo de unión de radioligandos como
antes. Los datos de la unión en equilibrio fueron analizados de
acuerdo con la ecuación de Klotz y Hunston (Klotz y Hunston, 1984):
B = nKA/1 + KA, donde B = ligando específicamente unido (unión
total, células incubadas sólo con indicador, menos unión
inespecífica, células incubadas con indicador en presencia de
material no marcado en exceso), n = sitios/célula, K = constante de
disociación, y A = concentración de ligando libre), usando un
análisis no lineal por mínimos cuadrados (Prism; San Diego,
California, EE.UU.). Donde se indica, se llevó a cabo un
pretratamiento con anticuerpos o con RAGE soluble.
Células endoteliales: se aislaron,
caracterizaron y mantuvieron células endoteliales de vena de cordón
umbilical humano (HUVECs) del modo previamente descrito (Schmidt
et al., 1995). Las células fueron cultivadas en RPMI 1640
exento de suero, sin factor de crecimiento de células endoteliales,
durante 24 horas y fueron luego estimuladas con las concentraciones
indicadas de EN-RAGE u otros estímulos. Donde se
indica, las células fueron pretratadas con IgG
anti-RAGE humano generada en conejo o con IgG de
conejo no inmune; en ciertos casos, se pretrató el
EN-RAGE con la concentración indicada de sRAGE
durante 2 horas antes de la estimulación con
EN-RAGE. Después de ocho horas de estimulación con
EN-RAGE, las células fueron fijadas con
paraformaldehído (2%) durante 30 minutos, lavadas dos veces con PBS
y tratadas con PBS que contenía leche seca sin grasa (5%) y BSA
(2,5%) para bloquear los sitios de unión inespecífica de la
superficie celular. Se llevó a cabo un ELISA de la superficie
celular empleando IgG anti-VCAM-1
(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, California, EE.UU.) del
modo previamente descrito (Schmidt et al., 1995b). La
valoración de la actividad VCAM-1 funcional fue
determinada utilizando células Molt-4 (ATCC)
marcadas con ^{51}Cr, de la manera previamente descrita (Schmidt
et al., 1995b). Se evaluó la activación de
NF-\kappaB utilizando extractos nucleares de HUVEC
preparados del modo previamente descrito (Schreiber et al.,
1998). Se cargaron 10 \mug de extracto nuclear en geles para PAGE
y se llevó a cabo un EMSA usando una sonda para
NF-\kappaB, marcada con ^{32}P, procedente del
promotor de VCAM-1 (Neish et al., 1992). Se
llevaron a cabo ensayos de superdesplazamiento mediante la
preincubación de IgG no inmune, anti-p50 o
anti-p65, o ambas IgG, con el extracto nuclear
durante 45 minutos a temperatura ambiental antes de la adición de la
sonda oligonucleotídica radiomarcada.
Ensayos de quimiotaxis: se llevaron a
cabo ensayos de quimiotaxis del modo previamente descrito (Schmidt
et al., 1993) en cámaras de 48 pocillos para
microquimiotaxis (Neuro-Probe, Bethesda, Maryland,
EE.UU.) que contenían una membrana de policarbonato (8 \mum;
Nucleopore, Pleasanton, California, EE.UU.). La cámara inferior
contenía el estímulo quimiotáctico, según se indica. Como testigo
positivo se empleó
N-formil-met-leu-phe
(Sigma). Se añadieron células Molt-4 (que llevan
RAGE en la superficie celular) a la cámara superior (10^{4}
células/pocillo). Después de una incubación a 37ºC durante 4 horas,
las células no migratorias de la superficie superior de la membrana
fueron suavemente separadas por raspado y eliminadas, la membrana
fue luego fijada en metanol (100%) y las células que habían migrado
a través de la membrana fueron teñidas con Giemsa (Sigma) y
contadas. Se contaron las células en nueve campos de gran aumento y
se presentó la media \pm error típico de la media. Cada
experimento fue repetido dos veces; en cada caso, se emplearon seis
duplicados por condición.
Ensayos mitogénicos: En los estudios
in vitro, se aislaron PBMCs de sangre completa utilizando un
gradiente de Ficoll (Histopaque 1077; Sigma) y se suspendieron en
RPMI que contenía suero bovino fetal (FBS; del inglés, fetal
bovine serum) (10%), en una concentración de
1x10^{6} células/ml. Las células fueron sembradas en placas de 96
pocillos para cultivo tisular y fueron tratadas del modo indicado
con EN-RAGE durante 12 horas antes de la
estimulación con PHA-P (Sigma) durante 12 horas. Las
células fueron luego estimuladas con
^{3}H-timidina (37kBq/pocillo; New England
Nuclear, Boston, Massachusetts, EE.UU.) y fueron incubadas durante
18 horas adicionales antes de la recolección y del procesamiento
para la cuenta del centelleo en estado líquido utilizando un
contador LK Betaplate (Wallac, Inc., Gaithersburg, Maryland,
EE.UU.). En los estudios in vivo, se obtuvieron esplenocitos
de ratón (raza CF-1) de tejido esplénico de ratones
sometidos a estudios de DTH, como se describe más adelante, y se
aislaron usando Histopaque 1077. Se estimularon con PMA (0,5
\mug/ml) durante 18 horas los esplenocitos (5x10^{5} por
pocillo; placas de 96 pocillos para cultivo tisular) en RPMI que
contenía FBS (10%) y, como anteriormente en los estudios in
vitro, se determinó el índice de proliferación usando timidina
tritiada. Todos los experimentos se llevaron a cabo con
determinaciones triplicadas.
Valoración de los niveles de citocinas:
se incubaron células BV2 (Yan et al., 1997), que llevan RAGE
en la superficie celular, o células Jurkat E6 (ATCC) del modo
indicado con EN-RAGE durante los tiempos indicados.
En ciertos experimentos, las células fueron preincubadas con
F(ab')_{2} anti-RAGE antes de la
estimulación con EN-RAGE. En otros casos, se
preincubó EN-RAGE con sRAGE antes de la
estimulación. Se llevó a cabo un ELISA para
TNF-\alpha, IL-1\beta o
IL-2 utilizando sistemas de R&D Systems
(Minneapolis, Minnesota, EE.UU.). Donde se indica, las células
fueron transfectadas con una construcción que codificaba un RAGE
humano en que se había suprimido el dominio citosólico (cola)
empleando Superfect (Qiagen, Valencia, California, EE.UU.) (1
\mug de DNA/ml de medio); se empleó pcDNA3 (Invitrogen) como
vector. Se llevaron a cabo experimentos de estimulación 48 horas
después de la transfección.
Estudios con infusiones: Se inyectó
intravenosamente EN-RAGE (30 \mug), BSA (30
\mug) o LPS (500 \mug), a través de la vena de la cola, a
ratones Balb/c (Charles River) de aproximadamente 6 semanas de edad.
Doce horas más tarde, se extrajeron rápidamente los pulmones y se
homogeneizaron en disolución salina tamponada con Tris (TBS; del
inglés, Tris buffered saline) que contenía
inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim), y se sometió el
producto de homogeneización a centrifugación a 8000 rpm durante 10
minutos. Luego se centrifugó el sobrenadante a 40.000 rpm durante
una hora a 4ºC. El sedimento de centrifugación fue luego disuelto en
TBS que contenía inhibidores de proteasas y
octil-\beta-glucósido (2%) durante
4 horas a 4ºC. Luego se sometió la suspensión a centrifugación a
14.000 rpm durante 10 minutos y se evaluó la concentración de
proteínas (Bio-Rad) en el sobrenadante. Se llevó a
cabo una inmunotransferencia después de someter 30 \mug de
proteína/carril a electroforesis y transferir los componentes del
gel a nitrocelulosa. La IgG
anti-VCAM-1 se obtuvo de Santa Cruz
Biotechnologies y la visualización de las bandas se realizó con el
sistema de ECL (Amersham-Pharmacia).
Se sensibilizaron hembras de ratón
CF-1, de 6 semanas de edad, mediante una inyección
subcutánea de una emulsión (0,1 ml) que contenía BSA metilada
(mBSA; 25 mg/ml; SIGMA), NaCl (0,9%), dextrano (peso molecular de
5-40 x 10^{6}; 50 mg/ml; SIGMA) y adyuvante
incompleto de Freund (50%; ICN Biomedical, Aurora, Ohio, EE.UU.) en
el ganglio linfático inguinal izquierdo. Tres semanas más tarde, se
inyectó subcutáneamente mBSA (0,4 mg/ml; 0,050 ml) en la zona
plantar de la pata trasera izquierda. Donde se indica, los ratones
fueron pretratados con una inyección intraperitoneal de sRAGE
(dosis indicada), albúmina sérica de ratón (SIGMA) o fragmentos
F(ab')_{2} inmunes o no inmunes (preparados usando un
sistema de Pierce, Arlington Heights, Illinois, EE.UU.) 24 y 12
horas antes de, y 6 y 12 horas después de, la estimulación local con
mBSA. 24 horas después de la inyección de mBSA en la almohadilla de
la pata, dos investigadores llevaron a cabo a ciegas la calificación
clínica de la almohadilla de la pata del modo anteriormente
descrito. Luego se sacrificaron humanamente los ratones y se
congelaron o fijaron en formol (10%) las patas para un análisis
ulterior. Dos investigadores llevaron a cabo a ciegas la
calificación histológica sobre cortes de patas teñidos con
hematoxilina y eosina (SIGMA). Se llevó a cabo el ensayo de
desplazamiento de la movilidad electroforética empleando 10 \mug
de extracto nuclear de almohadilla de pata añadidos por carril,
como antes. Se llevó a cabo una RT-PCR utilizando
cebadores comercialmente asequibles (Clontech) para
IL-2 (tamaño esperado: 413 pares de bases),
TNF-\alpha (tamaño esperado: 310 pares de bases)
y \beta-actina (tamaño esperado: 540 pares de
bases). En ciertos ratones, tras el sacrificio, se extrajo el bazo
y se prepararon esplenocitos por separación mediante Histopaque 1077
(Sigma). Se pusieron 5x10^{4} células en los pocillos de placas
de 96 pocillos para cultivo tisular y se llevó a cabo una
estimulación con PMA, 0,5 \mug/ml, durante 16 horas. Al final de
este período, se añadió timidina tritiada durante 18 horas
adicionales. Luego se recogieron las células y se contaron en un
contador de radiación beta.
Ratones de origen C57BL/6 deficientes en
IL-10 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine,
EE.UU.) nacieron y fueron criados en condiciones libres de
patógenos. A las 3 semanas de edad, los ratones fueron llevados a
un alojamiento convencional estándar con acceso libre a comida y
agua. Una semana después de la disposición en condiciones
estándares, los ratones fueron tratados una vez al día con una
inyección intraperitoneal de MSA (100 \mug/día) o sRAGE (100
\mug/día), durante seis semanas. Al final de ese periodo, se
anestesiaron profundamente los ratones, se extrajo plasma y luego
se extrajo el colon rectosigmoide para un análisis histológico
(hematoxilina y eosina) o la preparación de un extracto nuclear,
como se describió anteriormente. Los cortes de colon rectosigmoide
teñidos con hematoxilina y eosina fueron evaluados a ciegas por uno
de los investigadores. Se evaluaron los niveles de
TNF-\alpha en plasma (R&D Systems) y se llevó
a cabo un EMSA para NF-\kappaB sobre los extractos
nucleares.
Habíamos especulado previamente sobre que dicho
receptor de la superfamilia inmunoglobulínica podría interaccionar
con ligandos distintos de los AGEs. Tras la preparación del extracto
de pulmón bovino usando detergente, y la cromatografía del material
en columnas sucesivas, incluyendo en la última operación una resina
de Affi-Gel a la que se había adsorbido RAGE, se
eluyeron dos polipéptidos que tenían actividad ligante de RAGE en
ensayos de unión de radioligandos. El primero, un polipéptido de
\approx 23 kDa, fue identificado como anfoterina (Hori et
al., 1995). El segundo, un polipéptido de \approx 12 kDa, fue
sometido a un análisis de la secuencia de aminoácidos tanto en el
extremo amínico como internamente después de una digestión con la
endopeptidasa Lys-C (Tabla 2). La secuencia de este
polipéptido, inicialmente denominado "p12", reveló que poseía
la más estrecha y sorprendente homología con respecto a un
polipéptido conocido como proteína bovina 1 ligante de calcio en
fluido amniótico (CAAF-1) (Hitomi et al.,
1996) o antígeno corneal bovino/calgranulina C (Gottsch et
al., 1997), recientemente clasificado como S100A12 (Ilg et
al., 1996). Este polipéptido fue posteriormente llamado
EN-RAGE, nueva proteína extracelular ligante de
RAGE. La secuencia de EN-RAGE difería de la del
antígeno corneal bovino en dos aminoácidos. En la posición nº 30,
el EN-RAGE estaba compuesto de una tirosina (Y)
mientras que el antígeno corneal bovino estaba compuesto de una
arginina (R). En la posición nº 36, el EN-RAGE
estaba compuesto de una glicocola (G) mientras que el antígeno
corneal bovino estaba compuesto de una isoleucina (I) (Tabla 2).
Estudios de clonación molecular revelaron que
EN-RAGE era un miembro de la familia
calgranulínica/S100 de citocinas proinflamatorias. Dos clones de
cDNA obtenidos de un banco de pulmón bovino codificaban polipéptidos
idénticos al antígeno corneal bovino basándose en la deducida
secuencia de aminoácidos, con una arginina en la posición nº 30 y
una isoleucina en la posición nº 36. Basándose en estos datos, no se
puede excluir la posibilidad de que no se aislaran clones
específicos que codificaran la secuencia exacta de
EN-RAGE. Empleando un banco de pulmón humano, la
clonación molecular produjo un clon; la deducida secuencia de
aminoácidos del cDNA reveló que era probable que la equivalencia
humana de EN-RAGE fuera calgranulina C humana (o
antígeno corneal humano/S100A12) (Gottsch y Liu, 1998; Ilg et
al., 1996; Yamamura et al., 1996). La deducida secuencia
de aminoácidos del polipéptido reveló que la equivalencia humana era
muy homóloga al antígeno corneal bovino (> 77%).
En realidad, p12 es un miembro de la
superfamilia de S100/calgranulina (Dell'Angelica et al.,
1994; IIg et al., 1996; Wicki et al., 1996; Gottsch
et al., 1997; Gottsch y Liu, 1998). Por lo tanto, conservamos
el nombre de EN-RAGE porque una nueva propiedad de
éste y otros miembros de dicha familia es su interacción con RAGE,
lo cual tiene importantes implicaciones para la función de estos
polipéptidos, como se describe más adelante.
La familia molecular de S100/calgranulina ha
sido ampliamente asociada con una gran variedad de trastornos
inflamatorios, especialmente los de naturaleza crónica. Puesto que
se sabe que estos polipéptidos son liberados por células
inflamatorias tales como leucocitos polimorfonucleares y fagocitos
mononucleares procedentes de sangre periférica, se ha especulado
durante mucho tiempo sobre el hecho de que pueden desempeñar una
función en el desarrollo del fenotipo inflamatorio, tal como al
estimular la migración y activación de macrófagos. Por lo tanto,
analizamos el concepto de que la ligación de RAGE por
EN-RAGE activaría rutas de señalización celular
proinflamatorias, lo que conduciría a la modulación de la expresión
génica de un modo ligado a la inflamación.
Cuando células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) o células Jurkat, una línea inmortalizada de
células T, fueron estimuladas con PMA/ionomicina, la
inmunotransferencia del producto de homogeneización celular reveló
una generación de EN-RAGE aumentada 2,8 veces y 2,1
veces, respectivamente (Figura 6A). Por contraste, tras la
estimulación de células endoteliales de vena de cordón umbilical
humano (HUVEC) en cultivo con un estímulo prototípico, el factor
\alpha de necrosis tumoral, no se vio una modulación de la
expresión de EN-RAGE (Figura 6A). Similarmente, la
exposición de HUVEC a PMA/ionomicina no aumentó la expresión de
EN-RAGE (datos no mostrados). Por lo tanto, como es
típico de miembros de la familia de S100/calgranulina, la expresión
de EN-RAGE puede ser modulada en células
inflamatorias estimuladas.
Para determinar si se libera
EN-RAGE en un ambiente inflamatorio in vivo,
se infundió intravenosamente lipopolisacárido (LPS) a ratones. Se
advirtió un aumento dependiente del tiempo en la liberación de
EN-RAGE en el plasma (Figura 6B). La máxima
liberación de EN-RAGE se observó 12 horas después de
la inyección; en ese momento se demostró un aumento de
EN-RAGE \approx 3,6 veces por inmunotransferencia
(Figura 6B). Consecuentemente con la posibilidad de que RAGE
soluble, la porción extracelular de RAGE que se une al ligando,
pudiera interaccionar con EN-RAGE en el plasma,
facilitando por ello su aclaramiento y eliminación, la
administración concomitante de sRAGE (que no se une a LPS) y LPS no
dio lugar a un aumento detectable de EN-RAGE
plasmático por inmunotransferencia (Figura 6B), ni siquiera a las
12 horas después de la inyección de LPS (Figura 6B).
Estos datos sugerían que EN-RAGE
se unía a RAGE. En ensayos de unión de radioligandos,
^{125}I-EN-RAGE se unía a RAGE
inmovilizado en pocillos de plástico, de un modo dependiente de la
dosis, con una K_{d} \approx 91 \pm 29 nM y una capacidad
\approx 21 \pm 2,9 femtomoles/pocillo (Figura 6C). Tras la
incubación de EN-RAGE radiomarcado con sRAGE no
marcado en exceso, la unión al RAGE inmovilizado resultó
significativamente atenuada (Figura 6C, inserción). La unión
específica de EN-RAGE radiomarcado a RAGE resultó
disminuida un 82,5% en presencia de un exceso molar de 50 veces de
RAGE no marcado. Por contraste, la incubación con albúmina sérica
bovina (BSA) no marcada en exceso resultó sin efecto (Figura 6C).
Además, la preincubación de IgG anti-RAGE con el
RAGE inmovilizado inhibía significativamente la unión de
EN-RAGE radiomarcado al RAGE inmovilizado (Figura
6C, inserción). En presencia de IgG
anti-RAGE, 50 \mug/ml, la unión resultaba inhibida
un 67,9%. Por contraste, la preincubación con IgG no inmune resultó
sin efecto (Figura 6C, inserción). Es importante advertir
que la preincubación con S100B humano en exceso también suprimía
significativamente la unión de EN-RAGE a RAGE, lo
que sugiere que una variedad de polipéptidos S100/calgranulina se
unen a RAGE.
Sin embargo, resultó crítico determinar si
EN-RAGE podía interaccionar con RAGE en la
superficie de células implicadas en la respuesta inflamatoria. Para
probar esto, se llevaron a cabo ensayos de unión de radioligandos
sobre células endoteliales de aorta bovina (BAEC) en cultivo.
Consistentemente con nuestros estudios previos,
^{125}I-EN-RAGE se unía a RAGE de
BAECs de un modo dependiente de la dosis, con una K_{d} \approx
90,3 \pm 34 nM y una capacidad \approx 163 \pm 26,2
femtomoles/pocillo (Figura 6D), de modo similar a lo observado con
otros ligandos de RAGE, tales como AGEs (Schmidt et al.,
1992) y anfoterina (Hori et al., 1995). La unión específica
de EN-RAGE radiomarcado a RAGE de BAECs resultó
disminuida un 84,3% en presencia de un exceso molar de 50 veces de
RAGE no marcado. Por contraste, la incubación con BSA no marcada en
exceso resultó sin efecto (Figura 6D, inserción). La unión
de EN-RAGE radiomarcado a RAGE resultó inhibida un
41% tras la preincubación de BAECs con IgG
anti-RAGE, 50 \mug/ml, pero sólo un 28,7% en
presencia de IgG anti-RAGE, 5 \mug/ml. Por
contraste, la IgG no inmune resultó sin efecto (Figura 6D,
inserción). Se observaron resultados similares (no mostrados)
en células BV2 de tipo macrófago en cultivo.
Estos datos indicaban que
EN-RAGE se unía a RAGE de un modo específico y nos
condujo a formular la hipótesis de que la ligación de RAGE por
EN-RAGE podía desencadenar una activación
celular.
Puesto que la activación del endotelio es un
componente central de la respuesta inflamatoria, se probó primero
la capacidad de EN-RAGE para activar RAGE de ECs.
Consecuentemente con esta hipótesis, la incubación de
EN-RAGE con células endoteliales de vena de cordón
umbilical humano (HUVECs) en cultivo dio lugar a una expresión
aumentada de la molécula 1 de adhesión de células vasculares en la
superficie celular, un medio importante mediante el cual las
células mononucleares que llevan VLA-4 pueden ser
dirigidas al endotelio estimulado (Li et al., 1993;
Richardson et al., 1994) (Figura 7A). Que esto fue mediado en
gran medida por RAGE resultó evidente tras experimentos en que se
inhibía el acceso a RAGE. La preincubación de
EN-RAGE con un exceso molar de 40 veces de sRAGE
atenuaba significativamente la expresión de VCAM-1,
lo mismo que la preincubación de las células con IgG
anti-RAGE (Figura 7A). Por contraste, la
preincubación con IgG no inmune no dio lugar a cambio alguno en el
grado de expresión de VCAM-1 en la superficie
celular después del tratamiento con EN-RAGE (Figura
7A). Consecuentemente con la observación de que la ligación de RAGE
por EN-RAGE daba lugar a una expresión aumentada de
VCAM-1 en la superficie celular, se advirtió una
unión aumentada de células Molt, que llevan VLA-4,
al endotelio estimulado por EN-RAGE. La capacidad
de EN-RAGE para potenciar la unión de
Molt-4 a HUVECs fue dependiente de la dosis (Figura
7B, parte izquierda).
\newpage
Los efectos de EN-RAGE fueron
dependientes del tiempo, observándose un aumento máximo de unión de
Molt-4 después de 8 horas de incubación (Figura 7B,
parte central). Consecuentemente con nuestros hallazgos
previos, la unión aumentada de Molt-4 era debida a
la interacción de EN-RAGE con RAGE celular. La
preincubación de HUVECs con F(ab')_{2}
anti-RAGE, 5 \mug/ml, atenuó significativamente la
unión de Molt-4 a células tratadas con
EN-RAGE. Por contraste, tanto F(ab')_{2}
anti-RAGE, 0,1 \mug/ml, como F(ab')_{2}
no inmune no ejercieron efecto alguno (Figura 7B, parte
derecha). Similarmente, la preincubación de
EN-RAGE con un exceso molar de 30 veces de sRAGE
atenuó significativamente la potenciación, mediada por
EN-RAGE, de la unión de Molt-4 a
HUVEC. Por contraste, la preincubación de EN-RAGE
con sRAGE (exceso molar de 5 veces) o BSA, 5 \mug/ml, resultó sin
efecto significativo alguno (Figura 7B, parte derecha).
Un medio importante por el cual resulta un mRNA
aumentado para VCAM-1 es por la activación de un
factor de transcripción central en la respuesta inflamatoria,
NF-\kappaB (Neish et al., 1992). En
estudios previos, demostramos que la ligación de RAGE por AGEs y el
péptido \beta amiloide daba lugar a una translocación aumentada
de componentes de NF-\kappaB en el núcleo, como se
demostró mediante un ensayo de desplazamiento de la movilidad
electroforética (Yan et al., 1994; Yan et al., 1996;
Lander et al., 1997). Por lo tanto, analizamos si la
ligación de RAGE de ECs por EN-RAGE mediaba en la
activación de NF-\kappaB. En el ensayo de
desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de extractos
nucleares preparados a partir de HUVECs, la incubación con
EN-RAGE (2,5 o 5,0 \mug/ml) daba lugar a un
aumento \approx 5 veces del NF-\kappaB nuclear
por densitometría, en comparación con la incubación con BSA (Figura
7C, carriles 1, 2 y 7, respectivamente, e inserción). Que
esto fue mediado en gran medida por la interacción con RAGE resultó
demostrado mediante experimentos en que se pretrataban HUVECs con
IgG anti-RAGE antes de con EN-RAGE,
en los que la activación de NF-\kappaB resultó
significativamente atenuada (Figura 7C, carril 4 e
inserción). Similarmente, la preincubación de
EN-RAGE con sRAGE en exceso (50 veces) dio lugar a
una activación disminuida de NF-\kappaB (Figura
7C, carril 3 e inserción). Ensayos de superdesplazamiento en
que se empleaban tanto IgG anti-p50 como IgG
anti-p65 demostraron que el complejo de
NF-\kappaB activado tras la ligación de RAGE por
EN-RAGE estaba compuesto tanto de p50 como de p65
(Figura 7C, carriles 13, 14 y 15). Por contraste, la
preincubación del extracto nuclear con IgG no inmune no dio lugar a
un desplazamiento de bandas (Figura 7C, carril 12). Para
analizar el concepto de que el dominio citosólico de RAGE era
crítico para la activación de rutas de señalización próximas y
esenciales para la activación de NF-\kappaB, se
llevó a cabo la transfección transitoria de HUVECs con una
construcción que codificaba un RAGE humano en que estaba suprimido
el dominio citosólico. Consecuentemente con una función importante
del dominio citosólico en cuanto a la mediación en la señalización
celular, la activación de NF-\kappaB estimulada
por EN-RAGE resultó notablemente suprimida en los
transfectantes que contenían RAGE con la cola citosólica suprimida
(Figura 7C, carril 5 e inserción) en comparación con aquellos
transfectados con vector solo (Figura 7C, carril 6 e
inserción).
Tomados en conjunto, estos datos sugerían que la
interacción EN-RAGE/RAGE en células endoteliales
activaba un factor de transcripción importante,
NF-\kappaB, implicado en la respuesta
inflamatoria, lo que sugería un medio central mediante el cual esta
interacción podría impartir una perturbación proinflamatoria.
Además de las células endoteliales, los
fagocitos mononucleares (MPs) son críticamente importantes en la
mediación de procesos inmunes/inflamatorios. Formulamos la
hipótesis de que el EN-RAGE liberado por células
reclutadas a sitios de daño podría ser más importante a la hora de
amplificar la respuesta inflamatoria. Por lo tanto, se analizó la
capacidad de EN-RAGE para estimular la migración de
células similares a MP. En cámaras de quimiotaxis modificadas, el
EN-RAGE dispuesto en la cama inferior mediaba en la
quimiotaxis de células Molt-4 (que llevan RAGE en
la superficie celular) dispuestas en la cámara superior, de un modo
dependiente de la dosis (Figura 7D, parte izquierda, líneas 2,
3, 4 y 5). Por contraste, la disposición de BSA en la cámara
inferior resultó sin efecto significativo alguno (Figura 7D,
línea 1). El que esto representaba una quimiotaxis verdadera
fue sugerido por experimentos en que se ponía
EN-RAGE tanto en la cámara superior como en la
inferior. Cuando se añadían células Molt-4, no se
producía una migración significativa a la cámara inferior (Figura
7D, parte izquierda, línea 6). Para probar el concepto de
que el RAGE de la superficie de células MP era un medio principal
por el cual EN-RAGE estimulaba la migración, se
preincubó EN-RAGE con sRAGE en exceso; resultó una
significativa atenuación de la migración de Molt-4
a la cámara inferior (Figura 7D, parte derecha, líneas 2 y 3)
en comparación con la preincubación con BSA (Figura 7D, parte
derecha, línea 1). Además, cuando se preincubaron células
Molt-4 con F(ab')_{2}
anti-RAGE, se produjo una significativa disminución
en la migración de células Molt-4 mediada por
EN-RAGE (Figura 7D, parte derecha, líneas 5 y
6). Por contraste, la preincubación con F(ab')_{2} no
inmune resultó sin efecto alguno (Figura 7D, parte derecha, línea
4).
Buscamos delimitar si la interacción de
EN-RAGE con RAGE de MP daba lugar a una generación
aumentada de mediadores tales como IL-1\beta y
TNF-\alpha, unas citocinas críticamente ligadas a
la activación celular y la inflamación. La incubación de células
BV2 de tipo macrófago simuladamente transfectadas (vector solo), en
cultivo, con EN-RAGE daba lugar a una significativa
elaboración de IL-1\beta de un modo dependiente de
la dosis en el sobrenadante celular (Figura 7E, parte izquierda,
barras oscuras). El que las rutas de señalización intracelulares
de RAGE intactas eran esenciales fue demostrado mediante
experimentos en que se transfectaron transitoriamente células BV2
con una construcción que contenía RAGE humano con la cola suprimida;
resultó la supresión completa de la elaboración de
IL-1\beta, mediada por EN-RAGE, en
el sobrenadante, lo que es consistente con un efecto "negativo
dominante" (Figura 7E, parte izquierda, barras rayadas).
Se observaron resultados similares tras el examen de
TNF-\alpha; la interacción
EN-RAGE/RAGE daba lugar a una expresión
significativamente aumentada de TNF-\alpha en los
sobrenadantes celulares de un modo dependiente de la dosis (Figura
7E, parte derecha, barras oscuras). Sin embargo, tras la
transfección transitoria con la construcción que contenía RAGE con
la cola suprimida, la elaboración de TNF-\alpha
en el sobrenadante de BV2 resultó anulada (Figura 7E, parte
derecha, barras rayadas). Un medio central mediante el cual tuvo
lugar la modulación de la expresión de citocinas en MPs fue por
activación de NF-\kappaB. Similarmente a los
resultados obtenidos con HUVECs en cultivo, el EMSA de extractos
nucleares preparados a partir de células BV2 estimuladas con
EN-RAGE reveló la activación de
NF-\kappaB, un proceso notablemente suprimido en
presencia de F(ab')_{2} anti-RAGE o sRAGE o
por la transfección con la construcción que tiene la supresión de
la cola (datos no mostrados).
La ligación de RAGE por EN-RAGE
en células Jurkat media en la activación. La incubación de células
mononucleares procedentes de sangre periférica (PBMCs) con
EN-RAGE preparó a las células para una respuesta
exagerada cuando fueron estimuladas con PHA-P. En
comparación con el pretratamiento con BSA, se advirtió una
significativa incorporación de timidina tritiada en las células
previamente incubadas con EN-RAGE (Figura 7F). Que
esto fue debido en gran medida a la interacción de
EN-RAGE con RAGE de PBMC fue demostrado mediante
estudios en que se incubaron PBMCs con IgG
anti-RAGE o se preincubó EN-RAGE con
sRAGE en exceso; resultó una significativa atenuación de la
incorporación, estimulada por EN-RAGE, de timidina
tritiada (Figura 7F).
Consecuentemente con la evidencia de la
activación generalizada de PBMCs, la incubación de células Jurkat
(que llevan RAGE en la superficie celular) con
EN-RAGE dio lugar a una elaboración aumentada de
II-2 en el medio sobrenadante, de un modo
dependiente de RAGE (Figura 7G).
Tomados en conjunto, estos estudios demuestran
que la implicación de RAGE en la superficie de células críticas
para la propagación de la respuesta inflamatoria, tales como células
endoteliales, MPs y linfocitos, daba lugar a la activación de estas
células de una manera ligada a la estimulación de la migración, la
proliferación y la generación de mediadores citocínicos, respuestas
esenciales para la orquestación del fenotipo inflamatorio.
Resulta importante advertir que se buscó ensayar
la diversidad de miembros de la superfamilia de S100/calgranulina
que son ligandos de RAGE y se analizó la capacidad de S100B humano
para activar ECs. Puesto que la activación de
NF-\kappaB es un precursor esencial para la
modulación de la expresión de genes inflamatorios, analizamos este
concepto por EMSA. Cuando se estimularon HUVECs con S100B humano,
resultó evidente un aumento de la translocación nuclear de
NF-\kappaB \approx 13,9 veces por EMSA (Figura
7H, carril 2) en comparación con la exposición de las
células a BSA (Figura 7H, carril 1). Que estos hallazgos eran
debidos a la activación de RAGE fue demostrado mediante estudios en
que la preincubación con IgG anti-RAGE (Figura 7H,
carril 3), o la transfección con una construcción que
contenía RAGE con la cola suprimida, atenuaba acusadamente la
sensibilidad a S100B (Figura 7H, carril 5). Por contraste,
la preincubación con IgG no inmune (Figura 7H, carril 4) o
una transfección simulada (Figura 7H, carril 6) resultaban
sin efecto. Estas observaciones indican que una diversidad de
ligandos polipeptídicos S100/calgranulina interaccionan con
RAGE.
Se buscó ampliar nuestros hallazgos en modelos
in vitro para determinar si EN-RAGE mediaba
en la activación celular y en la expresión de mediadores
inflamatorios in vivo. Aunque especulamos que, in
vivo, EN-RAGE es localmente liberado en sitios
de estimulación inmune/inflamatoria, se probó el concepto de que la
infusión de EN-RAGE a ratones inmunocompetentes
mediaría en la expresión de mediadores inflamatorios.
Consecuentemente con este concepto, la infusión de
EN-RAGE, 30 \mug, a ratones CF-1
dio lugar a un aumento de 2,4 en la expresión de
VCAM-1 en el pulmón por inmunotransferencia, en
comparación con la infusión de BSA (Figura 8a, carriles 2 y 1,
respectivamente). Que esto era debido en gran parte a la
implicación del RAGE vascular fue demostrado mediante la
significativa atenuación de la expresión de VCAM-1
estimulada por EN-RAGE, en el pulmón, en presencia
de sRAGE (Figura 8A, carril 3) o de IgG
anti-RAGE (Figura 8A, carril 4). Por
contraste, la infusión de IgG no inmune/EN-RAGE
resultó sin efecto (Figura 8A, carril 5).
Sin embargo, la prueba crítica de estas
hipótesis fue si EN-RAGE y RAGE participan en la
respuesta inflamatoria en modelos de inflamación in vivo. Se
ensayó primero este concepto en un modelo murino de
hipersensibilidad de tipo retardado (Dunn et al., 1993). En
este modelo, se sensibilizaron ratones CF-1 con BSA
metilada (mBSA; que no se une a RAGE). Se inyectó localmente mBSA,
mezclada con una emulsión que contenía cloruro sódico, dextrano y
adyuvante incompleto de Freund, en los ganglios linfáticos de la
ingle. Veintiún días más tarde, se inyectó mBSA o vehículo
(disolución salina tamponada con fosfato) en la almohadilla de la
pata trasera izquierda. Nuestros estudios indicaban que la segunda
inyección no tenía efecto alguno y que, similarmente, la inyección
de mBSA sin sensibilización previa no generaba una respuesta
inflamatoria (datos no mostrados). En lo ratones tanto
sensibilizados como estimulados con mBSA en la almohadilla de la
pata trasera izquierda, se produjo una significativa respuesta
inflamatoria, según se midió mediante la calificación de la
inflamación (Figuras 9A, B, F).
Para analizar en este modelo el papel del
bloqueo de RAGE/EN-RAGE en la potencial modulación
de la inflamación, ciertos ratones sensibilizados/estimulados
fueron tratados intraperitonealmente con vehículo, albúmina sérica
murina (MSA). 24 horas después de la inyección de mBSA en la
almohadilla de la pata, apareció una significativa evidencia de
inflamación local (calificación: 9,0 \pm 0,4) (Figura 9A, línea
1; y Figura 9B). Además, el análisis con H&E de la
almohadilla de la pata afectada confirmó una acusada afluencia de
células inflamatorias, con granulomas así como un significativo
edema (Figura 9F). Sin embargo, en marcado contraste, la inyección
de sRAGE murino dio lugar a la supresión de la inflamación,
dependiente de la dosis, en los ratones sensibilizados/estimulados
con mBSA; tras la inyección de sRAGE, 100 \mug/dosis, la
calificación de la inflamación se redujo a 2,7 \pm 0,3, p <
0,001, en comparación con la correspondiente a la MSA (Figura 9A,
líneas
2-3-4-5-6;
y Figura 9C). Consecuentemente con la marcada supresión de la
inflamación, el examen de la almohadilla de la pata de los ratones
tratados con sRAGE (100 \mug) mediante H&E reveló una
sorprendente supresión de la afluencia de células inflamatorias a
la zona (Figura 9H). Especulamos que, al menos en parte, sRAGE
ejerce sus propicios efectos antiinflamatorios al unirse a
EN-RAGE e inhibir su interacción con el RAGE celular
y la activación de éste.
Resultó así crucial determinar si el bloqueo de
EN-RAGE empleando F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE o el bloqueo del
acceso al propio RAGE empleando F(ab')_{2}
anti-RAGE ejercería efectos beneficiosos similares,
validando por ello un papel importante para estos mediadores en las
cascadas inflamatorias desencadenadas por la inyección de mBSA a
ratones sensibilizados. Cuando ratones sensibilizados/estimulados
fueron tratados con F(ab')_{2} no inmune, no se advirtió
efecto alguno (calificación: 9,0 \pm 0,2). Sin embargo, en
presencia de F(ab')_{2} anti-RAGE (200
\mug) o F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE, resultó evidente una
significativa atenuación de la respuesta inflamatoria (Figura 9A,
líneas 9 y 11, respectivamente, y Figuras 9E y D,
respectivamente), con calificaciones de inflamación de 4,9
\pm 0,8 y 5,6 \pm 0,5, respectivamente (p < 0,05 en ambos
casos en comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no
inmune). Confirmando la inflamación disminuida en presencia de
F(ab')_{2} anti-RAGE o F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE, el análisis
histológico reveló una reducción significativa en los números de
células inflamatorias y edemas, y ausencia de granulomas (Figuras 9J
e I, respectivamente). Apoyando intensamente un papel
crítico para EN-RAGE/RAGE en la mediación de la
inflamación, se observó una sorprendente atenuación de la
inflamación cuando se administraron simultáneamente
F(ab')_{2} anti-EN-RAGE y
F(ab')_{2} anti-RAGE (Figura 9A, línea
12); la calificación de la inflamación se redujo a 3,6 \pm
0,9, p < 0,01, en comparación con el tratamiento con
F(ab')_{2} no inmune. En realidad, el análisis con H&E
reveló números notablemente disminuidos de células inflamatorias y
edemas (Figura 9K).
Estos datos sugerían que el bloqueo de
EN-RAGE/RAGE sofocaba sustancialmente la activación
celular en este modelo. En realidad, paralelamente a la evidencia
de inflamación disminuida en ratones sensibilizados/estimulados con
mBSA a los que se había administrado sRAGE, F(ab')_{2}
anti-RAGE o F(ab')_{2}
anti-RAGE/anti-EN-RAGE,
se observó una supresión significativa de la activación de
NF-\kappaB en extractos nucleares preparados a
partir de las almohadillas de las patas afectadas. En comparación
con la almohadilla de la pata contralateral (sensibilización con
mBSA/ausencia de estimulación local), los extractos nucleares de la
almohadilla de la pata en que se había inyectado mBSA revelaron un
aumento = 6,4 veces en la activación de NF-\kappaB
por EMSA (Figura 9L, carriles 1 y 2, respectivamente). En
presencia de sRAGE ip, 100 \mug/dosis, se advirtió una
significativa reducción en la activación de
NF-\kappaB en comparación con el tratamiento con
vehículo, MSA ip (Figura 9L, carriles 4 y 2,
respectivamente). Tras el tratamiento con F(ab')_{2}
anti-RAGE/anti-EN-RAGE
de los ratones sensibilizados/estimulados con mBSA, se advirtió una
disminución \approx 75% en la activación de
NF-\kappaB (Figura 9L, carril 6) en
comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune
(Figura 9L, carril 7). Considerados conjuntamente, estos
datos sugerían acusadamente que el bloqueo de
EN-RAGE/RAGE sofocaba potentemente la activación de
la ruta de señalización celular de NF-\kappaB.
Puesto que una consecuencia importante de la
ligación de RAGE por EN-RAGE era una expresión
aumentada de mediadores inflamatorios, al menos en parte mediada
por la activación de NF-\kappaB, se llevó a cabo
una RT-PCR del RNA extraído de ratones
sensibilizados/estimulados con mBSA y tratados con sRAGE, 100
\mug, y se halló una ausencia de transcritos para
IL-2 o TNF-\alpha (Figura 9M,
carriles 5 y 2, respectivamente). Por contraste, en las
almohadillas de las patas de los ratones tratados con vehículo, MSA,
eran evidentes transcritos para IL-2 y
TNF-\alpha (Figura 9M, carriles 4 y 1,
respectivamente).
Cuando se aislaron esplenocitos de ratones
sometidos a DTH y se analizaron ex vivo, se advirtió una
respuesta mitogénica disminuida en presencia de PMA en aquellos
esplenocitos recogidos de ratones tratados con sRAGE,
F(ab')_{2} anti-RAGE o F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE, cuando se comparó con
la de esplenocitos de ratones tratados con MSA o F(ab')_{2}
no inmune (Figura 3B).
Considerados conjuntamente, estos datos sugieren
que el bloqueo de la interacción EN-RAGE/RAGE en
hipersensibilidad de tipo retardado suprimía significativamente la
activación de rutas de señalización celular, la modulación de la
expresión génica y el fenotipo inflamatorio.
Característico de los polipéptidos
S100/calgranulina es su presencia en zonas de inflamación crónica,
tales como en enfermedades inflamatorias intestinales humanas
(Lugering et al., 1995; Schmidt et al., 1995). Para
ensayar el concepto de que su interacción con RAGE puede ser
importante en la patogénesis de la inflamación crónica, se
ensayaron estos conceptos en un modelo murino de colitis, ratones
deficientes en IL-10 (Kuehn et al., 1993;
Rennick et al., 1997). Para ensayar este concepto, se
trataron ratones deficientes en IL-10, comenzando a
la edad de 4 semanas, con MSA o sRAGE, 100 \mug ip por día durante
6 semanas. Al final de este periodo, se sacrificaron los ratones y
se evaluó su colon rectosigmoide en cuanto a la evidencia de
inflamación. Aunque en 4/5 ratones que recibieron MSA se reveló
evidencia de inflamación colónica submucosa, compuesta de
linfocitos, macrófagos, eosinófilos y células plasmáticas, sólo 1/5
ratones tratados con sRAGE presentó una inflamación desigual en la
base de las criptas (Tabla 3). Consecuentemente con estos hallazgos,
cuando se preparó tejido colónico para EMSA, se observó una
disminución media de unidades de densitometría \approx 3,7 veces
en el tejido recogido de ratones deficientes en
IL-10 y tratados con sRAGE en comparación con los
que habían recibido MSA (p = 0,04; Figura 10A). Similarmente, se
observó una disminución de los niveles de
TNF-\alpha plasmático \approx 8,7 veces en los
ratones tratados con sRAGE en comparación con los que habían
recibido MSA (p = 0,002; Figura 10B).
Considerados conjuntamente, estos datos sugieren
que la inhibición del eje EN-RAGE/RAGE suprime
potentemente la activación celular y la expresión de mediadores
esenciales en modelos de inflamaciones aguda y crónica.
Se ha advertido durante mucho tiempo la
presencia de polipéptidos S100/calgranulina en sitios de
inflamaciones aguda y crónica. En realidad, se ha sugerido la
evaluación de los niveles séricos de MRP8/14 (proteínas de relación
mieloide; del inglés, myeloic-related protein),
moléculas similares a S100, como un medio para rastrear actividad
morbosa en pacientes con colitis ulcerosa, una enfermedad
inflamatoria crónica del intestino ligada a disfunción intestinal
de larga duración y a neoplasia (Lugering et al., 1995). Las
moléculas de S100/calgranulina presentan homologías estructurales
definitorias, tales como dominios de "mano EF" ligantes de
calcio (Schafer y Heizmann, 1996). Basándose en estas propiedades,
se formuló el postulado de una diversidad de posibles funciones
intracelulares para estos polipéptidos, tales como alteración del
citoesqueleto y la forma celular, transducción de señales y, a
través de unos niveles aumentados de calcio celular, modulación de
la función fagocítica, incluyendo quimiotaxis, fagocitosis,
desgranulación y generación de especies oxigenadas reactivas (ROIs;
del inglés, reactive oxigen species)
(Snyderman y Goetzl, 1981; Smolen et al., 1981; Lew et
al., 1984; Sawyer et al., 1985). En realidad, la
generación de ROIs puede representar un medio distinto más por el
que estas moléculas inician la alteración de rutas de señalización
proinflamatorias (Schreck et al., 1992).
A pesar del hecho de que EN-RAGE
y miembros familiares relacionados carecen de péptidos señal, hay
suficiente evidencia de que estos polipéptidos logran acceder
fácilmente al espacio extracelular (Suzuki et al., 1983;
Shashoua et al., 1984; Schafer y Heizmann, 1996). En este
contexto, estudios previos han sugerido que miembros de esta
familia pueden mediar en una serie de fenómenos inflamatorios. Por
ejemplo, tras la infusión de péptido quimiotáctico 10
(CP-10; del inglés, chemotactic
peptide) (un miembro de la familia de S100) a ratones, los
macrófagos provocados muestran aumento de receptor supresor,
producción de TNF-\alpha, carga de lipoproteínas
de baja densidad acetiladas y formación de células espumosas, y
fagocitosis, así como producción disminuida de óxido nítrico.
Además, tras la inyección local de CP-10 en la
almohadilla de la pata, se origina una intensa afluencia de
leucocitos polimorfonucleares seguida de una infiltración de células
mononucleares mixtas (Hu et al., 1996; Geczy, 1996; Yen
et al., 1997; Kumar et al., 1998). Los datos aquí
presentados amplían estos hallazgos y sugieren que, tras el
reclutamiento de células inflamatorias a sitios de inflamación,
parece que estas moléculas se liberan y se dirigen al RAGE celular.
Tras la afectación de RAGE, un receptor crítico para miembros de
esta familia, puede tener lugar más estimulación celular, lo que
conduciría a activación de rutas de señalización, modulación de la
expresión génica y amplificación de procesos inflamatorios (Figura
11). Estas consideraciones aumentan más las implicaciones de la
interacción EN-RAGE/RAGE en trastornos inflamatorios
crónicos tales como la aterosclerosis (Ross, 1999).
Ciertamente, la inflamación es un proceso
complejo, con un montón de desencadenamientos iniciadores y
moléculas participantes intermedias implicados. Sin embargo, los
mecanismos proinflamatorios a menudo pueden quedar
considerablemente desenfrenados para conducir a isquemia tisular
crónica, muerte celular y respuestas reparadoras mal adaptadas. Los
datos presentes sugieren un nuevo paradigma en la inflamación:
prevenir la interacción de EN-RAGEs con RAGE puede
atenuar un mecanismo de amplificación esencial de la respuesta
inflamatoria a través del bloqueo de rutas de señalización
centrales que conducen a la expresión de citocinas. Los datos
presentes no excluyen la implicación de otros receptores de estas
moléculas. En este contexto, estudios futuros deben también
determinar el grado en que otros miembros distintos de la familia de
S100/calgranulina, además de EN-RAGE y S100B,
poseen capacidad para interaccionar con RAGE. Sin embargo, en dos
estudiados hasta la fecha, uno más similar a calgranulina
(EN-RAGE) y el otro más similar a S100 (S100B),
parece que RAGE es un sitio de interacción celular central. En
realidad, el presente hallazgo de que la administración de sRAGE,
F(ab')_{2} anti-EN-RAGE,
F(ab')_{2} anti-RAGE o F(ab')_{2}
anti-EN-RAGE +
anti-RAGE suprime significativamente la generación
de mediadores esenciales de la inflamación tales como
TNF-\alpha e IL-2, sugiere
acusadamente un papel fundamental para la interacción entre
EN-RAGE, y miembros familiares relacionados, con
RAGE en el fenotipo inflamatorio.
Los hallazgos presentes amplían el contexto de
RAGE como un miembro distinto de la superfamilia inmunoglobulínica
de moléculas de la superficie celular en virtud de su extraordinario
conjunto de ligandos, con implicaciones tanto en estados de
desarrollo como en estados patofisiológicamente relevantes (Schmidt
et al., 1998). La identificación de la anfoterina como un
ligando de RAGE (Rauvala y Pihlaskari, 1987; Parkkinen et
al., 1993; Hori et al., 1995) sugería un papel para RAGE
en la emergencia de neuritas en el sistema nervioso central (CNS;
del inglés, central nervous system) en
desarrollo. Consecuentemente con este concepto, la expresión de
anfoterina y RAGE neuronales está sorprendentemente aumentada y
conjuntamente localizada en neuronas en desarrollo del CNS de rata
(Hori et al., 1995). En estudios in vitro, la
emergencia neurítica de neuronas embrionarias de rata en cultivo
fue específicamente inhibida en matrices revestidas con anfoterina
mediante el bloqueo de RAGE empleando RAGE soluble (sRAGE) o
fragmentos F(ab')_{2} anti-RAGE. Resulta
importante advertir que la observación de que RAGE reacciona con
anfoterina en neuronas en desarrollo para mediar en la emergencia
de neuritas presenta notables paralelismos en la biología de la
familia de S100. Ciertos miembros de este segundo grupo, tal como
S100B, median en la emergencia de neuritas (Kligman y Marshak, 1985;
Marshak, 1990; Barger et al., 1992).
Después del desarrollo, la expresión de
anfoterina y RAGE neuronales disminuye en la homeostasis (Hori et
al., 1995). Sin embargo, tras la acumulación de péptido \beta
amiloide en el cerebro de enfermos de Alzheimer, aumenta la
expresión de RAGE, particularmente en neuronas y vasculatura
afectadas (Yan et al., 1996; Mackic et al., 1998).
Estudios en que se emplean neuronas y células de tipo neuronal en
cultivo sugieren que la interacción del péptido \beta amiloide
con RAGE media en el estrés y la toxicidad neuronales y en la
activación de la microglía, conduciendo esto último a una
generación aumentada del factor estimulador de colonias de
macrófagos, un posible medio, creemos, para desencadenar respuestas
inflamatorias localizadas en el cerebro afectado, lo que exacerba
la toxicidad neuronal (Yan et al., 1997). La expresión
aumentada del RAGE neuronal y vascular, que está conjuntamente
localizado con sitios de péptido \beta amiloide en el cerebro de
sujetos humanos con enfermedad de Alzheimer, sugiere además que
esta interacción puede ser muy relevante in vivo. Están en
camino estudios para elucidar la importancia de esta interacción
empleando ratones en que los niveles de RAGE y péptido \beta
amiloide en neuronas del CNS han sido genéticamente
incrementados.
En la homeostasis, hemos observado que los
niveles de RAGE son bastantes bajos en una gran variedad de tipos
celulares (Brett et al., 1993; Schmidt et al., 1995a).
Las implicaciones de esto no están totalmente claras; sin embargo,
en otros estudios hemos demostrado que la administración de RAGE
soluble a ratones diabéticos adultos durante largos periodos de
tiempo (hasta seis meses) no tiene efectos negativos (observaciones
no publicadas; D. Stern y A. M. Schmidt). En realidad, en el
escenario de la diabetes, se han advertido efectos saludables al
administrar sRAGE.
En tejido diabético, la expresión de RAGE está
muy suprarregulada en tejidos tales como la vasculatura y se
localiza conjuntamente con niveles elevados de los productos de
glicosilación y oxidación no enzimáticas, AGEs (Schmidt et
al., 1995a; Park et al., 1988). Formulamos la hipótesis
de que la interacción AGE-RAGE y la consiguiente
perturbación celular crónica están detrás, al menos en parte, de las
complicaciones de larga duración en células vasculares, neurales e
inflamatorias de este trastorno que imparten consecuencias
debilitantes (Schmidt et al., 1993; Schmidt et al.,
1994; Wautier et al., 1994; Schmidt et al., 1995b;
Wautier et al., 1996; Schmidt et al., 1996; Miyata
et al., 1996). Consecuentemente con esto, la administración
de sRAGE a roedores diabéticos invierte la hiperpermeabilidad
vascular y suprime la aterosclerosis acelerada (Wautier et
al., 1996; Park et al., 1998).
Basándose en estas observaciones, el grado en
que los EN-RAGEs contribuyen a procesos
inflamatorios y a la disfunción celular de trastornos que varían,
por ejemplo, de diabetes e insuficiencia renal a enfermedad de
Alzheimer, surge una serie de cuestiones intrigantes; futuros
estudios dirigirán dichas posibilidades a modelos murinos
transgénicos.
\newpage
Por lo tanto, los presentes hallazgos amplían el
concepto de que RAGE es una molécula importante en escenarios en
que se acumulan sus ligandos. La caracterización del promotor de
RAGE, en el que se identificaron múltiples posibles sitios ligantes
de DNA para una diversidad de factores de transcripción capaces de
alterar el fenotipo del huésped, tales como
NF-\kappaB,
NF-IL-6, g-IRE, Sp1,
AP2, etc. (Li y Schmidt, 1997; Li et al., 1998), sugiere
marcadamente que RAGE es un gen versátil, sensible a un conjunto
distinto de señales ambientales. Además, la localización del gen
que codifica RAGE humano en el cromosoma seis, dentro del complejo
principal de histocompatibilidad, sugiere que RAGE está implicado
en la respuesta del huésped, desde el desarrollo hasta estados
patofisiológicamente importantes (Sugaya et al., 1994).
Por lo tanto, en conjunto, la identificación de
EN-RAGE y moléculas similares a
EN-RAGE como ligandos de RAGE define la relevancia
biológica de los polipéptidos S100/calgranulina y de la molécula de
RAGE de la superfamilia inmunoglobulínica. La presente demostración
de que el bloqueo de EN-RAGE, RAGE y su interacción
detiene eficazmente la activación celular identifica estos
mediadores como nuevas próximas dianas para estrategias
antiinflamatorias diseñadas para sofocar las respuestas
inflamatorias exageradas, limitando por ello el daño tisular.
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DE RAGE (EN-RAGE) Y USOS DE LA MISMA
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<130>
0575-55873-B-PCT
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<140> Nº de Solicitud Internacional: AÚN
NO CONOCIDO
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<141>
06-10-1999
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> PatentIn versión 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> SEC 1
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 50
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<212> PRT
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<213> SEC 2
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 90
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<212> PRT
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<213> SEC 3
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<212> PRT
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<213> SEC 4
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> SEC 5
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> SEC 6
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\sa{Ala Gln Asn Ile Thr}
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<110> Los Administradores de la
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva proteína extracelular ligante
de Rage (En-Rage) y usos de la misma
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> B4873-CA/CS
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<140> 99953081.9
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<141>
06-10-1999
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<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Poco seguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 90
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<212> PRT
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<213> Bos taurus
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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\sa{Ala Gln Asn Ile Thr}
Claims (28)
1. Un péptido aislado que tiene la secuencia
N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1
(ID. SEC. nº 2).
2. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un péptido que tiene la secuencia
N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1
(ID. SEC. nº 2).
3. Una molécula de ácido nucleico aislada que
tiene la secuencia mostrada en la Figura 5 (ID. SEC. nº 1).
4. Un vector replicable que comprende la
molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3.
5. El vector replicable de la Reivindicación 4,
en que el vector es un vector de expresión procariótico, un vector
de expresión de levadura, un vector de expresión de baculovirus o un
vector de expresión de mamífero.
6. Una célula huésped que comprende el vector de
la Reivindicación 4.
7. La célula huésped de la Reivindicación 6, en
que la célula huésped es una célula eucariótica, una célula somática
o una célula germinal.
8. La molécula de ácido nucleico de la
Reivindicación 2 ó 3, en que la molécula de ácido nucleico está
marcada con un resto detectable.
9. La molécula de ácido nucleico de la
Reivindicación 8, en que el resto detectable es un marcador
fluorescente, una digoxigenina, una biotina, una enzima, un átomo
radiactivo, un ion paramagnético o un marcador
quimioluminiscente.
10. Una composición que comprende un péptido que
tiene la secuencia N-terminal de aminoácidos
mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. nº 2), y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
11. Una composición que comprende un péptido
codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura
5 (ID. SEC. nº 1), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. La composición de la Reivindicación 10 ó 11,
en que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo para
administración intravenosa, oral, tópica o por aerosol.
13. Un método para determinar si un compuesto es
capaz de inhibir la interacción entre el péptido codificado por la
molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3 y un péptido
RAGE, que comprende:
(a) mezclar:
- (i)
- un péptido RAGE o un péptido sRAGE o un fragmento de cualquiera de los mismos,
- (ii)
- el péptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3; y
- (iii)
- el compuesto;
(b) medir el nivel de interacción entre el
péptido de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a)
(ii); y
(c) comparar la cantidad de interacción medida
en la operación (b) con la cantidad medida entre el péptido de la
operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii) en ausencia
del compuesto, determinándose de esta manera si el compuesto es
capaz de inhibir la interacción entre el péptido codificado por la
molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3 y el péptido
RAGE; en el que una reducción en la cantidad de interacción en
presencia del compuesto indica que el compuesto es capaz de inhibir
la interacción.
14. El método de la Reivindicación 13, en que el
fragmento de la operación (a) (i) es el dominio V de RAGE.
15. El método de la Reivindicación 13, en que el
fragmento de la operación (a) (i) o (a) (ii) es sintético.
16. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto comprende al menos una porción de un péptido sRAGE
presente en la naturaleza.
17. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto es un compuesto peptidomimético.
18. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto es una molécula orgánica.
19. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto es un péptido, un ácido nucleico o un producto químico
inorgánico.
20. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto es una molécula de peso molecular inferior a 10.000
dáltones.
21. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
22. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto es un péptido RAGE mutado o un fragmento del mismo.
23. El método de la Reivindicación 13, en que el
compuesto es un péptido mutado de la Reivindicación 1 o un fragmento
del mismo.
24. El método de la Reivindicación 13, en que el
péptido de la operación (a) (ii) es fijado a una superficie
sólida.
25. El método de la Reivindicación 13, en que el
péptido de la operación (a) (i) o (a) (ii) es detectablemente
marcado.
26. El método de la Reivindicación 25, en que el
marcador detectable comprende fluorescencia, biotina o
radiactividad.
27. El método de la Reivindicación 13, en que el
mezclamiento tiene lugar en una célula.
28. El método de la Reivindicación 13, en que el
mezclamiento tiene lugar en un animal.
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