JP2002526117A - 細胞外新規ｒａｇｅ結合タンパク質（ｅｎ−ｒａｇｅ）及びその使用 - Google Patents

細胞外新規ｒａｇｅ結合タンパク質（ｅｎ−ｒａｇｅ）及びその使用

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JP2002526117A
JP2002526117A JP2000574713A JP2000574713A JP2002526117A JP 2002526117 A JP2002526117 A JP 2002526117A JP 2000574713 A JP2000574713 A JP 2000574713A JP 2000574713 A JP2000574713 A JP 2000574713A JP 2002526117 A JP2002526117 A JP 2002526117A
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シュミット、アン・マリー
スターン、デビッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離されたヒトＥＮ−ＲＡＧＥペプチドを提供する。また、本発明は、ある化合物がＥＮ−ＲＡＧＥペプチドのＲＡＧＥペプチドとの相互作用を阻害し得るかどうかを決定する方法であって：（ａ）（ｉ）ＲＡＧＥペプチド、若しくはｓＲＡＧＥペプチド、又はそれらのうちの何れかの断片、（ｉｉ）ＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又はその断片、および（ｉｉｉ）前記化合物を混合することと；（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドとの相互作用のレベルを測定することと；（ｃ）工程（ｂ）で測定された相互作用の量と、前記化合物の非存在下において工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドとの間で測定された量とを比較することにより、前記化合物が、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドとＲＡＧＥペプチドとの相互作用を阻害できるかどうかを決定することとを備え、前記化合物の存在下での相互作用の量の減少が、前記化合物が前記相互作用を阻害できることの指標となる方法を提供する。本発明はまた、患者の炎症を阻害する方法であって、前記患者においてＥＮ−ＲＡＧＥペプチドと後生的糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）との相互作用を妨害することができ、それによって前記患者の炎症を阻害し得る化合物を前記患者に投与することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本明細書で開示されている発明は、米国保健福祉省から国立衛生研究所のグラ
ント第ＡＧ００６０２号の下、及び合衆国公衆衛生局のグラント第ＤＫ５２４９
５号、ＨＬ５６８８１号、ＡＧ００６０２号、ＤＥ１１５６１号の下、合衆国政
府の補助によってなされた。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する
。
【０００２】 本出願を通じて、本文中に様々な文献が著者名と日付によって参照されている
。これらの参考文献の完全な引用は、各実験の実験詳細の部の末尾にアルファベ
ット順で列記されているであろう。本明細書に記載され、特許権が請求されてい
る本発明がなされた時点での、当業者に公知の技術水準をより完全に記述するた
めに、これらの文献の開示内容全体を本出願に参考文献として組み込む。
【０００３】
【発明の背景】
ＡＧＥの受容体（ＲＡＧＥ）は、細胞表面分子の免疫グロブリンスーパーファ
ミリーの一員である（１−２）。まず、グルコース（アルドース糖）修飾された
タンパク質、すなわち、後生的糖化最終産物（ＡＧＥｓ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇ
ｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）の細胞受容体として、同定され、
性質決定された後（３−１３）、ＲＡＧＥは、正常な発育状態下とアルツハイマ
ー病下の両者で、他のリガンドと相互作用することが報告された（１４−１６）
。通常の発育において、ＲＡＧＥは、培養された胚性ニューロンで神経突起の成
長を媒介するポリペプチドであるアムホテリンと相互作用する。それらの研究で
は、抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２又は可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）の何れかが
、アムホテリンがコートされたマトリックス上での神経突起の成長を阻害したが
、ラミニンまたはポリ−ｌ−リシンのような他の基材でコートされたマトリック
ス上では阻害は起こらなかった（３）。後の研究で、ＲＡＧＥは、アルツハイマ
ー病での神経細胞毒性とニューロンの死滅の発症と関連するポリペプチドである
アミロイド−β−ペプチドのニューロン及びミクログリア細胞の受容体として同
定された。
【０００４】
【発明の概要】
本発明は、単離されたヒトＥＮ−ＲＡＧＥペプチドを提供する。本発明は、あ
る化合物がＥＮ−ＲＡＧＥペプチドのＲＡＧＥペプチドとの相互作用を阻害し得
るかどうかを決定する方法であって、（ａ）（ｉ）ＲＡＧＥペプチド、若しくは
ｓＲＡＧＥペプチド、又はそれらのうちの何れかの断片と、（ｉｉ）ＥＮ−ＲＡ
ＧＥペプチド又はその断片と、（ｉｉｉ）前記化合物とを混合することと；（ｂ
）工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドとの相互作用の
レベルを測定することと；（ｃ）工程（ｂ）で測定された相互作用の量と、前記
化合物の非存在下で工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉｉ）のペプチ
ドとの間で測定された量とを比較することにより、前記化合物が、ＥＮ−ＲＡＧ
ＥペプチドとＲＡＧＥペプチドとの相互作用を阻害できるかどうかを決定するこ
ととを備え、前記化合物の存在下での相互作用の量の減少が、前記化合物が前記
相互作用を阻害できることの指標となる方法も提供する。本発明は、患者の炎症
を阻害する方法であって、前記患者でのＥＮ−ＲＡＧＥペプチドと後生的糖化最
終産物受容体（ＲＡＧＥ）との相互作用を妨害し得る化合物を前記患者に投与す
ることによって、前記患者の炎症を阻害することを備えた方法も提供する。
【０００５】
【発明の詳細な記述】
本明細書では、以下の略号が用いられる：ＣＭＬ−カルボキシメチル−リシン
；ＡＧＥ−後生的糖化最終産物；ＲＡＧＥ−後生的糖化最終産物受容体；ｓＲＡ
ＧＥ−後生的糖化最終産物の可溶性受容体；ＥＮ−ＲＡＧＥ−細胞外新規ＲＡＧ
Ｅ結合タンパク質。
【０００６】 本発明は単離されたヒトＥＮ−ＲＡＧＥペプチドを提供する。ある態様では、
前記単離されたＥＮ−ＲＡＧＥペプチドは、表１に示されたＮ末端アミノ酸配列
を有する。別の態様では、前記ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受付
番号ＡＦ０１１７５７のｃＤＮＡ配列によってコードされる。単離された核酸分
子は、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドをコードしている。ある態様では、前記ＥＮ−Ｒ
ＡＧＥペプチドは、ヒトＥＮ−ＲＡＧＥである。別の態様では、前記核酸は、Ｄ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡである。ある例において、前記ＥＮ−ＲＡＧＥの核
酸配列は、図５に示されている配列である（配列番号１）。
【０００７】 本発明は、ＥＮ−ＲＡＧＥ核酸分子を含む複製可能なベクターも提供する。あ
る態様では、前記複製可能なベクターは、原核生物の発現ベクター、酵母発現ベ
クター、バキュロウイルス発現ベクター、又は哺乳類発現ベクターである。
【０００８】 本発明は、前記複製可能なベクターを含む宿主細胞も提供する。ある態様では
、前記宿主細胞は、真核細胞、体細胞、又は生殖細胞である。
【０００９】 別の態様において、本発明の核酸分子は検出可能な部分で標識され得る。前記
検出可能な部分は、蛍光標識、ジゴキシゲニン、ビオチン、酵素、放射活性原子
、常磁性イオン、および化学発光標識からなる群から選択され得る。
【００１０】 本発明は、実質的に３’から５’方向のＥＮ−ＲＡＧＥ核酸配列のユニークな
断片からなる核酸分子であって、前記配列が、天然のＥＮ−ＲＡＧＥペプチドを
コードする遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸分子も提供
する。
【００１１】 本発明は、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又はその断片と薬学的に許容される担体を
含む組成物も提供する。ある態様では、前記薬学的に許容される担体は、エアロ
ゾル、静脈内の、経口、又は局所の担体である。
【００１２】 本発明は、ＥＮ−ＲＡＧＥのユニークな配列を含むエピトープと免疫的に反応
する抗体も提供する。
【００１３】 本発明は、細胞中でＥＮ−ＲＡＧＥ ｍＲＮＡを特異的に切断できるリボザイ
ムも提供する。
【００１４】 本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その生殖細胞又は体細
胞が、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又は生物学的に活性なその変種をコードし、胚段
階で前記哺乳類又はその先祖に導入された核酸分子を含有するトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳類も提供する。ある態様では、ＥＮ−ＲＡＧＥポリペプチドをコー
ドする核酸分子は、哺乳類の細胞中で過剰発現される。別の態様では、前記核酸
分子はヒトＥＮ−ＲＡＧＥペプチドをコードする。別の態様では、前記活性な変
種はＥＮ−ＲＡＧＥの相同体を含む。
【００１５】 本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その生殖細胞又は体細
胞が、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドの発現レベルが天然の哺乳類のＥＮ−ＲＡＧＥペ
プチドの発現レベル以下に減少するようにデザインされた適切な配列を有する適
切なベクターでトランスフェクトされたトランスジェニック非ヒト哺乳類を提供
する。ある態様では、前記適切なベクターは、相同的組換えを可能にするための
適切なクローニングされたゲノム核酸分子を含有する。別の態様では、前記適切
なベクターはＥＮ−ＲＡＧＥ ｍＲＮＡ分子、又は天然のＥＮ−ＲＡＧＥ ｍＲ
ＮＡ配列に対してアンチセンスな配列を含むアンチセンス分子を切断できるリボ
ザイムをコードする。
【００１６】 本発明は、ある化合物がＥＮ−ＲＡＧＥペプチドのＲＡＧＥペプチドとの相互
作用を阻害し得るかどうかを決定する方法であって、（ａ）（ｉ）ＲＡＧＥペプ
チド、若しくはｓＲＡＧＥペプチド、又はそれらのうちの何れかの断片と、（ｉ
ｉ）ＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又はその断片と、（ｉｉｉ）前記化合物とを混合す
ることと；ｂ）工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドと
の相互作用のレベルを測定することと；（ｃ）工程（ｂ）で測定された相互作用
の量と、前記化合物の非存在下で工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉ
ｉ）のペプチドとの間で測定された量とを比較することにより、前記化合物が、
ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドとＲＡＧＥペプチドとの相互作用を阻害できるかどうか
を決定することとを備え、前記化合物の存在下での相互作用の量の減少が、前記
化合物が前記相互作用を阻害できることの指標となる方法も提供する。
【００１７】 ある態様では、工程（ａ）（ｉ）の断片はＲＡＧＥのＶドメインである。別の
態様では、工程（ａ）（ｉ）又は（ａ）（ｉｉ）の断片は合成である。別の態様
では、前記化合物は、天然に存在するｓＲＡＧＥペプチドの一部分を含む。別の
態様では、前記化合物は、ペプチド模倣体である。別の態様では、前記化合物は
有機分子である。別の態様では、前記化合物は、ペプチド、核酸、あるいは無機
化合物である。別の態様では、前記化合物は１０，０００ダルトン未満の分子で
ある。別の態様では、前記化合物は抗体又はその断片である。別の態様では、前
記化合物は変異されたＲＡＧＥペプチド又はその断片である。別の態様では、前
記化合物は変異されたｓＲＡＧＥペプチド又はその断片である。別の態様では、
前記化合物は変異されたＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又はその断片である。別の態様
では、工程（ａ）（ｉ）のペプチドは固体表面に付着される。別の態様では、工
程（ａ）（ｉｉ）のペプチドは固体表面に付着される。別の態様では、工程（ａ
）（ｉ）又は工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドは検出可能に標識される。別の態様
では、前記検出可能な標識は蛍光、ビオチン、又は放射能を含む。
【００１８】 別の態様では、スクリーニング法での前記混合は、細胞中で起こる。別の態様
では、前記混合は動物中で起こる。
【００１９】 本発明は、本明細書に記載したスクリーニング法によって同定された化合物で
あって、患者の炎症の抑制に有用である化合物も提供する。
【００２０】 本発明は、本明細書に記載した方法によって同定された化合物であって、患者
の全身性エリテマトーデス又は炎症性ループス腎炎の治療に有用な化合物も提供
する。
【００２１】 本発明は、本明細書で上記した方法によって同定された以前には未知であった
化合物を提供する。
【００２２】 本発明は、患者の炎症を阻害する方法であって、前記患者においてＥＮ−ＲＡ
ＧＥペプチドと後生的糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）との相互作用を妨害する
ことができ、それによって前記患者の炎症を阻害し得る化合物を前記患者に投与
することを含む方法も提供する。
【００２３】 別の態様では、前記化合物は抗ＥＮ−ＲＡＧＥ抗体若しくはその断片、又は抗
ＲＡＧＥ抗体若しくはその断片である。別の態様では、前記化合物はｓＲＡＧＥ
ペプチドである。別の態様では、前記化合物は、実質的に、ｓＲＡＧＥペプチド
のリガンド結合ドメイン又はＥＮ−ＲＡＧＥペプチドのリガンド結合ドメインか
らなる。別の態様では、前記化合物は、核酸分子又はペプチドである。他の態様
において、前記ペプチドは抗体、あるいはその断片である。別の態様では、前記
核酸分子は、リボザイム、又はアンチセンス核酸分子である。
【００２４】 別の態様では、前記ペプチドは、抗体又はその断片である。別の態様では、前
記核酸分子は、リボザイム又はアンチセンス核酸分子である。別の態様では、前
記化合物は、請求項２６のスクリーニング法によって同定された化合物である。
【００２５】 別の態様では、前記炎症は、遅延型過敏症、加速されたアテローム性動脈硬化
症、又はループス腎炎を伴う。別の態様では、前記患者は、ヒト、類人猿、マウ
ス、ラット、又はイヌである。
【００２６】 別の態様では、前記投与は、病変内、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射；注入；
リポソームを介した送達；又は局所、莢膜内、歯肉ポケット、経直腸、気管支内
、鼻、口、眼、又は耳からの送達を含む。別の態様では、前記化合物は、毎時間
、毎日、毎週、毎月、又は毎年ごとに投与される。別の態様では、前記化合物の
有効量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む
。
【００２７】 別の態様では、前記患者は、全身性エリテマトーデス、炎症性ループス腎炎、
敗血性ショック又は内毒素血症に罹患している。別の態様では、前記患者は炎症
に罹患している。
【００２８】 さらなる態様では、前記患者は、ＥＮ−ＲＡＧＥを含有する炎症細胞の召集が
起こる自己免疫又は炎症性疾患に罹患している。別の態様では、前記患者は、細
菌が関連した、又は他の病原体が関連した感染症に罹患している。
【００２９】 別の態様では、前記方法は、前記化合物を投与する間に、前記患者に薬学的に
許容される担体を投与することをさらに備える。別の態様では、前記担体は、希
釈剤を含む。別の態様では、前記担体は、ウイルス、リポソーム、ミクロカプセ
ル、ポリマーに封入した細胞、又はレトロウイルスベクターを含む。別の態様で
は、前記担体は、エアロゾル、静脈内、経口、又は局所担体である。別の態様で
は、前記化合物は、経時放出インプラントから投与される。
【００３０】 本発明は、ある化合物が、ＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質の第２のタンパク質に結
合する能力を阻害できるかどうかを決定する方法であって、（ａ）ＥＮ−ＲＡＧ
Ｅタンパク質、前記第２のタンパク質、及び前記化合物を混合することと；（ｂ
）前記ＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質と前記第２のタンパク質との結合量を測定する
ことと；（ｃ）工程（ｂ）で測定された結合量を、前記化合物の非存在下におけ
るＥＮ−ＲＡＧＥと前記第２のタンパク質との結合量と比較することを備え、結
合量の減少が、前記化合物がＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質の前記第２のタンパク質
に結合する能力を阻害できることの指標となる方法も提供する。
【００３１】 ＲＡＧＥのヒトｃＤＮＡは１４０６塩基対であり、４０４アミノ酸の成熟した
タンパク質をコードする。Ｎｅｅｐｅｒら１９９２の図３を参照。本明細書で使
用する「ＲＡＧＥのＶドメイン」とは、「Ｎｅｅｐｅｒ．Ｍ．，Ｓｈｍｉｄｔ，
Ａ．Ｍ．，Ｂｒｅｔｔ，Ｊ．，Ｙａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｐａｎ，Ｙ
．Ｃ．，Ｅｌｌｉｓｔｏｎ，Ｋ．，Ｓｔｅｒｎ，Ｄ．，ａｎｄ Ｓｈａｗ，Ａ．
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＧＥ：ａ ｃｅ
ｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙ
ｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９９８−１５００４，１９９２」（そ
の内容は、参考文献として本明細書に組み込まれる）の図５に示されている免疫
グロブリン様可変ドメインを意味する。Ｖドメインは、Ｎｅｅｐｅｒら（１９９
２）の図４に示されているように、２３位〜１２０位のアミノ酸を含む。示され
ているリーダー配列は、前記Ｖドメインの一部ではなく、ヒトでは、前記Ｖドメ
インは、アミノ酸Ａ−Ｑ−Ｎ−Ｉ−Ｔから始まる。ＲＡＧＥタンパク質中のＡＧ
Ｅ結合部位を規定するのに最小限必要なアミノ酸配列は、１２０アミノ酸よりず
っと少ないかもしれない。
【００３２】 ウシのＥＮ−ＲＡＧＥ核酸配列をクローニングし、受付番号ＡＦ ０１１７５
７でＧｅｎｂａｎｋに寄託した。ＥＮ−ＲＡＧＥの核酸配列は図５に示されてい
る。他の種に存在するＥＮ−ＲＡＧＥの相同体は、当業者に公知の方法によって
取得できるであろう。例えば、ウシＥＮ−ＲＡＧＥ核酸ｃＤＮＡ配列にユニーク
な配列は、ヒトの相同体を得るために、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするためのプローブとして使用し得る。
【００３３】 ＡＧＥ（ＣＭＬ修飾されたＡＧＥ）のようなＲＡＧＥのリガンド及びｐ１２、
炎症誘導性サイトカインは、炎症細胞を活性化する。これは、マウスで示された
。これらの活性化効果は、ｓＲＡＧＥの存在下でブロックされる。このように、
本発明は、患者におけるＲＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥとの相互作用を妨害すること
ができる化合物を投与することによって、患者の炎症（例えば、免疫刺激による
炎症）をブロックする方法を提供する。このような方法は、炎症に対して選択的
であろう。前記化合物は、一例として、特にＲＡＧＥのリガンドの拮抗的阻害剤
としてデザインされる。
【００３４】 スクリーニングアッセイは、成分の１つが固体表面に結合又は付着されたとこ
ろで実施し得る。ある態様では、前記ペプチドは、固体表面に付着されている。
別の態様では、ＲＡＧＥのＡＧＥ結合部位の配列を有する第２のペプチドは固体
表面に結合又は付着されている。この態様で有用な固体表面は、当業者に公知で
あろう。例えば、固体表面の一例は、ビーズ、カラム、プラスチックの皿、プラ
スチックのプレート、顕微鏡のスライド、ナイロン膜などである。前記固体表面
を構成する材質は、一例として、合成品である。
【００３５】 スクリーニングアッセイの工程（ａ）の成分の１つは、検出可能に標識され得
る。前記成分（前記化合物、前記ペプチド又は前記Ｖドメイン又は第２のペプチ
ドの何れか）は、蛍光ラベル、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性原子、常磁性
イオン、及び化学発光標識を含む検出可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）で標識され得
る。前記成分は、化学的な、酵素的な、又は他の適切な手段のような共有結合手
段によって、酵素又は放射性同位体のような部分で標識され得る。
【００３６】 ある態様では、前記患者は哺乳類である。別の態様では、前記患者は脊椎動物
である。好ましい態様では、前記哺乳類はヒトである。ある例では、前記患者は
糖尿病患者である。本発明の別の例では、前記患者は、糖尿病、腎不全、アミロ
イドーシス、老化、又は炎症に罹患している。前記患者は、米国医学協会の身長
及び体重の基準によって定義される肥満患者であってもよい。前記患者は老齢で
あってもよい。前記患者は、ヒト、霊長類、ウマの患者、ヒツジ（ｏｐｉｎｅ）
の患者、トリの患者、ウシの患者、ブタ、イヌ、ネコ、又はマウスの患者であり
得る。
【００３７】 ある態様では、前記患者は、ＡＧＥに関連した疾病に罹患している。別の態様
では、このようなＡＧＥに関連した疾病は、脳、網膜、腎臓、脈管構造、心臓、
又は肺に現れる。別の態様では、前記患者は、アルツハイマー病又は患者に蓄積
するＡＧＥによって出現する疾病に罹患している。別の態様では、前記患者は、
軟組織の傷害、視力の衰え、心臓血管病、腎臓病などのような糖尿病の症状に罹
患している。このような症状は、当業者に公知であろう。
【００３８】 前記化合物は、ポリペプチドであり得る。前記ポリペプチドは、ペプチド、ペ
プチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、合成ポリペプチド、天然のポ
リペプチドの誘導体、修飾されたポリペプチド、標識されたポリペプチド、又は
非天然のペプチドを含むポリペプチドであり得る。前記ペプチド模倣体は、加速
されたアテローム性動脈硬化症になりやすい患者で加速されたアテローム性動脈
硬化症を抑制することができる化合物を決定するために、ペプチド模倣体である
様々な化合物の巨大なライブラリーをスクリーニングすることによって同定され
得る。前記ポリペプチドは、天然には見出されないキラリティーを有する非天然
のポリペプチド、すなわちＤ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸であり得る。
【００３９】 ある態様では、前記化合物はアンタゴニストであり、該アンタゴニストは、Ａ
ＧＥより高い親和性でＲＡＧＥを結合することができるため、ＡＧＥの結合の効
果を拮抗的に喪失させる。別の態様では、前記化合物は、ＲＡＧＥの発現を阻害
し得るリボザイムであり得る。別の態様では、前記化合物は、抗ＲＡＧＥ抗体、
抗ＡＧＥ抗体、ＲＡＧＥ抗体の抗Ｖドメインである。前記抗体は、モノクローナ
ル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、霊長類化であり得る。前記化合物は、こ
のような抗体の断片であり得る。
【００４０】 本発明の別の態様では、前記方法は、前記ポリペプチドを投与する間に、前記
患者に、薬学的に許容される担体を投与することをさらに備え得る。前記投与は
、病変内、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射；注入；リポソームを介した送達；又
は局所、鼻、口、眼、又は耳からの送達を含む。さらなる態様では、前記投与は
、気管支内投与、肛門又は莢膜内投与を含む。
【００４１】 前記ポリペプチドは、（例えば、経時放出形態で）毎時間、毎日、毎週、毎月
、若しくは毎年、又は単回送達として送達され得る。前記送達は、一定期間にわ
たる連続的な送達、例えば静脈内送達であり得る。
【００４２】 前記ポリペプチドの有効量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００
ｍｇ／ｋｇ体重を含み得る。ある態様では、前記有効量は、約０．００１ｍｇ／
ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重を含み得る。別の態様では、前記有効量は、約
０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重を含み得る。実際の有効量は、
ポリペプチドのサイズ、ポリペプチドの生物分解性、ポリペプチドの生物活性、
及びポリペプチドの生物学的利用能に基づくであろう。もしポリペプチドが迅速
に分解せず、生物学的利用能があり、高度に活性があれば、有効であるためには
、より少ない量が必要とされるであろう。前記有効量は、当業者に公知であろう
。それは、ポリペプチドの形態、ポリペプチドのサイズ、及びポリペプチドの生
物活性にも依存するであろう。当業者であれば、バイオアッセイでの生物活性を
決定し、これによって、有効量を決定するために、ポリペプチドに対する経験的
な活性テストを定型的に行うことができるだろう。
【００４３】 本発明の別の態様では、前記方法は、前記化合物を投与する間に、前記患者に
、薬学的に許容される担体を投与することをさらに備え得る。前記投与は、病変
内、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射；注入；リポソームを介した送達；又は局所
、鼻、口、眼、又は耳からの送達を含み得る。
【００４４】 前記化合物は、（例えば、経時放出形態で）毎時間、毎日、毎週、毎月、若し
くは毎年、又は単回送達として送達され得る。前記送達又は投与は、一定期間に
わたる連続的な送達、例えば静脈内送達であり得る。
【００４５】 前記化合物は、ｓＲＡＧＥのポリペプチド類縁体のようなｓＲＡＧＥポリペプ
チドであり得る。このような類縁体には、ｓＲＡＧＥの断片が含まれる。Ａｌｔ
ｏｎら（ＷＯ ８３／０４０５３）によって公表された出願の手順に従って、本
明細書に明記したものと、１以上の残基の同一性又は位置について、１次構造が
異なるポリペプチド（例えば、置換、末端及び中間への付加、並びに欠失）の微
生物での発現をコードする遺伝子を容易にデザインし、製造することができる。
交互に、ｃＤＮＡ及びゲノム遺伝子の修飾は、周知の位置指定変異導入技術によ
って容易に達成することができ、類縁体、及びｓＲＡＧＥポリペプチドの誘導体
を作成するために利用できる。このような産物は、ｓＲＡＧＥの生物学特性を少
なくとも１つ共有しているが、他の特性は異なっていてもよい。例として、本発
明の産物は、例えば、欠失によって短縮された産物、又は加水分解に対してより
安定である産物（それ故、天然のものと比べて、より顕著な、又はより長時間持
続する効果を有し得る）；又は１以上のＯ−グリコシル化及び／又はＮグリコシ
ル化され得る部位を欠失若しくは付加するように改変され、又は、例えばアラニ
ン若しくはセリン残基によって欠失若しくは置換された１以上のシステイン残基
を有し、微生物系から活性型として単離することがより容易であり得る、又は１
以上のチロシン残基がフェニルアラニンによって置換され、標的タンパク質若し
くは標的細胞上の受容体に事実上容易に結合する産物を含む。連続するアミノ酸
配列の一部、すなわちｓＲＡＧＥ中の２次構造のみが重複するポリペプチド断片
であって、ｓＲＡＧＥのある特性を有し、他の特性を有しなくてもよい断片も含
まれる。本発明の１以上のポリペプチドが治療的な有用性又は、ｓＲＡＧＥ拮抗
のアッセイにおけるような他の状況での有用性を有するためには活性は必要では
ないことに注意しなければならない。拮抗的なアンタゴニストは、例えば、ｓＲ
ＡＧＥの過剰生産の場合に、極めて有用であり得る。
【００４６】 本発明のポリペプチド類縁体の応用としては、天然のタンパク質、糖タンパク
質、及び核タンパク質に現存するアミノ酸配列を実質的に復元する合成ペプチド
の免疫学的特性の報告がある。より具体的には、相対的に低分子量のポリペプチ
ドが、ウイルス抗原、ポリペプチドホルモン等のような生理的に重要なタンパク
質の免疫反応と持続時間及び程度が類似する免疫反応に参加することが示されて
きた。このようなポリペプチドの免疫反応には、ペプチドホルモンの２次構造を
概ね共有するが、それらの１次構造のコンフォメーションを共有しなくてもよい
合成ペプチドの生物学的及び免疫学的な特性に関連する、免疫学的に活性な動物
における特異抗体の形成の刺激が含まれる［Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ，２３，３０９−３１０（１９８１）；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，２９４，６４５−６５８（１９８１）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，４８８２−４８８６（１９
８１）；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，７９、５３２２−５３２６（１９８２）；Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ，２８，３９５−４０４（１９８２）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔｕｒｅ，２９５，１８５−１６０（１９８２）；ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ
，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４８，６６−７４（１９８３）
．Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３，２４９−２５５（
１９８４）］も参照］。
【００４７】 本発明の化合物は、少なくとも部分的には天然のものでなくてもよいペプチド
模倣体化合物であり得る。ペプチド模倣体化合物は、ｓＲＡＧＥのアミノ酸配列
の一部の小分子模倣体であり得る。前記化合物は、前記模倣によって、安定性、
効力、有効性、及び生物学的利用能が増加していてもよい。さらに、前記化合物
は、毒性が減少していてもよい。前記ペプチド模倣体化合物は、粘膜の腸の透過
性が増大していてもよい。前記化合物は、合成的に調製してもよい。本発明の化
合物には、Ｌ−、Ｄ−、又は非天然のアミノ酸、α、αニ置換されたアミノ酸、
Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸（アラニンの等電子類縁体）、が含まれ得る。前記
化合物のペプチド骨格は、少なくとも１つの結合がＰＳＩ−［ＣＨ＝ＣＨ］（Ｋ
ｅｍｐｆ ｅｔ ａｌ．１９９１）で置換され得る。前記化合物には、さらに、
トリフルオロチロシン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラ
ニン、ポリ−Ｌ−プロパルギルグリシン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アリルグリシン、又は
ポリ−Ｌ−アリルグリシンが含まれ得る。
【００４８】 本発明のある態様は、前記化合物が、適切な模倣で置換された結合、ペプチド
骨格、又はアミノ酸成分を有するペプチド模倣体化合物である。適切なアミノ酸
模倣体であり得る天然でないアミノ酸の例には、Ｉ−アラニン、Ｌ−α−アミノ
酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン
酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、システイ
ン（アセトアミドメチル（ａｃｅｔａｍｉｎｄｏｍｅｔｈｙｌ））、Ｎ−ε−Ｂ
ｏｃ−Ｎ−α―ＣＢＺ−Ｌ−リシン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α―Ｆｍｏｃ−Ｌ−
リシン、Ｌ−メチオニンスルフォン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−
α−Ｂｏｃ−Ｎ−δＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ
−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒド
ロキシプロリン、Ｂｏｃ−Ｌ−チオプロリンが含まれる。（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ
， ｅｔ ａｌ．，１９９４：Ｐｉｎｉｌｌａ，ｅｔ ａｌ．１９９５）が含ま
れる。
【００４９】 別の態様では、前記化合物は、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）又はその断片で
あり得る。可溶性ＲＡＧＥは、細胞表面に存在せず、細胞膜に随伴しない。
【００５０】 前記患者は、哺乳類又は非哺乳類であり得る。前記患者は、ヒトであり得る。
前記患者は、マウス、ラット、ウシ、サル、ウマ、ブタ、又はイヌであり得る。
前記患者は、糖尿病患者であり得る。
【００５１】 前記化合物の投与は、病変内、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射；注入；リポソ
ームを介した送達；局所、鼻、口、肛門、眼、又は耳からの送達であり得る。前
記投与は、一定期間にわたる連続的な投与又は断続的且つ一定の間隔での投与で
あり得る。前記担体は、希釈剤、エアロゾル、局所担体、水溶液、非水溶液、又
は固体担体であり得る。
【００５２】 本発明の何れの方法の実施又は何れの薬学的組成物の調製においても、「治療
的有効量」とは、患者でＥＮ−ＲＡＧＥ／ＲＡＧＥの相互作用を防ぐことができ
る量である。従って、前記有効量は、治療を受けている患者、治療すべき症状に
応じて変わるであろう。本発明のために、投与方法には、皮膚、皮下、静脈内、
非経口、経口、局所、又はエアロゾルによる投与が含まれ得るが、これらに限定
されない。
【００５３】 本明細書において使用する「適切な薬学的に許容される担体」には、リン酸で
緩衝化した生理的食塩水溶液、水、油／水エマルジョン又はトリグリセリドエマ
ルジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、錠剤、被覆された錠剤
、及びカプセルのような標準的な薬学的に許容される任意の担体が包含される。
前記化合物の静脈内及び腹腔内投与に有用な許容されるトリグリセリドエマルジ
ョンの例は、商業的にＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）として知られるトリグ
リセリドエマルジョンである。
【００５４】 典型的には、このような担体は、デンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラ
チン、ステアリン酸、タルク、植物脂肪又は油、ゴム（ｇｕｍ）、グリコール、
又は他の公知の賦形剤のようなある種の賦形剤を含有する。このような担体は、
香料及び色素添加物又は他の成分も含み得る。
【００５５】 本発明は、適切な賦形剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び/又
は担体とともに、治療的有効量のポリペプチド組成物及び化合物を含む薬学的組
成物も提供する。このような組成物は、液体であるか、又は凍結乾燥され、若し
くはその他の方法で乾燥された製剤であり得、様々な緩衝成分（例えば、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨ、及びイオン強度の賦形剤、表面への吸収を
防ぐためのアルブミン又はゼラチンのような添加物、界面活性剤（例えば、Ｔｗ
ｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）、可
溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例え
ば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（チメロサール、ベン
ジルアルコール、パラベン）、充填剤又は張性制御剤（例えば、ラクトース、マ
ンニトール）、ポリエチレングリコールのようなポリマーの前記化合物への共有
結合、金属イオンとの錯化、又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ハイドロゲル等
のようなポリマー化合物の粒状調製物中又は粒状調製物上への、又はリポソーム
、ミクロエマルジョン、ミセル、単一膜層又は複数膜層の小胞、赤血球のゴース
ト、又はスフェロプラスト上への前記化合物の取り込みを含み得る。このような
組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、前記化合物又は組成物のインビボでの
放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を与えるであろう。組成物
の選択は、前記化合物の物理的及び化学的特性に依存するであろう。
【００５６】 制御又は維持された放出用の組成物には、親油性のデポ中（例えば、脂肪酸、
蝋、オイル）の製剤が含まれる。本発明には、ポリマー（例えば、ポロキサマー
又はポロキサミン）でコートされた粒状組成物及び組織特異的な受容体、リガン
ド、若しくは抗原に対して誘導された抗体に結合された、又は組織特異的な受容
体のリガンドに結合された化合物も含まれる。本発明の前記組成物の別の態様は
、粒状形態の保護用コーティング、プロテアーゼ阻害剤、又は非経口、肺、鼻、
及び経口を含む様々な投与経路のための透過増加剤を取り込む。
【００５７】 投与すると、化合物は、しばしば、循環から素早く消滅してしまい、それ故、
相対的に短い薬学的活性しか示さないことがある。従って、治療的効果を維持す
るためには、相対的に大用量の生物活性のある化合物を頻回投与することが必要
であり得る。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレ
ングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン、又はポリプロリンのような水溶性ポリ
マーの共有結合によって修飾された化合物は、対応する未修飾の化合物と比べて
、静注後に、かなり長い血中での半減期を示すことが知られている（Ａｂｕｃｈ
ｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１；Ｎｅｗｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９８
２； ａｎｄ Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。このような修飾は、水
溶液中での前記化合物の溶解度も増大させ、凝集をなくし、前記化合物の物理的
及び化学的安定性を増大させ、前記化合物の免疫原性及び反応性を大きく減少さ
せ得る。その結果、未修飾の化合物を用いたときと比べて、より少ない頻度又は
より少ない用量でこのようなポリマー化合物の付加物を投与することによって、
所望のインビボでの生物学的活性が達成され得る。
【００５８】 ＰＥＧは、哺乳類で極めて低い毒性を有するので（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９７１）、化合物へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付着は
特に有用である。例えば、アデノシンデアミナーゼのＰＥＧ付加物は、重症複合
免疫不全症を治療するためにヒトに使用することが米国で承認された。ＰＥＧの
抱合によってもたらされる第２の利点は、異種化合物の免疫原性と抗原性を効果
的に減少することである。例えば、ヒトのタンパク質のＰＥＧ付加物は、重篤な
免疫応答を引き起こすリスクなしに、他の哺乳類種の病気を治療するのに有用で
あり得る。本発明のポリペプチド又は組成物は、前記ポリペプチド又は前記ポリ
ペプチドを産生し得る細胞に対する宿主の免疫応答を減少又は阻害するために、
ミクロカプセル化装置に入れて送達され得る。本発明のポリペプチド又は組成物
は、リポソームのような膜にミクロカプセル化して送達してもよい。
【００５９】 ＰＥＧのようなポリマーは、アミノ末端アミノ酸のαアミノ基、リシン側鎖の
εアミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパラギン酸又はグルタミ
ン酸側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基、チロ
シン側鎖のようなタンパク質中の１以上の反応性アミノ酸残基に、又はある種の
アスパラギン、セリン、又はトレオニン残基に付着した糖鎖の活性化された誘導
体に、簡易に付着され得る。
【００６０】 これまで、タンパク質との直接的反応に適した多くの活性化された形態のＰＥ
Ｇが記載されてきた。タンパク質のアミノ基との反応に有用なＰＥＧ試薬は、カ
ルボン酸又はカルボネート誘導体の活性エステル、とりわけ脱離基がＮ−ヒドロ
キシスクインイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾール、または１−ヒドロ
キシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホネートであるものが含まれる。マレイミ
ド又はハロアセチル基を含有するＰＥＧ誘導体は、タンパク質の遊離スルフヒド
リル基を修飾するための有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジン又はヒド
ラジド基を含有するＰＥＧ試薬は、タンパク質中の炭水化物基の過ヨウ素酸酸化
によって生じたアルデヒドとの反応に有用である。
【００６１】 ＜担体との製薬＞ ある好ましい態様では、薬学的担体は液体であってよく、薬学的組成物は溶液
の形態であろう。同様に好ましい他の態様では、薬学的に許容される担体は固体
であり、組成物は粉末又は錠剤の形態である。さらなる態様では、薬学的な担体
はゲルであり、組成物は座剤又はクリームの形態である。さらなる態様では、前
記活性成分は、薬学的に許容される経皮貼付薬の一部として調剤してもよい。
【００６２】 固体担体は、香料、減摩剤、可溶化剤、懸濁剤、賦形剤、潤滑剤（ｇｌｉｄａ
ｎｔ）、圧縮補助剤、結合剤、又は錠剤崩壊剤としても作用し得る１以上の物質
を含むことができる。それは、カプセル化物質でもあり得る。粉末では、前記担
体は、細かく分割された活性成分と混合される細かく分割された固体である。錠
剤では、活性成分は、必要な圧縮特性を有する担体と適切な比率で混合され、所
望の形状及びサイズに圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは、９９％までの
活性成分を含有する。適切な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステア
リン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラ
チン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低溶融蝋、及びイオン交換樹脂が含
まれる。
【００６３】 液体担体は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤、及び加
圧された組成物を調製するのに使用される。活性成分は、水、有機溶媒、両者の
混合物、又は薬学的に許容される油若しくは脂肪のような薬学的に許容される液
体担体中に溶解、又は懸濁され得る。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、
防腐剤、甘味料、香料、懸濁剤、濃縮剤、着色料、粘度調整剤、安定化剤、又は
浸透圧調整剤のような他の適切な薬学的添加物を含有することができる。経口及
び非経口投与のための適切な液体担体の例には、水（上記の添加物、例えば、セ
ルロース誘導体、好ましくは、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を一
部含有する）、（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む
）アルコール、及びそれらの誘導体、並びに油（例えば、ヤシ油、及びラッカセ
イ油）が含まれる。非経口投与のためには、担体は、オレイン酸エチル及びミリ
スチン酸イソプロピルのような油状エステルでもあり得る。無菌液体担体は、非
経口投与用の無菌液体型組成物において有用である。加圧組成物用の液体担体は
、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容される圧縮不活性ガスであり得る。
【００６４】 無菌溶液又は懸濁液である液体薬学的組成物は、例えば、筋肉内、莢膜内、硬
膜外、腹腔内、又は皮下注射によって使用することができる。無菌溶液は、静脈
投与してもよい。前記活性成分は、無菌水、生理的食塩水、又は他の適切な無菌
の注射可能な溶媒を用いて、投与時に、溶解又は懸濁させ得る無菌固体組成物と
して調製し得る。担体は、必要な不活性結合剤、懸濁剤、減摩剤、香料、甘味料
、防腐剤、色素及びコーティングを含むことが予定されている。
【００６５】 本発明の前記活性成分（すなわち、前記スクリーニング法によって同定された
化合物又はその組成物）は、他の溶質又は懸濁剤、例えば、溶液を等張にするの
に十分な生理的食塩水又はグルコース、胆汁酸塩、アラビアゴム、ゼラチン、モ
ノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エス
テル、及びエチレンオキサイドと共重合したその無水物）等を含有する滅菌溶液
又は懸濁液の形態で経口投与できる。
【００６６】 前記活性成分は、液体又は固体組成物のうちの何れかの形態で、経口投与する
こともできる。経口投与に適した組成物は、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、及び
粉末のような固体形態、並びに溶液、シロップ、エリキシル、及び懸濁液のよう
な液体形態を含む。非経口投与に有用な形態には、無菌溶液、エマルジョン、及
び懸濁液が含まれる。
【００６７】 本発明の別の態様では、前記患者は糖尿病を有し得る。前記患者は、糖尿病に
伴う合併症を示してもよい。このような合併症の幾つかの例には、内皮及びマク
ロファージＡＧＥ受容体の活性化、変化したリポタンパク質、マトリックス、及
び基底膜タンパク質；血管平滑筋の変化した収縮及びホルモン応答性；変化した
内皮細胞の透過性；ソルビトールの蓄積；神経のミオイノーシトールの枯渇、又
は変化したＮａ−Ｋ ＡＴＰａｓｅ活性を含む。このような合併症は、「Ｐｏｒ
ｔｅ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ：Ｗｈｙ ｉｓ Ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ Ｔｏｘｉｃ？
，Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２７２，ｐａｇｅｓ ６９９−７００」の最新版
で考察されている。
【００６８】 本発明は、遅延型過敏症、炎症性大腸炎、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、
アテローム性動脈硬化症のような慢性の炎症性疾患、アルツハイマー病、糖尿病
、及び腎不全でのＥＮＲＡＧＥ／ＲＡＧＥ相互作用を妨害することによって、患
者の炎症を抑制する方法を提供する。
【００６９】 本発明は、ＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥの相互作用を通じて転写因子を活性化す
る方法を提供する。ある態様では、前記転写因子はＮＦ−κＢである。別の態様
では、前記転写因子はＩＬ−１βである。別の態様では、前記転写因子はＴＮＦ
−αである。別の態様では、前記転写因子はＩＬ−２である。
【００７０】 本発明は、ＥＮ−ＲＡＧＥ又はＥＮ−ＲＡＧＥ様分子とのＲＡＧＥの相互作用
を通じて、免疫反応に対して中心的な細胞を活性化する方法を提供する。
【００７１】 本発明は、細胞骨格や細胞の形状、シグナル伝達、並びに化学走性、食作用、
脱顆粒、及び反応性酸素種（ＲＯＩ）の生成を含む食作用機能の調節を変化させ
る方法を提供する。
【００７２】 本発明は、ＲＡＧＥとアミロイドβペプチドとの相互作用を阻害することによ
り、アルツハイマー病を治療する方法を提供する。
【００７３】 本発明は、慢性的な細胞の活性化を阻害する方法であって、慢性的な細胞の活
性化を患う患者に、ＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥとの相互作用を阻害し得る物質を
投与することを備えた方法を提供する。ある態様では、前記物質は、可溶性ＲＡ
ＧＥ、抗ＲＡＧＥ抗体、抗ＥＮ−ＲＡＧＥ抗体、又はＦ（ａｂ’）断片のような
何れかの抗体の断片である。
【００７４】 本発明は、炎症に起因する組織の傷害を阻害する方法であって、慢性的な細胞
の活性化を患う患者に、ＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥとの相互作用を阻害し得る物
質を投与することを備えた方法を提供する。
【００７５】 本発明は、患者の炎症を阻害する方法であって、ＲＡＧＥとＥＮ−ＲＡＧＥと
の相互作用を阻害するのに十分な量の、前記患者におけるＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡ
ＧＥとの相互作用を阻害し得る物質を、炎症を患う患者に投与することにより、
前記患者の炎症を阻害することを備えた方法を提供する。ある態様では、前記物
質は、可溶性ＲＡＧＥ、抗ＲＡＧＥ抗体、抗ＥＮ−ＲＡＧＥ抗体、又はＦ（ａｂ
’）断片のような何れかの抗体の断片である。
【００７６】 患者における細胞の活性化のレベルは、多くの方法で測定することができ、こ
のような方法は、当業者に公知であろう。例えば、インターロイキン−１β、Ｔ
ＮＦ−α、及び炎症反応の存在の指標となることが知られている他のサイトカイ
ンのような活性化の指標となるある種の分子のレベルを測定することができる。
【００７７】 本発明は、患者の大腸炎を治療する方法であって、前記患者におけるＲＡＧＥ
とＥＮ−ＲＡＧＥとの相互作用を阻害できる物質を患者に投与して、慢性的な炎
症を減少させることにより、前記患者の大腸炎を治療することを備えた方法を提
供する。
【００７８】 本発明は、患者の炎症を阻害する方法であって、患者におけるＲＡＧＥとＥＮ
−ＲＡＧＥとの相互作用を阻害できる少なくとも１つの物質を投与することによ
り、前記患者の炎症を阻害することを備えた方法を提供する。ある態様では、抗
ＲＡＧＥ抗体と抗ＥＮ−ＲＡＧＥ抗体の両者が投与される。
【００７９】 本発明は、以下の実験の詳細の部で説明される。これらの部は、本発明の理解
を助けるために記載されたものであり、いかなる意味においても、さらにその後
に存在する特許請求の範囲に記載された本発明を限定することを意図したもので
はなく、またそのように解してはならない。
【００８０】
【実験の詳細】
実験＃１ 本発明は、（カルグラニュリン分子のファミリーと幾らかの配列類似性を有す
る）新規炎症誘発性サイトカイン様分子（ＥＮ−ＲＡＧＥ）を提供する。ＥＮ−
ＲＡＧＥは、（好中球のような）炎症細胞の内部に存在するタンパク質であり、
このような炎症細胞によって放出され得る。ＥＮ−ＲＡＧＥは、細胞性受容体Ｒ
ＡＧＥと相互作用することによって、炎症反応の伝播と維持に必要であり得る生
物学的活性を有する。
【００８１】 例１：ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）とのＥＮ−ＲＡＧＥ（細胞外新規Ｒａｇｅ結
合タンパク質）の相互作用は、炎症反応を永続させる：可溶性ＡＧＥ受容体（ｓ
ＲＡＧＥ）による遅延型過敏症反応の抑制 ＲＡＧＥ（ｔｈｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃ
ａｔｉｏｎ Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）の発現は、炎症の状態下で増加する。こ
こで、我々は、内皮細胞のような細胞上のＲＡＧＥと相互作用して、擾乱と関連
した態様で、細胞の特性を変化させるＥＮ−ＲＡＧＥ（すなわち、Ｅｘｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｎｏｖｅｌ ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（細
胞外新規ＲＡＧＥ結合タンパク質））と称される、カルグラニュリンファミリー
の炎症誘発性サイトカインの新規メンバーを報告する。可溶性ＲＡＧＥ（ＲＡＧ
Ｅの細胞外リガンド結合ドメイン；ｓＲＡＧＥ）又は抗ＲＡＧＥ若しくは抗ＥＮ
−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２断片の投与は、遅延型過敏症のモデルで、炎症を顕
著に減弱させた。これらのデータは、ＲＡＧＥを炎症反応と関連付け、ＥＮ−Ｒ
ＡＧＥとＲＡＧＥとを抗炎症性介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の新しい標的
として同定する。このように、可溶性ＲＡＧＥは、さらに、新しいクラスの抗炎
症剤をデザインするための典型的な構造である。
【００８２】 ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）は、細胞表面分子の免疫グロブリンスーパーファミ
リーのメンバーである（１−２）。まず、グルコース（アルドース糖）修飾され
たタンパク質、すなわち後生的糖化最終産物（Ａｇｅｓ）に対する細胞の受容体
として同定され、性質決定された後（３−１３）、ＲＡＧＥは、正常な発育状態
下とアルツハイマー病下の両者で、他のリガンドと相互作用することが報告され
た（１４−１６）。正常な発育において、ＲＡＧＥは、培養胚性ニューロンの神
経突起の成長を媒介するポリペプチドであるアムホテリン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉ
ｎ）と相互作用する。それらの研究では、抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２断片又は
可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）は何れも、アムホテリンがコートされたマトリッ
クス上の神経突起の成長を阻害したが、ラミニン、又はポリ−ｌ−リシンのよう
な他の基材がコートされたマトリックス上の神経突起の成長は阻害しなかった（
３）。後の研究で、ＲＡＧＥは、アルツハイマー病における神経細胞毒性と神経
の死滅の発症と関連するポリペプチドであるアミロイド−β−ペプチドに対する
ニューロンとミクログリア上の受容体として同定された。
【００８３】 我々の研究室で得られた未発表の観察で、我々は、増加したＲＡＧＥの発現は
、活性型ループス腎炎患者からの腎臓組織中のような炎症性の病変の血管及び炎
症細胞中に見られることを見出した（図１）。それ故、我々は、その状態下では
、おそらく炎症反応に参加するために、ＲＡＧＥは別のリガンドと相互作用する
のかもしれないという仮説を立てた。
【００８４】 ここでは、この発見が、ＲＡＧＥは、カルグラニュリンＣと密接な相同性を有
する分子と相互作用することを実証する。我々は、この分子をＥＮ−ＲＡＧＥ（ Ｅ ｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｏｖｅｌ ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ）と名付け、ＥＮ−ＲＡＧＥ：ＲＡＧＥ相互作用が、炎症反応と重要な
関わりを有する内皮細胞のような細胞を活性化することを示す。マウスの遅延型
過敏症のモデルでは、リガンド相互作用ドメインを含有する可溶性ＲＡＧＥ（ｓ
ＲＡＧＥ）の投与は、細胞の活性化と炎症の進行を阻害する。これらの発見は、
ＲＡＧＥを抗炎症性介入の新しい標的として同定する。
【００８５】 ＜物質と方法＞ ＥＮ−ＲＡＧＥの単離と精製 ウシの肺のアセトン粉末（ＳＩＧＭＡ（登録商標））を、ｔｒｉｓ（０．０２
Ｍ、ｐＨ７．４）；ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）；オクチル−β−グルコシド（１％
）；及びプロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦとアプロチニン）を含有する緩衝液中で
の可溶化に供した。ＳＰセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ（登録商標
））、及び（バキュロウイルス発現系から調製された）精製された可溶性ヒトＲ
ＡＧＥを吸着したａｆｆｉゲル１０レジン（ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標））への
連続的なクロマトグラフィー後に、固定化されたカラム画分（Ｎｕｎｃ Ｍａｘ
ｉｓｏｒｐ ｄｉｓｈｅｓ）（ＮＵＮＣ（登録商標））と上記のように１２５Ｉ
標識したｓＲＡＧＥを用いたスクリーニングアッセイに基づいてＲＡＧＥ結合タ
ンパク質を同定した。ヘパリン含有緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ）で溶出した後、陽性
画分が同定された。ＲＡＧＥ結合タンパク質を配列分析に供した。
【００８６】 ＥＮ−ＲＡＧＥのクローニング： ウシ肺のライブラリーからＥＮ−ＲＡＧＥ
のｃＤＮＡをクローニングし、バキュロウイルス発現系に配置した。この系では
、リーダー配列を欠くＥＮ−ＲＡＧＥは、Ｓｆ９細胞中で合成された。続いて、
界面活性剤を含有する緩衝液中での細胞の可溶化、及びヒドロキシルアパタイト
とヘパリン含有レジン上での連続精製後に、ＥＮ−ＲＡＧＥが精製された。最終
産物は、クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で単一のバンドを示し、Ｄ
ｅｔｏｘｉゲルカラム（ＰＩＥＲＣＥ（登録商標））上でのクロマトグラフィー
後には、エンドトキシンが全くなかった。検出可能なエンドトキシンが存在しな
いことは、カブトガニアメーバ様細胞アッセイ（ＳＩＧＭＡ（登録商標））を用
いて確認した。
【００８７】 配列分析： ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、ＲＡＧＥ結合活性を有する約１２ｋＤａ
のポリペプチドが同定され、ゲルのバンドは、以前公表した方法（１７）に従っ
て溶出した。タンパク質が確実にフィルターから完全に洗浄されるようにするた
めに、２つの一定分量（各０．１ｍＬ）のグアニジン（５．０Ｍ）、尿素（５．
０Ｍ）、トリフルオロ酢酸（０．２％）、アセトニトリル（１０％）、及びＺｗ
ｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−０８（１．０％）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の最終洗
浄を添加することによって、前記公表した方法を改変した。アミノ末端配列の分
析を行った。自動化されたエドマン分解は、ＨＰ−Ｇ１００５Ａ配列決定機（Ｈ
ｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ）を用いて行った。内部の配列を得る目的で、抽出緩衝液が通常の半分の量の
ＳＤＳを含有すること以外は（１）上述のように、溶出のためにゲルのバンドを
処理した。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（１μｇ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、サンプルを一晩インキュベートした。続いて、１
ｍｍ×５０ｍｍのＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｌｔｄ．）上のｍｉｃｒｏｂｏｒｅ ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏ
ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）によって、消化物を分画した。用いたグラジエントは、ト
リフルオロ酢酸（０．１％）中のアセトニトリル（５〜７５％）から１分毎に２
％であり、画分は３０秒間隔で集めた。２１４ｎｍで吸光度をモニターし、続い
て、クロマトグラフィーのピークに相当する画分を配列分析にかけた。
【００８８】 内皮細胞の活性化： ヒトの臍静脈の内皮細胞を単離し、性質決定し、以前記
載したように培養した（１８）。内皮細胞増殖因子が加えられていない無血清Ｒ
ＰＭＩ１６４０中で細胞を２４時間培養した後、表記の濃度のＥＮ−ＲＡＧＥで
細胞を刺激した。表記されている場合には、ウサギの抗ヒトＲＡＧＥ ＩｇＧ；
非免疫ウサギＩｇＧで細胞を前処理し、あるケースでは、ＥＮ−ＲＡＧＥでの刺
激に先立って、表記の濃度の可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）で、ＥＮ−ＲＡＧＥ
を２時間前処理した。ＥＮ−ＲＡＧＥでの刺激から８時間後に、パラホルムアル
デヒド（２％）で３０分間細胞を固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞表面上の非
特異的結合部位をブロックするために無脂肪ドライミルク（５％）とＢＳＡ（２
．５％）を含有するＰＢＳで処理した。抗ＶＣＡＭ−１ ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を
用いた細胞表面ＥＬＩＳＡを行った。機能的なＶＣＡＭ−１活性の評価は、以前
記載したように（１０）、５１Ｃｒ標識したＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ）を用
いて決定した。
【００８９】 遅延型過敏症モデル； 遅延型過敏症のマウスモデルは、以前公表した研究（
１９）に基づいて確立した。左鼠頚部のリンパ節に、メチル化されたＢＳＡ（ｍ
ＢＳＡ；２５ｍｇ／ｍＬ；ＳＩＧＭＡ（登録商標））、ＮａＣｌ（０．９％）、
デキストラン（５−４０×１０６ＭＷ；５０ｍｇ／ｍＬ；ＳＩＧＭＡ（登録商標
））、及びフロイントの不完全アジュバント（５０％；ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ）を含有するエマルジョン（０．１ｍＬ）を皮下注射することによって、
６週齢の雌のＣＦ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）を感作した。３週間後、左後足の裏に、ｍＢＳＡ（０．４ｍｇ／ｍＬ
；０．０５０ｍＬ）を皮下注射した。表記されている場合には、ｍＢＳＡによる
局所攻撃誘発の２４及び１２時間前、並びに６及び１２時間後に、ｓＲＡＧＥ（
表記の用量）、マウス血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ（登録商標））、免疫又は非
免疫Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｐｉｅｒｃｅのキットを用いて調製）を腹腔内注射す
ることによって、マウスを前処理した。足底部（ｆｏｏｔ ｐａｄ）にｍＢＳＡ
を注射してから２４時間後に、足底部の臨床スコアを実施した。続いて、マウス
を人道的に屠殺し、足をホルマリン（１０％）で固定するか、又は、さらなる分
析のために凍結した。ヘマトキシリンとエオシン（ＳＩＧＭＡ（登録商標））で
染色した足の切片に対して組織学的なスコアを実施した。臨床スコアは、以下の
ように（スケール；１〜５）に定義した：１＝炎症がなく、このため、未処置の
足と同じ；２＝僅かな発赤と浮腫；３＝足底部の肌のしわを伴う重篤な発赤と浮
腫；４＝足底部の肌のしわを伴わない重篤な発赤と浮腫；５＝足指の広がりをも
たらす重篤な発赤と浮腫。ヘマトキシリンとエオシン染色後の組織学的スコアは
、以下のように（スケール；１〜５）に定義した：１＝僅かな皮下の浮腫を伴う
が白血球の浸潤はない；２＝僅かな皮下の浮腫を伴う血管周囲への僅かな白血球
の浸潤；３＝肉芽腫（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔａ）を伴わない重篤な白血球の浸潤
；及び４＝肉芽腫を伴う重篤な白血球の浸潤。
【００９０】 ＜結果＞ ＥＮ−ＲＡＧＥの同定： ウシの肺抽出物から（ＲＡＧＥは、最初、ここから
精製された）のＲＡＧＥ結合タンパク質を同定するためにデザインされた一連の
実験の後に、約１２ｋＤａのポリペプチドを同定した。配列分析時に、このポリ
ペプチドは、カルグラニュリンＣファミリーのタンパク質のメンバーとかなりの
相同性を有することが分かった（表１）（２０−２１）。このクラスのタンパク
質は、炎症細胞内部で細胞内に存在している。炎症部位で放出されると、我々は
、それらが、続いて、既に炎症反応に召集されている他の細胞を引きつけて、活
性化することができるかもしれないと推測した。このため、このことは、炎症反
応を伝播し、維持することにより、細胞の傷害の確率を増加させる重要な手段を
意味するかもしれない。
【００９１】 ＥＮ−ＲＡＧＥは、ＲＡＧＥ依存的に、内皮細胞を活性化する： この仮定を
テストするために、上述のようにＥＮ−ＲＡＧＥを精製し、内皮細胞と共にイン
キュベートした。ＥＮ−ＲＡＧＥをＹＵＶＥＣとインキュベートすると、ＲＡＧ
Ｅ依存的に細胞表面の血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）の増加がもたらされた
（図２）。これらのデータは、炎症の中心部で、ＥＮ−ＲＡＧＥのＥＣ−ＲＡＧ
Ｅとの相互作用が、さらに炎症反応を伝播するための手段であることを意味する
かもしれないということを示唆していた。ＥＮ−ＲＡＧＥ処理したＥＣの表面上
にＶＣＡＭ−１抗原が増加するのと一致して、続いて、（ＶＣＡＭ−１に対する
リガンド、ＶＬＡ−４を有する）Ｍｏｌｔ−４細胞への結合の増加が起こった（
図３）。ＢＳＡ又は非免疫ＩｇＧのうちの何れかとのインキュベーションは、Ｅ
Ｎ−ＲＡＧＥがＥＣ ＶＣＡＭ−１を活性化する能力に影響を与えなかったが、
ｓＲＡＧＥ又は抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＮ−ＲＡＧＥが被処理ＨＵＶ
ＥＣへのＭｏｌｔ−４の結合を増加する能力を著しく減弱せしめた。
【００９２】 我々は、インビボモデルで、これらの仮定をテストしようとした。我々は、Ｒ
ＡＧＥのリガンドが、少なくとも部分的に、タンパク質／脂質の糖化／酸化の産
物、後生的糖化最終産物、すなわちＡＧＥであると思われる糖尿病マウスにおい
て、ＲＡＧＥの可溶性、リガンド結合部分（可溶性又はｓＲＡＧＥ）の投与が、
糖尿病の無アポリポタンパク質Ｅマウスでのアテローム性動脈硬化症の加速（１
２）を抑制し、遺伝的に糖尿病のｄｂ＋／ｄｂ＋マウス（２２）での創傷治癒を
改善することを実証した。このように、肉芽腫性炎症病変（遅延型過敏症）のモ
デルによって特定された効果のような、高度な炎症の中心部でのＥＮ−ＲＡＧＥ
の生物学的効果が、ｓＲＡＧＥの存在下で抑制され得るかもしれない。
【００９３】 このことをテストするために、我々は、まず、雌のＣＦ−１マウスの鼠頚部の
リンパ節にメチル化されたＢＳＡ（ｍＢＳＡ；ＲＡＧＥを結合しない）を注射す
ることによってマウスを感作した遅延型過敏症（ＤＨ）のモデルを研究した。感
作から３週間後に、後足底部中にｍＢＳＡを注射することによって、マウスを攻
撃誘発した。図４に示されているように、臨床スコア（１〜４）と組織学的スコ
ア（１〜５）の両者を含む１〜９のスケールで、炎症スコアをデザインした。
【００９４】 我々の仮定どおり、予めｍＢＳＡでリンパ節を感作したマウスの足底部にｍＢ
ＳＡを注射すると、ｓＲＡＧＥの投与によって、炎症が用量依存的に抑制された
（図４）。１００μｇの用量のｓＲＡＧＥで、炎症は、顕著に抑制された（ｐ＜
０．０１）。対照的に、マウス血清アルブミンの投与は、炎症性病変の出現に全
く影響がなかった（図４）。このモデルでの炎症の進行におけるＥＮ−ＲＡＧＥ
とＲＡＧＥの重要な役割と合致して、抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２又は抗
ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の何れかでマウスを処置すると、炎症がかなり抑制さ
れた（各ケースで、非免疫Ｆ（ａｂ’）２での処置と比べて、ｐ＜０．０５）。
抗ＥＮ−ＲＡＧＥと抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の両者でマウスを処置すると、
免疫反応のさらなる抑制がもたらされた（非免疫Ｆ（ａｂ’）２での処置に比べ
てｐ＜０．０５）（図４）。
【００９５】 ＜考察＞ 遅延型過敏症反応で観察される炎症の表現型は、確実に、多数の細胞種とそれ
らの細胞媒介物質の複雑な相互作用と寄与の頂点を表している。炎症の進行では
、重要な刺激源は、炎症細胞自体に由来し得る。最初、炎症部位に召集されると
、好中球及びマクロファージのような細胞は、ＥＮ−ＲＡＧＥを含むカルグラニ
ュリンファミリーの媒介物質の如き媒介物質を放出し、炎症反応を伝播し、維持
するかもしれない。ＥＮ−ＲＡＧＥの如きこのような媒介物質は、遺伝子発現の
変化に達するであろう現象を開始するために、細胞の受容体を必要とすると思わ
れる。
【００９６】 我々のデータは、ＥＮ−ＲＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用がこれらの過程での重要
な要素であることを強く示唆する。ｓＲＡＧＥの存在下で、用量依存的に、ほぼ
完全な炎症の抑制が見られた。我々の研究に基づけば、ｓＲＡＧＥは、この状態
では、炎症反応に関与すると想定されているＲＡＧＥを有する細胞を引きつける
その能力に先だって、ＥＮ−ＲＡＧＥを結合するためのおとりとして作用するの
かもしれない。さらに、抗ＲＡＧＥ／抗ＥＮ−ＲＡＧＥ又は抗ＲＡＧＥ＋抗ＥＮ
−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の存在下では、かなりの炎症の抑制が観察され、炎
症反応の調節におけるこれらの因子の役割をさらに示している。
【００９７】 もちろん、ｓＲＡＧＥの有益な効果の下にある別の機序が、これらの状態で作
動しているかもしれないということに留意することは重要である。しかしながら
、表記のＦ（ａｂ’）２断片を用いた上記研究は、この状態での免疫反応の進展
にＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥが関与していることを強く示している。
【００９８】 結論的には、ここで記載した研究は、ＲＡＧＥが炎症反応で中心的な関与をし
ていることを示しており、可溶性ＲＡＧＥを新規抗炎症剤の開発のための典型的
な構造として同定している。
【００９９】 注：図５は、ウシＥＮ−ＲＡＧＥの核酸配列（ｃＤＮＡ３０配列）を示している
。
【０１００】
【表１】 例２：ＥＮ−ＲＡＧＥ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｏｖｅｌ−ＲＡＧＥ
Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は内皮細胞を活性化して炎症反応を媒介し
た ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）の発現は、アテローム性動脈硬化症と自己免疫性血
管炎のような炎症状態で増大する。我々は、ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）は、この
ような状態で後生的糖化最終産物（ＡＧＥ）のほかに別のリガンドと相互作用し
ているかもしれないという仮説を立てた。我々は、炎症誘導性媒介物質のカルグ
ラニュリンファミリーと相同性を有する約１２ｋＤａのポリペプチドをウシの肺
の抽出物から単離し、精製した。ＥＮ−ＲＡＧＥと呼ばれるこのポリペプチドは
、培養ウェルにおいて、約７５ｎＭのＫｄで、固定化されたＲＡＧＥと内皮（Ｅ
Ｃ）／マクロファージ（ＭＰ）ＲＡＧＥを結合し、このプロセスは、抗ＲＡＧＥ
ＩｇＧ又は可溶性（ｓＲＡＧＥ；ＲＡＧＥの細胞外部分の２／３）の存在下で
ブロックされた。インビトロでは、培養したＥＣのＥＮ−ＲＡＧＥへの暴露は、
ＮＦ−κＢの活性化、細胞表面のＶＣＡＭ−１の発現（ウシ血清アルブミンＢＳ
Ａによる処理と比べて４．３倍）、及びＭｏｌｔ−４細胞（ＶＣＡＭ−１の対リ
ガンドであるＶＬＡ−４を有する）（ＢＳＡと比較して７倍）の接着を増加し、
全て、ある程度は、抗ＲＡＧＥ ＩｇＧ又はｓＲＡＧＥの存在下で阻害された。
マクロファージのＥＮ−ＲＡＧＥへの暴露は、ＲＡＧＥ依存的に、化学走性の増
加をもたらした。これらの概念をインビボでテストするために、我々は、メチル
化されたＢＳＡ（ｍＢＳＡ）の足底部への注射が局所的な炎症を誘導するマウス
での遅延型過敏症のモデルを使用した。ｓＲＡＧＥよる前処理（腹腔内；ＩＰ）
は、ｍＢＳＡを介した炎症を用量依存的に抑制した。１００μｇのＩＰ ｓＲＡ
ＧＥでは、ｍＢＳＡ処置した足には炎症がみられず、ビークル、マウス血清アル
ブミン（ＭＳＡ）で処置したマウスと比べて、ＮＦ−κＢの活性化が顕著に減弱
していた。さらに、血清中へのＴＮＦαの生成が完全に阻害されていた。抗ＲＡ
ＧＥ又は抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の何れかでマウスを処置すると、部
分的な抗炎症反応が観察された。非免疫Ｆ（ａｂ’）２は、効果がなかった。総
合すると、これらの発見は、ＥＮ−ＲＡＧＥのようなＡＧＥの代わりとなるリガ
ンドがＥＣとＭＰを活性化することにより、ＲＡＧＥを、全身化した免疫反応と
関連付けることを示している。
【０１０１】 例３：ｓＲＡＧＥは、内毒素血症後の死亡率を減少させた：敗血性ショックの
治療の可能性 ｓＲＡＧＥ又はＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥの相互作用を阻害できる化合物の使
用は、患者の敗血性ショック又は敗血症の治療に対する有用な物質となり得る。
ｓＲＡＧＥの存在下でＬＰＳを与えると、致死量のＬＰＳを与えた検体の死亡率
が減少することが示された。
【０１０２】 ｓＲＡＧＥと内毒素血症： 可溶性ＡＧＥ受容体（ｓＲＡＧＥ）は、遅延型過敏症のモデルで炎症を阻止す
ることが示された。ある種の抗炎症型の物質とは異なり、ｓＲＡＧＥは、例えば
、激しいグラム陰性細菌血症の典型的な結果である内毒素血症の状態で投与する
と、有益な効果を示し得ると考えられた。
【０１０３】 Ｂａｌｂ／Ｃマウスに対して、一様に致死量のＬＰＳ（約７５０μｇ）を投与
すると、ｓＲＡＧＥの投与（ＬＰＳ注射前又は後）は、試験的研究で、約５０％
のマウスの死を防いだ。
【０１０４】 これらのデータは、ｓＲＡＧＥの強力な抗炎症効果は、敗血症／内毒素血症の
存在による罹患率／死亡率への不利な傾向を伴わないという主張を強調する。Ｓ
ＲＡＧＥは、それ故、順応性のない炎症反応に対する選択的な防御効果を有する
選択的抗炎症剤となり得る。
【０１０５】 例４ 我々は、ウシコラーゲンIIを用いた感作によって、ｄｂａマウスに関節炎を誘
導した。可溶性ＲＡＧＥ、マウス、１００μｇ／日、腹腔内で、あるマウス（２
０）を処置した。ビークル処置として、他のマウス（２０）をマウス血清アルブ
ミンで処置した。半分のマウスを６週後に屠殺し、残りの半分を９週後に屠殺し
た。
【０１０６】 データは以下のとおりである： １．我々は、ｓＲＡＧＥ対アルブミン処置マウスについて、関節の膨張を測定
した。関節の膨張は、ｓＲＡＧＥ処置マウスに対してアルブミン処置マウスで、
２倍増加していた、両時点で＜０．０５． ２．９週の時点で、アルブミン処置したマウスでの腫瘍壊死因子αの血漿レベ
ルは、ｓＲＡＧＥ処置したマウスに対して３倍高かった（ｐ＜０．０５）。
【０１０７】 ３．ウシコラーゲンIIの耳への局所的な注射は、アルブミン処置したマウスの
耳の厚さに２倍の増加をもたらした；ｓＲＡＧＥ処置したマウスでは、ベースラ
インからの変化は全く見られなかった（ｐ＜０．０５）。
【０１０８】 ４．末梢血での単球のレベルは、アルブミン処置したマウスに対してｓＲＡＧ
Ｅ処置したマウスで２．５倍低く（ｐ＜０．０５）、炎症の減少を示唆している
。
【０１０９】 懸案中の研究：関節の病理とレントゲン写真による研究
【０１１０】
【参照文献】 実験＃２ Ｒａｇｅは新規炎症誘導性の軸：Ｓ１００／カルグラニュリンポリペプチドに対
する細胞表面受容体を媒介する Ｓ１００／カルグラニュリンポリペプチドは、炎症部位に存在し、幅広い環境
的なきっかけによって、炎症細胞により、このような部位に標的化されて放出さ
れると思われる。我々は、ここに、ＡＧＥ受容体（ＲＡＧＥ）がＥＮ−ＲＡＧＥ
（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｏｖｅｌ ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）に対する細胞表面の受容体であり、Ｓ１００／カルグラニュリンス
ーパーファミリーの同族のメンバーであることを報告する。内皮細胞、単核食細
胞、及びリンパ球上の細胞性ＲＡＧＥとのＥＮ−ＲＡＧＥの相互作用は、細胞の
活性化を引き起こし、中心的な炎症誘導性媒介物質を生成する。中心のシグナリ
ング経路と炎症性遺伝子発現の活性化を停止することによって、ＥＮ−ＲＡＧＥ
／ＲＡＧＥのブロックは、マウスモデルで遅延型の過敏症と炎症性腸炎を和らげ
る。これらのデータは、炎症における新しいパラダイムに光を当て、慢性的な細
胞の活性化と組織の傷害におけるＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥの新しい役割を同定
する。
【０１１１】 細胞表面分子の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである後生的糖
化最終産物の受容体は（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｎｅｅｐｅ
ｒ， ｅｔ ａｌ．，１９９２）、別個のリガンドと相互作用する。ＲＡＧＥは
、まず、糖尿病や腎不全のような疾患で蓄積する糖酸化（ｇｌｙｃｏｘｉｄａｔ
ｉｏｎ）の産物である後生的糖化最終産物（ＡＧＥ）の細胞性受容体として記載
されたが（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｅｌｌ ａｎｄ Ｍ
ｏｎｎｉｅｒ，１９８９；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｉｙａｔａ
ｅｔ ａｌ．，１９９６ａ，ｂ）、最近のデータは、ホメオスタシスと病態生
理学的に重要な状態の両者における、様々な状態で、ＲＡＧＥの重要な役割が明
らかとなってきていることを示している（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５；
Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
【０１１２】 １つの受容体が１つのリガンドと相互作用するという概念に挑む明らかになり
つつあるパラダイムと合致して、我々は、以前、ＲＡＧＥが、炎症誘導性サイト
カインのＳ１００／カルグラニュリンスーパーファミリーのメンバーである（Ｚ
ｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓｃｈａｆｅｒ ａｎｄ Ｈｅｉｎｚｍ
ａｎｎ，１９９６）１２ｋＤａのポリペプチドを結合することに気付いた（Ｈｏ
ｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。多形核白血球、末梢血由来の単核食細胞、及
びリンパ球のような活性化された炎症細胞から放出されると思われるこのような
分子は、伝統的には、炎症性結膜炎（Ｇｏｔｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７
；Ｇｏｔｔｓｃｈ ａｎｄ Ｌｉｕ，１９９８）、乾癬性皮膚疾患（Ｍａｄｓｏ
ｎ，１９９１）、嚢胞性繊維症（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８
）、炎症性腸疾患（Ｌｕｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓｃｈｍｉｄ
ｅｔ ａｌ．，１９９５）、慢性関節リウマチ（Ｏｄｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，
１９８７）、及び慢性寄生生物感染症（Ｍａｒｔｉ ｅｔ ａｌ，１９９６）の
ような慢性的な炎症を特徴とする状態で蓄積するものとして記載されてきた。し
かしながら、今日まで、Ｓ１００／カルグラニュリンファミリー中のポリペプチ
ドが炎症プロセスの方向を潜在的に調節する具体的な手段は、明らかにはされて
いなかった。我々は、ここに、ＥＮ−ＲＡＧＥ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎ ｏｖｅｌ ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と名付けられた１２
ｋＤａのポリペプチドの性質決定を報告する。ＥＮ−ＲＡＧＥ及びＥＮ−ＲＡＧ
Ｅ様分子による細胞性ＲＡＧＥの連結は、炎症性の表現型の進行に中心的な役割
を果たす細胞である内皮細胞、マクロファージ、及びリンパ球の活性化を媒介す
る。ＥＮ−ＲＡＧＥ−ＲＡＧＥの相互作用が、炎症を増幅する現象のカスケード
において極めて重要な、基部に近い工程であるという考えと一致して、遅延型過
敏症と慢性的炎症性腸疾患のマウスモデルに可溶性ＲＡＧＥ又は抗ＲＡＧＥ／抗
ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の何れかを投与すると、ＮＦ−κＢと炎症性媒
介物質の活性化を抑制しながら、炎症の進行を抑制する。
【０１１３】 このため、我々のデータは、炎症反応でのＥＮ−ＲＡＧＥとＥＮ−ＲＡＧＥ様
分子の発病における重要な役割を初めて立証する。自己免疫性の、物理的な、又
は感染を介した傷害の部位へ炎症細胞が召集されると、例えば、我々は、これら
の分子の放出と、引き続き起こるそれらの細胞性ＲＡＧＥとの相互作用は、強力
な一連の悪化する炎症誘導性の現象を伝播するかもしれないと仮定する。このよ
うに、これらのデータは、炎症における新しいパラダイムに光を当て、慢性的な
細胞の活性化と組織の傷害におけるＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥの新しい役割を同
定する。
【０１１４】 ＜実験の手順＞ １．タンパク質の配列分析 配列分析を行うために、以前記載したように（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９
９５）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからバンド（約１２ｋＤａ）を溶出した。自動化
されたエドマン分解は、ＨＰ−Ｇ１００５Ａ配列決定機（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａ
ｃｋａｒｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｐａｌｏ Ａ
ｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行った。内部の配列決定は、記載したように、エンドプ
ロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）消化後に
、ミクロボアＨＰＬＣを用いて行った（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【０１１５】 ２．分子クローニング ウシ及びヒトのＥＮ−ＲＡＧＥのｃＤＮＡを得るために、製造者の指示書に従
って、ウシ肺ライブラリーとヒト肺ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、分子クローニングを行った。ウシのＥＮ−ＲＡＧ
ＥのｃＤＮＡをコードする配列は、＃ＡＦ ０１１７５７（Ｇｅｎｂａｎｋ）で
ある。
【０１１６】 ３．タンパク質発現 ＥＮ−ＲＡＧＥをコードするｃＤＮＡをバキュロウイルス発現系に配置し、Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ９（Ｓｆ９）細胞（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で発現させた。ＥＮ−ＲＡＧＥは、ヘパ
リンとヒドロキシルアパタイトカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上での連続的なクロマトグラフィーによって
細胞の沈降物から精製し、徐々に増加する濃度のＮａＣｌで溶出した。クマシー
染色したゲル上で単一のバンドであり、約１２ｋＤａの分子量の精製したＥＮ−
ＲＡＧＥは、Ｄｅｔｏｘ−ｉｇｅｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ）でのクロマトグラフィーによる実験の前に、エンド
トキシンが存在しなかった。エンドトキシンが存在しないことは、Ｓｉｇｍａ（
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のキット（ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ａ
ｓｓａｙ）を用いて立証した。表記されている場合には、ヒトの脳から精製した
Ｓ１００Ｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた。
【０１１７】 ４．イムノブロッティング インビトロでの研究： Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ）を使用
することによって、正常なボランティアからヒトの末梢血由来の単核細胞を単離
し、Ａｍｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ社（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
からＪｕｒｋａｔＥ６細胞を取得した。表記されている場合には、ＰＭＡ（１０
ｎｇ／ｍＬ）、イオノマイシン（１００ｎｇ／ｍＬ）、又はＴＮＦ−ａ（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によって、細胞を１２時間刺激した。プ
ロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有するＰＢＳの中で細胞（１×１０７）を音波
処理（Ｓｏｎｉｆｅｒ ２５０，Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）し、
１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心した。上清のタンパク質濃度は、Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。
ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の各レーン
に、７μｇのタンパク質を加えた。続いて、ゲルをニトロセルロース膜（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）に転写し、完全長の組換えウシＥＮ−ＲＡＧＥに対して調製されたポ
リクローナルウサギ単特異的抗ＥＮ−ＲＡＧＥ ＩｇＧを用いてイムノブロッテ
ィングを行った。一次抗体の結合部位を示すために、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（Ｓｉｇｍａ）で標識したヤギの抗ウサギＩｇＧとＥＣＬ系（Ａｍｅｒｓｈｍ
ａ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。
【０１１８】 インビボでの研究： ＣＦ−１マウスの腹腔内にＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）（３０
μｇ／ｇ体重）を注射した。表記されている場合には、あるマウスは、ＬＰＳの
注射の１２時間及び１時間前に、マウスのｓＲＡＧＥ（１００μｇ）で前処理し
た。表記の時点でマウスを屠殺し、ｔｒｉｓ−グリシンゲル（１４％；Ｎｏｖｅ
ｘ）を用いて、血清（０．０１５ｍＬ）を電気泳動にかけ、上記のようにイムノ
ブロッティングを行った。何れの場合にも、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、デン
シトメトリーを行った。
【０１１９】 ５．放射性リガンド結合アッセイ 約５，０００ｃｐｍ／ｎｇの比活性になるように、１２５ＩとＩｏｄｏｂｅａ
ｄｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、精製したＥＮ−ＲＡＧＥを放射線標識した。精
製したヒトＲＡＧＥ（５μｇ／ウェル）又はウシ大動脈内皮細胞の何れかを吸着
させた９６ウェルの皿で、放射性リガンド結合アッセイを行った。前者の場合に
は、炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）中のプラスチック性の皿にヒトの可溶性
ＲＡＧＥを一晩吸着させた後、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を含有するＰＢＳ
でウェルを洗浄した。プラスチックのウェル上の占有されていない結合部位は、
カルシウム／マグネシウムとウシ血清アルブミン（１％）を含有するＰＢＳと、
２時間３７℃でインキュベートすることによってブロックした。ウェルを吸引し
た後、カルシウム／マグネシウムとＢＳＡ０．２％を含有するＰＢＳ中で、３時
間３７℃で、表記の濃度の放射線標識したＥＮ−ＲＡＧＥ±５０倍モル過剰の標
識されていないＥＮ−ＲＡＧＥの存在下で、放射性リガンド結合アッセイを行っ
た。その時間が終了すると、上記の洗浄用緩衝液でウェルを素早く洗浄し、１ｍ
ｇ／ｍＬのヘパリンを含有する溶液中で、結合した成分の溶出を行った。続いて
、ウェルから溶液を吸引し、ガンマカウンター（ＬＫＢ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ，ＭＤ）の中で計数した。細胞結合アッセイでは、コラーゲンI（Ｂｉｏｃ
ｏａｔ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）を予めコ
ートした９６ウェルの組織培養プレート上に、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）
を播種した。集密が達成された時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、上記のように放
射性リガンド結合アッセイを行った。平衡結合データは、ＫｌｏｔｚとＨｕｎｓ
ｔｏｎの式：Ｂ＝ｎＫＡ／１＋ＫＡ（Ｋｌｏｔｚ ａｎｄ Ｈｕｎｓｔｏｎ，１
９８４）（ここで、Ｂ＝特異的に結合したリガンド（総結合、トレーサーのみと
インキュベートしたウェル−非特異的結合、過剰な非標識成分の存在下でトレー
サーとインキュベートしたウェル）、ｎ＝部位／細胞、Ｋ＝解離定数、及びＡ＝
遊離のリガンド濃度）に従い、非線形最小２乗分析（Ｐｒｉｓｍ；Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、ＣＡ）を用いて分析した。表記されている場合には、抗体又は可溶性Ｒ
ＡＧＥの何れかによる前処理を行った。
【０１２０】 ６．細胞の活性化の研究 内皮細胞： 以前に記載したように（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９
５）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離し、性質決定し、培養した。内皮
細胞増殖因子が加えられていない無血清ＲＰＭＩ１６４０中で細胞を２４時間培
養した後、表記の濃度のＥＮ−ＲＡＧＥ又は他の刺激で刺激した。表記されてい
る場合には、ウサギの抗ヒトＲＡＧＥ ＩｇＧ；非免疫ウサギＩｇＧで細胞を前
処理し、あるケースでは、ＥＮ−ＲＡＧＥでの刺激に先立って、表記の濃度のｓ
ＲＡＧＥで、ＥＮ−ＲＡＧＥを２時間前処理した。ＥＮ−ＲＡＧＥでの刺激から
８時間後に、パラホルムアルデヒド（２％）で３０分間細胞を固定し、ＰＢＳで
２回洗浄し、細胞表面上の非特異的結合部位をブロックするために無脂肪ドライ
ミルク（５％）とＢＳＡ（２．５％）を含有するＰＢＳで処理した。以前記載し
たように（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ｂ）、抗ＶＣＡＭ−１ Ｉ
ｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いた細胞表面ＥＬＩＳＡを行った。機能的なＶＣＡＭ−１
活性の評価は、以前記載したように（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５
ｂ）、５１Ｃｒ標識したＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ）を用いて決定した。ＮＦ
−κＢの活性化は、以前に記載したように（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．
，１９９８）調製したＨＵＶＥＣからの核抽出物を用いて評価した。１０μｇの
核抽出物をＰＡＧＥゲルにかけ、ＶＣＡＭ−１プロモーターからのＮＦ−κＢに
対する３２Ｐ標識プローブを用いてＥＭＳＡを行った（Ｎｅｉｓｈ ｅｔ ａｌ
．，１９９２）。スーパーシフトアッセイは、放射線標識したオリゴヌクレオチ
ドプローブを添加する前に、非免疫抗ｐ５０、抗ｐ６５、又は両ＩｇＧ（Ｓａｎ
ｔａ Ｃｒｕｚ）を核の抽出物と、室温で４５分間プレインキュベートすること
によって行った。
【０１２１】 ７．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単核食細胞（ＭＰ）、及びＪｕｒｋａｔ細
胞 化学走性アッセイ： 化学走性アッセイは、ポリカーボネート膜（８μｍ；Ｎ
ｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を含有する４８ウェルのミ
クロケモタクシスチャンバー（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍ
Ｄ）中で、以前に記載したように行った（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９
９３）。下方のチャンバーは、表記の化学走性刺激を含有していた。ポジティブ
コントロールとしてＮ−ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ（Ｓｉｇｍａ）を使
用した。上方のチャンバーに、Ｍｏｌｔ−４細胞（細胞表面ＲＡＧＥを有する）
を加えた（１０４細胞／ウェル）。３７℃で４時間インキュベートした後、前記
膜の上側表面上の移動していない細胞を穏やかに剥ぎ取って除去し、続いて、メ
タノール（１００％）中で前記膜を固定し、膜を通って移動した細胞をギムザ（
Ｓｉｇｍａ）染色し、計数した。９つの高倍率野の中にある細胞を計数し、平均
±ＳＥＭを報告した。各実験は２回繰り返し、各ケースで、条件当たり６つの繰
り返しを使用した。
【０１２２】 分裂促進アッセイ： インビトロ研究では、フィコール勾配（Ｈｉｓｔｏｐａ
ｑｕｅ １０７７；Ｓｉｇｍａ）を用いて全血からＰＢＭＣを単離し、１×１０ ６ 細胞／ｍＬの濃度でＦＢＳ（１０％）を含有するＲＰＭＩ中に懸濁した。９６
ウェルの組織培養ウェルに細胞を播種し、ＰＨＡ−Ｐ（Ｓｉｇｍａ）による１２
時間の刺激の前に、Ｅｎ−ＲＡＧＥで表記のように１２時間処理した。続いて、 ３ Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ
，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でウェルを瞬間標識し、ＬＫベータプレート（Ｗａｌｌ
ａｃ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いた液体シンチレーシ
ョンカウンティングのための採取とプロセッシングの前に、さらに１８時間イン
キュベートした。インビボでの研究では、マウスの脾臓細胞（ＣＦ−１株）は、
下記のようにＤＴＨ研究に供されたマウスの脾臓組織から得ており、Ｈｉｓｔｏ
ｐａｑｕｅ１０７７を用いて単離された。ＰＭＡ（０．５μｇ／ｍＬ）で、ＦＢ
Ｓ（１０％）を含有するＲＰＭＩ中の脾臓細胞（５×１０５細胞／ウェル；９６
ウェル組織培養プレート）を１８時間刺激し、トリチウムラベルしたチミジンを
用いて、上記のインビトロ研究のように増殖速度を実施した。全ての実験は、３
重の測定を行った。
【０１２３】 サイトカインレベルの評価： 表記のように、細胞表面ＲＡＧＥを有するＢＶ
２細胞（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）又はＪｕｒｋａｔＥ６細胞（ＡＴＣ
Ｃ）を、ＥＮ−ＲＡＧＥと共に表記の時間インキュベートした。ある実験では、
ＥＮ−ＲＡＧＥでの刺激の前に、細胞を抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２とプレイン
キュベートした。別のケースでは、ＥＮ−ＲＡＧＥは、刺激の前に、ｓＲＡＧＥ
とプレインキュベートした。ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１β、又はＩＬ−２のＥＬＩＳ
Ａは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のキットを用
いて行った。表記されている場合には、ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖ
ａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）（１μｇＤＮＡ／ｍＬ培地）を用いて細胞質ドメイン（
尾部）が欠失したヒトＲＡＧＥをコードする構築物を用いて細胞をトランスフェ
クトした；ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をベクターとして使用した。
刺激実験は、トランスフェクションの４８時間後に行った。
【０１２４】 注入研究： 尾静脈を介して、約６週齢のＢＡｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅ
ｓ Ｒｉｖｅｒ）に、ＥＮ−ＲＡＧＥ（３０μｇ）、ＢＳＡ（３０μｇ）、又は
ＬＰＳ（５００μｇ）を静脈内注射した。１２時間後に、肺を素早く採取し、プ
ロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有するｔｒ
ｉｓで緩衝化した生理的食塩水中でホモゲナイズし、８，０００ｒｐｍ、１０分
間の遠心にかけた。続いて、上清を４℃、４０，０００ｒｐｍで１時間遠心した
。沈降物は、プロテアーゼ阻害剤とオクチルβグルコシド（２％）を含有するＴ
ＢＳ中に、４時間４℃で溶解した。続いて、懸濁物を、１４，０００で１０分間
遠心し、上清のタンパク質濃度を測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。３０μｇタンパ
ク質／レーンの電気泳動とニトロセルロースへのゲル成分の転写後に、イムノブ
ロッティングを行った。抗ＶＣＡＭ−１ ＩｇＧは、Ｓａｎｔｚ Ｃｒｕｚ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから取得し、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でバンドの可視化を達成した。
【０１２５】 ８．遅延型過敏症のモデル 左鼠頚部のリンパ節に、メチル化されたＢＳＡ（ｍＢＳＡ；２５ｍｇ／ｍＬ；
ＳＩＧＭＡ（登録商標））、ＮａＣｌ（０．９％）、デキストラン（５−４０×
１０６ＭＷ；５０ｍｇ／ｍＬ；ＳＩＧＭＡ）、及びフロイントの不完全アジュバ
ント（５０％；ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を含有す
るエマルジョン（０．１ｍＬ）を皮下注射することによって、６週齢の雌のＣＦ
−１マウスを感作した。３週間後、左後足の裏に、ｍＢＳＡ（０．４ｍｇ／ｍＬ
；０．０５０ｍＬ）を皮下注射した。表記されている場合には、ｍＢＳＡによる
局所攻撃誘発の２４及び１２時間前、並びに６及び１２時間後に、ｓＲＡＧＥ（
表記の用量）、マウス血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ（登録商標））、免疫又は非
免疫Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｐｉｅｒｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ
，ＩＬＬのキットを用いて調製）を腹腔内注射することによって、マウスを前処
理した。予備知識を与えられていない２人の調査員によって、足底部にｍＢＳＡ
を注射してから２４時間後に、上述のように足底部の臨床スコアを実施した。続
いて、マウスを人道的に屠殺し、足をホルマリン（１０％）で固定するか、又は
、さらなる分析のために凍結した。予備知識を与えられていない２人の調査員に
よって、ヘマトキシリンとエオシン（Ｓｉｇｍａ）で染色した足の切片に対して
組織学的なスコアを実施した。上記レーン当たり１０μｇ添加した足底部核抽出
物を用いて、電気泳動移動度シフトアッセイを行った。ＩＬ−２（予想サイズ；
４１３塩基対）、ＴＮＦ−ａ（予想サイズ；３１０塩基対）、及びβアクチン（
予想サイズ；５４０塩基対）に対する市販のプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を
用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。あるマウスでは、屠殺時に、脾臓を回収し、Ｈｉ
ｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ）を用いた分離によって脾臓細胞を調製
した。９６ウェル組織培養プレートのウェルの中に、５×１０４の細胞を播種し
、ＰＭＡ０．５μｇ／ｍＬを用いて、１６時間刺激を行った。その時間が終了し
た時点で、さらに１８時間、トリチウムラベルしたチミジンを加えた。続いて、
細胞を回収し、ベータカウンターで計数した。
【０１２６】 ９．無ＩＬ−１０マウスでの慢性腸炎のモデル Ｃ５７ＢＬ／６系の無ＩＬ−１０マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）が産まれ、無病原体条件で飼育した。
３週齢の時点で、餌と水に自由に近づける標準的な慣用の住居にマウスを移した
。標準条件に置いてから１週後に、６週間にわたって、腹腔内にＭＳＡ（１００
μｇ／日）又はｓＲＡＧＥ（１００μｇ／日）の何れかを１日に１回注射して、
マウスを処置した。その時間が終了した時点で、マウスに深い麻酔をかけ、血漿
を採取した後、組織学的な分析（ヘマトキシリンとエオシン）又は上述のごとき
核抽出物の調製のために、直腸Ｓ状部の腸を取り出した。直腸Ｓ状部の腸ヘマト
キシリンとエオシン染色した切片は、前記調査員のうちの１人によって、予備知
識を与えずに評価された。血漿のＴＮＦ−ａのレベルを評価し（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）、核抽出物に対してＮＦ−κＢ用のＥＭＳＡを行った。
【０１２７】 ＜結果＞ １．約１２ｋＤａのＲＡＧＥ結合タンパク質の性質決定 我々は、以前、免疫グロブリンスーパーファミリー中のこのような受容体は、
ＡＧＥ以外のリガンドを使用しているかもしれないと推測した。ウシの肺の界面
活性剤抽出物を調製し、最後の工程での、ＲＡＧＥが吸着されたＡｆｆｉゲルの
レジンを含む連続するカラムで前記成分のクロマトグラフィーを行うと、放射性
リガンド結合アッセイでＲＡＧＥ結合活性を有する２つのポリペプチドが溶出さ
れた。約２３ｋＤａのポリペプチドである第１のポリペプチドは、アムホテリン
と同定された（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，）。約１２ｋＤａのポリペプチドであ
る第２のポリペプチドは、エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃによる消化後に、アミ
ノ末端と内部の両者がアミノ酸配列分析にかけられた（表２）。最初「ｐ１２」
と名付けられたこのポリペプチドの配列は、最近、Ｓ１００Ａ１２として分類さ
れた（Ｉｌｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、羊膜液中のウシカルシウム結合タン
パク質−１（ＣＡＡＦ−１）（Ｈｉｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）又はウ
シ角膜の抗原／カルグラニュリンＣ（Ｇｏｔｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７
）として知られるポリペプチドと最も密接且つ顕著な相同性を有することが明ら
かとなった。このポリペプチドは、その後、ＥＮ−ＲＡＧＥ、Ｅｘｔｒａｃｅｌ
ｌｕｌａｒ Ｎｏｖｅｌ ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎと称され
た。ＥＮ−ＲＡＧＥの配列は、ウシ角膜抗原の配列と２つのアミノ酸が異なって
いた。３０位に、ＥＮ−ＲＡＧＥはチロシン（Ｙ）を有しているのに対して、ウ
シ角膜抗原はアルギニン（Ｒ）を有していた。３６位に、ＥＮ−ＲＡＧＥはグリ
シン（Ｇ）を有しているのに対して、ウシ角膜抗原はイソロイシン（Ｉ）を有し
ていた（表２）。分子クローニング研究は、ＥＮ−ＲＡＧＥが、炎症誘導性サイ
トカインのカルグラニュリン／Ｓ１００ファミリーのメンバーであることを明ら
かにした。ウシの肺のライブラリーから得られた２つのｃＤＮＡクローンは、３
０位にアルギニン、３６位にイソロイシンを有し、推定アミノ酸配列に基づき、
ウシの角膜抗原と同一のポリペプチドをコードしていた。これらのデータに基づ
けば、我々は、我々がＥＮ−ＲＡＧＥの正確な配列をコードする特異的なクロー
ンを単離しなかったという可能性を除外することはできない。ヒトの肺のライブ
ラリーを用いた分子クローニングは１つのクローンを産生した。このｃＤＮＡの
推定アミノ酸配列は、ＥＮ−ＲＡＧＥのヒトの対応物がヒトのカルグラニュリン
Ｃ（又はヒト角膜抗原／Ｓ１００Ａ１２）の可能性があることを明らかにした（
Ｇｏｔｔｓｃｈ ａｎｄ Ｌｉｕ、１９９８；Ｉｌｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６
；Ｙａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。このポリペプチドの推定アミ
ノ酸配列は、ヒトの対応物がウシ角膜抗原と高度に相同である（＞７７％）こと
を明らかにした。
【０１２８】 実際に、ｐ１２は、Ｓ１００／カルグラニュリンスーパーファミリーのメンバ
ーである（Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｉｌｇ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６；Ｗｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇｏｔｔｓｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｇｏｔｔｓｃｈ ａｎｄ Ｌｉｕ，１９９８）。こ
のため、我々は、ＥＮ−ＲＡＧＥという名称を維持した。この及び他のこのよう
なファミリーのメンバーの新規特性は、以下に記載されているようにこれらのポ
リペプチドの機能の重要な示唆となるそれらのＲＡＧＥとの相互作用だからであ
る。
【０１２９】
【表２】 ２．ＥＮ−ＲＡＧＥの発現は刺激された炎症細胞で増大する Ｓ１００／カルグラニュリンファミリーの分子は、広範な炎症性疾患、特に慢
性状の疾患に広く伴われる。これらのポリペプチドは、多形核白血球と末梢血由
来の単核食細胞のような炎症細胞から放出されることが知られているので、それ
らは、例えば、マクロファージの移動や活性化を刺激することによって、炎症性
表現型の進行に役割を果たしているかもしれないと長い間推測されていた。この
ため、我々は、ＥＮ−ＲＡＧＥによるＲＡＧＥの連結は、炎症誘導性の細胞シグ
ナリング経路を活性化することにより、炎症と関連した態様で、遺伝子発現の調
節をもたらすという考えをテストした。
【０１３０】 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は不死化したＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞
をＰＭＡ／イオノマイシンで刺激すると、細胞ホモジネートのイムノブロッティ
ングは、ＥＮ−ＲＡＧＥの生成が、それぞれ２．８倍及び２．１倍増加すること
を明らかにした（図６Ａ）。これに対して、培養したヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵ
ＶＥＣ）を典型的な刺激、腫瘍壊死因子αで刺激すると、ＥＮ−ＲＡＧＥ発現の
調節は起こらなかった（図６Ａ）。同様に、ＨＵＶＥＣのＰＭＡ／イオノマイシ
ンへの暴露は、ＥＮ−ＲＡＧＥの発現を増加しなかった（データは示さず）。こ
のように、Ｓ１００／カルグラニュリンファミリーのメンバーの典型として、Ｅ
Ｎ−ＲＡＧＥの発現は、刺激された炎症細胞で調節され得る。
【０１３１】 ＥＮ−ＲＡＧＥが、インビボの炎症環境で放出されるかどうかを決定するため
に、リポ多糖（ＬＰＳ）をマウスの静脈内に注入した。ＥＮ−ＲＡＧＥの血漿中
への放出の時間依存性の増加が観察された（図６Ｂ）。ＥＮ−ＲＡＧＥの最大の
放出は、注射から１２時間後に観察された。イムノブロッティングにより、その
時点で、約３．６倍のＥＮ−ＲＡＧＥの増加が実証された（図６Ｂ）。ＲＡＧＥ
の細胞外リガンド結合ドメイン部である可溶性ＲＡＧＥが、ＥＮ−ＲＡＧＥを血
漿中に引きつけることにより、その排除と除去を促進するかもしれないという可
能性と一致して、ｓＲＡＧＥ（ＬＰＳを結合しない）とＬＰＳの同時投与は、Ｌ
ＰＳ注射の１２時間後でさえ（図６Ｂ）、イムノブロッティングによる血漿ＥＮ
−ＲＡＧＥに検出可能な増加をもたらさなかった（図６Ｂ）。
【０１３２】 これらのデータは、ＥＮ−ＲＡＧＥがＲＡＧＥを結合したことを示唆した。放
射性リガンド結合アッセイでは、１２５Ｉ ＥＮ―ＲＡＧＥは、約９１±２９ｎ
ＭのＫｄと約２１±２．９ｆｍｏｌ／ウェルのキャパシティーで、プラスチック
ウェル上の固定化されたＲＡＧＥを用量依存的に結合した（図６Ｃ）。放射性ラ
ベルしたＥＮ−ＲＡＧＥを過剰な非標識のｓＲＡＧＥとインキュベートすると、
固定化されたＲＡＧＥへの結合は著しく弱められた（図６Ｃ、挿入図）。放射性
標識されたＥＮ−ＲＡＧＥのＲＡＧＥへの特異的な結合は、５０倍モル過剰の非
標識のＲＡＧＥの存在下で、８２．５％減少した。これに対して、過剰な非標識
のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とのインキュベーションは、影響がなかった（
図６Ｃ）。さらに、固定化したＲＡＧＥの抗ＲＡＧＥ ＩｇＧとのプレインキュ
ベーションは、放射性標識されたＥＮ−ＲＡＧＥの固定化されたＲＡＧＥへの結
合を著しく阻害した（図６Ｃ、挿入図）。５０μｇ／ｍＬの抗ＲＡＧＥ ＩｇＧ
の存在下では、結合は６７．９％阻害された。これに対して、非免疫ＩｇＧとの
プレインキュベーションは影響がなかった（図６Ｃ、挿入図）。重要なことに、
過剰なヒトＳ１００Ｂとのプレインキュベーションも、ＥＮ−ＲＡＧＥのＲＡＧ
Ｅへの結合を著しく抑制し、幅広いＳ１００／カルグラニュリンポリペプチドが
ＲＡＧＥを結合することが示唆された。
【０１３３】 しかしながら、ＥＮ−ＲＡＧＥが、炎症反応に関与する細胞の表面上にＲＡＧ
Ｅを引きつけるかもしれないかどうかを決めることが決定的であった。これをテ
ストするために、我々は、培養したウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）で放射性リ
ガンド結合アッセイを行った。我々の以前の研究と一致して、ＡＧＥ（Ｓｃｈｍ
ｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及びアムホテリン（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．
，１９９５）のような他のＲＡＧＥのリガンドで観察されたのと同様に、１２５ Ｉ ＥＮ―ＲＡＧＥは、約９０．３±３４ｎＭのＫｄと約１６３±２６．２ｆｍ
ｏｌ／ウェルのキャパシティーで、用量依存的にＢＡＥＣ ＲＡＧＥを結合した
（図６Ｄ）。放射線標識されたＥＮ−ＲＡＧＥのＢＡＥＣ ＲＡＧＥへの特異的
な結合は、５０倍モル過剰の非標識ＲＡＧＥの存在下で８４．３％減少した。こ
れに対して、過剰な非標識のＢＳＡとのインキュベーションは、効果がなかった
（図６Ｄ、挿入図）。放射線標識されたＥＮ−ＲＡＧＥのＲＡＧＥへの結合は、
ＢＡＥＣを５０μｇ／ｍＬの抗ＲＡＧＥ ＩｇＧとプレインキュベートすると、
４１％阻害されたが、５μｇ／ｍＬの抗ＲＡＧＥ ＩｇＧの存在下では、２８．
７％にすぎなかった。これに対して、非免疫ＩｇＧは効果がなかった（図６Ｄ、
挿入図）。マクロファージ様培養ＢＶ２細胞でも、同様の結果が観察された（示
さず）。
【０１３４】 これらのデータは、ＥＮ−ＲＡＧＥがＲＡＧＥを特異的に結合することを示し
、ＥＮ−ＲＡＧＥによるＲＡＧＥの連結が細胞の活性を引き起こすかもしれない
という仮説を我々に立てさせる。
【０１３５】 ３．ＥＮ−ＲＡＧＥ及びＥＮ−ＲＡＧＥ様分子によるＲＡＧＥの連結は炎症反
応の中心となる細胞を活性化する 内皮細胞： 内皮の活性化は、炎症反応の中心的な成分なので、我々は、まず、ＥＮ−ＲＡ
ＧＥがＥＣ ＲＡＧＥを活性化する能力についてテストした。この仮定と合致し
て、ＥＮ−ＲＡＧＥを培養ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とインキュベート
すると、ＶＬＡ−４を有する単核細胞が刺激された内皮に標的化され得る重要な
手段である血管細胞接着分子−１（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｒｉｃｈａ
ｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の細胞表面への発現の増加がもたらされ
た（図７Ａ）。この大部分がＲＡＧＥによって媒介されたということは、ＲＡＧ
Ｅへの接近を阻害した実験で明白となった。ＥＮ−ＲＡＧＥを４０倍モル過剰の
ｓＲＡＧＥとプレインキュベートすると、抗ＲＡＧＥ ＩｇＧと前記細胞とのプ
レインキュベーションの場合と同様に、ＶＣＡＭ−１の発現が著しく減弱した（
図７Ａ）。これに対して、非免疫ＩｇＧとのプレインキュベーションは、ＥＮ−
ＲＡＧＥでの処理後の細胞表面のＶＣＡＭ−１の発現程度に変化をもたらさなか
った（図７Ａ）。ＥＮ−ＲＡＧＥによるＲＡＧＥの連結がＶＣＡＭ−１の細胞表
面の発現の増加をもたらしたという観察と一致して、ＥＮ−ＲＡＧＥ刺激した内
皮へのＶＬＡ−４を有するＭｏｌｔ細胞の結合の増加が観察された。ＥＮ−ＲＡ
ＧＥが、Ｍｏｌｔ−４のＨＵＶＥＣへの結合を増大させる能力は、用量依存的で
あった（図７Ｂ、左パネル）。ＥＮ−ＲＡＧＥの効果は時間依存的であり、Ｍｏ
ｌｔ−４結合の最大の増加は、インキュベーションから８時間後に観察された（
図７Ｂ、中央パネル）。我々の以前の発見と一致して、増加したＭｏｌｔ−４の
結合は、ＥＮ−ＲＡＧＥの細胞性ＲＡＧＥとの相互作用によるものであった。Ｈ
ＵＶＥＣを５μｇ／ｍＬの抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２とプレインキュベートす
ると、Ｍｏｌｔ−４のＥＮ−ＲＡＧＥ処理した細胞への結合が著しく減弱した。
これに対して、０．１μｇ／ｍＬの抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２と非免疫Ｆ（ａ
ｂ’）２はともに、効果がなかった（図７Ｂ、右パネル）。同様に、ＥＮ−ＲＡ
ＧＥを３０倍モル過剰のｓＲＡＧＥとプレインキュベートすると、ＥＮ−ＲＡＧ
Ｅを介したＭｏｌｔ−４のＨＵＶＥＣへの結合の増大は著しく減弱した。これに
対して、ＥＮ−ＲＡＧＥをｓＲＡＧＥ（５倍モル過剰）又は５μｇ／ｍＬのＢＳ
Ａの何れかとプレインキュベートしても、有意な効果はなかった（図７Ｂ、右パ
ネル）。
【０１３６】 ＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡの増加をもたらす重要な手段は、炎症反応における中
心的な転写因子ＮＦ−κＢの活性化によるものである（Ｎｅｉｓｈ ｅｔ ａｌ
．，１９９２）。以前の研究では、我々は、電気泳動移動度シフトアッセイによ
って実証されたように、ＡＧＥ及びアミロイドβペプチドによるＲＡＧＥの連結
は、ＮＦ−κＢ成分の核内への移動の増加をもたらすことを実証した（Ｙａｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｌａｎｄｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７）。このため、我々は、ＥＮ−ＲＡＧＥによるＥＣ ＲＡ
ＧＥの連結がＮＦ−κＢの活性化を媒介するかどうかをテストした。ＨＵＶＥＣ
から調製した核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）では、ＥＮ
−ＲＡＧＥ（２．５又は５．０μｇ／ｍＬ）とのインキュベーションは、デンシ
トメトリーにより、ＢＳＡとのインキュベーションと比べて、核のＮＦ−κＢを
約５倍増加した（それぞれ、図７Ｃ、レーン１、２、及び７、挿入図）。このう
ちの多くがＲＡＧＥとの相互作用によって媒介されたということは、ＥＮ−ＲＡ
ＧＥの前に、ＨＵＶＥＣを抗ＲＡＧＥ ＩｇＧで前処理する実験によって実証し
た。この実験では、ＮＦ−κＢの活性化は著しく弱められた（図７Ｃ、レーン４
及び挿入図）。同様に、ＥＮ−ＲＡＧＥを過剰なｓＲＡＧＥ（５０倍）とプレイ
ンキュベートすると、ＮＦ−κＢの活性化の減少がもたらされた（図７Ｃ、レー
ン３及び挿入図）。抗ｐ−５０と抗ｐ−６５ＩｇＧの両者を用いたスーパーシフ
トアッセイは、ＥＮ−ＲＡＧＥによるＲＡＧＥの連結時に活性化したＮＦ−κＢ
複合体は、ｐ５０とｐ６５の両者から構成されることを実証した（図７Ｃ、レー
ン１３、１４、及び１５）。これに対して、核抽出物を非免疫ＩｇＧとプレイン
キュベートしても、バンドのシフトはもたらされなかった（図７Ｃ、レーン１２
）。ＲＡＧＥの細胞質ドメインが、ＮＦ−κＢの活性化の基部に位置し、不可欠
なシグナリング経路の活性化に極めて重要であるという考えをテストするために
、細胞質ドメインが欠失されたヒトＲＡＧＥをコードする構築物を用いた一過性
のＨＵＶＥＣのトランスフェクションを行った。細胞シグナリングの媒介におけ
る細胞質ドメインの重要な役割と一致して、ＥＮ−ＲＡＧＥによって刺激された
ＮＦ−κＢの活性化は、ベクターのみをトランスフェクトしたもの（図７Ｃ、レ
ーン６及び挿入図）と比べて、ＲＡＧＥの細胞質尾部が欠失した形質移入体（図
７Ｃ、レーン５及び挿入図）で顕著に抑制された。
【０１３７】 総合すると、これらのデータは、内皮細胞でのＥＮ−ＲＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互
作用は、炎症反応に関与する重要な転写因子であるＮＦ−κＢを活性化すること
を示唆することにより、この相互作用が炎症誘導性の擾乱を与えるかもしれない
中心的な手段を示唆している。
【０１３８】 単核食細胞： 内皮細胞とともに、単核食細胞（ＭＰ）は、免疫／炎症現象を媒介する上で非
常に重要である。我々は、傷害部位に召集された細胞から放出されたＥＮ−ＲＡ
ＧＥは、炎症反応を増幅する上でさらに重要であるかもしれないという仮説を立
てた。このため、我々は、ＥＮ−ＲＡＧＥがＭＰ様細胞の移動を刺激する能力に
ついてテストした。改変した化学走性チャンバーにおいて、下側のチャンバーに
配置されたＥＮ−ＲＡＧＥは、用量依存的に、上側のチャンバーに配置されたＭ
ｏｌｔ−４細胞（細胞表面ＲＡＧＥを有する）の化学走性を媒介した（図７Ｄ、
左パネル、列２、３、４及び５）。これに対して、下側チャンバーにＢＳＡを置
いても、有意な効果はなかった（図７Ｄ、列１）。これが正しい化学走性を表し
ているということは、ＥＮ−ＲＡＧＥが上側チャンバーと下側チャンバーの両者
に配置された実験によって示唆された。Ｍｏｌｔ−４細胞を加えると、下側チャ
ンバーに有意な移動は起こらなかった図７Ｄ、左パネル、列６）。ＭＰ細胞の表
面上のＲＡＧＥが、ＥＮ−ＲＡＧＥが移動を刺激する主要な手段であるという考
えをテストするために、ＥＮ−ＲＡＧＥを過剰なｓＲＡＧＥとプレインキュベー
トした。ＢＳＡとのプレインキュベーションと比べて（図７Ｄ、右パネル、列１
）、下側チャンバーへのＭｏｌｔ−４の移動が著しく弱められた（図７Ｄ、右パ
ネル、列２、及び３）。さらに、Ｍｏｌｔ−４細胞を抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’） ２ とプレインキュベートすると、ＥＮ−ＲＡＧＥによって媒介されるＭｏｌｔ−
４の移動が著しく減少した（図７Ｄ、右パネル、列５及び６）。これに対して、
非免疫Ｆ（ａｂ’）２とのプレインキュベーションは、効果がなかった（図７Ｄ
、右パネル、列４）。
【０１３９】 我々は、ＥＮ−ＲＡＧＥのＭＰ−ＲＡＧＥとの相互作用が、細胞の活性化及び
炎症と重要な関連を有するサイトカインであるＩＬ−１β及びＴＮＦ−ａのよう
な媒介物質の生成の増大をもたらしたかどうかを描き出そうと試みた。偽トラン
スフェクトした（ベクターのみ）培養マクロファージ様ＢＶ２細胞をＥＮ−ＲＡ
ＧＥと共にインキュベートすると、細胞の上清中へのＩＬ−１βの顕著な生成が
、用量依存的にもたらされた（図７Ｅ、左パネル、黒塗りのバー）。無傷のＲＡ
ＧＥ細胞内シグナリング経路が不可欠であることは、ヒトＲＡＧＥ尾部欠失構築
物をＢＶ２細胞中に一過性にトランスフェクトした実験によって実証された。Ｅ
Ｎ−ＲＡＧＥを介した上清中へのＩＬ−１βの生成の完全な抑制が得られ、「ド
ミナントネガティブ」効果と一致していた（図７Ｅ、左パネル、ハッチングされ
たバー）。ＴＮＦ−ａを調べると、類似の結果が観察された。ＥＮ−ＲＡＧＥ−
ＲＡＧＥ相互作用は、用量依存的に、細胞の上清中へのＴＮＦ−ａの発現を顕著
に増加させた（図７Ｅ、右パネル、黒塗りのバー）。しかしながら、ＲＡＧＥ尾
部欠失構築物で一過性にトランスフェクトすると、ＢＶ２上清中へのＴＮＦ−ａ
の生成が喪失した（図７Ｅ、右パネル、ハッチングされたバー）。ＭＰにおける
サイトカイン発現の調節が起こる中心的な手段は、ＮＦ−κＢの活性化によるも
のであった。培養ＨＵＶＥＣを用いて得られた結果と同様に、ＥＮ−ＲＡＧＥ刺
激されたＢＶ−２細胞から調製した核抽出物のＥＭＳＡは、ＮＦ−κＢの活性化
を明らかにした。このプロセスは、抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２、ｓＲＡＧＥの
存在下で、又は尾部を欠失した構築物でのトランスフェクションで顕著に抑制さ
れた（データは示さず）。
【０１４０】 末梢血単核細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞： Ｊｕｒｋａｔ細胞中のＥＮ−ＲＡＧＥによるＲＡＧＥの連結は、活性化を媒介
する。末梢血由来の単核細胞（ＰＢＭＣ）をＥＮ−ＲＡＧＥとインキュベートす
ると、ＰＨＡ−Ｐで刺激したときに、細胞を過大な反応に対して準備刺激した。
ＢＳＡによる前処理と比べて、トリチウム化されたチミジンの顕著な取り込みが
、予めＥＮ−ＲＡＧＥとインキュベートした細胞中で見られた（図７Ｆ）。これ
が大部分ＥＮ−ＲＡＧＥのＰＢＭＣ ＲＡＧＥとの相互作用によるものであるこ
とは、ＰＢＭＣを抗ＲＡＧＥ ＩｇＧとインキュベートした研究、又はＥＮ−Ｒ
ＡＧＥを過剰なｓＲＡＧＥとともにプレインキュベートした研究によって実証さ
れた。ＥＮ−ＲＡＧＥで刺激されたトリチウム化されたチミジンの取り込みの著
しい減少が起こった（図７Ｆ）。
【０１４１】 全身的なＰＢＭＣの活性化についての証拠と一致して、Ｊｕｒｋａｔ細胞（細
胞表面ＲＡＧＥを有する）をＥＮ−ＲＡＧＥとインキュベートすると、ＲＡＧＥ
依存的に、上清培地中へのＩＬ−２の増加した生成がもたらされた（図２Ｇ）。
【０１４２】 総合すると、これらの研究は、内皮細胞、ＭＰ、及びリンパ球のような炎症反
応の伝播に極めて重要な細胞の表面にＲＡＧＥが引きつけられると、炎症性の表
現型の編成に不可欠な反応である、サイトカイン媒介物質の移動、増殖、及び生
成の刺激に関連した態様で、これらの細胞の活性化がもたらされることを実証し
ている。
【０１４３】 重要なことに、我々は、ＲＡＧＥのリガンドであるＳ１００／カルグラニュリ
ンスーパーファミリーメンバーの範囲をテストしようと試み、ヒトＳ１００Ｂが
ＥＣを活性化する能力をテストした。ＮＦ−κＢの活性化は炎症性遺伝子発現の
調節にとって不可欠な前駆体なので、我々は、ＥＭＳＡによってこの考えをテス
トした。ＨＵＶＥＣをヒトＳ１００Ｂで刺激すると、ＢＳＡへの細胞の暴露と比
べて（図７Ｈ、列１）、ＮＦ−κＢの核への移行が約１３．９倍増加することが
、ＥＭＳＡによって明らかとなった（図７Ｈ、列２）。これらの発見がＲＡＧＥ
の活性化によるものであることは、抗ＲＡＧＥＩｇＧとのプレインキュベーショ
ン（図７Ｈ、レーン３）又はＲＡＧＥ尾部欠失構築物でのトランスフェクション
（図７Ｈ、レーン５）の何れかがＳ１００Ｂに対する応答性を著しく弱めた研究
によって実証された。これに対して、非ＩｇＧとのプレインキュベーション（図
７Ｈ、レーン４）又は偽トランスフェクション（図７Ｈ、レーン６）は、効果が
なかった。これらの観察は、広範なＳ１００／カルグラニュリンポリペプチドの
リガンドがＲＡＧＥを引きつけることを示している。
【０１４４】 ４．マウスへのＥＮ−ＲＡＧＥの注入は細胞の活性化及び遺伝子発現の調節を
刺激する 我々は、ＥＮ−ＲＡＧＥがインビボで細胞の活性化と炎症性媒介物質の発現を
媒介するかどうかを決定するために、インビトロモデルでの我々の発見を拡張し
ようと試みた。我々は、インビボでは、ＥＮ−ＲＡＧＥは、免疫／炎症性の攻撃
誘発の部位に局所的に放出されると推測するが、我々は、ＥＮ−ＲＡＧＥを免疫
力のあるマウスに注入すると、炎症性媒介物質の発現を媒介するであろうという
考えをテストした。この考え方どおりに、３０μｇのＥＮ−ＲＡＧＥをＣＦ−１
マウス中に注入すると、ＢＳＡの注入と比べて、イムノブロッティングにより、
肺のＶＣＡＭ−１の発現がμ２．４増加した（図８Ａ、それぞれレーン２及び１
）。これが、大部分は血管のＲＡＧＥを引きつけたことによるものであるという
ことは、ｓＲＡＧＥ（図８Ａ、レーン３）又は抗ＲＡＧＥ ＩｇＧ（図８Ａ、レ
ーン４）の何れかの存在下で、肺におけるＥＮ−ＲＡＧＥによって刺激されたＶ
ＣＡＭ−１の発現が著しく弱められることによって実証された。これに対して、
非免疫ＩｇＧ／ＥＮ−ＲＡＧＥの注入は、効果がなかった（図８Ａ、レーン５）
。
【０１４５】 ５．炎症反応におけるＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥの役割 急性の炎症： しかしながら、これらの仮定の決定的なテストは、ＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥ
が、炎症のインビボモデルで炎症反応に参加するかどうかであった。我々は、ま
ず、遅延型過敏症のマウスモデル（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）でこの
概念をテストした。このモデルでは、ＣＦ−１マウスは、メチル化されたＢＳＡ
（ｍＢＳＡ；ＲＡＧＥを結合しない）で感作された。塩化ナトリウム、デキスト
ラン、及び不完全フロイントアジュバントを含有するエマルジョンと混合したｍ
ＢＳＡを、鼠頚部のリンパ節に局所投与した。２１日後に、ｍＢＳＡ又はビーク
ル（リン酸で緩衝化した生理的食塩水）を左後足の足底部に投与した。我々の研
究は、後者は効果がないことを示し、同様に、予め感作せずにｍＢＳＡを注射し
ても、炎症反応を生じないことを明らかにした（データは示さず）。左後足の足
底部にｍＢＳＡを感作し、攻撃誘発したマウスでは、炎症スコアによる測定によ
れば、顕著な炎症反応が起こった（図９Ａ、Ｂ、Ｆ）。
【０１４６】 このモデルで炎症を潜在的に調節する上での、ＲＡＧＥ／ＥＮ−ＲＡＧＥの遮
断の役割をテストするために、ある感作／攻撃誘発されたマウスの腹腔内に、ビ
ークル、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を処置した。足底部にｍＢＳＡを注入
してから２４時間後に、局所的な炎症の顕著な証拠が明らかとなった（スコア、
９．０±０．４）（図９Ａ、列１；及び図９Ｂ）。さらに、冒された足底部のＨ
＆Ｅ分析によって、肉芽腫と著しい浮腫を伴って、炎症細胞が著しく流入するこ
とが確かめられた（図９Ｆ）。しかしながら、全く対照的に、マウスのｓＲＡＧ
Ｅの注射は、ｍＢＳＡで感作／攻撃誘発したマウスで用量依存的に、炎症の抑制
をもたらした。１００μｇ／投与のｓＲＡＧＥを注射すると、炎症スコアは２．
７±０．３に減少した。ＭＳＡと比べてｐ＜０．００１（図９Ａ、列２−３−４
−５及び６；並びに図９Ｃ）。炎症の顕著な抑制と一致して、ｓＲＡＧＥ（１０
０μｇ）処置したマウスの足底部をＨ＆Ｅによって調べると、この領域への炎症
細胞の流入が顕著に停止することが明らかとなった（図９Ｈ）。我々は、少なく
とも部分的に、ｓＲＡＧＥは、ＥＮ−ＲＡＧＥを結合し、その細胞性ＲＡＧＥの
誘引及び活性化を阻害することによって、その有利な抗炎症作用を発揮すると推
測している。
【０１４７】 このため、抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２を用いたＥＮ−ＲＡＧＥの遮断
、又は抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２を用いたＲＡＧＥ自体へのアクセスの遮断が
、類似の有益な効果を発揮するかどうかを決定し、感作されたマウスへのｍＢＳ
Ａの注射によって引き起こされた炎症カスケードでの、これらの媒介物質の重要
な役割を立証することが重要であった。感作／攻撃誘発されたマウスを非免疫Ｆ
（ａｂ’）２で処置すると、全く効果が見られなかった（スコア、９．０±０．
２）。しかしながら、抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２（２００μｇ）又は抗ＥＮ−
ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の存在下では、炎症反応の顕著な減弱が明らかであり
（図９Ａ、それぞれ９及び１１列、並びにそれぞれ９Ｅ及びＤ）、それぞれ、炎
症スコアは４．９±０．８と５．６±０．５であった（両ケースで、非免疫Ｆ（
ａｂ’）２での処置と比較して、ｐ＜０．０５）。抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２ 又は抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の何れかの存在下での炎症の減少を確認
すると、組織学的な分析は、炎症細胞、浮腫の数の顕著な減少と肉芽腫の不存在
が明らかとなった（それぞれ、図９ＪとＩ）。炎症の媒介におけるＥＮ−ＲＡＧ
Ｅ／ＲＡＧＥの極めて重要な役割を強く示唆するように、抗ＥＮ−ＲＡＧＥと抗
ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の両者を同時に投与すると、顕著な炎症の減少が観察
された（図９Ａ、列１２）。炎症スコアは３．６±０．９まで減少した；非免疫
Ｆ（ａｂ’）２での処置と比べてｐ＜０．０１。実際に、Ｈ＆Ｅによる分析は、
炎症細胞と浮腫の数が顕著に減少することを明らかにした（図９Ｋ）。
【０１４８】 これらのデータは、ＥＮ−ＲＡＧＥ／ＲＡＧＥの遮断が、このモデルで細胞の
活性化をかなり弱めたことを示唆していた。実際に、ｓＲＡＧＥ、抗ＲＡＧＥ
Ｆ（ａｂ’）２、又は抗ＲＡＧＥ／抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２が投与さ
れたｍＢＳＡ感作／攻撃誘発されたマウスで炎症が減少するという証拠と平行し
て、冒された足底部から調製した核抽出物でのＮＦ−κＢの活性化の顕著な抑制
が観察された。反対側の足底部（ｍＢＳＡでの感作／局所攻撃誘発なし）と比較
して、ｍＢＳＡを注射した足底部からの核抽出物から、ＮＦ−κＢの活性化が約
６．４倍増加することがＥＭＳＡによって明らかとなった（図９Ｌ、それぞれレ
ーン１及び２）。ｓＲＡＧＥ、ＩＰ、１００μｇ／投与の存在下では、ビークル
、ＭＳＡ、ＩＰによる処置と比べて、ＮＦ−κＢの活性化に顕著な減少が見られ
た（図４Ｌ、それぞれレーン４及び２）。ｍＢＳＡ感作／攻撃誘発されたマウス
に抗ＲＡＧＥ／抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２を処置すると、非免疫Ｆ（ａ
ｂ’）２による処置（図９Ｌ、レーン７）と比べて、ＮＦ−κＢの活性化が約７
５％減少するのが観察された（図９Ｌ、レーン６）。総合すると、これらのデー
タは、ＥＮ−ＲＡＧＥ／ＲＡＧＥの遮断は、細胞シグナリング経路ＮＦ−κＢの
活性化を強力に弱めることを強く示唆した。
【０１４９】 ＥＮ−ＲＡＧＥによるＲＡＧＥの連結の重要な結果は、少なくとも部分的には
ＮＦ−κＢの活性化によって媒介された、炎症性媒介物質の増加した発現なので
、我々は、１００μｇのｓＲＡＧＥで処置したｍＢＳＡ感作／攻撃誘発されたマ
ウスから抽出したＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲを行い、ＩＬ−２又はＴＮＦ−ａの
うちの何れかの転写物が存在しないことを見出した（図９Ｍ、それぞれレーン５
及び２）。これに対して、ビークル、ＭＳＡ処置したマウスからの足底部では、
ＩＬ−２とＴＮＦ−ａの転写物が明瞭であった（図９Ｍ、それぞれレーン４及び
１）。
【０１５０】 ＤＴＨに供したマウスからの脾臓細胞を単離し、エクソビボで分析すると、Ｍ
ＳＡ又は非免疫Ｆ（ａｂ’）２の何れかで処置したマウスからの脾臓細胞と比較
すると、ｓＲＡＧＥ、抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２、又は抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ
（ａｂ’）２の何れかで処置したマウスから回収したそれらの脾臓細胞において
、ＰＭＡの存在下で分裂促進反応が減少するのが見られた（図３Ｂ）。
【０１５１】 総合すると、これらのデータは、遅延型過敏症でのＥＮ−ＲＡＧＥ−ＲＡＧＥ
相互作用の遮断は、細胞シグナリング経路の活性化、遺伝子発現の調節、及び炎
症性の表現型を著しく抑制することを示唆する。
【０１５２】 慢性的な炎症： Ｓ１００／カルグラニュリンポリペプチドの特徴は、それらが、ヒトの炎症性
腸疾患（Ｌｕｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａ
ｌ．，）１９９５）のような慢性的な炎症の領域に存在するということである。
ＲＡＧＥとのそれらの相互作用が、慢性的な炎症の発病において重要であり得る
という考えをテストするために、我々は、マウスの腸炎モデルである無ＩＬ−１
０マウス（Ｋｕｅｈｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｒｅｎｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ
．，１９９７）で、これらの考えをテストした。この考えをテストするために、
４週齢から開始して、ＭＳＡ又はｓＲＡＧＥの何れか、１００μｇ／日、ＩＰで
、無ＩＬ−１０マウスを６週間処置した。その時間が終了した時点で、マウスを
屠殺し、炎症の徴候について直腸Ｓ状部の腸を評価した。ＭＳＡを与えたマウス
のうち４／５では、リンパ球、マクロファージ、好酸球、及び形質細胞から構成
される粘膜下の結腸の炎症の徴候が明らかであったが、ｓＲＡＧＥで処置したマ
ウスでは、１／５がクリプトの付け根に斑の炎症を示したにすぎなかった（表３
）。これらの発見と一致して、ＥＭＳＡ用に結腸組織を調製すると、ＭＳＡを与
えたものと比べて、ｓＲＡＧＥ処置した無ＩＬ−１０マウスから回収した組織に
は、デンシトメトリー単位で平均約３．７倍の減少が観察された（ｐ＝０．０４
、図１０Ａ）。同様に、ＭＳＡを与えたマウスと比べて、ｓＲＡＧＥで処置した
マウスでは、血漿ＴＮＦ−ａのレベルに約８．７倍の減少が観察された（ｐ＝０
．００２、図１０Ｂ）。
【０１５３】 総合すると、これらのデータは、ＥＮ−ＲＡＧＥ／ＲＡＧＥ軸の阻害が、急性
及び慢性の炎症モデルで、細胞の活性化と主要な媒介物質の発現を強く抑制する
ことを示唆している。
【０１５４】
【表３】 ＜考察＞ 急性及び慢性の炎症部位にＳ１００／カルグラニュリンポリペプチドが存在す
ることは、長い間注目されてきた。実際、Ｓ１００様分子であるＭＲＰ８／１４
（骨髄球関連タンパク質）の血清レベルの評価は、長期の腸の機能不全と腫瘍形
成と関連する腸の慢性炎症性疾患である潰瘍性大腸炎患者での病気の活動を追跡
するための手段として示唆されてきた（Ｌｕｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９
９５）。Ｓ１００／カルグラニュリン分子は、カルシウム結合ＥＦハンドドメイ
ンのような、構造的な特徴となる相同性を有する（Ｓｃｈａｆｅｒ ａｎｄ Ｈ
ｅｉｚｍａｎｎ，１９９６）。これらの特性に基づいて、細胞骨格や細胞の形状
の変化、細胞のカルシウムレベルの増加を介したシグナル伝達、化学走性、食作
用、脱顆粒、及び反応性酸素種（ＲＯＩ）の生成を含む食細胞機能の調節のよう
なこれらのポリペプチドの細胞内での考えられる広範な機能が推測されてきた（
Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｏｅｔｚｌ、１９８１；Ｓｍｏｌｅｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８１；Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ，１９８４；Ｓａｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ
．，１９８５）。実際に、ＲＯＩの生成は、炎症誘導性シグナリング経路の変化
がこれらの分子によって開始されるさらに別の手段を意味しているのかもしれな
い（Ｓｃｈｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【０１５５】 ＥＮ−ＲＡＧＥ及び関連するファミリーのメンバーがシグナルペプチドを欠い
ているという事実にもかかわらず、これらのポリペプチドが、細胞外空間へ容易
にアクセスできるという十分な証拠が存在する（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，
１９８３；Ｓｈａｓｈｏｕａ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｓｃｈａｆｅｒ ａｎ
ｄ Ｈｅｉｚｍａｎｎ，１９９６）。この意味で、以前の研究は、このファミリ
ーのメンバーが、一連の炎症性の現象を媒介し得ることを示唆してきた。例えば
、ＣＰ−１０（Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ−１０；Ｓ１００ファ
ミリーのメンバー）をマウスに注入すると、誘引されたマクロファージは、スカ
ベンジャー受容体の増加、ＴＮＦ−ａの産生、アセチル化されたＬＤＬの搭載と
泡沫細胞の形成、及び食作用、並びに酸化窒素の産生の減少を示す。さらに、Ｃ
Ｐ−１０を局所足底部に注射すると、多形核白血球の強度の流入後に、混合した
単核細胞の浸潤が起こる（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｇｅｃｚｙ、１９９
６；Ｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）
。ここに示したデータはこれらの発見を拡張し、炎症部位に炎症細胞が召集され
ると、これらの分子が放出され、細胞性ＲＡＧＥにターゲッティングされるよう
であることを示唆する。このファミリーのメンバーに対する重要な受容体である
ＲＡＧＥが引きつけられると、さらなる細胞の刺激が起こり、シグナリング経路
の活性化、遺伝子発現の調節、及び炎症性現象の増幅がもたらされるかもしれな
い（図１１）。これらの考察は、ＥＮ−ＲＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用の影響をア
テローム性動脈硬化症のような慢性炎症疾患にまで拡張する（Ｒｏｓｓ，１９９
９）。
【０１５６】 確かに、炎症は、多くの初発刺激と中間の参加分子が関与する複雑なプロセス
である。しかしながら、炎症誘導性の機序は、しばしば、大部分チェックされず
に放置され、慢性的な組織の虚血、細胞死、及び順応性のない修復反応をもたら
すかもしれない。我々のデータは、炎症における新しいパラダイムを示唆する。
ＥＮ−ＲＡＧＥとＲＡＧＥとの相互作用を阻害すると、中心的なシグナリング経
路の遮断を介して、炎症反応の不可欠な増幅機構を弱め、サイトカインの発現を
もたらし得る。我々のデータは、これらの分子に対する他の受容体の関与を除外
するものではない。この意味で、さらなる研究によって、ＥＮ−ＲＡＧＥとＳ１
００Ｂ以外のＳ１００／カルグラニュリンファミリーの他の異なるメンバーが、
ＲＡＧＥと相互作用する能力を有する程度も決定しなければならない。しかしな
がら、これまでに研究された２つ、（１つはカルグラニュリンに近く（ＥＮ−Ｒ
ＡＧＥ）、他方はＳ−１００に近い（Ｓ１００Ｂ））では、ＲＡＧＥが中心的な
細胞での相互作用部位のようである。実際に、ｓＲＡＧＥ、抗ＥＮ−ＲＡＧＥ
Ｆ（ａｂ’）２、抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２、又は抗ＥＮ−ＲＡＧＥ＋抗ＥＮ
−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２の投与は、ＴＮＦ−ａやＩＬ２のような主要な炎症
媒介物質の生成を顕著に停止させ、炎症性の表現型におけるＥＮ−ＲＡＧＥ及び
関連ファミリーメンバーとＲＡＧＥの相互作用の枢要な役割を強く示唆する。本
発見は、そのユニークなリガンド群故に、ＲＡＧＥのコンテキストを、発育及び
病態生理的に関連する状態の両者に関与する細胞表面分子の免疫グロブリンスー
パーファミリーの異なるメンバーとして拡張する（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ
．，１９９８）。アムホテリンのＲＡＧＥのリガンドとしての同定（Ｒａｕｖａ
ｌａ ａｎｄ Ｐｉｈｌａｓｋａｒｉ，１９８７；Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９３；Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）は、発育する中枢神経
系（ＣＮＳ）での神経突起の成長におけるＲＡＧＥの役割を示唆した。この考え
と一致して、ニューロンのアムホテリンとＲＡＧＥの発現は、ラットＣＮＳの発
育中のニューロンで顕著に増加し、共存していた（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１
９９５）。インビトロの研究では、培養したラットの胚性ニューロンの神経突起
の成長は、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）又は抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２断片
の何れかを用いたＲＡＧＥの遮断によって、アムホテリンをコートしたマトリッ
クス上で特異的に阻害された。注目すべきことに、ＲＡＧＥが、発育中のニュー
ロン中のアムホテリンと反応して、神経突起の成長を媒介するという観察は、Ｓ
１００ファミリーの生物学と極めて一致する。Ｓ１００Ｂのような後者のグルー
プのあるメンバーは、神経突起の成長を媒介する（Ｋｌｉｇｍａｎ ａｎｄ Ｍ
ａｒｓｈａｋ，１９８５；Ｍａｒｓｈａｋ，１９９０；Ｂａｒｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２）。
【０１５７】 発育後には、ニューロンのアムホテリン及びＲＡＧＥの両者の発現は、恒常状
態では減少する（Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。しかしながら、アルツ
ハイマー病（ＡＤ）でアミロイドβペプチドが蓄積すると、脳、特に冒されたニ
ューロン及び脈管構造で、ＲＡＧＥの発現が増大する（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９６；Ｍａｃｋｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。培養ニューロンとニュー
ロン様の細胞を用いた研究は、アミロイドβペプチドとＲＡＧＥの相互作用が、
ニューロンのストレスと毒性、及びミクログリアの活性化を媒介することを示唆
する。後者は、マクロファージコロニー刺激因子の生成の増加をもたらし、我々
の推測によれば、冒された脳での局所的な炎症反応を引き起こすことにより、ニ
ューロンの毒性を悪化させる手段であるかもしれない（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９７）。アルツハイマー病のヒトの患者の脳内のアミロイドβペプチド部位
と共存するニューロン及び血管のＲＡＧＥの増大した発現は、さらに、この相互
作用がインビボで高度に関連しているかもしれないことを示唆する。ＣＮＳのニ
ューロン内でレベルとＲＡＧＥとアミロイドβペプチドが遺伝的に増大している
マウスを用いて、この相互作用の重要性を明らかにするための研究が進行中であ
る。
【０１５８】 我々は、恒常状態では、広範な細胞種でＲＡＧＥのレベルが非常に低いことを
観察した（Ｂｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ
．，１９９５ａ）。この意味は完全には明らかでないが、他の研究で、我々は、
長期にわたって（６ヶ月まで）、成体の糖尿病マウスに可溶性ＲＡＧＥを投与し
ても、有害な影響を与えないことを実証した（未発表の観察、Ｄ．Ｓｔｅｒｎ
ａｎｄ Ａ．Ｍ． Ｓｃｈｍｉｄｔ）。実際に、糖尿病の状態では、ｓＲＡＧＥ
の投与の有益な効果が見られた。
【０１５９】 糖尿病の組織では、脈管構造のような組織で、ＲＡＧＥの発現が高度にアップ
レギュレートされ、高レベルの非酵素的な糖化及び酸化産物ＡＧＥと共存してい
る（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ａ；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１
９９８）。我々は、少なくとも部分的に、衰弱化する結果を与えるこの疾患での
長期にわたる血管、神経、及び炎症細胞の併発症（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ
．，１９９３；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗａｕｔｉｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ｂ；Ｗａｕｔ
ｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６；
Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の基礎には、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作
用、及び引き続き起こる慢性的な細胞の擾乱が存在すると仮定している。これと
一致して、ｓＲＡＧＥを糖尿病の齧歯類に投与すると、血管の透過性の亢進を覆
し、加速されたアテローム性動脈硬化症を抑圧する（Ｗａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１６０】 これらの観察に基づき、ＥＮ−ＲＡＧＥが、糖尿病や腎不全からアルツハイマ
ー病にわたる疾患に由来する炎症現象及び細胞の機能不全に寄与する程度は、例
えば、一連の興味深い問題を提起する。さらなる研究は、トランスジェニックマ
ウスモデルでこのような可能性を与えるであろう。
【０１６１】 我々の本発見は、このように、ＲＡＧＥが、そのリガンドが蓄積する状態下に
おいて重要な分子であるという考えを敷衍する。ＮＦ−κＢ、ＮＦ−Ｉｌ−６、
ｇ−ＩＲＥ、Ｓｐ１、ＡＰ２などのような、宿主の表現型を変え得る様々な転写
因子に対する複数の潜在的なＤＮＡ結合部位が存在するＲＡＧＥプロモーターの
特徴が同定され（Ｌｉ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ
．，１９９８）、ＲＡＧＥが、異なる多数の環境シグナルに応答する多用途の遺
伝子であることを強く示唆する。さらに、主要組織適合遺伝子複合体内の第６染
色体にヒトのＲＡＧＥをコードする遺伝子が位置するということは、ＲＡＧＥが
、発育から病態生理的に重要な疾患に至る宿主の応答に関与していることを示唆
している（Ｓｕｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
【０１６２】 総合すると、ＥＮ−ＲＡＧＥ及びＥＮ−ＲＡＧＥ様分子をＲＡＧＥのリガンド
として同定したことは、このように、Ｓ１００／カルグラニュリンポリペプチド
と免疫グロブリンスーパーファミリー分子であるＲＡＧＥの生物学的な関連性を
規定する。ＥＮ−ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ、及びそれらの相互作用の遮断が細胞の活
性化を効果的に停止するという我々の実証は、過度の炎症反応を和らげることに
より、組織の傷害を制限するようにデザインされた抗炎症戦略に対する新しい、
根本的な標的としてこれらの媒介物質を同定する。
【０１６３】
【参照文献】
【０１６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒト腎臓（活性型ループス腎炎）の免疫組織化学 活性型ループス腎炎の患者からの腎組織を取得して、ホルマリンで固定し、パラ
フィンに包埋された切片を調製した。切片はウサギ抗ＲＡＧＥ ＩｇＧで染色し
た。糸球体の有足突起において、ＲＡＧＥの発現の増加が見られた。
【図２】 ＨＵＶＥＣｓをＥＮ−ＲＡＧＥとインキュベートすると、細胞表面のＶＣＡＭ
−１が増加する 内皮細胞増殖因子を加えずに、無血清ＲＰＭＩ １６４０中でヒト臍静脈内皮細
胞を２４時間培養した後、ＥＮ−ＲＡＧＥ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
両者とも１０μｇ／ｍｌ、で刺激した。表記されている場合には、ウサギ抗ヒト
ＲＡＧＥ ＩｇＧ、非免疫ウサギＩｇＧで細胞を前処理された。ある場合には、
ＥＮ−ＲＡＧＥは、ＥＮ−ＲＡＧＥによる刺激の前に、表記の濃度の可溶性ＲＡ
ＧＥ（ｓＲＡＧＥ）で２時間前処理した。ＥＮ−ＲＡＧＥで８時間刺激した後、
上述のように細胞を固定された。抗ＶＣＡＭ−１ ＩｇＧを使用した細胞表面Ｅ
ＬＩＣＡを行った。統計学的考察は図中に示されている。
【図３】 ＨＵＶＥＣｓをＥＮ−ＲＡＧＥとインキュベートすると、ＶＣＡＭ−１の機能
的活性：Ｍｏｌｔ−４細胞の増加した結合を増加させる 機能的ＶＣＡＭ−１活性の評価は、上述のように、５１Ｃｒで標識されたＭｏｌ
ｔ−４細胞（ＡＴＣＣ）を用いて決定した。ＨＵＶＥＣは、ＢＳＡ（１０μｇ／
ｍＬ）又はＥＮ−ＲＡＧＥ（５μｇ／ｍＬ）の何れかで８時間処理した。５１Ｃ
ｒ（０．１ｍＣｉ）を含むＲＰＭＩ中で、Ｍｏｌｔ−４細胞（５ｘ１０７／ｍＬ
）を２時間インキュベートした。その時間の最後に、ＰＢＳで細胞を洗浄した後
、処理されたＨＵＶＥＣの単層に１時間添加した。結合していないＭｏｌｔ−４
細胞は、ＰＢＳで３回洗浄することによって除去した。続いて、放射能を含有す
るＭｏｌｔ−４細胞を放出するために、ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（２％）を含
有するバッファー中で細胞を溶解した。統計学的考察は図中に示されている。
【図４】 遅延型過敏症モデル：溶解性ＲＡＧＥの存在下での炎症の抑制。 ＣＦ−１マウスをｍＢＳＡで感作した。；３週間後、ｍＢＳＡを後足底部中に注
入した。あるマウスは、表記の濃度のマウス血清アルブミン、ｓＲＡＧＥ、又は
ＲＡＧＥ若しくはＥＮ−ＲＡＧＥの表記のＦ（ａｂ’）２抗体断片で処置した。
炎症スコアは上記（スケール；１−９）のように定義した。
【図５】ウシＥＮ−ＲＡＧＥの核酸配列 ウシＥＮ−ＲＡＧＥのｃＤＮＡをクローニングし、受付番号ＡＦ０１１７５７で
Ｇｅｎｂａｎｋに寄託した。配列（５’から３’）は、図５に示されている。
【図６−１】 ＥＮ−ＲＡＧＥの発現は刺激された炎症細胞中で増加する（Ａ−Ｂ）；ＥＮ−
ＲＡＧＥはＲＡＧＥを結合する（Ｃ−Ｄ） （パネルＡ）ＥＮ−ＲＡＧＥの発現は、刺激されたＰＢＭＣｓ中、及びＪｕｒｋ
ａｔ細胞中で増大されるが、ＨＵＶＥＣ中では増大されない。；標準中の末梢血
単核細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６細胞、又はＨＵＶＥＣは、単独で、又は表記の刺
激の存在下で１２時間培養された。ＰＢＭＣ及びＪｕｒｋａｔ Ｅ６細胞をＰＭ
Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）／イオノマイシン（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、ＨＵＶ
ＥＣはＴＮＦ−ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理した。１２時間のインキュベーショ
ンの最後に、細胞溶解産物を調製し、ウサギ抗ＥＮ−ＲＡＧＥ ＩｇＧ（２μｇ
／ｍＬ）を用いて、上述のように、電気泳動／イムノブロッティングを行った。
１次抗体の部位は、ウサギＩｇＧに対するペルオキシダーゼ結合抗体とＥＣＬ検
出システムを用いて可視化した。分子量マーカーは、示されているように、同時
に流した。濃度分析の結果が示されている。本実験は２回繰り返され、類似の結
果を得た。
【図６−２】 （パネルＢ）マウスへのＬＰＳの注入は、ＥＮ−ＲＡＧＥの血漿への生成をも
たらす。：ｓＲＡＧＥの存在下、又は非存在下で（１００μｇ；ＬＰＳの注入前
１２時間、及び１時間前に投与された）、腹腔内投与によって３０μｇ／ｋｇ体
重のＬＰＳをＢａｌｂ／ｃマウスに注入した。表記の時点で、血液を回収し、Ｅ
Ｎ−ＲＡＧＥのために、上記のように抗−ＥＮ−ＲＡＧＥ ＩｇＧ（２μｇ／ｍ
Ｌ）を用いて、血漿を電気泳動／イムノプロッティングにかけた。濃度分析の結
果が示されている。本実験は２回繰り返され、類似の結果を得た。
【図６−３】 （パネルＣ−Ｄ） ＥＮ−ＲＡＧＥは、精製ＲＡＧＥ（Ｃ）とＢＡＥＣｓ（Ｄ
）を結合する。：Ｃでは、ヒト可溶性ＲＡＧＥはプラスティック皿のウェル上に
固定化され、Ｄでは、集密したＢＡＥＣｓは組織培養処理されたウェル上に培養
された。放射性リガンド結合アッセイは、過剰な非標識ＥＮ−ＲＡＧＥ（５０倍
）の存在下又は非存在下で、表記の濃度の１２５−Ｉ ＥＮ−ＲＡＧＥを用いて
行った。Ｃでは、Ｋｄ＝約９１±２９ｎＭ、且つキャパシティー＝約２１±２．
９ｆｍｏｌｅｓ／ウェルでの、精製されたＲＡＧＥへの特異的な結合が示されて
いる。Ｄでは、Ｋｄ＝約９０．３±３４ｎＭ、且つキャパシティー＝約１６３±
２６．２ｆｍｏｌｅｓ／ウェルでの、ＢＡＥＣｓへの特異的な結合が示されてい
る。表記されている場合には、結合アッセイの前に、表記の量の過剰なｓＲＡＧ
Ｅとともに、放射線標識されたＥＮ−ＲＡＧＥ（１００ｎＭ）を２時間培養する
か、又は、結合アッセイの前に、表記の濃度のウサギ非免疫ＩｇＧ、若しくはポ
リクローナル単一特異的ウサギ抗−ＥＮ−ＲＡＧＥ ＩｇＧ、若しくは抗−ＲＡ
ＧＥ ＩｇＧとともに、ウェルを２時間プレインキュベートし、結果は、平均値
の％最大特異的結合±ＳＤとして報告された。これらの実験は少なくとも５回行
い、類似の結果を得た。
【図６−４】 （パネルＣ−Ｄ） ＥＮ−ＲＡＧＥは、精製ＲＡＧＥ（Ｃ）とＢＡＥＣｓ（Ｄ
）を結合する。：Ｃでは、ヒト可溶性ＲＡＧＥはプラスティック皿のウェル上に
固定化され、Ｄでは、集密したＢＡＥＣｓは組織培養処理されたウェル上に培養
された。放射性リガンド結合アッセイは、過剰な非標識ＥＮ−ＲＡＧＥ（５０倍
）の存在下又は非存在下で、表記の濃度の１２５−Ｉ ＥＮ−ＲＡＧＥを用いて
行った。Ｃでは、Ｋｄ＝約９１±２９ｎＭ、且つキャパシティー＝約２１±２．
９ｆｍｏｌｅｓ／ウェルでの、精製されたＲＡＧＥへの特異的な結合が示されて
いる。Ｄでは、Ｋｄ＝約９０．３±３４ｎＭ、且つキャパシティー＝約１６３±
２６．２ｆｍｏｌｅｓ／ウェルでの、ＢＡＥＣｓへの特異的な結合が示されてい
る。表記されている場合には、結合アッセイの前に、表記の量の過剰なｓＲＡＧ
Ｅとともに、放射線標識されたＥＮ−ＲＡＧＥ（１００ｎＭ）を２時間培養する
か、又は、結合アッセイの前に、表記の濃度のウサギ非免疫ＩｇＧ、若しくはポ
リクローナル単一特異的ウサギ抗−ＥＮ−ＲＡＧＥ ＩｇＧ、若しくは抗−ＲＡ
ＧＥ ＩｇＧとともに、ウェルを２時間プレインキュベートし、結果は、平均値
の％最大特異的結合±ＳＤとして報告された。これらの実験は少なくとも５回行
い、類似の結果を得た。
【図７−１】 ＲＡＧＥのＥＮ−ＲＡＧＥとＳ１００Ｂによる連結は細胞の活性化をもたらす
。内皮細胞（Ａ−Ｄ、Ｈ）。 （パネルＡ）ＶＣＡＭ−１のための細胞表面ＥＬＩＳＡ：非免疫ＩｇＧ、抗Ｒ
ＡＧＥ ＩｇＧ、又は過剰の可溶性ＲＡＧＥのいずれかとの２時間の前処理の存
在下、もしくは非存在下で、表記の伝達物質存在下において、８時間３７℃でＨ
ＵＶＥＣを培養した。その後、細胞を固定し、抗ＶＣＡＭ−１ ＩｇＧ（４μｇ
／ｍＬ）を用いて、ＶＣＡＭ−１のための細胞表面ＥＬＩＳＡを行った。
【図７−２】 （パネルＢ）Ｍｏｌｔ−４接着アッセイ：表記の媒介物質の存在下で８時間Ｈ
ＵＶＥＣを培養した。ＥＮ−ＲＡＧＥに対して、様々な濃度（左のパネル）とイ
ンキュベーション時間（中央のパネル）を使用した。インキュベーション後、５ １ −クロム標識したＭｏｌｔ−４細胞を１時間単層に結合させた。その時間の最
後に、培養液中で細胞を洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１％）存在下で崩
壊させた；得られた物質をベータカウンター中で計数した。右のパネルでは、表
記のＦ（ａｂ’）２、過剰なｓＲＡＧＥ、又は過剰なＢＳＡとの前処理（２時間
）の存在下又は非存在下で、ＥＮ−ＲＡＧＥ ５μｇ／ｍｌによってＨＵＶＥＣ
を処理した。結果は、上記コントロールに対する増加倍数として報告した（ＢＳ
Ａによる細胞の処理、１０μｇ／ｍＬ）。Ａ−Ｂでは、結果は、平均値±平均値
のＳＤとして報告されている。実験は、少なくとも３回実施した。
【図７−３】 （パネルＣ）電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：表記の媒介物質で
ＨＵＶＥＣを８時間処理した。ある場合には、抗ＲＡＧＥ ＩｇＧで細胞を前処
理し、別の場合には、過剰のｓＲＡＧＥでＥＮ−ＲＡＧＥを前処理した（２時間
）。あるＨＵＶＥＣは、ＥＮ−ＲＡＧＥでの処理の前に、細胞質ドメインが欠失
した形態のヒトＲＡＧＥをコードする構築物で、又は対照としてベクターのみ（
ｐｃＤＮＡ３）で一過性にトランスフェクトされた。核抽出物を調製し、下記の
ようにＥＭＳＡを実施した。スーパーシフトアッセイは、ＥＭＳＡの前に、核抽
出物を表記の抗体（２μｇ／ｍＬ）と４５分間インキュベートすることによって
実施した。濃度分析の結果が挿入図中に示されている。本実験は２回繰り返し、
類似の結果を得た。
【図７−４】 単核食細胞（ＭＰｓ）（パネルＤ−Ｅ） （パネルＤ）改変された化学走性アッセイ：改変された化学走性アッセイを記
述のごとく実施した。示されているように、上方又は下方のチャンバーに、媒介
物質を配置し、Ｍｏｌｔ−４細胞（これは細胞表面ＲＡＧＥを含む）３７℃で４
時間。膜を通して移動した細胞を染色し、９つの高倍率野中で計数した。表記さ
れている場合には（右のパネル）、表記のＦ（ａｂ’）２断片で細胞を前処理し
、又は、化学走性アッセイの前に、過剰のｓＲＡＧＥとともにＥＮ−ＲＡＧＥを
２時間インキュベートした。平均値±平均値のＳＤが示される。各実験は２回行
った。；各ケースにおいて、条件につき６回の繰り返しを使用した。
【図７−５】 （パネルＥ）ＩＬ−１β及びＴＮＦ−ａの生成：ＲＡＧＥの細胞質ドメインが
欠失したｃＤＮＡをコードする構築物でトランスフェクションされたＢＶ−２マ
クロファージ、又は疑似トランスフェクトされた細胞（ベクターのみ）の何れか
を、８時間３７℃で表記の媒介物質と培養した。その時間の最後に、上清を集め
、ＩＬ−１βとＴＮＦ−ａのうちの何れかのためのＥＬＩＳＡを実施した。結果
はＢＳＡのみとインキュベートした細胞と比較した、誘導倍数として示されてい
る。３つの実験の平均値±平均値のＳＤが示されている。 ＰＢＭＣおよびＪｕｒｋａｔ細胞（パネルＦ−Ｇ） （パネルＦ）有糸分裂誘導アッセイ。：記載したように、全血からＰＢＭＣを
単離し、組織培養ウェル中に接種した。ＰＨＡ−Ｐでの刺激の前に、表記の濃度
のＥＮ−ＲＡＧＥで１２時間細胞を処理した。続いて、３Ｈ−チミジンでウェル
をパルスし、採集及び液体シンチレーション計測のためのプロセシングの前に、
さらに１８時間インキュベートした。ある場合には、非免疫又は抗−ＲＡＧＥ
ＩｇＧで細胞を前処理するか、又は過剰のｓＲＡＧＥでＥＮ−ＲＡＧＥを前処理
した。
【図７−６】 （パネルＧ）ＩＬ−２の生成：表記の媒介物質とともに、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６
細胞を８時間インキュベートした；上清を集め、ＩＬ−２のためのＥＬＩＳＡを
行った。表記されている場合には、表記のＩｇＧで細胞を前処理するか、又は過
剰のｓＲＡＧＥでＥＮ−ＲＡＧＥを前処理した。結果は（ＢＳＡのみとの細胞の
インキュベーションと比較した）誘導倍数として報告されている。Ｆ−Ｇでは、
少なくとも２つの実験の平均値±ＳＤが報告されている。
【図７−７】 （パネルＨ）Ｓ１００Ｂ、ＲＡＧＥを介してＨＵＶＥＣ中のＮＦ−ｋＢを活性
化する：表記の媒介物質で、８時間ＨＵＶＥＣを処理した。抗体又はｓＲＡＧＥ
での前処理及びＥＭＳＡは、（Ｃ）で上記したように実施した。
【図７−８】 電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す図である。
【図８−１】 ＥＮ−ＲＡＧＥはｉｎ ｖｉｖｏで細胞の活性化を媒介する。 （パネルＡ）肺でのＶＣＡＭ−１の発現：尾静脈からＣＦ−１マウスにＥＮ−
ＲＡＧＥ（３０μｇ）、ＢＳＡ（３０μｇ）、又はＬＰＳ（５００μｇ）を静注
した。１２時間後、素早く肺を回収し、以下に記載されているように、イムノブ
ロッティングのために抽出物を調製した。電気泳動およびイムノブロッティング
は、抗ＶＣＡＭ−１ ＩｇＧ（０．４μｇ／ｍＬ）を用いて、記述されたように
行った。濃度分析が示されている。本実験は２回繰り返し、類似の結果を得た。
【図８−２】 （パネルＢ）有糸分裂誘導アッセイ：遅延型過敏症（下記参照）であるマウス
から脾臓細胞を回収し、記載されているように、ＰＭＡに対する反応をエクソビ
ボで調べた。各条件下において、ｎ＝５、平均値±ＳＤが示されている。
【図９−１】 ＥＮ−ＲＡＧＥ／ＲＡＧＥの遮断は、遅延型過敏症（ＤＴＨ）のモデルにおい
て急性炎症を抑制する：臨床的及び組織学的なスコア（Ａ−Ｋ） （パネルＡ）炎症スコア：ＣＦ−１マウスを、記載したように、メチル化された
ＢＳＡ（ｍＢＳＡ）で感作し（左鼡径部）、攻撃誘発した（左後脚）。表記され
ている場合には、ｓＲＡＧＥ、マウス血清アルブミン、免疫されたＦ（ａｂ’） ２ 断片、もしくは非免疫のＦ（ａｂ’）２断片を腹腔内注射することによって、
ｍＢＳＡでの局所攻撃誘発の２４及び１２時間前、並びに６及び１２時間後にマ
ウスを前処理した。ｍＢＳＡを足底部へ注入してから２４時間後に、記載したよ
うに、２人の盲検調査者によって、足底部の臨床的及び組織学的スコアが実施さ
れた。Ａでは、スコア（最大９、炎症なし＝２）は、臨床的および組織学的スコ
アの合計として定義されている。：臨床的スコア：１＝炎症が存在しない（処理
されていない右の足底部と同一である）；２＝軽度の発赤及び浮腫；３＝中等度
の発赤及び皮膚の皺を伴った浮腫；４＝重度の発赤及び皮膚の皺のない浮腫。；
５＝重度の発赤及び過剰な浮腫による足指の広がりをともなった浮腫。組織学的
スコア（Ｈ＆Ｅの研究に従って）：１＝白血球の浸潤なし及び皮下の浮腫なし。
；２＝軽度の皮下浮腫を伴った、軽度の脈管周囲の白血球の浸潤。；３＝肉芽腫
なしの重度の白血球の浸潤。４＝肉芽腫を伴った重度の白血球の浸潤。これらの
実験において、ｎ＝５／群であり、平均値±平均値のＳＤが報告されている。
【図９−２】 （パネルＢ−Ｅ）臨床分析：ＢＳＡで感作／攻撃誘発された代表的なマウスが
示されるている：Ｂ＝ＭＳＡで処理したもの；Ｃ＝投与当たり１００μｇ ＩＰ
のｓＲＡＧＥで処理したもの；Ｄ＝投与当たり２００μｇ ＩＰの抗ＥＮ−ＲＡ
ＧＥ Ｆ（ａｂ’）２で処理したもの；Ｅ＝投与当たり２００μｇ ＩＰの抗Ｒ
ＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２で処理したもの；
【図９−３】 （パネルＦ−Ｋ）Ｈ＆Ｅ分析：ｍＢＳＡで感作／攻撃されたマウスから得た代
表的な足底部のＨ＆Ｅ分析が示されている：Ｆ＝ＭＳＡで処理したもの；Ｇ＝反
対側の足底部、ＤＴＨなし。Ｈ＝投与当たり１００μｇ ＩＰのｓＲＡＧＥで処
理したもの；Ｉ＝投与当たり２００μｇのＩＰで抗ＥＮ−ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’
）２；Ｊ＝投与当たり２００μｇ ＩＰの抗ＲＡＧＥ Ｆ （ａｂ’）２；Ｋ＝
投与当たり２００μｇ ＩＰで抗ＥＮ−ＲＡＧＥ＋抗ＲＡＧＥ Ｆ（ａｂ’）２ 。スケールバー＝ｘｘｘμｍ。
【図９−４】 （パネルＬ）ＥＭＳＡ：プールされていた後足底部（ｎ＝３／条件）から核抽
出物を調製し、ＥＭＳＡを実施した。濃度分析の結果が示されている。
【図９−５】 （パネルＭ）ＩＬ−２及びＴＮＦ−ａのためのＲＴ−ＰＣＲ：ＲＴ−ＰＣＲは
、図中に示されているように、後足底部から調製されたＲＮＡから行い、ＴＮＦ
−ａ（レーン１及び２）のプライマー、又はＩＬ−２（レーン４及び５）、又は
βアクチンを用いて行った。塩基対マーカーが示されている。レーン３は陰性対
照（ＰＣＲ中にＤＮＡを加えていない）を示す。
【図１０−１】 ＥＮ−ＲＡＧＥ／ＲＡＧＥの遮断は無ＩＬ−１０マウスにおいて慢性結腸炎症
を抑制する （パネルＡ）ＥＭＳＡ：核抽出物は、ｓＲＡＧＥ（レーン１−６）又はＭＳＡ
（レーン７−１２）の何れかで処理されたマウスの直腸Ｓ状結腸組織から調製し
た。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓを用いて
、濃度分析を実施した。ＭＳＡ処理（ｎ＝６）対ｓＲＡＧＥ処理マウスの平均デ
ンシトメトリーピクセルユニットは、７，１２１．８±５，３５９．６対１．９
９１±１，１５５ユニットであった；ｐ＝０．０４。
【図１０−２】 （Ｂ）血漿ＴＮＦ−ａの評価：屠殺直前に、無ＩＬ−１０マウスから血漿を回収
し、無細胞上清を得るために８００ｒｐｍで１０分間の遠心にかけた。ＴＮＦ−
ａのためのＥＬＩＳＡは、製造業者の使用説明書に従って、本検体を用いて行っ
た。ＭＳＡ（ｎ＝６）対ｓＲＡＧＥ処理マウス（ｎ＝６）の平均値は１９０．５
±８９．０対２１．９±６３．６ｐｇ／ｍｌであった；ｐ＝０．００２。
【図１１】 炎症反応の増幅はＥＮ−ＲＡＧＥ−ＲＡＧＥ軸によって媒介された 我々は、免疫／炎症刺激の部位への召集時に、炎症細胞がＥＮ−ＲＡＧＥ及び
ＥＮ−ＲＡＧＥ様 Ｓ１００／カルグラニュリン分子を放出すると仮定する。続
いて、これらの分子は、エンドセリン、ＭＰｓ、及びリンパ球のような細胞上で
細胞性ＲＡＧＥを連結し、それによって、接着分子及びサイトカインのような炎
症の鍵となる媒介物質の生成によって炎症反応を増幅し得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｙ ４Ｂ０６５ 45/00 ４Ｃ０８４ 48/00 ４Ｃ０８５ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８６ 48/00 9/00 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 3/10 9/10 9/00 13/12 9/10 25/28 13/12 29/00 25/28 37/08 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/08 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/00 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/00 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュミット、アン・マリー アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07417 フランクリン・レイクス、ハブ ン・ロード 242 (72)発明者 スターン、デビッド アメリカ合衆国、ニューヨーク州 11020 グレート・ネック、タナーズ・ロード 63 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CB01 CB21 DA36 DA77 FB01 FB02 4B024 AA01 AA11 AA13 BA44 CA01 CA04 HA11 4B050 CC03 CC10 DD11 LL01 LL03 4B063 QA05 QA06 QA07 QQ42 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR56 QS32 QS34 QX01 4B064 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 DA15 4B065 AA87Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 AA27 BA01 BA02 BA05 BA08 BA09 BA10 BA34 BA37 BA38 BA41 BA43 BA44 CA04 CA05 CA18 CA20 CA23 CA53 CA56 CA59 DC50 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA35 MA37 MA43 MA47 MA52 MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZA162 ZA362 ZA452 ZA812 ZB112 ZB132 ZC352 ZC422 4C085 AA14 AA15 AA16 BB11 BB36 BB43 FF24 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA18 MA01 MA05 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA35 MA37 MA43 MA47 MA52 MA56 MA57 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZA16 ZA36 ZA45 ZA81 ZB11 ZB13 ZC80 4H045 AA10 AA11 BA10 BA70 BA71 CA40 EA20 EA52

Claims (69)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたヒトＥＮ−ＲＡＧＥペプチド。
  2. 【請求項２】 表１に示されたＮ末端アミノ酸配列を有する単離されたＥＮ
    −ＲＡＧＥペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のタンパク質であって、前記ペプチドはＧｅ
    ｎｂａｎｋ受付番号ＡＦ０１１７５７のｃＤＮＡ配列によってコードされるタン
    パク質。
  4. 【請求項４】 ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドをコードしている単離された核酸分
    子。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載の核酸分子であって、前記ＥＮ−ＲＡＧＥペ
    プチドはヒトＥＮ−ＲＡＧＥである核酸分子
  6. 【請求項６】 請求項４に記載の核酸分子であって、前記核酸は、ＤＮＡ、
    ｃＤＮＡ、又はＲＮＡである核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項４に記載の核酸分子であって、前記核酸配列は図５に
    示されている配列（配列番号１）である核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項４に記載の核酸分子を含む複製可能なベクター。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の複製可能なベクターであって、前記ベクタ
    ーは原核生物の発現ベクター、酵母発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクタ
    ー、又は哺乳類発現ベクターであるベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載のベクターを含んだ宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、
    真核細胞、体細胞、又は生殖細胞である細胞。
  12. 【請求項１２】 請求項６に記載の核酸分子であって、検出可能な部分で標
    識される核酸分子。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の核酸分子であって、前記検出可能な部
    分は、蛍光標識、ジゴキシゲニン、ビオチン、酵素、放射活性原子、常磁性イオ
    ン、および化学発光標識からなる群から選択される核酸分子。
  14. 【請求項１４】 ３’から５’方向のＥＮ−ＲＡＧＥ核酸配列のユニークな
    断片から実質的になる核酸分子であって、前記配列が、天然のＥＮ−ＲＡＧＥペ
    プチドをコードする遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸分
    子。
  15. 【請求項１５】 ＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又はその断片と薬学的に許容され
    る担体を含む組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の組成物であって、前記薬学的に許容さ
    れる担体は、エアロゾル、静脈内、経口、又は局所用の担体である組成物。
  17. 【請求項１７】 ＥＮ−ＲＡＧＥのユニークな配列を含むエピトープと免疫
    的に反応する抗体。
  18. 【請求項１８】 細胞中でＥＮ−ＲＡＧＥ ｍＲＮＡを特異的に切断できる
    リボザイム。
  19. 【請求項１９】 トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その生殖細胞
    又は体細胞が、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又は生物学的に活性なその変種をコード
    し、胚段階で前記哺乳類又はその先祖に導入された核酸分子を含有するトランス
    ジェニック非ヒト哺乳類。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類であ
    って、前記ＥＮ−ＲＡＧＥポリペプチドをコードする核酸分子は、哺乳類の細胞
    中で過剰発現されるトランスジェニック非ヒト哺乳類。
  21. 【請求項２１】 請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類であ
    って、前記核酸分子はヒトＥＮ−ＲＡＧＥペプチドをコードするトランスジェニ
    ック非ヒト哺乳類。
  22. 【請求項２２】 請求項１９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類であ
    って、前記活性な変種はＥＮ−ＲＡＧＥの相同体を包含するトランスジェニック
    非ヒト哺乳類。
  23. 【請求項２３】 トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その生殖細胞
    又は体細胞が、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドの発現レベルが天然の哺乳類のＥＮ−Ｒ
    ＡＧＥペプチドの発現レベル以下に減少するようにデザインされた適切な配列を
    有する適切なベクターでトランスフェクトされたトランスジェニック非ヒト哺乳
    類。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類であ
    って、前記適切なベクターは、相同的組換えを可能にするための適切なクローニ
    ングされたゲノム核酸分子を含有するトランスジェニック非ヒト哺乳類。
  25. 【請求項２５】 請求項２３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類であ
    って、前記適切なベクターはＥＮ−ＲＡＧＥ ｍＲＮＡ分子、又は天然のＥＮ−
    ＲＡＧＥ ｍＲＮＡ配列に対してアンチセンスな配列を含むアンチセンス分子を
    切断できるリボザイムをコードするトランスジェニック非ヒト哺乳類。
  26. 【請求項２６】 ある化合物がＥＮ−ＲＡＧＥペプチドのＲＡＧＥペプチド
    との相互作用を阻害し得るかどうかを決定する方法であって： （ａ）（ｉ）ＲＡＧＥペプチド、若しくはｓＲＡＧＥペプチド、又はそれらの
    うちの何れかの断片と、 （ｉｉ）ＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又はその断片と、 （ｉｉｉ）前記化合物とを混合することと； （ｂ）工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドとの相互
    作用のレベルを測定することと； （ｃ）工程（ｂ）で測定された相互作用の量と、前記化合物の非存在下におい
    て工程（ａ）（ｉ）のペプチドと工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドとの間で測定さ
    れた量とを比較することにより、前記化合物が、ＥＮ−ＲＡＧＥペプチドとＲＡ
    ＧＥペプチドとの相互作用を阻害できるかどうかを決定することとを備え、 前記化合物の存在下での相互作用の量の減少が、前記化合物が前記相互作用を
    阻害できることの指標となる方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の方法であって、前記工程（ａ）（ｉ）
    の断片はＲＡＧＥのＶドメインである方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２６に記載の方法であって、前記工程（ａ）（ｉ）
    又は（ａ）（ｉｉ）の断片は合成品である方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は、天然に
    存在するｓＲＡＧＥペプチドの一部分を含む方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は、ペプチ
    ド模倣体である方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は有機分子
    である方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は、ペプチ
    ド、核酸、あるいは無機化合物である方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は１０，０
    ００ダルトン未満の分子である方法。
  34. 【請求項３４】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は抗体又は
    その断片である方法。
  35. 【請求項３５】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は変異され
    たＲＡＧＥペプチド又はその断片である方法。
  36. 【請求項３６】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は変異され
    たｓＲＡＧＥペプチド又はその断片である方法。
  37. 【請求項３７】 請求項２６に記載の方法であって、前記化合物は変異され
    たＥＮ−ＲＡＧＥペプチド又はその断片である方法。
  38. 【請求項３８】 請求項２６に記載の方法であって、工程（ａ）（ｉ）のペ
    プチドが固体表面に固定される方法。
  39. 【請求項３９】 請求項２６に記載の方法であって、工程（ａ）（ｉｉ）の
    ペプチドが固体表面に付着される方法。
  40. 【請求項４０】 請求項２６に記載の方法であって、工程（ａ）（ｉ）又は
    工程（ａ）（ｉｉ）のペプチドは検出可能に標識される方法。
  41. 【請求項４１】 請求項４０に記載の方法であって、前記検出可能な標識は
    蛍光、ビオチン、又は放射能を包含する方法。
  42. 【請求項４２】 請求項２６に記載の方法であって、前記混合は細胞内で起
    きる方法。
  43. 【請求項４３】 請求項２６に記載の方法であって、前記混合は動物内で起
    きる方法。
  44. 【請求項４４】 請求項２６に記載の方法によって同定された化合物であっ
    て、患者の炎症の抑制に有用である化合物。
  45. 【請求項４５】 請求項２６に記載の方法によって同定された化合物であっ
    て、患者の全身性エリテマトーデス又は炎症性ループス腎炎の治療に有用な化合
    物。
  46. 【請求項４６】 請求項２６に記載の方法によって同定された化合物であっ
    て、以前には未知であった化合物。
  47. 【請求項４７】 患者の炎症を阻害する方法であって、前記患者においてＥ
    Ｎ−ＲＡＧＥペプチドと後生的糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）との相互作用を
    妨害することができ、それによって前記患者の炎症を阻害し得る化合物を前記患
    者に投与することを含む方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は抗ＥＮ−
    ＲＡＧＥ抗体若しくはその断片、又は抗ＲＡＧＥ抗体若しくはその断片である方
    法。
  49. 【請求項４９】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物はｓＲＡＧ
    Ｅペプチドであるである方法。
  50. 【請求項５０】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は、実質的
    に、ｓＲＡＧＥペプチドのリガンド結合ドメイン又はＥＮ−ＲＡＧＥペプチドの
    リガンド結合ドメインからなる方法。
  51. 【請求項５１】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は核酸分子
    またはペプチドである方法。
  52. 【請求項５２】 請求項５１に記載の方法であって、前記ペプチドは抗体、
    あるいはその断片である方法。
  53. 【請求項５３】 請求項５１に記載の方法であって、前記核酸分子は、リボ
    ザイム、又はアンチセンス核酸分子である方法。
  54. 【請求項５４】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は、請求項
    ２６のスクリーニング法によって同定された化合物である方法。
  55. 【請求項５５】 請求項４７に記載の方法であって、前記炎症は、遅延型過
    敏症、加速されたアテローム性動脈硬化症、又はループス腎炎を伴う方法。
  56. 【請求項５６】 請求項４７に記載の方法であって、前記患者は、ヒト、類
    人猿、マウス、ラット、又はイヌである方法。
  57. 【請求項５７】 請求項４７に記載の方法であって、前記投与は、病変内、
    腹腔内、筋肉内又は静脈内注射；注入；リポソームを介した送達；又は局所、莢
    膜内、歯肉ポケット、経直腸、気管支内、鼻、口、眼、又は耳からの送達を含む
    方法。
  58. 【請求項５８】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物は、毎時間
    、毎日、毎週、毎月、又は毎年ごとに投与される方法。
  59. 【請求項５９】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物の有効量は
    、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む方法。
  60. 【請求項６０】 請求項４７に記載の方法であって、前記患者は、全身性エ
    リテマトーデス、炎症性ループス腎炎、敗血性ショック又は内毒素血症に罹患し
    ている方法。
  61. 【請求項６１】 請求項４７に記載の方法であって、前記患者は炎症に罹患
    している方法。
  62. 【請求項６２】 請求項４７に記載の方法であって、前記化合物を投与する
    間に、前記患者に薬学的に許容される担体を投与することをさらに備える方法。
  63. 【請求項６３】 請求項６２に記載の方法であって、前記担体は希釈剤を含
    む方法。
  64. 【請求項６４】 請求項６２に記載の方法であって、前記担体は、ウイルス
    、リポソーム、ミクロカプセル、ポリマーに封入した細胞、又はレトロウイルス
    ベクターを含む方法。
  65. 【請求項６５】 請求項６２に記載の方法であって、前記担体は、エアロゾ
    ル、静脈内、経口、又は局所担体である方法。
  66. 【請求項６６】 請求項６２に記載の方法であって、前記化合物は、経時放
    出インプラントから投与される方法。
  67. 【請求項６７】 請求項４７に記載の方法であって、前記患者は、ＥＮ−Ｒ
    ＡＧＥを含有する炎症細胞の召集が起こる自己免疫又は炎症性疾患に罹患してい
    る方法。
  68. 【請求項６８】 請求項４７に記載の方法であって、前記患者は、細菌が関
    連した、又は他の病原体が関連した感染症に罹患している方法。
  69. 【請求項６９】 ある化合物が、ＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質の第２のタンパ
    ク質に結合する能力を阻害できるかどうかを決定する方法であって： （ａ）ＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質、前記第２のタンパク質、及び前記化合物を
    混合することと； （ｂ）前記ＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質と前記第２のタンパク質との結合量を測
    定することと； （ｃ）工程（ｂ）で測定された結合量を、前記化合物の非存在下におけるＥＮ
    −ＲＡＧＥと前記第２のタンパク質との結合量と比較することを備え、結合量の
    減少が、前記化合物がＥＮ−ＲＡＧＥタンパク質の前記第２のタンパク質に結合
    する能力を阻害できることの指標となる方法。
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7258857B2 (en) 1996-11-22 2007-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods for treating inflammation
US6790443B2 (en) * 1996-11-22 2004-09-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for treating symptoms of diabetes
US6528640B1 (en) * 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6482932B1 (en) * 1997-11-05 2002-11-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides
US6617438B1 (en) * 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6465422B1 (en) * 1998-04-17 2002-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject
JP2002526117A (ja) * 1998-10-06 2002-08-20 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 細胞外新規ｒａｇｅ結合タンパク質（ｅｎ−ｒａｇｅ）及びその使用
US6303321B1 (en) 1999-02-11 2001-10-16 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods for diagnosing sepsis
US6613801B2 (en) 2000-05-30 2003-09-02 Transtech Pharma, Inc. Method for the synthesis of compounds of formula I and their uses thereof
US6908741B1 (en) 2000-05-30 2005-06-21 Transtech Pharma, Inc. Methods to identify compounds that modulate RAGE
AU2002213192A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A method for inhibiting new tissue growth in blood vessels in a patient subjected to blood vessel injury
WO2002070473A2 (en) 2001-03-05 2002-09-12 Transtech Pharma, Inc. Carboxamide derivatives as therapeutic agents
AU2002245590B2 (en) 2001-03-05 2006-06-29 Transtech Pharma, Inc. Benzimidazole derivatives as therapeutic agents
US7304034B2 (en) 2001-05-15 2007-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
US20030175713A1 (en) * 2002-02-15 2003-09-18 Clemens Sorg Method for diagnosis of inflammatory diseases using CALGRANULIN C
CN101597262A (zh) 2002-03-05 2009-12-09 特兰斯泰克制药公司 抑制配体与高级糖化终产物受体相互作用的单和双环吡咯衍生物
BR0313491A (pt) * 2002-08-16 2007-08-14 Wyeth Corp composições e métodos para tratar distúrbios associados ao rage
ATE411038T1 (de) 2003-03-28 2008-10-15 Univ Laval S100 protein als aktivator neutrophiler zellen zur verminderung der neutropenie bei der krebsbehandlung
WO2004100890A2 (en) 2003-05-09 2004-11-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage g82s-related methods and compositions for treating inflammatory disorders
US7696169B2 (en) 2003-06-06 2010-04-13 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
JP4792392B2 (ja) 2003-09-11 2011-10-12 コーナーストーン セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｍｇｂ１に対するモノクローナル抗体
WO2006012415A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
JP5188804B2 (ja) 2004-08-03 2013-04-24 トランステック ファーマ，インコーポレイティド Ｒａｇｅ融合タンパク質及びその使用方法
CA2575830A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
CA2601630A1 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage/diaphanous interaction and related compositions and methods
WO2006119510A2 (en) * 2005-05-04 2006-11-09 Receptor Biologix, Inc. Isoforms of receptor for advanced glycation end products (rage) and methods of identifying and using same
RU2431804C2 (ru) * 2005-12-23 2011-10-20 ДжиКоудер Системз АБ Шаблон позиционирования
CA2638907A1 (en) * 2006-02-09 2007-08-23 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
CA2651348A1 (en) 2006-05-05 2007-11-15 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof
WO2008100470A2 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins
US20100254983A1 (en) * 2007-06-07 2010-10-07 Ann Marie Schmidt Uses of rage antagonists for treating obesity and related diseases
KR101595634B1 (ko) 2007-06-14 2016-02-18 갈락티카 파마슈티칼스, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질
CA2702533A1 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Erac As Edta resistant s100a12 complexes (erac)
WO2009143411A2 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Siwa Corporation Methods, compositions and apparatus for facilitating regeneration
US9034341B2 (en) 2009-04-20 2015-05-19 Transtech Pharma, Llc Control of RAGE fusion protein glycosylation and RAGE fusion protein compositions
TWI517850B (zh) 2009-09-30 2016-01-21 Ｖｔｖ治療有限責任公司 經取代之咪唑衍生物及其使用方法
US8431575B2 (en) 2010-02-18 2013-04-30 Transtech Pharma, Inc. Phenyl-heteroaryl derivatives and methods of use thereof
WO2011146479A1 (en) * 2010-05-18 2011-11-24 The Texas A&M University System Method and composition for the diagnosis and monitoring of inflammatory diseases
US9649376B2 (en) 2010-09-27 2017-05-16 Siwa Corporation Selective removal of age-modified cells for treatment of atherosclerosis
US8721571B2 (en) 2010-11-22 2014-05-13 Siwa Corporation Selective removal of cells having accumulated agents
US9678084B2 (en) * 2011-06-04 2017-06-13 Rochester General Hospital Research Institute Compositions and methods related to S100A12
WO2013103688A1 (en) * 2012-01-03 2013-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human soluble receptors for advanced glycation end products (srage), methods of preparing human srage, and treatment methods using srage
US9717710B2 (en) 2012-10-05 2017-08-01 Vtv Therapeutics Llc Treatment of mild and moderate Alzheimer's disease
CA2961603C (en) 2014-09-19 2021-07-13 Siwa Corporation Anti-age antibodies for treating inflammation and auto-immune disorders
US9993535B2 (en) 2014-12-18 2018-06-12 Siwa Corporation Method and composition for treating sarcopenia
US10358502B2 (en) 2014-12-18 2019-07-23 Siwa Corporation Product and method for treating sarcopenia
CN109071675A (zh) 2016-02-19 2018-12-21 Siwa有限公司 使用高级糖化终产物(age)的抗体治疗癌症、杀死转移性癌细胞和预防癌症转移的方法和组合物
KR20180133452A (ko) 2016-04-15 2018-12-14 시와 코퍼레이션 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 항-노화 항체
WO2017222535A1 (en) 2016-06-23 2017-12-28 Siwa Corporation Vaccines for use in treating various diseases and disorders
US11267854B2 (en) 2016-07-20 2022-03-08 Westfaelische Wilhelms-Universitaet Muenster Complex-specific standardization of immunological methods for the quantification of S100A12
US10925937B1 (en) 2017-01-06 2021-02-23 Siwa Corporation Vaccines for use in treating juvenile disorders associated with inflammation
US10995151B1 (en) 2017-01-06 2021-05-04 Siwa Corporation Methods and compositions for treating disease-related cachexia
US10858449B1 (en) 2017-01-06 2020-12-08 Siwa Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
US10961321B1 (en) 2017-01-06 2021-03-30 Siwa Corporation Methods and compositions for treating pain associated with inflammation
JP2020516648A (ja) 2017-04-13 2020-06-11 シワ コーポレーション ヒト化モノクローナル終末糖化産物抗体
US11518801B1 (en) 2017-12-22 2022-12-06 Siwa Corporation Methods and compositions for treating diabetes and diabetic complications

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0731166A3 (en) * 1995-03-06 1997-12-29 Tonen Corporation Novel calcium-binding proteins
US5976832A (en) * 1995-03-06 1999-11-02 Tonen Corporation DNA encoding novel calcium-binding proteins
US5864018A (en) * 1996-04-16 1999-01-26 Schering Aktiengesellschaft Antibodies to advanced glycosylation end-product receptor polypeptides and uses therefor
US5688653A (en) * 1996-06-27 1997-11-18 The Picower Institute For Medical Research 3-alkylamino-2-hydroxy-4-hydroxymethyl-2-cyclopenten-1-one advanced glycosylation endproducts and methods of use therefor
US7258857B2 (en) * 1996-11-22 2007-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods for treating inflammation
US6790443B2 (en) * 1996-11-22 2004-09-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for treating symptoms of diabetes
US7081241B1 (en) * 1998-10-06 2006-07-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Extracellular rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof
US6555651B2 (en) * 1997-10-09 2003-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Ligand binding site of rage and uses thereof
US7101838B2 (en) * 1997-08-05 2006-09-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to prevent accelerated atherosclerosis using (sRAGE) soluble receptor for advanced glycation endproducts
US6465422B1 (en) * 1998-04-17 2002-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject
US6753150B2 (en) * 1998-10-05 2004-06-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for determining whether a compound is capable of inhibiting the interaction of a peptide with rage
JP2002526117A (ja) * 1998-10-06 2002-08-20 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 細胞外新規ｒａｇｅ結合タンパク質（ｅｎ−ｒａｇｅ）及びその使用
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
AU6766800A (en) * 1999-08-13 2001-03-13 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Methods of inhibiting binding of beta-sheet fibril to rage and consequences thereof
US20050170382A1 (en) * 1999-10-06 2005-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York. RAGE-related compositions
US6825164B1 (en) * 2000-08-14 2004-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to increase cerebral blood flow in amyloid angiopathy
US6563015B1 (en) * 2000-08-14 2003-05-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof
AU2002213192A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A method for inhibiting new tissue growth in blood vessels in a patient subjected to blood vessel injury
WO2004100890A2 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage g82s-related methods and compositions for treating inflammatory disorders
WO2005023191A2 (en) * 2003-09-05 2005-03-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods and compositions for treating glomerular injury
US20080260717A1 (en) * 2003-10-31 2008-10-23 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for Reducing Seizure-Induced Neuronal Damage
US20070167360A1 (en) * 2003-10-31 2007-07-19 Yan Shi D Methods for treating multiple sclerosis
CA2575830A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
CA2601630A1 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage/diaphanous interaction and related compositions and methods
US20080207499A1 (en) * 2005-06-29 2008-08-28 Gaetano Barile Rage-related methods for treating and preventing diabetic retinopathy
US20100254983A1 (en) * 2007-06-07 2010-10-07 Ann Marie Schmidt Uses of rage antagonists for treating obesity and related diseases

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CA2346217A1 (en) 2000-04-13

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