JP2002355077A - カスパーゼ３阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特にカスパーゼの活性化を直接的あるいは間
接的に抑制できる薬剤の開発。 【解決手段】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその塩を含有してなるカスパーゼ３阻
害剤。 【効果】 本発明のタンパク質、その部分ペプチドまた
はそれらの塩は、例えば、ＡＩＤＳ、アルツハイマー
病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜
炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球
性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿
主病または先天性・後天性酵素障害などの予防および／
または治療剤などの医薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なカスパーゼ
３阻害剤などに関する。

【０００２】

【従来の技術】アポトーシスが発生過程や生体での不必
要な細胞、何らかの傷害を受けて生体を維持する上で危
険となった細胞の除去機構として生理的に重要な機能を
担っていることが認識されてきた。しかもアポトーシス
が増殖や分化にかかわっていることが明らかにされてき
ている。このことは、死のプログラムの異常という概念
から疾患を見直すことで、新しい疾患概念の確立や治療
法の開発への道を開ける可能性を示唆している（アポト
ーシスの多様性とその制御機構：臨床免疫、27:308-316
(1995)）。生体内でのアポトーシスの機能は大きく次
の３つに分かれる。第１は発生過程での形態、組織形成
時のプログラム細胞死にみられるもので、発生過程での
不必要な細胞群の除去にかかわっている。第２には、生
体のホメオスターシスの維持のための機能である。臓器
ではそれを構成する細胞の増殖とアポトーシスの２つの
過程によって細胞動態のバランスがとられており、機能
の調節や細胞のターンオーバが行われていると考えてい
る。第３には細胞内外からの侵襲によって障害を受けて
危険になった細胞、例えば前癌状態になった細胞やウイ
ルス等の感染した細胞にアポトーシスを誘発させて積極
的にその細胞群を除去するための生体防御機構である。
このように、アポトーシスが生体の機能維持に重要な機
能を担っていることから、その障害は当然、病気の発症
や病態とかかわってくることが推察される。

【０００３】アポトーシス制御による治療の可能性につ
いては、近年、その可能性を支持する報告が増加してい
る。すなわち、アポトーシスの異常による疾病の治療
は、その過程の分子を制御することでアポトーシスを促
進させたり、あるいは抑制することが可能になりつつあ
る。例えば癌細胞にアポトーシス誘発を目的とした化学
療法、放射線療法、ホルモン療法、サイトカイン療法な
どが臨床的に用いられている（Science, 267, 1456-146
2 (1995), Cancer, 73, 2013-2026 (1994)）。受容体の
アンタゴニストによる乳癌の治療やＦａｓ抗原を標的と
したモノクローナル抗体による治療の試み、あるいは自
己免疫疾患における自己抗体の反復投与なども受容体を
標的としてアポトーシスの誘発を目的とした治療法の例
である。逆に、エリスロポエチンや顆粒球コロニー刺激
因子による貧血、好中球減少症の治療はアポトーシスを
抑制することを目的にしている。これらはいずれもアポ
トーシスのシグナルとレセプターを標的とした治療法で
ある。

【０００４】細胞内の情報伝達系のうち、カスパーゼフ
ァミリーを含めたプロテアーゼ、タンパク質リン酸化・
脱リン酸化を標的とした治療法も近年、研究が進んでい
る。例えばチロシンリン酸化阻害薬による癌細胞のアポ
トーシス誘発なども試みられている。さらに、アポトー
シスを制御するｐ５３やｂｃｌ−２などのアンチセンス
オリゴヌクレオチド、あるいは逆にそれらの遺伝子発現
誘導による手法が癌・リンパ腫治療への応用として注目
されている。例えばｂｃｌ−２の臓器特異的な発現は細
胞死促進により生じた疾病の有効な治療法としての可能
性を示唆しているし、またｂｃｌ−２機能を抑制するｂ
ｃｌ−Ｘｓを発現させることによって乳癌治療を行う試
みも動物実験でなされている。アポトーシスの実行過程
での制御、すなわちプロテアーゼ、トランスグルタミナ
ーゼ、エンドヌクレアーゼなどもアポトーシスの異常に
よる病態に対しての対症療法としての標的になると考え
られているが、未だその応用について十分には検討がな
されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、ア
ポトーシスの実行過程での制御、特にカスパーゼの活性
化を直接的あるいは間接的に抑制できる薬剤が開発でき
れば、アポトーシスの異常による疾病の治療に繋げるこ
とができると考えられる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＴＮＦフ
ァミリーに属するリガンド分子であるＴＬ４（ＷＯ９８
/０３６４８号）がＴＮＦαにより惹起される正常ヒト
肝実質細胞の細胞死を抑制する過程で、予想外にもこの
抑制効果にＴＬ４によるカスパーゼ３の活性化の阻害が
中心的に関与する事実を突き止めた。これはカスパーゼ
３が疾病原因の中心的な役割を担っている疾患において
は、ＴＬ４の投与がその疾患に対して新たな治療法とな
りうることを示している。さらに研究を進めることによ
り、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、（１）配列番号：
１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：３１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を含
有してなるカスパーゼ３阻害剤、（２）配列番号：１、
配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５４〜５
９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番目、
第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第１４
４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１
８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１３番
目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２４０番目
のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列である上記（１）
記載の剤、（３）上記（１）記載のタンパク質の部分ペ
プチドまたはその塩を含有してなるカスパーゼ３阻害
剤、（４）上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチド
が配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第８４〜２４
０番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなるペ
プチドである上記（３）記載の剤、（５）上記（１）記
載のタンパク質または上記（３）記載の部分ペプチドを
コードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有してなるカス
パーゼ３阻害剤、（６）ＤＮＡが配列番号：４〜配列番
号：１０のいずれかの配列番号または配列番号：３０で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡである上記（５）記
載の剤、（７）ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキン
ソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変
性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心
筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または
先天性・後天性酵素障害の予防・治療剤である上記
（１）、上記（３）または上記（５）記載の剤、（８）
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列
番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その
部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる
ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮
性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、骨髄異形成
症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心筋虚血、伝導障
害、慢性心不全、移植片対宿主病または先天性・後天性
酵素障害の診断剤、（９）配列番号：１、配列番号：
２、配列番号：３または配列番号：３１で表わされるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡを含有してなるＡＩＤＳ、
アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化
症、色素性網膜炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生不良
性貧血、鉄芽球性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不
全、移植片対宿主病または先天性・後天性酵素障害の診
断剤、（１０）哺乳動物に対して、配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３または配列番号：３１で表わさ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するタンパク質またはその塩の有効量を投
与することを特徴とするカズパーゼ３阻害方法、（１
１）哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：２、
配列番号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質またはその塩の有効量を投与すること
を特徴とするＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソ
ン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、
骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心筋虚
血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または先天
性・後天性酵素障害の予防・治療方法、（１２）哺乳動
物に対して、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：
３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡの有効量を投与することを特徴とするカス
パーゼ３阻害方法、（１３）哺乳動物に対して、配列番
号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：
３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部
分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの有効
量を投与することを特徴とするＡＩＤＳ、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網
膜炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽
球性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対
宿主病または先天性・後天性酵素障害の予防・治療方
法、（１４）カスパーゼ３阻害剤を製造するための配列
番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはそ
の塩の使用、（１５）ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小
脳変性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧
血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病
または先天性・後天性酵素障害の予防・治療剤を製造す
るための配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３ま
たは配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質またはその塩の使用、（１６）カスパーゼ３阻害剤を
製造するための配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡの使用、および（１７）ＡＩＤＳ、ア
ルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化
症、色素性網膜炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生不良
性貧血、鉄芽球性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不
全、移植片対宿主病または先天性・後天性酵素障害の予
防・治療剤を製造するための配列番号：１、配列番号：
２、配列番号：３または配列番号：３１で表わされるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡの使用などを提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のカスパーゼ３阻害剤に含
有されるタンパク質（以下、本発明のタンパク質と称す
る場合がある）は、配列番号：１、配列番号：２、配列
番号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配
列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
る。本発明のタンパク質は、例えば、ヒトや非ヒト温血
動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワト
リ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど）の
あらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細
胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲ
ルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽
細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マ
クロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細
胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨
核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細
胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら
細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）、また
はそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、
脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視
床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂
体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、
骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小
腸、十二指腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末
梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨
格筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合
成タンパク質であってもよい。

【０００９】本発明のタンパク質としては、例えば、Ｗ
Ｏ ９８／０３６４８号公報およびＷＯ ９７／３４９１
１号公報に記載のタンパク質などがあげられる。さらに
本発明のタンパク質としては、例えば、J. Clin. Inves
t., 102, 1142-1151 (1998)や米国特許第5,874,240号に
記載のレセプタータンパク質に対するリガンド活性を有
するタンパク質（ポリペプチド）なども含まれる。配列
番号：１、配列番号：２、配列番号：３と実質的に同一
のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約
４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約
８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ま
しくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列など
が挙げられる。特に、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列のうち第８４番目〜第２４０番目のアミノ酸配
列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列のうち第８
２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列または配列番号：
３で表わされるアミノ酸配列のうち第８２番目〜第２３
９番目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０
％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましく
は約９０％以上の相同性を有する場合が好ましい。

【００１０】また、配列番号：１、配列番号：２または
配列番号：３と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
構成アミノ酸として、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目、第９３〜
１０２番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６
番目、第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、
第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８
４〜１８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２
１９番目および第２２８〜２３９番目のアミノ酸配列を
有するアミノ酸配列なども好ましい。これらのアミノ酸
配列は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列および配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列に共通するアミノ酸配列であ
る。また、配列番号：１または配列番号：２と実質的に
同一のアミノ酸配列としては、構成アミノ酸として、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番
目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９
〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３
４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番
目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第
１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２
２８〜２４０番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列
なども好ましい。これらのアミノ酸配列は、配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５２
〜５７番目、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番
目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第
１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１
２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３９
番目のアミノ酸配列に対応し、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列に共通するアミノ酸配列である。

【００１１】さらに、配列番号：３１と実質的に同一の
アミノ酸配列としては、構成アミノ酸として、配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、
第５７〜６６番目、第７３〜８０番目、第８２〜９０番
目、第９２〜９８番目、第１０８〜１１１番目、第１２
６〜１３４番目、第１４０〜１４６番目、第１４８〜１
５３番目、第１５７〜１７７番目、第１７９〜１８３番
目および第１９２〜２０４番目のアミノ酸配列を有する
アミノ酸配列などがあげられる。配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３または配列番号：３１で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
る本発明のタンパク質としては、上記のとおり配列番
号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：
３１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタ
ンパク質などが好ましい。実質的に同質の活性として
は、例えば、カスパーゼ３阻害作用などの活性があげら
れる。カスパーゼ３阻害作用とは、細胞の細胞死が誘導
される際に活性化されて、種々の細胞内タンパク質を分
解することによって細胞死を実行するプロテア―ゼであ
るカスパーゼ３の部分切断による活性化を抑制する作用
をいう。実質的に同質とは、それらの活性が性質的
（例、生理化学的または薬理学的）に同質であることを
示す。したがって、カスパーゼ３阻害作用などの活性が
同等（例、約０．０１〜２０倍、好ましくは約０．２〜
５倍、より好ましくは約０.５〜２倍）であることが好
ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量な
どの量的要素は異なっていてもよい。

【００１２】カスパーゼ３阻害作用などの活性は、公知
の方法あるいはそれに準じる方法（例えば、Trends Bio
chem. Sci., 22, 388-393 (1997)、Biochem. J., 326,
1-16(1997)、Anal. Biochem., 251, 98-102 (1997)など
に記載の方法）や例えば、後述するスクリーニング方
法、実施例になどに記載されている方法などを用いて測
定することができる。また、本発明のタンパク質には、
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配
列番号：３１で表わされるアミノ酸配列中の１または２
個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程
度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数
（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３また
は配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列に１または
２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程
度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数
（例、１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３また
は配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列中の１また
は２個以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個
程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは
数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたア
ミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイ
ンも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が欠失または
置換されている場合、その欠失または置換の位置として
は、特に限定されないが、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９
番目（または第５４〜５９番目）、第９３〜１０２番
目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第
１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２
〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８
９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目
または第２２８〜２３９番目（または第２２８〜２４０
番目）のアミノ酸配列以外の位置、好ましくは、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の第９３〜１０２番
目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第
１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２
〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８
９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目
または第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列以外の位
置、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第６〜
１９番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５７番
目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第
１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２
〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８
２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番
目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３８番目
（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列以外の
位置、好ましくは、配列番号：２で表わされるアミノ酸
配列の第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、第
１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４２
〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１８
２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番
目、第２１４〜２１８番目または第２２７〜２３９番目
のアミノ酸配列以外の位置、配列番号：３で表わされ
るアミノ酸配列の第６〜１９番目、５３〜５７番目（ま
たは第５２〜５７番目）、第９１〜１００番目、第１０
７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１
３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番
目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第
１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目または第２
２７〜２３８番目（または第２２７〜２３９番目）のア
ミノ酸配列以外の位置、好ましくは、配列番号：３で表
わされるアミノ酸配列の第９１〜１００番目、第１０７
〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３
２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番
目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第
１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目または第２
２７〜２３９番目のアミノ酸配列以外の位置、配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、
第５７〜６６番目、第７３〜８０番目、第８２〜９０番
目、第９２〜９８番目、第１０８〜１１１番目、第１２
６〜１３４番目、第１４０〜１４６番目、第１４８〜１
５３番目、第１５７〜１７７番目、第１７９〜１８３番
目および第１９２〜２０４番目のアミノ酸配列以外の位
置などが挙げられる。

【００１３】さらには、配列番号：１、配列番号：２ま
たは配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するタンパク質として具体的に
は、一般式、 Met Glu Xaa Ser Val Val Xaa Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Xaa Arg Leu Xaa Xaa Xaa His Arg Arg Xaa Xaa 20 25 30 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Leu Xaa Leu Leu Leu Xaa Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Xaa Gln Gly Trp Phe Leu Leu Xaa Leu His Xaa Arg 50 55 60 Leu Gly Xaa Xaa Vla Xaa Xaa Leu Pro Asp Gly Xaa Xaa Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Xaa Leu Ile Gln Xaa Xaa Arg Ser His Xaa Xaa Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Xaa Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Xaa Tyr 115 120 125 His Asp Gly Ala Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr 130 135 140 Ser Lys Val Gln Leu Xaa Gly Val Gly Cys Pro Xaa Gly Leu Ala Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro 165 170 175 Glu Xaa Leu Glu Leu Leu Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala 180 185 190 Xaa Xaa Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val 195 200 205 Val His Leu Glu Ala Gly Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Arg Leu Val Arg Xaa Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe 225 230 235 240 Met Val （Ｉ） 〔式中、Ｘａａは任意のアミノ酸残基または結合手を示
す〕で表わされるアミノ酸配列〔配列番号：２５で表わ
されるアミノ酸配列〕を有するタンパク質なども好まし
く用いられる。

【００１４】また、上記の一般式（Ｉ）において、１個
または２個以上（例えば１〜５６、好ましくは１〜４０
個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜
９個、最も好ましくは数（１〜５）個）の位置でＸａａ
が欠失していてもよい。Ｘａａで示されるアミノ酸とし
ては、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸のいずれでもよ
く、また、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性アミノ
酸のいずれでもよい。具体的には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅ
ｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈ
ｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどが用
いられる。一般式（Ｉ）中、第３番目のＸａａとして
は、Ｇｌｕが好ましく、あるいは欠失していてもよい。
第７番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。第
２２番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＴｈｒまたはＡｒｇが好適である。第
２５番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＧｌｙまたはＧｌｕが好適である。第
２６番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。第
２７番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第
３１番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。第
３２番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＡｒｇが好適である。第
３４番目のＸａａとしては、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＧｌｙが好適である。第
３５番目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈ
ｒが好適である。第３６番目のＸａａとしては、例え
ば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｌａま
たはＶａｌが好適である。第３７番目のＸａａとして
は、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、
ＡｒｇまたはＧｌｎが好適である。第３９番目のＸａａ
としては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的
には、ＧｌｙまたはＳｅｒが好適である。第４１番目の
Ｘａａとしては、例えば、ＧｌｙまたはＡｌａが好適で
ある。第４３番目のＸａａとしては、例えば、疎水性ア
ミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＶａｌが
好適である。第４７番目のＸａａとしては、Ｍｅｔが好
ましく、あるいは欠失していてもよい。第５３番目のＸ
ａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好適であ
る。第６０番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミ
ノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好
適である。第６３番目のＸａａとしては、例えば、Ｔｒ
ｐまたはＧｌｎが好適である。第６７番目のＸａａとし
ては、例えば、酸性アミノ酸が好ましく、具体的には、
ＧｌｕまたはＡｓｐが好適である。第６８番目のＸａａ
としては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的
には、ＭｅｔまたはＩｌｅが好適である。第７０番目の
Ｘａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＡｌａが好適で
ある。第７１番目のＸａａとしては、例えば、塩基性ア
ミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＨｉｓが
好適である。第７６番目のＸａａとしては、例えば、Ｐ
ｒｏまたはＧｌｙが好適である。第７７番目のＸａａと
しては、例えば、ＡｌａまたはＬｙｓが好適である。第
８２番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が
好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＬｙｓが好適であ
る。第８６番目のＸａａとしては、例えば、酸性アミノ
酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＡｓｐが好適
である。第８７番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎ
が好適である。第９１番目のＸａａとしては、例えば、
親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌｕまたは
Ｇｌｎが好適である。第９２番目のＸａａとしては、例
えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｖａｌ
またはＡｌａが好適である。

【００１５】第１０３番目のＸａａとしては、例えば、
ＳｅｒまたはＡｌａが好適である。第１０６番目のＸａ
ａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＩｌｅが好適であ
る。第１０８番目のＸａａとしては、例えば、Ｓｅｒま
たはＩｌｅが好適である。第１１７番目のＸａａとして
は、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、
ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。第１２７番目のＸａ
ａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体
的には、ＳｅｒまたはＴｈｒが好適である。第１３５番
目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好
適である。第１３６番目のＸａａとしては、例えば、Ｔ
ｈｒまたはＭｅｔが好適である。第１３７番目のＸａａ
としては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的
には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適である。第１３８番目
のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＡｌａまたはＰｒｏが好適である。第
１４３番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＩｌｅまたはＶａｌが好適で
ある。第１５０番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｙまたはＳｅｒ
が好適である。第１５６番目のＸａａとしては、例え
ば、ＬｅｕまたはＧｌｎが好適である。第１６０番目の
Ｘａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、
具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第１６
１番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好
ましく、具体的には、ＴｈｒまたはＧｌｙが好適であ
る。第１６２番目のＸａａとしては、Ｌｅｕが好まし
く、あるいは欠失していてもよい。第１６３番目のＸａ
ａとしては、Ｐｒｏが好ましく、あるいは欠失していて
もよい。第１７３番目のＸａａとしては、例えば、Ｐｒ
ｏまたはＳｅｒが好適である。第１７８番目のＸａａと
しては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的に
は、ＧｌｕまたはＬｙｓが好適である。第１８５番目お
よび１８６番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミ
ノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇが好
適である。第１９３番目のＸａａとしては、Ｔｈｒが好
ましく、あるいは欠失していてもよい。第１９４番目の
Ｘａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、
具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第２１
６番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好
ましく、具体的には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適であ
る。第２２２番目のＸａａとしては、例えば、疎水性ア
ミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＰｒｏが
好適である。第２２３番目のＸａａとしては、例えば、
親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｓｐまたは
Ｇｌｙが好適である。第２２４番目のＸａａとしては、
例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌ
ｕまたはＡｓｎが好適である。第２２９番目のＸａａと
しては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的に
は、ＬｅｕまたはＰｒｏが好適である。

【００１６】また、配列番号：３１で表されるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質として具体的には、一般式、 Met Glu Xaa Ser Val Val Xaa Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Xaa Arg Leu Xaa Xaa Xaa His Arg Arg Xaa Xaa 20 25 30 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Gly Xaa Xaa Gly Ser Trp Glu Xaa Leu Ile 35 40 45 Gln Xaa Xaa Arg Ser His Xaa Xaa Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 50 55 60 Ala Asn Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 65 70 75 80 Xaa Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Xaa Tyr His Asp Gly Ala 85 90 95 Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Ser Lys Val Gln 100 105 110 Leu Xaa Gly Val Gly Cys Pro Xaa Gly Leu Ala Xaa Xaa Ile Thr His 115 120 125 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro Glu Xaa Leu Glu Leu Leu 130 135 140 Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala Xaa Xaa Ser Ser Arg Val 145 150 155 160 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 165 170 175 Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa Arg Leu Val Arg Xaa Arg 180 185 190 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val （II） 195 200 204 〔式中、Ｘａａは任意のアミノ酸残基または結合手を示
す〕で表わされるアミノ酸配列〔配列番号：３２で表わ
されるアミノ酸配列〕を有するタンパク質なども好まし
く用いられる。

【００１７】また、上記の一般式（II）において、１個
または２個以上（例えば１〜４０個、好ましくは１〜２
０個、より好ましくは１〜９個、最も好ましくは数（１
〜５）個）の位置でＸａａが欠失していてもよい。Ｘａ
ａで示されるアミノ酸としては、親水性アミノ酸、疎水
性アミノ酸のいずれでもよく、また、酸性アミノ酸、塩
基性アミノ酸、中性アミノ酸のいずれでもよい。具体的
には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙ
ｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒ
ｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどが用いられる。一般式（II）
中、第３番目のＸａａとしては、Ｇｌｕが好ましく、あ
るいは欠失していてもよい。第７番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｒｇま
たはＧｌｎが好適である。第２２番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｔｈｒま
たはＡｒｇが好適である。第２５番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌｙま
たはＧｌｕが好適である。第２６番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｒｇま
たはＧｌｎが好適である。第２７番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｓｅｒま
たはＡｓｎが好適である。第３１番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｇｌｎま
たはＡｒｇが好適である。第３２番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｓｅｒま
たはＡｒｇが好適である。第３４番目のＸａａとして
は、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｓｅｒま
たはＧｌｙが好適である。第３５番目のＸａａとして
は、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好適である。第３６
番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ま
しく、具体的には、ＡｌａまたはＶａｌが好適である。
第３７番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好適で
ある。第４０番目のＸａａとしては、例えば、Ｐｒｏま
たはＧｌｙが好適である。第４１番目のＸａａとして
は、例えば、ＡｌａまたはＬｙｓが好適である。第４６
番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ま
しく、具体的には、ＧｌｎまたはＬｙｓが好適である。
第５０番目のＸａａとしては、例えば、酸性アミノ酸が
好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＡｓｐが好適であ
る。第５１番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミ
ノ酸が好ましく、具体的には、ＡｒｇまたはＧｌｎが好
適である。第５５番目のＸａａとしては、例えば、親水
性アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｕまたはＧｌ
ｎが好適である。第５６番目のＸａａとしては、例え
ば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ｖａｌま
たはＡｌａが好適である。第６７番目のＸａａとして
は、例えば、ＳｅｒまたはＡｌａが好適である。第７０
番目のＸａａとしては、例えば、ＴｈｒまたはＩｌｅが
好適である。第７２番目のＸａａとしては、例えば、Ｓ
ｅｒまたはＩｌｅが好適である。第８１番目のＸａａと
しては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的に
は、ＧｌｎまたはＡｒｇが好適である。第９１番目のＸ
ａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具
体的には、ＳｅｒまたはＴｈｒが好適である。第９９番
目のＸａａとしては、例えば、ＶａｌまたはＴｈｒが好
適である。第１００番目のＸａａとしては、例えば、Ｔ
ｈｒまたはＭｅｔが好適である。第１０１番目のＸａａ
としては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的
には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適である。第１０２番目
のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＡｌａまたはＰｒｏが好適である。第
１０７番目のＸａａとしては、例えば、疎水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＩｌｅまたはＶａｌが好適で
ある。第１１４番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｙまたはＳｅｒ
が好適である。第１２０番目のＸａａとしては、例え
ば、ＬｅｕまたはＧｌｎが好適である。第１２４番目の
Ｘａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、
具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第１２
５番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好
ましく、具体的には、ＴｈｒまたはＧｌｙが好適であ
る。第１３５番目のＸａａとしては、Ｐｒｏが好まし
く、あるいは欠失していてもよい。第１４０番目のＸａ
ａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体
的には、ＧｌｕまたはＬｙｓが好適である。第１４７番
目および１４８番目のＸａａとしては、例えば、親水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＧｌｎまたはＡｒｇ
が好適である。第１５５番目のＸａａとしては、Ｔｈｒ
が好ましく、あるいは欠失していてもよい。第１５６番
目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸が好まし
く、具体的には、ＳｅｒまたはＡｓｎが好適である。第
１７８番目のＸａａとしては、例えば、親水性アミノ酸
が好ましく、具体的には、ＬｙｓまたはＧｌｕが好適で
ある。第１８４番目のＸａａとしては、例えば、疎水性
アミノ酸が好ましく、具体的には、ＬｅｕまたはＰｒｏ
が好適である。第１８５番目のＸａａとしては、例え
ば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、Ａｓｐま
たはＧｌｙが好適である。第１８６番目のＸａａとして
は、例えば、親水性アミノ酸が好ましく、具体的には、
ＧｌｕまたはＡｓｎが好適である。第１９１番目のＸａ
ａとしては、例えば、疎水性アミノ酸が好ましく、具体
的には、ＬｅｕまたはＰｒｏが好適である。

【００１８】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステ
ル基のＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロ
ピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6ア
ルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルな
どのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−
ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、
フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくは
α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキ
ル基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステル
として汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用い
られる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシ
ル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カ
ルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも
のも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステ
ルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用
いられる。

【００１９】さらに、本発明のタンパク質には、上記し
たタンパク質において、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ
基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ
_1-6アルカノイルなどのＣ_1-6アシル基など）で保護され
ているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタ
ミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ
酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ
基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ_1-6アルカノイルなどのＣ_1-6アシル基など）で
保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる
糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。よ
り具体的には、本発明のタンパク質としては、例えば、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト肝
臓由来のタンパク質、配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列を有するマウス胚由来のタンパク質、配列番号：
３で表わされるアミノ酸配列を有するラット肝臓由来の
タンパク質、配列番号：３１で表されるヒト肝臓由来の
タンパク質などが好適である。

【００２０】本発明のタンパク質の部分ペプチドとして
は、前記した本発明のタンパク質と同質の活性、例え
ば、カスパーゼ３阻害作用などの活性を有するペプチド
であれば何れのものであってもよい。例えば、本発明の
タンパク質のアミノ酸配列のうち、少なくとも約２０個
以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約７０
個以上、さらに好ましくは約１００個以上、最も好まし
くは約２００個以上のアミノ酸残基を有するペプチドな
どが好ましく用いられる。例えば、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜
５９番目、第９３〜１０２番目、第１０９〜１１６番
目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３４番目、第
１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９３〜２１
３番目、第２１５〜２１９番目および第２２８〜２３９
番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上の
アミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、配列番
号：２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の
第６〜２０番目、第５３〜５７番目、第９１〜１００番
目、第１０７〜１１４番目、第１１６〜１２４番目、第
１２６〜１３２番目、第１４２〜１４７番目、第１６２
〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８
９番目、第１９２〜２１２番目、第２１４〜２１８番目
および第２２７〜２３８番目のアミノ酸配列から選ばれ
る少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプ
チド）、（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
の第８〜２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２
番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、
第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６
２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１
８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番
目および第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列から選ば
れる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペ
プチド（すなわち、配列番号：２または配列番号：３で
表わされるアミノ酸配列の第６〜２０番目、第５２〜５
７番目、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番目、
第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第１４
２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６〜１
８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１２番
目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３９番目
のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミ
ノ酸配列を有する部分ペプチド）、（３）配列番号：３
１で表わされるアミノ酸配列の第８〜２１番目、第５７
〜６６番目、第７３〜８０番目、第８２〜９０番目、第
９２〜９８番目、第１０８〜１１３番目、第１２６〜１
３４番目、第１４０〜１４６番目、第１４８〜１５３番
目、第１５７〜１７７番目、第１７９〜１８３番目およ
び第１９２〜２０３番目のアミノ酸配列から選ばれる少
なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチド
などが用いられる。

【００２１】より具体的には、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目のアミノ酸
配列を有する部分ペプチド、配列番号：２で表わされる
アミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配
列を有する部分ペプチド、配列番号：３で表わされるア
ミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列
を有する部分ペプチド、配列番号：３１で表わされるア
ミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目のアミノ酸配列
を有する部分ペプチドなどが好ましく用いられる。さら
に、本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目の
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第
２４０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的
に同質の活性を有するペプチド、配列番号：２で表わ
されるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３
９番目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同
質の活性を有するペプチド、配列番号：３で表わされ
るアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番
目のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の
活性を有するペプチド、配列番号：３１で表わされる
アミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目のアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目
のアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活
性を有するペプチドなどが好ましい。

【００２２】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の
第８４番目〜第２４０番目のアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目のア
ミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、よ
り好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％
以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するア
ミノ酸配列などが用いられる。配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜
第２３９番目のアミノ酸配列と約４０％以上、好ましく
は６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有するアミノ酸配列などが用いられる。配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３
９番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と
しては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配
列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列と約４０
％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは約８０
％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましく
は約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが用
いられる。配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の
第４８番目〜第２０４番目のアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３１で
表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２０４番目の
アミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、
より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０
％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する
アミノ酸配列などが用いられる。「実質的に同質の活
性」とは、前記と同意義を示す。

【００２３】また、本発明の部分ペプチドには、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２
４０番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば
１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましく
は１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）
個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目
のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜８０
個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９
個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミ
ノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列の第８４番目〜第２４０番目のアミノ酸
配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好まし
くは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組
み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチド、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜
第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例
えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ま
しくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜
５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３
９番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜
８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１
〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：２で表わ
されるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミ
ノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、好
ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程
度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチ
ド、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８２
番目〜第２３９番目のアミノ酸配列中の１または２個以
上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、よ
り好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、
１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列
番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２
３９番目のアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１
〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは
１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）
のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：３で表
わされるアミノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のア
ミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜８０個、
好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程
度、さらに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれ
らを組み合わせたアミノ酸配配列を含有する部分ペプチ
ド、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４
８番目〜第２０４番目のアミノ酸配列中の１または２個
以上（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、
より好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数
（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８
番目〜第２０４番目のアミノ酸配列に１または２個以上
（例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より
好ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１
〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２
０４番目のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば
１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましく
は１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜５）
個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配
列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配配列を含有
する部分ペプチドなども含まれる。

【００２４】上記のように欠失または置換されている場
合、具体的には、一般式（Ｉ）で表わされるアミノ酸配
列から第１〜８３番目のアミノ酸を取り除いたアミノ酸
配列を有するペプチドなどが好ましく用いられる。ま
た、本発明の部分ペプチドのＣ末端は通常カルボキシル
基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ^-）
であるが、前記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末
端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯ
Ｒ）（Ｒは前記と同意義を示す）であってもよい。さら
に、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタン
パク質と同様に、上記した部分ペプチドにおいて、Ｎ末
端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されている
もの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残
基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の
側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合
ペプチドなども含まれる。

【００２５】本発明の部分ペプチドとしては、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の第８４番目〜第２４
０番目のアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミ
ノ酸配列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列を
有するペプチド、配列番号：３で表わされるアミノ酸配
列の第８２番目〜第２３９番目のアミノ酸配列、配列番
号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜第２
０４番目のアミノ酸配列を有するペプチドが好適であ
る。本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩と
しては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機
酸）または塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質また
はその塩は、前述したヒトや非ヒト温血動物の細胞また
は組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造す
ることもできるし、後述するタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製
造することができる。また、後述のタンパク質合成法ま
たはこれに準じて製造することもできる。具体的には、
ＷＯ ９８／０３６４８号公報またはＷＯ ９７／３４９
１１号公報に記載の方法によって製造することができ
る。ヒトや非ヒト温血動物の組織または細胞から製造す
る場合、ヒトや非ヒト温血動物の組織または細胞をホモ
ジナイズした後、酸などで抽出を行い、得られた抽出液
を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることによ
り精製単離することができる。

【００２６】本発明のタンパク質、その部分ペプチドも
しくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフ
ェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従
い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパ
ク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高
希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれら
のアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に
関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬
を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよ
い。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジ
イソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３
−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用い
られる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ
酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または
ＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあ
らかじめ保護アミノ酸の活性化を行なったのちに樹脂に
添加することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂と
の縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応
に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択され
うる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メ
チルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノー
ル、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、ジメチルスルホキ
シド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、塩化メチ
レン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチ
ル、Ｎ-メチルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合
物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反
応に使用され得ることがしられている範囲から適宜選択
され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択され
る。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過
剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結
果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことな
く縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうこ
とができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られな
いときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用
いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後
の反応に影響を与えないようにすることができる。

【００２７】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーアミルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリ
ル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフ
ェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル（例
えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリ
ーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘ
プチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどのエス
テル基）、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエス
テル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベン
ジルエステル、ベンズヒドリルエステル、フェナシンエ
ステル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシ
ャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラ
ジドなどに導くことによって保護することができる。セ
リンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化
によって保護することができる。このエステル化に適す
る基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノ
イル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキ
シカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から
誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適
する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピ
ラニル基、t-ブチル基などである。

【００２８】チロシンのフェノール性水酸基の保護基と
しては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロ
ベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いら
れる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例
えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル
ベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、
Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例
えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アル
コール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５
−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノー
ル、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、
ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシ
フタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いら
れる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例
えば、対応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除
去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰ
ｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還
元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリ
フルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいは
これらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエ
チルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジ
ンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウ
ムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離
反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれる
が、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノー
ル、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾー
ル、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、
１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添
加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護
基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオ
フェノール処理により除去され、トリプトファンのイン
ドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，
２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなど
の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリ
ウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっ
ても除去される。原料の反応に関与すべきでない官能基
の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応
に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知
の手段から適宜選択しうる。

【００２９】タンパク質のアミド体を得る別の方法とし
ては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシ
ル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド
（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプ
チド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタ
ンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去
したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記し
たような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細につ
いては上記と同様である。縮合により得られた保護タン
パク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を
除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この
粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、
主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミ
ド体を得ることができる。タンパク質のエステル体を得
るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基
を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした
後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパ
ク質のエステル体を得ることができる。本発明の部分ペ
プチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従っ
て、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼ
で切断することによって製造することができる。ペプチ
ドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法
のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタンパク
質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部
分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基
を脱離することにより目的のペプチドを製造することが
できる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例え
ば、以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店

【００３０】また、反応後は通常の精製法、例えば、溶
媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマ
トグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のタン
パク質を精製単離することができる。上記方法で得られ
るタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法あるい
はそれに準じる方法によって適当な塩に変換することが
できるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるい
はそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換
することができる。

【００３１】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａを含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
前記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡの
いずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、
バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージ
ミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞ま
たは組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅する
こともできる。また、ＷＯ ９８／０３６４８号公報ま
たはＷＯ ９７／３４９１１号公報に記載の本発明のタ
ンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡも本発
明のＤＮＡとしてあげられる。具体的には、本発明の配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：
４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活
性（例、カスパーゼ３阻害作用など）を有するタンパク
質をコードするＤＮＡなどが用いられる。配列番号：４
で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列と約４
０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８
０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好まし
くは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有する
ＤＮＡなどが用いられる。

【００３２】本発明の配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡ、配列番号：７で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡにハイストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
するタンパク質と同質の活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡなどが用いられる。配列番号：７で表わさ
れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：７
で表わされる塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６
０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましく
は約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性
を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質と同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａなどが用いられる。配列番号：１０で表わされる塩基
配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
できるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表わ
される塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以
上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９
０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有す
る塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。本発明
の配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列
番号：３０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、配
列番号：３０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質
と同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡな
どが用いられる。

【００３３】配列番号：３０で表わされる塩基配列とハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号：３０で表わされる塩
基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より
好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイ
ゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、
例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Clon
ing）２nd（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor L
ab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうこ
とができる。また、市販のライブラリーを使用する場
合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこと
ができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条
件に従って行なうことができる。ハイストリンジェント
な条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍ
Ｍ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７
０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、
ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が
最も好ましい。より具体的には、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。また、本発明の配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：５または配列番号：６で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００３４】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列
番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用
いられる。また、本発明の配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡを
含有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８または
配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなど
が用いられる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列
を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配
列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなど
が用いられる。配列番号：３１で表わされるアミノ酸配
列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、
配列番号：３０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡな
どが用いられる。本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコード
する塩基配列を含有するものであればいかなるものであ
ってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブ
ラリー、前記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、前記
した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成
ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベク
ターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、
ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記し
た細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用
いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもでき
る。

【００３５】具体的には、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列の第８〜２１番目、第５５〜５９番目（また
は第５４〜５９番目）、第９３〜１０２番目、第１０９
〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、第１２８〜１３
４番目、第１４４〜１４９番目、第１６２〜１７０番
目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第
１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番目および第２
２８〜２３９番目（または第２２８〜２４０番目）のア
ミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列
を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例
えば、配列番号：４で表わされる塩基配列の第２２〜６
３番目、第１６３〜１７７番目（または第１６０〜１７
７番目）、第２７７〜３０６番目、第３２５〜３４８番
目、第３５２〜３７８番目、第３８２〜４０２番目、第
４３０〜４４７番目、第４８４〜５１０番目、第５２６
〜５４６番目、第５５０〜５６７番目、第５７７〜６３
９番目、第６４３〜６５７番目および第６８２〜７１７
番目（または第６８２〜７２０番目）の塩基配列から選
ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが
用いられる。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の
第６〜２０番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５
７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番
目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第
１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１
２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３８
番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列か
ら選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する部分
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：７で表わされる塩基配列の第１６〜６０番目、第１
５７〜１７１番目（または第１５４〜１７１番目）、第
２７１〜３００番目、第３１９〜３４２番目、第３４６
〜３７２番目、第３７６〜３９６番目、第４２４〜４４
１番目、第４８４〜５１０番目、第５２６〜５４６番
目、第５５０〜５６７番目、第５７４〜６３６番目、第
６４０〜６５４番目および第６７８〜７１４番目（また
は第６７８〜７１７番目）の塩基配列から選ばれる少な
くとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００３６】配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の
第６〜２０番目、第５３〜５７番目（または第５２〜５
７番目）、第９１〜１００番目、第１０７〜１１４番
目、第１１６〜１２４番目、第１２６〜１３２番目、第
１４２〜１４７番目、第１６２〜１７０番目、第１７６
〜１８２番目、第１８４〜１８９番目、第１９２〜２１
２番目、第２１４〜２１８番目および第２２７〜２３８
番目（または第２２７〜２３９番目）のアミノ酸配列か
ら選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を有する部分
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：１０で表わされる塩基配列の第１６〜６０番目、第
１５７〜１７１番目（または第１５４〜１７１番目）、
第２７１〜３００番目、第３１９〜３４２番目、第３４
６〜３７２番目、第３７６〜３９６番目、第４２４〜４
４１番目、第４８４〜５１０番目、第５２６〜５４６番
目、第５５０〜５６７番目、第５７４〜６３６番目、第
６４０〜６５４番目および第６７８〜７１４番目（また
は第６７８〜７１７番目）の塩基配列から選ばれる少な
くとも１つの塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第８〜
２１番目、第５７〜６６番目、第７３〜８０番目、第８
２〜９０番目、第９２〜９８番目、第１０８〜１１３番
目、第１２６〜１３４番目、第１４０〜１４６番目、第
１４８〜１５３番目、第１５７〜１７７番目、第１７９
〜１８３番目および第１９２〜２０３番目のアミノ酸配
列から選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を有
する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：３０で表わされる塩基配列の第２２〜６
３番目、第１６９〜１９８番目、第２１７〜２４０番
目、第２４４〜２７０番目、第２７４〜２９４番目、第
３２２〜３３９番目、第３７６〜４０２番目、第４１８
〜４３８番目、第４４２〜４５９番目、第４６９〜５３
１番目、第５３５〜５４９番目および第５７４〜６０７
番目の塩基配列から選ばれる少なくとも１つの塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００３７】また、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列の第８４番目〜２４０番目のアミノ酸配列を有する
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：４で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第
７２０番目の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：４
で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第７２０番目の
塩基配列を有するＤＮＡにハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列の第８４番目〜２４０番目のアミノ酸配列を有
する部分ペプチドと同質の活性（例、カスパーゼ３阻害
作用など）を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡな
ども用いられる。配列番号：４で表わされる塩基配列の
第２５０番目〜第７２０番目の塩基配列とハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列の第２
５０番目〜第７２０番目の塩基配列と約４０％以上、好
ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さ
らに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％
以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが
用いられる。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の
第８２番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペ
プチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：７で表わされる塩基配列の第２４４番目〜第７１７
番目の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：７で表わ
される塩基配列の第２４４番目〜第７１７番目の塩基配
列を有するＤＮＡにハイブリダイズし、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜２３９番目のア
ミノ酸配列を有する部分ペプチドと同質の活性（例、カ
スパーゼ３阻害作用など）を有する部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡなども用いられる。

【００３８】配列番号：７で表わされる塩基配列の第２
４４番目〜第７１７番目の塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、
例えば、配列番号：７で表わされる塩基配列の第２４４
番目〜第７１７番目の塩基配列と約４０％以上、好まし
くは約６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに
好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上
の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用い
られる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第８
２番目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：
１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜第７１７番
目の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号：１０で表わ
される塩基配列の第２４４番目〜第７１７番目の塩基配
列を有するＤＮＡにハイブリダイズし、配列番号：３で
表わされるアミノ酸配列の第８２番目〜２３９番目のア
ミノ酸配列を有する部分ペプチドと同質の活性（例、カ
スパーゼ３阻害作用など）を有する部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡなども用いられる。また、配列番号：３１
で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜２０４番目の
アミノ酸配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：３０で表わされる塩基
配列の第１４２番目〜第６１２番目の塩基配列を有する
ＤＮＡ、配列番号：３０で表わされる塩基配列の第１
４２番目〜第６１２番目の塩基配列を有するＤＮＡにハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列
番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８番目〜２
０４番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドと同質の
活性（例、カスパーゼ３阻害作用など）を有する部分ペ
プチドをコードするＤＮＡなども用いられる。配列番
号：１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜第７１
７番目の塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜第７１
７番目の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％
以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは約
９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有
する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイ
ブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェント
な条件は、前記と同様である。

【００３９】より具体的には、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列の第８４番目〜２４０番目のアミノ酸配
列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：４で表わされる塩基配列の第２５０番目〜第
７２０番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列の第８２番
目〜２３９番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる
塩基配列の第２４４番目〜第７１７番目の塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：３で表わされ
るアミノ酸配列の第８２番目〜２３９番目のアミノ酸配
列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、
配列番号：１０で表わされる塩基配列の第２４４番目〜
第７１７番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列の第４８
番目〜２０４番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わさ
れる塩基配列の第１４２番目〜第６１２番目の塩基配列
を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００４０】本発明のタンパク質またはその部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列
を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によ
って前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを
増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ
を本発明のタンパク質の一部あるいは全領域を有するＤ
ＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとの
ハイブリダイゼーションによって選別することができ
る。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J.
Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 19
89）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡ
の塩基配列の置換は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-
super ExpressKm（宝酒造（株））、Mutan^TM-K（宝酒造
（株））等を用いて、ODA-LA PCR法やGapped duplex法
やKunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法
に従って行なうことができる。

【００４１】クローン化された本発明のタンパク質また
はその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、目的により
そのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リ
ンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮ
Ａはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを
有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡ
Ａ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの
翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡ
アダプターを用いて付加することもできる。本発明のタ
ンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの
発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡから目的とするＤＮ
Ａ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベ
クター中のプロモーターの下流に連結することにより製
造することができる。ベクターとしては、例えば、大腸
菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２
５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母
由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λフ
ァージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワ
クシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイル
スなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭ
Ｖ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用い
られる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿
主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０
プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメ
ガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモータ
ーなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿
主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ
Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバ
チルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰ
Ｏ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が
酵母である場合は、ＡＯＸ１プロモーター、ＰＨＯ５プ
ロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモータ
ー、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細
胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プ
ロモーターなどが好ましい。

【００４２】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝
子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、ネオマイ
シン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合があ
る、Ｇ４１８耐性）等が用いられる。ｄｈｆｒ遺伝子は
メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性を、ＮｅｏはＧ４１８
耐性を付与する。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択
マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地
によっても目的とする遺伝子を選択することができる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タ
ンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属
菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・
シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合
は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シ
グナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・
シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動
物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル
配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子
・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。

【００４３】このようにして構築された本発明のタンパ
ク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導
入することによって形質転換体を製造することができ
る。宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチル
ス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いら
れる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６
８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサー
チ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９
８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア・パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが
用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞とし
ては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１
細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vit
ro）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、
Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中でも、ＣＨ
Ｏ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、２９３細胞などが
好ましい。

【００４４】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９
７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４
巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載
の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞や昆虫を
形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bi
o/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に
従って行なうことができる。動物細胞を形質転換するに
は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコ
ール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴ
ィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に
記載の方法に従って行なうことができる。発現ベクター
の細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロ
ジー（Virology） 52, 456-467（1973）〕、電気穿孔法
〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.）
1,841-845（1982）〕等が用いられる。このようにし
て、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する
発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることが
できる。なお、動物細胞を用いて、本発明のタンパク質
を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導
入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をク
ローン選択によって選択する方法がある。具体的には、
上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する
ことができる。さらに、このように選択マーカーを用い
て得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を
行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有す
る安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆ
ｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度
を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、
ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のタンパク質をコード
するＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物
細胞株を得ることもできる。上記の形質転換体を本発明
のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質ま
たはその部分ペプチドを生成、蓄積せしめることによっ
て、本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれ
らの塩を製造することができる。

【００４５】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ用いられ
る。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など
を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例え
ば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー
（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Exp
eriments in Molecular Genetics），４３１−４３３，
Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕
が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく
働かせるために、例えば３β−インドリルアクリル酸の
ような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア
属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもでき
る。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４
０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を
加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培
養する際、培地としては、例えば、バークホールダー
（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８
０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitte
r, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１
巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨ
は約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０
℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通
気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（G
race, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）
に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたも
のなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に
調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５
日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が
動物細胞である形質転換体を培養する際、培地として
は、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培
地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５
２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８
巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジ
ャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシ
エーション（The Journal of the American Medical As
sociation）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培
地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding ofthe
Society for the Biological Medicine），７３巻，１
(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８である
のが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜
７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。特
に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を
選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほとんど含
まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるの
が好ましい。

【００４６】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用
い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタン
パク変性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤
が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌さ
れる場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは
細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして
得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明
のタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組
み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、
精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用
する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主とし
て分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティー
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を
利用する方法などが用いられる。このようにして得られ
る本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、公
知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換す
ることができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あ
るいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に
変換することができる。なお、組換え体が産生する本発
明のタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパ
ク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加
えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもでき
る。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、
プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられ
る。このようにして生成する本発明のタンパク質の存在
は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどに
より測定することができる。

【００４７】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタ
ンパク質と略記することもある）を認識し得る抗体であ
れば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れ
であってもよい。本発明のタンパク質に対する抗体（以
下、本発明の抗体と略記することもある）は、本発明の
タンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清
の製造法に従って製造することができる。

【００４８】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行なうことができる。温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが用いら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免
疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種
または異種の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することがで
きる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識
化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1
975)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例え
ば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられ
る。

【００４９】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物由来の
骨髄腫細胞が用いられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いら
れる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施することが
できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タ
ンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固
相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清
を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫
グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの
場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）また
はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル
抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロ
テインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を
添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を
加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方
法などが用いられる。

【００５０】モノクローナル抗体の選別は、公知あるい
はそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常
ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）
を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を
含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブ
リドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００５１】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例え
ば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコ
ール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体
（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテ
インＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なう
ことができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル
抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製
造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗
原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記
のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫
を行ない、該免疫動物から本発明のポリクローナル抗体
含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより
製造することができる。温血動物を免疫するために用い
られる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関
し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハ
プテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫した
ハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なも
のをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ
血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン
等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ま
しくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられ
る。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種
々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒ
ドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオー
ル基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等
が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体
産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とと
もに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週
毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができ
る。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温
血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取する
ことができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定
は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき
る。抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分
離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行
なうことができる。

【００５２】本発明のタンパク質または部分ペプチドを
コードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに実質的に相補的な塩
基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本発明の
タンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまた
はｍＲＮＡの塩基配列またはその一部の塩基配列に実質
的に相補的な塩基配列を有し、該タンパク質または部分
ペプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレ
オチドまたはその誘導体であれば、いずれのアンチセン
スＤＮＡであってもよい。該ＤＮＡまたはｍＲＮＡに実
質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、該ＤＮＡまた
はｍＲＮＡの相補鎖）の全塩基配列または部分塩基配列
と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好まし
くは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相
同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明
のＤＮＡまたはｍＲＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本
発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基
配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補
鎖と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ま
しくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の
相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これ
らのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置など
を用いて製造することができる。

【００５３】本発明のタンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩は、例えば、カスパーゼ３阻害作用など
の作用を有している。したがって、本発明のタンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は上記作用に基
づくさまざまな用途に用いることができる。

【００５４】以下に、本発明のタンパク質、その部分ペ
プチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と
略記する場合がある）、本発明のタンパク質等をコード
するＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合があ
る）、本発明のタンパク質等に対する抗体（本発明の抗
体と略記する場合がある）およびアンチセンスＤＮＡの
用途を説明する。

【００５５】（１）カスパーゼ３阻害作用に基づく各種
疾病の予防および／または治療剤などの医薬 カスパーゼ３阻害作用とは、細胞の細胞死が誘導される
際に活性化されて、種々の細胞内タンパク質を分解する
ことによって細胞死を実行するプロテア―ゼであるとこ
ろのカスパーゼ３の部分切断による活性化を抑制する作
用のことなどをいう。すなわち、本発明のタンパク質ま
たは本発明のＤＮＡは、カスパーゼの前駆体から活性型
カスパーゼへのプロセッシングを抑制する作用を有して
いる。例えば、生体内において本発明のタンパク質が減
少あるいは欠損しているために、カスパーゼ３阻害作用
などが十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる
場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体
内で本発明のタンパク質を発現させることによって、
（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパ
ク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することに
よって、（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投与する
ことなどによって、該患者における本発明のタンパク質
の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができ
る。。したがって、本発明のタンパク質および本発明の
ＤＮＡは、カスパーゼ３阻害剤として、例えば、ＡＩＤ
Ｓ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索
硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生
不良性貧血、鉄芽球性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性
心不全、移植片対宿主病または先天性・後天性酵素障害
などの疾病の予防および／または治療剤などの医薬とし
て有用である。本発明のＤＮＡを上記の予防および／ま
たは治療剤などとして使用する場合は、該ＤＮＡを単独
あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベク
ター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクタ
ーなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従っ
てヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明
のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補
助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化
し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテー
テルによって投与できる。

【００５６】本発明のタンパク質を上記の予防および／
または治療剤として使用する場合は、少なくとも９０
％、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、
さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用す
るのが好ましい。本発明のタンパク質を上記の医薬とし
て使用する場合は、例えば、必要に応じて糖衣を施した
錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤
などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬
学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤な
どの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発
明のタンパク質を生理学的に認められる担体、香味剤、
賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などととも
に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態
で混和することによって製造することができる。これら
製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量
が得られるようにするものである。本発明のＤＮＡを用
いる場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソ
シエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに
挿入した後、常套手段に従って投与することができる。

【００５７】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、
ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例
えば、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０など）など
と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、
大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、
通常、適当なアンプルに充填される。本発明のＤＮＡが
挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、
非経口的に使用される。

【００５８】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラ
ット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。本発明のタンパク質の投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、再生不良性貧血治療剤として本発明のタンパク質
を経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）
においては、一日につき該タンパク質を約０.１ｍｇ〜
１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ま
しくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与す
る場合は、該タンパク質の１回投与量は投与対象、対象
疾患などによっても異なるが、例えば、再生不良性貧血
治療剤として本発明のタンパク質を注射剤の形で成人
（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該
タンパク質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約
０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０
ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都
合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算し
た量を投与することができる。

【００５９】（２）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することによ
り、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモ
ット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）における本発明のタンパク質をコードす
るＤＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができ
る。したがって、本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク
質が関与する各種疾病の遺伝子診断剤として有用であ
る。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡま
たはｍＲＮＡが損傷し、欠損し、あるいはタンパク質の
発現が減少していることが検出された場合は、カスパー
ゼ３阻害作用が十分でないことから、ＡＩＤＳ、アルツ
ハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色
素性網膜炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生不良性貧
血、鉄芽球性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不全、
移植片対宿主病または先天性・後天性酵素障害などの疾
病であると診断することができる。本発明のＤＮＡを用
いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイ
ブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミック
ス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９
年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー
（Proceedings of theNational Academy of Sciences o
f the United States of America），第８６巻，２７６
６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施するこ
とができる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーション
により該ｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、例え
ば、カスパーゼ３阻害作用が十分でないことから、ＡＩ
ＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側
索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、骨髄異形成症、再
生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢
性心不全、移植片対宿主病または先天性・後天性酵素障
害などの疾病である、または将来罹患する可能性が高い
と診断することができる。

【００６０】（３）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩の定量による本発明のタンパク質
のカスパーゼ３阻害作用に基づく各種疾病の診断 本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識す
ることができるので、被検液中の本発明のタンパク質の
定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量をするこ
とによって、本発明のタンパク質のカスパーゼ３阻害作
用に基づく各種疾病の診断などに使用することができ
る。本発明のタンパク質の定量法としては、（ｉ）本発
明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパ
ク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化さ
れた本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴と
する被検液中の本発明のタンパク質を定量する方法、お
よび（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体お
よび標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連
続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク
質を定量する方法などがあげられる。上記（ii）の定量
法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端
部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質
のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。また、
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以
下、単にモノクローナル抗体と称する場合がある）を用
いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染
色等による検出を行なうこともできる。これらの目的に
は、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子
のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いて
もよい。本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定
量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中
の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗
原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的
手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を
用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、
いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリ
ー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法
が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述する
サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を
用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放
射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いら
れる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、
〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが、上記酵素として
は、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β
−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフ
ォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵
素などが、蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物
質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、
ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ用いられる。
さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン
−アビジン系を用いることもできる。抗原あるいは抗体
の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通
常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに
用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体として
は、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースな
どの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミ
ド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラスなどが用い
られる。サンドイッチ法においては不溶化したモノクロ
ーナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標
識化したモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによ
り被検液中の本発明のタンパク質量を定量することがで
きる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、ま
た、同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても
よい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準
じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測
定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いら
れる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度
を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用
いてもよい。

【００６１】本発明のサンドイッチ法による本発明のタ
ンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用
いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタン
パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いら
れる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる
抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明
のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用い
られる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を
認識する抗体が用いられる。本発明のモノクローナル抗
体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合
法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに
用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標
識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反
応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）と
を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測
定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗
体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレン
グリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液
相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、
あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体とし
て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノ
メトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一
定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相
を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標
識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の
標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離
する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の
抗原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内
あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈
降物の量を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少
量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利
用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられ
る。

【００６２】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイム
ノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunoch
emical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunoche
mical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunoche
mical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunoche
mical Techniques(Part D: Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E: Mo
noclonal Antibodiesand General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量す
ることができる。上述の定量法によって、本発明のタン
パク質が関与する各種疾病の診断を行なうことができ
る。例えば、本発明のタンパク質の濃度の減少が検出さ
れた場合は、例えば、カスパーゼ３阻害作用が不十分で
あることから、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキン
ソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変
性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心
筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または
先天性・後天性酵素障害などの疾病である、または将来
罹患する可能性が高いと診断することができる。

【００６３】（４）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能を
抑制することができるので、例えば、本発明のタンパク
質などの発現過多に起因する疾患の予防および／または
治療剤として使用することができる。上記アンチセンス
ＤＮＡを上記の予防および／または治療剤として使用す
る場合、前記した本発明のＤＮＡを含有する各種疾病の
予防および／または治療剤と同様にして使用することが
できる。例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、
該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソ
シエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに
挿入した後、常套手段に従って投与することができる。
該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促
進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とと
もに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ
うなカテーテルによって投与できる。さらに、該アンチ
センスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの
存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレ
オチドプローブとして使用することもできる。

【００６４】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission
on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸

【００６５】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl₂Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００６６】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のヒト由来タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明のマウス由来タンパク質のアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のラット由来タンパク質のアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：４〕本発明の配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５〕プラスミドｐＴＢ１９３９に挿入され
ている、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃＤＮＡを
含有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：６〕プラスミドｐＴＢ１９４０に挿入され
ている、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有するヒト由来タンパク質をコードするｃＤＮＡを
含有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７〕本発明の配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を有するマウス由来タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：８〕プラスミドｐＴＢ１９５８に挿入され
ている、本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列を有するマウス由来タンパク質をコードするｃＤＮＡ
を含有するＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：９〕本発明の配列番号：２で表わされるア
ミノ酸配列を有するマウス由来タンパク質をコードする
ゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１０〕本発明の配列番号：３で表わされる
アミノ酸配列を有するラット由来タンパク質をコードす
るｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：１１〕本発明のヒト由来タンパク質をコー
ドするＤＮＡをクローニングするために使用した合成オ
リゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１２〕本発明のヒト由来タンパク質をコー
ドするＤＮＡをクローニングするために使用したプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１３〕本発明のヒト由来タンパク質をコー
ドするＤＮＡをクローニングするために使用したプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：１４〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したオリ
ゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１５〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したオリ
ゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１６〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１７〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：１８〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用したマウス染色体ＤＮＡ断片の両末端結合しているア
ダプターの塩基配列を示す。 〔配列番号：１９〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：２０〕本発明のマウス由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡの開始コドン付近の塩基配列の解析に使
用した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号：２１〕本発明のヒト由来タンパク質の細胞
外領域をコードするＤＮＡをクローニングするために使
用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２２〕本発明のヒト由来タンパク質の細胞
外領域をコードするＤＮＡをクローニングするために使
用したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２３〕本発明のラット由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２４〕本発明のラット由来タンパク質をコ
ードするＤＮＡをクローニングするために使用したプラ
イマーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２５〕本発明のタンパク質のアミノ酸配列
の一般式（Ｉ）を示す。 〔配列番号：２６〕後述の参考例６で使用したプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２７〕後述の参考例６で使用したプライマ
ーの塩基配列を示す。 〔配列番号：２８〕後述の参考例７で使用したプライマ
ー１の塩基配列を示す。 〔配列番号：２９〕後述の参考例７で使用したプライマ
ー２の塩基配列を示す。 〔配列番号：３０〕後述の参考例７で取得した６１２塩
基からなるｃＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：３１〕後述の参考例７で取得したｈＴＬ４
−２のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３２〕本発明のタンパク質のアミノ酸配列
の一般式（ＩＩ）を示す。 〔配列番号：３３〕後述の参考例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。 〔配列番号：３４〕後述の参考例８で用いられたプライ
マーの塩基配列を示す。

【００６７】後述の参考例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴ
Ｂ１９３９およびエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４０は、それぞれ１９９６
年７月１７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中
央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産
業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））
に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５５９５およびＦＥＲＭ
ＢＰ−５５９６として、また１９９６年７月１１日から
大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便
番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に寄託番号ＩＦＯ １５９９７およびＩＦＯ １５
９９８として寄託されている。後述の参考例２で得られ
た形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
ＤＨ５α／ｐＴＢ１９５８は、１９９７年１月３０日か
ら茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番
号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究
所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５８０５として、また１９９７年１月３１
日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号
（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所
（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６０５４として寄託さ
れている。なお、ＮＩＢＨによる寄託証中の微生物の識
別のための表示欄に「エシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９５８」と記載されてい
るが、正しくは「エシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）ＤＨ５α／ｐＴＢ１９５８」であり、本件について
は１９９７年２月５日付で記載事項変更届を提出済みで
ある。後述の参考例３で得られた形質転換体エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１
１は、１９９７年７月８日から茨城県つくば市東１丁目
１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独
立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０１２と
して、また１９９７年７月７日から大阪府大阪市淀川区
十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８
６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６１０９として寄託されている。後述の参考例５
で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１２は、１９９７年７月
８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６０１３として、また１９９７年
７月７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番
８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵
研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６１１０として
寄託されている。後述の参考例７で得られたｈＴＬ４−
２をコードする塩基配列を保持する形質転換体エシェリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｈＴＬ４−
ｐＣＲ２．１は、１９９９年１２月６日から茨城県つく
ば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８
５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物
寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
６９５８として、また１９９９年１０月２７日から大阪
府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号
５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）
に寄託番号ＩＦＯ １６３２９として寄託されている。

【００６８】

【実施例】以下に、実施例および参考例をあげて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定され
るものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、モレキュラー・クローニング（Molecular clonin
g）に記載されている方法に従った。

【００６９】参考例１ ヒト由来ＴＬ４タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡのクローニング ｃＤＮＡのクローニングは、ジーントラッパー（GENETR
APPERＴＭ）ｃＤＮＡポジティブ選択システム（ギブコ
ビーアールエル社）を用いて行なった。スーパースクリ
プト^TMヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ギブコビーアー
ルエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００μg/ml ア
ンピシリン含有Terrific Broth（１２g/l Bacto-trypto
ne（ディフコ社）、２４g/l Bacto-yeast extract（デ
ィフコ社）、２.３g/l リン酸一カリウム、１２.５g/l
リン酸二カリウム、０．４％ グリセロール）で３０℃
で１６時間培養し、集菌後、キアジェンプラスミドキッ
ト（キアジェン社）を用いて、プラスミドｃＤＮＡライ
ブラリーを調製した。精製したプラスミドｃＤＮＡライ
ブラリーをＧｅｎｅII，ＥｘｏIII（いずれもギブコビ
ーアールエル社）によって消化し、一本鎖ｃＤＮＡライ
ブラリーを作成した。一方、プローブとして、合成オリ
ゴヌクレオチド（配列番号：１１）をｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングに用いた。プローブは、ＴｄＴ，
ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコビーアールエル社）
を用いて、３'末端をビオチン化することで標識した。
一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを９５℃で１分間処理した
後、氷中で急冷し、ビオチン化したプローブを加えて３
７℃で１時間、室温でハイブリダイゼーションを行なっ
た。ハイブリダイゼーション後、ジーントラッパーｃＤ
ＮＡポジティブ選択システム・ストレプトアビジンビー
ズ（ギブコビーアールエル社）を加えて、室温で２分ご
とに撹拌しながら３０分間放置した。その後、ジーント
ラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・マグネット
ラック（ギブコビーアールエル社）中に入れ、２分間放
置した。上清を捨て、マグネットビーズをジーントラッ
パーｃＤＮＡポジティブ選択システム・ウオッシュバッ
ファーで洗浄した。このウオッシュバッファーによる洗
浄を３回行なった。その後、マグネットラックに入れて
放置し、上清を捨て、ジーントラッパーｃＤＮＡポジテ
ィブ選択システム・溶出バッファーを加え、５分間室温
で放置した。マグネットラックに入れて５分間放置した
後、その上清のＤＮＡ溶液を回収した。取得したＤＮＡ
溶液にプライマーとして合成オリゴヌクレオチド（配列
番号：１１）を入れ、９５℃で１分間処理した。ジーン
トラッパーｃＤＮＡポジティブ選択システム・修復酵素
を加え、７０℃で１５分間放置して二本鎖ＤＮＡを合成
した。合成した二本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーション
装置（バイオ・ラッド社）により、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株
に導入した。得られた形質転換株を用いて２種のオリゴ
ヌクレオチド（配列番号：１２、配列番号：１３）をプ
ライマーとしてコロニーＰＣＲによるスクリーニングを
行なった。ＰＣＲにより４３４ｂｐの増幅断片が形成さ
れたコロニーを陽性クローンとして３株（＃９、＃３
３、＃８１）選択した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮ
Ａを抽出し、Ｔａｑダイデオキシターミネーターサイク
ルシーケンシングキット（パーキンエルマー社）を用い
て反応を行ない、ABI PRISM^TM ３７７ ＤＮＡシーケン
サー（パーキンエルマー社）により、ｃＤＮＡ断片の塩
基配列を決定した。取得した３クローンのうち、クロー
ン＃９とクローン＃３３は同一のＤＮＡ断片を含んでお
り、poly(Ａ)⁺鎖を含む配列番号：５で表される１４９
１個の塩基配列を有していた。また、クローン＃８１は
poly(Ａ)⁺鎖、並びに poly(Ａ)⁺付加シグナル（ＡＡＴ
ＡＡ）を含む配列番号：６で表される１３５３個の塩基
配列を有していた。これら３クローンのｃＤＮＡ断片に
は同一遺伝子が含まれており、配列番号：１で表される
２４０個のアミノ酸からなるＴＬ４タンパク質がコード
されていた。また Kyte−Doolittle解析から、３５番バ
リン（Ｖａｌ）から６３番トリプトファン（Ｔｒｐ）に
かけての疎水性領域が本タンパク質の膜貫通領域と予想
された。本タンパク質はヒトリンホトキシンβと最も相
同性が高かったが、アミノ酸レベルで３３％の相同性が
見られた。また、ヒトＦａｓリガンドとはアミノ酸レベ
ルで３１％の相同性が見られたが、J. Hein法（PAM250
residue weight table に基づく）による系統樹解析で
は、ヒトリンホトキシンβよりもヒトＦａｓリガンドと
のより高い相同性が見られた。本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡのうちクローン＃９を保持するプラスミ
ドｐＴＢ１９３９並びにクローン＃８１を含むプラスミ
ドｐＴＢ１９４０を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ１
０Ｂに導入して、形質転換体：大腸菌（Escherichia co
li）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９３９並びに大腸菌（Escher
ichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＢ１９４０を得た。

【００７０】参考例２ マウス由来ＴＬ４タンパク質を
コードするｃＤＮＡのクローニングｃＤＮＡのクローニ
ングは、ＰＣＲ法によって行なった。スーパースクリプ
ト ^TMマウス８.５日胚由来ｃＤＮＡライブラリー（ギブ
コビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００
μg/ml アンピシリン含有Super Broth（３２g/l Bacto
-tryptone（ディフコ社）、２０g/l Bacto-yeast extr
act（ディフコ社）、０.２g/l NaCl）で３０℃、１６
時間培養した後、キアジェンプラスミドキット（キアジ
ェン社）を用いてプラスミドｃＤＮＡライブラリーを調
製し、鋳型として用いた。プライマーとして、次の２つ
の合成オリゴヌクレオチドを用いた。 ５'−ＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＴ−３' （配列番号：１４） ５'−ＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＧＴＣ−３' （配列番号：１５） ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造
（株））を含む系で、サーマルサークラー（GeneAmpＲ
PCR System 2400，パーキンエルマー社）を用いて９４
℃，１分を１サイクル、９４℃，２０秒→５５℃，３０
秒→７２℃，２分を３０サイクル、４℃放置の条件で行
なった。得られた増幅断片をpT7Blue T-vector（ノバジ
ェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージョン２
（宝酒造（株））を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５α株に
導入した。得られた形質転換菌からプラスミドＤＮＡを
抽出し、ダイターミネーターサイクルシークエンスＦＳ
レディリアクションキット（パーキンエルマー社）を用
いて反応を行ない、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（パ
ーキンエルマー社）によりｃＤＮＡ断片の塩基配列を決
定した。取得したクローンは、配列番号：７で表わされ
る７１７個の塩基配列を含む配列番号：８で表される７
９５個の塩基配列を有しており、配列番号：２で表わさ
れる２３９個のアミノ酸からなるマウス由来ＴＬ４タン
パク質をコードしていた。このマウス由来ＴＬ４タンパ
ク質と参考例１で得られた配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を有するヒト由来ＴＬ４タンパク質とは、ア
ミノ酸レベルで７８％の相同性を有しており、また、そ
れをコードするＤＮＡは、塩基レベルで７７％の相同性
を有していた。得られたマウス由来ＴＬ４タンパク質を
コードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ１９５８
を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５αに導入して、形
質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＴ
Ｂ１９５８を得た。次に、プロモーターファインダーＤ
ＮＡウォーキングキット（クローンテック社）を用い
て、本発明のマウス由来タンパク質をコードするＤＮＡ
の開始コドン付近の配列の解析を行なった。使用したマ
ウスゲノムＤＮＡは、予めＳｃａＩの制限酵素で消化さ
れ、その５'および３'末端に、プライマーＡＰ１（クロ
ーンテック社）やプライマーＡＰ２（クローンテック
社）が結合可能なアダプター配列が連結されている。 プライマーＡＰ１：（配列番号：１６） ５'−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
−３' プライマーＡＰ２：（配列番号：１７） ５'−ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３' アダプター配列：（配列番号：１８） ５'−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧ
Ｔ−３' 第１ＰＣＲ反応は、このマウスゲノムＤＮＡ溶液とＴａ
ＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲキットバージョン２（宝酒造
（株））、ＡＰ１、合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ１を
用い、サーマルサイクラー（GeneAmpＲ PCR System 240
0，パーキンエルマー社）で、９４℃，２秒、７２℃，
３分を７サイクル、９４℃，２秒、６８℃，３分を３７
サイクル、６８℃，４分、４℃放置の条件で行なった。 合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ１：（配列番号：１
９） ５'−ＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣ
ＡＣＣＡＧ−３' 次に、この反応液を滅菌水で５０倍希釈し、第２ＰＣＲ
反応に用いた。第２ＰＣＲ反応は、この第１ＰＣＲ反応
液、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲキットバージョン２（宝
酒造（株））、前記プライマーＡＰ２、合成オリゴヌク
レオチドＧＳＰ２を用い、サーマルサイクラー（GeneAm
pＲ PCR System 2400，パーキンエルマー社）で、９４
℃，２秒、７２℃，３分を５サイクル、９４℃，２秒、
６８℃，３分を２５サイクル、６８℃，４分、４℃放置
の条件で行なった。 合成オリゴヌクレオチドＧＳＰ２：（配列番号：２
０） ５'−ＧＣＣＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣＣＧＴ
ＣＴＧＴＣ−３' ＳｃａＩで消化したゲノムＤＮＡ溶液から得られた約
１.１ｋｂｐの増幅断片をｐＴ７ブルーＴ−ベクター
（ノバジェン社）にＤＮＡライゲーションキットバージ
ョン２（宝酒造（株））を用いて挿入し、大腸菌ＤＨ５
α株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株
から、プラスミドＤＮＡを抽出し、ダイターミネーター
サイクルシークエンスＦＳレディリアクションキット
（パーキンエルマー社）を用いて反応を行ない、３７３
Ａ ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー社）によ
り増幅断片の塩基配列の一部を決定した。取得したクロ
ーンには、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
する本発明のマウス由来タンパク質の１番Ｍｅｔ（開始
コドン）から１３番Ａｓｐをコードする塩基配列（配列
番号：７で表わされる塩基配列の第１〜３９番目の塩基
配列）と完全に一致する配列が存在したことから、本発
明のマウス由来タンパク質をコードするｃＤＮＡのクロ
ーニングに用いた合成オリゴヌクレオチド（配列番号：
１４）の配列は、実際の本発明のマウス由来タンパク質
をコードするＤＮＡの配列の一部であることが確認され
た。

【００７１】参考例３ マウス由来ＴＬ４タンパク質遺
伝子のコード領域を含む染色体遺伝子のクローニング マウス由来ＴＬ４タンパク質遺伝子のオープンリーディ
ングフレーム部分を含む領域をコードする染色体ＤＮＡ
断片の取得は、１２９ＳＶＪマウス染色体ＤＮＡ Ｓａ
ｕ３ＡＩ部分消化断片を組み込んだラムダＦＩＸＲIIラ
イブラリー（ストラタジーン社）を用いて、標識したマ
ウス由来ＴＬ４タンパク質ｃＤＮＡをプローブとしたプ
ラークハイブリダイゼーション法により単離した。ま
ず、１^-10×１０⁴pfu（plaque-forming unit）/mlにな
るように希釈したファージ溶液に、０.２％マルトー
ス，１０mM ＭｇＳＯ₄を添加したＬＢ培地で３０℃一晩
培養した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡの培養液を同
量混ぜ、３７℃、１０分間インキュベートした。該混合
液２００μｌに対して、あらかじめ５０℃に温めておい
た５mlのトップアガロース（０.７％になるようアガロ
ースを添加したＮＺＹ培地〔５g/l ＮａＣｌ、２g/l Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５g/l yeast extract、１０g/l Ｎ
Ｚアミン（ｐＨ７.５に調整）〕を加え、ＮＺＹプレー
ト（１.５％ アガロース、９cmディッシュ）に均一にな
るように重曹した後、９時間、３７℃で静置した。あら
かじめプレートの位置がわかるように印をつけたナイロ
ントランスファーメンブレン HybondＴＭ−Ｎ＋（アマ
シャム社）を該プレート上に１分間密着させることによ
り、出現したファージ粒子をメンブレン上に移した。該
メンブレンを変性溶液（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ Ｎ
ａＯＨ）を染み込ませたワットマン３ＭＭペーパー濾紙
（ワットマンインターナショナル社）上に、ファージの
ついた面を上にして７分間置いた後、中和溶液（１.５
Ｍ ＮａＣｌ、０.５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ７.２）、１mM
ＥＤＴＡ）を染み込ませた濾紙上に、ファージのつい
た面を上にして３分間放置した。再度この中和処理を繰
り返した後、２×ＳＳＣ溶液（０.３Ｍ ＮａＣｌ、０.
０３Ｍ クエン酸ナトリウム）で洗浄した。該メンブレ
ンを自然乾燥させた後、０.４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませ
た濾紙上に、ファージのついた面を上にして２０分間置
き、５×ＳＳＣ溶液（０.７５Ｍ ＮａＣｌ、７５mM ク
エン酸ナトリウム）で洗浄し、ハイブリダイゼーション
パックにつめた。このパックにＥＣＬ遺伝子検出システ
ム（アマシャム社）のハイブリダイゼーションバッファ
ーを５ml加えて１時間、４２℃でプレハイブリダイゼー
ションを行なった。一方、マウス由来ＴＬ４タンパク質
ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム部分（７２０
ｂｐ）をＰＣＲ反応により増幅させたＤＮＡ断片を熱変
性後に、ＥＣＬ遺伝子検出システムのラベリング試薬と
グルタルアルデヒドを同量ずつ添加して５分間３７℃で
インキュベートし標識した後、これを１０μlずつプレ
ハイブリダイゼーションパックに添加し、４２℃で１時
間インキュベートした。その後パックよりメンブレンを
取り出し、あらかじめ４２℃に保温させた一次洗浄バッ
ファー（６Ｍ 尿素、４g/l ＳＤＳ、２５ml/l ２０×Ｓ
ＳＣ）で２０分間洗浄した。これを再度繰り返した後、
室温で二次洗浄バッファー（２×ＳＳＣ）で５分間洗浄
した。これを再度繰り返した後、ＥＣＬ遺伝子検出シス
テムの検出試薬に１分間浸した後、メンブレンをＸ線フ
ィルムに重ね、感光させた。１時間後に該メンブレンを
取り出して現像を行ない、ポジティブクローンを選択し
た。ここで選択したクローンをさらに先と同様の方法に
より二次スクリーニングに供し、最終的に５つの候補ク
ローン（＃２，３，４，５，６）を得ることができた。
ＰＣＲ反応を行なった結果から、これら５つの候補クロ
ーンのうち、マウス由来ＴＬ４タンパク質をコードする
遺伝子の全領域を包含しているクローンは＃１クローン
及び＃６クローンであることがわかった。次に、マウス
由来ＴＬ４タンパク質遺伝子のコード領域を含む染色体
ＤＮＡの塩基配列を明らかにする目的でサブクローニン
グを行なった。まず得られた＃６クローンを制限酵素Ｘ
ｂａＩで消化した後、０.７％アガロースゲルを用いて
電気泳動を行ない、マウス由来ＴＬ４タンパク質遺伝子
のコード領域を含むことが考えられた約９kbのＤＮＡ断
片を切り出し、キアクイックゲル抽出キット（キアジェ
ン社）を用いて回収・精製を行なった。一方、クローニ
ングベクターｐＵＣ１９は制限酵素ＸｂａＩで消化した
後、１.０％アガロースゲルを用いて電気泳動を行な
い、２.７kbに相当するＤＮＡ断片を切り出し、キアク
イックゲル抽出キット（キアジェン社）を用いて回収・
精製を行なった後、ウシ小腸由来アルカリフォスファタ
ーゼＣＩＡＰ（宝酒造）を用いて末端の脱リン酸化を行
なった。このＣＩＡＰ処理ｐＵＣ１９に、先に調製した
＃６クローン由来のＤＮＡ断片をＤＮＡ Ligation Kit
Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに導
入して得られたアンピシリン耐性株より目的のＤＮＡ断
片が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択・単離した。ク
ローン化された＃６クローン由来のＸｂａＩ ＤＮＡ断
片の塩基配列については、種々の合成オリゴＤＮＡをプ
ライマーとし、ダイターミネーターサイクルシークエン
スＦＳレディリアクションキット（パーキンエルマー
社）を用いたシークエンス反応を、添付資料の条件に従
ってGeneAmpＲPCR System 2400で行なった後、該試料を
ＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー社）で決定
した。得られた塩基配列は遺伝子解析ソフトレーザージ
ーン（Lasergene、ディーエヌエースター（DNASTAR）
社）で確認した。その結果、マウス由来ＴＬ４タンパク
質をコードする染色体遺伝子は４つのエクソンから成る
ことが分かった。以上のようにして取得した、マウス由
来ＴＬ４タンパク質のコード領域を含む＃６クローン由
来のＸｂａＩ ＤＮＡ断片を保持するプラスミドはｐＴ
Ｂ２０１１と命名し、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ
５αに導入して得た形質転換体は、大腸菌（Escherichi
a coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ２０１１とした。

【００７２】参考例４ Pichia酵母を宿主としたヒト由
来ＴＬ４タンパク質の細胞外領域の発現とウエスタンブ
ロット解析 本発明のヒト由来ＴＬ４タンパク質の細胞外領域を酵母
Pichia pastorisで発現させるためのベクターとしては
ｐＰＩＣＺαＡ（インビトロジェン社）を用いた。本ベ
クターには該酵母のアルコールオキシダーゼ遺伝子（Ａ
ＯＸ１）のプロモーターの下流にPichia酵母でも機能的
な出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの分泌シグナルα
−因子をコードする遺伝子とそれに続くマルチクローニ
ングサイトが含まれており、組換えタンパク質を培地中
に分泌させることが可能である。まず本発明のヒト由来
ＴＬ４タンパク質の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片
はＰＣＲ法により調製するが、その際用いる次の２種の
プライマーをＤＮＡ合成機（Oligo1000M、ベックマン
社）で合成した。 ５'−プライマー：（配列番号：２１） ５'−ＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＧＴＣ
ＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣ−３' （このプライマーは、ＥｃｏＲＩ認識配列とその３'側
にヒト由来ＴＬ４タンパク質の細胞外領域のうち、Ｎ末
端側の８５番Ｇｌｎから８アミノ酸をコードする２４塩
基を有する） ３'−プライマー：（配列番号：２２） ５'−ＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡ
ＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣ−３' （このプライマーは、ＸｂａＩ認識配列とその３'側に
終止コドン（ＴＧＡ）とヒト由来ＴＬ４タンパク質の細
胞外領域Ｃ末端５アミノ酸をコードする１５塩基に相補
的な配列を有する） 得られたプライマーをそれぞれ５０pmol、参考例１で得
られたプラスミドｐＴＢ１９３９を１００ｎｇ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各１０ｎｍｏｌ、
２.５ユニットのネイティブＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジーン社）とネイティブＰｆｕバッファー
（ストラタジーン社）５μｌを含む５０μｌの溶液を調
製し、サーマルサイクラー（GeneAmpＲ PCR System 240
0、パーキンエルマー社）を用いて、９４℃、１分、続
いて９８℃、２０秒→５５℃、３０秒→６８℃、２分を
１サイクルとする反応を３０サイクル、最後に７２℃、
５分の条件でＰＣＲ反応を行なった。反応終了液からＰ
ＣＲ産物を回収し、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化後、予
めＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化・線状化したｐＰＩＣＺ
αＡに連結し、環状化プラスミドを得た。該プラスミド
ＤＮＡを再びＡＯＸ１座位のＳａｃＩユニーク切断部位
で切断し、線状化後、エレクトロポレーション法により
Pichia pastoris ＫＭ７１株に導入した。そこで得られ
た１００μg/mlZeocin^TM（インビトロジェン社）含有Ｙ
ＰＤ寒天培地（１％ yeast extract（ディフコ（Difc
o）社）、２％ Bactopeptone（ディフコ（Difco）
社）、２％ glucose（和光純薬）、２％ 寒天末（和光
純薬））上で生育可能なZeocin^TM耐性株の中から数クロ
ーンを選択し、各染色体ＤＮＡを調製後、それを鋳型に
用いた、導入プラスミドＤＮＡの染色体への組み込みを
確認するためのＰＣＲ反応を行ない、組み込みが確認さ
れたクローンを目的とする組換えタンパク質発現用形質
転換株として選択した。組換えタンパク質の発現は以下
の手順で行なった。まず、１白金耳のヒト由来ＴＬ４タ
ンパク質の発現用形質転換株のコロニーをＢＭＧＹ培地
（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００mM リン酸
カリウム（ｐＨ６.０）、１.３４％ yeast nitrogen ba
se with ammonium sulfate without amino acids（ディ
フコ（Difco）社）、４×１０^-5％ ビオチン、１％ グ
リセロール）２５mlに接種し、３０℃、２０時間培養し
た。菌体を遠心で集め、次にＯＤ６００＝１.０になる
ようにＢＭＭＹ（１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１
００mM リン酸カリウム（ｐＨ６.０）、１.３４％ yeas
t nitrogen base with ammonium sulfate withoutamino
acids（ディフコ（Difco）社）、４×１０^-5％ ビオチ
ン、０.５％ メタノール）培地に再懸濁後、３０℃で培
養し、１日、または２日後に該培養液をサンプリング
し、遠心して培養上清を得た。本培養上清を用いたウエ
スタンブロッティングは以下の通りに行なった。まず、
ヒト由来ＴＬ４タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列
の一部（配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第１
６６番目〜第１８０番目までのアミノ酸配列）を含むペ
プチドを合成し、該合成ペプチドを認識するウサギ抗血
清を公知の方法に従って作製した。次に上述の培養上清
５μｌをサンプル処理液（０.２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、２％ ＳＤＳ、３０％ glycerol、１０％ β−merca
ptoethanol，０.０１％ bromophenol blue，ｐＨ６.
８）５μｌと混合し９５℃で５分処理した後、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０−２０％グラジ
エントゲル）を用い、泳動終了後タンパク質ブロッティ
ング装置（SemiPhor^TM、ホーファ・ファルマシア・バイ
オテック（Hoefer Pharmacia BioTech）社）を用いてニ
トロセルロース膜（ファルマシア社）に泳動タンパク質
を転写した。３％ ゼラチン含有ＴＢＳ（２０mM Ｔｒｉ
ｓ，５００mM ＮａＣｌ，ｐＨ７.５）で膜をブロッキン
グして、次にＴＴＢＳ（０.０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含
有ＴＢＳ）で洗浄後、１.０％ ゼラチン含有ＴＴＢＳで
２０００倍に希釈された上述のウサギ抗血清と室温で２
時間反応させた。反応終了後、膜をＴＴＢＳで２回洗浄
して、次に１.０％ゼラチン含有ＴＴＢＳで３０００倍
に希釈されたアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ヤ
ギ抗ウサギＩｇＧ抗体と室温で１時間反応させた。膜を
ＴＴＢＳで２回洗浄してさらにＴＢＳで１回洗浄後、Ａ
Ｐ発色キット（バイオラッド社）を用いて検出した。発
現ベクターを導入した株の培養上清では約２０ｋＤ付近
に主たるバンドが認められ、そのシグナルの強さは経時
的に増加していたが、対照のｐＰＩＣＺαＡ導入株の培
養上清では全くシグナルが認められなかった。

【００７３】参考例５ ラット由来ＴＬ４タンパク質を
コードするｃＤＮＡのクローニング ラット由来ＴＬ４タンパク質をコードするｃＤＮＡのク
ローニングは、ＰＣＲ法によって行なった。スーパース
クリプトＴＭラット肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ
ビーアールエル社）の大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を、１００μ
g/mlアンピシリン含有Terrific Broth（１２g/l Bacto-
tryptone（ディフコ社），２４g/l Bacto-yeast extrac
t（ディフコ社），２.３g/l リン酸一カリウム，１２.
５g/l リン酸二カリウム，０.４％ グリセロール）で３
０℃で１６時間培養し、集菌後、キアジェンプラスミド
キット（キアジェン社）を用いてプラスミドｃＤＮＡラ
イブラリーを調製した。該ＤＮＡを鋳型として、また、
下記の２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーＤＮ
Ａとして、またTaKaRa LA Taq（宝酒造（株））をＤＮ
Ａポリメラーゼとして用いた反応系でＰＣＲ反応を行な
った。 ５'−ＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣ−３' （配列番号：２３） ５'−ＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＡＧＣＣ−３' （配列番号：２４） 反応はサーマルサイクラー（GeneAmpＲ PCR System 240
0，パーキンエルマー社）を用いて、９４℃・１分を１
サイクル、９８℃・２０秒→５５℃・３０秒→７２℃・
３分を３５サイクル、７２℃・２分を１サイクル、４℃
・放置のプログラムで行なった。反応終了液の一部を
１.０％アガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ反応で増幅
された単一のＤＮＡ断片に対応するバンドを確認の後、
キアクィックゲルエキストラクションキット（キアジェ
ン社）を用いて該ＤＮＡ断片を回収し、その塩基配列を
決定するためにpT7Blue T-vector（ノバジェン社）のＴ
クローニングサイトにＤＮＡライゲーションキットバー
ジョン２（宝酒造（株））を用いて挿入・連結した。該
ライゲーション液を大腸菌ＤＨ５α株に導入後、アンピ
シリン含有ＬＢ寒天培地上で出現してきたアンピシリン
耐性形質転換株のコロニー群の中から２クローンを選択
し、各々からプラスミドＤＮＡを調製した。両クローン
の各挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するため、各プラスミ
ドＤＮＡを鋳型に、２種（ＰＲＭ−００７、ＰＲＭ−０
０８）の市販プライマーＤＮＡ（東洋紡績（株））の
他、ＤＮＡ合成装置（Oligo1000M、ベックマン社）で合
成したオリゴＤＮＡをプライマーＤＮＡとして用い、Th
ermo SequenaseＴＭ dye terminator cycle sequencing
pre-mix kit（アマシャム社）を用いたサイクルシーク
エンス反応を添付資料の条件に従ってGeneAmpＲ PCR Sy
stem 2400で行なった後、該試料をＤＮＡシーケンサー
３７３Ａ（パーキンエルマー社）で分析した。得られた
塩基配列は遺伝子解析ソフトレーザージーン（Lasergen
e、ディーエヌエースター（DNASTAR）社）で解析した。
その結果、両クローンとも、Ｔクローニングサイトに
は、配列番号：３で表される２３９個のアミノ酸からな
るラット由来ＴＬ４タンパク質をコードする配列番号：
１０で表される７１７個の塩基配列からなるオープンリ
ーディングフレーム（Open reading frame）を含む７８
４塩基対の塩基配列のＤＮＡ断片が含まれていた。この
ラット由来ＴＬ４タンパク質と参考例１で得られた配列
番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒト由来ＴＬ
４タンパク質とはアミノ酸レベルで７５％の相同性を有
しており、それらをコードするＤＮＡは塩基レベルで７
４％の相同性を有していた。また、このラット由来ＴＬ
４タンパク質と参考例２で得られた配列番号：２で表さ
れるアミノ酸配列を有するマウス由来ＴＬ４タンパク質
とはアミノ酸レベルで９６％の相同性を有しており、そ
れらをコードするＤＮＡは塩基レベルで９４％の相同性
を有していた。得られたラット由来ＴＬ４タンパク質を
コードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴＢ２０１２
を大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５αに導入して形質
転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ
２０１２を得た。

【００７４】参考例６ 昆虫細胞発現系を用いた可溶型
ヒトＴＬ４の生産 ヒトＴＬ４タンパク質をコードするＤＮＡを挿入したプ
ラスミドｐＴＢ１９４０を鋳型にして、５'末端部分に
制限酵素EcoRIの切断部位を付加した合成オリゴヌクレ
オチド（５’ＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡ
ＡＧＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣ３'（配列番号：２
６））と３’末端部にXbaIの制限酵素部位を付加した合
成オリゴヌクレオチド（５'ＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣ
ＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣ３’
（配列番号：２７））をプライマーとして用いてＰＣＲ
反応を行い、ＴＬ４の細胞外領域に相当する８４残基目
のイソロイシンから２４０残基目のバリンをコードする
可溶型ＴＬ４の増幅ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ反応はＤ
ＮＡサーマルサイクラー９６００を使用し、９４℃で１
分間処理した後、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用い
て９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１分間
のサイクルを２５回繰り返した。このようにして得られ
た増幅断片は制限酵素EcoRI及びXbaＩで処理した。また
ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧプラスミドを同じく制限酵素EcoRI
及びXbaＩで処理して、プレプロトリプシンのシグナル
配列並びにタグとして精製・検出を容易にする目的で付
加されたＦＬＡＧタンパク質を各々コードするＤＮＡ断
片を取得した。該プレプロトリプシン-ＦＬＡＧタンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片の３'末端側に制限酵素処
理を行った可溶型ＴＬ４の増幅ＤＮＡ断片を連結した。
得られた該プレプロトリプシン-ＦＬＡＧタンパク質-可
溶型ヒトＴＬ４タンパク質をコードするＤＮＡ断片を制
限酵素SacＩ及びＸｂａＩで処理し、同じく制限酵素Sac
Ｉ及びＸｂａＩで処理した昆虫細胞発現用ベクターpFAS
T Bac1（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬライフテック社）に挿入
した。得られたＴＬ４発現プラスミドpFAST Bac1/shTL
4は、昆虫細胞においてプレプロトリプシンを利用して
細胞培養上清中に分泌され、かつＦＬＡＧタグが付加さ
れた融合タンパク質として産生されることが期待され
た。以後の操作については、Bac-to-Bac Baculovirus
Expression Systems（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬライフテッ
ク社）を用い、実験方法については添付のプロトコール
に従った。すなわち、得られたヒトＴＬ４タンパク質を
コードするＤＮＡを挿入した組換えプラスミドpFAST B
ac1/shTL4を添付の大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃに導入し形質
転換菌を得た後、その菌体より組換えバックミドを回収
した。得られた組換えバックミドは添付のセルフェクチ
ン試薬を用いてＳｆ９昆虫細胞へ形質導入し、組換えバ
キュロウイルスを得た。これをＳｆ９昆虫細胞へ再度感
染させた後、４日ないし５日間培養を行い、培養上清中
に分泌されたＦＬＡＧヒトＴＬ４融合タンパク質を抗Ｆ
ＬＡＧ抗体カラムを用いて精製し、shTL4と名づけた。

【００７５】参考例７ ヒト肝臓由来の新規Ｆａｓリガ
ンド様可溶型タンパク質をコードするｃＤＮＡのクロー
ニングと塩基配列の決定 ヒト肝臓ｃＤＮＡを鋳型とし、２個のプライマー、プラ
イマー１(配列番号：２８)及びプライマー２(配列番
号：２９)を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応におけ
る反応液の組成は上記ｃＤＮＡ、33.5ngを鋳型として使
用し、Advantage2 Polymerase Mix(CLONTECH社)1/50
量、プライマー１(配列番号：２８)及びプライマー２
(配列番号：２９)を各々20μM、dNTPs 2.5mM、及び酵素
に添付のバッファーを1/10を加え、総50μlの液量とし
た。ＰＣＲ反応は95℃・30秒の後95℃・10秒、58℃
・10秒、72℃・45秒のサイクルを30回最後に72℃・2
分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産物は、
723塩基と615塩基の二つの産物を有するが、615塩基対
の反応産物をゲルから回収し、QIAquick Gel Extractio
n Kit(QIAGEN社)の方法に従い、精製を行った。精製産
物をＴＡクローニングキット(Invitrogen社)の処方に従
い、プラスミドベクターpCR2.1-TOPO vectorへサブクロ
ーニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、目的の
ｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天
培地中で選択した後、個々のクローンの配列を解析した
結果、新規Ｆａｓリガンド様可溶型タンパク質をコード
する６１２塩基対のｃＤＮＡ配列(配列番号：３０)を得
た。このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列(配列
番号：３１)を有する新規Ｆａｓリガンド様可溶型タン
パク質をｈＴＬ４−２と命名した。

【００７６】参考例８ 昆虫細胞発現系を用いた可溶型
マウスＴＬ４の生産 マウスＴＬ４タンパク質（配列番号：２）をコードする
ＤＮＡを挿入したプラスミドpTB1958を鋳型にして、
５’末端部分に制限酵素EcoRIの切断部位を付加した合
成オリゴヌクレオチド（5'-GTAGAATTCGGCCAACCCAGCAGCA
CATCTTAC-3'（配列番号:３３））と３’末端部にXbaIの
制限酵素部位を付加した合成オリゴヌクレオチド（5'-A
AATCTAGATATTGCTGGGTTTGAGGTGAGTCC-3'（配列番号:３
４））をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、Ｔ
Ｌ４の細胞外領域に相当する90残基目のアラニンから23
9残基目のバリンをコードする可溶型ＴＬ４の増幅ＤＮ
Ａ断片を得た。ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマルサイクラー
９６００を使用し、９４℃で１分間処理した後、ＥｘＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて９８℃で１０秒間、60
℃で５秒間、７２℃で１.5分間のサイクルを２５回繰り
返した。このようにして得られた増幅断片は制限酵素Ec
oRI及びXbaＩで処理した。またｐＣＭＶ−ＦＬＡＧプラ
スミドを同じく制限酵素EcoRI及びXbaＩで処理して、プ
レプロトリプシンのシグナル配列並びにタグとして精製
・検出を容易にする目的で付加されたＦＬＡＧタンパク
質を各々コードするＤＮＡ断片を取得した。該プレプロ
トリプシン-ＦＬＡＧタンパク質をコードするＤＮＡ断
片の３'末端側に制限酵素処理を行った可溶型ＴＬ４の
増幅ＤＮＡ断片を連結した。得られた該プレプロトリプ
シン-ＦＬＡＧタンパク質-可溶型マウスＴＬ４タンパク
質をコードするＤＮＡ断片を制限酵素SacＩ及びＸｂａ
Ｉで処理し、同じく制限酵素SacＩ及びＸｂａＩで処理
した昆虫細胞発現用ベクターpFAST Bac1（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬライフテック社）に挿入した。得られたＴＬ４
発現プラスミドpFAST Bac1/smTL4は、昆虫細胞におい
てプレプロトリプシンを利用して細胞培養上清中に分泌
され、かつＦＬＡＧタグが付加された融合タンパク質と
して産生されることが期待された。以後の操作について
は、Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬライフテック社）を用い、実験方
法については添付のプロトコールに従った。すなわち、
得られたマウスＴＬ４タンパク質をコードするＤＮＡを
挿入した組換えプラスミドpFAST Bac1/smTL4を添付の
大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃに導入し形質転換菌を得た後、そ
の菌体より組換えバックミドを回収した。得られた組換
えバックミドは添付のセルフェクチン試薬を用いてＳｆ
９昆虫細胞へ形質導入し、組換えバキュロウイルスを得
た。これを1.5x10⁶/mlに調製したＳｆ９昆虫細胞へ総体
積の1/20量を再度感染させた後、２日間培養を行い、培
養上清中に分泌されたＦＬＡＧマウスＴＬ４融合タンパ
ク質を回収した。これをＵＦ膜（MWCO 3000 0.1平方メ
ートル）で濃縮し、ＴＢＳ（50mM Tris-HCl,150mM NaCl
pH7.4）に置換した。抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体カラムを用
いて精製し、溶出液をSephadex G-25カラムで精製後、
再度抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体カラムを用いて精製し、各画
分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認後、純度の高い画分をまと
めて回収した。これをCentriplus 10Kで濃縮し、Sephad
ex G-25カラムで精製後ＰＢＳに置換した。得られたＦ
ＬＡＧマウスＴＬ４融合タンパク質をｓｍＴＬ４と名づ
けた。

【００７７】実施例１ ＴＬ４によるカスパーゼ３のプ
ロセッシングの抑制 Ｉ型コラーゲンコート２２５ｃｍ²培養フラスコ（ＩＷ
ＡＫＩ）を用いて、ハムＦ−１２培地とライホビッツＬ
−１５培地（GIBCO社）を当量混合した基礎培地に、各
最終濃度1% BSA、5mMグルコース（WAKO社）、10^-8Mデキ
サメタゾン（WAKO社）、10^-8Mウシインスリン（GIBCO
社）となるように添加した基本培地に、正常ヒト肝実質
細胞（Cell System社 ＃3716）を５０００個/well/100m
lで懸濁し、CO₂インキュベーターで２４時間培養した。
その後、基本培地に最終濃度１％となるよう新生仔牛血
清（ＧＩＢＣＯ社）を添加した培地に置換し、1.33mMの
アクチノマイシンＤ（WAKO社）と最終濃度が１００ng/m
lになるようにヒトＴＮＦα（Genzyme社）を添加してア
ポトーシス誘導を行った。参考例７で得られたhTL4-2を
最終濃度100ng/mlでアポトーシス誘導刺激６時間前に添
加することにより行った。アポトーシス誘導４時間、１
４時間後にスクレーパーで細胞を回収し、タンパク抽出
まで−８０℃で保存した。タンパク抽出は以下のように
行った。すなわち、−８０℃保存してあった細胞に０．
５ｍｌの細胞融解液（50mM TrisHCl(pH8.0), 1mM EDTA,
150mM NaCl, 1% NP-40, 100μM APMSF（(p-Amidinophe
nyl) Methanesulfonyl Fluoride Hydrochloride）, 1μ
g/mlAprotinin, 5μg/ml Leupeptin, 1μg/ml Pepstati
nA, 50μg/ml Antipain）を添加し、懸濁後、15000rpm
で10分間遠心した後、上清を回収しこれを細胞抽出液と
した。各細胞抽出液のタンパク定量をプロテインアッセ
イキット（バイオラッド社）で行い、タンパク量２０か
ら８０μg/laneでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、
0.8mA/cm²で２時間イモビロン−Ｐメンブレンへトラン
スファーを行った。次にブロックエース（大日本製薬）
中にて４℃で一晩ブロッキングを行った。ブロッキング
後、メンブレンを２５％ブロックエースで１／１０００
希釈した抗カスパーゼ３抗体（ファーミンジェン社：６
５９０６Ｅ）と３０分間室温で反応させた。最終濃度
０．０５％ Tween20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でメン
ブレンを３回洗浄後、１／５０００希釈したＨＲＰ標識
抗ウサギＩｇ抗体（サンタクルズ社：sc-2004）と３０
分間室温で反応させた後ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＥＣ
Ｌplus（アマシャム社）で前駆体カスパーゼ３、および
成熟カスパーゼ３のバンドを検出した。対照として抗ア
クチン抗体（サンタクルズ社：sc-1616）、２次抗体と
してＨＲＰ標識抗ヤギ抗体Ｉｇ抗体（サンタクルズ社：
sc-2020）を用いた。得られた結果を図１および図２に
示す。図１に示すように、アポトーシス刺激４時間後に
おいて、ｈＴＬ４−２前処理サンプル中の成熟カスパー
ゼ３量が非処理のそれと比較して低下していた。また、
刺激１４時間後においては、成熟カスパーゼ３量は両者
においてほぼ同量であったが、ｈＴＬ４−２前処理サン
プル中の前駆体カスパーゼ３量は非刺激サンプルと同程
度含まれていた。一方、非処理サンプル中の前駆体カス
パーゼ３量は、非刺激サンプルのそれと比較して明らか
に低下していた。従ってＴＮＦαによりカスパーゼ３の
プロセッシングはｈＴＬ４−２前処理によって抑制でき
ることが示された。カスパーゼ３のプロセッシングはカ
スパーゼ３の活性化に必須であることから、ｈＴＬ４−
２はカスパーゼ３の活性化を抑制することが示唆され
た。このことから、ｈＴＬ４−２はＴＮＦαによるアポ
トーシスを抑制するのみならず、カスパーゼ３が中心と
なって関与するアポトーシスを伴う疾患を改善すること
が期待できる。

【００７８】実施例２ ＴＬ４によるカスパーゼ３また
はカスパーゼ８活性化の抑制 実施例１の結果より、ｈＴＬ４−２はＴＮＦαによるカ
スパーゼ３のプロセッシングを抑制することが明らかと
なった。カスパーゼはプロセッシングを受けることで活
性化することが知られている。この時のカスパーゼ３ま
たはカスパーゼ８の活性化状態を酵素活性を指標に検討
した。すなわち、実施例１で得た細胞抽出液を用い、Ａ
ｐｏＡｌｅｒｔ ｃａｓｐａｓｅ３ ａｓｓａｙ ｋｉ
ｔ、あるいはＡｐｏＡｌｅｒｔ ｃａｓｐａｓｅ８ ａ
ｓｓａｙ ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を利用し、細
胞抽出液中の各酵素活性を測定した。得られた結果を図
３および図４に示した。ＴＮＦα添加により抽出液中の
カスパーゼ３またはカスパーゼ８の酵素活性が上昇した
が、ｈＴＬ４−２前処理によってその活性上昇は抑制さ
れた。また、酵素反応処理の際、各カスパーゼ阻害剤を
添加した場合、酵素活性はバックグラウンドまで低下し
た。以上のことからＴＮＦαにより特異的にカスパーゼ
３またはカスパーゼ８の活性化が起こるが、ｈＴＬ４−
４はそれを抑制することが明らかとなった。このことか
らＴＬ４はカスパーゼ３のみならずカスパーゼ８の活性
化により誘導される細胞死を抑制することが分かった。

【００７９】実施例３ ＴＬ４によるＮｕｃｌｅｏｆａ
ｃｔｏｒ−ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）の活性化 細胞死を抑制する刺激のいくつかはＮＦ−ｋＢを活性化
することが知られている。そこで、実施例１に従ってＮ
Ｆ−ｋＢの活性化が起きるか否かをＭｅｒｃｕｒｙ Ｐ
ａｔｈｗａｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて検討した。すなわち、実施
例１で用いたヒト正常肝実質細胞用いた１０％ＦＣＳを
含む基本培地で懸濁し、Ｉ型コラーゲンコート２４穴プ
レート（ＦＡＬＣＯＮ社）に２ｘ１０⁴／ｗｅｌｌ／ｍ
ｌとなるように播種した。１晩培養後、９８．５μｌの
ＤＭＥＭと１．５μｌのＦｕｇｅｎｅ６（ベーリンガー
社）と１μｌの各プラスミド（ｐＮＦ−ｋＢ−ＳＥＡ
Ｐ、ｐＴＡＬ−ＳＥＡＰ（陰性対照）、ｐＳＥＡＰ２−
ｃｏｎｔｒｏｌ（陽性対照））を混合後５００μｌの１
０％ＦＣＳ含ＤＭＥＭと混合し、各ウェルに添加した。
１晩培養後、細胞を１％ＮＢＣＳ含基本培地で２回洗浄
した。最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるようｈＴＬ４−
２またはＴＮＦα、５００ｎｇ／ｍｌとなるよう抗Ｆａ
ｓ抗体を培地で調整し、それを６００μｌ各ウェルに添
加した。添加後１，２，３，４，５，６，８，２４時間
後に５０μｌずつ分取し、培養液中のＳＥＡＰ活性測定
まで−２０度で保存した。ＳＥＡＰ活性測定はＧｒｅａ
ｔ ＥｓｃＡＰｅ ＳＥＡＰ ＲｅｐｏｒｔｅｒＳｙｓ
ｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて測定した。結果
を図５に示した。ｈＴＬ４−２またはＴＮＦαを添加し
た場合、経時的に培養上清中のＳＥＡＰ活性は上昇し
た。一方、抗Ｆａｓ抗体を添加した場合、活性上昇は観
察されなかった。すなわち、ｈＴＬ４−２およびＴＮＦ
αによりヒト正常肝実質細胞のＮＦ−ｋＢの転写活性能
が上昇することが明らかとなった。このことから、ＴＬ
４により、ＮＦ−ｋＢが制御する細胞死抑制因子または
生存因子の発現上昇が促進されることが分かった。

【００８０】

【発明の効果】本発明のタンパク質、その部分ペプチド
またはそれらの塩は、カスパーゼ３阻害作用を有してお
り、例えば、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソ
ン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、
骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心筋虚
血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または先天
性・後天性酵素障害などの予防および／または治療剤な
どの医薬として有用である。

【００８１】

【配列表】 Sequence Listing <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Caspase 3 Inhibitor <130> P02-0017 <150> JP 2001-49453 <151> 2001-02-23 <160> 34 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser 20 25 30 Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg 50 55 60 Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr 115 120 125 His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr 130 135 140 Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser 145 150 155 160 Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser 180 185 190 Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His 195 200 205 Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu 210 215 220 Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 225 230 235 240 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Murine <400> 2 Met Glu Ser Val Val Gln Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln Thr 1 5 10 15 Asp Ile Pro Phe Arg Arg Leu Glu Gln Asn His Arg Arg Arg Arg Cys 20 25 30 Gly Thr Val Gln Val Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Thr Gln Gly Trp Phe Leu Leu Arg Leu His Gln Arg Leu Gly 50 55 60 Asp Ile Val Ala His Leu Pro Asp Gly Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys 65 70 75 80 Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser His Gln Ala Asn Pro Ala Ala His Leu 85 90 95 Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp 100 105 110 Glu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp 115 120 125 Gly Ala Leu Val Thr Met Glu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys 130 135 140 Val Gln Leu Ser Gly Val Gly Cys Pro Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu 145 150 155 160 Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg Arg Ser Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser 180 185 190 Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu 195 200 205 Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Pro Gly Asn Arg Leu Val 210 215 220 Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 225 230 235 <210> 3 <211> 239 <212> PRT <213> Rat <400> 3 Met Glu Ser Val Val Gln Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln Thr 1 5 10 15 Asp Ile Pro Phe Arg Arg Leu Gly Gln Asn His Arg Arg Arg His Cys 20 25 30 Gly Thr Val Gln Val Ser Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly 35 40 45 Leu Ala Thr Glu Gly Trp Phe Leu Leu Arg Leu His Gln Arg Leu Gly 50 55 60 Asp Ile Val Ala His Leu Pro Asp Gly Gly Lys Gly Ser Trp Glu Lys 65 70 75 80 Leu Ile Gln Asp Gln Arg Ser His Gln Pro Asn Pro Ala Ala His Leu 85 90 95 Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu Leu Trp 100 105 110 Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Thr Tyr His Asp 115 120 125 Gly Ala Leu Val Thr Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ser Lys 130 135 140 Val Gln Leu Ser Gly Val Gly Cys Pro Gln Gly Leu Ala Asn Gly Leu 145 150 155 160 Pro Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Ser Arg Tyr Pro Lys Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Val Ser Arg Arg Ser Pro Cys Gly Arg Ala Asn Ser 180 185 190 Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu 195 200 205 Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Pro Gly Asn Arg Leu Val 210 215 220 Arg Pro Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Ile 225 230 235 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Human <400> 4 atggaggaga gtgtcgtacg gccctcagtg tttgtggtgg atggacagac cgacatccca 60 ttcacgaggc tgggacgaag ccaccggaga cagtcgtgca gtgtggcccg ggtgggtctg 120 ggtctcttgc tgttgctgat gggggctggg ctggccgtcc aaggctggtt cctcctgcag 180 ctgcactggc gtctaggaga gatggtcacc cgcctgcctg acggacctgc aggctcctgg 240 gagcagctga tacaagagcg aaggtctcac gaggtcaacc cagcagcgca tctcacaggg 300 gccaactcca gcttgaccgg cagcgggggg ccgctgttat gggagactca gctgggcctg 360 gccttcctga ggggcctcag ctaccacgat ggggcccttg tggtcaccaa agctggctac 420 tactacatct actccaaggt gcagctgggc ggtgtgggct gcccgctggg cctggccagc 480 accatcaccc acggcctcta caagcgcaca ccccgctacc ccgaggagct ggagctgttg 540 gtcagccagc agtcaccctg cggacgggcc accagcagct cccgggtctg gtgggacagc 600 agcttcctgg gtggtgtggt acacctggag gctggggaga aggtggtcgt ccgtgtgctg 660 gatgaacgcc tggttcgact gcgtgatggt acccggtctt acttcggggc tttcatggtg 720 <210> 5 <211> 1491 <212> DNA <213> Human <400> 5 cgagactcca tctcaaaaac aaaacaaata aacgaacaaa aaaacccaca acgtattatt 60 ttcttgttta cgaggtttct tgtctctctg gctccaccag aagaggagca gggacccttc 120 ttgctgttgt tcattgctgc atcccccaca ccgagagcag agcctggcat gggcagaaag 180 tcctcagtcg atatttggtg gccccaagcg aatgaagcat ccaagaaggg aaagctgggg 240 gctccccact gcacttgcca cctgagtcac attttcagaa gcctctggaa agtcgtgcac 300 agcccaggag tgttgagcaa tttcggtttc ctctgaggtt gaaggaccca ggcgtgtcag 360 ccctgctcca gacaccttgg gcatggagga gagtgtcgta cggccctcag tgtttgtggt 420 ggatggacag accgacatcc cattcacgag gctgggacga agccaccgga gacagtcgtg 480 cagtgtggcc cgggtgggtc tgggtctctt gctgttgctg atgggggctg ggctggccgt 540 ccaaggctgg ttcctcctgc agctgcactg gcgtctagga gagatggtca cccgcctgcc 600 tgacggacct gcaggctcct gggagcagct gatacaagag cgaaggtctc acgaggtcaa 660 cccagcagcg catctcacag gggccaactc cagcttgacc ggcagcgggg ggccgctgtt 720 atgggagact cagctgggcc tggccttcct gaggggcctc agctaccacg atggggccct 780 tgtggtcacc aaagctggct actactacat ctactccaag gtgcagctgg gcggtgtggg 840 ctgcccgctg ggcctggcca gcaccatcac ccacggcctc tacaagcgca caccccgcta 900 ccccgaggag ctggagctgt tggtcagcca gcagtcaccc tgcggacggg ccaccagcag 960 ctcccgggtc tggtgggaca gcagcttcct gggtggtgtg gtacacctgg aggctgggga 1020 gaaggtggtc gtccgtgtgc tggatgaacg cctggttcga ctgcgtgatg gtacccggtc 1080 ttacttcggg gctttcatgg tgtgaaggaa ggagcgtggt gcattggaca tgggtctgac 1140 acgtggagaa ctcagagggt gcctcagggg aaagaaaact cacgaagcag aggctgggcg 1200 tggtggctct cgcctgtaat cccagcactt tgggaggcca aggcaggcgg atcacctgag 1260 gtcaggagtt cgagaccagc ctggctaaca tggcaaaacc ccatctctac taaaaataca 1320 aaaattagcc ggacgtggtg gtgcctgcct gtaatccagc tactcaggag gctgaggcag 1380 gataattttg cttaaacccg ggaggcggag gttgcagtga gccgagatca caccactgca 1440 ctccaacctg ggaaacgcag tgagactgtg cctcaaaaaa aaaaaaaaaa a 1491 <210> 6 <211> 1353 <212> DNA <213> Human <400> 6 cccacgcgtc cgcccacgcg tccgctgagg ttgaaggacc caggcgtgtc agccctgctc 60 cagacacctt gggcatggag gagagtgtcg tacggccctc agtgtttgtg gtggatggac 120 agaccgacat cccattcacg aggctgggac gaagccaccg gagacagtcg tgcagtgtgg 180 cccgggtggg tctgggtctc ttgctgttgc tgatgggggc tgggctggcc gtccaaggct 240 ggttcctcct gcagctgcac tggcgtctag gagagatggt cacccgcctg cctgacggac 300 ctgcaggctc ctgggagcag ctgatacaag agcgaaggtc tcacgaggtc aacccagcag 360 cgcatctcac aggggccaac tccagcttga ccggcagcgg ggggccgctg ttatgggaga 420 ctcagctggg cctggccttc ctgaggggcc tcagctacca cgatggggcc cttgtggtca 480 ccaaagctgg ctactactac atctactcca aggtgcagct gggcggtgtg ggctgcccgc 540 tgggcctggc cagcaccatc acccacggcc tctacaagcg cacaccccgc taccccgagg 600 agctggagct gttggtcagc cagcagtcac cctgcggacg ggccaccagc agctcccggg 660 tctggtggga cagcagcttc ctgggtggtg tggtacacct ggaggctggg gagaaggtgg 720 tcgtccgtgt gctggatgaa cgcctggttc gactgcgtga tggtacccgg tcttacttcg 780 gggctttcat ggtgtgaagg aaggagcgtg gtgcattgga catgggtctg acacgtggag 840 aactcagagg gtgcctcagg ggaaagaaaa ctcacgaagc agaggctggg attacaggcg 900 tgagccactg ttcccagcag gaatttcttt tttatagtat tggataaagt ttggtgtttt 960 tacagaggag aagcaatggg tcttagctct ttctctatta tgttatcatc ctcccttttt 1020 tgtacaatat gttgtttacc tgaaaggaag gtttctattc gttggttgtg gacctggaca 1080 aagtccaagt ctgtggaact taaaaccttg aaggtctgtc ataggactct ggacaatctc 1140 acaccttagc tattcccagg gaaccccagg gggcaactga cattgctcca agatgttctc 1200 ctgatgtagc ttgagatata aaggaaaggc cctgcacagg tggctgtttc ttgtctgtta 1260 tgtcagagga acagtcctgt tcagaaaggg gctcttctga gcagaaatgg ctaataaact 1320 ttgtgctgat 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Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro 165 170 175 Glu Xaa Leu Glu Leu Leu Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala 180 185 190 Xaa Xaa Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val 195 200 205 Val His Leu Glu Ala Gly Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Arg Leu Val Arg Xaa Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe 225 230 235 240 Met Val <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 26 gaattcgata caagagcgaa ggtctcacga ggtc 34 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 27 aaatctagat ccttccttca caccatgaaa gcccc 35 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 28 aggaattcat ggaggagagt gtcgtacggc cctcag 36 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 29 agctcgagct ccttccttca caccatgaaa gcccc 35 <210> 30 <211> 612 <212> DNA <213> Human <400> 30 atggaggaga gtgtcgtacg gccctcagtg tttgtggtgg atggacagac cgacatccca 60 ttcacgaggc tgggacgaag ccaccggaga cagtcgtgca gtgtggcccg ggacggacct 120 gcaggctcct gggagcagct gatacaagag cgaaggtctc acgaggtcaa cccagcagcg 180 catctcacag gggccaactc cagcttgacc ggcagcgggg ggccgttgtt atgggagact 240 cagctgggcc tggccttcct gaggggcctc agctaccatg atggggccct tgtggtcacc 300 aaagctggct actactacat ctactccaag gtgcagctgg gcggtgtggg ctgcccgctg 360 ggcctggcca gcaccatcac ccacggcctc tacaagcgca caccccgcta ccccgaggag 420 ctggagctgt tggtcagcca gcagtcaccc tgcggacggg ccaccagcag ctcccgggtc 480 tggtgggaca gcagcttcct gggtggtgtg gtacacctgg aggctgggga gaaggtggtc 540 gtccgtgtgc tggatgaacg cctggttcga ctgcgtgatg gtacccggtc ttacttcggg 600 gctttcatgg tg 612 <210> 31 <211> 204 <212> PRT <213> Human <400> 31 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser 20 25 30 Cys Ser Val Ala Arg Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile 35 40 45 Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 50 55 60 Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 65 70 75 80 Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala 85 90 95 Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln 100 105 110 Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His 115 120 125 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu 130 135 140 Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val 145 150 155 160 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 165 170 175 Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg 180 185 190 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 195 200 <210> 32 <211> 204 <212> PRT <213> Human <220> <221> VARIANT <222> <223> <400> 32 Met Glu Xaa Ser Val Val Xaa Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Xaa Arg Leu Xaa Xaa Xaa His Arg Arg Xaa Xaa 20 25 30 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Gly Xaa Xaa Gly Ser Trp Glu Xaa Leu Ile 35 40 45 Gln Xaa Xaa Arg Ser His Xaa Xaa Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly 50 55 60 Ala Asn Xaa Ser Leu Xaa Gly Xaa Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr 65 70 75 80 Xaa Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Xaa Tyr His Asp Gly Ala 85 90 95 Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Ser Lys Val Gln 100 105 110 Leu Xaa Gly Val Gly Cys Pro Xaa Gly Leu Ala Xaa Xaa Ile Thr His 115 120 125 Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Xaa Arg Tyr Pro Glu Xaa Leu Glu Leu Leu 130 135 140 Val Ser Xaa Xaa Ser Pro Cys Gly Arg Ala Xaa Xaa Ser Ser Arg Val 145 150 155 160 Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly 165 170 175 Glu Xaa Val Val Val Arg Val Xaa Xaa Xaa Arg Leu Val Arg Xaa Arg 180 185 190 Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 195 200 204 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 gtagaattcg gccaacccag cagcacatct tac 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 aaatctagat attgctgggt ttgaggtgag tcc 33

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で確認された本発明のタンパク質の
カスパーゼ３阻害作用の結果を示す。図中、レーン１は
非刺激、レーン２は刺激４時間後、前処理なし、レーン
３は刺激４時間後、本発明のタンパク質前処理、レーン
４は刺激１４時間後、前処理なし、レーン５は刺激１４
時間後、本発明のタンパク質前処理の各サンプルを示
す。また、Ａは前駆体カスパーゼ３のバンドを、Ｂは成
熟カスパーゼ３のバンドを示す。

【図２】 実施例１で抗アクチン抗体を用いた対照実験
の結果を示す。図中、レーン１は非刺激、レーン２は刺
激４時間後、前処理なし、レーン３は刺激４時間後、本
発明のタンパク質前処理、レーン４は刺激１４時間後、
前処理なし、レーン５は刺激１４時間後、本発明のタン
パク質前処理の各サンプルを示す。また、Ａはアクチン
のバンドを示す。

【図３】 アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）とＴＮＦα
により活性化されたカスパーゼ３に対するＴＬ４の抑制
活性を調べた結果を示す。横軸は無添加の場合、Ａｃｔ
ＤはアクチノマイシンＤを添加した場合、ＴＮＦαはＴ
ＮＦαを添加した場合、Ａｃｔ＋ＴＮＦαはＡｃｔＤお
よびＴＮＦαを添加した場合、Ａｃｔ＋ＴＮＦα＋ＴＬ
４はＡｃｔＤ、ＴＮＦαおよびｈＴＬ４−２を添加した
場合を示す。縦軸はカスパーゼ３活性の値を示す。

【図４】 ＡｃｔＤとＴＮＦαにより活性化されたカス
パーゼ８に対するＴＬ４の抑制活性を調べた結果を示
す。横軸は無添加の場合、ＡｃｔＤはアクチノマイシン
Ｄを添加した場合、ＴＮＦαはＴＮＦαを添加した場
合、Ａｃｔ＋ＴＮＦαはＡｃｔＤおよびＴＮＦαを添加
した場合、Ａｃｔ＋ＴＮＦα＋ＴＬ４はＡｃｔＤ、ＴＮ
ＦαおよびｈＴＬ４−２を添加した場合を示す。縦軸は
カスパーゼ８活性の値を示す。

【図５】 肝実質細胞におけるＴＬ４によるＮＦ−ｋＢ
活性化を調べた結果を示す。−○−は無添加の場合、−
△−はＴＬ４（ｈＴＬ４−２）を添加した場合、−□−
はＴＮＦａはＴＮＦαを添加した場合、−◇−はＦａｓ
を添加した場合を示す。縦軸はＮＦ−ｋＢ活性の値を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 9/10 9/04 21/04 9/10 25/00 21/04 25/16 25/00 25/28 25/16 27/02 25/28 31/18 27/02 37/06 31/18 43/00 １０５ 37/06 １１１ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 9/99 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 引地 由紀子 茨城県つくば市松代４丁目21番地２ シャ レールつくば松代１号棟504号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA12 HA17 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ02 QQ42 QR32 QR38 QR55 QR82 QS25 QS34 QS39 QX02 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 CA17 CA18 DC01 DC02 DC32 NA14 ZA011 ZA021 ZA161 ZA331 ZA361 ZA401 ZA551 ZA941 ZB081 4C086 AA01 AA02 AA04 EA16 NA14 ZA01 ZA02 ZA16 ZA33 ZA36 ZA40 ZA55 ZA94 ZB08

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
   号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
   と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
   タンパク質またはその塩を含有してなるカスパーゼ３阻
   害剤。
2. 【請求項２】 配列番号：１、配列番号：２または配列
   番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
   ミノ酸配列が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
   の第８〜２１番目、第５４〜５９番目、第９３〜１０２
   番目、第１０９〜１１６番目、第１１８〜１２６番目、
   第１２８〜１３４番目、第１４４〜１４９番目、第１６
   ２〜１７０番目、第１７６〜１８２番目、第１８４〜１
   ８９番目、第１９３〜２１３番目、第２１５〜２１９番
   目および第２２８〜２４０番目のアミノ酸配列を有する
   アミノ酸配列である請求項１記載の剤。
3. 【請求項３】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
   号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
   と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
   タンパク質の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる
   カスパーゼ３阻害剤。
4. 【請求項４】 該部分ペプチドが配列番号：１で表され
   るアミノ酸配列の第８４〜２４０番目のアミノ酸配列を
   有するアミノ酸配列からなるペプチドである請求項３記
   載の剤。
5. 【請求項５】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
   号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
   と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
   タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ
   を含有するＤＮＡを含有してなるカスパーゼ３阻害剤。
6. 【請求項６】 ＤＮＡが配列番号：４から配列番号：１
   ０のいずれかの配列番号または配列番号：３０で表わさ
   れる塩基配列を含有するＤＮＡである請求項５記載の
   剤。
7. 【請求項７】 ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキン
   ソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変
   性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心
   筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または
   先天性・後天性酵素障害の予防・治療剤である請求項
   １、請求項３または請求項５記載の剤。
8. 【請求項８】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
   号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
   と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
   タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗
   体を含有してなるＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキ
   ンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変
   性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心
   筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または
   先天性・後天性酵素障害の診断剤。
9. 【請求項９】 配列番号：１、配列番号：２、配列番
   号：３または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列
   と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
   タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ
   を含有するＤＮＡを含有してなるＡＩＤＳ、アルツハイ
   マー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性
   網膜炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄
   芽球性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片
   対宿主病または先天性・後天性酵素障害の診断剤。
10. 【請求項１０】 哺乳動物に対して、配列番号：１、配
    列番号：２、配列番号：３または配列番号：３１で表わ
    されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
    ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の有効量を
    投与することを特徴とするカズパーゼ３阻害方法。
11. 【請求項１１】 哺乳動物に対して、配列番号：１、配
    列番号：２、配列番号：３または配列番号：３１で表わ
    されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
    ノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の有効量を
    投与することを特徴とするＡＩＤＳ、アルツハイマー
    病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜
    炎、小脳変性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球
    性貧血、心筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿
    主病または先天性・後天性酵素障害の予防・治療方法。
12. 【請求項１２】 哺乳動物に対して、配列番号：１、配
    列番号：２、配列番号：３または配列番号：３１で表わ
    されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
    ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド
    をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの有効量を投与す
    ることを特徴とするカスパーゼ３阻害方法。
13. 【請求項１３】 哺乳動物に対して、配列番号：１、配
    列番号：２、配列番号：３または配列番号：３１で表わ
    されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
    ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド
    をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの有効量を投与す
    ることを特徴とするＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パー
    キンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳
    変性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、
    心筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病また
    は先天性・後天性酵素障害の予防・治療方法。
14. 【請求項１４】 カスパーゼ３阻害剤を製造するための
    配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列
    番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実
    質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または
    その塩の使用。
15. 【請求項１５】 ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキ
    ンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変
    性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心
    筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または
    先天性・後天性酵素障害の予防・治療剤を製造するため
    の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配
    列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
    はその塩の使用。
16. 【請求項１６】 カスパーゼ３阻害剤を製造するための
    配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列
    番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実
    質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または
    その部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ
    の使用。
17. 【請求項１７】 ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキ
    ンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変
    性、骨髄異形成症、再生不良性貧血、鉄芽球性貧血、心
    筋虚血、伝導障害、慢性心不全、移植片対宿主病または
    先天性・後天性酵素障害の予防・治療剤を製造するため
    の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配
    列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは
    実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
    はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
    Ａの使用。