JP2001269183A - 肝臓機能調節剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規肝臓機能調節剤のＤＮＡの提供。 【解決手段】配列番号：１、配列番号：２、配列番号：
３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質またはそれの塩を含有してなる肝臓機能調節剤、該
肝臓機能調節剤のスクリーニング方法など。 【効果】本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたは
それらの塩は、肝臓機能調節作用を有しており、肝機能
不全症、肝炎、肝癌または肝硬変などの疾病の予防・治
療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な肝臓機能調
節剤などに関する。

【０００２】

【従来の技術】肝臓は我々の全身のエネルギーの代謝を
調節する上で中心的な役割を担う生命維持に不可欠の臓
器であり、非常に多彩な機能を有している。肝臓の主な
生体機能として例えば、貯蔵・循環機能、分解・排出機
能、代謝機能（各種栄養素［糖質、タンパク質、脂質、
ビタミン、ホルモン等］の処理）、保護・解毒機能及び
血液学的機能などがあるが、そのいずれかが障害を受け
ると、過労感、倦怠感、食欲不振、黄胆や微熱を始めと
する肝機能障害特有の諸症状があらわれることとなる。
さらに、肝硬変、ウイルス肝炎、劇症肝炎、肝癌等の重
篤な肝疾患が、これといった有効な治療法が確立される
ことなく現在に至っている。一方で、肝臓は生体内で最
も高度に分化した、かつ再生能の高い臓器である（Cel
l, 96, 235-244(1999））。肝臓には代謝や合成を司る
肝実質細胞と、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞や血管内皮細胞、Ｉ
ｔｏ細胞などの様々な非実質細胞から構成されている。
なかでも中心的な役割を担っている肝実質細胞は生体内
において各種ホルモンにより制御を受けており、ある環
境下においては極めて旺盛な増殖を示すことが知られて
いる（Science, 276, 60-65 (1997)）。例えば、ラ
ットの肝を７０％切除した場合、１０日間前後でほぼ元
の重量まで回復することが知られており、またヒトでも
肝癌患者等において、部分肝切除とその後の再生による
治療法が行われている。このため、肝再生に関しては古
くからその再生機構に興味が持たれ、細胞生物学の重要
な課題であったのみならず、各種肝疾患に対する治療法
確立のため、注目されてきた問題でもある。事実、肝実
質細胞の増殖による肝再生機構については従来数多くの
研究が行われ、複数の候補となる肝実質細胞増殖因子が
報告されてきた（Molecular Medicine, 34, 544-553
(1997)）。

【０００３】現在、肝再生を促進する因子としては、Ｈ
ＧＦ，ＴＧＦα，ＥＧＦ，ＨＢ-ＥＧＦ，ＴＮＦα，Ｉ
Ｌ-６等が知られている。ＨＧＦは肝実質細胞を除く全
身の様々な細胞で産生されるが、肝切除を行うことによ
り肝臓を含む多数の臓器の細胞からのＨＧＦの産生が増
加し、血中HGF濃度が上昇し肝実質細胞の増殖に関与し
ていると考えられている（FASEB J., 9, 1527-1536 (19
95)）。ＴＧＦαはＥＧＦファミリーに属する因子であ
るが、肝実質細胞で産生され、オートクリン因子として
作用するといわれている（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 86, 1558-1562 (1989)）。一方でＥＧＦはin vitro
で肝細胞の増殖を非常に強く促進する因子として古くか
ら知られていたが、肝臓では発現しないと考えられるこ
とから、実際の肝再生にどれくらい関与しているかは意
見の分かれるところである（FASEBJ., 9, 1527-1536 (1
995)）。またＨＢ-ＥＧＦは、肝細胞に対し非常に強力
な増殖促進作用を示すことから最近注目されている分子
である（Biochem. Bophys. Res. Commun.,198, 25-31
(1994)）。

【０００４】しかしながら、最近の研究成果から、肝再
生のいちばん最初の引き金を引くのはＨＧＦ等の増殖因
子ではなく、細胞分裂には関与しないものの、Ｇ０期か
らＧ１期への細胞周期の移行を促す因子であることが明
らかとなってきた（Progressin Cell Cycle Researc
h, 2, 37-47 (1996)）。これを便宜上プライミング
因子と呼んでいる。肝実質細胞を肝臓から分離、培養す
ることですでにＧ１期への移行が起こるため、上記の増
殖因子は試験管内での肝実質細胞の増殖を強力に促進す
ることができる。しかしながら正常動物ではこの移行を
促す因子が発現、あるいは活性化しない限り増殖因子を
投与しても肝実質細胞の増殖は誘導できない。現在、こ
のＧ０期からＧ１期への移行期に関与する因子の同定が
進められているところである。Posthepatectomy factor
（PHF）/NF-κB、AP-1、あるいはSTAT3を含む転写因子
の活性化がDNA合成の前に起こることが示されており、
肝再生時において重要な役割を演じていると考えられて
いる。これら転写因子の活性化を誘導する因子がすなわ
ちプライミング因子と考えられるが、その候補としてTN
Fα、IL-6が挙がっている。これらのサイトカインがNF-
κB，STAT3など転写因子の活性化に関与すること、また
TNFαレセプターあるいはIL-6のノックアウトマウスで
は肝切除後の肝再生が非常に悪く、NF-κB，STAT3など
の活性化が抑制されていること、さらにこの様な個体に
IL-6を投与することによって肝再生が可能になること等
が報告されており（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,
1441-1446 (1997)、Science, 274, 1379-1383, (199
6)）、プライミング因子としての強い根拠となってい
る。しかしながら、これらの因子が実際の肝再生の場に
実際にどれくらい関与するかについては意見の分かれる
ところである。それを明確に示した研究は未だなされて
いない。特にＴＮＦαは肝再生に関与することが示唆さ
れる一方で、肝障害機構にも深く関与しているものと考
えられるため（Hepatology, 29, 1-4, (1999); J.
Immunol., 153, 1778-1788 (1994)）、本来の生理
的な意義については未定である。またこれらの治療薬と
しての有効性についても不明である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、肝
再生に有効な活性を有する新たな因子を見出し、またそ
の因子が肝細胞に対しては副作用（例えば細胞死誘導等
の重篤な作用など）を示さないものであれば、ヒトを含
めた哺乳類の肝機能を正常な状態に調節することができ
ると考えられる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＴＮＦフ
ァミリーに属するリガンド分子であるＴＬ４（ＷＯ９８
／０３６４８号）が予想外にも正常ヒト肝実質細胞のDN
A合成能を促進する作用を有することを見出し、かつ他
のTNFファミリーリガンド分子で顕著に認められる、ア
クチノマイシンDとの併用による細胞死誘導活性がＴＬ
４には認められない事実を突き止めた。さらに研究を進
めることにより、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、（１）配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：３１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を含
有してなる肝臓機能調節剤、（２）配列番号：１、配列
番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５４〜５９番
目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１
１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜
１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２
番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、
第２１５〜２１９番目および第２２８〜２４０番目のア
ミノ酸配列を有するアミノ酸配列である上記（１）記載
の剤、（３）上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチ
ドまたはその塩を含有してなる肝臓機能調節剤、（４）
上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドが配列番
号：１で表されるアミノ酸配列の第８４〜２４０番目の
アミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなるペプチドで
ある上記（３）記載の剤、（５）上記（１）記載のタン
パク質または上記（３）記載の部分ペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡを含有して
なる肝臓機能調節剤、（６）ＤＮＡが配列番号：４〜配
列番号：１０のいずれかの配列番号または配列番号：３
０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡである上記
（５）記載の剤、（７）上記（１）記載のタンパク質も
しくは上記（３）記載の部分ペプチドまたはそれらの塩
に対する抗体を含有してなる肝臓機能調節剤、（８）
上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の
部分ペプチドまたはその塩、上記（５）記載のＤＮ
Ａ、または上記（７）記載の抗体を用いることを特徴
とする肝臓機能調節剤のスクリーニング方法、（９）上
記（８）記載のスクリーニング方法を用いて得られる化
合物またはその塩を含有してなる肝臓機能調節剤、（１
０）肝臓機能促進剤である上記（１）、上記（３）、上
記（５）、上記（７）または上記（９）記載の剤、（１
１）肝臓再生剤である上記（１）、上記（３）、上記
（５）、上記（７）または上記（９）記載の剤、（１
２）Ｇ０期からＧ１期への細胞周期の移行促進作用を有
する上記（１）、上記（３）、上記（５）、上記（７）
または上記（９）記載の剤、（１３）配列番号：３１で
表されるアミノ酸配列を含有してなるタンパク質または
その塩、（１４）上記（１３）記載のタンパク質をコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（１
５）配列番号：３０で表される塩基配列を有する上記
（１４）記載のＤＮＡ、（１６）上記（１５）記載のＤ
ＮＡを含有する組換えベクター、（１７）上記（１６）
記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１８）上記（１７）記載の形質転換体を培養し、上記
（１３）記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とする上記（１３）記載のタンパク
質またはその塩の製造法、（１９）上記（１３）記載の
タンパク質またはその塩に対する抗体、（２０）上記
（１４）記載のＤＮＡまたは上記（１９）記載の抗体を
含有してなる診断剤、（２１）上記（１４）記載のＤＮ
Ａに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、該
ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンスＤ
ＮＡ、（２２）上記（１３）記載のタンパク質またはそ
の塩を用いることを特徴とする上記（１３）記載のタン
パク質またはその塩の活性を促進または阻害する化合物
またはその塩のスクリーニング方法、（２３）上記（１
３）記載のタンパク質またはその塩を含有してなる上記
（１３）記載のタンパク質またはその塩の活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キ
ット、（２４）上記（２２）記載のスクリーニング方法
または上記（２３）記載のスクリーニング用キットを用
いて得られうる上記（１３）記載のタンパク質またはそ
の塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２５）上記（２４）記載の化合物またはその塩を含有
してなる医薬組成物、および（２６）肝臓機能調節剤で
ある上記（２５）記載の医薬組成物などを提供する。

【０００８】さらには、本発明は、（２７）（ｉ）肝細
胞に、上記（１）記載のタンパク質、上記（３）記載の
部分ペプチドまたはそれらの塩を接触させた場合と、
（ii）肝細胞または肝臓組識に、上記（１）記載のタン
パク質、上記（３）記載の部分ペプチドまたはそれらの
塩および試験化合物を接触させた場合において、該肝細
胞のＤＮＡ合成能を測定し、比較することを特徴とする
上記（８）記載のスクリーニング方法、（２８）肝細胞
が肝実質細胞である上記（２７）記載のスクリーニング
方法、（２９）上記（２８）記載のスクリーニング方法
を用いて得られる肝臓機能調節作用を有する化合物また
はその塩、（３０）肝機能不全症、肝癌、肝炎（ウイル
ス肝炎、劇症肝炎など）または肝硬変の予防・治療剤で
ある上記（２４）または上記（２８）記載の化合物また
はその塩、および（３１）肝臓再生剤である上記（２
４）または上記（２８）記載の化合物またはその塩など
に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の肝臓機能調節剤に含有さ
れるタンパク質（以下、本発明のタンパク質と称する場
合がある）は、配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
る。本発明のタンパク質は、例えば、ヒトや温血動物
（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウ
サギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど）のあらゆ
る細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓
β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス
細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊
維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファ
ージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜
細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細
胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆
細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）、またはそれらの
細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、嗅球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下
部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸、十二指
腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立
腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに
由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク
質であってもよい。

【００１０】本発明のタンパク質としては、例えば、Ｗ
Ｏ ９８／０３６４８号公報およびＷＯ ９７／３４９１
１号公報に記載のタンパク質などがあげられる。さらに
本発明のタンパク質としては、例えば、J. Clin. Inves
t., 102, 1142-1151 (1998)や米国特許第5,874,240号に
記載のレセプター蛋白質に対するリガンド活性を有する
タンパク質（ポリペプチド）なども含まれる。配列番
号：１、配列番号：２、配列番号：３と実質的に同一の
アミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約４
０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８
０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好まし
くは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが
挙げられる。特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列のうち第８４番目〜第２４０番目のアミノ酸配列、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列のうち第８２番
目〜第２３９番目のアミノ酸配列または配列番号：３で
表わされるアミノ酸配列のうち第８２番目〜第２３９番
目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以
上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約
９０％以上の相同性を有する場合が好ましい。

【００１１】また、配列番号：１、配列番号：２または
配列番号：３と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
構成アミノ酸として、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第９３〜
１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６
番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、
第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８
４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２
１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸配列を
有するアミノ酸配列なども好ましい。これらのアミノ酸
配列は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列および配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列に共通するアミノ酸配列であ
る。また、配列番号：１または配列番号：２と実質的に
同一のアミノ酸配列としては、構成アミノ酸として、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番
目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９
〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３
４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番
目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第
１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２
２８〜２４０番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列
なども好ましい。これらのアミノ酸配列は、配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５２
〜５７番目、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番
目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第
１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１
２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３９
番目のアミノ酸配列に対応し、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列に共通するアミノ酸配列である。

【００１２】さらに、配列番号：３１と実質的に同一の
アミノ酸配列としては、構成アミノ酸として、配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、
第５７〜６６番目、第７３〜８０番目、第８２〜９０番
目、第９２〜９８番目、第１０８〜１１１番目、第１２
６〜１３４番目、第１４０〜１４６番目、第１４８〜１
５３番目、第１５７〜１７７番目、第１７９〜１８３番
目および第１９２〜２０４番目のアミノ酸配列を有する
アミノ酸配列などがあげられる。配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：３１で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
る本発明のタンパク質としては、上記のとおり配列番
号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：
３１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタ
ンパク質などが好ましい。実質的に同質の活性として
は、例えば、肝機能調節作用（例、肝細胞維持作用、肝
細胞死抑制作用、肝臓機能促進作用など）、より具体的
には、肝臓再生作用（好ましくは、肝実質細胞増殖作
用）など、さらに具体的には、 Ｇ０期からＧ１期への
細胞周期（好ましくは、肝細胞の細胞周期）の移行促進
作用などの活性が挙げられる。実質的に同質とは、それ
らの活性が性質的（例、生理化学的または薬理学的）に
同質であることを示す。したがって、肝機能調節作用
（例、肝細胞維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機能促
進作用など）、より具体的には、肝臓再生作用（好まし
くは、肝実質細胞増殖作用）など、さらに具体的には、
Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好ましくは、肝細胞
の細胞周期）の移行促進作用などの活性が同等（例、約
０．０１〜２０倍、好ましくは約０．２〜５倍、より好
ましくは約０.５〜２倍）であることが好ましいが、こ
れらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素
は異なっていてもよい。

【００１３】肝機能調節作用（例、肝細胞維持作用、肝
細胞死抑制作用、肝臓機能促進作用など）、より具体的
には、肝臓再生作用（好ましくは、肝実質細胞増殖作
用）など、さらに具体的には、 Ｇ０期からＧ１期への
細胞周期（好ましくは、肝細胞の細胞周期）の移行促進
作用などの活性は、自体公知の方法あるいはそれに準じ
る方法（例えば、目加田英輔、三宅康子、岡田善雄；癌
と化学療法、４、４０７(１９７７)などに記載の方法）
や例えば、後述するスクリーニング方法で記載されてい
る方法などを用いて測定することができる。また、本発
明のタンパク質には、配列番号：１、配列番号：２、
配列番号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好ま
しくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、
さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠
失したアミノ酸配列、配列番号：１、配列番号：２、
配列番号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ
酸配列に１または２個以上（例えば１〜８０個、好まし
くは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が付加
したアミノ酸配列、配列番号：１、配列番号：２、配
列番号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸
配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好まし
くは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などの
いわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ酸配
列が欠失または置換されている場合、その欠失または置
換の位置としては、特に限定されないが、例えば、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番
目、第５５〜５９番目（または第５４〜５９番目）、第
９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜
１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９
番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、
第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１
５〜２１９番目または第２２８〜２３９番目（または第
２２８〜２４０番目）のアミノ酸配列以外の位置、好ま
しくは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第９
３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１
２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番
目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第
１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５
〜２１９番目または第２２８〜２４０番目のアミノ酸配
列以外の位置、配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列の第６〜１９番目、第５３〜５７番目（または第５２
〜５７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４
番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、
第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７
６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２
１２番目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３
８番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列
以外の位置、好ましくは、配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列の第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番
目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第
１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１
２番目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３９
番目のアミノ酸配列以外の位置、配列番号：３で表わ
されるアミノ酸配列の第６〜１９番目、５３〜５７番目
（または第５２〜５７番目）、第９１〜１００番目、第
１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６
〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７
０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番
目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目また
は第２２７〜２３８番目（または第２２７〜２３９番
目）のアミノ酸配列以外の位置、好ましくは、配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列の第９１〜１００番
目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第
１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２
〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８
９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目
または第２２７〜２３９番目のアミノ酸配列以外の位
置、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第８
〜２１番目、第５７〜６６番目、第７３〜８０番目、第
８２〜９０番目、第９２〜９８番目、第１０８〜１１１
番目、第１２６〜１３４番目、第１４０〜１４６番目、
第１４８〜１５３番目、第１５７〜１７７番目、第１７
９〜１８３番目および第１９２〜２０４番目のアミノ酸
配列以外の位置などが挙げられる。

【００１４】さらには、配列番号：１、配列番号：２ま
たは配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するタンパク質として具体的に
は、一般式、 Met Glu Xaa Ser Val Val Xaa Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Xaa Arg Leu Xaa Xaa Xaa His Arg Arg Xaa Xaa 20 25 30 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Leu Xaa Leu Leu Leu Xaa Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Xaa Gln Gly Trp Phe Leu Leu Xaa Leu His Xaa Arg 50 55 60 Leu Gly Xaa Xaa Vla Xaa Xaa Leu Pro Asp Gly Xaa Xaa Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Xaa Leu Ile Gln Xaa Xaa Arg Ser His Xaa Xaa Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Xaa Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Xaa Tyr 115 120 125 His Asp Gly Ala Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr 130 135 140 Ser Lys Val Gln Leu Xaa Gly Val Gly Cys Pro Xaa Gly Leu Ala Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro 165 170 175 Glu Xaa Leu Glu Leu Leu Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala 180 185 190 Xaa Xaa Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val 195 200 205 Val His Leu Glu Ala Gly Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Arg Leu Val Arg Xaa Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe 225 230 235 240 Met Val （Ｉ） 〔式中、Ｘａａは任意のアミノ酸残基または結合手を示
す〕で表わされるアミノ酸配列〔配列番号：２５で表わ
されるアミノ酸配列〕を有するタンパク質なども好まし
く用いられる。

【００１５】また、上記の一般式（Ｉ）において、１個
または２個以上（例えば１〜５６、好ましくは１〜４０
個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜
９個、最も好ましくは数（１〜５）個）の位置でＸａａ
が欠失していてもよい。Ｘａａで示されるアミノ酸とし
ては、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸のいずれでもよ
く、また、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性アミノ
酸のいずれでもよい。具体的には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅ
ｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈ
ｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどが用
いられる。一般式（Ｉ）中、第３番目のＸａａとして
は、Ｇｌｕが好ましく、あるいは欠失していてもよい。
第７番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。第
２２番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＴｈｒまたはＡｒｇが好適である。第
２５番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＧｌｙまたはＧｌｕが好適である。第
２６番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。第
２７番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第
３１番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。第
３２番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＡｒｇが好適である。第
３４番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＧｌｙが好適である。第
３５番目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈ
ｒが好適である。第３６番目のＸａａとしては、例え
ば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｌａま
たはＶａｌが好適である。第３７番目のＸａａとして
は、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、
ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。第３９番目のＸａａ
としては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的
には、ＧｌｙまたはＳｅｒが好適である。第４１番目の
Ｘａａとしては、例えば、ＧｌｙまたはＡｌａが好適で
ある。第４３番目のＸａａとしては、例えば、疎水性ア
ミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＶａｌが
好適である。第４７番目のＸａａとしては、Ｍｅｔが好
ましく、あるいは欠失していてもよい。第５３番目のＸ
ａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好適であ
る。第６０番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミ
ノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好
適である。第６３番目のＸａａとしては、例えば、Ｔｒ
ｐまたはＧｌｎが好適である。第６７番目のＸａａとし
ては、例えば、酸性アミノ酸が好ましく、具体的には、
ＧｌｕまたはＡｓｐが好適である。第６８番目のＸａａ
としては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的
には、ＭｅｔまたはＩｌｅが好適である。第７０番目の
Ｘａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＡｌａが好適で
ある。第７１番目のＸａａとしては、例えば、塩基性ア
ミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＨｉｓが
好適である。第７６番目のＸａａとしては、例えば、Ｐ
ｒｏまたはＧｌｙが好適である。第７７番目のＸａａと
しては、例えば、ＡｌａまたはＬｙｓが好適である。第
８２番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が
好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＬｙｓが好適であ
る。第８６番目のＸａａとしては、例えば、酸性アミノ
酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＡｓｐが好適
である。第８７番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎ
が好適である。第９１番目のＸａａとしては、例えば、
親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌｕまたは
Ｇｌｎが好適である。第９２番目のＸａａとしては、例
えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｖａｌ
またはＡｌａが好適である。第１０３番目のＸａａとし
ては、例えば、ＳｅｒまたはＡｌａが好適である。第１
０６番目のＸａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＩｌ
ｅが好適である。第１０８番目のＸａａとしては、例え
ば、ＳｅｒまたはＩｌｅが好適である。第１１７番目の
Ｘａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、
具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。第１２
７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好
ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＴｈｒが好適であ
る。第１３５番目のＸａａとしては、例えば、Ｖａｌま
たはＴｈｒが好適である。第１３６番目のＸａａとして
は、例えば、ＴｈｒまたはＭｅｔが好適である。第１３
７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好
ましく、具体的には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適であ
る。第１３８番目のＸａａとしては、例えば、疎水性ア
ミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｌａまたはＰｒｏが
好適である。第１４３番目のＸａａとしては、例えば、
疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｉｌｅまたは
Ｖａｌが好適である。第１５０番目のＸａａとしては、
例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌ
ｙまたはＳｅｒが好適である。第１５６番目のＸａａと
しては、例えば、ＬｅｕまたはＧｌｎが好適である。第
１６０番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適で
ある。第１６１番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＴｈｒまたはＧｌｙ
が好適である。第１６２番目のＸａａとしては、Ｌｅｕ
が好ましく、あるいは欠失していてもよい。第１６３番
目のＸａａとしては、Ｐｒｏが好ましく、あるいは欠失
していてもよい。第１７３番目のＸａａとしては、例え
ば、ＰｒｏまたはＳｅｒが好適である。第１７８番目の
Ｘａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、
具体的には、ＧｌｕまたはＬｙｓが好適である。第１８
５番目および１８６番目のＸａａとしては、例えば、親
水性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡ
ｒｇが好適である。第１９３番目のＸａａとしては、Ｔ
ｈｒが好ましく、あるいは欠失していてもよい。第１９
４番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好
ましく、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適であ
る。第２１６番目のＸａａとしては、例えば、親水性ア
ミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｙｓまたはＧｌｕが
好適である。第２２２番目のＸａａとしては、例えば、
疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｌｅｕまたは
Ｐｒｏが好適である。第２２３番目のＸａａとしては、
例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｓ
ｐまたはＧｌｙが好適である。第２２４番目のＸａａと
しては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的に
は、ＧｌｕまたはＡｓｎが好適である。第２２９番目の
Ｘａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、
具体的には、ＬｅｕまたはＰｒｏが好適である。

【００１６】また、配列番号：３１で表されるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質として具体的には、一般式、 Met Glu Xaa Ser Val Val Xaa Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Xaa Arg Leu Xaa Xaa Xaa His Arg Arg Xaa Xaa 20 25 30 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Gly Xaa Xaa Gly Ser Trp Glu Xaa Leu Ile 35 40 45 Gln Xaa Xaa Arg Ser His Xaa Xaa Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 50 55 60 Ala Asn Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 65 70 75 80 Xaa Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Xaa Tyr His Asp Gly Ala 85 90 95 Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Ser Lys Val Gln 100 105 110 Leu Xaa Gly Val Gly Cys Pro Xaa Gly Leu Ala Xaa Xaa Ile Thr His 115 120 125 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro Glu Xaa Leu Glu Leu Leu 130 135 140 Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala Xaa Xaa Ser Ser Arg Val 145 150 155 160 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 165 170 175 Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa Arg Leu Val Arg Xaa Arg 180 185 190 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val （II） 195 200 204 〔式中、Ｘａａは任意のアミノ酸残基または結合手を示
す〕で表わされるアミノ酸配列〔配列番号：４７で表わ
されるアミノ酸配列〕を有するタンパク質なども好まし
く用いられる。

【００１７】また、上記の一般式（II）において、１個
または２個以上（例えば１〜４０個、好ましくは１〜２
０個、より好ましくは１〜９個、最も好ましくは数（１
〜５）個）の位置でＸａａが欠失していてもよい。Ｘａ
ａで示されるアミノ酸としては、親水性アミノ酸、疎水
性アミノ酸のいずれでもよく、また、酸性アミノ酸、塩
基性アミノ酸、中性アミノ酸のいずれでもよい。具体的
には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒ
ｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどが用いられる。一般式（II）
中、第３番目のＸａａとしては、Ｇｌｕが好ましく、あ
るいは欠失していてもよい。第７番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｒｇま
たはＧｌｎが好適である。第２２番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｔｈｒま
たはＡｒｇが好適である。第２５番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌｙま
たはＧｌｕが好適である。第２６番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｒｇま
たはＧｌｎが好適である。第２７番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｓｅｒま
たはＡｓｎが好適である。第３１番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌｎま
たはＡｒｇが好適である。第３２番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｓｅｒま
たはＡｒｇが好適である。第３４番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｓｅｒま
たはＧｌｙが好適である。第３５番目のＸａａとして
は、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好適である。第３６
番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ま
しく、具体的には、ＡｌａまたはＶａｌが好適である。
第３７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適で
ある。第４０番目のＸａａとしては、例えば、Ｐｒｏま
たはＧｌｙが好適である。第４１番目のＸａａとして
は、例えば、ＡｌａまたはＬｙｓが好適である。第４６
番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ま
しく、具体的には、ＧｌｎまたはＬｙｓが好適である。
第５０番目のＸａａとしては、例えば、酸性アミノ酸が
好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＡｓｐが好適であ
る。第５１番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミ
ノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好
適である。第５５番目のＸａａとしては、例えば、親水
性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＧｌ
ｎが好適である。第５６番目のＸａａとしては、例え
ば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｖａｌま
たはＡｌａが好適である。第６７番目のＸａａとして
は、例えば、ＳｅｒまたはＡｌａが好適である。第７０
番目のＸａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＩｌｅが
好適である。第７２番目のＸａａとしては、例えば、Ｓ
ｅｒまたはＩｌｅが好適である。第８１番目のＸａａと
しては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的に
は、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。第９１番目のＸ
ａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具
体的には、ＳｅｒまたはＴｈｒが好適である。第９９番
目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好
適である。第１００番目のＸａａとしては、例えば、Ｔ
ｈｒまたはＭｅｔが好適である。第１０１番目のＸａａ
としては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的
には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適である。第１０２番目
のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＡｌａまたはＰｒｏが好適である。第
１０７番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＩｌｅまたはＶａｌが好適で
ある。第１１４番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｙまたはＳｅｒ
が好適である。第１２０番目のＸａａとしては、例え
ば、ＬｅｕまたはＧｌｎが好適である。第１２４番目の
Ｘａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、
具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第１２
５番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好
ましく、具体的には、ＴｈｒまたはＧｌｙが好適であ
る。第１３５番目のＸａａとしては、Ｐｒｏが好まし
く、あるいは欠失していてもよい。第１４０番目のＸａ
ａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体
的には、ＧｌｕまたはＬｙｓが好適である。第１４７番
目および１４８番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇ
が好適である。第１５５番目のＸａａとしては、Ｔｈｒ
が好ましく、あるいは欠失していてもよい。第１５６番
目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第
１７８番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適で
ある。第１８４番目のＸａａとしては、例えば、疎水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＰｒｏ
が好適である。第１８５番目のＸａａとしては、例え
ば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｓｐま
たはＧｌｙが好適である。第１８６番目のＸａａとして
は、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、
ＧｌｕまたはＡｓｎが好適である。第１９１番目のＸａ
ａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体
的には、ＬｅｕまたはＰｒｏが好適である。

【００１８】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステ
ル基のＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロ
ピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6ア
ルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルな
どのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−
ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、
フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくは
α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキ
ル基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステル
として汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用い
られる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシ
ル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カ
ルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも
のも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステ
ルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用
いられる。

【００１９】さらに、本発明のタンパク質には、上記し
たタンパク質において、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ
基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ
_1-6アルカノイルなどのＣ_1-6アシル基など）で保護され
ているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタ
ミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ
酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ
基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ_1-6アルカノイルなどのＣ_1-6アシル基など）で
保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる
糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。よ
り具体的には、本発明のタンパク質としては、例えば、
配列番号：１〔図１〜３または図４〜６〕で表わされる
アミノ酸配列を有するヒト肝臓由来のタンパク質、配列
番号：２〔図７〜８または図９〜１８〕で表わされるア
ミノ酸配列を有するマウス胚由来のタンパク質、配列番
号：３〔図２０〜２１〕で表わされるアミノ酸配列を有
するラット肝臓由来のタンパク質、配列番号：３１で表
されるヒト肝臓由来のタンパク質などが好適である。本
発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本
発明のタンパク質と同質の活性、例えば、肝機能調節作
用（例、肝細胞維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機能
促進作用など）、より具体的には、肝臓再生作用（好ま
しくは、肝実質細胞増殖作用）など、さらに具体的に
は、 Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好ましくは、肝
細胞の細胞周期）の移行促進作用などの活性を有するペ
プチドであれば何れのものであってもよい。例えば、本
発明のタンパク質のアミノ酸配列のうち、少なくとも約
２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは
約７０個以上、さらに好ましくは約１００個以上、最も
好ましくは約２００個以上のアミノ酸残基を有するペプ
チドなどが好ましく用いられる。

【００２０】例えば、（１）配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第
９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜
１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９
番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、
第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１
５〜２１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸
配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を
有する部分ペプチド（すなわち、配列番号：２または配
列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番
目、第５３〜５７番目、第９１〜１００番目、第１０７
〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３
２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番
目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第
１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目および第２
２７〜２３８番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくと
も１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチド）、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜
２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番目、第
１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８
〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７
０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番
目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目およ
び第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列から選ばれる少
なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチド
（すなわち、配列番号：２または配列番号：３で表わさ
れるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５２〜５７番
目、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第１
１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２〜
１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２
番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番目、
第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３９番目のア
ミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸
配列を有する部分ペプチド）、（３）配列番号：３１で
表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５７〜６
６番目、第７３〜８０番目、第８２〜９０番目、第９２
〜９８番目、第１０８〜１１３番目、第１２６〜１３４
番目、第１４０〜１４６番目、第１４８〜１５３番目、
第１５７〜１７７番目、第１７９〜１８３番目および第
１９２〜２０３番目のアミノ酸配列から選ばれる少なく
とも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチドなど
が用いられる。

【００２１】より具体的には、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目のアミノ酸
配列を有する部分ペプチド、配列番号：２で表わされる
アミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配
列を有する部分ペプチド、配列番号：３で表わされるア
ミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列
を有する部分ペプチド、配列番号：３１で表わされるア
ミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目のアミノ酸配列
を有する部分ペプチドなどが好ましく用いられる。さら
に、本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目の
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第
２４０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的
に同質の活性を有するペプチド、配列番号：２で表わ
されるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３
９番目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同
質の活性を有するペプチド、配列番号：３で表わされ
るアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番
目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の
活性を有するペプチド、配列番号：３１で表わされる
アミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目のアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目
のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活
性を有するペプチドなどが好ましい。

【００２２】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の
第８４番目〜第２４０番目のアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目のア
ミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、よ
り好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％
以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するア
ミノ酸配列などが用いられる。配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜
第２３９番目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましく
は６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有するアミノ酸配列などが用いられる。配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３
９番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と
しては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配
列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と約４０
％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８０
％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましく
は約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用
いられる。配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の
第４８番目〜第２０４番目のアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３１で
表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目の
アミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、
より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０
％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する
アミノ酸配列などが用いられる。「実質的に同質の活
性」とは、前記と同意義を示す。

【００２３】肝機能調節作用（例、肝細胞維持作用、肝
細胞死抑制作用、肝臓機能促進作用など）、より具体的
には、肝臓再生作用（好ましくは、肝実質細胞増殖作
用）など、さらに具体的には、 Ｇ０期からＧ１期への
細胞周期（好ましくは、肝細胞の細胞周期）の移行促進
作用などの活性は、自体公知の方法（目加田英輔、三宅
康子、岡田善雄；癌と化学療法、４、４０７（１９７
７）あるいはそれに準じる方法、例えば、後述するスク
リーニング方法で記載されている方法などを用いて測定
することができる。また、本発明の部分ペプチドには、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８４番目
〜第２４０番目のアミノ酸配列中の１または２個以上
（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より
好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１
〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４
０番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜
８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１
〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目のアミ
ノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好
ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程
度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチ
ド、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２
番目〜第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以
上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、よ
り好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、
１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２
３９番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１
〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは
１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）
のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：２で表
わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のア
ミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、
好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程
度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチ
ド、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８２
番目〜第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以
上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、よ
り好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、
１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列
番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２
３９番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１
〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは
１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）
のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：３で表
わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のア
ミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、
好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程
度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチ
ド、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４
８番目〜第２０４番目のアミノ酸配列中の１または２個
以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、
より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数
（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８
番目〜第２０４番目のアミノ酸配列に１または２個以上
（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より
好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１
〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２
０４番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば
１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましく
は１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）
個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配
列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配配列を含有
する部分ペプチドなども含まれる。

【００２４】上記のように欠失または置換されている場
合、具体的には、一般式（Ｉ）で表わされるアミノ酸配
列から第１〜８３番目のアミノ酸を取り除いたアミノ酸
配列を有するペプチドなどが好ましく用いられる。ま
た、本発明の部分ペプチドのＣ末端は通常カルボキシル
基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ^-）
であるが、前記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末
端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯ
Ｒ）（Ｒは前記と同意義を示す）であってもよい。さら
に、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタン
パク質と同様に、上記した部分ペプチドにおいて、Ｎ末
端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されている
もの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残
基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の
側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合
ペプチドなども含まれる。

【００２５】本発明の部分ペプチドとしては、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４
０番目のアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミ
ノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を
有するペプチド、配列番号：３で表わされるアミノ酸配
列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列、配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２
０４番目のアミノ酸配列を有するペプチドが好適であ
る。本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩と
しては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機
酸）または塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質また
はその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織
から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造する
こともできるし、後述するタンパク質をコードするＤＮ
Ａを含有する形質転換体を培養することによっても製造
することができる。また、後述のタンパク質合成法また
はこれに準じて製造することもできる。具体的には、Ｗ
Ｏ ９８／０３６４８号公報またはＷＯ９７／３４９１
１号公報に記載の方法によって製造することができる。
ヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒ
トや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、
酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラ
フィーを組み合わせることにより精製単離することがで
きる。

【００２６】本発明のタンパク質、その部分ペプチドも
しくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタン
パク質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取
得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タン
パク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることが
できるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイ
ミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイ
ミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カル
ボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化には
ラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保
護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水
物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあ
らかじめ保護アミノ酸の活性化を行なったのちに樹脂に
添加することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂と
の縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応
に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択され
うる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メ
チルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノー
ル、ジメチルスルホキシド、DMF、ジメチルスルホキシ
ド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、塩化メチレ
ン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチ
ル、Ｎ-メチルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合
物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反
応に使用され得ることがしられている範囲から適宜選択
され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択され
る。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過
剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結
果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことな
く縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうこ
とができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られな
いときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用
いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後
の反応に影響を与えないようにすることができる。

【００２７】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーアミルオキシカルボニル、
イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジル
オキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカ
ルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミ
ル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホス
フィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル
基は、例えば、アルキルエステル（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロ
ペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオ
クチル、２−アダマンチルなどのエステル基）、ベンジ
ルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキ
シベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベ
ンズヒドリルエステル、フェナシンエステル、ベンジル
オキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカ
ルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどに導くこ
とによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイ
ル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、
エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基など
が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、
例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチ
ル基などである。

【００２８】チロシンのフェノール性水酸基の保護基と
しては、例えば、Bzl、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジル、
Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。ヒスチジ
ンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-
メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、
ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用
いられる。原料のカルボキシル基の活性化されたものと
しては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エス
テル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、
2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノー
ル、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、
HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイ
ミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料の
アミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応す
るリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱離）方
法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒
の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フ
ッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスル
ホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液など
による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエ
チルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処
理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども
用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−
２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理において
は、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソー
ル、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフ
ィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールの
ようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒス
チジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニ
トロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、
トリプトファンのインドール保護基として用いられるホ
ルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジ
チオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希
水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカ
リ処理によっても除去される。原料の反応に関与すべき
でない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基
の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基
あるいは公知の手段から適宜選択しうる。

【００２９】タンパク質のアミド体を得る別の方法とし
ては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシ
ル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド
（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプ
チド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタ
ンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去
したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記し
たような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細につ
いては上記と同様である。縮合により得られた保護タン
パク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を
除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この
粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、
主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミ
ド体を得ることができる。タンパク質のエステル体を得
るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基
を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした
後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパ
ク質のエステル体を得ることができる。本発明の部分ペ
プチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に
従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダ
ーゼで切断することによって製造することができる。ペ
プチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合
成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタン
パク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残
余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保
護基を脱離することにより目的のペプチドを製造するこ
とができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、
例えば、以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年） 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店

【００３０】また、反応後は通常の精製法、例えば、溶
媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマ
トグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のタン
パク質を精製単離することができる。上記方法で得られ
るタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法あるい
はそれに準じる方法によって適当な塩に変換することが
できるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるい
はそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換
することができる。本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコードす
る塩基配列を含有するものであればいかなるものであっ
てもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラ
リー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細
胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バ
クテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミ
ドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組
織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Revers
e Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、
ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもで
きる。また、ＷＯ ９８／０３６４８号公報またはＷＯ
９７／３４９１１号公報に記載の本発明のタンパク質を
コードする塩基配列を含有するＤＮＡも本発明のＤＮＡ
としてあげられる。

【００３１】具体的には、本発明の配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡ、配列番号：４で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質と同質の活性（例、肝機能調
節作用（例、肝細胞維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓
機能促進作用など））、より具体的には、肝臓再生作用
（好ましくは、肝実質細胞増殖作用）など、さらに具体
的には、 Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好ましく
は、肝細胞の細胞周期）の移行促進作用などの活性）を
有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表わされる
塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、よ
り好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００３２】本発明の配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡ、配列番号：７で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡにハイストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
するタンパク質と同質の活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡなどが用いられる。配列番号：７で表わさ
れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７
で表わされる塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６
０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましく
は約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性
を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質と同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａなどが用いられる。配列番号：１０で表わされる塩基
配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
できるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わ
される塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以
上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９
０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。本発明
の配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列
番号：３０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、配
列番号：３０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質
と同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡな
どが用いられる。

【００３３】配列番号：３０で表わされる塩基配列とハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号：３０で表わされる塩
基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より
好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイ
ゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方
法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）２nd（J. Sambrook etal., Cold Spring Harb
or Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行な
うことができる。また、市販のライブラリーを使用する
場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ
とができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな
条件に従って行なうことができる。ハイストリンジェン
トな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０
ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜
７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特
に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場
合が最も好ましい。より具体的には、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる。また、本発明の配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク
質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：５〔図１〜３〕または配列番号：６〔図
４〜６〕で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用
いられる。

【００３４】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列
番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用
いられる。また、本発明の配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡを
含有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８〔図７
〜８〕または配列番号：９で表わされる塩基配列を有す
るＤＮＡ〔図９〜１８〕などが用いられる。配列番号：
３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表わされる
塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：
３１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質を
コードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わされ
る塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明の
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本
発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するも
のであればいかなるものであってもよい。また、ゲノム
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ
ライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラ
リーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラ
スミド、コスミド、ファージミドなどいずれであっても
よい。また、前記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調
製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅す
ることもできる。

【００３５】具体的には、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目（また
は第５４〜５９番目）、第９３〜１０２番目、第１０９
〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３
４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番
目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第
１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２
２８〜２３９番目（または第２２８〜２４０番目）のア
ミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列
を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例
えば、配列番号：４で表わされる塩基配列の第２２〜６
３番目、第１６３〜１７７番目（または第１６０〜１７
７番目）、第２７７〜３０６番目、第３２５〜３４８番
目、第３５２〜３７８番目、第３８２〜４０２番目、第
４３０〜４４７番目、第４８４〜５１０番目、第５２６
〜５４６番目、第５５０〜５６７番目、第５７７〜６３
９番目、第６４３〜６５７番目および第６８２〜７１７
番目（または第６８２〜７２０番目）の塩基配列から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが
用いられる。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の
第６〜２０番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５
７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番
目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第
１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１
２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３８
番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列か
ら選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する部分
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：７で表わされる塩基配列の第１６〜６０番目、第１
５７〜１７１番目（または第１５４〜１７１番目）、第
２７１〜３００番目、第３１９〜３４２番目、第３４６
〜３７２番目、第３７６〜３９６番目、第４２４〜４４
１番目、第４８４〜５１０番目、第５２６〜５４６番
目、第５５０〜５６７番目、第５７４〜６３６番目、第
６４０〜６５４番目および第６７８〜７１４番目（また
は第６７８〜７１７番目）の塩基配列から選ばれる少な
くとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００３６】配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の
第６〜２０番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５
７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番
目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第
１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１
２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３８
番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列か
ら選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する部分
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：１０で表わされる塩基配列の第１６〜６０番目、第
１５７〜１７１番目（または第１５４〜１７１番目）、
第２７１〜３００番目、第３１９〜３４２番目、第３４
６〜３７２番目、第３７６〜３９６番目、第４２４〜４
４１番目、第４８４〜５１０番目、第５２６〜５４６番
目、第５５０〜５６７番目、第５７４〜６３６番目、第
６４０〜６５４番目および第６７８〜７１４番目（また
は第６７８〜７１７番目）の塩基配列から選ばれる少な
くとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第８〜
２１番目、第５７〜６６番目、第７３〜８０番目、第８
２〜９０番目、第９２〜９８番目、第１０８〜１１３番
目、第１２６〜１３４番目、第１４０〜１４６番目、第
１４８〜１５３番目、第１５７〜１７７番目、第１７９
〜１８３番目および第１９２〜２０３番目のアミノ酸配
列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有
する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：３０で表わされる塩基配列の第２２〜６
３番目、第１６９〜１９８番目、第２１７〜２４０番
目、第２４４〜２７０番目、第２７４〜２９４番目、第
３２２〜３３９番目、第３７６〜４０２番目、第４１８
〜４３８番目、第４４２〜４５９番目、第４６９〜５３
１番目、第５３５〜５４９番目および第５７４〜６０７
番目の塩基配列から選ばれる少なくとも１つの塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００３７】また、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列の第８４番目〜２４０番目のアミノ酸配列を有する
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：４で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第
７２０番目の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：４
で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第７２０番目の
塩基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列の第８４番目〜２４０番目のアミノ酸配列を有
する部分ペプチドと同質の活性（例、肝機能調節作用
（例、肝細胞維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機能促
進作用など））、より具体的には、肝臓再生作用（好ま
しくは、肝実質細胞増殖作用）など、さらに具体的に
は、 Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好ましくは、肝
細胞の細胞周期）の移行促進作用などの活性）を有する
部分ペプチドをコードするＤＮＡなども用いられる。配
列番号：４で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第７
２０番目の塩基配列とハイストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：４で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第７２０
番目の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以
上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９
０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜２３９
番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードする
ＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７で表わされる
塩基配列の第２４４番目〜第７１７番目の塩基配列を有
するＤＮＡ、配列番号：７で表わされる塩基配列の第
２４４番目〜第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡに
ハイブリダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸
配列の第８２番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する
部分ペプチドと同質の活性（例、肝機能調節作用（例、
肝細胞維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機能促進作用
など））、より具体的には、肝臓再生作用（好ましく
は、肝実質細胞増殖作用）など、さらに具体的には、
Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好ましくは、肝細胞の
細胞周期）の移行促進作用などの活性）を有する部分ペ
プチドをコードするＤＮＡなども用いられる。

【００３８】配列番号：７で表わされる塩基配列の第２
４４番目〜第７１７番目の塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、
例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列の第２４４
番目〜第７１７番目の塩基配列と約４０％以上、好まし
くは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに
好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上
の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用い
られる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８
２番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜第７１７番
目の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：１０で表わ
される塩基配列の第２４４番目〜第７１７番目の塩基配
列を有するＤＮＡにハイブリダイズし、配列番号：３で
表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜２３９番目のア
ミノ酸配列を有する部分ペプチドと同質の活性（例、肝
機能調節作用（例、肝細胞維持作用、肝細胞死抑制作
用、肝臓機能促進作用など））、より具体的には、肝臓
再生作用（好ましくは、肝実質細胞増殖作用）など、さ
らに具体的には、 Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好
ましくは、肝細胞の細胞周期）の移行促進作用などの活
性）を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡなども用
いられる。また、配列番号：３１で表わされるアミノ酸
配列の第４８番目〜２０４番目のアミノ酸配列を有する
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：３０で表わされる塩基配列の第１４２番目〜
第６１２番目の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：
３０で表わされる塩基配列の第１４２番目〜第６１２番
目の塩基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、配列番号：３１で表わされ
るアミノ酸配列の第４８番目〜２０４番目のアミノ酸配
列を有する部分ペプチドと同質の活性（例、肝機能調節
作用（例、肝細胞維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機
能促進作用など））、より具体的には、肝臓再生作用
（好ましくは、肝実質細胞増殖作用）など、さらに具体
的には、Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好ましくは、
肝細胞の細胞周期）の移行促進作用などの活性）を有す
る部分ペプチドをコードするＤＮＡなども用いられる。
配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜
第７１７番目の塩基配列とハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配
列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜第
７１７番目の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６
０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましく
は約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性
を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェ
ントな条件は、前記と同様である。

【００３９】より具体的には、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列の第８４番目〜２４０番目のアミノ酸配
列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：４で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第
７２０番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番
目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる
塩基配列の第２４４番目〜第７１７番目の塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：３で表わされ
るアミノ酸配列の第８２番目〜２３９番目のアミノ酸配
列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜
第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８
番目〜２０４番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わさ
れる塩基配列の第１４２番目〜第６１２番目の塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明のタンパク質
またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡのクローニ
ングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを
用いて、ＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等か
ら目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクタ
ーに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部ある
いは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用
いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって
選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法
は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Har
bor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行な
うことができる。また、市販のライブラリーを使用する
場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ
とができる。ＤＮＡの塩基配列の変換（欠失・付加・置
換）は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-G（宝酒造
（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））などを用いて、G
apped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法あるい
はそれらに準じる方法に従って行なうことができる。ク
ローン化された本発明のタンパク質またはその部分ペプ
チドをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、また
は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加し
たりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末
端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'
末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまた
はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドン
や翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用
いて付加することもできる。本発明のタンパク質または
その部分ペプチドをコードするＤＮＡの発現ベクター
は、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該Ｄ
ＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流
に連結することにより製造することができる。ベクター
としては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢ
Ｒ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、
枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ
５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１
９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファー
ジ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウ
イルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐ
ＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で用いられるプロ
モーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応し
て適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプ
ロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモータ
ー、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、Ｈ
ＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのう
ち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用
いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合
は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃ
Ａプロモーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモー
ターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ
１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＡＯＸ１プロ
モーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモータ
ー、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好
ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプ
ロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現
ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、
スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マ
ーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉ
と略称する場合がある）などを含有しているものを用い
ることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合があ
る）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^r
と略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以
下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が
用いられる。ｄｈｆｒ遺伝子はメソトレキセート（ＭＴ
Ｘ）耐性を、ＮｅｏはＧ４１８耐性を付与する。特に、
ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、チミジンを含まない培地によっても目的とする遺
伝子を選択することができる。また、必要に応じて、宿
主に合ったシグナル配列を、タンパク質のＮ端末側に付
加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ
・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主が
バチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル
配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母
である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグ
ナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えば
インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・
シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ
利用できる。

【００４０】このようにして構築された本発明のタンパ
ク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導
入することによって形質転換体を製造することができ
る。宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチル
ス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いら
れる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６
８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサー
チ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９
８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが
用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞とし
ては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１
細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vit
ro）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。

【００４１】昆虫としては、例えば、カイコの幼虫など
が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５
巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞としては、例えば、
サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター
細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝
子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨ
Ｏ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウス
ＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，
ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３
Ｔ３細胞、Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中
でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、２９３
細胞などが好ましい。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことが
できる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１
１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことがで
きる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１
９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）など
に記載の方法に従って行なうことができる。

【００４２】昆虫細胞や昆虫を形質転換するには、例え
ば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-5
5(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができ
る。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別
冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７
（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行なうことができる。発現ベクターの細胞への導入方法
としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham, F.
L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology） 5
2, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et a
l. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1,841-845（198
2）〕等が用いられる。このようにして、本発明のタン
パク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形
質転換された形質転換体を得ることができる。なお、動
物細胞を用いて、本発明のタンパク質を安定に発現させ
る方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベク
ターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によっ
て選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカ
ーを指標にして形質転換体を選択することができる。さ
らに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細
胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより
本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細胞
株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培
養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子と
ともに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを細胞
内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ること
もできる。上記の形質転換体を本発明のタンパク質また
はその部分ペプチドをコードするＤＮＡが発現可能な条
件下で培養し、本発明のタンパク質またはその部分ペプ
チドを生成、蓄積せしめることによって、本発明のタン
パク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を製造する
ことができる。

【００４３】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ用いられ
る。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など
を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例え
ば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー
（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Exp
eriments in Molecular Genetics），４３１−４３３，
Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕
が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく
働かせるために、例えば３β−インドリル アクリル酸
のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒ
ア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４
時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもで
きる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜
４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌
を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を
培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー
（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８
０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitte
r, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１
巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨ
は約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０
℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通
気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（G
race, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）
に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたも
のなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に
調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５
日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００４４】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２
巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー
（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Journal of the Ame
rican Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞およ
びｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合、チ
ミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭ
ＥＭ培地を用いるのが好ましい。上記培養物から本発明
のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法
により行なうことができる。本発明のタンパク質を培養
菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公
知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝
液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融
解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心
分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽出液を得る
方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グア
ニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００^TM
などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタ
ンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体
公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清
を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは
抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、自体
公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことが
できる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や
溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外
ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を
利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなど
の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマト
グラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電
気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いら
れる。

【００４５】かくして得られる本発明のタンパク質が遊
離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩
で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じ
る方法により、遊離体または他の塩に変換することがで
きる。なお、組換え体が産生する本発明のタンパク質
を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用さ
せることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチド
を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素として
は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニル
エンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダ
ーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のタン
パク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノア
ッセイなどにより測定することができる。本発明のタン
パク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗
体は、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩（以下、本発明のタンパク質と略記することも
ある）を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。

【００４６】本発明のタンパク質に対する抗体（以下、
本発明の抗体と略記することもある）は、本発明のタン
パク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清
の製造法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行なうことができる。温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが用いら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免
疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種
または異種の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することがで
きる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識
化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1
975)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例え
ば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられ
る。

【００４７】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物由来の
骨髄腫細胞が用いられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いら
れる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施することが
できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タ
ンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固
相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清
を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫
グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの
場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）また
はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル
抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロ
テインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を
添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を
加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方
法などが用いられる。

【００４８】モノクローナル抗体の選別は、自体公知あ
るいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。
通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。
選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育
できるものならばどのような培地を用いても良い。例え
ば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血
清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハ
イブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水
製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、
通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時
間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間で
ある。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００４９】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル
抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にした
がって製造することができる。例えば、免疫抗原（タン
パク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、
上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に
免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリクローナル
抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことに
より製造することができる。温血動物を免疫するために
用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関
し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテ
ンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプ
テンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものを
どの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清
アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を
重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましく
は約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。ま
た、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮
合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカ
ルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、
ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用い
られる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全
フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン
トを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回
ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリク
ローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血
液、腹水など、好ましくは血液から採取することができ
る。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の
血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。抗体の
分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同
様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことが
できる。本発明のタンパク質または部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩基配
列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明のタン
パク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡの塩基配列またはその一部の塩基配列に実質的に
相補的な塩基配列を有し、該タンパク質または部分ペプ
チドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチ
ドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセンスＤ
ＮＡであってもよい。該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的
に相補的な塩基配列とは、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、該ＤＮＡまたはｍ
ＲＮＡの相補鎖）の全塩基配列または部分塩基配列と約
４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは
約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性
を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明
のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列
（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と
約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましく
は約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同
性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらの
アンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用
いて製造することができる。

【００５０】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩は、例えば、肝機能調節作用（例、肝細
胞維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機能促進作用な
ど）、より具体的には、肝臓再生作用（好ましくは、肝
実質細胞増殖作用）など、さらに具体的には、 Ｇ０期
からＧ１期への細胞周期（好ましくは、肝細胞の細胞周
期）の移行促進作用などの作用を有している。したがっ
て、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれ
らの塩は上記作用に基づくさまざまな用途に用いること
ができる。

【００５１】以下に、本発明のタンパク質、その部分ペ
プチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と
略記する場合がある）、本発明のタンパク質等をコード
するＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合があ
る）、本発明のタンパク質等に対する抗体（本発明の抗
体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡの
用途を説明する。 （１）肝機能調節作用に基づく各種疾病の治療・予防剤
などの医薬 例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少ある
いは欠損しているために、肝機能調節作用（例、肝細胞
維持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機能促進作用な
ど）、より具体的には、肝臓再生作用（好ましくは、肝
実質細胞増殖作用）など、さらに具体的には、 Ｇ０期
からＧ１期への細胞周期（好ましくは、肝細胞の細胞周
期）の移行促進作用などが十分に、あるいは正常に発揮
されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該
患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させ
ることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入
し、本発明のタンパク質を発現させた後に、該細胞を患
者に移植することによって、（ハ）本発明のタンパク質
を該患者に投与することなどによって、該患者における
本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発
揮させることができる。また、後述の実施例４および実
施例５に示されているとおり、本発明のタンパク質は他
のTNF-ファミリーリガンド分子で顕著に見られる肝細胞
死（アポトーシス）誘導能、肝細胞障害活性などの医薬
として用いる場合の副作用と考えられる作用を有してい
ないという優れた性質を有している。したがって、本発
明のタンパク質および本発明のＤＮＡは、例えば、肝機
能不全症、肝癌、肝炎（ウイルス肝炎、劇症肝炎など）
または肝硬変などの疾病の治療・予防剤などの医薬とし
て有用である。また、肝癌患者などにおける部分肝切除
（摘出）後の肝臓再生剤などの医薬としても有用であ
る。本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤または肝臓再
生剤などとして使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるい
はレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、
アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなど
の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従ってヒト
または温血動物に投与することができる。本発明のＤＮ
Ａは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤な
どの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝
子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによ
って投与できる。本発明のタンパク質を上記の治療・予
防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好まし
くは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ま
しくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ま
しい。本発明のタンパク質を上記の医薬として使用する
場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプ
セル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして
経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容
し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤
の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパ
ク質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベ
ヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認
められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和する
ことによって製造することができる。これら製剤におけ
る有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られる
ようにするものである。本発明のＤＮＡを用いる場合
は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテ
ッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した
後、常套手段に従って投与することができる。錠剤、カ
プセル剤などに混和することができる添加剤としては、
例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラ
ビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦
形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのよ
うな膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑
剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペ
パーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤
などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合
には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体
を含有することができる。注射のための無菌組成物は注
射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油
などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させ
るなどの通常の製剤実施に従って処方することができ
る。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブ
ドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソ
ルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）
などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコー
ル（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例え
ば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールな
ど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油
性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、
リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに
充填される。本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上
記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。

【００５２】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与
することができる。本発明のタンパク質の投与量は、対
象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある
が、例えば、肝硬変治療剤として本発明のタンパク質を
経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき該タンパク質を約０.１ｍｇ〜１
００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好まし
くは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する
場合は、該タンパク質の１回投与量は投与対象、対象疾
患などによっても異なるが、例えば、肝臓再生剤として
本発明のタンパク質を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇ
として）に投与する場合、一日につき該タンパク質を約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部
に注射することにより投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与する
ことができる。

【００５３】（２）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することによ
り、ヒトまたは温血哺乳動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、
ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡの異常（遺伝子異常）を検出すること
ができる。したがって、本発明のＤＮＡは、本発明のタ
ンパク質が関与する各種疾病の遺伝子診断剤として有用
である。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡが損傷し、欠損し、あるいはタンパク
質の発現が減少していることが検出された場合は、例え
ば、肝機能不全症、肝炎（ウイルス肝炎、劇症肝炎な
ど）、肝癌または肝硬変などの疾病であると診断するこ
とができる。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断
は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーショ
ンやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），
第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings ofth
e National Academy of Sciences of the United State
s of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１
９８９年））などにより実施することができる。例え
ば、ノーザンハイブリダイゼーションにより該ｍＲＮＡ
の発現低下が検出された場合は、例えば、肝機能不全
症、肝炎（ウイルス肝炎、劇症肝炎など）、肝癌または
肝硬変などの疾病である、または将来罹患する可能性が
高いと診断することができる。

【００５４】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量による本発明のタンパク質
の肝機能調節作用に基づく各種疾病の診断 本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識す
ることができるので、被検液中の本発明のタンパク質の
定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量をするこ
とによって、本発明のタンパク質の肝機能調節作用に基
づく各種疾病の診断などに使用することができる。本発
明のタンパク質の定量法としては、（ｉ）本発明の抗体
と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを
競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発
明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検
液中の本発明のタンパク質を定量する方法、および（i
i）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標
識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に
反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定す
ることを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質を定
量する方法などがあげられる。上記（ii）の定量法にお
いては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端
部に反応する抗体であることが望ましい。また、本発明
のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、単に
モノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発
明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等によ
る検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体
分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａ
ｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法
は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の
抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原
もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手
段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用
いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、い
ずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリ
ー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法
が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述する
サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を
用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放
射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いら
れる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが、上記酵素として
は、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β
−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフ
ォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵
素などが、蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物
質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、
ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ用いられる。
さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン
−アビジン系を用いることもできる。抗原あるいは抗体
の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通
常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに
用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体として
は、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースな
どの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミ
ド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラスなどが用い
られる。サンドイッチ法においては不溶化したモノクロ
ーナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標
識化したモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによ
り被検液中の本発明のタンパク質量を定量することがで
きる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、ま
た、同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても
よい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準
じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測
定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いら
れる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度
を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用
いてもよい。

【００５５】本発明のサンドイッチ法による本発明のタ
ンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用
いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタン
パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いら
れる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる
抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明
のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用い
られる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を
認識する抗体が用いられる。本発明のモノクローナル抗
体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合
法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに
用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標
識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反
応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）と
を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測
定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗
体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレン
グリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液
相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、
あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体とし
て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノ
メトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一
定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相
を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標
識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の
標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離
する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の
抗原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内
あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈
降物の量を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少
量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利
用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられ
る。これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に
適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必
要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操
作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタン
パク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技
術手段の詳細については、総説、成書などを参照するこ
とができる。例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniq
ues(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniq
ues(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniq
ues(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniq
ues(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92
(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antib
odies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vo
l. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカ
デミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによっ
て、本発明のタンパク質を感度良く定量することができ
る。上述の定量法によって、本発明のタンパク質が関与
する各種疾病の診断を行なうことができる。例えば、本
発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合は、例
えば、肝機能不全症、肝炎（ウイルス肝炎、劇症肝炎な
ど）、肝癌または肝硬変などの疾病である、または将来
罹患する可能性が高いと診断することができる。

【００５６】（４）医薬候補化合物のスクリーニング （Ａ）肝機能調節作用を有する化合物のスクリーニング
方法 本発明のタンパク質は、肝機能調節作用（例、肝細胞維
持作用、肝細胞死抑制作用、肝臓機能促進作用など）、
より具体的には、肝臓再生作用（好ましくは、肝実質細
胞増殖作用）など、さらに具体的には、Ｇ０期からＧ１
期への細胞周期（好ましくは、肝細胞の細胞周期）の移
行促進作用などを有するので、本発明のタンパク質と肝
細胞（好ましくは肝実質細胞など）を用いたアッセイ系
を構築することによって、本発明のタンパク質の肝機能
調節作用を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。すなわち、本発明は、肝
細胞（好ましくは、肝実質細胞）に、本発明のタンパク
質を接触させた場合と（ii）肝細胞（好ましくは、肝実
質細胞）に、本発明のタンパク質および試験化合物を接
触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、本発
明のタンパク質の肝機能調節作用を促進または阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供す
る。具体的には、本発明のスクリーニング方法において
は、上記の場合における、例えば、肝細胞（好ましくは
肝実質細胞）のＤＮＡ合成能などを測定して、比較する
ことを特徴とするものである。また、上記のスクリーニ
ング方法において、本発明のタンパク質の肝細胞（好ま
しくは肝実質細胞）のＤＮＡ合成能の促進作用が認めら
れた試験化合物をアゴニストとして選択することがで
き、ＤＮＡ合成能の阻害作用が認められた試験化合物を
アンタゴニストとして選択することができる。本発明の
スクリーニング方法に用いられる肝細胞としては、ヒト
または温血動物（例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなど）
由来の肝細胞（特に肝実質細胞）であればいかなるもの
であっていてもよい。用いられる肝細胞（好ましくは肝
実質細胞）は、ヒトや温血動物などの正常組織からコラ
ーゲナーゼ潅流法という確立された方法により分離する
ことができる。

【００５７】上記肝細胞の培地としては、例えば、ＣＳ
Ｃ無血清培地（Cell System社）、ハムＦ−１２培地
（ＧＩＢＣＯ社）、ライホビッツＬ−１５培地（ＧＩＢ
ＣＯ社）などの市販の培地、約５〜２０％の胎児牛血清
を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２
巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー
（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Journal of the Ame
rican Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding of the Society for the Biological Med
icine），７３巻，１(１９５０)〕、またはこれらを適
宜混合した培地などが用いられる。本発明のスクリーニ
ング方法において、肝細胞をグルタルアルデヒド、ホル
マリンなどで固定化することができる。固定化方法は、
それ自体公知の方法に従って行なうことができる。肝細
胞に本発明のタンパク質を接触させる場合、本発明のタ
ンパク質の発現能を有する細胞または本発明のタンパク
質の発現能を有する細胞の細胞膜画分を用いることも可
能である。本発明のタンパク質の発現能を有する細胞と
しては、本発明のタンパク質を発現する能力を有する細
胞であればいかなるものであっていてもよく、具体的に
は、上記の形質転換体として例示した細胞などがあげら
れる。本発明のタンパク質の発現能を有する細胞の細胞
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方
法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。
細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナ
イザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーや
ポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波によ
る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細い
ノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ
る。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心
分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したまたは本発明のタ
ンパク質と、細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成
分が多く含まれる。試験化合物としては、例えば、ペプ
チド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、
発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出
液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物
であってもよいし、公知の化合物であってもよい。

【００５８】本発明のスクリーニング方法において、本
発明のタンパク質と肝細胞（好ましくは肝実質細胞）と
の反応は、通常約３７℃で数十時間（例えば、３６時間
〜７２時間、好ましくは４８時間〜７２時間）行なうこ
とができる。具体的には、上記のスクリーニング方法を
実施するには、まず、肝細胞（好ましくは肝実質細胞）
を、スクリーニングに適した培地（具体的には、上述の
培地など）に懸濁することにより肝細胞（好ましくは肝
実質細胞）を調製する。培地に懸濁された肝細胞（好ま
しくは肝実質細胞）は、培養プレート（例えば、市販の
マルチウェルプレート等など）に播種される。このと
き、該プレートとしては、表面がコラーゲンなどでコー
トされ、プレートへの付着を促進するように加工された
ものが好ましい。播種される際の肝細胞（好ましくは肝
実質細胞）濃度は約１０００〜５０００個／well、好ま
しくは約２０００〜５０００個／well、より好ましくは
約３０００〜５０００個／wellである。次に、上記の自
体公知の方法により精製された本発明のタンパク質を最
終濃度が約０．０１〜１０００ng／ml、好ましくは約
０．１〜１０００ng／ml、より好ましくは約０．１〜１
００ng／mlとなるようにプレートに添加し、肝細胞（好
ましくは肝実質細胞）を培養し、該肝細胞（好ましくは
肝実質細胞）をコントロールとして用いる。一方、上記
と同様の方法でマルチプレートに播種された肝細胞（好
ましくは肝実質細胞）に自体公知の方法により精製され
た本発明のタンパク質および試験化合物を最終濃度が約
０．０１〜１０００ng／ml、好ましくは約０．０５〜５
００ng／ml、より好ましくは約０．１〜１００ng／mlと
なるように添加し、肝細胞（好ましくは肝実質細胞）を
上記と同様の培養条件下で培養する。培養後の各肝細胞
におけるＤＮＡ合成活性の検出は自体公知の方法（例え
ば、Burton, K : Biochem. J., 62, 315 (1956)などに
記載の方法）に準じて行うことができる。具体的には、
例えば、Schmidt-Thanhauser法によって得られるＤＮＡ
画分を約０．５ｍｌとり、５％過塩素酸約０．５ｍｌを
加える。発色が強すぎる場合は、５％過塩素酸でさらに
希釈する。これにジフェニルアミン試薬（ジフェニルア
ミン 約１．５ｇ；氷酢酸約１００ｍｌ；濃硫酸 約１．
５ｍｌ、使用時調製）約１．０ｍｌを加え、次にアセト
アルデヒド（約１０．３ｍｌを水で１００ｍｌに希釈し
たもの）約０．０５ｍｌを加え、約２７〜３７℃で約１
６時間放置し、Ａ₆₀₀ｎｍを測定する。標準として、市
販の仔ウシ胸腺ＤＮＡを約１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に完
全に溶解し、この一部をとり、約０．２Ｎ ＮａＯＨに
して、Ａ₂₆₀ｎｍを測定する。市販のＤＮＡは水分、タ
ンパク質、塩などの混入のおそれがあるので、先のＡ
₂₆₀ｎｍの測定値から、１μｇ／ｍｌのＤＮＡはＡ₂₆₀＝
０．０２３として、もとのＤＮＡ濃度を補正しておく。
上記のスクリーニング方法において、試験化合物を添加
した際の肝細胞（好ましくは肝実質細胞）におけるＤＮ
Ａの合成能が試験化合物を添加しない場合の肝細胞（好
ましくは肝実質細胞）におけるＤＮＡの合成能より高い
場合には、該試験化合物をアゴニスト候補化合物として
選択することができる。一方、試験化合物を添加した際
の肝細胞（好ましくは肝実質細胞）におけるＤＮＡの合
成能が試験化合物を添加しない場合の肝細胞（好ましく
は肝実質細胞）におけるＤＮＡの合成能より低い場合に
は、該試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選
択することができる。

【００５９】本発明のスクリーニング用キットは、肝細
胞（好ましくは肝実質細胞）および本発明のタンパク質
等等を含有するものである。本発明のスクリーニング用
キットの例としては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 肝細胞（好ましくは肝実質細胞）用培地 （ａ）ＣＳＳ無血清培地（Cell Systems社）または
（ｂ）ハムF-12培地（GIBCO社）とライホビッツL-15培
地（GIBCO社）を当量混合した基礎培地に、各最終濃度
１％BSA、５ｍMグルコース（WAKO社）、10^-8Mデキサメ
タゾン（WAKO社）、10^-8Mウシインスリン（GIBCO社）と
なるように添加した基本培地。 肝細胞（好ましくは肝実質細胞）標品 正常ヒト肝実質細胞（Cell System社、＃３７１６）。 本発明のタンパク質標品 上述の本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩。 〔測定法〕 CSC無血清培地（Cell Systems社）で懸濁した正常
ヒト肝実質細胞（Cell Systems社、#3716）をI型コラー
ゲンコート96穴培養プレート（FALCON社）に2500個/wel
l/50mlで播種する。 精製した本発明のタンパク質を3倍公比で最終濃度
が0.1 ng/mlから10 ng/mlになるように50ml/well（n=
2）で添加し3日間CO₂インキュベータ−（37℃、5% C
O₂）で培養する。 上記とは別に上記のプレートに精製した本発明
のタンパク質および試験化合物を3倍公比で最終濃度が
0.1 ng/mlから10 ng/mlになるように50ml/well（n=2）
で添加し3日間CO₂インキュベータ−（37℃、5% CO₂）で
培養する。 培養後、最終希釈率が1000倍になるようにブロモデ
オキシウリジン（BrdU）を各ウエルに添加し1晩培養し
た後、各培養液を除去しFix Denat溶液を200ml/wellで
添加した後30分間室温で細胞を固定する。 その後、溶液を除去しHRP標識抗BrdU抗体溶液を100
ml/wellで添加した後90分間室温で作用させ、PBSで洗浄
後、基質を50ml/wellで添加し30分間発色させ、96穴プ
レートリーダー（マルチスチャンマルチソフト：大日本
製薬）で波長340nmでの吸光と、対照として492nmの吸光
を測定する。 上記の培養細胞のBrdUの取り込み、すなわちDNA
の合成能と、上記の培養細胞のBrdUの取り込み、すな
わちDNAの合成能を比較する。 以上のとおり、本発明のタンパク質は、本件タンパク質
が有する肝機能調節作用を促進する化合物（アゴニス
ト）または阻害する化合物（アンタゴニスト）をスクリ
ーニングするための試薬として有用である。

【００６０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、本発明のタンパク質が有する肝機能調節作用を促進
または阻害する作用を有する化合物であり、具体的に
は、肝臓再生作用（好ましくは、肝実質細胞増殖作
用）、 Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好ましくは、
肝細胞の細胞周期）の移行促進作用を促進または阻害す
る化合物である。該化合物は、前述した試験化合物
（例、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物
組織抽出液、血漿など）から得られるものであり、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。上記のアゴニストは、本発明のタン
パク質が有する生理活性の全部または一部を有している
ので、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有
用である。すなわち、肝機能不全症、肝炎（ウイルス肝
炎、劇症肝炎など）、肝癌または肝硬変 などの疾病の
予防・治療剤などの医薬として有用である。また、肝癌
患者などにおける部分肝切除（摘出）後の肝臓再生剤な
どの医薬としても有用である。上記スクリーニング方法
で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物
の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、
有機酸）または塩基（例、アルカリ金属）との塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。該化合物を上記の疾患の
治療・予防剤として用いる場合、前記した本発明のタン
パク質を含有する医薬と同様にして製剤化し、使用する
ことができる。このようにして得られる製剤は安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラ
ット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル
など）に対して投与することができる。

【００６１】上記スクリーニングで得られた化合物また
はその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート
などにより差異はあるが、例えば、肝硬変治療の目的で
該アゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重
６０ｋｇとして）においては、一日につき該アゴニスト
を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経
口的に投与する場合は、該アゴニストの１回投与量は投
与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肝
硬変治療の目的で該アゴニストを注射剤の形で通常成人
（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該アゴ
ニストを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．
１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与する
ことができる。

【００６２】（６）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能を
抑制することができるので、例えば、本発明のタンパク
質などの発現過多に起因する疾患の治療・予防剤として
使用することができる。上記アンチセンスＤＮＡを上記
の治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明の
ＤＮＡを含有する各種疾病の治療・予防剤と同様にして
使用することができる。例えば、該アンチセンスＤＮＡ
を用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレ
トロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデ
ノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適
当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与する
ことができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、
あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認め
られる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲル
カテーテルのようなカテーテルによって投与できる。さ
らに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本
発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断
用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもで
きる。本明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commis
sion on Biochemical Nomenclature による略号あるい
は当該分野における慣用略号に基づくものであり、その
例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得
る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸

【００６３】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl₂Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００６４】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のヒト由来タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明のマウス由来タンパク質のアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のラット由来タンパク質のアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：４〕本発明の配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕プラスミドｐＴＢ１９３９に挿入され
ている、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃＤＮＡを
含有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕プラスミドｐＴＢ１９４０に挿入され
ている、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃＤＮＡを
含有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕本発明の配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を有するマウス由来タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：８〕プラスミドｐＴＢ１９５８に挿入され
ている、本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列を有するマウス由来タンパク質をコードするｃＤＮＡ
を含有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：９〕本発明の配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を有するマウス由来タンパク質をコードする
ゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕本発明の配列番号：３で表わされる
アミノ酸配列を有するラット由来タンパク質をコードす
るｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１〕本発明のヒト由来タンパク質をコー
ドするＤＮＡをクローニングするために使用した合成オ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２〕本発明のヒト由来タンパク質をコー
ドするＤＮＡをクローニングするために使用したプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３〕本発明のヒト由来タンパク質をコー
ドするＤＮＡをクローニングするために使用したプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したオリ
ゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したオリ
ゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用したマウス染色体ＤＮＡ断片の両末端結合しているア
ダプターの塩基配列を示す。 〔配列番号：１９〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：２０〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：２１〕本発明のヒト由来タンパク質の細胞
外領域をコードするＤＮＡをクローニングするために使
用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２２〕本発明のヒト由来タンパク質の細胞
外領域をコードするＤＮＡをクローニングするために使
用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２３〕本発明のラット由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２４〕本発明のラット由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２５〕本発明のタンパク質のアミノ酸配列
の一般式（Ｉ）を示す。 〔配列番号：２６〕後述の実施例１で使用したプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２７〕後述の実施例１で使用したプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２８〕後述の実施例６で使用したプライマ
ー１の塩基配列を示す。 〔配列番号：２９〕後述の実施例６で使用したプライマ
ー２の塩基配列を示す。 〔配列番号：３０〕後述の実施例６で取得した６１２塩
基からなるｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３１〕後述の実施例６で取得したｈＴＬ４
−２のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３２〕後述の実施例８で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：３３〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：３４〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：３５〕後述の実施例８で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：３６〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：３７〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：３８〕後述の実施例８で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：３９〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４０〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４１〕後述の実施例８で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：４２〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４３〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４４〕後述の実施例８で用いられたプロー
ブの塩基配列を示す。 〔配列番号：４５〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４６〕後述の実施例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４７〕本発明の蛋白質のアミノ酸配列の一
般式（ＩＩ）を示す。 〔配列番号：４８〕後述の実施例９で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：４９〕後述の実施例９で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５０〕後述の実施例１０で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５１〕後述の実施例１０で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５２〕後述の実施例１０で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５３〕後述の実施例１０で用いられたプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５４〕後述の実施例９で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：５５〕後述の実施例９で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。

【００６５】後述の参考例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴ
Ｂ１９３９およびエシェリヒア コリ（Escherichia co
li)ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４０は、それぞれ１９９６
年７月１７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５
９５およびＦＥＲＭ ＢＰ−５５９６として、また１９
９６年７月１１日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）
に寄託番号ＩＦＯ １５９９７およびＩＦＯ １５９９
８として寄託されている。後述の参考例２で得られた形
質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＤＨ
５α／ｐＴＢ１９５８は、１９９７年１月３０日から通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０５として、また
１９９７年１月３１日から財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に寄託番号ＩＦＯ １６０５４として寄託されてい
る。後述の参考例３で得られた形質転換体エシェリヒア
コリ（Escherichia coli)ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１１
は、１９９７年７月８日から通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６０１２として、また１９９７年７月７日から財
団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６
１０９として寄託されている。後述の参考例５で得られ
た形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)
ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１２は、１９９７年７月８日から
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０１３として、また
１９９７年７月７日から財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に寄託番号ＩＦＯ １６１１０として寄託されてい
る。後述の実施例６で得られたｈＴＬ４−２をコードす
る塩基配列を保持する形質転換体エシェリヒア コリ
（Escherichia coli)ＤＨ５α／ｈＴＬ４−ｐＣＲ２．
１は、１９９９年１２月６日から通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６９５８として、また１９９９年１０月２７
日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６３２９として寄託されている。

【００６６】

【実施例】以下に、実施例および参考例をあげて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定され
るものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、モレキュラー・クローニング（Molecular clonin
g）に記載されている方法に従った。

【００６７】参考例１ ヒト由来ＴＬ４タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡのクローニング ｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパー（GENETR
APPER^TM）ｃＤＮＡポジティブ選択システム（ギブコビ
ーアールエル社）を用いて行なった。 スーパースクリ
プト^TMヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ギブコビーアー
ルエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００μg/ml ア
ンピシリン含有Terrific Broth（１２g/lBacto-trypton
e（ディフコ社）、２４g/l Bacto-yeast extract（ディ
フコ社）、２.３g/l リン酸一カリウム、１２.５g/l リ
ン酸二カリウム、０．４％ グリセロール）で３０℃で
１６時間培養し、集菌後、キアジェンプラスミドキット
（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライブ
ラリーを調製した。精製したプラスミドｃＤＮＡライブ
ラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれもギブコビー
アールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤＮＡライブ
ラリーを作成した。一方、プローブとして、合成オリゴ
ヌクレオチド（配列番号：１１）をｃＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニングに用いた。プローブは、ＴｄＴ，ビ
オチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコビーアールエル社）を
用いて、３'末端をビオチン化することで標識した。一
本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処理した
後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加えて３
７℃で１時間、室温でハイブリダイゼーションを行なっ
た。ハイブリダイゼーション後、ジーントラッパーｃＤ
ＮＡポジティブ選択システム・ストレプトアビジンビー
ズ（ギブコビーアールエル社）を加えて、室温で２分ご
とに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーント
ラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・マグネット
ラック（ギブコビーアールエル社）中に入れ、２分間放
置した。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッ
パーｃＤＮＡポジティブ選択システム・ウオッシュバッ
ファーで洗浄した。このウオッシュバッファーによる洗
浄を３回行なった。その後、マグネットラックに入れて
放置し、上清を捨て、ジーントラッパーｃＤＮＡポジテ
ィブ選択システム・溶出バッファーを加え、５分間室温
で放置した。マグネットラックに入れて５分間放置した
後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。取得したＤＮＡ
溶液にプライマーとして合成オリゴヌクレオチド（配列
番号：１１）を入れ、９５℃で１分間処理した。ジーン
トラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・修復酵素
を加え、７０℃で１５分間放置して二本鎖ＤＮＡを合成
した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション
装置（バイオ・ラッド社）により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株
に導入した。得られた形質転換株を用いて２種のオリゴ
ヌクレオチド（配列番号：１２、配列番号：１３）をプ
ライマーとしてコロニーＰＣＲによるスクリーニングを
行なった。ＰＣＲにより４３４ｂｐの増幅断片が形成さ
れたコロニーを陽性クローンとして３株（＃９、＃３
３、＃８１）選択した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮ
Ａを抽出し、Ｔａｑダイデオキシターミネーターサイク
ルシーケンシングキット（パーキンエルマー社）を用い
て反応を行ない、ABI PRISM^TM ３７７ ＤＮＡシーケン
サー（パーキンエルマー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩
基配列を決定した。取得した３クローンのうち、クロー
ン＃９とクローン＃３３は同一のＤＮＡ断片を含んでお
り、poly(Ａ)⁺鎖を含む配列番号：５で表される１４９
１個の塩基配列を有していた〔図１〜３〕。また、クロ
ーン＃８１は poly(Ａ)⁺鎖、並びに poly(Ａ)⁺付加シグ
ナル（ＡＡＴＡＡ）を含む配列番号：６で表される１３
５３個の塩基配列を有していた〔図４〜６〕。これら３
クローンのｃＤＮＡ断片には同一遺伝子が含まれてお
り、配列番号：１で表される２４０個のアミノ酸からな
るＴＬ４蛋白質がコードされていた。また Kyte−Dooli
ttle解析から、３５番バリン（Ｖａｌ）から６３番トリ
プトファン（Ｔｒｐ）にかけての疎水性領域が本タンパ
ク質の膜貫通領域と予想された。本タンパク質はヒトリ
ンホトキシンβと最も相同性が高かったが、アミノ酸レ
ベルで３３％の相同性が見られた。また、ヒトＦａｓリ
ガンドとはアミノ酸レベルで３１％の相同性が見られた
が、J. Hein法（PAM250 residue weight table に基づ
く）による系統樹解析では、ヒトリンホトキシンβより
もヒトＦａｓリガンドとのより高い相同性が見られた。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのうちクローン
＃９を保持するプラスミドｐＴＢ１９３９並びにクロー
ン＃８１を含むプラスミドｐＴＢ１９４０を大腸菌（Es
cherichia coli）ＤＨ１０Ｂに導入して、形質転換体：
大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９３
９並びに大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴ
Ｂ１９４０を得た。

【００６８】参考例２ マウス由来ＴＬ４タンパク質を
コードするｃＤＮＡのクローニング ｃＤＮＡのクローニングは、ＰＣＲ法によって行なっ
た。スーパースクリプト^TMマウス８.５日胚由来ｃＤＮ
Ａライブラリー（ギブコビーアールエル社）の大腸菌Ｄ
Ｈ１２Ｓ株を、１００μg/ml アンピシリン含有Super B
roth（３２g/l Bacto-tryptone（ディフコ社）、２０g
/l Bacto-yeast extract（ディフコ社）、０.２g/l N
aCl）で３０℃、１６時間培養した後、キアジェンプラ
スミドキット（キアジェン社）を用いてプラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーを調製し、鋳型として用いた。プライ
マーとして、次の２つの合成オリゴヌクレオチドを用い
た。 ５'−ＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
ＧＧＴ−３'（配列番号：１４） ５'−ＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＧ
ＴＣ−３'（配列番号：１５） ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造
（株））を含む系で、サーマルサークラー（GeneAmp^R P
CR System 2400，パーキンエルマー社）を用いて９４
℃，１分を１サイクル、９４℃，２０秒→５５℃，３０
秒→７２℃，２分を３０サイクル、４℃放置の条件で行
なった。得られた増幅断片をpT7Blue T-vector（ノバジ
ェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２
（宝酒造（株））を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５α株に
導入した。得られた形質転換菌からプラスミドＤＮＡを
抽出し、ダイターミネーターサイクルシークエンスＦＳ
レディリアクションキット（パーキンエルマー社）を用
いて反応を行ない、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（パ
ーキンエルマー社）によりｃＤＮＡ断片の塩基配列を決
定した。取得したクローンは、配列番号：７で表わされ
る７１７個の塩基配列を含む配列番号：８で表される７
９５個の塩基配列を有しており、配列番号：２で表わさ
れる２３９個のアミノ酸からなるマウス由来ＴＬ４タン
パク質をコードしていた〔図７〜８〕。このマウス由来
ＴＬ４タンパク質と参考例１で得られた配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来ＴＬ４タンパ
ク質とは、アミノ酸レベルで７８％の相同性を有してお
り、また、それをコードするＤＮＡは、塩基レベルで７
７％の相同性を有していた。 得られたマウス由来ＴＬ
４タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミド
ｐＴＢ１９５８を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α
に導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）
ＤＨ５α／ｐＴＢ１９５８を得た。次に、プロモーター
ファインダーＤＮＡウォーキングキット（クローンテッ
ク社）を用いて、本発明のマウス由来タンパク質をコー
ドするＤＮＡの開始コドン付近の配列の解析を行なっ
た。使用したマウスゲノムＤＮＡは、予めＳｃａＩの制
限酵素で消化され、その５'および３'末端に、プライマ
ーＡＰ１（クローンテック社）やプライマーＡＰ２（ク
ローンテック社）が結合可能なアダプター配列が連結さ
れている。 プライマーＡＰ１：（配列番号：１６） ５'−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
−３'プライマーＡＰ２：（配列番号：１７） ５'−ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３'
アダプター配列：（配列番号：１８） ５'−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧ
Ｔ−３' 第１ＰＣＲ反応は、このマウスゲノムＤＮＡ溶液とＴａ
ＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲキットバージョン２（宝酒造
（株））、ＡＰ１、合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ１を
用い、サーマルサイクラー（GeneAmp^R PCR System 240
0，パーキンエルマー社）で、９４℃，２秒、７２℃，
３分を７サイクル、９４℃，２秒、６８℃，３分を３７
サイクル、６８℃，４分、４℃放置の条件で行なった。 合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ１：（配列番号：１
９） ５'−ＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣ
ＡＣＣＡＧ−３' 次に、この反応液を滅菌水で５０倍希釈し、第２ＰＣＲ
反応に用いた。第２ＰＣＲ反応は、この第１ＰＣＲ反応
液、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲキットバージョン２（宝
酒造（株））、前記プライマーＡＰ２、合成オリゴヌク
レオチドＧＳＰ２を用い、サーマルサイクラー（GeneAm
p^R PCR System 2400，パーキンエルマー社）で、９４
℃，２秒、７２℃，３分を５サイクル、９４℃，２秒、
６８℃，３分を２５サイクル、６８℃，４分、４℃放置
の条件で行なった。 合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ２：（配列番号：２
０） ５'−ＧＣＣＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣＣＧＴ
ＣＴＧＴＣ−３' ＳｃａＩで消化したゲノムＤＮＡ溶液から得られた約
１.１ｋｂｐの増幅断片をｐＴ７ブルーＴ−ベクター
（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージ
ョン２（宝酒造（株））を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５
α株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株
から、プラスミドＤＮＡを抽出し、ダイターミネーター
サイクルシークエンスＦＳレディリアクションキット
（パーキンエルマー社）を用いて反応を行ない、３７３
Ａ ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー社）によ
り増幅断片の塩基配列の一部を決定した。取得したクロ
ーンには、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
する本発明のマウス由来タンパク質の１番Ｍｅｔ（開始
コドン）から１３番Ａｓｐをコードする塩基配列（配列
番号：７で表わされる塩基配列の第１〜３９番目の塩基
配列）と完全に一致する配列が存在したことから、本発
明のマウス由来タンパク質をコードするｃＤＮＡのクロ
ーニングに用いた合成オリゴヌクレオチド（配列番号：
１４）の配列は、実際の本発明のマウス由来タンパク質
をコードするＤＮＡの配列の一部であることが確認され
た。

【００６９】参考例３ マウス由来ＴＬ４タンパク質遺
伝子のコード領域を含む染色体遺伝子のクローニング マウス由来ＴＬ４タンパク質遺伝子のオープンリーディ
ングフレーム部分を含む領域をコードする染色体ＤＮＡ
断片の取得は、１２９ＳＶＪマウス染色体ＤＮＡ Ｓａ
ｕ３ＡＩ部分消化断片を組み込んだラムダＦＩＸ^RIIラ
イブラリー（ストラタジーン社）を用いて、標識したマ
ウス由来ＴＬ４タンパク質ｃＤＮＡをプローブとしたプ
ラークハイブリダイゼーション法により単離した。ま
ず、１−１０×１０⁴pfu（plaque-forming unit）/mlに
なるように希釈したファージ溶液に、０.２％マルトー
ス，１０mM ＭｇＳＯ₄を添加したＬＢ培地で３０℃一晩
培養した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡの培養液を同
量混ぜ、３７℃、１０分間インキュベートした。該混合
液２００μｌに対して、あらかじめ５０℃に温めておい
た５mlのトップアガロース（０.７％になるようアガロ
ースを添加したＮＺＹ培地〔５g/l ＮａＣｌ、２g/l Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５g/l yeast extract、１０g/l Ｎ
Ｚアミン（ｐＨ７.５に調整）〕を加え、ＮＺＹプレー
ト（１.５％ アガロース、９cmディッシュ）に均一にな
るように重曹した後、９時間、３７℃で静置した。あら
かじめプレートの位置がわかるように印をつけたナイロ
ントランスファーメンブレン Hybond^TM−Ｎ＋（アマシ
ャム社）を該プレート上に１分間密着させることによ
り、出現したファージ粒子をメンブレン上に移した。該
メンブレンを変性溶液（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ Ｎ
ａＯＨ）を染み込ませたワットマン３ＭＭペーパー濾紙
（ワットマンインターナショナル社）上に、ファージの
ついた面を上にして７分間置いた後、中和溶液（１.５
Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７.２）、１mM
ＥＤＴＡ）を染み込ませた濾紙上に、ファージのつい
た面を上にして３分間放置した。再度この中和処理を繰
り返した後、２×ＳＳＣ溶液（０.３Ｍ ＮａＣｌ、０.
０３Ｍ クエン酸ナトリウム）で洗浄した。該メンブレ
ンを自然乾燥させた後、０.４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませ
た濾紙上に、ファージのついた面を上にして２０分間置
き、５×ＳＳＣ溶液（０.７５Ｍ ＮａＣｌ、７５mM ク
エン酸ナトリウム）で洗浄し、ハイブリダイゼーション
パックにつめた。このパックにＥＣＬ遺伝子検出システ
ム（アマシャム社）のハイブリダイゼーションバッファ
ーを５ml加えて１時間、４２℃でプレハイブリダイゼー
ションを行なった。一方、マウス由来ＴＬ４タンパク質
ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム部分（７２０
ｂｐ）をＰＣＲ反応により増幅させたＤＮＡ断片を熱変
性後に、ＥＣＬ遺伝子検出システムのラベリング試薬と
グルタルアルデヒドを同量ずつ添加して５分間３７℃で
インキュベートし標識した後、これを１０μlずつプレ
ハイブリダイゼーションパックに添加し、４２℃で１時
間インキュベートした。その後パックよりメンブレンを
取り出し、あらかじめ４２℃に保温させた一次洗浄バッ
ファー（６Ｍ 尿素、４g/l ＳＤＳ、２５ml/l ２０×Ｓ
ＳＣ）で２０分間洗浄した。これを再度繰り返した後、
室温で二次洗浄バッファー（２×ＳＳＣ）で５分間洗浄
した。これを再度繰り返した後、ＥＣＬ遺伝子検出シス
テムの検出試薬に１分間浸した後、メンブレンをＸ線フ
ィルムに重ね、感光させた。１時間後に該メンブレンを
取り出して現像を行ない、ポジティブクローンを選択し
た。ここで選択したクローンをさらに先と同様の方法に
より二次スクリーニングに供し、最終的に５つの候補ク
ローン（＃２，３，４，５，６）を得ることができた。
ＰＣＲ反応を行なった結果から、これら５つの候補クロ
ーンのうち、マウス由来ＴＬ４タンパク質をコードする
遺伝子の全領域を包含しているクローンは＃１クローン
及び＃６クローンであることがわかった。次に、マウス
由来ＴＬ４タンパク質遺伝子のコード領域を含む染色体
ＤＮＡの塩基配列を明らかにする目的でサブクローニン
グを行なった。まず得られた＃６クローンを制限酵素Ｘ
ｂａＩで消化した後、０.７％アガロースゲルを用いて
電気泳動を行ない、マウス由来ＴＬ４タンパク質遺伝子
のコード領域を含むことが考えられた約９kbのＤＮＡ断
片を切り出し、キアクイックゲル抽出キット（キアジェ
ン社）を用いて回収・精製を行なった。一方、クローニ
ングベクターｐＵＣ１９は制限酵素ＸｂａＩで消化した
後、１.０％アガロースゲルを用いて電気泳動を行な
い、２.７kbに相当するＤＮＡ断片を切り出し、キアク
イックゲル抽出キット（キアジェン社）を用いて回収・
精製を行なった後、ウシ小腸由来アルカリフォスファタ
ーゼＣＩＡＰ（宝酒造）を用いて末端の脱リン酸化を行
なった。このＣＩＡＰ処理ｐＵＣ１９に、先に調製した
＃６クローン由来のＤＮＡ断片をＤＮＡ Ligation Kit
Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに導
入して得られたアンピシリン耐性株より目的のＤＮＡ断
片が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択・単離した。ク
ローン化された＃６クローン由来のＸｂａＩ ＤＮＡ断
片の塩基配列については、種々の合成オリゴＤＮＡをプ
ライマーとし、ダイターミネーターサイクルシークエン
スＦＳレディリアクションキット（パーキンエルマー
社）を用いたシークエンス反応を、添付資料の条件に従
ってGeneAmp^R PCR System 2400で行なった後、該試料を
ＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー社）で決定
した。得られた塩基配列は遺伝子解析ソフトレーザージ
ーン（Lasergene、ディーエヌエースター（DNASTAR）
社）で確認した。その結果、マウス由来ＴＬ４タンパク
質をコードする染色体遺伝子は４つのエクソンから成る
ことが分かった〔図９〜１８〕。以上のようにして取得
した、マウス由来ＴＬ４タンパク質のコード領域を含む
＃６クローン由来のＸｂａＩ ＤＮＡ断片を保持するプ
ラスミドはｐＴＢ２０１１と命名し、大腸菌（Escheric
hia coli）ＤＨ５αに導入して得た形質転換体は、大腸
菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１１とし
た。

【００７０】参考例４ Pichia酵母を宿主としたヒト由
来ＴＬ４タンパク質の細胞外領域の発現とウエスタンブ
ロット解析 本発明のヒト由来ＴＬ４タンパク質の細胞外領域を酵母
Pichia pastorisで発現させるためのベクターとしては
ｐＰＩＣＺαＡ（インビトロジェン社）を用いた。本ベ
クターには該酵母のアルコールオキシダーゼ遺伝子（Ａ
ＯＸ１）のプロモーターの下流にPichia酵母でも機能的
な出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの分泌シグナルα
−因子をコードする遺伝子とそれに続くマルチクローニ
ングサイトが含まれており、組換え蛋白質を培地中に分
泌させることが可能である。まず本発明のヒト由来ＴＬ
４タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片はＰ
ＣＲ法により調製するが、その際用いる次の２種のプラ
イマーをＤＮＡ合成機（Oligo1000M、ベックマン社）で
合成した。 ５'−プライマー：（配列番号：２１） ５'−ＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＧＴＣ
ＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣ−３' （このプライマーは、ＥｃｏＲＩ認識配列とその３'側
にヒト由来ＴＬ４タンパク質の細胞外領域のうち、Ｎ末
端側の８５番Ｇｌｎから８アミノ酸をコードする２４塩
基を有する） ３'−プライマー：（配列番号：２２） ５'−ＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡ
ＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣ−３' （このプライマーは、ＸｂａＩ認識配列とその３'側に
終止コドン（ＴＧＡ）とヒト由来ＴＬ４タンパク質の細
胞外領域Ｃ末端５アミノ酸をコードする１５塩基に相補
的な配列を有する） 得られたプライマーをそれぞれ５０pmol、参考例１で得
られたプラスミドｐＴＢ１９３９を１００ng、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各１０nmol、２.
５ユニットのネイティブＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジーン社）とネイティブＰｆｕバッファー
（ストラタジーン社）５μｌを含む５０μｌの溶液を調
製し、サーマルサイクラー（GeneAmp^R PCR System 240
0、パーキンエルマー社）を用いて、９４℃、１分、続
いて９８℃、２０秒→５５℃、３０秒→６８℃、２分を
１サイクルとする反応を３０サイクル、最後に７２℃、
５分の条件でＰＣＲ反応を行なった。反応終了液からＰ
ＣＲ産物を回収し、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化後、予
めＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化・線状化したｐＰＩＣＺ
αＡに連結し、環状化プラスミドを得た。該プラスミド
ＤＮＡを再びＡＯＸ１座位のＳａｃＩユニーク切断部位
で切断し、線状化後、エレクトロポレーション法により
Pichia pastoris ＫＭ７１株に導入した。そこで得られ
た１００μg/ml Zeocin^TM（インビトロジェン社）含有
ＹＰＤ寒天培地（１％ yeast extract（ディフコ（Difc
o）社）、２％ Bactopeptone（ディフコ（Difco）
社）、２％ glucose（和光純薬）、２％ 寒天末（和光
純薬））上で生育可能なZeocin^TM耐性株の中から数クロ
ーンを選択し、各染色体ＤＮＡを調製後、それを鋳型に
用いた、導入プラスミドＤＮＡの染色体への組み込みを
確認するためのＰＣＲ反応を行ない、組み込みが確認さ
れたクローンを目的とする組換え蛋白質発現用形質転換
株として選択した。組換え蛋白質の発現は以下の手順で
行なった。まず、１白金耳のヒト由来ＴＬ４タンパク質
の発現用形質転換株のコロニーをＢＭＧＹ培地（１％
酵母エキス、２％ ペプトン、１００mM リン酸カリウム
（ｐＨ６.０）、１.３４％ yeast nitrogen base with
ammonium sulfate without amino acids（ディフコ（Di
fco）社）、４×１０^-5％ ビオチン、１％ グリセロー
ル）２５mlに接種し、３０℃、２０時間培養した。菌体
を遠心で集め、次にＯＤ₆₀₀＝１.０になるようにＢＭＭ
Ｙ（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００mM リン
酸カリウム（ｐＨ６.０）、１.３４％ yeast nitrogen
base with ammonium sulfate without amino acids（デ
ィフコ（Difco）社）、４×１０^-5％ ビオチン、０.５
％ メタノール）培地に再懸濁後、３０℃で培養し、１
日、または２日後に該培養液をサンプリングし、遠心し
て培養上清を得た。本培養上清を用いたウエスタンブロ
ッティングは以下の通りに行なった。まず、ヒト由来Ｔ
Ｌ４タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列の一部（配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１６６番目〜
第１８０番目までのアミノ酸配列）を含むペプチドを合
成し、該合成ペプチドを認識するウサギ抗血清を公知の
方法に従って作製した。次に上述の培養上清５μｌをサ
ンプル処理液（０.２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ Ｓ
ＤＳ、３０％ glycerol、１０％ β−mercaptoethano
l，０.０１％ bromophenol blue，ｐＨ６.８）５μｌと
混合し９５℃で５分処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（１０−２０％グラジエントゲル）
を用い、泳動終了後タンパク質ブロッティング装置（Se
miPhor^TM、ホーファ・ファルマシア・バイオテック（Ho
efer Pharmacia BioTech）社）を用いてニトロセルロー
ス膜（ファルマシア社）に泳動タンパク質を転写した。
３％ ゼラチン含有ＴＢＳ（２０mM Ｔｒｉｓ，５００mM
ＮａＣｌ，ｐＨ７.５）で膜をブロッキングして、次に
ＴＴＢＳ（０.０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で
洗浄後、１.０％ ゼラチン含有ＴＴＢＳで２０００倍に
希釈された上述のウサギ抗血清と室温で２時間反応させ
た。反応終了後、膜をＴＴＢＳで２回洗浄して、次に
１.０％ゼラチン含有ＴＴＢＳで３０００倍に希釈され
たアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗ウサギ
ＩｇＧ抗体と室温で１時間反応させた。膜をＴＴＢＳで
２回洗浄してさらにＴＢＳで１回洗浄後、ＡＰ発色キッ
ト（バイオラッド社）を用いて検出した。〔図１９〕に
そのウエスタンブロッティングの結果を示した。発現ベ
クターを導入した株の培養上清では約２０ｋＤ付近に主
たるバンドが認められ、そのシグナルの強さは経時的に
増加していたが、対照のｐＰＩＣＺαＡ導入株の培養上
清では全くシグナルが認められなかった。

【００７１】参考例５ ラット由来ＴＬ４タンパク質を
コードするｃＤＮＡのクローニング ラット由来ＴＬ４タンパク質をコードするｃＤＮＡのク
ローニングは、ＰＣＲ法によって行なった。スーパース
クリプト^TMラット肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ギブコビ
ーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００μg/
mlアンピシリン含有Terrific Broth（１２g/l Bacto-tr
yptone（ディフコ社），２４g/l Bacto-yeast extract
（ディフコ社），２.３g/l リン酸一カリウム，１２.５
g/l リン酸二カリウム，０.４％ グリセロール）で３０
℃で１６時間培養し、集菌後、キアジェンプラスミドキ
ット（キアジェン社）を用いてプラスミドｃＤＮＡライ
ブラリーを調製した。該ＤＮＡを鋳型として、また、下
記の２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーＤＮＡ
として、またTaKaRa LA Taq（宝酒造（株））をＤＮＡ
ポリメラーゼとして用いた反応系でＰＣＲ反応を行なっ
た。 ５'−ＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣ
ＴＣ−３'（配列番号：２３） ５'−ＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣＧＴＣＡ
ＴＡＧＣＣ−３'（配列番号：２４） 反応はサーマルサイクラー（GeneAmp^R PCR System 240
0，パーキンエルマー社）を用いて、９４℃・１分を１
サイクル、９８℃・２０秒→５５℃・３０秒→７２℃・
３分を３５サイクル、７２℃・２分を１サイクル、４℃
・放置のプログラムで行なった。反応終了液の一部を
１.０％アガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ反応で増幅
された単一のＤＮＡ断片に対応するバンドを確認の後、
キアクィックゲルエキストラクションキット（キアジェ
ン社）を用いて該ＤＮＡ断片を回収し、その塩基配列を
決定するためにpT7Blue T-vector（ノバジェン社）のＴ
クローニングサイトにＤＮＡライゲーションキットバー
ジョン２（宝酒造（株））を用いて挿入・連結した。該
ライゲーション液を大腸菌ＤＨ５α株に導入後、アンピ
シリン含有ＬＢ寒天培地上で出現してきたアンピシリン
耐性形質転換株のコロニー群の中から２クローンを選択
し、各々からプラスミドＤＮＡを調製した。両クローン
の各挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するため、各プラスミ
ドＤＮＡを鋳型に、２種（ＰＲＭ−００７、ＰＲＭ−０
０８）の市販プライマーＤＮＡ（東洋紡績（株））の
他、ＤＮＡ合成装置（Oligo1000M、ベックマン社）で合
成したオリゴＤＮＡをプライマーＤＮＡとして用い、Th
ermo Sequenase^TM dye terminator cycle sequencing p
re-mix kit（アマシャム社）を用いたサイクルシークエ
ンス反応を添付資料の条件に従ってGeneAmp^R PCR Syste
m 2400で行なった後、該試料をＤＮＡシーケンサー３７
３Ａ（パーキンエルマー社）で分析した。得られた塩基
配列は遺伝子解析ソフトレーザージーン（Lasergene、
ディーエヌエースター（DNASTAR）社）で解析した。そ
の結果、両クローンとも、Ｔクローニングサイトには、
配列番号：３で表される２３９個のアミノ酸からなるラ
ット由来ＴＬ４タンパク質をコードする配列番号：１０
で表される７１７個の塩基配列からなるオープンリーデ
ィングフレーム（Open reading frame）を含む７８４塩
基対の塩基配列のＤＮＡ断片が含まれていた〔図２０〜
２１〕。このラット由来ＴＬ４タンパク質と参考例１で
得られた配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有する
ヒト由来ＴＬ４タンパク質とはアミノ酸レベルで７５％
の相同性を有しており、それらをコードするＤＮＡは塩
基レベルで７４％の相同性を有していた。また、このラ
ット由来ＴＬ４タンパク質と参考例２で得られた配列番
号：２で表されるアミノ酸配列を有するマウス由来ＴＬ
４タンパク質とはアミノ酸レベルで９６％の相同性を有
しており、それらをコードするＤＮＡは塩基レベルで９
４％の相同性を有していた。得られたラット由来ＴＬ４
タンパク質をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐ
ＴＢ２０１２を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５αに
導入して形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ
５α／ｐＴＢ２０１２を得た。

【００７２】実施例１ 昆虫細胞発現系を用いた可溶型
ヒトTL4の生産 ヒトＴＬ４タンパク質をコードするＤＮＡを挿入したプ
ラスミドｐＴＢ１９４０を鋳型にして、５'末端部分に
制限酵素EcoRIの切断部位を付加した合成オリゴヌクレ
オチド（５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡ
ＡＧＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣ３'（配列番号：２
６））と３’末端部にXbaIの制限酵素部位を付加した合
成オリゴヌクレオチド（５'ＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣ
ＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣ３’
（配列番号：２７））をプライマーとして用いてＰＣＲ
反応を行い、ＴＬ４の細胞外領域に相当する８４残基目
のイソロイシンから２４０残基目のバリンをコードする
可溶型ＴＬ４の増幅ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ反応はＤ
ＮＡサーマルサイクラー９６００を使用し、９４℃で１
分間処理した後、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用い
て９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１分間
のサイクルを２５回繰り返した。このようにして得られ
た増幅断片は制限酵素EcoRI及びXbaＩで処理した。また
ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧプラスミドを同じく制限酵素EcoRI
及びXbaＩで処理して、プレプロトリプシンのシグナル
配列並びにタグとして精製・検出を容易にする目的で付
加されたＦＬＡＧタンパク質を各々コードするＤＮＡ断
片を取得した。該プレプロトリプシン-ＦＬＡＧタンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片の３'末端側に制限酵素処
理を行った可溶型ＴＬ４の増幅ＤＮＡ断片を連結した。
得られた該プレプロトリプシン-ＦＬＡＧタンパク質-可
溶型ヒトＴＬ４タンパク質をコードするＤＮＡ断片を制
限酵素SacＩ及びＸｂａＩで処理し、同じく制限酵素Sac
Ｉ及びＸｂａＩで処理した昆虫細胞発現用ベクターpFAS
T Bac1（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬライフテック社）に挿入
した（図２２）。得られたＴＬ４発現プラスミドpFAST
Bac1/shTL4は、昆虫細胞においてプレプロトリプシン
を利用して細胞培養上清中に分泌され、かつＦＬＡＧタ
グが付加された融合タンパク質として産生されることが
期待された。以後の操作については、Bac-to-Bac Bacu
lovirus Expression Systems（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬラ
イフテック社）を用い、実験方法については添付のプロ
トコールに従った。すなわち、得られたヒトＴＬ４タン
パク質をコードするＤＮＡを挿入した組換えプラスミド
pFAST Bac1/shTL4を添付の大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃに導
入し形質転換菌を得た後、その菌体より組換えバックミ
ドを回収した。得られた組換えバックミドは添付のセル
フェクチン試薬を用いてＳｆ９昆虫細胞へ形質導入し、
組換えバキュロウイルスを得た。これをＳｆ９昆虫細胞
へ再度感染させた後、４日ないし５日間培養を行い、培
養上清中に分泌されたＦＬＡＧヒトＴＬ４融合タンパク
質を抗ＦＬＡＧ抗体カラムを用いて精製し、shTL4と名
づけ以後の実験に供した。

【００７３】実施例２ 可溶型ヒトTL4による正常ヒト
肝実質細胞のDNA合成促進作用の確認 正常ヒト肝実質細胞に対するshTL4のDNA合成に及ぼす作
用を調べるために、以下の実験を行った。すなわちCSC
無血清培地（Cell Systems社）で懸濁した正常ヒト肝実
質細胞（Cell Systems社、#3716）をI型コラーゲンコー
ト96穴培養プレート（FALCON社）に2500個/well/50mlで
播種し、同時に実施例１の方法により取得、精製したsh
TL4を3倍公比で最終濃度が0.1 ng/mlから10 ng/mlにな
るように50ml/well（n=2）で添加し3日間CO₂インキュベ
ータ−（37℃、5% CO₂）で培養した。DNA合成の検出に
はCell Proliferation ELISA, BrdU kit（BOEHRINGER
社）を用いた。すなわち最終希釈率が1000倍になるよう
にブロモデオキシウリジン（BrdU）を各ウエルに添加し
1晩培養した後、培養液を除去しFix Denat溶液を200ml/
wellで添加した後30分間室温で細胞を固定した。その
後、溶液を除去しHRP標識抗BrdU抗体溶液を100ml/well
で添加した後90分間室温で作用させた。PBSで洗浄後、
基質を50ml/wellで添加し30分間発色させ、96穴プレー
トリーダー（マルチスチャンマルチソフト：大日本製
薬）で波長340nmでの吸光と、対照として492nmの吸光を
測定した。その結果、shTL4は用量依存的に肝実質細胞
のBrdUの取り込み、すなわちDNAの合成を促進すること
が明らかとなった（図２３）。

【００７４】実施例３ 可溶型ヒトTL4による飢餓状態
下での正常ヒト肝実質細胞のDNA合成促進作用 飢餓状態下でのshTL4の作用を検討するために、ハムF-1
2培地とライホビッツL-15培地（GIBCO社）を当量混合し
た基礎培地に、各最終濃度1% BSA、5mMグルコース（WAK
O社）、10^-8Mデキサメタゾン（WAKO社）、10^-8Mウシイ
ンスリン（GIBCO社）となるように添加したものを基本
培地とした。この培地に懸濁した正常ヒト肝実質細胞を
I型コラーゲンコート96穴培養プレート（FALCON社）に2
500個/well/50mlで播種し、CO₂インキュベーターで24時
間培養した。shTL4、ヒトEGF、ヒトヘパリン結合型EGF
（HB-EGF）、ヒトTGFα、またはヒトHGF（各増殖因子：
R&D社）を3倍公比で最終濃度0.03 ng/mlから100ng/mlと
なるように50ml/well（n=3）で添加し3日間培養した
後、実施例1と同様にDNA合成の検出を行った。その結
果、shTL4は飢餓状態においても、他の増殖因子と同様
な肝実質細胞のBrdUの取り込み、すなわちDNA合成を促
進した。したがってshTL4は肝実質細胞の増殖過程にお
いて促進的な作用を有することが示された（図２４）。

【００７５】実施例４ 可溶型ヒトTL4のアクチノマイ
シンD（ActD）との併用による肝実質細胞に対する細胞
障害活性 実施例３で記載した基本培地に最終濃度10%となるよう
新生仔牛血清（GIBCO社）を添加した培地に懸濁した正
常ヒト肝実質細胞をI型コラーゲンコート96穴培養プレ
ート（FALCON社）に5000個/well/100mlで播種しCO₂イン
キュベーターで1昼夜培養した。その後、基本培地に最
終濃度1%となるよう新生仔牛血清（GIBCO社）を添加し
た培地に置換し、1.33mMのActD（WAKO社）を50ml/well
で添加し30分間CO₂インキュベーターで培養した。shTL
4、ヒトTNFα（Genzyme社）、ヒトLTα（Genzyme社）、
抗ヒトFas抗体（CH-11：MBL社）、ヒトHB-EGF（R&D
社）、ヒトHGF（R&D社）を各々最終濃度0.3 ng/mlから1
00ng/mlとなるように3倍公比で50ml/wellづつ添加し、2
4時間CO₂インキュベーターで培養した。細胞障害活性の
指標として、LDH-Cytotoxic Test Wako（WAKO社）を用
いて培養上清中のラクトースデヒドロゲナーゼ（LDH）
活性を測定した。すなわち培養上清を10ml、PBSを40m
l、基質50mlを混合し室温で45分間放置した後、プレー
トリーダーで620nmの吸光を測定した。LDH活性は培養上
清の代わりに培地を用いた値をブランク値とし、0.5% T
ween20（BioRad社）を含む培地で細胞を融解したものを
100%とした。TNFα、抗Fas抗体は用量依存的に培養上清
中のLDH活性を増加させたのに対し、shTL4添加では明ら
かな増加は認められなかった。すなわち肝実質細胞に対
してTNFα、抗Fas抗体は顕著な細胞障害活性を有するの
に比べ、shTL4にはそのような活性がないことがわかっ
た。LTαについては明らかなLDH活性の上昇は検出でき
なかったが、顕微鏡観察では若干の死細胞が認められた
（図２５）。

【００７６】実施例５ アネキシンVとPropidium Iodid
e（P.I.）を用いたアポトーシス誘導活性の検出 実施例４で見出したshTL4とTNFα、抗Fas抗体あるいはL
Tαとの相違点をアネキシンVとP.I.を用いたアポトーシ
ス検出系で検討した。正常ヒト肝実質細胞をI型コラー
ゲンコート6穴プレート（FALCON社）に150000個/well/2
mlで播種し、CO₂インキュベーターで1昼夜培養した後、
実施例4と同様に培地交換をした後、最終濃度が333nMと
なるようにActDを添加し30分間培養した。その後、最終
濃度が100ng/mlとなるようにshTL4、TNFα、LTα、抗Fa
s抗体を各々添加し15時間培養した後、細胞を回収し
た。アポトーシスの検出にはEarly Apoptosis detectio
n kit（KAMIYA BIOMEDICAL社）を用いた。すなわちトリ
プシン処理で細胞を回収した後、400mlのBinding buffe
rに懸濁し、10mlのFITC-アネキシンV溶液と10mlのP.I.
溶液を添加し30分間暗所で放置した。染色した細胞をFA
CScan（Becton Dekinson社）で解析した。 解析条件はF
SC：E-1、9.5、lin、SSC：330、1.0、lin、FL-1：320、
log、FL-2：320、log、comp：FL1-1.1%FL2、FL2-24.4%F
L1を用いた。対照の細胞と比較してTNFα、LTα、抗Fas
抗体を添加した細胞ではFL-1、FL-2の蛍光強度が上昇し
ていたが、shTL4を添加した細胞は上昇しなかった、す
なわちTNFα、LTα、抗Fas抗体を添加した細胞はアネキ
シンV、P.I.で染色されたが、shTL4を添加した細胞は染
色されなかった。このことはTNFα、LTα、抗Fas抗体に
は肝実質細胞に対するアポトーシス誘導能があるもの
の、shTL4には誘導能がないことを示す。以上の結果か
らshTL4は他のTNFファミリーリガンドと異なり、肝実質
細胞を傷害しないことが明らかとなった（図２６）。

【００７７】実施例６ ヒト肝臓由来の新規Fasリガン
ド様可溶型蛋白質をコードするcDNAのクローニングと塩
基配列の決定 ヒト肝臓cDNAを鋳型とし、2個のプライマー、プライマ
ー１(配列番号：２８)及びプライマー２(配列番号：２
９)を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の
組成は上記cDNA、33.5ngを鋳型として使用し、Advantag
e 2 PolymeraseMix(CLONTECH社)1/50量、プライマー１
(配列番号：２８)及びプライマー２(配列番号：２９)を
各々20μM、dNTPs 2.5mM、及び酵素に添付のバッファー
を1/10を加え、総50μlの液量とした。PCR反応は95℃
・30秒の後95℃・10秒、58℃・10秒、72℃・45秒のサ
イクルを30回最後に72℃・2分の伸長反応を行った。
該PCR反応後の反応産物は、723塩基と615塩基の二つの
産物を有するが、615塩基対の反応産物をゲルから回収
し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社)の方法に
従い、精製を行った。精製産物をTAクローニングキット
(Invitrogen社)の処方に従い、プラスミドベクターpCR
2.1-TOPO vectorへサブクローニングした。これを大腸
菌DH5αに導入し、目的のcDNAを持つクローンをアンピ
シリンを含むLB寒天培地中で選択した後、個々のクロー
ンの配列を解析した結果、新規Fasリガンド様可溶型蛋
白質をコードする612塩基対のcDNA配列(配列番号：３
０)を得た。このcDNAより導き出されるアミノ酸配列(配
列番号：３１)を有する新規Fasリガンド様可溶型蛋白質
をhTL4-2と命名した。

【００７８】実施例７ 各種増殖因子による正常ヒト肝
実質細胞のＤＮＡ合成誘導における可溶型ヒトＴＬ４の
相乗的なＤＮＡ合成促進作用 実施例３で認められた可溶型ヒトＴＬ４（shTL4）によ
るＤＮＡ合成促進作用が、増殖因子の存在下でどのよう
に発揮されるかを明らかにするため、各種増殖因子存在
下での効果を調べた。まずハムＦ１２培地とライホビッ
ツＬ１５培地（ＧＩＢＣＯ社）を等量混合した基礎培地
に、最終濃度が１％のＢＳＡ、５ｍＭグルコース、１０
^―8Ｍデキサメタゾン（以上、ＷＡＫＯ社）、１０^―8Ｍ
ウシインスリン（ＧＩＢＣＯ社）を添加したものを基本
培地とした。この培地に正常ヒト肝実質細胞を懸濁し、
あらかじめＥＨＳ細胞由来細胞外基質matrigel（ファル
コン社）溶液を１０μｇ／ｗｅｌｌの濃度になるように
添加してコートした９６穴培養プレート（ファルコン
社）上に２５００個/ｗｅｌｌで播種し、ＣＯ₂インキュ
ベーターで２４時間培養した。shTL4は最終濃度が１ま
たは１０ｎｇ／ｍｌの用量になるように、またヒトＥＧ
Ｆは0.1, 0.3, 1, 3, 10ng/mlの用量で、ヒトヘパ
リン結合型EGF（ＨＢ−ＥＧＦ），ヒトＴＧＦαおよび
ヒトＨＧＦ（以上、Ｒ＆Ｄ社）は最終濃度が各々１、
３、１０、３０、１００ng/mlとなるように添加し３日
間培養した後、実施例１と同様にＤＮＡ合成の検出を行
った（ｎ＝３）。その結果、matrigelをコートしたプレ
ート上では、肝実質細胞の増殖因子によるＤＮＡ合成の
低応答性が認められ、これはmatrigelから入る増殖抑制
性のシグナルによる脱分化抑制の結果であると考えてい
るが、このような条件下においてもshTL4は肝実質細胞
のBrdUの取り込み、すなわち肝細胞のＤＮＡ合成を促進
し、それは他の増殖因子と相乗的に作用することがわか
った。従って、shTL4は肝実質細胞の増殖因子による増
殖過程において、ＤＮＡ合成の相乗的な誘導促進因子で
あることが示された（図２７）。

【００７９】実施例８ 四塩化炭素投与肝障害モデルマ
ウスにおける各遺伝子発現変動の検討 四塩化炭素(CCl₄)投与肝障害モデルマウスの肝臓におい
て、マウスTL4をはじめとする種々の遺伝子がどのよう
な発現変動を示すのかをPCR法により増幅された特異的P
CR鎖をABI PRISM^TM7700 Sequence Detection System(SD
S7700)(PE Applied Biosystems)によって検出、定量す
ることにより検討した。まずCCl₄投与肝障害モデルマウ
スの作製と肝臓の摘出を行った。すなわちC57BL/6マウ
ス(雄、７週齢)(日本SLCより購入)の体重測定を行い、7
0％エタノールで腹部を消毒した後、 CCl₄ (和光純薬)
をコーンオイル(和光純薬）で8倍希釈したサンプルを0.
5ml/kgで各マウス(N=3)に腹腔内投与した。その1、4、
7、12、24、48、72時間経過後に再び体重測定を行い、
エーテル麻酔の後、肝臓を摘出し、肝臓の重量を測定し
た。摘出した肝臓の外側左葉部分はホルマリン保存を行
い、残りの肝臓は3匹分をまとめて即座に液体窒素中で
凍結させ、以後-80℃保存を行った。コントロールとし
てコーンオイルのみを腹腔内投与したモデルマウスを作
製し、同様の一連の操作を行った。またプラズマ中のGP
T活性は、各時間での肝臓摘出の前にヘパリナイズを予
め行ったシリンジを用いて心採血を行い、採取した血液
を3000回転、10分間の遠心して調製した血漿中のGPT活
性を測定した。血漿中のGPT活性の測定は、エスティエ
ーテストワコー(和光純薬)を用いて行った。方法は添付
のプロトコールに準じた。その結果、 CCl₄投与マウス
において血漿中のGPT活性は投与後24時間をピークとし
て上昇し、その後低下した。コーンオイルを投与したコ
ントロール群ではGPT活性の上昇は認められなかったこ
とより、 CCl₄依存的な肝障害を惹起することが出来
た。また肝重量はCCl₄投与群では24時間まで減少し、そ
の後増加する傾向にあり、一方コントロール群ではほぼ
一定の値を示していた。このことから肝障害成立後、肝
再生が起きていることが示された。一方、肝組織のPCNA
(Proliferating Cell Nuclear Antigen)免疫染色
は、以下の方法で行った。すなわち、ホルマリン固定し
た肝臓を脱水包埋装置にて脱水、透徹、パラフィン浸透
させた後、融点60℃のパラフィンを使用して包埋皿に組
織を包埋し、2〜３μの厚さで薄切した。切片をスライ
ドガラスにのせ、48〜52℃の湯に浸し伸展させ、37℃の
孵卵器で2時間以上乾燥させた後、キシレン、エタノー
ルを順次通して脱パラフィン処理し、十分水洗した。0.
01Mクエン酸バッファー(pH6)中でオートクレーブ121
℃、10分間の処理を行った後、0.03%過酸化水素水と0.1
%NaN₃・PBSの混合溶液中に20分間浸し、内因性処理を行
い更に、100倍希釈した抗PCNAマウスモノクローナル抗
体クローンPC10(DAKO社)含有液中で室温で60分間浸透さ
せ、その後PBSで40分間洗浄した。その後100倍希釈した
ビオチン化ウサギ抗マウスIg,F(ab')₂(DAKO社)含有液中
で室温で60分間浸透させた後PBSで40分間洗浄した。3次
試薬としてストレプトアビジンとビオチンの複合体/パ
オキシダーゼ標識(DAKO社)の酵素試薬中で30分間反応さ
せ、 PBSで40分間洗浄した後、 DAB(3,3'-diaminobenzi
dine tetrahydrochloride)7030mg、0.05ＭTris-HCl(pH
7.6)、0.01％過酸化水素水中で発色程度を見ながら発色
させ、ヘマトキシリン液で核染色を行い、脱水、透徹の
操作を経て封入し、PCNA陽性細胞数を光学顕微鏡にてカ
ウントした。その結果、CCl₄投与後4時間目から顕著な
陽性細胞が確認され、それは少なくとも72時間後も継続
したことから、旺盛な肝再生がCCl₄により誘発されたこ
とが分かった。次にCCl₄投与肝障害モデルマウスから摘
出した肝臓から以下の方法を用いてトータルRNAを調製
した。すなわち-80℃保存した肝臓のサンプルを再び液
体窒素中に入れ、気泡が出なくなったことを確認してか
らスパチュラで薬包紙の上にのせ、上から木槌で破砕
し、予め用意しておいたISOGEN(（株）ニッポンジーン)
30ml中に入れる。事前に約10%の過酸化水素水で処理
し、RNaseフリーの滅菌水(（株）ニッポンジーン)でリ
ンスしたポリトロンホモジナイザー(KINEMATICA社)でホ
モジナイズし、室温で15分間静置した。新しい50ml用の
チューブに15mlのホモジネートを移し、さらに15mlのIS
OGENを加え、よく混合し、6mlのクロロホルム(和光純薬
工業(株))を加えボルテックスで撹拌し、室温で5分間静
置した。10000回転、15分間(4℃)の遠心分離後、水層を
10ml回収し等量の2-プロパノール(和光純薬工業(株))を
加えて、穏やかに混合し室温で10分間静置した。10000
回転、10分間(4℃)の遠心分離後、ゲル様のペレットと
してチューブの内壁に付着したRNA沈澱を回収し、70%エ
タノールでリンスした後、風乾した。58℃の温浴水層中
で10〜20mlのRNaseフリーの滅菌水に溶解し、濃度を測
定し、トータルRNA(tRNA)溶液を得た。次に該tRNAをMes
sageCleanKit(Gen Hunter Corporation社)を用いてDNas
eI処理した。該反応における反応組成はtRNA、100μg
、添付バッファー11.4μl、DNaseI2μlを加え、総113.
4μlの液量とした。37℃・30分の反応を行った後、RNea
sy Mini Kit(QIAGEN社)のRNA cleanupのプロトコールに
従い、RNAを精製した。該精製RNAをTaqMan Gold RT-PCR
Kit(PE Applied Biosystems)のプロトコールに従い、
リバーストランスクリプション(RT)反応を行った。該反
応における反応組成はtRNA2μg 、10xTaqMan RT Buffer
10μl、5.5mM MgCl₂、0.5mM dNTPs、2.5μM Random Hex
amer、 RNase Inhibitor0.4U/μl 、MultiScribe Rever
seTranscriptase1.25 U/μlを加え、総100μlの液量と
した。25℃・10分、48℃・30分、95℃・5分のPCR反応を
行った後、cDNA溶液として-20℃保存を行った。CCl₄投
与肝障害モデルマウスにおける各遺伝子発現変動はTaqM
an法を用いて定量した。すなわちTaqManプローブ、プラ
イマーの設計はPrimer Express(PE Applied Biosystems
社製ソフトウエアー)を用いて行った。マウスTL4のTaq
Manプローブ配列(配列番号：３２）、 TaqManプライマ
ー配列(配列番号：３３、３４）、マウスTNFαのTaq Ma
nプローブ配列(配列番号：３５）、 TaqManプライマー
配列(配列番号：３６、３７）、マウスc-mycのTaq Man
プローブ配列(配列番号：３８）、 TaqManプライマー配
列(配列番号：３９、４０）、マウスHB-EGFのTaq Manプ
ローブ配列(配列番号：４１）、 TaqManプライマー配列
(配列番号：４２、４３）、マウスTGF-αのTaq Manプロ
ーブ配列(配列番号：４４）、 TaqManプライマー配列
(配列番号：４５、４６）を選択し、合成を行った。Taq
Man PCR反応における反応組成は既に調製したcDNAを鋳
型として使用し、2x TaqMan UniversalPCR Master Mix
(PE Applied Biosystems)12.5μl、200nM TaqManプロー
ブ、TaqManプライマー各々100nMになるように加え、総2
5μlの液量とした。PCR反応は50℃・2分、95℃・10分の
後(95℃・15秒、62℃・1分)のサイクルを40回行い、反
応終了と同時にPCRの定量的自動解析を行った。また各c
DNA間のばらつきは、TaqMan Rodent GAPDH Control Rea
gents(PE Applied Biosystems)を用いて補正を行った。
以下に上記各プローブ、プライマーの塩基配列を記載す
る。 配列番号：３２ ； CCAACGCCAGCTTGATAGGTATTGGTGG 配列番号：３３ ； CCCAGCAGCACATCTTACAGGA 配列番号：３４ ； AGGCCAAGTCGTGTCTCCCATA 配列番号：３５ ； CTATGGCCCAGACCCTCACACTCAGATCAT 配列番号：３６ ； CAAATGGCCTCCCTCTCATCAG 配列番号：３７ ； GGCTACAGGCTTGTCACTCGAA 配列番号：３８ ； ACAACGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTGA 配列番号：３９ ； GTGACCAGATCCCTGAATTGGAA 配列番号：４０ ； GTAGGCGGTGGCTTTTTTGAG 配列番号：４１ ； CCTCTTGCAAATGCCTCCCTGGTTACCA 配列番号：４２ ； ATACAAGGACTACTGCATCCACGG 配列番号：４３ ； GTAGAGTCAGCCCATGACACCTGT 配列番号：４４ ； ＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣ
ＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡ 配列番号：４５ ； AAGAAGCAAGCCATCACTGCC 配列番号：４６ ； ACAGTGTTTGCGGAGCTGACAG その結果、図２８に示すように、CCl₄投与群での肝臓中
のTL4メッセンジャーRNA(mRNA)量は7時間をピークとし
て上昇し、その後発現は低下した。一方、コントロール
群では4時間をピークとして比較的高い発現上昇を示し
たが、肝臓中のTNFα mRNA量は24時間後に発現の上昇が
認められ、TL4よりも発現がかなり遅れることが明らか
となった。一方HB-EGFはCCl₄投与4時間後に発現のピー
クをむかえ、またc-mycは投与4時間後に顕著な上昇があ
り、以後12時間目をピークとして、この上昇は持続し
た。肝再生における重要な肝細胞増殖因子であるHB-EGF
の発現上昇がCCl₄投与後4時間目という比較的早い時期
に起こること、それに連動するようにc-myc、PCNA陽性
細胞の上昇とTL4の発現上昇が起こることから、従来言
われていた肝再生時におけるTNFαの役割よりもむしろT
L4がより積極的に障害肝の再生に関与している可能性が
示された。TL4が細胞レベルにおいて、正常肝実質細胞
のHB-EGFをはじめとする肝細胞増殖因子によるDNA合成
を相乗的に促進することと考え合わせ、これらの事実か
らTL4が障害肝の修復過程において重要な役割を担って
いることが示唆される。

【００８０】実施例９ 昆虫細胞発現系を用いた可溶型
マウスTL4の生産 マウスTL4タンパク質（配列番号：２）をコードするDNA
を挿入したプラスミドpTB1958を鋳型にして、５'末端部
分に制限酵素EcoRIの切断部位を付加した合成オリゴヌ
クレオチド（5'-GTAGAATTCGGCCAACCCAGCAGCACATCTTAC-
3'（配列番号:４８））と3'末端部にXbaIの制限酵素部
位を付加した合成オリゴヌクレオチド（5'-AAATCTAGATA
TTGCTGGGTTTGAGGTGAGTCC-3'（配列番号:４９））をプラ
イマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＴＬ４の細胞外
領域に相当する90残基目のアラニンから239残基目のバ
リンをコードする可溶型ＴＬ４の増幅ＤＮＡ断片を得
た。ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマルサイクラー９６００を
使用し、９４℃で１分間処理した後、ＥｘＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて９８℃で１０秒間、60℃で５秒
間、７２℃で１.5分間のサイクルを２５回繰り返した。
このようにして得られた増幅断片は制限酵素EcoRI及びX
baＩで処理した。またｐＣＭＶ−ＦＬＡＧプラスミドを
同じく制限酵素EcoRI及びXbaＩで処理して、プレプロト
リプシンのシグナル配列並びにタグとして精製・検出を
容易にする目的で付加されたＦＬＡＧタンパク質を各々
コードするＤＮＡ断片を取得した。該プレプロトリプシ
ン-ＦＬＡＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片の３'末
端側に制限酵素処理を行った可溶型ＴＬ４の増幅ＤＮＡ
断片を連結した。得られた該プレプロトリプシン-ＦＬ
ＡＧタンパク質-可溶型マウスＴＬ４タンパク質をコー
ドするＤＮＡ断片を制限酵素SacＩ及びＸｂａＩで処理
し、同じく制限酵素SacＩ及びＸｂａＩで処理した昆虫
細胞発現用ベクターpFAST Bac1（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
ライフテック社）に挿入した。得られたＴＬ４発現プラ
スミドpFAST Bac1/smTL4は、昆虫細胞においてプレプ
ロトリプシンを利用して細胞培養上清中に分泌され、か
つＦＬＡＧタグが付加された融合タンパク質として産生
されることが期待された。以後の操作については、Bac-
to-Bac Baculovirus Expression Systems（ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬライフテック社）を用い、実験方法について
は添付のプロトコールに従った。すなわち、得られたマ
ウスＴＬ４タンパク質をコードするＤＮＡを挿入した組
換えプラスミドpFAST Bac1/smTL4を添付の大腸菌ＤＨ
１０Ｂａｃに導入し形質転換菌を得た後、その菌体より
組換えバックミドを回収した。得られた組換えバックミ
ドは添付のセルフェクチン試薬を用いてＳｆ９昆虫細胞
へ形質導入し、組換えバキュロウイルスを得た。これを
1.5x10⁶/mlに調製したＳｆ９昆虫細胞へ総体積の1/20量
を再度感染させた後、2日間培養を行い、培養上清中に
分泌されたＦＬＡＧマウスＴＬ４融合タンパク質を回収
した。これをUF膜(MWCO 3000 0.1平方メートル)で濃縮
し、TBS(50mM Tris-HCl,150mM NaCl pH7.4)に置換し
た。抗ＦＬＡＧ M2抗体カラムを用いて精製し、溶出液
をSephadex G-25カラムで精製後、再度抗ＦＬＡＧ M2抗
体カラムを用いて精製し、各画分をSDS-PAGEで確認後、
純度の高い画分をまとめて回収した。これをCentriplus
10Kで濃縮し、 Sephadex G-25カラムで精製後PBSに置
換した。得られたＦＬＡＧマウスＴＬ４融合タンパク質
をsmTL4と名づけ以後の実験に供した。

【００８１】実施例１０ コンカナバリンA投与肝障害
モデルマウスにおける各遺伝子発現変動の検討 コンカナバリンA(ConA)投与肝障害モデルマウスの肝臓
において、TL4やTNFa遺伝子がどのような発現変動を示
すのかをPCR法により増幅された特異的PCR鎖をABI PRIS
M^TM7700 Sequence Detection System(SDS7700)(PE Appl
ied Biosystems)によって検出、定量することにより検
討した。まずConA投与肝障害モデルマウスの作製と肝臓
の摘出を行った。すなわちC57BL/6マウス(雄、6週齢)
(日本SLCより購入)の体重測定を行い、70％エタノール
で腹部を消毒した後、 ConA(和光純薬)をPBSで5mg/mlの
濃度になるように調製したサンプルを20mg/kgで各マウ
ス(N=3)に腹腔内投与した。その1、4、7、12、24時間経
過後にエーテル麻酔の後、肝臓を摘出し、3匹分をまと
めて即座に液体窒素中で凍結させ、以後-80℃保存を行
った。コントロールとしてPBSのみを腹腔内投与したモ
デルマウスを作製し、同様の一連の操作を行った。また
プラズマ中のGPT活性は、各時間での肝臓摘出の前にヘ
パリナイズを予め行ったシリンジを用いて心採血を行
い、採取した血液を3000回転、10分間の遠心して調製し
た血漿中のGPT活性を測定した。血漿中のGPT活性の測定
は、エスティエーテストワコー(和光純薬)を用いて行っ
た。方法は添付のプロトコールに準じた。その結果、 C
onA投与マウスにおいて血漿中のGPT活性は投与後7時間
目から上昇し、24時間目まで高値を持続した。 PBSを投
与したコントロール群ではGPT活性の上昇は認められな
かったことより、 ConA依存的な肝障害を惹起すること
が出来た(図２９)。次にConA投与肝障害モデルマウスか
ら摘出した肝臓から以下の方法を用いてトータルRNAを
調製した。すなわち-80℃保存した肝臓のサンプルを再
び液体窒素中に入れ、気泡が出なくなったことを確認し
てからスパチュラで薬包紙の上にのせ、上から木槌で破
砕し、予め用意しておいたISOGEN(（株）ニッポンジー
ン)30ml中に入れる。事前に約10%の過酸化水素水で処理
し、RNaseフリーの滅菌水(（株）ニッポンジーン)でリ
ンスしたポリトロンホモジナイザー(KINEMATICA社)でホ
モジナイズし、室温で15分間静置した。新しい50ml用の
チューブに15mlのホモジネートを移し、さらに15mlのIS
OGENを加え、よく混合し、6mlのクロロホルム(和光純薬
工業(株))を加えボルテックスで撹拌し、室温で5分間静
置した。10000回転、15分間(4℃)の遠心分離後、水層を
10ml回収し等量の2-プロパノール(和光純薬工業(株))を
加えて、穏やかに混合し室温で10分間静置した。10000
回転、10分間(4℃)の遠心分離後、ゲル様のペレットと
してチューブの内壁に付着したRNA沈澱を回収し、70%エ
タノールでリンスした後、風乾した。58℃の温浴水層中
で10〜20mlのRNaseフリーの滅菌水に溶解し、濃度を測
定し、トータルRNA(tRNA)溶液を得た。次に該tRNAをMes
sageCleanKit(Gen Hunter Corporation社)を用いてDNas
eI処理した。該反応における反応組成はtRNA、100μg
、添付バッファー11.4μl、DNaseI2μlを加え、総113.
4μlの液量とした。37℃・30分の反応を行った後、RNea
sy Mini Kit(QIAGEN社)のRNA cleanupのプロトコールに
従い、RNAを精製した。該精製RNAをTaqMan Gold RT-PCR
Kit(PE Applied Biosystems)のプロトコールに従い、
リバーストランスクリプション(RT)反応を行った。該反
応における反応組成はtRNA2μg 、10xTaqMan RT Buffer
10μl、5.5mM MgCl₂、0.5mM dNTPs、2.5μM Random Hex
amer、 RNase Inhibitor0.4U/μl 、MultiScribe Rever
seTranscriptase1.25 U/μlを加え、総100μlの液量と
した。25℃・10分、48℃・30分、95℃・5分のPCR反応を
行った後、cDNA溶液として-20℃保存を行った。ConA投
与肝障害モデルマウスにおける各遺伝子発現変動はTaqM
an法を用いて定量した。すなわちTaqManプローブ、プラ
イマーの設計はPrimer Express(PE Applied Biosystems
社製ソフトウエアー)を用いて行った。マウスTL4のTaq
Manプローブ配列(配列番号：５０）、 TaqManプライマ
ー配列(配列番号：５１、５２）、マウスTNFαのTaq Ma
nプローブ配列(配列番号：５３）、 TaqManプライマー
配列(配列番号：５４、５５）を選択し、合成を行っ
た。TaqMan PCR反応における反応組成は既に調製したcD
NAを鋳型として使用し、2x TaqMan Universal PCR Mast
er Mix(PE Applied Biosystems)12.5μl、200nM TaqMan
プローブ、TaqManプライマー各々100nMになるように加
え、総25μlの液量とした。PCR反応は50℃・2分、95℃
・10分の後(95℃・15秒、62℃・1分)のサイクルを40回
行い、反応終了と同時にPCRの定量的自動解析を行っ
た。また各cDNA間のばらつきは、TaqMan RodentGAPDH C
ontrol Reagents(PE Applied Biosystems)を用いて補正
を行った。以下に上記各プローブ、プライマーの塩基配
列を記載する。 配列番号：５０ ； CCAACGCCAGCTTGATAGGTATTGGTGG 配列番号：５１ ； ＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＴ
ＴＡＣＡＧＧＡ 配列番号：５２ ； AGGCCAAGTCGTGTCTCCCATA 配列番号：５３ ； CTATGGCCCAGACCCTCACACTCAGATCAT 配列番号：５４ ； CAAATGGCCTCCCTCTCATCAG 配列番号：５４ ； GGCTACAGGCTTGTCACTCGAA その結果、ConA投与群での肝臓中のTL4メッセンジャーR
NA(mRNA)量は1時間後にコントロール群の約10倍に上昇
し、その後24時間まで4〜5倍の発現上昇を保持してい
た。一方、肝臓中のTNFα mRNA量は1時間後にコントロ
ール群の約60倍上昇し、その後24時間まで10倍前後の発
現上昇を保持していた(図２９)。 ConA投与によりTL4が
早い時期に発現上昇し、それに引き続いてGPT値が上昇
したことにより肝障害が起こることが示唆された。

【００８２】実施例１１ アクチノマイシンDとTNFαに
より惹起される正常ヒト肝実質細胞のアポトーシスに対
する可溶型ヒトＴＬ４の抗アポトーシス作用 実施例３及び実施例４で見出したアクチノマイシンD（A
ctD）とTNFαによる正常ヒト肝実質細胞のアポトーシス
に対し、ＴＬ４がどのような影響を与えるかを検討し
た。尚、培養条件並びに実験条件は下記に示す以外、実
施例３及び４に順じた。その結果、ActDとTNFαの同時
投与により正常ヒト肝実質細胞にアポトーシスを誘導す
る際に、あらかじめ可溶型ヒトＴＬ４を添加することに
よりTNFαによるアポトーシスを抑制することができ
た。このＴＬ４による抗アポトーシス作用は、ActDとTN
Fαで刺激する３時間以上前にＴＬ４を添加することに
より顕著に誘導されることが分かった（図30、図31）。
すなわち、ＴＬ４は単独で肝実質細胞に対し傷害作用を
有さないのみならず、TNFαによるアポトーシス作用を
抑制できる活性を有することが明らかとなり、このこと
からＴＬ４の投与あるいはＴＬ４と同様の活性を有する
低分子化合物や抗体（アゴニスト）の投与により、TNF
αが関与する種々の肝障害（疾患）の改善が期待でき
る。

【００８３】

【発明の効果】本発明のタンパク質、その部分ペプチド
またはそれらの塩は、肝機能調節作用（例、肝細胞維持
作用、肝細胞死抑制作用など）より具体的には、肝臓再
生作用（好ましくは、肝実質細胞増殖作用）など、さら
に具体的には、Ｇ０期からＧ１期への細胞周期（好まし
くは、肝細胞の細胞周期）の移行促進作用などを有して
おり、例えば、肝癌患者などにおける部分肝切除（摘
出）後の肝臓再生剤などの医薬としても有用である。

【００８４】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Liver Function Modulator <130> B00119 <150> JP 11-141106 <151> 1999-05-21 <150> JP 2000-014044 <151> 2000-01-19 <160> 55 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser 20 25 30 Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg 50 55 60 Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr 115 120 125 His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr 130 135 140 Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser 145 150 155 160 Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser 180 185 190 Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His 195 200 205 Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu 210 215 220 Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 225 230 235 240 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Murine <400> 2 Met Glu Ser Val Val Gln Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln Thr 1 5 10 15 Asp Ile Pro Phe Arg Arg Leu Glu Gln Asn His Arg Arg Arg Arg Cys 20 25 30 Gly Thr Val Gln Val Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Thr Gln Gly Trp Phe Leu Leu Arg Leu His Gln Arg Leu Gly 50 55 60 Asp Ile Val Ala His Leu Pro Asp Gly Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys 65 70 75 80 Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser His Gln Ala Asn Pro Ala Ala His Leu 85 90 95 Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp 100 105 110 Glu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp 115 120 125 Gly Ala Leu Val Thr Met Glu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys 130 135 140 Val Gln Leu Ser Gly Val Gly Cys Pro Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu 145 150 155 160 Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg Arg Ser Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser 180 185 190 Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu 195 200 205 Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Pro Gly Asn Arg Leu Val 210 215 220 Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 225 230 235 <210> 3 <211> 239 <212> PRT <213> Rat <400> 3 Met Glu Ser Val Val Gln Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln Thr 1 5 10 15 Asp Ile Pro Phe Arg Arg Leu Gly Gln Asn His Arg Arg Arg His Cys 20 25 30 Gly Thr Val Gln Val Ser Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Thr Glu Gly Trp Phe Leu Leu Arg Leu His Gln Arg Leu Gly 50 55 60 Asp Ile Val Ala His Leu Pro Asp Gly Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys 65 70 75 80 Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser His Gln Pro Asn Pro Ala Ala His Leu 85 90 95 Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp 100 105 110 Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp 115 120 125 Gly Ala Leu Val Thr Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys 130 135 140 Val Gln Leu Ser Gly Val Gly Cys Pro Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu 145 150 155 160 Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg Arg Ser Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser 180 185 190 Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu 195 200 205 Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Pro Gly Asn Arg Leu Val 210 215 220 Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Ile 225 230 235 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Human <400> 4 ATGGAGGAGA GTGTCGTACG GCCCTCAGTG TTTGTGGTGG ATGGACAGAC CGACATCCCA 60 TTCACGAGGC TGGGACGAAG CCACCGGAGA CAGTCGTGCA GTGTGGCCCG GGTGGGTCTG 120 GGTCTCTTGC TGTTGCTGAT GGGGGCTGGG CTGGCCGTCC AAGGCTGGTT CCTCCTGCAG 180 CTGCACTGGC GTCTAGGAGA 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CATTTCACTA GGAAGCTTCA ATACCTTGTG 6780 CCTCAGTTTC TTCTTTGGTA TTCAAGTGAC TTTGCTCCTC AGTGCTTCAG TGTCTACCCT 6840 TGCAGAAGGA GATGGGAATG AACGGAGTTA AGACACAACC ACCAAATTAC TTTGCTTGCT 6900 TTCCTGTATC TCAGTTTCTT CCCCCTGCAA GATAGGAATG GGCTGAGTCA ACCCAGACAA 6960 GCAGCCTACT ATGGTGGTGA AACCAGAGGG AACTAGCATA AGGTCACACA GAAAGGGTGG 7020 GCACAATGCT AACCGTGCTG ACGGGTTATC TTTCTCTCTC CTTTCCTCCC AGGAGCCAAC 7080 GCCAGCTTGA TAGGTATTGG TGGACCTCTG TTATGGGAGA CACGACTTGG CCTGGCCTTC 7140 TTGAGGGGCT TGACGTATCA TGATGGGGCC CTGGTGACCA TGGAGCCCGG TTACTACTAT 7200 GTGTACTCCA AAGTGCAGCT GAGCGGCGTG GGCTGCCCCC AGGGGCTGGC CAATGGCCTC 7260 CCCATCACCC ATGGACTATA CAAGCGCACA TCCCGCTACC CGAAGGAGTT AGAACTGCTG 7320 GTCAGTCGGC GGTCACCCTG TGGCCGGGCC AACAGCTCCC GAGTCTGGTG GGACAGCAGC 7380 TTCCTGGGCG GCGTGGTACA TCTGGAGGCT GGGGAAGAGG TGGTGGTCCG CGTGCCTGGA 7440 AACCGCCTGG TCAGACCACG TGACGGCACC AGGTCCTATT TCGGAGCTTT CATGGTCTGA 7500 AGGCTGCGGT GACAATGTAT TTTGTGGAGG GACCTCTCCA GGACTCACCT CAAACCCAGC 7560 AATAGGGTTT GAAGTCCTCC CTTTAAGGAG CCCTGAACTC TGCAGTGCTC GGGGCGGTGT 7620 TCACTGCTGA CCTGCTTTGG GCAATCTTCA AATCAGAGAC CTGGAGACTT GGGGCGTGGA 7680 GCCCAGGAGC GAGGGGTCAG CTCATTTGCC TGATATTCAG GAAGAAAGAA TCAAGCTGGG 7740 GTATTTATGC TTCTGATGCA AACACTGAGA TTTCGGCTTT CTGGGTTTTG AGCTGGAGGC 7800 AAGAAACCTT CCCAGAGTGT CATCAGGACC ATGTTGGCAG GACTTGGGGC TCCAGACTTG 7860 CCACCACACT CTGGCCTCTC CCATCCATCC GCTGCATTGG TTTCCAGCCA CCAAAACAGC 7920 ACTGGCCCCC TGGCTGCAAC TGGCCAGGTA CGAGCTTCTG AGCACCTACA TTCCTCAGGG 7980 ACATCTTGAT GAGATCTCAG TACTCAGTCC AATGCGCAGC AGCGACAGAC ATGCCAGGAA 8040 TGGTTGGTCA GAAGGGAAGG GAGGAAAGGG AGGAAAGAAC GGAATGCACA AGAGAAGGGG 8100 GGAAAACAAG ACCAAAACAA AACAGCAACA ACAAAGCGGC AGGGAAGAAG TTGACACCCT 8160 TGGGGATACT TTAGTCAACA CACTTAGAAC AGATTGTGCC AGGCCTGTTG GATTCCTGGA 8220 GTTGATGGGA TCGTGGGAAG GCACAATGGG GAGCAAGTGG GCTTGGGTTA TGGCTCAGTG 8280 GGTAAAGTGC AATTATGGGG ATCTGAGTTT GAATCCCTGG TACCCATATA AAGACACAGA 8340 TGCGGTGATG GGCACTTGTG ACAATGAGAT CATCAATAGG GAATGGAGAC AGGAGGGACC 8400 TCTGGGGTTC ACTGGCCAGG CAGTCTAGCT GAATCAAAGA GCTCCAAGTT CAGTCGATAG 8460 CTCCTGAAGA TGACAACTGA GGCTATTCTC CAAACCCCAC ACGCAGGGAC ACATGCGTAA 8520 TAAATAAAAT TTTAAAAATA TTAAATAATA GTGTTTGAGA GGCACTTTAT ATGTTCTAAT 8580 CATTTGTGCT TTTGTTTATT TGTTCAGGTT TGTTTGTTTG TTTGTTGGAA GACAGGGGTC 8640 TCAAGTAGCC CAGGCTAGCT TTGAACTATA TATTTCATAT ATTTTGAGGC AGTCTTATGC 8700 CTTTTATCTA GGTTTTCTTG GCATCTAAAG CTATAGCTGT GTGTTACTCC AATGGAACAT 8760 CTGGGCAGTT ACCCAGCACC TTCAAATGCA GAGCCCACAC CTGATAGGGT CGGGCTCGCC 8820 CTGCTCAGGG GTCGCTGCTA GTCCAAGCCA GTCCAAGCGG ACTTCCCGCG TCCTGTCCTT 8880 GCAACCCTGG TGGGAGGTGG AAAAGCCCCC AAATACCCAG TCTCACCCTC CATCGGAGTT 8940 TCCTTTATGC TTATCACGGC CTGTTTCCGT GTCTTTGATG AGACCAAGGT GTGGGGACAG 9000 TATATTTATA AAAAGCCACC AGCAGTTTCC GCTGTAAGGA AAAAAAAATC ACTCTAGA 9058 <210> 10 <211> 717 <212> DNA <213> Rat <400> 10 ATGGAGAGTG TGGTACAGCC TTCAGTGTTT GTGGTGGATG GACAGACAGA CATCCCATTC 60 AGGCGGCTGG GACAGAACCA CAGGAGACGG CACTGCGGCA CTGTCCAGGT CAGCCTGGCC 120 CTGCTGCTGC TGCTGGGTGC TGGGCTGGCC ACTGAGGGCT GGTTTCTCCT GAGACTGCAT 180 CAGCGTCTTG GGGACATAGT AGCTCATCTG CCAGATGGAG GCAAAGGCTC CTGGGAGAAG 240 CTGATACAAG ATCAACGATC TCACCAGCCC AACCCAGCAG CACATCTCAC AGGAGCTAAC 300 GCCAGCTTGA TAGGCATTGG TGGACCTCTG TTATGGGAGA CACAACTTGG CCTGGCCTTC 360 CTGAGGGGCC TGACGTATCA TGATGGGGCC CTGGTGACCA CCGAGGCTGG CTACTACTAC 420 GTGTACTCCA AAGTGCAGTT GAGTGGTGTG GGCTGCCCCC AGGGGCTGGC CAATGGCCTC 480 CCCATCACCC ACGGGCTGTA CAAGCGCACA TCCCGATACC CCAAGGAGTT AGAACTGCTG 540 GTCAGCCGGC GGTCACCTTG TGGCCGGGCC AACAGCTCCC GAGTCTGGTG GGACAGTAGT 600 TTCCTCGGCG GAGTGGTACA TCTGGAGGCC GGAGAAGAGG TGGTGGTCCG CGTGCCTGGA 660 AACCGCCTGG TCAGACCACG TGATGGCACG AGGTCCTATT TCGGAGCTTT CATGATC 717 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 11 AGGTCAACCC AGCAGCGCAT CTCA 24 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 12 AGGTCAACCC AGCAGCGCAT CTCACAGG 28 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 13 CAAATTAAAC CGGGTACCAT CACGCAGTCG 30 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 14 TCTGCTCTGG CATGGAGAGT GTGGT 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 15 CTATTGCTGG GTTTGAGGTG AGTC 24 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 16 GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 17 ACTATAGGGC ACGCGTGGT 19 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 18 GTAATACGAC TCACTATAGG GCACGCGTGG TCGACGGCCC GGGCTGGT 48 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 19 CAGCCCAGCA CCTAGCAGCA GCACCAG 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 20 GCCGCCTGAA TGGGATGTCC GTCTGTC 27 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 21 ACGAATTCCA AGAGCGAAGG TCTCACGAGG TC 32 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 22 AGTCTAGACT CCTTCCTTCA CACCATGAAA GCCCC 35 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 23 CCTGACCCTG GGCTTCTGAG CCTC 24 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 24 TCCACAAAAT CCATTGTCGT CATAGCC 27 <210> 25 <211> 242 <212> PRT <213> Human, Murine, Rat <400> 25 Met Glu Xaa Ser Val Val Xaa Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Xaa Arg Leu Xaa Xaa Xaa His Arg Arg Xaa Xaa 20 25 30 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Leu Xaa Leu Leu Leu Xaa Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Xaa Gln Gly Trp Phe Leu Leu Xaa Leu His Xaa Arg 50 55 60 Leu Gly Xaa Xaa Vla Xaa Xaa Leu Pro Asp Gly Xaa Xaa Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Xaa Leu Ile Gln Xaa Xaa Arg Ser His Xaa Xaa Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Xaa Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Xaa Tyr 115 120 125 His Asp Gly Ala Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr 130 135 140 Ser Lys Val Gln Leu Xaa Gly Val Gly Cys Pro Xaa Gly Leu Ala Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro 165 170 175 Glu Xaa Leu Glu Leu Leu Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala 180 185 190 Xaa Xaa Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val 195 200 205 Val His Leu Glu Ala Gly Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Arg Leu Val Arg Xaa Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe 225 230 235 240 Met Val <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 26 GAATTCGATA CAAGAGCGAA GGTCTCACGA GGTC 34 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 27 AAATCTAGAT CCTTCCTTCA CACCATGAAA GCCCC 35 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 28 AGGAATTCAT GGAGGAGAGT GTCGTACGGC CCTCAG 36 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 29 AGCTCGAGCT CCTTCCTTCA CACCATGAAA GCCCC 35 <210> 30 <211> 612 <212> DNA <213> Human <400> 30 ATGGAGGAGA GTGTCGTACG GCCCTCAGTG TTTGTGGTGG ATGGACAGAC CGACATCCCA 60 TTCACGAGGC TGGGACGAAG CCACCGGAGA CAGTCGTGCA GTGTGGCCCG GGACGGACCT 120 GCAGGCTCCT GGGAGCAGCT GATACAAGAG CGAAGGTCTC ACGAGGTCAA CCCAGCAGCG 180 CATCTCACAG GGGCCAACTC CAGCTTGACC GGCAGCGGGG GGCCGTTGTT ATGGGAGACT 240 CAGCTGGGCC TGGCCTTCCT GAGGGGCCTC AGCTACCATG ATGGGGCCCT TGTGGTCACC 300 AAAGCTGGCT ACTACTACAT CTACTCCAAG GTGCAGCTGG GCGGTGTGGG CTGCCCGCTG 360 GGCCTGGCCA GCACCATCAC CCACGGCCTC TACAAGCGCA CACCCCGCTA CCCCGAGGAG 420 CTGGAGCTGT TGGTCAGCCA GCAGTCACCC TGCGGACGGG CCACCAGCAG CTCCCGGGTC 480 TGGTGGGACA GCAGCTTCCT GGGTGGTGTG GTACACCTGG AGGCTGGGGA GAAGGTGGTC 540 GTCCGTGTGC TGGATGAACG CCTGGTTCGA CTGCGTGATG GTACCCGGTC TTACTTCGGG 600 GCTTTCATGG TG 612 <210> 31 <211> 204 <212> PRT <213> Human <400> 31 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser 20 25 30 Cys Ser Val Ala Arg Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile 35 40 45 Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 50 55 60 Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 65 70 75 80 Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala 85 90 95 Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln 100 105 110 Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His 115 120 125 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu 130 135 140 Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val 145 150 155 160 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 165 170 175 Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg 180 185 190 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 195 200 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 32 CCAACGCCAG CTTGATAGGT ATTGGTGG 28 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 33 CCCAGCAGCA CATCTTACAG GA 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 34 AGGCCAAGTC GTGTCTCCCA TA 22 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 35 CTATGGCCCA GACCCTCACA CTCAGATCAT 30 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 36 CAAATGGCCT CCCTCTCATC AG 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 37 GGCTACAGGC TTGTCACTCG AA 22 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 38 ACAACGAAAA GGCCCCCAAG GTAGTGA 27 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 39 GTGACCAGAT CCCTGAATTG GAA 23 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 40 GTAGGCGGTG GCTTTTTTG AG 22 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 41 CCTCTTGCAA ATGCCTCCCT GGTTACCA 28 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 42 ATACAAGGAC TACTGCATCC ACGG 24 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 43 GTAGAGTCAG CCCATGACAC CTGT 24 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 44 TGTCCTCATT ATCACCTGTG TGCTGATCCA 30 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 45 AAGAAGCAAG CCATCACTGC C 21 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 46 ACAGTGTTTG CGGAGCTGAC AG 22 <210> 47 <211> 204 <212> PRT <213> Human <400> 47 Met Glu Xaa Ser Val Val Xaa Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Xaa Arg Leu Xaa Xaa Xaa His Arg Arg Xaa Xaa 20 25 30 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Gly Xaa Xaa Gly Ser Trp Glu Xaa Leu Ile 35 40 45 Gln Xaa Xaa Arg Ser His Xaa Xaa Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 50 55 60 Ala Asn Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 65 70 75 80 Xaa Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Xaa Tyr His Asp Gly Ala 85 90 95 Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Ser Lys Val Gln 100 105 110 Leu Xaa Gly Val Gly Cys Pro Xaa Gly Leu Ala Xaa Xaa Ile Thr His 115 120 125 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro Glu Xaa Leu Glu Leu Leu 130 135 140 Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala Xaa Xaa Ser Ser Arg Val 145 150 155 160 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 165 170 175 Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa Arg Leu Val Arg Xaa Arg 180 185 190 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 195 200 204 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 GTAGAATTCG GCCAACCCAG CAGCACATCT TAC 33 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 AAATCTAGAT ATTGCTGGGT TTGAGGTGAG TCC 33 <210> 50 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 50 CCAACGCCAG CTTGATAGGT ATTGGTGG 28 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 CCCAGCAGCA CATCTTACAG GA 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 AGGCCAAGTC GTGTCTCCCA TA 22 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 CTATGGCCCA GACCCTCACA CTCAGATCAT 30 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 CAAATGGCCT CCCTCTCATC AG 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 GGCTACAGGC TTGTCACTCG AA 22

【００８５】

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９３９
に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤ
ＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒ
ト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図２に続
く）。

【図２】参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９３９
に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤ
ＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒ
ト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図１の続き、
図３に続く）。

【図３】参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９３９
に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤ
ＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒ
ト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図２の続
き）。

【図４】参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９４０
に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤ
ＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒ
ト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図５に続
く）。

【図５】参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９４０
に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤ
ＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒ
ト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図４の続き、
図６に続く）。

【図６】参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ１９４０
に含まれる本発明のヒト由来タンパク質をコードするＤ
ＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明のヒ
ト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図５の続
き）。

【図７】参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ１９５８
に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明の
マウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図８に続
く）。

【図８】参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ１９５８
に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明の
マウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図７の続
き）。

【図９】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１１
に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードする
ゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本
発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図
１０に続く）。

【図１０】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図９の続き、図１１に続く）。

【図１１】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１０の続き、図１２に続く）。

【図１２】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１１の続き、図１３に続く）。

【図１３】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１２の続き、図１４に続く）。

【図１４】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１３の続き、図１５に続く）。

【図１５】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１４の続き、図１６に続く）。

【図１６】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１５の続き、図１７に続く）。

【図１７】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１６の続き、図１８に続く）。

【図１８】参考例３で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
１に含まれる本発明のマウス由来タンパク質をコードす
るゲノムＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される
本発明のマウス由来タンパク質のアミノ酸配列を示す
（図１７の続き）。

【図１９】参考例４でPichia酵母を宿主とした本発明の
ヒトＴＬ４タンパク質の細胞外領域組換えタンパク質の
発現を該タンパク質に対する抗血清を用いたウエスタン
ブロット解析で調べた結果を示す。レーン１〜３はヒト
ＴＬ４タンパク質発現ベクターを導入した株の培養上清
を用いた場合の結果を、レーン４〜６はベクターｐＰＩ
ＣＺαＡを導入した株の培養上清を用いた場合の結果を
示す（レーン１、４はＢＭＭＹ培地での培養開始直後、
レーン２、５は培養１日後、レーン３、６は培養２日
後）。バンドは目的の組換えタンパク質の発現を示す。

【図２０】参考例５で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
２に含まれる本発明のラット由来タンパク質をコードす
るＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明
のラット由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図２１
に続く）。

【図２１】参考例５で得られたプラスミドｐＴＢ２０１
２に含まれる本発明のラット由来タンパク質をコードす
るＤＮＡの塩基配列、およびそれから推定される本発明
のラット由来タンパク質のアミノ酸配列を示す（図２０
の続き）。

【図２２】実施例１で用いられた昆虫細胞用ＴＬ４発現
ベクターの構築図を示す。

【図２３】実施例２で行われた可溶性ヒトＴＬ４による
正常ヒト肝実質細胞のＤＮＡ合成促進作用の測定結果を
示す。

【図２４】実施例３で行われた可溶性ヒトＴＬ４による
飢餓状態下での正常ヒト肝実質細胞のＤＮＡ合成促進作
用の測定結果を示す。

【図２５】実施例４で行われた可溶性ヒトＴＬ４のアク
チノマイシンとの併用による肝実質細胞に対する細胞障
害活性の測定結果を示す。

【図２６】実施例５で行われたアネキシンＶとpropidiu
m Iodideを用いたアポトーシス誘導活性の検出結果を示
す。

【図２７】実施例７で行われた正常ヒト肝実質細胞のＴ
Ｌ４と各増殖因子との相乗的なＤＮＡ合成促進作用の測
定結果を示す。

【図２８】実施例８で行われたＣＣｌ₄投与肝障害マウ
スモデルにおける各遺伝子の発現変動の測定結果を示
す。

【図２９】図２９は実施例１０で行われたコンカナバリ
ンＡ投与肝傷害モデルマウスにおける遺伝子発現変動の
結果を示す。

【図３０】実施例１１で行われたアクチノマイシンDとT
NFαにより惹起される正常ヒト肝実質細胞のアポトーシ
スに対する可溶型ヒトＴＬ４の抗アポトーシス作用の結
果を示す。図中、−○−は可溶型ヒトＴＬ４無添加、−
●−は可溶型ヒトＴＬ４を100ng/ml添加したサンプルを
示す。

【図３１】実施例１１で行われたアクチノマイシンDとT
NFαにより惹起される正常ヒト肝実質細胞のアポトーシ
スに対する可溶型ヒトＴＬ４の抗アポトーシス作用の結
果を示す。図中、−○−は可溶型ヒトＴＬ４無添加、−
●−は可溶型ヒトＴＬ４を100ng/ml添加したサンプルを
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｃ０８４ 48/00 43/00 １０５ ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 1/16 Ｃ０７Ｋ 14/525 ４Ｃ０８６ 43/00 １０５ 16/24 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/525 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/04 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/04 33/50 Ｚ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 (Ｃ１２Ｎ 1/19 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:84） // Ｃ１２Ｐ 21/08 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:84） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 引地 由紀子 茨城県つくば市松代４丁目21番２ シャレ ールつくば松代１号棟504号 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA28 BA44 CA04 DA02 DA12 EA04 GA11 GA18 GA19 HA01 HA04 HA14 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ02 QQ42 QQ53 QQ58 QR42 QR48 QR55 QR69 QR73 QS12 QS20 QS25 QS34 QX01 4B064 AG07 AG27 CA06 CA10 CA19 CC24 CE07 CE11 CE12 CE14 DA01 DA13 4B065 AA77X AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 CA59 DB62 NA14 ZA752 ZB212 4C085 AA17 AA19 BB07 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA75 ZB21 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA14 DA76 DA86 EA28 EA50 FA74 GA23 GA26 GA32

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１、配列番号：２、配列番号：
   ３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同
   一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
   パク質またはその塩を含有してなる肝臓機能調節剤。
2. 【請求項２】配列番号：１、配列番号：２または配列番
   号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
   ノ酸配列が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の
   第８〜２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番
   目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第
   １２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２
   〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８
   ９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目
   および第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列を有するア
   ミノ酸配列である請求項１記載の剤。
3. 【請求項３】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
   またはその塩を含有してなる肝臓機能調節剤。
4. 【請求項４】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
   が配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第８４〜２４
   ０番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなるペ
   プチドである請求項３記載の剤。
5. 【請求項５】請求項１記載のタンパク質または請求項３
   記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮ
   Ａを含有するＤＮＡを含有してなる肝臓機能調節剤。
6. 【請求項６】ＤＮＡが配列番号：４〜配列番号：１０の
   いずれかの配列番号または配列番号：３０で表わされる
   塩基配列を有するＤＮＡである請求項５記載の剤。
7. 【請求項７】請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
   ３記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を
   含有してなる肝臓機能調節剤。
8. 【請求項８】請求項１記載のタンパク質もしくは請求
   項３記載の部分ペプチドまたはその塩、請求項５記載
   のＤＮＡ、または請求項７記載の抗体を用いることを
   特徴とする肝臓機能調節剤のスクリーニング方法。
9. 【請求項９】請求項８記載のスクリーニング方法を用い
   て得られる化合物またはその塩を含有してなる肝臓機能
   調節剤。
10. 【請求項１０】肝臓機能促進剤である請求項１、請求項
    ３、請求項５、請求項７または請求項９記載の剤。
11. 【請求項１１】肝臓再生剤である請求項１、請求項３、
    請求項５、請求項７または請求項９記載の剤。
12. 【請求項１２】Ｇ０期からＧ１期への細胞周期の移行促
    進作用を有する請求項１、請求項３、請求項５、請求項
    ７または請求項９記載の剤。
13. 【請求項１３】配列番号：３１で表されるアミノ酸配列
    を含有してなるタンパク質またはその塩。
14. 【請求項１４】請求項１３記載のタンパク質をコードす
    る塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
15. 【請求項１５】配列番号：３０で表される塩基配列を有
    する請求項１４記載のＤＮＡ。
16. 【請求項１６】請求項１５記載のＤＮＡを含有する組換
    えベクター。
17. 【請求項１７】請求項１６記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
18. 【請求項１８】請求項１７記載の形質転換体を培養し、
    請求項１３記載のタンパク質を生成、蓄積せしめ、これ
    を採取することを特徴とする請求項１３記載のタンパク
    質またはその塩の製造法。
19. 【請求項１９】請求項１３記載のタンパク質またはその
    塩に対する抗体。
20. 【請求項２０】請求項１４記載のＤＮＡまたは請求項１
    ９記載の抗体を含有してなる診断剤。
21. 【請求項２１】請求項１４記載のＤＮＡに相補的または
    実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑
    制し得る作用を有するアンチセンスＤＮＡ。
22. 【請求項２２】請求項１３記載のタンパク質またはその
    塩を用いることを特徴とする請求項１３記載のタンパク
    質またはその塩の活性を促進または阻害する化合物また
    はその塩のスクリーニング方法。
23. 【請求項２３】請求項１３記載のタンパク質またはその
    塩を含有してなる請求項１３記載のタンパク質またはそ
    の塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩の
    スクリーニング用キット。
24. 【請求項２４】請求項２２記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項２３記載のスクリーニング用キットを用いて
    得られうる請求項１３記載のタンパク質またはその塩の
    活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
25. 【請求項２５】請求項２４記載の化合物またはその塩を
    含有してなる医薬組成物。
26. 【請求項２６】肝臓機能調節剤である請求項２５記載の
    医薬組成物。