JP2002047203A - 肺高血圧症予防・治療剤 - Google Patents
肺高血圧症予防・治療剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】新規肺高血圧症予防・治療剤の提供。
【解決手段】ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインもしくは
その塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする
塩基配列を有するＤＮＡまたはＭＣＰ−１に対する中和
抗体を含有してなる肺高血圧症予防・治療剤などの提
供。 【効果】ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインもしくはその
塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする塩基
配列を有するＤＮＡまたはＭＣＰ−１に対する中和抗体
は、血圧低下作用などを有しており、肺高血圧症（特
に、原発性肺高血圧症）の予防・治療剤として有用であ
る。
その塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする
塩基配列を有するＤＮＡまたはＭＣＰ−１に対する中和
抗体を含有してなる肺高血圧症予防・治療剤などの提
供。 【効果】ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインもしくはその
塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする塩基
配列を有するＤＮＡまたはＭＣＰ−１に対する中和抗体
は、血圧低下作用などを有しており、肺高血圧症（特
に、原発性肺高血圧症）の予防・治療剤として有用であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な肺高血圧予
防・治療剤などに関する。
防・治療剤などに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＭＣＰ−１（Monocyte chemoattractant
protein-1：マクロファージ走化性因子）はC-Cケモカ
インファミリーに属し、動脈硬化症（アテローム性動脈
硬化症など）の病変部に多く発現していることが知られ
ている（Takeya, M. et.al., Hum. Pathol. 24:534-539
(1993)；Yla-Herttuala, S. et.al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 88:5252-5257 (1991)）。一方、原発性肺
高血圧症（primary pulmonary hypertension：PH）は予
後不良の疾患であり、現在のところ、心肺移植が唯一の
効果的な治療方法である。しかし、心肺移植療法はドナ
ーが少なく現実的は治療方法としてはかなり問題があ
る。
protein-1：マクロファージ走化性因子）はC-Cケモカ
インファミリーに属し、動脈硬化症（アテローム性動脈
硬化症など）の病変部に多く発現していることが知られ
ている（Takeya, M. et.al., Hum. Pathol. 24:534-539
(1993)；Yla-Herttuala, S. et.al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 88:5252-5257 (1991)）。一方、原発性肺
高血圧症（primary pulmonary hypertension：PH）は予
後不良の疾患であり、現在のところ、心肺移植が唯一の
効果的な治療方法である。しかし、心肺移植療法はドナ
ーが少なく現実的は治療方法としてはかなり問題があ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】かかる状況に鑑み、心
肺移植をすることなく、肺高血圧症（特に原発性肺高血
圧症）を治療することを可能たらしめる肺高血圧症の治
療剤の開発が期待されている。
肺移植をすることなく、肺高血圧症（特に原発性肺高血
圧症）を治療することを可能たらしめる肺高血圧症の治
療剤の開発が期待されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】ＭＣＰ−１（Monocyte c
hemoattractant protein-1：マクロファージ走化性因
子）はC-Cケモカインファミリーに属し、動脈硬化症
（アテローム性動脈硬化症など）の病変部に多く発現し
ていることが知られている（Takeya, M. et.al., Hum.
Pathol. 24:534-539 (1993)；Yla-Herttuala, S. et.a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5252-5257 (199
1)）。一方、原発性肺高血圧症では、その初期に肺小動
脈の炎症（単球／マクロファージを主体として炎症反
応）が生じ、ついで中膜肥厚による肺血管抵抗の増加、
右心室肥大などが起るが、本発明者らは上記ＭＣＰ−１
の作用を抑制する作用を有するＭＣＰ−１の拮抗阻害型
ムテイン等（本明細書において「拮抗阻害型ムテイン」
とは、「ドミナントネガティブムテインまたはミュータ
ント」と同意義に用いられる場合がある）が、予想外に
も原発性肺高血圧症の予防・治療剤として用いられるこ
とを見出した。さらに研究を進めることにより、本発明
を完成するに至った。
hemoattractant protein-1：マクロファージ走化性因
子）はC-Cケモカインファミリーに属し、動脈硬化症
（アテローム性動脈硬化症など）の病変部に多く発現し
ていることが知られている（Takeya, M. et.al., Hum.
Pathol. 24:534-539 (1993)；Yla-Herttuala, S. et.a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5252-5257 (199
1)）。一方、原発性肺高血圧症では、その初期に肺小動
脈の炎症（単球／マクロファージを主体として炎症反
応）が生じ、ついで中膜肥厚による肺血管抵抗の増加、
右心室肥大などが起るが、本発明者らは上記ＭＣＰ−１
の作用を抑制する作用を有するＭＣＰ−１の拮抗阻害型
ムテイン等（本明細書において「拮抗阻害型ムテイン」
とは、「ドミナントネガティブムテインまたはミュータ
ント」と同意義に用いられる場合がある）が、予想外に
も原発性肺高血圧症の予防・治療剤として用いられるこ
とを見出した。さらに研究を進めることにより、本発明
を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、（１）ＭＣＰ−１の
拮抗阻害型ムテインもしくはその塩、ＭＣＰ−１の拮抗
阻害型ムテインをコードする塩基配列を有するＤＮＡま
たはＭＣＰ−１に対する中和抗体を含有してなる肺高血
圧症予防・治療剤、（２）ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテ
インが７ＮＤ−ＭＣＰ−１である上記（１）記載の剤、
（３）肺高血圧症が原発性肺高血圧症である上記（１）
記載の剤、（４）肺高血圧症予防・治療作用を有する医
薬を製造するための上記（１）記載のＭＣＰ−１の拮抗
阻害型ムテインもしくはその塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害
型ムテインをコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは
ＭＣＰ−１に対する中和抗体の使用。（５）上記（１）
記載のＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインもしくはその
塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする塩基
配列を哺乳動物に投与することを特徴とする肺高血圧症
予防・治療方法などに関する。
拮抗阻害型ムテインもしくはその塩、ＭＣＰ−１の拮抗
阻害型ムテインをコードする塩基配列を有するＤＮＡま
たはＭＣＰ−１に対する中和抗体を含有してなる肺高血
圧症予防・治療剤、（２）ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテ
インが７ＮＤ−ＭＣＰ−１である上記（１）記載の剤、
（３）肺高血圧症が原発性肺高血圧症である上記（１）
記載の剤、（４）肺高血圧症予防・治療作用を有する医
薬を製造するための上記（１）記載のＭＣＰ−１の拮抗
阻害型ムテインもしくはその塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害
型ムテインをコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは
ＭＣＰ−１に対する中和抗体の使用。（５）上記（１）
記載のＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインもしくはその
塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする塩基
配列を哺乳動物に投与することを特徴とする肺高血圧症
予防・治療方法などに関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のＭＣＰ−１の拮抗阻害型
ムテイン（以下、単に本発明のムテインと称する場合が
ある）はＭＣＰ−１（Rollins, B.J. Chemokines. Bloo
d. 90:909-928 (1997)）；配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列からなるタンパク質）の有する作用（例えば、
単球／マクロファージ走化（遊走）作用など）を抑制す
る作用を有していれば、いかなるものであってもよい
が、具体的には、（１）ＭＣＰ−1のＮ末端から２〜７
６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、（２）Ｍ
ＣＰ−1のＮ末端から３〜７６番目の部分アミノ酸配列
からなるムテイン、（３）ＭＣＰ−1のＮ末端から４〜
７６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、（４）
ＭＣＰ−1のＮ末端から５〜７６番目の部分アミノ酸配
列からなるムテイン、（５）ＭＣＰ−1のＮ末端から６
〜７６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、
（６）ＭＣＰ−1のＮ末端から７〜７６番目の部分アミ
ノ酸配列からなるムテイン、（７）ＭＣＰ−1のＮ末端
から８〜７６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイ
ン、（８）ＭＣＰ−1のＮ末端から９〜７６番目の部分
アミノ酸配列からなるムテイン、（９）ＭＣＰ−1のＮ
末端から１０〜７６番目の部分アミノ酸配列からなるム
テイン、（１０）ＭＣＰ−1のＮ末端から１１〜７６番
目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、（１１）ＭＣ
Ｐ−１のＮ末端から２〜８番目のアミノ酸残基が欠失し
たアミノ酸配列（配列番号：２）からなるムテイン（本
明細書においては、「７ＮＤ−ＭＣＰ−１」と称す
る）、（１２）ＭＣＰ−１のＮ末端から３番目のＡｓｐ
がＡｌａに置換されたムテイン、（１３）ＭＣＰ−１の
Ｎ末端から２２番目のＶａｌがＡｓｐに置換されたムテ
イン、（１４） ＭＣＰ−１のＮ末端から２４番目のＡ
ｒｇがＬｅｕに置換されたムテインなどがあげられ、特
に、７ＮＤ−ＭＣＰ−１が好ましく用いられる。本発明
のムテインは、例えば、ヒトや温血動物（例えば、モル
モット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒ
ツジ、ウシ、ウマ、サルなど）のあらゆる細胞（例え
ば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など）、またはそれらの細胞が存
在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅
球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下部、大脳
皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、
肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋
肉、肺、消化管（例、大腸、小腸、十二指腸）、血管、
心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵
巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタン
パク質のムテインであってもよく、また合成タンパク質
であってもよい。
ムテイン（以下、単に本発明のムテインと称する場合が
ある）はＭＣＰ−１（Rollins, B.J. Chemokines. Bloo
d. 90:909-928 (1997)）；配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列からなるタンパク質）の有する作用（例えば、
単球／マクロファージ走化（遊走）作用など）を抑制す
る作用を有していれば、いかなるものであってもよい
が、具体的には、（１）ＭＣＰ−1のＮ末端から２〜７
６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、（２）Ｍ
ＣＰ−1のＮ末端から３〜７６番目の部分アミノ酸配列
からなるムテイン、（３）ＭＣＰ−1のＮ末端から４〜
７６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、（４）
ＭＣＰ−1のＮ末端から５〜７６番目の部分アミノ酸配
列からなるムテイン、（５）ＭＣＰ−1のＮ末端から６
〜７６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、
（６）ＭＣＰ−1のＮ末端から７〜７６番目の部分アミ
ノ酸配列からなるムテイン、（７）ＭＣＰ−1のＮ末端
から８〜７６番目の部分アミノ酸配列からなるムテイ
ン、（８）ＭＣＰ−1のＮ末端から９〜７６番目の部分
アミノ酸配列からなるムテイン、（９）ＭＣＰ−1のＮ
末端から１０〜７６番目の部分アミノ酸配列からなるム
テイン、（１０）ＭＣＰ−1のＮ末端から１１〜７６番
目の部分アミノ酸配列からなるムテイン、（１１）ＭＣ
Ｐ−１のＮ末端から２〜８番目のアミノ酸残基が欠失し
たアミノ酸配列（配列番号：２）からなるムテイン（本
明細書においては、「７ＮＤ−ＭＣＰ−１」と称す
る）、（１２）ＭＣＰ−１のＮ末端から３番目のＡｓｐ
がＡｌａに置換されたムテイン、（１３）ＭＣＰ−１の
Ｎ末端から２２番目のＶａｌがＡｓｐに置換されたムテ
イン、（１４） ＭＣＰ−１のＮ末端から２４番目のＡ
ｒｇがＬｅｕに置換されたムテインなどがあげられ、特
に、７ＮＤ−ＭＣＰ−１が好ましく用いられる。本発明
のムテインは、例えば、ヒトや温血動物（例えば、モル
モット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒ
ツジ、ウシ、ウマ、サルなど）のあらゆる細胞（例え
ば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細
胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など）、またはそれらの細胞が存
在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅
球、扁桃核、大脳基底核、海馬、視床、視床下部、大脳
皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、
肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋
肉、肺、消化管（例、大腸、小腸、十二指腸）、血管、
心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵
巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタン
パク質のムテインであってもよく、また合成タンパク質
であってもよい。
【０００７】また、本発明のムテインとしては、ＭＣＰ
−１の有する作用（例えば、単球／マクロファージ走化
（遊走）作用など）を抑制する作用を有しているかぎ
り、配列番号：２と実質的に同一のアミノ酸配列を有し
ていてもよく、配列番号：２と実質的に同一のアミノ酸
配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミ
ノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より
好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列などがあげられる。
−１の有する作用（例えば、単球／マクロファージ走化
（遊走）作用など）を抑制する作用を有しているかぎ
り、配列番号：２と実質的に同一のアミノ酸配列を有し
ていてもよく、配列番号：２と実質的に同一のアミノ酸
配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミ
ノ酸配列と約４０％以上、好ましくは６０％以上、より
好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以
上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列などがあげられる。
【０００８】また、本発明のムテインには、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列に１または２個以上（例えば１〜２０個程度、好
ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜
５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有するムテインも含まれ
る。上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されて
いる場合、その欠失または置換の位置としては、特に限
定されない。
号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ
酸配列に１または２個以上（例えば１〜２０個程度、好
ましくは１〜９個程度、さらに好ましくは数（例、１〜
５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（例えば１〜２０個程度、好ましくは１〜９個程度、さ
らに好ましくは数（例、１〜５）個）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有するムテインも含まれ
る。上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されて
いる場合、その欠失または置換の位置としては、特に限
定されない。
【０００９】本発明のムテインは、ペプチド標記の慣例
に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端
（カルボキシル末端）である。配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列からなるムテインをはじめとする、本発
明のムテインは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯ
ＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、
Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−Ｃ
ＯＯＲ）であってもよい。ここでエステル基のＲとして
は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロ
ピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例え
ば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シク
ロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどの
Ｃ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなど
のフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメ
チルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ
7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用さ
れるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発
明のムテインがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカ
ルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基が
アミド化またはエステル化されているものも本発明のム
テインに含まれる。この場合のエステルとしては、例え
ば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端
（カルボキシル末端）である。配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列からなるムテインをはじめとする、本発
明のムテインは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯ
ＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-）であるが、
Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−Ｃ
ＯＯＲ）であってもよい。ここでエステル基のＲとして
は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロ
ピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例え
ば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シク
ロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどの
Ｃ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなど
のフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメ
チルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ
7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用さ
れるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発
明のムテインがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカ
ルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基が
アミド化またはエステル化されているものも本発明のム
テインに含まれる。この場合のエステルとしては、例え
ば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
【００１０】さらに、本発明のムテインには、上記した
ムテインにおいて、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が
保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6
アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されて
いるもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミ
ル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸
の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ
基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で
保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる
糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。本
発明のムテインの塩としては、生理学的に許容される酸
（例、無機酸、有機酸）または塩基（例、アルカリ金
属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容さ
れる酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例え
ば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫
酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられ
る。本発明のムテインまたはその塩は、前述したヒトや
温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の
精製方法によってＭＣＰ−１を製造した後、自体公知の
方法に準じて、アミノ酸残基または部分アミノ酸配列を
欠失させるなどすることによって製造することもできる
し、後述するムテインをコードするＤＮＡを含有する形
質転換体を培養することによっても製造することができ
る。また、後述のタンパク質合成法またはこれに準じて
製造することもできる。ヒトや温血動物の組織または細
胞からＭＣＰ−１を製造する場合、ヒトや温血動物の組
織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ
せることにより精製単離することができる。
ムテインにおいて、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が
保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6
アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されて
いるもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミ
ル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸
の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ
基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で
保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる
糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。本
発明のムテインの塩としては、生理学的に許容される酸
（例、無機酸、有機酸）または塩基（例、アルカリ金
属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容さ
れる酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例え
ば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫
酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられ
る。本発明のムテインまたはその塩は、前述したヒトや
温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の
精製方法によってＭＣＰ−１を製造した後、自体公知の
方法に準じて、アミノ酸残基または部分アミノ酸配列を
欠失させるなどすることによって製造することもできる
し、後述するムテインをコードするＤＮＡを含有する形
質転換体を培養することによっても製造することができ
る。また、後述のタンパク質合成法またはこれに準じて
製造することもできる。ヒトや温血動物の組織または細
胞からＭＣＰ−１を製造する場合、ヒトや温血動物の組
織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ
せることにより精製単離することができる。
【００１１】本発明のムテインの合成には、通常市販の
タンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのよう
な樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキ
シメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチ
ル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、
４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−
ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹
脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシ
フェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェ
ノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂
を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したア
ミノ酸を、目的とするムテインの配列通りに、自体公知
の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最
後に樹脂からムテインを切り出すと同時に各種保護基を
除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合
形成反応を実施し、目的のムテインまたはそれらのアミ
ド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関して
は、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用い
ることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カ
ルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカ
ルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリ
ル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活
性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)と
ともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対
称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステル
としてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なったのち
に樹脂に添加することができる。保護アミノ酸の活性化
や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質
縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜
選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオ
ロエタノール、ジメチルスルホキシド、DMF、ジメチル
スルホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、
塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、
酢酸エチル、Ｎ-メチルピロリドンあるいはこれらの適
宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結
合形成反応に使用され得ることがしられている範囲から
適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜
選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５
〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ
ストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行
うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を
行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が
得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾ
ールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによ
って、後の反応に影響を与えないようにすることができ
る。
タンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのよう
な樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキ
シメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチ
ル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、
４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−
ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹
脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシ
フェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェ
ノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂
を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したア
ミノ酸を、目的とするムテインの配列通りに、自体公知
の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最
後に樹脂からムテインを切り出すと同時に各種保護基を
除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合
形成反応を実施し、目的のムテインまたはそれらのアミ
ド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関して
は、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用い
ることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カ
ルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカ
ルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリ
ル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活
性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)と
ともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対
称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステル
としてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なったのち
に樹脂に添加することができる。保護アミノ酸の活性化
や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質
縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜
選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオ
ロエタノール、ジメチルスルホキシド、DMF、ジメチル
スルホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、
塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、
酢酸エチル、Ｎ-メチルピロリドンあるいはこれらの適
宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結
合形成反応に使用され得ることがしられている範囲から
適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜
選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５
〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ
ストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行
うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を
行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が
得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾ
ールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによ
って、後の反応に影響を与えないようにすることができ
る。
【００１２】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーアミルオキシカルボニル、
イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジル
オキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカ
ルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミ
ル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホス
フィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル
基は、例えば、アルキルエステル（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロ
ペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオ
クチル、２−アダマンチルなどのエステル基）、ベンジ
ルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキ
シベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベ
ンズヒドリルエステル、フェナシンエステル、ベンジル
オキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカ
ルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどに導くこ
とによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイ
ル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、
エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基など
が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、
例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチ
ル基などである。
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーアミルオキシカルボニル、
イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジル
オキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカ
ルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミ
ル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホス
フィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル
基は、例えば、アルキルエステル（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロ
ペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオ
クチル、２−アダマンチルなどのエステル基）、ベンジ
ルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキ
シベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベ
ンズヒドリルエステル、フェナシンエステル、ベンジル
オキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカ
ルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどに導くこ
とによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイ
ル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、
エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基など
が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、
例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチ
ル基などである。
【００１３】チロシンのフェノール性水酸基の保護基と
しては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、
Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。ヒスチジ
ンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-
メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、
ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用
いられる。原料のカルボキシル基の活性化されたものと
しては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エス
テル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、
2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノー
ル、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、
HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイ
ミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料の
アミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応す
るリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱離）方
法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒
の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フ
ッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスル
ホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液など
による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエ
チルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処
理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども
用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−
２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理において
は、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソー
ル、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフ
ィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールの
ようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒス
チジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニ
トロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、
トリプトファンのインドール保護基として用いられるホ
ルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジ
チオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希
水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカ
リ処理によっても除去される。原料の反応に関与すべき
でない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基
の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基
あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
しては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−ニトロベンジル、
Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。ヒスチジ
ンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-
メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、
ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用
いられる。原料のカルボキシル基の活性化されたものと
しては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エス
テル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、
2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノー
ル、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、
HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイ
ミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料の
アミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応す
るリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱離）方
法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒
の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フ
ッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスル
ホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液など
による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエ
チルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処
理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども
用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−
２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理において
は、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソー
ル、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフ
ィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールの
ようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒス
チジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニ
トロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、
トリプトファンのインドール保護基として用いられるホ
ルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジ
チオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希
水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカ
リ処理によっても除去される。原料の反応に関与すべき
でない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基
の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基
あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
【００１４】本発明のムテインのアミド体を得る別の方
法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カル
ボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペ
プチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、
該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除
いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみ
を除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を
上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳
細については上記と同様である。縮合により得られた保
護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保
護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができ
る。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して
精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のムテイン
のアミド体を得ることができる。本発明のムテインのエ
ステル体を得るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カ
ルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エ
ステルとした後、本発明のムテインのアミド体と同様に
して、所望のエステル体を得ることができる。本発明の
ムテインは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あ
るいはＭＣＰ−１を適当なペプチダーゼで切断すること
によって製造することができる。ペプチドの合成法とし
ては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっ
ても良い。すなわち、本発明のムテインを構成し得る部
分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、
生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することに
より目的の本発明のムテインを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店
法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カル
ボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペ
プチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、
該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除
いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみ
を除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を
上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳
細については上記と同様である。縮合により得られた保
護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保
護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができ
る。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して
精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のムテイン
のアミド体を得ることができる。本発明のムテインのエ
ステル体を得るには、カルボキシ末端アミノ酸のα−カ
ルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エ
ステルとした後、本発明のムテインのアミド体と同様に
して、所望のエステル体を得ることができる。本発明の
ムテインは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あ
るいはＭＣＰ−１を適当なペプチダーゼで切断すること
によって製造することができる。ペプチドの合成法とし
ては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっ
ても良い。すなわち、本発明のムテインを構成し得る部
分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、
生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することに
より目的の本発明のムテインを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店
【００１５】また、反応後は通常の精製法、例えば、溶
媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマ
トグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のムテ
インを精製単離することができる。上記方法で得られる
本発明のムテインが遊離体である場合は、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換するこ
とができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に
変換することができる。本発明のムテインをコードする
ＤＮＡとしては、前述した本発明のムテインをコードす
る塩基配列を含有するものであればいかなるものであっ
てもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラ
リー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細
胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バ
クテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミ
ドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組
織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Revers
e Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、
ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもで
きる。
媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマ
トグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のムテ
インを精製単離することができる。上記方法で得られる
本発明のムテインが遊離体である場合は、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換するこ
とができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に
変換することができる。本発明のムテインをコードする
ＤＮＡとしては、前述した本発明のムテインをコードす
る塩基配列を含有するものであればいかなるものであっ
てもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラ
リー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細
胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バ
クテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミ
ドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組
織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Revers
e Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、
ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもで
きる。
【００１６】具体的には、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列をからなるＭＣＰ−１をコードするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配列を
有するＤＮＡ、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列
をからなる７ＮＤ−ＭＣＰ−１をコードするＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。
ミノ酸配列をからなるＭＣＰ−１をコードするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配列を
有するＤＮＡ、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列
をからなる７ＮＤ−ＭＣＰ−１をコードするＤＮＡとし
ては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。
【００１７】本発明のムテインをコードするＤＮＡのク
ローニングの手段としては、本発明のムテインをコード
するＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマ
ーを用いて、ＰＣＲ法によって鋳型となるＤＮＡを増幅
するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本
発明のムテインの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断
片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブ
リダイゼーションによって選別することができる。ハイ
ブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook
et al., ColdSpring Harbor Lab. Press, 1989）に記
載の方法などに従って行なうことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記
載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配
列の変換（欠失・付加・置換）は、公知のキット、例え
ば、MutanTM-G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造
（株））などを用いて、Gapped duplex法やKunkel法な
どの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従っ
て行なうことができる。クローン化された本発明のムテ
インをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、また
は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加し
たりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末
端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'
末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまた
はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドン
や翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用
いて付加することもできる。本発明のムテインをコード
するＤＮＡの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明の
ムテインをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片
を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター
中のプロモーターの下流に連結することにより製造する
ことができる。ベクターとしては、例えば、大腸菌由来
のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵ
Ｃ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、
ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラ
スミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージな
どのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニア
ウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの
他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ
／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。用
いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる
宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるも
のでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合
は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴ
Ｒプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロ
モーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、
ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＡＯＸ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、Ｐ
ＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモ
ーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、
ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが
好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望により
エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シ
グナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、
ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有して
いるものを用いることができる。選択マーカーとして
は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと
略称する場合がある）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子
（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシ
ン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ
４１８耐性）等が用いられる。ｄｈｆｒ遺伝子はメソト
レキセート（ＭＴＸ）耐性を、ＮｅｏはＧ４１８耐性を
付与する。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハム
スター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカ
ーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっ
ても目的とする遺伝子を選択することができる。また、
必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タンパク
質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌であ
る場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列
などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラ
ーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、
ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場
合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−イン
ターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列
などがそれぞれ利用できる。
ローニングの手段としては、本発明のムテインをコード
するＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマ
ーを用いて、ＰＣＲ法によって鋳型となるＤＮＡを増幅
するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本
発明のムテインの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断
片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブ
リダイゼーションによって選別することができる。ハイ
ブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook
et al., ColdSpring Harbor Lab. Press, 1989）に記
載の方法などに従って行なうことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記
載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配
列の変換（欠失・付加・置換）は、公知のキット、例え
ば、MutanTM-G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造
（株））などを用いて、Gapped duplex法やKunkel法な
どの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従っ
て行なうことができる。クローン化された本発明のムテ
インをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、また
は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加し
たりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末
端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'
末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまた
はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドン
や翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用
いて付加することもできる。本発明のムテインをコード
するＤＮＡの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明の
ムテインをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片
を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター
中のプロモーターの下流に連結することにより製造する
ことができる。ベクターとしては、例えば、大腸菌由来
のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵ
Ｃ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、
ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラ
スミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージな
どのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニア
ウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの
他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ
／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。用
いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる
宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるも
のでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合
は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴ
Ｒプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロ
モーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、
ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＡＯＸ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、Ｐ
ＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモ
ーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、
ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが
好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望により
エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シ
グナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、
ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有して
いるものを用いることができる。選択マーカーとして
は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと
略称する場合がある）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子
（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシ
ン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ
４１８耐性）等が用いられる。ｄｈｆｒ遺伝子はメソト
レキセート（ＭＴＸ）耐性を、ＮｅｏはＧ４１８耐性を
付与する。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハム
スター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカ
ーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっ
ても目的とする遺伝子を選択することができる。また、
必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、タンパク
質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌であ
る場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列
などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラ
ーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、
ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場
合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−イン
ターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列
などがそれぞれ利用できる。
【００１８】このようにして構築された本発明のムテイ
ンをコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導入
することによって形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属
菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられ
る。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシー
ジングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Nat
l. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６
８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサー
チ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９
８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが
用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveＴＭ細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞また
はEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイ
ルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx m
ori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞と
しては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２
１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in V
itro）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
ンをコードするＤＮＡを含有するベクターを細胞に導入
することによって形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属
菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられ
る。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシー
ジングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Nat
l. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６
８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサー
チ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９
８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが
用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveＴＭ細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞また
はEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイ
ルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx m
ori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞と
しては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２
１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in V
itro）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
【００１９】昆虫としては、例えば、カイコの幼虫など
が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５
巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞としては、例えば、
サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター
細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝
子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨ
Ｏ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウス
ＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，
ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３
Ｔ３細胞、Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中
でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞、２９３
細胞などが好ましい。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことが
できる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１
１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことがで
きる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１
９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）など
に記載の方法に従って行なうことができる。
が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５
巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞としては、例えば、
サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター
細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝
子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨ
Ｏ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウス
ＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，
ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３
Ｔ３細胞、Ｓｐ−２細胞などが用いられる。これらの中
でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞、２９３
細胞などが好ましい。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことが
できる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１
１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことがで
きる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１
９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）など
に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２０】昆虫細胞や昆虫を形質転換するには、例え
ば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-5
5(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができ
る。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別
冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７
（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行なうことができる。発現ベクターの細胞への導入方法
としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham, F.
L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology） 5
2, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et a
l. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1,841-845（198
2）〕等が用いられる。このようにして、本発明のムテ
インをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質
転換された形質転換体を得ることができる。なお、動物
細胞を用いて、本発明のムテインを安定に発現させる方
法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクター
が染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選
択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを
指標にして形質転換体を選択することができる。さら
に、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞
に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本
発明のムテインの高発現能を有する安定な動物細胞株を
得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカ
ーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養
し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とと
もに、本発明のムテインをコードするＤＮＡを細胞内で
増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもで
きる。上記の形質転換体を本発明のムテインをコードす
るＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のムテイ
ンを生成、蓄積せしめることによって、本発明のムテイ
ンを製造することができる。
ば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-5
5(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができ
る。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別
冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７
（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行なうことができる。発現ベクターの細胞への導入方法
としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham, F.
L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology） 5
2, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et a
l. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1,841-845（198
2）〕等が用いられる。このようにして、本発明のムテ
インをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質
転換された形質転換体を得ることができる。なお、動物
細胞を用いて、本発明のムテインを安定に発現させる方
法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクター
が染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選
択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを
指標にして形質転換体を選択することができる。さら
に、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞
に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本
発明のムテインの高発現能を有する安定な動物細胞株を
得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカ
ーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養
し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とと
もに、本発明のムテインをコードするＤＮＡを細胞内で
増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもで
きる。上記の形質転換体を本発明のムテインをコードす
るＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のムテイ
ンを生成、蓄積せしめることによって、本発明のムテイ
ンを製造することができる。
【００２１】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ用いられ
る。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など
を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例え
ば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー
（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Exp
eriments in Molecular Genetics），４３１−４３３，
Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕
が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく
働かせるために、例えば３β−インドリル アクリル酸
のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒ
ア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４
時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもで
きる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜
４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌
を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を
培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー
（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８
０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitte
r, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１
巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨ
は約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０
℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通
気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（G
race, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）
に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたも
のなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に
調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５
日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ用いられ
る。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など
を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例え
ば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー
（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Exp
eriments in Molecular Genetics），４３１−４３３，
Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕
が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく
働かせるために、例えば３β−インドリル アクリル酸
のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒ
ア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４
時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもで
きる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜
４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌
を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を
培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー
（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８
０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitte
r, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１
巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨ
は約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０
℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通
気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（G
race, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）
に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたも
のなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に
調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５
日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２２】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２
巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー
（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Journal of the Ame
rican Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞およ
びｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合、チ
ミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭ
ＥＭ培地を用いるのが好ましい。上記培養物から本発明
のムテインを分離精製するには、例えば、下記の方法に
より行なうことができる。本発明のムテインを培養菌体
あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の
方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に
懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解な
どによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離
やろ過により本発明のムテインの粗抽出液を得る方法な
どが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン
などのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの
界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク
質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の
方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集め
る。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液
中に含まれる本発明のムテインの精製は、自体公知の分
離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
る際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２
巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー
（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Journal of the Ame
rican Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜７２時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞およ
びｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合、チ
ミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭ
ＥＭ培地を用いるのが好ましい。上記培養物から本発明
のムテインを分離精製するには、例えば、下記の方法に
より行なうことができる。本発明のムテインを培養菌体
あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の
方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に
懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解な
どによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離
やろ過により本発明のムテインの粗抽出液を得る方法な
どが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン
などのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの
界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク
質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の
方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集め
る。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液
中に含まれる本発明のムテインの精製は、自体公知の分
離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００２３】かくして得られる本発明のムテインが遊離
体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法により、遊離体または他の塩に変換することができ
る。なお、組換え体が産生する本発明のムテインを、精
製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させるこ
とにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分
的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例
えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンド
ペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼな
どが用いられる。かくして生成する本発明のムテインの
存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイな
どにより測定することができる。ＭＣＰ−１に対する中
和抗体（以下、本発明の抗体と称することがある）はＭ
ＣＰ−１を中和する作用を有し、ＭＣＰ−１を認識し得
る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体の何れであってもよい。本発明の抗体は、ＭＣＰ−
１を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製
造法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 ＭＣＰ−１は、温血動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全
フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン
トを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ず
つ、計２〜１０回程度行なうことができる。温血動物と
しては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マ
ウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが用いられる
が、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノク
ローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫さ
れた温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた
個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ
節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種また
は異種の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合
した標識剤の活性を測定することにより行なうことがで
きる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス
などが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法により、遊離体または他の塩に変換することができ
る。なお、組換え体が産生する本発明のムテインを、精
製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させるこ
とにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分
的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例
えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンド
ペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼな
どが用いられる。かくして生成する本発明のムテインの
存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイな
どにより測定することができる。ＭＣＰ−１に対する中
和抗体（以下、本発明の抗体と称することがある）はＭ
ＣＰ−１を中和する作用を有し、ＭＣＰ−１を認識し得
る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体の何れであってもよい。本発明の抗体は、ＭＣＰ−
１を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製
造法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 ＭＣＰ−１は、温血動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全
フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン
トを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ず
つ、計２〜１０回程度行なうことができる。温血動物と
しては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マ
ウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが用いられる
が、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノク
ローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫さ
れた温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた
個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ
節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種また
は異種の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合
した標識剤の活性を測定することにより行なうことがで
きる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス
などが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００２４】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物由来の
骨髄腫細胞が用いられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いら
れる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施することが
できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タ
ンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固
相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清
を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫
グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの
場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）また
はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル
抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロ
テインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を
添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を
加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方
法などが用いられる。
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物由来の
骨髄腫細胞が用いられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いら
れる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施することが
できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タ
ンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固
相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清
を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫
グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの
場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）また
はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル
抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロ
テインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を
添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を
加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方
法などが用いられる。
【００２５】モノクローナル抗体の選別は、自体公知あ
るいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。
通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。
選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育
できるものならばどのような培地を用いても良い。例え
ば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血
清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハ
イブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水
製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、
通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時
間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間で
ある。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
るいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。
通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。
選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育
できるものならばどのような培地を用いても良い。例え
ば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血
清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハ
イブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水
製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、
通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時
間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間で
ある。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００２６】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕ポリクローナル抗体は、
それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製
造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗
原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモ
ノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行
ない、該免疫動物からポリクローナル抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造すること
ができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋
白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、
キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体
が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架
橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシ
サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン
１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合
でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いること
ができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マ
レイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基
を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成
物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ
自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に
際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュ
バントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、
上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好
ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポ
リクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の
測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、上記
のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリ
ンの分離精製法に従って行なうことができる。
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕ポリクローナル抗体は、
それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製
造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗
原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモ
ノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行
ない、該免疫動物からポリクローナル抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造すること
ができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋
白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、
キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体
が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架
橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシ
サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン
１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合
でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いること
ができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マ
レイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基
を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成
物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ
自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に
際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュ
バントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、
上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好
ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポ
リクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の
測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、上記
のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリ
ンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００２７】上記の本発明のムテイン、本発明のムテイ
ンをコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは本発明の
抗体は、例えば、肺高血圧症、より具体的には、原発性
肺高血圧症の予防・治療剤として用いることができる。
本発明のムテインをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
を上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡ
を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルス
ベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段
に従ってヒトまたは温血動物に投与することができる。
本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のた
めに補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製
剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカ
テーテルによって投与できる。本発明のムテインを上記
の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０
％、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、
さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用す
るのが好ましい。本発明のムテインまたは本発明の抗体
を上記の予防・治療剤として使用する場合は、例えば、
必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシ
ル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるい
は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌
性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に
使用できる。例えば、本発明のムテインを生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加
剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ
とができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。上記のＤＮＡが挿入されたベ
クターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使
用される。
ンをコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは本発明の
抗体は、例えば、肺高血圧症、より具体的には、原発性
肺高血圧症の予防・治療剤として用いることができる。
本発明のムテインをコードする塩基配列を有するＤＮＡ
を上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡ
を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルス
ベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段
に従ってヒトまたは温血動物に投与することができる。
本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のた
めに補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製
剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカ
テーテルによって投与できる。本発明のムテインを上記
の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０
％、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、
さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用す
るのが好ましい。本発明のムテインまたは本発明の抗体
を上記の予防・治療剤として使用する場合は、例えば、
必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシ
ル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるい
は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌
性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に
使用できる。例えば、本発明のムテインを生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加
剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ
とができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調整された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。上記のＤＮＡが挿入されたベ
クターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使
用される。
【００２８】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与
することができる。また、上記の本発明のムテインをコ
ードするＤＮＡ、上記のＤＮＡを含有してなるベクター
等は、肺高血圧症（特に、原発性肺高血圧症）の遺伝子
治療に用いることができる。本発明の予防・治療剤の投
与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差
異はあるが、例えば、原発性肺高血圧症患者に本発明の
ムテイン、本発明のDNAまたは本発明の抗体を注射剤の
形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日
につき有効成分として約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ま
しくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．
１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たり
に換算した量を投与することができる。
毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与
することができる。また、上記の本発明のムテインをコ
ードするＤＮＡ、上記のＤＮＡを含有してなるベクター
等は、肺高血圧症（特に、原発性肺高血圧症）の遺伝子
治療に用いることができる。本発明の予防・治療剤の投
与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差
異はあるが、例えば、原発性肺高血圧症患者に本発明の
ムテイン、本発明のDNAまたは本発明の抗体を注射剤の
形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日
につき有効成分として約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ま
しくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．
１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与する
のが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たり
に換算した量を投与することができる。
【００２９】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００３０】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl２Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカル
ボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ
−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-
ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl２Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカル
ボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ
−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-
ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド
【００３１】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 〔配列番号：１〕ＭＣＰ−１のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕７ＮＤ−ＭＣＰ−１のアミノ酸配列を
示す。 〔配列番号：３〕ＭＣＰ−１をコードするＤＮＡの塩基
配列を示す。 〔配列番号：４〕７ＮＤ−ＭＣＰ−１をコードするＤＮ
Ａの塩基配列を示す。
列を示す。 〔配列番号：１〕ＭＣＰ−１のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕７ＮＤ−ＭＣＰ−１のアミノ酸配列を
示す。 〔配列番号：３〕ＭＣＰ−１をコードするＤＮＡの塩基
配列を示す。 〔配列番号：４〕７ＮＤ−ＭＣＰ−１をコードするＤＮ
Ａの塩基配列を示す。
【００３２】
【実施例】以下に、実施例をあげて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。 実施例１ モノクロタリン(MCT)誘発ラット肺高血圧症
モデルにおけるMCP-1の拮抗阻害型ムテインの作用 方法：正常ラット（市販の雄性正常血圧ラット(６〜８
週齢)）を４群に分けた。第1群は無処置対照群、第２群
はMCT(60mg/kg,s.c.)処置対照群、第3群はMCT処置＋7ND
-MCP-1の1回投与群(MCT処置と同時投与)および第4群はM
CT処置＋7ND-MCP-1の2回投与群(MCT処置時とMCT処置2週
間後)とした。すなわち、遺伝子導入3日前にマーカイン
500μｌをラット両側大腿四頭筋に注入し、その3日後
に、MCT(60mg/kg,s.c.)処置対照群のラットには、MCT 6
0mg/kgを皮下注射した。7ND-MCP-1の1回投与群のラット
には、 MCT 60mg/kgと同時に7ND-MCP-1発現プラスミド5
00μｇを数箇所に分けて両側大腿四頭筋に注入した。 M
CT処置＋7ND-MCP-1の2回投与群のラットには、 MCT 60m
g/kgと同時に7ND-MCP-1発現プラスミド500μｇを数箇所
に分けて両側大腿四頭筋に注入した後、14日目に7ND-MC
P-1発現プラスミド500μｇを数箇所に分けて両側大腿四
頭筋に注入した。MCT処置１、２、３および４週間目
に、心エコーによる心室の形態および内腔サイズの変化
および右心室内圧、4週目に摘出した心臓について、心
重量、右心室壁厚および心室内腔サイズを、また肺につ
いて形態学的解析を行った。なお、7ND-MCP-1発現プラ
スミドは、MCP-1ｃDNAを鋳型として、自体公知のPCRに
より7ND-MCP-1ｃDNAを取得し（7ND-MCP-1の3'末端にはF
LAG配列が付加していてもよい）、該7ND-MCP-1cDNAをｐ
ＣＤＮＡ３発現プラスミドのBamHIサイトとNotIサイト
の間に5'端がBamHIサイト側、3'端がNotIサイトになる
ように導入することにより、作製した。結果を以下に示
す。 １．肺高血圧に対する作用 右心室圧は無処置対照群で26.2 ± 4.7 mmHgであったの
がMCT処置4週間後に69.7 + 2.1 mmHgと上昇していた
が、7ND-MCP-1（ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテイン）の
１回投与で37.3 ± 4.6 mmHg、２回投与でそれぞれ45.6
± 9.8 mmHgと有意に血圧低下作用が確認された。 ２．心重量、心臓の形態変化に対する作用 MCT処置群では、右心室の肥大、特に右心室壁厚の肥厚
および内腔拡大が認められたが、7ND-MCP-1の投与でこ
れらの変化が抑制されていた。 ３．血管および肺に対する作用 右心室の小動脈において、MCT投与群では中膜の有意な
肥厚が認められたが、7ND-MCP-1の投与でこれらの変化
が抑制された。また、MCT処置群では肺胞腔内を中心に
多数のマクロファージと単核球の浸潤を認めたが、7ND-
MCP-1の投与でこれらの変化が抑制された。7ND-MCP-1投
与によるラットにおけるモノクロタリン誘発肺高血圧症
とそれに附随して進展する肺動脈ならびに心室壁のリモ
デリングから、MCP-1の拮抗阻害型ムテインは、肺高血
圧症（特に、原発性肺高血圧症）に対する予防・治療剤
となりうる。
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。 実施例１ モノクロタリン(MCT)誘発ラット肺高血圧症
モデルにおけるMCP-1の拮抗阻害型ムテインの作用 方法：正常ラット（市販の雄性正常血圧ラット(６〜８
週齢)）を４群に分けた。第1群は無処置対照群、第２群
はMCT(60mg/kg,s.c.)処置対照群、第3群はMCT処置＋7ND
-MCP-1の1回投与群(MCT処置と同時投与)および第4群はM
CT処置＋7ND-MCP-1の2回投与群(MCT処置時とMCT処置2週
間後)とした。すなわち、遺伝子導入3日前にマーカイン
500μｌをラット両側大腿四頭筋に注入し、その3日後
に、MCT(60mg/kg,s.c.)処置対照群のラットには、MCT 6
0mg/kgを皮下注射した。7ND-MCP-1の1回投与群のラット
には、 MCT 60mg/kgと同時に7ND-MCP-1発現プラスミド5
00μｇを数箇所に分けて両側大腿四頭筋に注入した。 M
CT処置＋7ND-MCP-1の2回投与群のラットには、 MCT 60m
g/kgと同時に7ND-MCP-1発現プラスミド500μｇを数箇所
に分けて両側大腿四頭筋に注入した後、14日目に7ND-MC
P-1発現プラスミド500μｇを数箇所に分けて両側大腿四
頭筋に注入した。MCT処置１、２、３および４週間目
に、心エコーによる心室の形態および内腔サイズの変化
および右心室内圧、4週目に摘出した心臓について、心
重量、右心室壁厚および心室内腔サイズを、また肺につ
いて形態学的解析を行った。なお、7ND-MCP-1発現プラ
スミドは、MCP-1ｃDNAを鋳型として、自体公知のPCRに
より7ND-MCP-1ｃDNAを取得し（7ND-MCP-1の3'末端にはF
LAG配列が付加していてもよい）、該7ND-MCP-1cDNAをｐ
ＣＤＮＡ３発現プラスミドのBamHIサイトとNotIサイト
の間に5'端がBamHIサイト側、3'端がNotIサイトになる
ように導入することにより、作製した。結果を以下に示
す。 １．肺高血圧に対する作用 右心室圧は無処置対照群で26.2 ± 4.7 mmHgであったの
がMCT処置4週間後に69.7 + 2.1 mmHgと上昇していた
が、7ND-MCP-1（ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテイン）の
１回投与で37.3 ± 4.6 mmHg、２回投与でそれぞれ45.6
± 9.8 mmHgと有意に血圧低下作用が確認された。 ２．心重量、心臓の形態変化に対する作用 MCT処置群では、右心室の肥大、特に右心室壁厚の肥厚
および内腔拡大が認められたが、7ND-MCP-1の投与でこ
れらの変化が抑制されていた。 ３．血管および肺に対する作用 右心室の小動脈において、MCT投与群では中膜の有意な
肥厚が認められたが、7ND-MCP-1の投与でこれらの変化
が抑制された。また、MCT処置群では肺胞腔内を中心に
多数のマクロファージと単核球の浸潤を認めたが、7ND-
MCP-1の投与でこれらの変化が抑制された。7ND-MCP-1投
与によるラットにおけるモノクロタリン誘発肺高血圧症
とそれに附随して進展する肺動脈ならびに心室壁のリモ
デリングから、MCP-1の拮抗阻害型ムテインは、肺高血
圧症（特に、原発性肺高血圧症）に対する予防・治療剤
となりうる。
【００３３】
【配列表】 [Sequence Listing] <110> Egashira Kensuke <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Composition for treating or preventing primary pulmonary hypertens ion <130> P2001-077 <160> 4 <210> 1 <211> 76 <212> PRT <213> Human <400> 1 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 2 <211> 69 <212> PRT <213> Human <400> 2 Gln Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln 1 5 10 15 Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu 20 25 30 Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro 35 40 45 Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr 50 55 60 Gln Thr Pro Lys Thr 65 <210> 3 <211> 228 <212> DNA <213> Human <400> 3 cagccagatg caatcaatgc cccagtcacc tgctgttata acttcaccaa taggaagatc 60 tcagtgcaga ggctcgcgag ctatagaaga atcaccagca gcaagtgtcc caaagaagct 120 gtgatcttca agaccattgt ggccaaggag atctgtgctg accccaagca gaagtgggtt 180 caggattcca tggaccacct ggacaagcaa acccaaactc cgaagact 228 <210> 4 <211> 207 <212> DNA <213> Human <400> 4 caggtcacct gctgttataa cttcaccaat aggaagatct cagtgcagag gctcgcgagc 60 tatagaagaa tcaccagcag caagtgtccc aaagaagctg tgatcttcaa gaccattgtg 120 gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag aagtgggttc aggattccat ggaccacctg 180 gacaagcaaa cccaaactcc gaagact 207
【００３４】
【発明の効果】本発明のＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテイ
ン、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする塩基
配列を有するＤＮＡまたはＭＣＰ−１に対する中和抗体
を含有してなる剤は、肺高血圧症（特に、原発性肺高血
圧症）の予防・治療のための医薬として有用である。
ン、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードする塩基
配列を有するＤＮＡまたはＭＣＰ−１に対する中和抗体
を含有してなる剤は、肺高血圧症（特に、原発性肺高血
圧症）の予防・治療のための医薬として有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/12 Ａ６１Ｐ 9/12 11/00 11/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 16/24 16/24 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 米満 吉和 福岡県福岡市東区名島５−31−３ (72)発明者 居石 克夫 福岡県福岡市南区大池１−29−22 (72)発明者 池田 康博 福岡県福岡市東区原田１−21−10−405 (72)発明者 稲田 義行 兵庫県川西市松が丘町３番６号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA06 EA04 GA11 HA17 4C084 AA02 BA01 BA08 BA20 CA18 DC50 ZA362 ZA592 4C085 AA13 AA14 CC22 CC23 EE01 GG01 GG08 JJ02 JJ11 KA03 KA04 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA42 ZA59 ZC41 ZC51 4H045 AA30 BA20 BA21 CA40 DA01 EA23 FA74
Claims (5)
- 【請求項１】 ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインもしく
はその塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡまたはＭＣＰ−１に対する中
和抗体を含有してなる肺高血圧症予防・治療剤。 - 【請求項２】 ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテインが７Ｎ
Ｄ−ＭＣＰ−１である請求項１記載の剤。 - 【請求項３】 肺高血圧症が原発性肺高血圧症である請
求項１記載の剤。 - 【請求項４】 肺高血圧症予防・治療作用を有する医薬
を製造するための請求項１記載のＭＣＰ−１の拮抗阻害
型ムテインもしくはその塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ム
テインをコードする塩基配列を有するＤＮＡまたはＭＣ
Ｐ−１に対する中和抗体の使用。 - 【請求項５】 請求項１記載のＭＣＰ−１の拮抗阻害型
ムテインもしくはその塩、ＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテ
インをコードする塩基配列を哺乳動物に投与することを
特徴とする肺高血圧症予防・治療方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001156252A JP4827320B2 (ja) | 2000-05-26 | 2001-05-25 | 肺高血圧症予防・治療剤 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000161145 | 2000-05-26 | ||
| JP2000-161145 | 2000-05-26 | ||
| JP2000161145 | 2000-05-26 | ||
| JP2001156252A JP4827320B2 (ja) | 2000-05-26 | 2001-05-25 | 肺高血圧症予防・治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002047203A true JP2002047203A (ja) | 2002-02-12 |
| JP4827320B2 JP4827320B2 (ja) | 2011-11-30 |
Family
ID=26592956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001156252A Expired - Fee Related JP4827320B2 (ja) | 2000-05-26 | 2001-05-25 | 肺高血圧症予防・治療剤 |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP4827320B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016194897A1 (ja) * | 2015-06-01 | 2016-12-08 | 国立大学法人富山大学 | 肺高血圧症の治療薬及び治療方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1149700A (ja) * | 1997-07-31 | 1999-02-23 | Toray Ind Inc | 肺疾患治療剤 |
-
2001
- 2001-05-25 JP JP2001156252A patent/JP4827320B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1149700A (ja) * | 1997-07-31 | 1999-02-23 | Toray Ind Inc | 肺疾患治療剤 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016194897A1 (ja) * | 2015-06-01 | 2016-12-08 | 国立大学法人富山大学 | 肺高血圧症の治療薬及び治療方法 |
| JPWO2016194897A1 (ja) * | 2015-06-01 | 2018-03-22 | 国立大学法人富山大学 | 肺高血圧症の治療薬及び治療方法 |
| US10479836B2 (en) | 2015-06-01 | 2019-11-19 | National University Corporation University Of Toyama | Method for treating pulmonary hypertension with interleukin-5 receptor antibody |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4827320B2 (ja) | 2011-11-30 |
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