ES2229234T3

ES2229234T3 - Nueva subunidad alfa de la integrina beta2 humana.

Info

Publication number: ES2229234T3
Application number: ES95905459T
Authority: ES
Inventors: W. Michael Gallatin; Monica Van Der Vieren
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2014-12-21
Also published as: JP3261383B2; AU1860395A; EP0686161A1; EP0686161B1; JPH08507933A; CA2156622A1; PT686161E; DE69433869T2; ATE270330T1; EP0686161A4; DK0686161T3; US5766850A; HK1011999A1; US5470953A; DE69433869D1; WO1995017412A1

Abstract

Polinucleótido de ad, purificado y aislado, que tiene la secuencia de codificación de proteína de ad humana indicada en SEQ ID NO: 1. En un aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos nuevos, purificados y aislados, (por ejemplo transcriptos ADN y ARN, ambas cadenas, sentido y anti sentido) que codifican una nueva subunidad alfa de la integrina beta2, alfa2, y variantes de la misma (es decir, análogos de eliminación, adición o sustitución) que poseen propiedades de fijación y/o inmunológicas inherentes a alfad. Según la presente invención, se presenta un polinucleótido beta2 purificado y aislado que tiene la secuencia de codificación de proteína alfad humana expuesta en SEQ ID NO: 1. Entre las moléculas preferidas de ADN de la invención, se encuentran: cADN, ADN genómico y moléculas de ADN total o parcialmente sintetizadas químicamente. Un polinucleótido actualmente preferido es el ADN expuesto en SEQ ID NO:1, que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2. También se ofrecen construcciones de ADN viral y plásmido recombinante (constructos de expresión), que incluyen secuencias de codificación alfad de la invención, donde la secuencia de codificación alfad está operativamente relacionada con un elemento o varios elementos de regulación transcripcional homólogo o heterólogo. La presente invención también describe el aislamiento y la purificación de polinucleótidos de ratón y rata, que presentan homología con los polinucleótidos de purificación de alfa2 humano. Un polinucleótido preferido de ratón de la invención se muestra en SEQ ID NO: 52; un polinucleótido preferido de rata de la invención se muestra en SEQ ID NO:54.

Description

Nueva subunidad \alpha de la integrina \beta_{2} humana.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a la clonación y a la expresión de polinucleótidos que codifican una nueva subunidad \alpha de la integrina \beta_{2} humana, designada \alpha_{2}, estructuralmente afín a las subunidades \alpha de la integrina \beta_{2} humana conocida, CD11a, CD11b y CD11c. La presente invención se refiere también a polinucleótidos aislados de otras especies, que presentan homología con secuencias de codificación de \alpha_{d} humana.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son una clase de moléculas asociadas a membranas, que participan activamente en la adhesión celular. Las integrinas son heterodímeros de transmembrana que comprenden una subunidad \alpha en asociación no covalente con una subunidad \beta. Hasta la fecha se han identificado por lo menos catorce subunidades \alpha y ocho subunidades \beta [recopilado en Springer, Nature 346-425-434 (1990)]. Las subunidades \beta son generalmente capaces de asociarse con más de una subunidad \alpha y los heterodímeros que comparten una subunidad \beta común han sido clasificados como subfamilias dentro de la población de integrinas.

Una clase de integrinas humanas, limitada a la expresión en leucocitos se caracteriza por una subunidad \beta_{2} común. Como resultado de esta expresión específica celular, estas integrinas suelen recibir el nombre de integrinas de leucocito, Leu-CAMs o leuco-integrinas. Debido a la subunidad \beta_{2} común, una designación alternativa de esta clase es la de integrinas \beta_{2}. La subunidad \beta_{2} (CD18) ha sido aislada previamente en asociación con una de tres subunidades \alpha distintas CD11a, CD11b o CD11c. El aislamiento de una CD18 humana codificadora de cADN se describe en Kishimoto, et al., Cell 48:681-690 (1987). En la nomenclatura oficial de la OMS, las proteínas heterodímeras reciben el nombre de CD11a / CD11b / CD18, y CD11c / CD18; en la nomenclatura común reciben la designación de LFA-1, Mac-1 o Mol y p150,95 o LeuM5, respectivamente [Cobbod, et al., en Leukocyte Typing III, McMichael (ed), Oxford Press, p.788 (1987)]. Las subunidades \alpha de la integrina \beta_{2} humana CD11a, CD11b y CD11c migran, como se ha podido comprobar, en condiciones reductoras, en electrofóresis, con pesos moleculares aparentes de aproximadamente 180 kD, 155 kD y 150kD, respectivamente, y se han clonado ADNs que codifican estas subunidades [CD11a, Larson, et al., J. Cell Biol. 108:703-712 (1989); CD11b, Corbi, et al., J. Biol. Chem.263:12404-12411 (1988) y CD11c, Corbi et al. EMBO J. 6:4023-4028 (19871 Se han identificado de formas diversas en otras especies, inclusive en los monos y otros primates, homólogos putativos de las cadenas \alpha y \beta de la integrina \beta_{2} humana [Letvin, et al., Blood 61:408-410 (1983)], ratones [Sanchez-Madrid, et al., J.Exp.Med. 154:1517 (1981] y perros [Moore, et al., Tissue Antigens 36:211-220(1990)].

Los pesos moleculares absolutos de los supuestos homólogos de otras especies varían notablemente, según se ha podido comprobar [véase por ejemplo Danilenko et al., Tissue Antigens 40:13-21 (1992)], y en ausencia de información de secuencia, no ha sido posible establecer una correlación definitiva entre subunidades de integrina humana y las identificadas en otras especies. Además, se ha observado que existen variaciones en el número de miembros en una familia de proteínas según las especies. Hay que tener en cuenta, por ejemplo, que se han aislado más isotipos IgA en conejos que en humanos [Burnett, et al., EMBO J.8:4041-49¡047 (1989) y Schneiderman, et al., Proc. Natl.Acad.Sci.(USA)86:7561-7565 (1989)]. De forma similar, en los humanos se han identificado previamente por lo menos seis variantes de proteína metalo tionina [Karin y Richards, Nature 299:797-802 (1982) y Varshney, et al., Mol. Cell.Biol. 6:26-37, (1986)], y en el ratón, solo se evidencian dos de estas variantes [Searle, et al., Mol.Cell.Biol.4:1221-1230 (1984)]. Por consiguiente, la existencia de múltiples miembros de una familia de proteínas en una especie no implica necesariamente que existen miembros de la familia correspondiente en otras especies.

En el contexto específico de las integrinas \beta_{2}, se ha observado en perros que la supuesta contrapartida \beta_{2} canina a la CD18 humana es capaz de formación dímera con hasta cuatro subunidades \alpha potencialmente distintas [Danilenko, et al., supra]. Los anticuerpos generados con la inmunización de ratones con esplenocitos caninos dieron como resultados anticuerpos monoclonales, que inmuno-precipitaron proteínas designadas provisionalmente como homólogos caninos de las CD18, CD11a, CD11b y CD11c humanas, sobre la base principalmente de pesos moleculares similares aunque no idénticos. Otro anticuerpo esplenocito anti-canino, Ca11.8H2, reconoció e inmuno-precipitó una cuarta subunidad canina similar a \alpha, capaz también de asociación con la unidad \beta_{2}, aunque tiene un peso molecular único y de expresión limitada, a un subconjunto de macrófagos o histiocitos diferenciados. Los anticuerpos generados por inmunización de hámsters con células dendríticas murinas dieron como resultado dos anticuerpos anti-integrina [Metlay, et al., J. Exp. Med. 171:1753-1771 (1990)]. Un anticuerpo, dos 2E6, inmuno-precipitó un heterodímero predominante con subunidades que tenían pesos moleculares aproximados de 180 kD y 90 kD además de bandas menores en la gama de pesos moleculares de 150-160 kD. El segundo anticuerpo N418, precipitó otro heterodímero aparente con subunidades que tenían pesos moleculares aproximados de 150 kD y 90 kD. Sobre la base de estudios de bloqueo de adhesión celular, se emitió la hipótesis de que el anticuerpo 2E6 reconocía una contrapartida murina a la CD18 humana. Si bien el peso molecular del antígeno N418 sugería el reconocimiento de un homólogo murino a la

\hbox{CD11c /}

CD18 humana, un análisis ulterior indicó que el antígeno murino presentaba un modelo de distribución tisular, que no se correspondía con el observado para la CD11c / CD18 humana.

Los antígenos reconocidos por el anticuerpo canino Ca11.8H2 y el anticuerpo murino N418 podían representar una especie variante (por ejemplo, una glicosilación o variante splice (empalme)) de una subunidad \alpha murina o canina previamente identificada.

Alternativamente, estos antígenos pueden representar subunidades únicas \alpha de la integrina canina y murina. En ausencia de información específica respecto de la estructura primaria, no se pueden distinguir estas alternativas.

En los humanos, CD11a / CD18 se expresan en todos los leucocitos. CD11b / CD18 y CD11c / CD18 limitan esencialmente la expresión en monocitos, granulocitos, macrófagos y linfocitos citolíticos naturales (NK), aunque también se detecta CD11c / CD18 en algunos tipos de célula B. En general CD11a / CD18 predomina en los linfocitos, CD11b / CD18 en granulocitos y CD11c / CD18 en los macrófagos [véase revisión, Arnaout, Blood 75: 1037-1050 (1990)]. No obstante, la expresión de las cadenas \alpha es variable con respecto al estado de activación y diferenciación de los tipos celulares individuales [véase revisión, Larson y Springer, Immunol. Rev. 114:181-217 (1990)].

Se ha demostrado la implicación de las integrinas \beta_{2} en las respuestas inflamatorias e inmunitarias humanas utilizando anticuerpos monoclonales, que son capaces de bloquear la adhesión celular asociada a la integrina \beta_{2}. Por ejemplo, CD11a / CD18, CD11b / CD18 y CD11c / CD18 participan activamente en la fijación del linfocito citolítico natural (NK) en células de linfoma y de Adenocarcinoma [Patarroyo, et al., Immunol.Rev.114:67-108 (1990)], la acumulación de granulocitos [Nourshargh, et al., J. Immunol. 142:3193-3198 (1989)], pérdida de plasma independiente de granulocito [Arfors, et al., Blood 69:338-340 (1987)], respuesta quimio táctica de leucocitos estimulados [Arfors, et al., supra] y adhesión de leucocitos al endotelio vascular [Price, et al., J. Immunol.139:4174-4177 (1987)] y Smith, et al., J. Clin. Invest. 83:2008-2017(1989)]. El papel fundamental de las integrinas \beta_{2} en respuestas inmunitarias e inflamatorias se pone de manifiesto en el síndrome clínico que recibe el nombre de deficiencia de adhesión leucocítica (LAD), donde las manifestaciones clínicas incluyen infecciones bacterianas recurrentes y que muchas veces ponen en peligro la vida del paciente. La LAD es el resultado de mutaciones heterogéneas y la subunidad \beta_{2} [Kishimoto, et al., Cell 50:193-202 (1987)] y la gravedad del estado patológico es proporcional al grado de la deficiencia en expresión de la subunidad \beta_{2}. La formación del heterodímero de integrina completo queda alterada por la mutación \beta_{2} [Kishimoto, et al., supra].

Dato interesante, por lo menos un anticuerpo específico de CD18, ha mostrado que inhibe la formación in vitro de sincitios por virus de inmuno deficiencia humana tipo 1 (VIH-1), aunque no está claro cuál es el mecanismo exacto de esta inhibición [Hildreth and Orentas, Science 244:1075-1078 (1989)]. Esta observación se corresponde con el descubrimiento de que un contra receptor principal de CD11a / CD18, ICAM-1 es también un receptor de superficie para el grupo principal de serotipos de rinovirus [Greve, et al., Cell 56:839 (1989)].

La importancia de la actividad de fijación de la integrina \beta_{2} en respuestas inmunitarias e inflamatorias humanas subrayan la necesidad de desarrollar una comprensión más completa de esta clase de proteínas de superficie. La identificación de miembros todavía desconocidos de esta sub-familia, así como sus contra-receptores, y la generación de anticuerpos monoclonales u otros factores solubles que pueden alterar la actividad biológica de las interinas \beta_{2} proporcionarán unos medios prácticos para la intervención terapéutica en respuestas inmunitarias e inflamatorias relacionadas con la integrina \beta_{2}.

Breve descripción de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos nuevos, purificados y aislados, (por ejemplo transcriptos ADN y ARN, ambas cadenas, sentido y anti sentido) que codifican una nueva subunidad \alpha de la integrina \beta_{2}, \alpha_{2}, y variantes de la misma (es decir, análogos de eliminación, adición o sustitución) que poseen propiedades de fijación y/o inmunológicas inherentes a \alpha_{d}. Según la presente invención, se presenta un polinucleótido \beta_{2} purificado y aislado que tiene la secuencia de codificación de proteína \alpha_{d} humana expuesta en SEQ ID NO: 1. Entre las moléculas preferidas de ADN de la invención, se encuentran: cADN, ADN genómico y moléculas de ADN total o parcialmente sintetizadas químicamente. Un polinucleótido actualmente preferido es el ADN expuesto en SEQ ID NO:1, que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2. También se ofrecen construcciones de ADN viral y plásmido recombinante (constructos de expresión), que incluyen secuencias de codificación \alpha_{d} de la invención, donde la secuencia de codificación \alpha_{d} está operativamente relacionada con un elemento o varios elementos de regulación transcripcional homólogo o heterólogo.

La presente invención también describe el aislamiento y la purificación de polinucleótidos de ratón y rata, que presentan homología con los polinucleótidos de purificación de \alpha_{2} humano. Un polinucleótido preferido de ratón de la invención se muestra en SEQ ID NO: 52; un polinucleótido preferido de rata de la invención se muestra en SEQ ID NO:54.

Como un aspecto ulterior de la invención se presentan células anfitriones procariotas o eucariotas o transfectadas con secuencias ADN de la invención que expresan polipéptido \alpha_{d} o variantes del mismo. Las células anfitrionas de la invención resultan particularmente útiles para la producción a gran escala de polipéptido \alpha_{d}, que se puede aislar de la célula anfitriona misma o del medio en el que se cultiva la célula anfitriona. Las células anfitrionas que expresan el polipéptido \alpha_{d} en la superficie de su membrana extracelular resultan también útiles como inmunogenes en la producción de anticuerpos específicos \alpha_{d}. De preferencia, las células anfitrionas transfectadas con \alpha_{d} se co-transfectarán para expresar una unidad de la integrina \beta_{2} con el fin de permitir la expresión superficial del heterodímero.

También se describe, en la presente invención, la purificación y el aislamiento de polipéptidos \alpha_{d}, fragmentos y variantes de los mismos. Según la invención, se presenta un polipéptido \alpha_{d} purificado y aislado que tiene la secuencia de amino ácido \alpha_{d} humano expuesto en SEQ ID NO: 2. Los nuevos productos \alpha_{d} de la invención se pueden obtener como elementos aislados de fuentes naturales si bien, junto con productos variantes de \alpha_{d}, aunque se producen de preferencia mediante procedimientos recombinantes, en los que participan células anfitrionas de la invención. Se pueden generar formas completamente glicosiladas, parcialmente glicosiladas o enteramente de-glicosiladas del polipéptido \alpha_{d} variando la célula anfitriona para la producción recombinante y/o el proceso posterior de aislamiento. Como variante de los polipéptidos \alpha_{d} de la invención se pueden citar los polipéptidos \alpha_{d} solubles e insolubles en agua, que incluyen análogos, en los que uno o más amino ácidos han sido eliminados o sustituidos: (1) sin pérdida, y de preferencia potenciando una o más actividades biológicas o características inmunológicas específicas de \alpha_{d}: o (2) con incapacitación específica de una función particular de fijación o señalización de ligando / receptor. También se presentan polipéptidos de fusión, donde las secuencias de amino ácido \alpha_{d} de la invención se expresan junto con secuencias de amino ácidos de otros polipéptidos. Estos polipéptidos de fusión pueden poseer propiedades biológicas, bioquímicas y/o inmunológicas modificadas en comparación con la \alpha_{d} natural. Se contemplan polipéptidos análogos que incluyen residuos de amino ácidos adicionales (por ejemplo lisina o cisteína) que facilitan la formación multímera.

También se describen polipéptidos y otras moléculas no-péptidas que se unen específicamente con el \alpha_{d} de la invención. Como moléculas preferidas de fijación, se pueden citar los anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales y policlonales), contra-receptores y (por ejemplo formas solubles y de membrana asociada) y otros ligandos (por ejemplo moléculas naturales o sintéticas), que incluyen aquellas que fijan de modo competitivo \alpha_{d} en presencia de anticuerpos monoclonales \alpha_{d} y/o contra-receptores específicos. Las moléculas de fijación resultan útiles para la purificación de polipéptidos \alpha_{d} y para la identificación de tipos de células que expresan \alpha_{d}. Las moléculas de fijación resultan útiles para modular (por ejemplo inhibir, bloquear o estimular) actividades transductoras de señales y/o de fijación in vivo de \alpha_{d}.

También se ofrecen ensayos para identificar moléculas de fijación \alpha_{d} que incluyen ensayos de fijación de ligando inmovilizado, ensayos de fijación de solución, ensayos de proximidad de centelleo, ensayos de selección / detección di-híbrida y similares.

Los ensayos in vitro para identificar anticuerpos u otros compuestos que modulan la actividad de \alpha_{d} pueden incluir por ejemplo la inmovilización de \alpha_{d} o de un ligando natural al que se une \alpha_{d}, el marcado detectable del otro elemento del enlace no inmovilizado, la incubación de los elementos del enlace juntos y la determinación del efecto de un compuesto de prueba sobre la cantidad de marca fijada, donde una reducción de la marca fijada en presencia del compuesto de test, comparado con la cantidad de marca fijada en ausencia del compuesto de test, indica que el agente de test es un inhibidor de la fijación de \alpha_{d}.

Otro tipo de ensayo para identificar compuestos que modulan la interacción entre \alpha_{d} de la invención y un ligando supone la inmovilización de \alpha_{d} o de un fragmento de la misma sobre un soporte sólido revestido (o impregnado con) un agente fluorescente, el marcado del ligando con un compuesto capaz de excitar el agente fluorescente, la puesta en contacto del \alpha_{d} inmovilizado con el ligando marcado en presencia y en ausencia de un compuesto modulador putativo, la detección de emisión de luz por el agente fluorescente y la identificación de compuestos de modulación como los compuestos que afectan la emisión de luz por parte del agente fluorescente, comparado con la emisión de luz por el agente fluorescente en ausencia de un compuesto de modulación. Alternativamente, se puede inmovilizar el ligando \alpha_{d} y marcarse \alpha_{d} en el ensayo.

Otro método contemplado para identificar compuestos que modulan la interacción entre \alpha_{d} y un ligando supone transformar o transfectar células anfitrionas adecuadas con un constructo ADN, que comprende un gen indicador bajo el control de un promotor regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de fijación de ADN y un dominio de activación, que expresa en las células anfitrionas una primera secuencia ADN híbrida que codifica una primera fusión de parte o todo el \alpha_{d} y, o bien el dominio de fijación ADN o el dominio de activación del factor de transcripción, que expresa en las células anfitrionas una segunda secuencia ADN híbrida que codifica parte o la totalidad del ligando y el dominio de fijación ADN o dominio de activación del factor de transcripción que no está incorporado en la primera fusión, que evalúa el efecto de un compuesto de modulación putativo sobre la interacción entre \alpha_{d} y el ligando, detectando la fijación del ligando a \alpha_{d} en una célula anfitriona particular, midiendo la producción de producto génico indicador en la célula anfitriona en presencia o en ausencia del modulador putativo, e identificado compuestos de modulación como aquellos compuestos que alteran la producción del producto génico indicador en comparación con la producción del producto génico indicador en ausencia del compuesto de modulación. Actualmente, se prefiere la utilización en el ensayo del promotor lexA, el dominio de fijación ADN lexA, el dominio de transactivación GAL4, el gen indicador lacZ y una célula anfitriona de levadura.

Una versión modificada del ensayo anterior se puede utilizar en el aislamiento de un polinucleótido que codifica una proteína que interacciona con \alpha_{d} de la invención transformando o transfectando células anfitrionas adecuadas con un constructo ADN que comprende un gen indicador bajo el control de un promotor regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de fijación ADN y un dominio de activación, que expresa en las células anfitrionas una primera secuencia ADN híbrida que codifica una primera fusión de parte o la totalidad del \alpha_{d} y, o bien el dominio de fijación ADN o el dominio de activación del factor de transcripción, expresando en las células anfitrionas una biblioteca de segundas secuencias ADN híbrida que codifican segundas fusiones de parte o de la totalidad de proteínas de fijación \alpha_{d} putativas y el dominio de fijación ADN o dominio de activación del factor de transcripción que no está incorporado en la primera fusión, detectando la interacción de una proteína de fijación de \alpha_{d} con \alpha_{d} en una célula anfitriona particular detectando la producción de un producto génico indicador en la célula anfitriona, y aislando segundas secuencias ADN híbridas que codifican la proteína de fijación \alpha_{d} a partir de la célula anfitriona particular.

Las líneas celulares hibridomas que producen anticuerpos específicos de \alpha_{d} de la invención también son contempladas por la invención. Las técnicas para producir hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales son bien conocidas en el estado de la técnica. Las líneas celulares de hibridomas se pueden general tras inmunizar un animal con \alpha_{d} purificado, variantes de \alpha_{d} o células que expresan \alpha_{d} o una variante del mismo sobre la superficie de la membrana extracelular. Los tipos celulares inmunógenos incluyen células que expresan \alpha_{d} in vivo o líneas celulares procariotas o eucariotas transfectadas que no expresan normalmente \alpha_{d} in vivo.

El valor de la información aportada por la descripción de las secuencias de ADN y amino ácido de \alpha_{d} es evidente. En una serie de ejemplos, la secuencia descrita CADN \alpha_{d} hace posible el aislamiento de la secuencia de ADN genómico de \alpha_{d} humana, que incluye elementos de control transcripcional para la secuencia genómica. También contempla la identificación de variantes alélicos y ADN de especies heterólogas (por ejemplo rata o ratón). El aislamiento de ADN genómico de \alpha_{d} humano y ADN de especies heterólogas se puede realizar por medio de técnicas de hibridación standard ADN / ADN, en condiciones adecuadamente rigurosas, utilizando la totalidad o parte de la secuencia cADN \alpha_{d} como sonda para el cribaje de una biblioteca adecuada. Alternativamente, se puede utilizar la reacción de cadena de polimerasa (PCR) que utiliza iniciadores oligonucleótidos, designados sobre la base de la conocida secuencia cADN, para amplificar e identificar secuencias ADN \alpha_{d} genómicas. Se pueden producir mediante métodos de síntesis convencionales ADNs sintéticos que codifican el polipéptido \alpha_{d}, inclusive fragmentos u otras variantes del mismo.

La información de la secuencia ADN de la invención también hace posible el desarrollo, por medio de recombinación homologa o estrategias "knockout" [véase por ejemplo Kapecchi, Science 244:1288-1292 (1989)], para producir roedores que no expresan un polipéptido \alpha_{d} funcional o que expresan un polipéptido \alpha_{d} variante. Estos roedores resultan útiles como modelos para estudiar las actividades de \alpha_{d} y moduladores \alpha_{d} in vivo.

Las secuencias de amino ácido y ADN de la invención también hacen posible el análisis de epítopos \alpha_{d} que participan activamente en la fijación de contra receptor así como epítopos que pueden regular en lugar de participar activamente en la fijación. La identificación de epítopos que pueden participar en la transducción de señal transmembrana también se contempla en la invención.

El ADN de la invención resulta también útil para la detección de tipos de células que expresan polipéptido \alpha_{d}. Las técnicas de hibridación standard ADN / ARN que utilizan un ADN de \alpha_{d} para detectar ARN de \alpha_{d} se pueden utilizar para determinar el nivel constitutivo de transcripción de \alpha_{d} dentro de una célula, así como los cambios en el nivel de transcripción en respuesta a agentes internos o externos. La identificación de agentes que modifican la transcripción y/o la traducción de \alpha_{d} puede evaluarse a su vez para determinar su valor profiláctico o terapéutico potencial. El ADN de la invención también hace posible la hibridación in situ de ADN de \alpha_{d} en ARN celular para determinar la localización celular de mensajes específicos de \alpha_{d} dentro de poblaciones celulares complejas y tejidos.

El ADN de la invención resulta también útil para identificar secuencias de polinucleótido no humano que presenta homología con secuencias humanas de \alpha_{d}. La posesión de secuencias ADN de \alpha_{d} no humano permite desarrollar modelos animales (inclusive, por ejemplos transgénicos) del sistema humano.

Según otro aspecto, se puede utilizar anticuerpos monoclonales o policlonales específicos de \alpha_{d} de la invención en el análisis inmuno-histoquímico para localizar \alpha_{d} en compartimentos subcelulares o células individuales dentro de tejidos. Los análisis inmuno-histoquímicos de este tipo resultan particularmente útiles cuando se utilizan en combinación con la hibridación in situ para localizar mARN de \alpha_{d} y productos polipéptidos del gen de \alpha_{d}.

La identificación de tipos celulares que expresan \alpha_{d} pueden tener ramificaciones significativas para el desarrollo de agentes terapéuticos y profilácticos. Se prevé que los productos de la invención relacionados con \alpha_{d} se pueden utilizar en el tratamiento de patologías en la que los macrófagos son un elemento esencial de dicha patología. En el estado de la técnica, se han descrito modelos animales para muchos estados patológicos asociados con actividad de macrófagos. Así por ejemplo Jutila, et al., J. Leukocyte Biol.54:30-39 (1993). Describe el reclutamiento macrofago, en ratones a zonas de infamación crónica y aguda. En ratas, Adams et al., [Transplantation 53:1115-1119 (1992 y Transplantation 56:794-799 (1993)] describen un modelo para arterosclerosis de transplante tras alo-transplante cardiaco abdominal heterotrópico. Rosenfeld, et al., [Arteriosclerosis 7:9-23 (1987) y Arteriosclerosis 7:24-34 (1987)] describen la aterosclerosis inducida en conejos alimentados con una dieta suplementada con colesterol. Hanenberg, et al., [Diabetología 32:126-134 (1989)] informan del desarrollo espontáneo de diabetes dependiente de insulina en ratas BB. Yamada et al., Gastroenterology 104:759-771 (1993)] describen una patología intestinal inflamatoria inducida, colitis granulomatosa crónica en ratas tras la inyección de polímeros de péptido glucan-polisacárido estreptocócicos. Cromartie, et al [J.Exp.Med. 146:1585-1602 (1977)] y Schwab, et al., [Infection and Immunity 59:4436-4442 (1991)] informan que la inyección en ratas de proteína de pared celular estreptocócica tiene como resultado un estado artrítico caracterizado por la inflamación de las articulaciones periféricas y la subsiguiente destrucción de las articulaciones. Finalmente, Huitinga et al., [Eur.J.lmmunol 23:709-715 (1993) describen la encéfalo mielitis alérgica experimental, un modelo para esclerosis múltiple, en ratas Lewis. En cada uno de estos modelos, se utilizan anticuerpos de \alpha_{d}, otras proteínas de fijación de \alpha_{d} o formas solubles de \alpha_{d} para atenuar el estado patológico, al parecer por inactivación de la actividad macrófaga.

La invención presenta composiciones farmacéuticas para el tratamiento de estos estados patológicos y de otros. Las composiciones farmacéuticas están diseñadas para inhibir la interacción de \alpha_{d} y su(s) ligando (s) e incluye varias formas solubles y asociadas a membrana de \alpha_{d} (que incluyen la totalidad del polipéptido de \alpha_{d} o fragmentos del mismo, que participan activamente en la fijación de \alpha_{d}) formas solubles y asociadas a membrana de proteína de \alpha_{d} (inclusive anticuerpos, ligandos y similares) moduladores intracelulares o extracelulares de la actividad de \alpha_{d}, y/o moduladores de \alpha_{d} y/o polipéptido de ligando de \alpha_{d}, inclusive moduladores de transcripción, traducción, proceso post-traducción y/o transporte intracelular. La invención también describe métodos para el tratamiento de estados patológicos en los cuales está implicada la fijación de \alpha_{d} y donde se proporciona a un paciente que padece uno de esos estados patológicos cierta cantidad de composición farmacéutica de la invención suficiente para modular los niveles de fijación de \alpha. El método de tratamiento es aplicable a estados patológicos (sin que esto suponga limitación) como diabetes tipo I, aterosclerosis, esclerosis múltiple, asma, psoriasis y artritis reumatoide.

Breve descripción de la figura

Otros muchos aspectos y ventajas de la presente invención se podrán apreciar en la siguiente descripción, en la que se hace referencia a la figura, donde:

La figura 1A a 1D comprende una alineación de las secuencias de amino ácidos humanos de CD11b (SEQ ID NO:3), CD11c (SEQ ID NO: 4) y \alpha_{d} (SEQ ID NO: 2).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos, relativos al aislamiento de un clon cADN que codifica \alpha_{d} de una biblioteca de cADN de bazo humano. Más particularmente, el ejemplo 1 ilustra la utilización de anticuerpo anticanino \alpha_{TM1} en un intento de detectar una proteína humana homóloga. El ejemplo 2 detalla la purificación de \alpha_{TM1} canino y la secuenciación N-terminal del polipéptido para diseñar iniciadores oligonucleótido para la amplificación PCR del gen de \alpha_{TM1} canino. El ejemplo 3 se refiere a la purificación a gran escala de \alpha_{TM1} canino para secuenciación interna con el objeto de diseñar iniciadores PCR adicionales. El ejemplo 4 describe la utilización del PCR y iniciadores de secuencia interna para ampliar un fragmento del gen de \alpha_{TM1} canino. El ejemplo 5 se refiere a la clonación de la secuencia de cADN de codificación de \alpha_{d} humano. El ejemplo 6 describe el análisis de hibridación de transferencia de Northern de tejidos y células humanas para la expresión de mARN de \alpha_{d}. El ejemplo 7 detalla la construcción de plasmidos de expresión de \alpha_{d} humano y la transfección de células COS con los plásmidos resultantes. El ejemplo 8 se refiere al análisis ELISA de expresión de \alpha_{d} en células COS transfectadas. El ejemplo 9 describe el análisis FACS de células COS transfectadas con plásmidos de expresión de \alpha_{d} humano. El ejemplo 10 se refiere a la inmuno precipitación de CD18 en asociación con \alpha_{d} en células COS co-transfectadas. El ejemplo 11 se refiere a la transfección estable de constructos de expresión de \alpha_{d} en células de ovarios de hámster chino. El ejemplo 12 se refiere a la interacción dependiente de CD18 de \alpha_{d} con la molécula de adhesión intercelular, ICAM-R. El ejemplo 13 describe ensayos de detección de proximidad por centelleo para identificar inhibidores de interacciones de fijación ligando / anti ligando de \alpha_{d}. El ejemplo 14 se refiere a la construcción de plásmidos de expresión, que codifican formas solubles de \alpha_{d}. El ejemplo 15 se refiere a la producción de anticuerpos monoclonales \alpha_{d}-específicos. El ejemplo 16 describe el análisis de la distribución tisular de \alpha_{d} utilizando antisuero policlonal. El ejemplo 17 describe el aislamiento de secuencias cADN de rata, que muestran homología con secuencias génicas de \alpha_{d} humano. El ejemplo 18 se refiere a la construcción de plásmidos de expresión de dominio I de \alpha_{d} de rata, que incluye proteínas de fusión dominio I/IgG y la producción de anticuerpos monoclonales a proteínas de fusión de dominio I. El ejemplo 19 se refiere al aislamiento de secuencias cADN de ratón que muestran homología con secuencias génicas de \alpha_{d} humano. El ejemplo 20 describe el aislamiento de clones de cADN de \alpha_{d} adicionales de ratón utilizados para el análisis de secuencia conformacional. El ejemplo 21 se refiere al análisis de hibridación in situ de diversos tejidos de ratón para determinar la expresión específica del tejido y la célula del ratón putativo homólogo al \alpha_{d} humano. El ejemplo 22 describe la generación de constructos de expresión que codifican el homólogo de ratón putativo del \alpha_{d} humano. El ejemplo 23 se refiere al diseño de un ratón "knock-out" donde se destruye el gen que codifica el homólogo de ratón putativo del \alpha_{d} humano. El ejemplo 24 describe el aislamiento de clones de cADN de conejo que muestran homología con secuencias de codificación de \alpha_{d} humano. El ejemplo 25 describe modelos animales que se asemejan a estados patológicos humanos donde se prueba la modulación de \alpha_{d} para conocer sus posibilidades terapéuticas.

Ejemplo 1 Intento de detectar un homólogo humano de \alpha_{TM1} canino

El anticuerpo monoclonal Ca11.8H2 [Moore, et al., supra] específico de \alpha_{TM1} canino se sometió a prueba para comprobar la reactividad cruzada sobre leucocitos periféricos humanos, en un intento de identificar homólogo humano de \alpha_{TM1} canino. Se incubaron preparaciones celulares (por lo general 1 x 10^{6} células) con hibridona no diluida sobrenadante o un anticuerpo de control negativo-IgG de ratón purificado (10 µg/ml) sobre hielo, en presencia de 0,1% de azida sódica. Se detectó la fijación del anticuerpo monoclonal por incubación subsiguiente con IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) antiratón caballo conjugado-FITC, a 6 \mug/ml. Se fijaron células coloreadas con 2% w/v (p/v) de para-formaldehido en solución salina con tampón de fosfato (PBS) y se analizaron con un separador-analizador celular activado por fluorescencia Facstar Plus (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se analizó la intensidad de fluorescencia, por lo general, de 10.000 células utilizando ampliación logarítmica.

Los resultados indicaron que Ca11.8H2 no tenía una reacción cruzada con proteínas de superficie expresadas sobre leucocitos de sangre periférica humana, mientras que las células de control, linfocitos de sangre periférica canina, neoplásicos eran prácticamente rodos positivos para \alpha_{TM1}.

Debido a que el anticuerpo monoclonal Ca11.8H2 específico de la subunidad de \alpha canina no tenía una reacción cruzada con un homólogo humano, se consideró que era requisito previo necesario el aislamiento de ADN de \alpha_{TM1} canino para aislar un gen humano de contrapartida, si existía alguno.

Ejemplo 2 Purificación por afinidad de \alpha_{TM1} canino para la secuenciación terminal N

Se purificó por afinidad \alpha_{TM1} canino, con el fin de determinar las secuencias de amino ácido N-terminal para el diseño de sonda de oligonucleótido / iniciador. En suma, se acopló anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{TM1} Ca11.8H2 con resina cromatográfica Affigel 10 (BioRad, Hercules, CA) y se aisló proteína por medio de interacción específica anticuerpo-proteína. El anticuerpo se conjugó con la resina, según el protocolo sugerido por BioRad, a una concentración de aproximadamente 5 mg de anticuerpo por ml de resina. Tras la reacción de conjugación, se quitó el anticuerpo excedente y la resina se bloqueó con tres volúmenes de 0,1 M etanol amina. La resina se lavó entonces con 30 volúmenes de columna de solución salina con tampón de fosfato (PBS).

Se homogeneizaron 25 g de un solo bazo de perro en 250 ml de tampón que contenía 0,32 M sucrosa en 25 mM Tris-HCl, Ph 8,0 con inhibidores de proteasa. Los núcleos y residuos celulares se granularon con centrifugación a 1000 g durante 15 minutos. Se granularon membranas del sobrenadante con centrifugación a 100.000 g durante 30 minutos. El gránulo de membrana se resuspendió en 200 ml de tampón de lisis (50 mM NaCl, 50 mM borato, pH 8,0, con 2% NP-40) y se incubó durante una hora sobre hielo. El material insoluble se granuló entonces por centrifugación a 100.000 g durante 60 minutos. Se transfirieron 10 ml del lisato clarificado a un tubo de polipropileno de 15 ml con 0,5 ml de la resina Affigel 10 Ca11.8H2-conjugada descrita anteriormente. El tubo se incubó durante la noche a 4ºC con rotación y la resina se lavó ulteriormente con 50 volúmenes de columna de D-PBS. La resina se transfirió entonces a un tubo de microfuga y se hirvió durante 10 minutos en 1 ml de tampón de muestra Laemmli (no reductor), que contenía 0,1 M Tris-HCl, pH 6,82, 2% SDS, 20% de glicerol y 0,002% de azul de bromo fenol. La resina se granuló por centrifugación y se descartó; el sobrenadante se trató con 1/15 volumen de \beta-mercapto etanol (Sigma, St. Louis, MO) y se vertió sobre 7% de gel de poliacrilamida. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA) según se indica a continuación.

Los geles se lavaron una vez en agua desionizada y filtrada por Millipore y se equilibraron durante 15-45 minutos en 10 mM de tampón de transferencia ácido 3-[ciclo hexil amino]-1-propano sulfónico (CAPS), pH 10,5, con 10% de metanol. Las membranas de Immobilon se humedecieron con metanol, se enjuagaron con agua filtrada y se equilibraron durante 15-30 minutos en tampón de transferencia CAPS. La transferencia inicial se realizó utilizando un aparato de transferencia BioRad a 70 voltios durante 3 horas. La membrana Immobilon se quitó después de la transferencia y se tiñó en tinte filtrado 0,1% R250 Coomassie durante 15 minutos. Las membranas se descolorearon en 50% de metanol / 10% de ácido acético tres veces, y durante diez minutos cada vez. Después de la descoloración, las membranas se lavaron en agua filtrada y se secaron con aire.

Se detectaron bandas de proteínas de aproximadamente 150 kD, 95 kD, 50 kD y 30 kD. Al parecer las bandas de 50 kD y 30 kD eran el resultado de contaminación por anticuerpo. Se intentó entonces la secuenciación N-terminal en las bandas 150 kD y 95 kD, pero se bloqueó la proteína 95 kD, impidiendo la secuenciación. La banda de proteína de 150 kD se extrajo de la membrana y se secuenció directamente con un secuenciador de proteína Modelo 473A de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La secuencia de amino ácidos se muestra en SEQ ID NO: 5 utilizando designaciones de amino ácido de una sola letra.

FNLDVEEPMVFQ

(SEQ ID NO:5)

La secuencia identificada incluía la secuencia FNLD característica de subunidades de \alpha de la familia de las integrinas [Tamura, et al., J.Cell.Biol. 111:1593-1604 (1990)].

Diseño de iniciador e intento de ampliar las secuencias de \alpha_{TM1} canina

Partiendo de la información secuencia N-terminal, se diseñaron tres sondas de oligonucleótido para la hibridación: a) "Tommer" un oligo nucleótido enteramente degenerado; b) "Patmer" un oligo nucleótido parcialmente degenerado y c) "Guessmer" un oligo nucleótido no degenerado basado en el uso de codón de mamífero. Estas sondas se muestran a continuación como SEQ ID NOS: 6, 7 y 8, respectivamente. Los símbolos del ácido nucleico tienen en cuenta el artículo 1.882 de 37 C.F.R para estas secuencias y todas las demás secuencias de nucleotídos aquí indicadas.

\newpage

5'-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3	(SEQ ID NO:6)

5'-TTCAACCTGGACGTGGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3	(SEQ ID NO:7)

5'-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGCTTCCAA-3	(SEQ ID NO:8)

Sobre la base de los datos de secuenciación no se detectaron clones relevantes utilizando estos oligo nucleótidos en diversas hibridaciones de baja rigurosidad en una biblioteca de cADN macrofago sangre periférica / bazo canino clonada en \lambdaZAP (Stratagene, La Jolla, CA).

Cuatro iniciadores de oligo nucleótido más, designados 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg y 3'Spec (según se indica en SEQ ID NOS: 9, 10, 11 y 12, respectivamente, donde Deg indica degenerado y Spec indica no degenerado) fueron diseñados ulteriormente sobre la base de la secuencia N-terminal deducida en un intento de ampliar secuencias de \alpha_{TM1} canino por PCR de ADN de librería fago purificado procedente de lisatos en placas de la biblioteca Stratagene descrita anteriormente.

5'-TTYAAYYTNGAYGTNGARCARCC-3'	(SEQ ID NO: 9)

5'-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3'	(SEQ ID NO: 10)

5'-TGRAANACCATNGGYTC-3'	(SEQ ID NO: 11)

5'-TTGGAAGACCATNGGYTC-3'	(SEQ IN NO: 12)

Los iniciadores de oligo nucleótido \alpha_{TM1} se emparejaron con iniciadores de vector T3 o T7 tal como se indica en SEQ ID NOS: 13 Y 14, respectivamente, que se hibridan en secuencias que flanquea la región polienlace en el fagómido Bluescript encontrado en \lambdaZAP.

5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'	(SEQ ID NO: 13)

5-'AATACGACTCACTATAG-3'	(SEQ ID NO: 14)

La ampliación PCR se realizó en tampón Taq (Boehringer Mannheim,. Indianápolis, IN) que contenía magnesio con 150 ng de ADN de biblioteca, 1 \mug de cada iniciador, 200 \muM dNTPs y 2,5 unidades de polimerasa Taq (Boehringer Mannheim) y se separaron los productos por electrofóresis sobre un gel agarosa 1% en tampón Tris-acetato EDTA (TAE) con 0,25 \mug/ml de bromuro de etidio. El ADN se transfirió a una membrana Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL) rotando (wicking) durante la noche en 10X SSPE. Después de la transferencia, se desnaturalizó el ADN inmovilizado con 0,5 M NaOH con 0,6 M NaCl, se neutralizó con 1,0 M Tris-HCl, pH 8,0 en 1,5 M NaCl, y se lavó con 2X SSPE antes de proceder a la reticulación UV con un aparato de reticulación Stratalinker (Stratagene). La membrana se incubó en tampón de pre-hibridación (5X SSPE, 4X Denhardts, 0,8% SDS, 30% formamida) durante 2 horas 50ºC, agitando.

Las sondas de oligo nucleótido 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg y 3'Spec (SEQ ID NOS: 9, 10, 11 y 12, respectivamente) se marcaron utilizando un tampón de quinasa Boehringer Mannheim con 100-300 \muCi \gammaP^{32}-dATP y 1-3 unidades de quinasa de polinucleótido durante 1-3 horas a 37ºC. Se quitó la marca no incorporada con cromatografía fina Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM tampón EDTA (TE) y lo que había pasado (flow-through) se añadió directamente a la solución de pre-hibridación. Las membranas se sondearon durante 16 horas a 42ºC con agitación y se lavaron repetidas veces, con un lavado final riguroso de 1X SSPE/0,1% SDS a 50ºC durante 15 minutos. Se expuso entonces la transferencia (blot) a película Kodak X-Omat AR durante 1-4 horas a -80ºC.

Los oligo nucleótidos 5'Deg, 5'Spec, 3'Deg y 3'Spec únicamente se hibridaron a productos PCR desde las reacciones en las que se utilizaban como iniciadores y dejaron de hibridarse según lo esperado a productos PCR desde las reacciones en las cuales no se utilizaron como iniciadores. Por consiguiente, se sacó la conclusión de que ninguno de los productos PCR era específico de \alpha_{TM1} debido a que ningún producto se hibridó con la totalidad de las sondas adecuadas.

Ejemplo 3 Purificación por afinidad a gran escala de \alpha_{TM1} canino para secuenciación interna

Con el objeto de proporcionar una secuencia de amino ácidos adicional para diseño de iniciadores, se purificó \alpha_{TM1} canino para la secuenciación interna. Se utilizaron tres secciones de bazo congelado (aproximadamente 50 g cada uno) y células congeladas de dos bazos parciales de perros adultos para generar proteína para la secuenciación interna. Se homogeneizaron con 50 g de bazo en 200-300 ml de tampón de borato con un mezclador Waring (blender). El material homogeneizado se diluyó con un volumen de tampón que contenía 4% NP-40, y la mezcla se agitó suavemente durante por lo menos una hora. Se quitaron los residuos grandes del lisato resultante por centrifugación a 2000 g durante 20 minutos y luego se filtró a través de un pre-filtro Corning (Corning, NY) o un filtro Corning de 0,8 micras. El lisato se siguió aclarando por filtración a través del sistema de filtro Corning de 0,4 micras.

Se combinaron lisato esplénico y la resina Affigel 10 anticuerpo-conjugada descrita en el ejemplo 2 con una relación de volúmenes de 150:1 en partes de 100 ml y se incubaron durante la noche a 4ºC con balanceo. El lisato se quitó después de la centrifugación a 1000 g durante 5 minutos, se combinó con más resina Affigel 10, anticuerpo-conjugada y se incubó durante la noche según lo indicado anteriormente. La parte de resina absorbida se combinó entonces y se lavó con 50 volúmenes D-PBS/0,1% Tween 20 y la resina se transfirió a una columna BioRad de 50 ml. La proteína adsorbida se eluyó de la resina con 3-5 volúmenes de 0,1 M glicina (pH 2,5); se recogieron fracciones de aproximadamente 900 \mul y se neutralizaron con 100 \mul de 1 M Tris tampón, pH 8,0. Se quitaron de cada fracción partes de 15 \mul y se hirvieron en un volumen igual de tampón de muestra 2X Laemmli con 1/15 volúmenes de 1 M ditiotreitol (DTT). Estas muestras se sometieron a electrofóresis sobre 8% de geles de poliacrilamida Novex (San Diego, CA) y se visualizaron por coloración Coomassie o por coloración plaqueada utilizando un kit Daiichi (Enprotech, Natick, MA) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se combinaron y concentraron con vacío fracciones que contenían las cantidades más grandes de proteína. La solución restante se diluyó un 50% reduciendo el tampón de muestra Laemmli y se virtió sobre 1,5 ml de geles de poli acril amida al 7% en Tris – glicina / tampón SDS. La proteína se transfirió de los geles a la membrana Immobilon utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 2 y el aparato de transferencia Hoefer.

Se extrajeron de 10 membranas PVDF las bandas de proteína correspondientes a \alpha_{TM1} canino, obteniéndose aproximadamente 47 \mug de proteína total. Las bandas se descolorearon en 4 ml de metanol al 50% durante 5 minutos, se secaron al aire y se cortaron en trozos de 1 x 2 mm. Los trozos de membrana se sumergieron en 2 ml de acetona al 95% a 4ºC durante 30 minutos, con vórtice ocasional y luego se secaron al aire.

Antes de la separación proteolítica de la proteína ligada a la membrana, se disolvieron 3 mg de bromuro de cianógeno (CNBr) (Pierce, Rockford, IL) en 1,25 ml de ácido fórmico al 70%. Esta solución se añadió entonces a un tubo que contenía los trozos de membrana de PVDF y se incubó el tubo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas. Se quitó entonces el sobrenadante (S1) y se puso en otro tubo, y los trozos de membrana se lavaron con 0,25 ml de ácido fórmico al 70%. Se quitó este sobrenadante (S2) y se añadió al sobrenadante anterior (S1). Se añadieron 2 ml de agua Milli Q a los sobrenadantes combinados (S1 y S2) y se liofilizó la solución. Los trozos de membrana de PVDF se secaron bajo nitrógeno y se extrajeron nuevamente con 1,25 ml de aceto nitrilo al 60%, 0,1% ácido tetra fluor acético (TFA) a 42ºC durante 17 horas.

Se quitó este sobrenadante (S3) y los trozos de membrana se extrajeron nuevamente con 1,0 ml de aceto nitrilo al 80% con 0,08% TFA a 42ºC durante 1 hora. Este sobrenadante (S4) se combinó con el sobrenadante anterior (S1, S2 y S3) y se secó al vacío.

Los fragmentos secos de CNBr se disolvieron entonces en 63 \mul de 8 M urea, 0,4 M NH_{4}HCO_{3}. Los fragmentos se redujeron en 5 \mul de 45 mM ditiotreitol (DTT) y ulteriormente se incubaron a 60ºC durante 15 minutos. La solución se enfrió entonces a temperatura ambiente y los fragmentos se sometieron a alquilación añadiendo 5 \mul de 100 mM iodoacetamida (Sigma, St. Louis MO). Tras una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, se diluyó la muestra con 187 \mul de agua Milli Q hasta una concentración final de urea de 2,0 M. Se añadió entonces tripsina (Worthington, Freehold, NJ) a razón de 1:25 (p:p) de enzima / proteína y la proteína se sometió a digestión durante 24 horas a 37ºC. La digestión se terminó añadiendo 30 \mul de TFA.

Los fragmentos de proteínas se separaron entonces con cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en un sistema Waters 625 LC(Millipore, Milford, MA) utilizando una columna Vydac C-18 de 5 micras, de 2,1 x 250 mm (Vydac, Hesperia, CA) equilibrada en 0,05% TFA y agua HPLC (tampón A). Los péptidos se eluyeron con una concentración creciente de 80% de aceto nitrilo en 0,04% TFA (tampón B) con un gradiente de 38-75% tampón B durante 65-95 minutos y 75-98% tampón B durante 95-105 minutos. Se fraccionaron péptidos a un caudal de 0,02 ml / minuto y se detectaron a 210 nm.

Tras el fraccionamiento, se analizó la secuencia de amino ácidos de los péptidos por medio de degradación automática Edman realizada en un secuenciador de proteína Applied Biosystems Model 437A, utilizando los ciclos standard del fabricante y el programa de software de Model 610A Data Analysis, versión 1.2.1. Todos los reactivos de secuenciación fueron suministrados por Applied Biosystems. Las secuencias de amino ácidos de siete de los ocho fragmentos internos se indican a continuación, donde "X" indica que no se estaba seguro de la identidad del amino ácido.

VFQEXGAGFGQ	(SEQ ID NO: 15)

LYDXWAATGLXQPI	(SEQ ID NO: 16)

PLEYXDVIPQAE	(SEQ ID NO: 17)

FQEGSFSXVLV	(SEQ ID NO: 18)

TSPTFIMSQENVD	(SEQ ID NO: 19)

LWGAPLEWAVXQTGR	(SEQ ID NO: 20)

LDXKPXDTA	(SEQ ID NO: 21)

Diseño de iniciador

Se utilizó entonces una secuencia interna de amino ácidos (expuesta en SEQ ID NO: 22) que se había obtenido, para diseñar un iniciador de oligo nucleótido enteramente degenerado, designado p4(R) según se indica en SEQ ID NO: 23.

FGEQFSE	(SEQ ID NO: 22)

5'-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3'	(SEQ ID NO: 23)

Ejemplo 4 Clonación PCR de un fragmento de \alpha_{TM1} canino

La porción 5' del gen \alpha_{TM1} canino se amplificó por PCR de cADN esplénico canino de doble cadena.

A. Generación de cADN de bazo canino de doble cadena

Se pulverizó un gramo de material congelado de bazo de un perro joven en nitrógeno líquido sobre hielo seco y se homogeneizó en 20 ml de tampón ARN-Stat 60 buffer (Tel-Test B, Inc, Friendswood, TX). Se añadieron 4 ml de cloroformo y se extrajo la solución por centrifugación a 12.000 g durante 15 minutos. Se precipitó ARN de la capa acuosa con 10 ml de etanol. Se seleccionó entonces poli A^{+} ARN sobre Dynal Oligo dT Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega). Se combinaron 5 partes de 100 \mug de ARN total y se diluyeron con un volumen igual de tampón de fijación 2X (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Se incubó entonces ARN 5 minutos con el Oligo dT Dynabeads (perlas de 1,0 ml o 5 mg para todas las muestras). Se lavaron las perlas con tampón que contenía 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA y 0,1% SDS, según el protocolo sugerido por el fabricante antes de la elusión de poli A^{+} mARN con 2 mM EDTA, pH 7,5. Se generó entonces cADN de doble cadena utilizando el poli A^{+} mARN eluido y el kit de síntesis cADN de Boehringer Mannheim según el protocolo sugerido por el fabricante.

B. Aislamiento de cADN de \alpha_{TM1} canino parcial

Se utilizaron iniciadores de oligo nucleótido 5'Deg (SEQ ID NO: 9) y p4(R) (SEQ ID NO: 23) en una reacción standard PCR utilizando 150 ng de cADN de doble cadena, 500 ng de cada iniciador, 200 \muM dNTPs y 1,5 unidades Taq polimerasa (Boehringer Mannheim) en tampón Taq (Boehringer Mannheim) con magnesio. Los productos resultantes (1 \mul de la reacción original) se sometieron a una segunda ronda de PCR con los mismos iniciadores para aumentar el rendimiento del producto. Esta banda se eluyó de un gel de agarosa 1% sobre papel NA45 Schleicher & Schuell (Keene, NH) en un tampón que contenía 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl a 65ºC, se precipitó y ligó en el vector PCR^{tm}II (Invitrogen, San Diego, CA) utilizando el kit de clonación TA (Invitrogen) y el protocolo sugerido por el fabricante. La mezcla de ligadura se transformó por electroporación en XL-1 Blue bacteria (Stratagene). Se determinó que un clon, 2.7, contenía secuencias correspondientes a secuencias de péptido \alpha_{TM1} que no se utilizaban en el diseño de los iniciadores.

La secuenciación se realizó con un secuenciador Applied Biosystems 373A DNA (Foster City, CA) con un kit de secuencia de ciclo Dye-deoxy terminator (ABI) en el que se incorporaron dNTPs con marca fluorescente en una reacción asimétrica PCR [McCabe, "Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR", en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicationst Innis, et al.(eds.) pp. 76-83 Academic Press: New York (1990)] según se indica a continuación. Las muestras se mantuvieron a 92ºC durante 4 minutos y se sometieron a 25 ciclos de secuencia gradual: 96ºC, durante 15 segundos; 50ºC durante 1 segundo; 60ºC durante 4 minutos. Los datos de las secuencias se bajaron automáticamente en archivos de muestras del ordenador que incluían cromatograma y archivos de texto. La secuencia del inserto completo del clon 2.7 se expone en SEQ ID NO: 24.

No tuvieron éxito los intentos realizados para aislar el cADN del \alpha_{TM1} canino en toda su longitud de la biblioteca Stratagene (según se describe en el ejemplo 2). Se detectaron aproximadamente 1 x 10^{6} placas de fago por hibridación en condiciones de poca rugosidad utilizando 30% de formamida con clon 2,7 como sonda, aunque no se obtuvieron como resultado clones positivos. Tampoco tuvieron éxito los intentos para amplificar secuencias relevantes "downstream" de las representadas en el clon 2.7 utilizando oligonucleótidos específicos derivados de clon 2.7 o iniciadores degenerados basados en secuencia de amino ácidos de otros fragmentos de péptidos emparejados con un oligo nucleótido degenerado sobre la base del motivo de amino ácido de la subunidad a conservado GFFKR [Tamura, et al., supra].

Ejemplo 5 Clonación de un homólogo humano putativo de \alpha_{TM1} canino

En el intento de aislar una secuencia humana homóloga de \alpha_{TM1} canino, se utilizó como sonda el fragmento de \alpha_{TM1} canino de aproximadamente 1 kb del clon 2.7. La sonda se generó por PCR en las condiciones descritas en el ejemplo 2 utilizando NT2 (según lo indicado en SEQ ID NO: 25) e iniciadores p4(R) (SEQ ID NO: 23).

5'-GTNTTYCARCARGAYGG-3'

(SEQ ID NO: 25)

El producto PCR se purificó utilizando el kit Quick Spin Qiagen (Chastworth, GA) y el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN purificado (200 ng) se marcó con 200 \muCi \alpha^{32} PdCTP utilizando el kit de Boehringer Mannheim Randon Prime Labelling, así como el protocolo sugerido por el fabricante. Se eliminó el isótopo no incorporado con cromatografía por gravedad (fina) Sephadex G25. La sonda se desnaturalizó con 0,2 NaOH y se neutralizó con 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0 antes de usar.

Se prepararon siembras por réplica (colony lifts) sobre filtros Hybond (Amersham) de una biblioteca cADN de bazo humano en pCADN / Amp (Invitrogen, San Diego, CA). Los filtros se desnaturalizaron inicialmente y se neutralizaron en la forma descrita en el ejemplo 2 y ulteriormente se incubaron en una solución de pre-hibridación (8 ml/filtro) con 30% de formamida a 50ºC agitando suavemente durante dos horas. Se añadió a esta solución la sonda marcada tal como se describe anteriormente y se incubó con los filtros durante 14 horas a 42ºC. Los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/0,1% SDS a 37ºC y dos veces en 2X SSC/0,1% SDS a 50ºC. Los lavados finales rigurosos fueron 1X SSC/0,1% SDS, dos veces a 65ºC (1X SCC es 150 mM NaCl, 15 mM citrato sódico, pH 7,0). Los filtros se expusieron a película Kodak X-Omat AR durante 6 horas con una pantalla reforzadora. Las colonias que daban señales sobre "lifts" (siembras) duplicados se estriaron sobre placas de medio LB con magnesio (LBM) / carbenicilina y se incubaron durante la noche a 37ºC. Las colonias estriadas resultantes se "lifted" con filtros Hybond y estos filtros se trataron en la misma forma que antes. Los filtros se hibridaron en condiciones más rigurosas con la sonda 1 kb del clon 2,7, se marcaron en la forma descrita anteriormente, en una solución de hibridación de formamida al 50% a 50ºC durante 3 horas. Los filtros sondados se lavaron con rigurosidad final de 0,1 X SSC/0,1% SDS a 65ºC y se expusieron a una película Kodak X-Omat AR durante 2,5 horas a -80ºC con una pantalla reforzadora. Se identificaron las colonias positivas y se cultivaron durante la noche en medio LBM / carbenicilina. Se preparó ADN de los cultivos utilizando el kit miniprep Promega Wizard según el protocolo sugerido por el fabricante y se secuenció el ADN resultante.

El cribaje inicial dio como resultado 18 clones positivos, mientras que el secundario en condiciones de hibridación más rigurosas produjo un clon positivo que recibió la designación de 19A2. Las secuencias de ADN y de amino ácido deducido del clon \alpha_{d} humano 19A2 se indican en SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente.

Características del cADN de \alpha_{d} humano y polipéptido pronosticado

El clon 19A2 comprende toda la región de codificación para la proteína madura más 48 bases (16 residuos de amino ácidos) de la secuencia de señal 5' upstream y 241 bases de secuencia no traducida 3' que no termina en una secuencia de poli adenilación. El peso molecular nuclear de la proteína madura es, según lo previsto, de 125 kD. Se prevé que el dominio extracelular comprende aproximadamente residuos de amino ácido 17 a 1108 de SEQ ID NO: 2. Esta región extracelular es contigua a una región de 20 amino ácidos homóloga a la región transmembrana humana CD11c (residuos 1109 a 1128 de SEQ ID NO: 2). El dominio citoplásmico comprende aproximadamente 30 amino ácidos (aproximadamente residuos 1129 a 1161 de SEQ ID NO: 2). La proteína contiene también una región (en torno a residuos 150 a 352) de aproximadamente 202 amino ácidos homólogos al dominio I (inserción) común a CD11a, CD11b y CD11c [Larson and Springer, supra] \alpha_{E} [Shaw, et al., J. Biol. Chem. 269:6016-6025 (1994)] y en VLA-1 y VL2, [Tamura, et al., supra. El dominio I en las demás integrinas participa, según se ha visto, en la fijación de ICAM [Landis, et al., J. Cell.Biol. 120:1519-1527 (1993); Diamond, et al., J.Cell.Biol.120:1031-1031 (1993)], lo cual sugiere que \alpha_{d} también fija miembros de la familia ICAM de moléculas de superficie. No se ha demostrado que exista esta región en ninguna otra subunidad de integrina.

La secuencia amino ácido deducida de \alpha_{d} muestra aproximadamente un 36% de identidad con la de CD11a, aproximadamente 60% de identidad con la CD11b y aproximadamente 66% de identidad con CD11c. En la figura 1 se presenta una alineación de secuencias amino ácido para (CD11b SEQ ID NO:3), CD11c (SEQ ID NO: 4) y \alpha_{d} (SEQ IN DO: 2).

Los dominios citoplásmicos de subunidades \alpha en integrinas \beta_{2} suelen ser distintos entre sí dentro de la misma especie, mientras que las subunidades individuales a muestran altos grados de homología a través de los límites de las especies (¿???). De acuerdo con estas observaciones, la región citoplásmica de \alpha_{d} difiere notablemente de CD11a, CD11b y CD11c salvo una secuencia amino ácido GFFKR proximal de una membrana que, según se ha visto, se conserva en todas las integrinas \alpha [Rojiani, et al., Biochemistry 30:9859-9866 (1991)]. Debido a que la región de cola (tail) citoplásmica de integrinas se ha visto implicada en la señalización "inside out" y en la regulación de avidez [Landis et al., supra] es posible que \alpha_{d} interactúe con moléculas citosólicas distintas de las que interactúan con CD11a, CD11b y CD11c y por consiguiente, participe en señalar vías distintas de las que involucran otras integrinas \beta_{2}.

El dominio extracelular de \alpha_{d} contiene una secuencia amino ácido conservada DGSGS adyacente al dominio I; En CD11b, la secuencia DGSGS es una región de fijación de metal necesaria para la interacción del ligando [Michishita, et al., Cell 72:857-867 (1993)]. Tres zonas de fijación de catión putativo adicional en CD11b y CD11c se conservan en la secuencia \alpha en amino ácidos 465-474, 518-527, y 592-600 en el clon 19A2 (SEQ ID NO: 1). El dominio I de \alpha_{d} es 36%, 62% y 57% idéntico a las regiones correspondientes en CD11a, CD11b y CD11c respectivamente, y la homología de secuencia relativamente baja en esta región sugiere que \alpha_{d} puede interactuar con un conjunto de proteínas extracelulares distintas de las proteínas con las que interactúan otras integrinas conocidas \beta_{2}. Alternativamente, la afinidad de \alpha_{d} por ligandos conocidos de integrina \beta_{2}, por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2 y/o ICAM-R, puede ser distinta de la mostrada para las otras interacciones integrina \beta_{2} /ICAM. [Véase ejemplo 12].

Ejemplo 6 Análisis Northern de expresión de \alpha_{d} humana en tejidos

Con el fin de determinar el nivel relativo de expresión y la especificidad tisular de \alpha_{d}, se realizó el análisis Northern utilizando fragmentos de clon 19A2 como sondas. Aproximadamente 10 \mug del ARN total de cada uno de los diversos tejidos humanos o líneas celulares cultivadas se cargó sobre un gel agarosa formaldehído en presencia de 1 \mug gen de bromuro de etidio. Tras la electrofóresis a 100 V durante 4 horas, el ARN se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell), rotando (wicking) en 10X SSC durante la noche. La membrana se calcinó durante una hora a 80ºC bajo vacío. Se utilizó solución de pre-hibridación que contenía 50% de formamida en tampón de ácido 3-(N-morfolino) propano sulfónico (MOPS) para bloquear la membrana durante 3 horas a 42ºC. Se marcaron fragmentos del clon 19A2 con el kit Boehringer Mannheim Random Prime, siguiendo las instrucciones del fabricante inclusive \alphaP^{32} dCTP y \alphaP^{32} dTTP. Se quitó la marca no incorporada sobre una columna Sephadex G25 en tampón TE. La membrana se midió con 1,5 x 10^{6} recuentos por ml de tampón de pre-hibridación. La transferencia (blot) se lavó entonces sucesivamente con 2X SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente, 2X SSC/0,1% a 42ºC, 2X SSC/0,1% SDS a 50ºC, 1X SSC/0,1% SDS a 50ºC, 0,5X SSC/0,1% SDS a 50ºC y 0,1 X SSC/0,1% SDS a 50ºC. La transferencia se expuso entonces a la película durante 19 horas.

La hibridación utilizando un fragmento BstXI del clon 19A2 (correspondiente a nucleótidos 2011 a 3388 en SEQ ID NO: 1) reveló una señal débil en la zona de aproximadamente 5 kb en el hígado, la placenta, el timo y ARN total de la amígdala. No se detectó ninguna señal en las muestras de riñón, cerebro o corazón. La cantidad de ARN presente en la "ruta" (lane) del riñón era mínima, según se determinó con tinte de bromuro de etidio.

Utilizando un segundo fragmento del clon 19A2 (que abarca la región de las bases 500 a 2100 en SEQ ID NO: 1), se detectaron transcripciones ARN de dos tamaños diferentes en una transferencia Northern (MTN) de multitejido humano con utilización de ARN poli A^{+} (Clontech). Se observó una banda de aproximadamente 6,5 kb en el bazo y el músculo esquelético, mientras se detectó una banda de 4,5 kb en el pulmón y los leucocitos de la sangre periférica. La variación en tamaño observada podía haber sido causada por poli adenilación específica tisular, reactividad cruzada de la sonda con otros miembros de la familia de las integrinas o hibridación con mARNs alternativamente cortados y empalmados.

El análisis Northern utilizando un tercer fragmento del clon 19A2, que abarcaba nucleotídos 2000 a 3100 en SEQ ID NO: 1, dio resultados coherentes con los obtenidos utilizando los demás fragmentos del clon 19A2.

Se midió también el ADN de 3 líneas celulares de linaje mieloide utilizando los fragmentos correspondientes a nucleotídos 500 a 2100 y 2000 a 3100 en SEQ ID NO: 1. Una línea celular THP-1, previamente estimulada con PMA, dio una señal difusa en la misma gama de tamaños (aproximadamente 5,0 kb) con una intensidad ligeramente más fuertes que las señales del tejido. El ARN de células HL-60 no estimuladas y estimuladas con DMSO hibridó con la sonda \alpha_{d} a la misma intensidad que las muestras de tejido aunque el tratamiento PMA pareció aumentar la intensidad de la señal. Como PMA y DMSO llevan la diferenciación celular HL-60 hacia vías monocito / macrófago y granulocito, respectivamente; este resultado sugiere una expresión \alpha_{d} potenciada en tipo de células monocito / macrófago. Las células U937 expresaron el mensaje \alpha_{d} y esta señal no aumentó con estimulación PMA. No se detectó ninguna banda en células Molt, Daudi, H9, JY o Jurkat.

Ejemplo 7 Expresión transitoria de constructos de \alpha_{d} humanos A. Generación de constructos de expresión

El clon humano 19A2 carece de un codón iniciador de metionina y posiblemente alguna de las secuencias de señal 5'. Por consiguiente, para generar un plásmido de expresión humana que contenga secuencias 19A2, se utilizaron dos estrategias diferentes. En la primera, se construyeron dos plásmidos, en los cuales se empalmaron secuencias péptido señal derivadas de genes que codifican CD11b o CD11c en un clon 19A2 para generar una secuencia \alpha_{d} híbrida. En el segundo enfoque, se construyó un tercer plásmido en el que se añadió una base adenosina en la posición 0 en el clon 19A2 para codificar una metionina iniciadora.

Los tres plásmidos contenían regiones diferentes que codificaban la porción 5' de la secuencia \alpha_{d} o la secuencia \alpha_{d} híbrida. La región \alpha_{d} se sometió a amplificación PCR (véase condiciones en el ejemplo 2) con un iniciador específico 3' BamRev (expuesto a continuación en SEQ ID NO: 26) y uno de tres iniciadores 5'. Los tres iniciadores 5' contenían en secuencia: (1) bases no específicas idénticas en posiciones 1-6 que permitían la digestión, una zona EcoRI de posiciones 7-12 y una secuencia Kozak consensus de posiciones 13-18; (2) una parte de la secuencia de señal CD11b (iniciador ER1B) o CD11c (iniciador ER1C), o una adenosina (iniciador ER1D); y (3) una base adicional 15-17 que solapaba específicamente secuencias 5' del clon 19A2 para permitir la hibridación del iniciador. Los iniciadores ER1B, ER1C o ER1D se exponen en SEQ ID NOS: 27, 28 ó 29, respectivamente, donde se subraya el codón de metionina iniciador y se subraya dos veces la zona EcoRI.

5'- CCACTGCAGGTGCCCGTG-3'	(SEQ ID NO: 26)

5'-AGTTACGAATTCGCCACATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG	(SEQ ID NO: 27)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGGCTTCTTCTG	(SEQ ID NO: 28)

5'-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG	(SEQ ID NO: 29)

El producto PCR resultante se digirió con EcoRI y BamHI.

Los tres plásmidos contenían una segunda región común \alpha_{d} (a insertar inmediatamente "downstream " desde la región 5' descrita en el párrafo anterior) que incluía el extremo 3' del clon \alpha_{d}. La segunda región \alpha_{d} que se extendía del nucleótido 625 a la zona XbaI en la región poli ligante 3' del vector del clon 19A2, se aisló por digestión del clon 19A2 con BamHI y XbaI.

Se prepararon tres reacciones de ligación, en las cuales el fragmento 3' \alpha_{d} BamHI/XbaI se ligó con uno de los tres fragmentos 5' \alpha_{d} EcoRI/BamHI utilizando tampón ligasa Boehringer Mannheim y ligasa T4 (1 unidad por reacción) Tras 4 horas de incubación a 14ºC se añadió a cada reacción con una unidad adicional de ligasa, una cantidad adecuada de vector pcADN.3 (Invitrogen) digerida con EcoRI y XbaI. Se dejaron seguir las reacciones durante otras 14 horas. Una décima parte de la mezcla de reacción se transformó entonces en células XL-1 Blue competentes. Las colonias resultantes se cultivaron y se aisló el ADN como en el ejemplo 5. La digestión con EcoRI identificó tres clones que eran positivos para esta zona de restricción y, por consiguiente, las secuencias de señal realizadas. Los clones recibieron la designación pATM.B1 (CD11c/\alpha_{d}, del iniciador ER1B), pATM.CD10 (CD11c/\alpha_{d}, del iniciador ER1C) y pATM.D12 (adenosina/\alpha_{d} del iniciador ER1d). La presencia de las secuencias de señal adecuada en cada clon se verificó mediante secuenciación de ácido nucleico.

B. Transfección de células COS

Se realizó la expresión de los plasmidos \alpha_{d} tratados anteriormente, mediante transfección de células COS con los plásmidos individuales y un plásmido de expresión CD18, pRC.CD18. Como control positivo, se co-transfectaron también células COS con el plásmido pRC.CD18 y un plásmido de expresión CD11a, pDC.CD11A.

Las células se llevaron en medio de cultivo (DMEM / 10% FBS / penstrep) al interior de placas de Petri tratadas con cultivo tisular Corning al 50% de confluencia, 16 horas antes de la transfección. Las células se quitaron de la placa con tampón Versene (0,5 mM NaEDTA en PBS) sin tripsina para todos los procedimientos. Antes de la transfección, las placas se lavaron una vez con DMEM libre de suero. Se añadieron 15 microgramos de cada plásmido a 5 ml de tampón de transfección (DMEM con 20 \mug/ml DEAE-dextrano y 0,5 mM cloroquina) en cada placa. Después de 1,5 horas de incubación a 37ºC, las células se sometieron a choque (shocked) durante 1 minuto con 5 ml DMEM / 10% DMSO. Esta solución de DMSO se sustituyó entonces por 10 ml / medio de cultivo de placa.

Los transfectantes resultantes se analizaron por ELISA, FACS e inmuno precipitación, tal como se describe en los ejemplos 8, 9 y 10.

Ejemplo 8 Análisis ELISA de transfectantes COS

Con el fin de determinar si las células COS co-transfectadas con pRC.CD18 plásmido de expresión CD18 y un plásmido \alpha_{d} expresaban \alpha_{d} sobre la superficie de la célula en asociación con CD18, se realizaron análisis ELISA utilizando anticuerpos primarios cultivados contra CD18 (por ejemplo TS1/18 purificado de ATCC HB203). Como control positivo también se realizaron análisis ELISA sobre células co-transfectadas con el plásmido de expresión CD18 y un plásmido de expresión CD11a, pDC.CD11A. Los anticuerpos primarios en este control incluían anticuerpos CD18 y anticuerpos anti-CD11a (por ejemplo, TS1 / 22 purificado a partir de ATCC HB202).

Para el análisis ELISA, se quitaron células de cada placa con tampón Versene y se transfirieron a una sola placa de cultivo de tejido Corning de fondo plano de 96 pocillos. Se dejó que incubaran células en medio de cultivo dos días antes del ensayo. Las placas se lavaron entonces dos veces con 150 \mul / pocillo D-PBS / 0,5% de solución (Sigma) teleost skin gelatin. Este tampón se utilizó en todas las etapas salvo durante el desarrollo. Todos los lavados e incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Los pocillos se bloquearon con solución de gelatina durante una hora. Se diluyeron anticuerpos primarios hasta 10 \mug / ml en solución de gelatina y se añadieron entonces 50 \mul a cada pocillo. Se establecieron pocillos triplicados para cada anticuerpo primario. Tras una hora de incubación, se lavaron las placas tres veces con 150 \mul / pocillo de solución de gelatina. Se añadió anticuerpo secundario (cabra anti-ratón Ig / HRP-Fc específico [Jackson, West Grove, PA]) a una dilución de 1:3500 a razón de 50 \mul / pocillo y se incubaron las placas durante 1 hora. Después de tres lavados, las placas se revelaron / desarrollaron durante 20 minutos con 100 \mu / pocillo de solución de o-fenildiamina (OPD) (Sigma) (1 mg/ml OPD en tampón de citrato) antes de añadir 50 \mu / pocillo de ácido sulfúrico al 15%.

El análisis de transfectantes en el formato ELISA con anticuerpos específicos anti-CD18 no reveló ninguna expresión notable por encima de lo conocido en células transfectadas únicamente con el CD18 codificador de plásmido. Las células co-transfectadas con plásmido que contenía CD11a y CD18 mostraron un incremento en la expresión por encima de lo habitual cuando se analizaron con anticuerpos específicos CD18 o con reactivos específicos de CD11a. El análisis ulterior de células co-transfectadas con plasmidos codificadores de CD18 y uno de los constructos de expresión \alpha_{d} (pATM.C10 o pATM.D12) reveló que la expresión de la superficie de la célula de CD18 fue socorrida por la expresión concomitante de \alpha_{d}. El aumento en la expresión detectable de CD18 en células COS transfectadas con pATM.C10 o pATM.D12 era comparable al observado en células de control positivo co-transfectadas CD11a / CD18.

Ejemplo 9 Análisis FACS de transfectantes COS

Para el análisis FACS, se aportó medio de cultivo reciente a células en placas de Petri el día después de la transfección, dejándose incubar 2 días antes del ensayo. Las células de transfectante se quitaron de las placas con 3 ml de Versene, se lavaron una vez con 5 ml de tampón FACS (DMEM/2% FBS/0,2% azida de sodio) y se diluyeron hasta 500.000 células / muestra en 0,1 ml de tampón FACS. Se añadieron a cada muestra diez microlitros de un 1 mg / ml de anticuerpos específicos CD18 FITC conjugado, CD11a o CD11b (Becton Dickinson o 800 \mug / ml de 23F2G murina CFSE-conjugada (anti-CD18) (ATCC HB11081). Las muestras se incubaron entonces sobre hielo durante 45 minutos, se lavaron tres veces con 5 ml/lavado de tampón FACS y se resuspendieron en 0,2 ml de tampón FACS. Las muestras se procesaron sobre un FACscan Becton Dickinson y los datos se analizaron utilizando software Lysys II (Becton Dickinson).

Las células COS transfectadas con secuencias CD18 solamente no se tiñeron para CD18, CD11a o CD11b. En la co-transfección con CD11a / CD18, aproximadamente el 15% de las células se tiñeron con anticuerpos a CD11a o CD18. Todas las células transfectadas con CD18 y todo constructo \alpha_{d} dio como resultado un teñido no detectable para CD11 a y CD11 b. Los grupos pATM.B1, pATM.C10 y pATM.D12 se tiñeron 4%, 13% y 8% positivo para CD18, respectivamente. La fluorescencia de la población positiva en el grupo CD11a/CD18 era 4 veces superior a lo normal. En comparación, la co-transfección de constructos de \alpha_{d} con el constructo CD18 produjo una población positiva que mostraba un incremento en intensidad de fluorescencia de 4 a 7 veces por encima de lo habitual.

Ejemplo 10 Inmunoprecipitación marcada con biotina de complejos de \alpha_{d} /CD18 humano de células COS co-transfectadas

Se intentó la inmuno precipitación sobre células co-transfectadas con CD18 y cada uno de los plásmidos de expresión \alpha_{d} se describió por separado en el ejemplo 7 con el fin de determinar si se podía aislar \alpha_{d} como parte del complejo heterodímero \alpha\beta característico de las integrinas.

Se quitaron las células transfectadas (1-3 x 10^{8} células / grupo) de placas de Petri con tampón Versene y se lavaron tres veces en 50 ml / grupo D-PBS. Cada muestra se marcó con 2 mg de Sulfo-NHS biotina (Pierce, Rockford, IL) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se apagó lavando tres veces en 50 ml / muestra de D-PBS frío. Las células lavadas se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis (1% NP40, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,2 M NaCl, 2 mM Ca^{++}, 2 mM Mg^{++}, e inhibidores de proteasa) y se incubaron 15 minutos sobre hielo. El material insoluble se granuló por centrifugación a 10.000 g durante 5 minutos y se quitó el sobrenadante pasándolo a tubos frescos. Para quitar el material no específicamente reactivo con inmuno globulina de ratón, se realizó inicialmente una etapa de pre-aclarado. Se incubaron 25 microgramos de inmuno globulina de ratón (Cappel, West Chester, PA) con sobrenadantes a 4ºC. Después de 2 horas, se añadió a cada muestra 100 \mul (25 \mug) conejo anti-ratón Ig conjugado Sepharose (preparado a partir de proteína A Sepharose 4B y conejo anti-ratón Ig, ambos de Zymed, San Francisco, CA); Se prosiguió con la incubación a 4ºC con balanceo durante 16 horas. Se quitaron perlas se Sepharose de los sobrenadantes mediante centrifugación. Después del pre-aclarado, los sobrenadantes se trataron con 20 \mug de anticuerpo anti-CD18 (TS1.18) durante 2 horas a 4ºC. Se aislaron complejos de anticuerpo / antígeno de los sobrenadantes por incubación con 100 µl/muestra de preparado de conejo anti-ratón / proteína A-Sepharose, descrita anteriormente. Las perlas se lavaron 4 veces con 10 mM HEPES, 0,2 M NaCl, y 1% de Triton-X 100. Las perlas lavadas se granularon y se hirvieron durante 10 minutos en 20 \mul de tampón de muestra 2X Laemmli con \beta-mercaptoetanol al 2%. Las muestras se centrifugaron y vertieron sobre un gel de poliacrilamida Novex derramado previamente al 8% (Novex) a 100 V durante 30 minutos. Se transfirió proteína a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) en tampón TBS-T a 200 mAmps durante 1 hora. Se bloquearon membranas durante 2 horas con 3% BSA en TBS-T. Las membranas se trataron con dilución 1:6000 de peroxidasa de rábano picante Strep-avidin (POD) (Boehringer Mannheim) durante 1 hora, seguido de tres lavados en TBS-T. El kit de Quimio luminiscencia Potenciada Amersham se utilizó entonces siguiendo las instrucciones del fabricante para desarrollar la transferencia. La membrana se expuso a Hyperfilm (Amersham) durante 0,5 a 2 minutos.

La inmuno precipitación de complejos de CD18 de células transfectadas con pRC.CD18 o bien pATM.B1,
pATM.C10 o pATM.D12 reveló expresión de superficie de una especie heterodimérica que consistía en aproximadamente una cadena de 100 kD \beta que se correspondía con el tamaño previsto de CD18 y una cadena \alpha de aproximadamente 150 kD correspondiente a \alpha_{d}.

Ejemplo 11 Transfección estable de \alpha_{d} humano en células de ovario de hámster chino

Para determinar si \alpha_{d} se expresa sobre la superficie celular como un heterodímero en asociación con CD18, se transfectaron de forma transitoria y estable cADNs de codificación de cada cadena en una línea celular que carecía de \alpha_{d} y CD18.

Para estos experimentos, se aumentó el cADN de \alpha_{d} con secuencias líder adicionales y una secuencia de consenso Kozad, como se describe en el ejemplo 7, y se sub-clonó en el vector de expresión pcADN3. El constructo final, designado pATM.D12, se co-transfectó con un vector comercial modificado pDC1.CD18 de codificación de CD18 humano en un dihidrofolato reductasa (células de ovario de hámster chino) (CHO). El plásmido pDC1.CD18 codifica un marcador DHFR^{+} y se pueden elegir transfectantes utilizando un medio adecuado nucleósido-deficiente. Las modificaciones resultantes en pDC1.CD18 son las siguientes:

El plásmido pRC / CMV (Invitrogen) es un vector de expresión de mamífero con promotor de cito megalo virus y gen marcador de resistencia a la ampicilina. Se insertó un gen DHFR del plásmido pSC1190-DHFR en pRC/CMV 5' del origen SV40 de replicación. Además se ligó un poli ligante de la región 5' del plásmido pHF2G-DHF en el constructo pRC / CMV / DHFR, 3' al gen DHFR. Las secuencias de codificación de CD18 se clonaron ulteriormente en el plásmido resultante entre la región de poliligante de borde 5' y la región de codificación de poli A de la hormona de crecimiento bovino.

Se analizó la expresión de superficie de CD18 por citometría de flujo utilizando el anticuerpo monoclonal TS1/18. La formación heterodímera detectada entre \alpha_{d} y CD18 en esta línea celular se correspondía con la inmuno precipitación descrita en el ejemplo 10 con expresión transitoria en células COS.

Ejemplo 12 El \alpha_{d} humano interacciona con ICAM-R de una forma que depende de CD18

A la vista de los informes que muestran interacciones entre las integrinas de leucocito y las moléculas de adhesión intercelular (ICAMs) que median el contacto célula-célula [Hynes, Cell 69:11-25 (1992)], se evaluó utilizando dos métodos, la aptitud de la células CHO de expresión de \alpha_{d}/CD18 para fijar ICAM-1, ICAM-R o VCAM-1.

En ensayos de replicación se inmovilizaron proteínas de fusión ICAM-1, ICAM-R o VCAM-1 IgG1 sobre plástico y se determinó la aptitud de las células transfectadas de \alpha_{d}/CD18 CHO para fijar el ligando inmovilizado. Las células transfectadas se marcaron internamente con calceina lavada en tampón de fijación (RPMI con 1% BSA, y se incubaron en tampón solamente (con o sin 10 ng/ml PMA) o tampón con anticuerpos monoclonales anti-CD18 a 10 \mug/ml. Se añadieron células transfectadas a placas Immulon 6 microtítulo de 96 pocillos previamente revestidas con proteína de fusión soluble ICAM-1/IgG1, ICAM-R/IgG1 o VCAM-1/IgG1 o albúmina de suero bovino (BSA) como control negativo. El diseño de las formas solubles de estas moléculas de adhesión se describe y revela completamente en la solicitud de patente US, co-pendiente y en co-titularidad, número de serie 08/102.852, presentada el 5 de agoto de 1993. Se bloquearon los pocillos con 1% de BSA en PBS antes de añadir las células marcadas. Después de lavar las placas por inmersión en PBS con 0,1% BSA durante cinco minutos, se midió la fluorescencia total restante en cada pocillo utilizando un Cytofluor 2300 (Millipore, Milford, MA).

En experimentos con ICAMs inmovilizados, los co-transfectantes \alpha_{d} / CD18 mostraron coherentemente un incremento de 3-5 veces de la fijación a pocillos ICAM-R / IgG1 con respecto a pocillo revestidos con BSA. La especificidad y dependencia de CD18 de esta fijación se demostró mediante los efectos inhibitorios de anticuerpo anti-CD18 TS1/18. La fijación de células transfectadas con CD11a / CD18 a pocillos ICAM-1 / IgG1 era comparable a la fijación observada con pocillos revestidos con BSA. Las células transfectadas CD11a / CD18 mostraron un aumento de 2 a 3 veces en la fijación a pocillos ICAM-1 / IgG1 únicamente tras el pre-tratamiento con PMA. El tratamiento con PMA de transfectantes \alpha_{d} / CD18 no afectó la fijación a pocillos ICAM-1 / IgG1 o ICAM-R / IgG1. No se observó ninguna fijación detestable de transfectantes \alpha_{d}/ CD18 a pocillos VCAM-1 / IgG1.

Se determinó por citometría de flujo la fijación de células transfectadas \alpha_{d} /CD18 a proteínas de fusión solubles ICAM-1 / IgG1, ICAM-R / IgG1 O VCAM-1 / IgG1. Se suspendieron para realizar la medida aproximadamente un millón de células CHO transfectadas \alpha_{d}/CD18 (cultivadas en matraces giratorios para mayor expresión) en 100 \mul de tampón de fijación (RPMI y 1% BSA) con o sin 10 \mug / ml anticuerpo anti-CD18. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron en tampón de fijación y se añadió proteína de fusión soluble ICAM-1 / IgG1 o ICAM-R / IgG1 a la concentración final de 50 \mug/ml. Se permitió la fijación durante 30 minutos a 37ºC después de lo cual las células se lavaron tres veces y se resuspendieron en 100 \mul de tampón de fijación que contenía IgG1 antihumano de oveja FITC-conjugado con una dilución de 1:100. Después de incubación de 30 minutos, se lavaron muestras tres veces y suspendieron en 200 \mul de tampón de fijación para su análisis con un Becton Dickinson FACScan.

Aproximadamente 40-50% de los transfectantes \alpha_{d} / CD18 indicaron interacción con ICAM-R / IgG1, pero ninguna interacción con ICAM-1 / Ig / G1 o VCAM-1 / IgG1. El pretratamiento de células transfectadas con PMA no tuvo ningún efecto en la interacción de \alpha_{d} / CD18 con ICAM-1 / IgG1, ICAM-R / IgG1 o VCAM-1 / IgG1, lo cual se correspondía con el ensayo de adhesión inmovilizado. La fijación por ICAM-R se redujo a niveles de referencia después del tratamiento de transfectantes \alpha_{d} / CD18 con anticuerpo anti-CD18 TS1 / 18.

Los datos colectivos de estos dos ensayos de fijación ilustran que \alpha_{d} / CD18 interactúa con ICAM-R y lo hace de forma preferente comparado con ICAM-1 y VCAM-1. La preferencia de interacción de \alpha_{d} / CD18 por ICAM-R respecto de ICAM-1 se opone a lo observado con CD11a / CD18 y CD11b / CD18. Por consiguiente, se puede esperar que la modulación de la interacción \alpha_{d} / CD18 afecte de forma selectiva la función inmunitaria normal y patológica donde ICAM-R desempeña un papel importante. Además, los resultados de ensayos similares, en los cuales se comprobó la aptitud de anticuerpos inmunoespecíficos de varios dominios intracelulares de ICAM-R para inhibir la interacción de ICAM-R con transfectantes \alpha_{d} / CD18, indicaron que \alpha_{d} / CD18 y CD11a / CD18 interactúan con diferentes dominios de ICAM-R.

El hecho de que CD11a / CD18 no interactúe con ICAM-1 / IgG1 o ICAM-R / IgG1 en solución sugiere que la afinidad de interacción entre CD11a / CD18 y ICAM-1 o ICAM-R es demasiado baja para permitir la interacción en solución. La detección de la interacción de \alpha_{d} / CD18 con ICAM-R / IgG1 sugiere sin embargo una afinidad de interacción inusualmente elevada.

Interacción de \alpha_{d} con iC3b

El componente complemento C3 puede ser segmentado para formar el complejo iC3b que inicia la vía alternativa de activación complementaria y conduce en ultima instancia a la destrucción con mediación celular de la diana. Tanto la CD11b como la CD11c se han visto implicadas en la fijación de iC3b y subsiguiente fagocitosis de partículas revestidas con iC3b. Se ha identificado recientemente un fragmento de péptido en el dominio I CD11b como la zona de interacción de iC3b [Ueda, et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 91:10680-10684 (1994)]. La región de interacción de iC3b está muy conservada en CD11b, CD11c, y \alpha_{d} sugiriendo una interacción de fijación \alpha_{d}/ iC3b.

La interacción de \alpha_{d} con iC3b se realiza utilizando transfectantes o líneas celulares que expresan naturalmente \alpha_{d} (por ejemplo, células HL60 estimulada con PMA) y hematíes de oveja revestidos iC3b (sRBC) en un ensayo de rosetón [Dana, et al., J.Clin. Invest. 73: 153-159 (1984)]. Se compara la aptitud de los transfectantes \alpha_{d} / CD18 CHO, transfectantes VLA4-CHO (control negativo) y células HL60 estimuladas con PMA (control positivo) para formar rosetones en presencia y ausencia de un anticuerpo monoclonal anti-CD18 (por ejemplo TS1/18.1).

Ejemplo 13 Detección por ensayo de proximidad por centelleo

Los inhibidores específicos de fijación entre los ligandos \alpha_{d} de la presente invención y sus parejas de fijación (par ligando \alpha_{d} / antiligando) se pueden determinar de muchas formas como por ejemplo con las técnicas de ensayo de proximidad por centelleo descritas en general en la patente U.S nº. 4.271.139, Hart and Greewald, Mol.Immunol. 12:265-267 (1979), y Hart and Greewald, J.Nuc. Med.20:1062-1065 (1979).

En suma, un elemento del par \alpha_{d} ligando / antiligando está unido a un soporte sólido. También está ligado al soporte un agente fluorescente. Se puede integrar alternativamente el agente fluorescente dentro del soporte sólido, tal como se describe en la patente US nº. 4.568.649. El elemento no unido al soporte del par \alpha_{d} ligando / antiligando se marca con un compuesto radioactivo que emite una radiación capaz de excitar el agente fluorescente. Cuando el ligando liga el antiligando radio marcado, se lleva la marca lo suficientemente cerca del fluorescente ligado al soporte para excitar el fluorescente y producir la emisión de luz. Si no está unido, la marca está generalmente demasiado lejos del soporte sólido para excitar el agente fluorescente y las emisiones de luz son bajas. La luz emitida se mide y se correlaciona con la interacción entre el ligando y el antiligando. La adición de un inhibidor de fijación a la muestra reducirá la emisión fluorescente pidiendo que la marca radioactiva sea capturada en la proximidad del soporte sólido. Por consiguiente, los inhibidores de fijación se pueden identificar por su efecto sobre emisiones fluorescentes procedentes de las muestras. También se pueden identificar por medios similares los anti ligandos potenciales con respecto a \alpha_{d}.

Ejemplo 14 Constructos de expresión \alpha_{d} humanos solubles

La expresión en toda su longitud de proteína heterodímera de \alpha_{d} / CD18 humana soluble proporciona un material fácilmente purificado para ensayos de inmunización y fijación. La ventaja de generar proteína soluble consiste en que se puede purificar a partir de sobrenadantes en lugar de a partir de lisatos celulares (como ocurre con \alpha_{d} / CD18 ligado a membrana en toda su longitud); mejora por lo tanto la recuperación y la reducción de impurezas.

El plásmido de expresión \alpha_{d} soluble se construyó del siguiente modo: Se aisló por digestión con HindIII y AatII un fragmento de nucleótido correspondiente a la región de bases 0 a 3161 en SEQ ID NO: 1, y se clonó en plásmido pATM.D12. Se amplificó un fragmento PCR correspondiente a bases 3130 a 3390 en SEQ ID NO: 1, que solapaba el fragmento HindIII/AatII y contenía una zona de restricción MIuI de adición en el final 3', a partir de pATM.D12 con iniciadores sHAD.5 y sHAD.3 expuestos en SEQ ID NOS: 30 y 31, respectivamente.

5'-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3'	(SEQ ID NO: 30)

5'-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC	(SEQ ID NO: 31)

El producto de amplificación PCR se digirió con AatII y MIuI y se ligó al fragmento Hindi / AatII. El producto resultante se ligó en plásmido pDC1.s Hindi / MIuI-digerido.

Este constructo se co-expresa con CD18 soluble en células CHO transfectadas establemente y la expresión se detecta por visualización auto radiográfica de complejos CD18 inmuno precipitados, derivados de células marcadas de ^{35}S-metionina. El constructo también se co-expresa con CD18 en 293 células [Berman, et al., J. Cell.Biochem.52:183-195 (1993)].

Constructos de expresión de dominio I \alpha_{d} humanos solubles

Se ha indicado previamente que el dominio I en CD11a se puede expresar como una unidad estructural independiente que mantiene aptitudes de fijación de ligando y reconocimiento de anticuerpo. [Randi and Hogg, J.Biol.Chem. 269; 12395-12398 (1994); South, et al., J.Biol. Chem. 269:179075-17079 (1994); Michishita, et al., Cell 72: 857-867 (1993)]. Para generar una proteína de fusión soluble que comprenda el dominio I \alpha_{d} e IgG4 humano, se amplificó el dominio I \alpha_{d} mediante PCR utilizando iniciadores designados para añadir zonas de restricción BamHI y XhoI de flanco para facilitar la subclonación. Estos iniciadores se indican en SEQ ID NOS: 32 y 33 con las zonas de restricción subrayadas.

5'-ACGTATGCAGGATCCCATAAGAGATGGACATCGCT	(SEQ ID NO: 32)

5'-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACAT	(SEQ ID NO: 33)

El nucleótido C inmediato 3' a la zona BamHI en SEQ ID N: 32 corresponde al nucleótido 435 en SEQ ID NO: 1; el nucleótido G3' de la zona XhoI en SEQ ID NO: 33 es complementario al nucleótido 1067 en SEQ ID NO: 1. El dominio I amplificado es digerido con las enzimas adecuadas, el fragmento purificado se liga en el vector de expresión de mamífero pDCs y el vector de expresión procariótica pGEX-4T-3 (Pharmacia) y el fragmento de dominio I se secuencian. La proteína de fusión se expresa entonces en COS, las células CHO o E. coli se transfectan o transforman con un constructo de expresión adecuado.

Dada la afinidad de \alpha_{d} por ICAM-R, la expresión del dominio I \alpha_{d} puede tener una afinidad suficiente para ser un inhibidor útil de adhesión celular en la que participa \alpha_{d}.

Análisis de proteínas de fusión IgG4 / dominio I de \alpha_{d} humano

La proteína se descompuso mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y se visualizó con coloración de plata o coloración Coomassie. La proteína se transfirió entonces a membranas PVDF Immobilon y se sometió a análisis Western utilizando anticuerpos monoclonales IgG anti humanos o anticuerpos monoclonales Ig anti bovinos.

Se determinó que la proteína detectada migraba a aproximadamente 120 kD en condiciones no reductoras y aproximadamente 45 kD en condiciones reductoras. Se detectaron también banda más pequeñas en geles no reductores a aproximadamente 40-50 kD que reaccionaban con anticuerpos anti humanos pero no anti bovinos. Se determinó por análisis Western que la banda secundaria de 200 kD era Ig bovino.

Ensayos de fijación utilizando productos de expresión de dominio I

La capacidad del dominio I para reconocer específicamente proteínas híbridas ICAM-R / IgG se comprobó en un formato ELISA. Se incubaron diluciones en serie de proteína de fusión IgG4 dominio I \alpha_{d} (I\alpha_{d}/IgG4) en TBS con ICAM-1 / IgG, ICAM-R / IgG, VCAM-1 / IgG, o se inmovilizó una proteína de mieloma IgG1 irrelevante sobre placas Immulon IV RIA/EIA. Se utilizaron como controles negativos proteína híbrida Cd11a dominio I IgG y proteína mieloma IgG4 / kappa humana. Se detectó el IgG4 ligado con el anticuerpo HP6023 monoclonal anti-IgG4 biotinilado, seguido de la adición de conjugado de strepavidin-peroxidasa y desarrollo con sustrato o-fenildiamina.

En ensayos repetidos, no se detectó la fijación de la proteína CD11a/IgG4 o la proteína mieloma IgG4 con ninguna de las proteínas inmovilizadas. La proteína I / IgG4 no interactuaba con agentes de bloqueo de albúmina de suero bovino o gelatina de piel de pescado, IgG1 humano, o ICAM-1 / IgG. Se detectó un incremento en la señal de fijación 2 a 3 veces por encima del nivel de referencia en pocillos revestidos con proteína ICAM-R / IgG utilizando concentraciones de 1-5 \mug / ml de proteína I\alpha_{d} / IgG4. La señal en los pocillos revestidos con proteína VCAM-1 / IgG era de 7 a 10 veces mayor que la referencia. En ensayos anteriores las células CHO transfectadas \alpha_{d}/ CD18 no fijaban proteína VCAM-1 / IgG, lo cual sugería que la fijación de VCAM-1 puede ser característica de secuencias amino ácido de dominio I aisladas.

Constructos adicionales de dominio I de \alpha_{d}

Se generaron constructos adicionales de dominio I de \alpha_{d} del mismo modo que el constructo anterior pero incorporando más amino ácidos en torno al dominio I\alpha_{d}. Los constructos específicos comprenden: i) secuencias de exon 5 (amino ácidos 127-353 en SEQ ID NO: 2), que preceden el constructo actual, ii) repite el EF-hand (amino ácidos 17-603 en SEQ ID NO: 2) siguiendo el dominio I, y iii) la cadena alfa truncada en la región transmembrana (amino ácidos 17-1029 en SEQ ID NO: 2), con una cola IgG4 para fines de purificación y detección. Estos constructos se ligan en el factor de expresión de mamífero pDCS1 o el vector de expresión procariótica pGEX-4T-3 (Pharmacia) y se secuencia el dominio I. Las proteínas de fusión se expresan entonces en Cos, CHO, o células E.coli transformadas o transfectadas con un constructo de expresión adecuado. Se purifica la proteína sobre una columna ProSepA (Bioprocessing Limited, Durham, Inglaterra), se comprueba la reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-IgG4 HP6023 y se visualiza sobre geles de poliacrilamida con coloración Coomassie.

Con el fin de construir un plásmido de expresión para todo el polipéptido \alpha_{d}, se modifica pATM.D12, descrito anteriormente, para expresar una proteína de fusión \alpha_{d}-IgG4 con el siguiente método. Se aísla ADN codificador de IgG4 del vector pDCS1 mediante PCR utilizando iniciadores que incorporan individualmente una zona de restricción 5' AatII (SEQ ID NO: 89) y una zona de restricción 3' XhoI (SEQ ID NO: 90).

5'-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3'	(SEQ ID NO: 89)

5'-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3'	(SEQ ID NO: 90)

Se digiere el plásmido pATM.D12 con AatII y XbaI y se liga en el vector lineal el producto IgG4 PCR adecuadamente digerido y purificado.

Ejemplo 15 Producción de anticuerpos monoclonales específicos de \alpha_{d} humanos

Las células transfectadas transitoriamente del ejemplo 7 se lavaron tres veces en solución salina con tampón de fosfato de Dulbecco (De-PBS) y se inyectaron a razón de 5 x 10^{6} células / ratón en ratones Balb/c con 50 \mug / ratón de muramil dipeptidasa (Sigma) en PBS. Se inyectaron a los ratones dos veces más, del mismo modo, a intervalos de dos semanas. El suero pre-sangrado e inmunizado de los ratones se examinó por análisis FACS según lo indicado en el ejemplo 9 y se fundió el bazo del ratón con la máxima reactividad a células transfectadas con \alpha_{d} / CD18. Se examinó por separado en los sobrenadantes de cultivo hibridoma la falta de reactividad contra células COS transfectada con CD11a/CD18 y la reactividad con células co-transfectadas con un plásmido de expresión \alpha_{d} y CD18.

Este método dio como resultado la ausencia de anticuerpos monoclonales.

Como alternativa para la producción de anticuerpos monoclonales, se purificó por afinidad, proteína de fusión soluble IgG4 dominio I de \alpha_{d} del sobrenadante de células CHO transfectadas establemente y se utilizó para inmunizar ratones Balb/c en la forma descrita anteriormente. Se establecieron los hibridomas y se examinó con ELISA la reactividad contra la proteína de fusión dominio I de \alpha_{d} de sobrenadantes de estos hibridomas. Se analizaron entonces los cultivos positivos para comprobar su reactividad con complejos \alpha_{d}/CD18 de longitud completa expresados sobre transfectantes CHO.

El ratón 1908 recibió tres inmunizaciones iniciales de células CHO transfectadas \alpha_{d} / Cd18 y dos refuerzos subsiguientes con heterodímero soluble \alpha_{d} / CD18. Dos inmunizaciones finales incluían 50 \mug / ratón de proteína de fusión I\alpha_{d} / IgG4. La fusión produjo 270 pocillos de producción IgG. El sobrenadante de 45 pocillos mostraba por lo menos una interacción con la proteína de fusión I\alpha_{d} / IgG4 7 veces mayor que con IgG4 humano con ELISA. Ninguno de los sobrenadantes reaccionó con células CHO transfectadas \alpha_{d} / CD18 según se determinó por análisis FACS.

Para determinar si los sobrenadantes eran capaces de reconocer proteínas de subunidad \alpha de integrina en otro contexto, se colorearon secciones esplénicas recientemente congeladas con sobrenadantes de 24 de los 45 pocillos. Se determinó que tres sobrenadantes eran positivos: uno coloreó células grandes en la pulpa roja, mientras que otros dos colorearon células dispersadas en la pulpa roja y también trabeculae.

Se analizó además la capacidad de estos sobrenadantes de inmuno precipitar complejos biotinilados CD18 de células CHO transfectadas \alpha_{d} / CD18 o células HL60 PMA-estimuladas. Se seleccionaron, para la subclonación ulterior, pocillos de fusión con sobrenadantes que reconocían proteínas en lisatos detergentes (que deberían tener una configuración no tan restringida como la proteína expresada como heterodímeros). Los anticuerpos monoclonales que reconocen proteína en detergente pueden ser más útiles en la inmuno precipitación de complejos heterodímeros de transfectantes, tejidos y líneas celulares.

Según otra alternativa, los anticuerpos monoclonales se generan del siguiente modo. La proteína heterodímera \alpha_{d} / CD18 purificada por afinidad a partir de lisatos detergentes de células CHO establemente transfectadas se utiliza con 50 \mug/ml de muramil dipeptidasa para inmunizar ratones Balb/c, según lo descrito anteriormente. Los ratones reciben tres inmunizaciones antes de determinar la seroreactividad contra \alpha_{d} / CD18 por inmuno precipitación de complejos biotinilados en los transfectantes CHO. Se establecen hibridomas de animales positivos según los protocolos normalizados, tras lo cual se seleccionan cultivos de hibridoma por citometría de flujo utilizando transfectantes \alpha_{d} / CD18. Los transfectantes CD11a / CD18 se utilizan para controlar la actividad de CD18 solamente.

Otra alternativa para la producción de anticuerpos monoclonales consiste en someter a ratones Balb/c a un protocolo de inmunización / inmunosupresión designado para reducir la reactividad a determinantes de célula CHO sobre transfectantes utilizados para la inmunización. Este protocolo comprende la inmunización con células CHO no transfectadas y la eliminación subsiguiente de plastocitos B CHO reactivos con tratamiento de ciclo fosfamida. Una vez que se han realizado tres tandas del tratamiento de inmunización y ciclofosfamida, los ratones se inmunizan con células transfectadas \alpha_{d} / CD18 CHO, según lo descrito anteriormente.

Otra alternativa más consiste en inmunoprecipitar complejos CD18 heterodímeros de lisatos detergentes de bazo completo utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD18 tras el pre-aclarado de CD11a / CD18 y CD11b / CD18. Los complejos CD11a / CD18 y CD11b / CD18 se preaclaran por cromatografía por afinidad utilizando anticuerpos monoclonales TS2/4 y Mol, respectivamente, acoplados a una resina cromatográfica. Los complejos CD18 restantes se utilizan como inmunógeno en ratones Balb/c para la primera inmunización. Se dan tres inmunizaciones a intervalos de tres semanas, administrándose la inmunización inicial junto con Adyuvante Completo de Freund y las inmunizaciones ulteriores con adyuvante Incompleto de Freund. Se comprueba por inmuno precipitación la reactividad \alpha_{d}-específica del suero. Los hibridomas resultantes se examinan por citometría de flujo con transfectantes \alpha_{d} / CD18 CHO.

Otra alternativa consiste en enriquecer complejos CD18 de lisatos detergente de células HL60 estimuladas con PMA por medio de pre-aclarado, según lo descrito anteriormente. Se aclaran en las mismas columnas otras integrinas \beta_{2}. La inmunización con los complejos resultantes, la producción de hibridoma y los protocolos de examen se realizan en la forma descrita anteriormente.

Ejemplo 16 Análisis de distribución de \alpha_{d} con suero policlonal

Se determinó la distribución del tejido de \alpha_{d} / CD18 utilizando antisuero policlonal. El antisuero utilizado para colorear el tejido se obtuvo de un ratón inmunizado tres veces con células CHO transfectadas \alpha_{d} (D6.CHO, \alpha_{d} / CD18) con péptido adyuvante y una vez con heterodímero \alpha_{d} / CD18 purificado. Un refuerzo final incluía solamente heterodímero \alpha_{d} / CD18. Se aclararon aproximadamente 100 \mum de suero inmunizado añadiendo aproximadamente 10^{8} células CHO transfectadas por LFA-1 durante 2 horas a 4ºC. Se examinó la reactividad \alpha_{d} del suero resultante en diluciones de 1/5000, 1/10000, 1/20000 y 1/40000 sobre bazo humano normal. El anticuerpo policlonal era reactivo a una dilución de 1/20000 mientras que una dilución de 1/40000 se coloreó de forma muy débil.

Una vez que se había determinado que el suero tenía reactividad específica \alpha_{d}, se utilizó para colorear varios tejidos linfoides y no linfoides. Se utilizaron en el mismo experimento, como controles, anticuerpos monoclonales que reconocen CD18, CD11a, CD11b, y CD11c. El coloreado de secciones de bazo normal con sueros policlonales \alpha_{d} y anticuerpos monoclonales a CD11a, CD11b, CD11c y CD18 mostró los siguientes resultados. El modelo observado con sueros policlonales \alpha_{d} no mostraba el mismo modelo de marcado que CD11a, CD11b, CD11c o CD18. Existe un modelo diferente de marcar con algunas células situadas en la zona marginal del a pulpa blanca y un marcado diferente de células periféricas a la zona marginal. Este modelo no se observó con los demás anticuerpos. Las células individuales dispersadas por la pulpa roja se marcaron también y pueden ser o no la misma población o subconjunto apreciado con CD11a y CD18.

El marcado con CD11c mostró algunas células que se coloreaban en la zona marginal pero el anticuerpo no mostró el modelo anular nítido en torno a la pulpa blanca si se compara con sueros policlonales \alpha_{d}, y el marcado en la pulpa roja tampoco dio el mismo modelo de coloreado que los sueros policlonales \alpha_{d}.

Por consiguiente, el modelo de marcado visto con el suero policlonal \alpha_{d} era único si se compara con el que se vió utilizando anticuerpos para las demás integrinas \beta (CD11a, CD11b, CD11c y CD18), y sugiere que la distribución in vivo de \alpha_{d} en el hombre es diferente de la de otras integrinas \beta.

Ejemplo 17 Aislamiento de clones de cADN de rata

A la vista de la existencia de subunidades de \alpha_{d} humanas y caninas, se realizaron intentos para aislar genes homogéneos en otras especies, inclusive la rata (este ejemplo) y el ratón (ejemplo 17, más adelante).

De una biblioteca \lambdagt10 (Clontech) esplénica de rata, se obtuvo una secuencia parcial de cADN de rata, que mostraba homología con el gen \alpha_{d} humano. La biblioteca se preparó en placas de Petri a razón de 2 x 10^{4} pfu / placa sobre 150 mm de placas LBM / agar. La biblioteca se "lifted" sobre membranas Hybond (Amersham), se desnaturalizó durante 3 minutos, se neutralizó durante 3 minutos y se lavó durante 5 minutos con tampones según lo descrito en los protocolos standard [Sambrook, et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, p.2.110]. Las membranas se colocaron inmediatamente en un Stratalinker (Stratagene) y el ADN se retículó utilizando el ajuste de auto reticulación. Las membranas se pre-hibridaron e hibridaron en 30% o 50% formamida, para condiciones de rigurosidad baja y alta, respectivamente. Las membranas fueron exploradas inicialmente con una sonda marcada ^{32}p, generada de cADN \alpha_{d} humano, correspondientes a bases 500 a 2100 en el clon 19A2 (SEQ ID NO:1). La sonda se marcó utilizando el kit Random Prime de Boehringer Mannheim según el protocolo sugerido por el fabricante. Los filtros se lavaron con 2X SSC a 55ºC.

Se identificaron dos clones, designados 684.3 y 705.1 que mostraban homología de secuencia con el \alpha_{d} humano, CD11b humano y CD11c humano. Ambos clones se alinearon con el gen \alpha_{d} humano en la región 3' del gen, partiendo en la base 1871 y extendiéndose a la base 3012 para el con 684.3, y base 1515 a 3367 para el clon 705.1

Con el fin de aislar una secuencia de rata más completa, que incluyera la región 5', se volvió a examinar la misma biblioteca utilizando el mismo protocolo empleado en el examen inicial, si bien utilizando una sonda de ratón generada a partir del clon A1160 (véase ejemplo 17, más abajo). Se seleccionaron placas aisladas, individuales del segundo examen y se mantuvieron como clones individuales sobre placa de LBM / agar. Se utilizaron iniciadores de secuenciación 434 FL y 434FR (SEQ ID NOS: 35 y 35, respectivamente) en un protocolo PCR standard para generar ADN para la secuenciación.

5'-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3'	(SEQ ID NO: 34)

5'-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3'	(SEQ ID NO: 35)

Se purificó el ADN del PRC utilizando una columna Quick Spin (Qiagen) según el protocolo sugerido por el fabricante.

Se identificaron dos clones designados 741.4 y 741.11 que solaparon los clones 684.3 y 705.1; en las regiones de solapamiento, los clones 741.1 y 741.11 eran 100% homólogos a los clones 684.3 y 705.1. En SEQ ID NO: 36 se presenta un cADN de rata compuesto que presenta homología con el gen \alpha_{d} humano; la secuencia amino ácida prevista se expone en SEQ ID NO: 37.

Clonación del extremo 5' de \alpha_{d} de rata

Se obtuvo un fragmento 5' cADN para el gen \alpha_{d} de la rata utilizando un kit de clonación RACE de bazo de rata Clonetech, según el protocolo sugerido por el fabricante Los oligo nucleótidos específicos del gen utilizados fueron designados 741.11#2R y 741.2 #1R (SEQ ID NOS. 59 y 58 respectivamente).

5'-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3'	(SEQ ID NO: 59)

5'-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3'	(SEQ ID NO: 58)

Oligo 741.11#2R abarca pares de bases 131-152 en SEQ ID NO: 36, en la orientación inversa y 741.2#1R abarca pares de bases 696-715 en SEQ ID NO: 36, también en la orientación inversa. Se realizó un PRC primario utilizando el oligo más 3', 741.2#1R. Siguió un segundo PCR utilizando oligo 741.11#2R y ADN generado de la reacción primera. Se detectó una banda de aproximadamente 300 pares de bases en un gel agarosa 1%. El producto PCR secundario se ligó en plásmido pCRTAII (Invitrogen) según el protocolo sugerido por el fabricante. Se cogieron colonias blancas (positivas) y se añadieron a 10 \mul de LBM que contenía un 1\mul de una solución madre de carbenicilina 50 mg / ml y 1 \mul de cultivo de fago M13 K07 en pocillos individuales en una placa para el cultivo de tejido de 96 pocillos, de fondo redondo. La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos a una hora. Tras el período de incubación inicial, se añadieron 100 \mul de LBM (que contenían 1 \mul de 50 mg / ml de carbenicilina y una dilución 1:250 de una solución madre de kanamicina 10 mg / ml) y se prosiguió con la incubación durante la noche a 37ºC.

Utilizando una punta de transferencia de metal esteril de 96 pocillos, se transfirió sobrenadante de la placa de 96 pocillos a 4 filtros de nylon Amersham Hybond. Los filtros se desnaturalizaron, se neutralizaron y se reticularon siguiendo protocolos standard. Los filtros fueron pre-hibridados en 20 mis de tampón de pre-hibridación (5X SSPE; 5X Denhardts; 1% SDS; 50 ugs/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado) a 50ºC durante varias hora agitando.

Se marcaron en la forma indicada a continuación oligo sondas 741.11#1 y 741.#1R (SEQ ID NOS. 56 y 57, respectivamente) que abarcaban pares de bases 86-105 (SEQ ID NO: 36) en la orientación hacia adelante e inversa respectivamente.

5'-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3'	(SEQ IN NO: 56)

5'-AGGTTAGACCCATGACAGG-3'	(SEQ ID NO: 57)

Se calentaron hasta 65ºC durante dos minutos aproximadamente 60 ng de oligo ADN en 12 \mul dH_{2}O. Se añadieron 3 \mul de 10 mCi/ml \gamma^{-32} P-ATP al tubo junto con tampón 4 \mul 5x Kinase (Gibco) y 1 \mul T4 ADN Kinase (Gibco). La mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Tras la incubación se añadieron 10 \mul de cada sonda oligo marcada, al tampón de prehibricación y a los filtros y se siguió con la hibridación durante la noche a 42ºC. Los filtros se lavaron tres veces en 5X SSPE; 0,1% SDS durante 5 minutos por lavado a temperatura ambiente, y se autoradiografiaron durante 9 horas. Los clones positivos se fueron expandidos y el ADN purificado utilizando el kit Magic Mini prep. (Promega) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Se eligió el clon 2F7 para la secuenciación, el cual mostraba 100% de homología con el clon 741.11 en la región de solapamiento. La secuencia de ácido nucleico de \alpha_{d} completa de la rata se puede ver en SEQ ID NO: 54; la secuencia de amino ácidos se puede ver en SEQ ID NO: 55.

Características de cADN de rata y secuencias de amino ácido

No se ha informado anteriormente de secuencias de ácido nucleico ni de amino ácidos para subunidades \alpha de rata en integrinas \beta_{2}. No obstante, la comparación con las subunidades de \alpha de la integrina humana \beta_{2} sugiere que el clon de rata aislado y su secuencia prevista de amino ácidos son muy afines a las secuencias de amino ácidos y de nucleotídos \alpha_{d}.

A nivel del ácido nucleico, el clon cADN de rata aislado muestra 80% de identidad en comparación con el cADN de \alpha_{d} humano; 68% de identidad en comparación con CD11b humano, 70% de identidad en comparación con CD11c humano; y 65% de identidad en comparación con CD11b de ratón. No se encuentra ninguna identidad notable en comparación con CD11a humano y CD11a de ratón.

A nivel de los amino ácidos, el polipéptido de rata previsto codificado por el cADN aislado muestra un 70% de identidad en comparación con el polipéptido \alpha_{d} humano; 28% de identidad en comparación con CD11 a humano; 58% de identidad en comparación con CD11b humano; 61% de identidad en comparación con CD11c humano; 28% de identidad en comparación con CD11a de ratón; y 55% de identidad en comparación con CD11b de ratón.

Ejemplo 18 Anticuerpos monoclonales contra proteínas de fusión de \alpha_{d} de rata dominio I / Hu IgG4

A la vista de que el dominio I de integrinas \beta_{2} humanas participa, como se ha demostrado, en la fijación de ligando, se ha supuesto que lo mismo se produciría para la proteína \alpha_{d} de rata. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales inmuno específicos del dominio I de \alpha_{d} de la rata pueden ser útiles en modelos de rata de estados patológicos humanos en los que está implicada la fijación de \alpha_{d}.

Se generaron oligos "rata alfa-DI5" (SEQ ID NO: 87) y "rata-alfa-DI3" (SEQ ID NO: 88) a partir de la secuencia \alpha_{d} de rata correspondientes a pares de bases 469-493 y pares de bases 1101-1125 (en orientación inversa), respectivamente, en SEQ ID NO: 54. Los oligos se utilizaron en una reacción PCR standard para generar un fragmento de ADN \alpha_{d} de rata que contenía el dominio I que abarca pares de bases 459-1125 en SEQ ID NO:54. El producto PCR se ligó en el vector pCRTAII (Invitrogen) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Se seleccionó una colonia positiva y se expandió para la purificación de ADN utilizando un kit Qiagen (Chatswoth, GA) Midi prep. según el protocolo del fabricante. Si se digirió el ADN con XhoI y BgIII en un digestor de enzima de restricción standard y una banda de par de base 600 se purificó con gel y se purificó ulteriormente en el vector de expresión pDCS1/HulgG4. Se seleccionó una colonia positiva, se expandió y se purificó el ADN con un kit Qiagen Maxi Prep.

Se cultivaron células COS en placas de Petri a semi confluencia sobre placas de cultivo de 100 mm y se cultivaron durante la noche a 37ºC en 7% CO_{2}. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de DMEM. Se añadieron a 5 ml de DMEM, 50 \mul de DEAE-dextrano, 2 \mul de cloroquina y 15 \mul de ADN HulgG4/dominio I \alpha_{d} de rata, descrito anteriormente. Se añadió la mezcla a las células COS y se incubó a 37ºC durante 3 horas. Se quitó entonces el medio y se añadió durante exactamente 1 minuto 5 ml 10% DMSO en CMF-PBS. Las células se enjuagaron cuidadosamente una vez con DMEM. Se añadieron 10 ml de DMEM que contenía 10% FBS a las células y siguió la incubación durante la noche a 37ºC en 7% CO_{2}. Al día siguiente, el medio se sustituyó por otro fresco y siguió la incubación durante tres días más. Se recolectó el medio y se añadió medio fresco a la placa. Después de tres días se volvió a recoger el medio y se descartaron las placas. El procedimiento se repitió hasta recoger 2 litros de sobrenadante de cultivo.

El sobrenadante recogido según lo descrito anteriormente se cargó sobre una columna Prosep-A (Bioprocessign Limited) y la proteína se purificó según lo descrito a continuación.

La columna se lavó inicialmente con 15 volúmenes de columna de tampón Wash que contenía 25 mM Tris 150 mM NaCl, pH 7,5. El sobrenadante se cargó a una velocidad reducida inferior a aproximadamente 60 volúmenes de columna por hora. Después de la carga, se lavó la columna con 15 volúmenes de columna de tampón Wash, 15 volúmenes de columna de 0,55 M dietanolamina, pH 8,5, y 15 volúmenes de columna 50 mM ácido cítrico, pH 5,0. Se eluyó la proteína con 50 mM de ácido cítrico, pH 3,0. La proteína se neutralizó con 12,0 M Tris, pH 8,0, y se dializó en PBS estéril.

La proteína dominio I \alpha_{d} de rata se analizó en la forma descrita en el Ejemplo 14. La proteína detectada migró del mismo modo que lo observado con la proteína humana dominio I.

Protocolo de inmunización

Se inmunizaron individualmente unos ratones con 50 \mug de proteína de fusión \alpha_{d} dominio I/HulgG4 de rata purificada, previamente emulsionada en un volumen igual de Adyuvante Completo de Freunds (FCA) (Sigma). Se inyectaron aproximadamente 200 \mul de la preparación antígeno / adyuvante en 4 zonas en la parte posterior y los flancos de cada uno de los ratones. Dos semanas más tarde se reforzaron los ratones con una inyección de 100 \mul de antígeno dominio I \alpha_{d} / HulgG4 de rata (50 \mug / ratón) previamente emulsionado en un volumen igual de Adyuvante Incompleto de Freunds (FIA). Tras otras dos semanas, los ratones se reforzaron con 50 \mug de antígeno en 200 \mul PBS inyectado por vía intravenosa.

Para evaluar las concentraciones de suero en los ratones inmunizados, se realizaron extracciones retro orbitales en los animales 10 días después de la tercera inmunización. Se dejó que la sangre se coagulara y se aisló el suero por centrifugación. El suero se utilizo en una inmuno precipitación sobre esplenocitos de rata biotinilados (BIP). El suero de cada uno de los ratones inmuno-precipitó bandas de proteína de peso molecular esperado para \alpha_{d} de rata y CD18 de rata. Se eligió un ratón para la fusión y se reforzó una cuarta vez en la forma descrita anteriormente para el tercer refuerzo.

Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron por captura anticuerpo en la forma descrita a continuación. Se revistieron placas de Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, Massachussets) a 4ºC con 50 \mul/pocillo de IgA, IgG o IgM anti-ratón cabra (Organon Teknika) diluido en 1:5000 en 50 mM de tampón de carbonato, pH 9,6. Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,05% Tween 20 (PBST) y se añadieron 50 \mul de sobrenadante de cultivo. Tras la incubación a 37ºC durante 30 minutos y el lavado en la forma descrita anteriormente, se añadieron 50 pi de IgG9 (Fc) anti ratón cabra preoxidas-conjugada de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) diluido 1:3500 en PBST. Se incubaron placas en la forma descrita anteriormente y se lavaron cuatro veces con PBST. Inmediatamente después, se añadieron 100 \mul de substrato, que contenía 1 mg/ml o-fenilen diamina (Sigma) y 0,1 \mul/ml 30% H_{2}O_{2} en 100 mM de citrato, pH 4,5. Se detuvo la reacción de color a los 5 minutos con la adición de 50 \mul de 15% H_{2}SO_{4}. Se leyó la absorbancia a 490 nm en un lector de placa Dynatech.

Se analizó también por medio de ELISA el sobrenadante de los pocillos que contenían anticuerpo con proteína de fusión \alpha_{d} dominio I/HulgG4 de rata inmovilizada. Sirvió de control de la reactividad frente al colaborador de fusión IgG un ELISA con placas revestidas con anticuerpo HulgG4. Se eligieron pocillos positivos para seguir cribando por BIP sobre lisatos de esplenocito de rata utilizando las técnicas descritas a continuación.

Biotinilación de antígenos de superficie celular

Se sacrificaron ratas por asfixia con CO_{2} y se quitaron los bazos utilizando técnicas quirúrgicas standard. Los esplenocitos se recogieron haciendo pasar suavemente el bazo a través de un pistón de jeringa de 3 cc en 20 mls RPMI. Las células se recogieron en un tubo cónico de 50 ml y se lavaron en el tampón adecuado.

Las células se lavaron tres veces en D-PBS y se re-suspendieron a una densidad de 10^{8} a 10^{9} células en 40 ml de PBS. Se añadieron 4 mg de NHS-biotina (Pierce) a la suspensión celular y se dejó que continuara la reacción durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se granularon y lavaron 3 veces en D-PBS frío.

Lisatos celulares

Se resuspendieron células a una densidad de 10^{8} células /ml en tampón de lisis frío (1% NP40; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 2 mM CaCl; 2 mM MgCl; solución 1:100 de pepstaina, leupeptina y aprotinina, añadidas justo antes de añadir a las células y 0,0001 g de cristales de PMSF añadidos justo antes de añadir a las célula). Se sometieron los lisatos a movimiento vorticial durante aproximadamente 30 segundos, se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y se siguieron incubando durante 15 minutos sobre hielo. Se centrifugaron los lisatos durante 10 minutos a 10.000 xg para granular el material insoluble. Se recogió el sobrenadante en un nuevo tubo y se almacenó a temperaturas comprendidas entre 4ºC y -20ºC.

Inmuno precipitación

Se pre-aclaró por incubación 1 ml de lisato celular con 200 \mul de una pasta de sepharose A de proteína (Zymed) durante la noche a 4ºC. El lisato pre-aclarado se introdujo a partes iguales en tubos Eppendorf a razón de 50 \mul / tubo para cada anticuerpo sometido a prueba. Se añadieron a los lisatos pre-aclarados 25 \mul de suero policlonal o 100 a 500 \mu de sobrenadante de anticuerpo monoclonal y la mezcla resultante se incubó durante 2 horas a 4ºC con rotación. Se añadieron entonces 100 \mul de IgG anti ratón conejo (Jackson) ligado a perlas de sepharosa A proteína en una pasta de PBS y se continuó la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente con rotación. Se granularon perlas con una centrifugación suave y se lavaron tres veces con tampón Wash frío (10 mM HEPES; 0,2 M NaCl; 1% Trition X-100). Se quitó por aspiración el sobrenadante y se añadieron 20 \mul de tampón de muestra 2X SDS que contenía 10% de \beta-mercaptoetanol. La muestra se hirvió durante 2 minutos en un baño de agua y se cargó sobre un gel SDS PAGE 5%. Tras la separación, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa con corriente constante durante la noche. Los filtros de nitrocelulosa se bloquearon con 3% BSA en TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente y se quitó el tampón de bloqueo. Se añadió una dilución 1:6000 de conjugado strepavidin-HRP (Jackson) en 0,1% BSA TBS-T y continuó la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los filtros se lavaron tres veces durante 15 minutos cada uno con TBS-T y se auto radiografiaron utilizando el kit ECL de Amersham siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante.

Ejemplo 19 Aislamiento de clones de cADN de ratón

Se intentó el aislamiento de un homólogo de \alpha_{d} de ratón.

Se realizó la hibridación de especies cruzadas utilizando 2 sondas generadas por PCR: un fragmento 1,5 kb correspondiente a bases 522 a 2047 de clon humano 19A2 (SEQ ID NO:1) y un fragmento de rata de 1,0 kb que corresponde a bases 1900 a 2900 en clon humano 19A2 (SEQ ID NO:1). La sonda humana se generó por PCR utilizando pares de iniciadores designados ATM-2 y 9-10.1 expuestos en SEQ ID NOS: 38 y 49, respectivamente; la sonda de rata se generó utilizando pares de iniciadores 434L y 434R, expuestos en SEQ ID NOS: 34 y 35, respectivamente. Se incubaron muestras a 54ºC durante 4 minutos y se sometieron a 30 ciclos de la secuencia gradual de temperaturas 94ºC; 50ºC 2 minutos; 72ºC, 4 minutos.

5'-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3'	(SEQ ID NO: 38)

5'-GTCCAGCAGACTAAGAGCACGG-3'	(SEQ ID NO: 39)

Los productos PCR se purificaron utilizando el kit Qiagen Quick Spin según el protocolo sugerido por el fabricante y se marcaron aproximadamente 180 ng de ADN con 200 \muCi [^{32}P]-dCTP utilizando un kit de Marcado de Iniciador Aleatorio de Boehringer Mannheim siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Se quitó el isótopo no incorporado utilizando una columna Centri-sep Spin (Princeton Separations, Adelphia, NJ) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Se desnaturalizaron las sondas con 0,2 N en NaOH y se neutralizaron con 0,4 M Tris-HCI, pH 8,0 antes de usarlos.

Se preparó en placas de Petri una biblioteca cADN oligo dT-iniciada tímica de ratón en lambda ZAP II (Stratagene) a razón de aproximadamente 30.000 placas por placa de 15 cm. Se incubaron los "lifts" de la placa sobre filtros de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene, NH) a 50ºC con agitación durante 1 hora en una solución de prehibridación (8 ml/ lift) que contenía 30% de formamida. Se añadieron sondas de rata y humanas marcadas a la solución de prehibridación y siguió la incubación durante la noche a 50ºC. Se lavaron dos veces los filtros en 2X SSC/0,1% a temperatura ambiente, uno en 2X SSC/0,1% SDS a 37ºC, y uno en 2X SSC/0,1% SDS a 42ºC. Se expusieron filtros sobre película Kodak X-Omat AR a -80ºC durante 27 horas con una pantalla reforzadora.

Cuatro placas que daban señales positivas sobre lifts duplicados se volvieron a estriar sobre medio LB con placas de magnesio (LBM) / carbenicilina (100 mg/ml) y se incubaron durante la noche a 37ºC. Las placas de fagos se liftaron con filtros Hybond (Amersham) se probaron como en la pantalla inicial y se expusieron sobre película Kodak X-Omat AR durante 24 horas a -80ºC con una pantalla reforzadora.

Se transfirieron 12 placas que daban señales positivas a un diluyente Mg^{++} reducido que contenía 10 mM Tris-HCl y 1 mM MgCl_{2}. El tamaño del inserto se determinó por amplificación PCR utilizando iniciadores T3 y T7 (SEQ ID NOS: 13 y 14, respectivamente) y las siguientes condiciones de reacción. Las muestras se incubaron a 94ºC durante 4 minutos y se sometieron a 30 ciclos de la secuencia gradual de temperaturas: 94ºC, durante 15 segundos; 50ºC durante 50ºC; y 72ºC durante 1 minuto.

Seis muestras produjeron bandas distintas cuyo tamaño oscilaba entre 300 bases y 1 kb. Se liberaron fagómidos vía co-infección con fago ayudante y se recircularizaron para generar Bluescript SK (Stratagene). Las colonias resultantes se cultivaron en LBM / carbenicilina (100 mg / ml) durante la noche. Se aisló ADN con un kilt miniprep Promega Wizard (Madison, WI) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. El análisis de restricción EcoRI de ADN purificado confirmó los pesos moleculares que se habían detectado utilizando PCR. Se secuenció el ADN inserto con M13 y M13 inverso.1 iniciadores que figuran en SEQ ID NOS: 40 y 41 respectivamente.

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'	(SEQ ID NO: 40)

5-'GGAAACAGCTATGACCATG-3'	(SEQ ID NO: 41).

La secuenciación se realizó en la forma descrita en el Ejemplo 4.

De los seis clones, solo dos, designados 10.3-1 y 10.5-2 proporcionaron información sobre la secuencia y eran idénticos a fragmentos de 600 bp. La secuencia de 600 bp era 68% idéntica a una región correspondiente de \alpha_{d}, 40% idéntica a CD11a humano, 58% idéntica a CD11 humano y 54% idéntica a CD11b de ratón. Este fragmento de 600 bp se utilizó luego para aislar un cADN más completo codificador de un homólogo de \alpha_{d} de ratón putativo.

Se preparó en placas de Petri una biblioteca de cADN esplénica de ratón (oligo dT y con iniciador aleatorio) en lambda Zap II (Stratagene) a razón de 2,5 x 10{4} fago/placa LBM 15 cm. Las placas liftadas sobre membranas de transferencia de nylon Hybond (Amersham), se desnaturalizaron con 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl, se neutralizaron con 0,5 M Tris Base/1,5 M NaCl/11.6 HCl y se lavaron en 2X SCC. El ADN se reticuló en filtros por radiación ultravioleta.

Se cribaron aproximadamente 500.000 placas utilizando sondas 10.3-1 y 10.5-2 previamente marcadas en la forma descrita anteriormente. Se añadieron sondas a una solución de pre-hibridación y se incubaron durante la noche a 50ºC. Los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente, una vez en 2X SSC/0,1% SDS a 37ºC y una vez en 2X SSC/0,1% SDS a 42ºC. Los filtros se expusieron sobre película Kodak X-Omat AR durante 24 horas a -80ºC con pantalla reforzadora. Catorce placas que daban señales positivas sobre lifts duplicados se sometieron a un cribado idéntico al del cribado inicial salvo los lavados finales adicionales de gran rigurosidad en 2X SSC/0,1% SDS a 50ºC, en 0,5X SSC/0,1% SDS a 50ºC, y a 55ºC en 0,2X SSC/0,1% SDS. Los filtros se expusieron sobre película Kodak X-Omat AR a -80ºC durante 13 hora con una pantalla reforzadora.

Se transfirieron 18 placas positivas a un diluyente reducido de fago Mg^{++} y se determinó el tamaño del inserto por amplificación PCR en la forma descrita anteriormente. Siete de las muestras dieron bandas individuales cuyo tamaño oscilaba entre 600 bp y 40 kb. El análisis de restricción EcoRI de ADN purificado confirmó los tamaños observados de PCR y se secuenció el ADN con iniciadores M13 y M13 inverso.1 (SEQ ID NOS: 40 y 41 respectivamente).

Un clon designado B3800 contenía un inserto 4 kb que correspondía a una región 200 bases downstream del extremo 5' del \alpha_{d} humano clon 19A2 e incluía 553 bases de una región 3' no traducida. El clon B3800 mostraba un 77% de identidad con una región correspondiente de \alpha_{d} humano, 44% de identidad con una región correspondiente de CD11a humano, 59% de identidad con una región correspondiente de CD11c humano y 51% de identidad con una región correspondiente de CD11b de ratón. El segundo clon A1160 era un inserto de 1,2 kb que se alineaba con el extremo 5' de la región codificadora del \alpha_{d} humano aproximadamente 12 ácidos nucleicos downstream de la metionina de iniciación. El clon A1160 mostró 75% de identidad con una región correspondiente de \alpha_{d} humano, 46% de identidad con una región correspondiente de CD11a humano, 62% de identidad con una región correspondiente de CD11c humano y 66% de identidad con una región correspondiente de CD11b de ratón.

El clon A1160, el fragmento más cercano al extremo 5' del clon humano 19A2 tiene una longitud de 1160 bases y comparte una región de solapamiento con el clon B3800 que comienza en la base 205 y sigue hasta la base 1134. El clon A1160 contiene una inserción base 110 (bases 704-814 del clon A1160) no presente en la región de solapamiento del clon B3800. Esta inserción se produce en un límite probable exon-intron [Fleming et al., J.Immunol. 150:480-490 (1993)] y se quitó antes de la ligación ulterior de clones A1160 y B3800.

Amplificación rápida del extremo 5'cADN del clon de \alpha_{d} de ratón putativo

Se utilizó RACE PCR [Frohman, "RACE Rapid Amplification of cADN Ends" (Amplificación Rápida de Extremos de cADN) en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al. (eds.) pp. 28-38, Academic Press: Nueva York (1990)] para obtener las secuencias 5' que faltaban del clon de \alpha_{d} de ratón putativo, inclusive la secuencia 5' no traducida y la metionina de iniciación. Se utilizó un kit RACE-Ready esplénico de ratón Clontech, Palo Alto, CA) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Se diseñaron dos iniciadores anti sentido, gen-específicos, A1160 RACE1-primario y A1160 RACE2-encajado (SEQ ID NOS: 42 y 43), para realizar un PCR primario y encajado.

5'-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3'	(SEQ ID NO: 42)

5'-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3'	(SEQ ID NO: 43)

Los iniciadores, SEQ ID NOS: 42 y 43, corresponden a regiones que comienzan en bases 302 y 247 del extremo 5', respectivamente. Se realizó en la forma descrita en PCR utilizando el iniciador de fijación 5' (SEQ ID NO. 44) y el cADN de bazo de ratón suministrado con el kit.

\newpage

5'-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCCGAT

(SEQ ID NO: 44)

La electrofóresis del producto PCR reveló una banda de aproximadamente 280 bases de tamaño, que se subclonó utilizando un kit de donación TA (Invitrogen) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Se cultivaron diez colonias resultantes y se aisló y secuenció el ADN. Se identificaron con este método 60 bases adicionales de secuencia 5' que corresponden a bases 1 a 60 en SEQ ID NO: 45.

Características del cADN de ratón y secuencia de amino ácido prevista

En SEQ ID NO. 45 se presenta una secuencia compuesta del cADN de ratón que codifica un homólogo putativo de \alpha_{d} humano. Aunque la homología entre los dominios externos de los clones humanos y de ratón es elevada, la homología entre los dominios citoplásmicos es solamente de 30%. La variación observada puede indicar diferencias funcionales C-terminales entre las proteínas humanas y de ratón. Alternativamente, la variación entre los dominios citoplásmicos puede ser debida a la variación splice (empalme) o puede indicar la existencia de unos o varios genes adicionales de integrina \beta_{2}.

A nivel del amino ácido, el cADN de ratón predice una proteína (SEQ ID NO: 46) con 28% de identidad con CD11a de ratón, 53% de identidad con CD11b de ratón, 28% de identidad con CD11 a humano, 55% de identidad con CD11b humano, 59% de identidad con CD11c humano y 70% de identidad con \alpha_{d} humano. La comparación de las secuencias de amino ácido de los dominios citoplásmicos de \alpha_{d} humano y el homólogo de ratón putativo indica regiones de misma longitud pero que tienen estructura primaria diferente. La longitud de secuencia similar en estas regiones sugiere una variación de especie más que formas variantes splice (de empalme). Si se compara con el polipéptido de rata predicho, ejemplo 16 anterior, los dominios citoplásmicos de ratón y rata muestran una identidad superior al 60%.

Ejemplo 20 Aislamiento de clones adicionales de ADN de \alpha_{d} de ratón para verificación de secuencia

Con el fin de verificar las secuencias de ácidos nucleicos y amino ácidos descritos en el ejemplo 19 para el \alpha_{d} de ratón, se aislaron secuencias adicionales de ratón con vistas a la confirmación.

El aislamiento de cADN de ratón por hibridación por dos sondas de \alpha_{d} homólogas (3' y 5') se realizó utilizando una biblioteca de iniciación aleatoria esplénica de ratón y una biblioteca de cADN oligo dT-iniciada en lambda ZAP II (Stratagene). La biblioteca se preparó en placa de Petri a razón de 5 x 10^{5} fagos por placa LBM de 15 cm. Las placas se liftaron sobre membranas de nylon Hybond (Amersham) y las membranas se desnaturalizaron (0,5 M NaOH/1.5 M NaCl) se neutralizaron (0,5 M Tris Base/1,5 M NaCl/11.6 M HCl) y se lavaron (solución salina 2X SSC). El ADN se reticuló en filtros por radiación ultravioleta.

Las sondas se generaron utilizando iniciadores descritos más abajo en una reacción PCR en las siguientes condiciones. Las muestras se mantuvieron a 94ºC durante 4 minutos y luego se sometieron a 30 ciclos de la secuencia gradual de temperatura (94ºC durante 15 segundos; 50ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 1 minuto en un termo ciclador Perkin-Elmer 9600).

La sonda 3' tenía aproximadamente 900 bases de longitud y abarcaba una región de nucleotídos 2752 a 3651 (en SEQ ID NO:1) (5' \rightarrow 3') y se produjo con iniciadores 11.b-1/2FOR11 y 11.b.-1/2REV2 según se indica en SEQ ID NOS: 69 y 74, respectivamente. Esta sonda se utilizó en un primer conjunto de lifts. La sonda 5' tenía aproximadamente 800 bases de longitud y abarcaba una región de nucleotídos 149 a 946 (en SEQ ID NO: 1) (5'\rightarrow 3') y se produjo con iniciadores 11.b-1/2FOR1 y 11.a-1/1REV1 según se muestra en SEQ ID NOS: 50 y 85, respectivamente). Esta sonda se utilizó en un segundo conjunto de lifts.

En un tercer conjunto de lifts, se utilizaron las dos sondas descritas anteriormente juntas en las mismas placas.

Se cribaron aproximadamente 500.000 placas utilizando las dos sondas anteriores que se marcaron tal como se describe en el ejemplo 17. Las sondas marcadas se añadieron a una solución de pre-hibridación, que contenía 45% de formamida y se incubaron durante la noche a 50ºC. Los filtros se lavaron dos veces en 2X SSC/0,1/ SDS a temperatura ambiente (22ºC). Se realizó un lavado final en 2X SSC/0,1% SDS a 50ºC. Se realizó la autoradiografía durante 19 horas a -80ºC sobre película Kodak X-Omat AR con una pantalla reforzadora.

Trece placas que dieron señales positivas sobre por lo menos lifts duplicados se sometieron a un segundo cribaje secundario realizado en la forma descrita para el cribado inicial con la diferencia de que se utilizaron las sondas marcadas 3' y 5' para la hibridación y se incorporó un lavado final adicional utilizando 2X SSC/0,1% SDS a 65ºC. Se realizó la autografía en la forma descrita anteriormente durante 2,5 horas.

Trece placas (designadas MS2P1 a MS2P13) que daban señales positivas se transfirieron a un diluyente reducido Mg^{++} fago. El tamaño del inserto se determinó por amplificación PCR (termociclador Perkin-Elmer 9600) utilizando iniciadores T3 y T7 con hibridación a fagómido Bluescript en ZAP II (secuencia descrita anteriormente) en las misma condiciones mostradas anteriormente. Los tamaños de banda oscilaban entre 500 bases y Kb. Se aislaron fagómidos, se prepararon y secuenciaron con iniciadores M13 y M13 inverso. (SEQ ID NOS: 40 y 41, respectivamente). Cinco de los trece clones MSP2-3, MS2P-6, MS2P-9, MS2P-12 y MS2P-13 se secuenciaron y juntos, representaron una región de aproximadamente 200 bases en el extremo 5' hasta aproximadamente 300 bases pasado un primer codón de terminación en el extremo 3'.

Se realizó la secuenciación automática según se describe en el ejemplo 4 utilizando primero iniciadores M13 y M13 inverso.1 (SEQ ID NOS: 40 y 41, respectivamente) para secuenciar los extremos de cada clon y determinar su posición respecto del constructo #17 (SEQ ID NO: 45). Se secuenció entonces completamente cada clon utilizando los iniciadores adecuados (indicados a continuación) para esta región particular.

65

66

Se editaron secuencias, se alinearon y se compararon con una secuencia \alpha_{d} de ratón previamente aislada (constructo nº. 17,SEQ ID NO: 45).

La alineación de las nuevas secuencias reveló una supresión de 18 bases en el constructo nº. 17 empezando en el nucleótido 2308; la supresión no causó ninguna desviación en el marco de lectura. El clon MS2P9, secuenciado en la forma descrita anteriormente, también reveló la misma supresión de 18 bases. Se ha observado que la supresión ocurre en 50% de los clones de ratón que incluyen la región pero no se ha detectado en clones de \alpha_{d} humano o de rata. La supresión de 18 bases se caracteriza por una secuencia palíndromo de 12 bases AAGCAGGAGCTCCTGTGT (SEQ ID NO: 91). Esta repetición invertida en la secuencia de ácido nucleico es auto complementaria y puede formar un bucle (loop out) produciendo segmentación durante la transcripción inversa. La secuencia de \alpha_{d} de ratón que incluye las 18 bases adicionales se indica en SEQ ID NO: 52; la secuencia de amino ácido deducida se indica en SEQ ID NO: 53.

Ejemplo 21 Hibridaciones in situ en ratón

Se determinó entonces la distribución tisular para \alpha_{d} de ratón con el fin de ofrecer una comparación con la de los humanos, descrita en el ejemplo 6.

Se generó una sonda mARN 200 bp de una sola cadena de un molde ADN, correspondiente a nucleotídos 3460 a 3707 en la región citoplásmica de cola del cADN de murino, por transcripción ARN in vitro que incorpora ^{35}S-UTP (Amersham).

Se hibridaron in situ con la sonda radio marcada de mARN de una sola cadena embriones completos de ratón (cosechados los días 11-18 después de la fertilización) y varios tejidos de ratón, inclusive el bazo, riñón, hígado, intestino y timo.

Los tejidos se seccionaron a espesores de 6 \mum, se adhirieron a porta objetos revestidos de Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), y se almacenaron a -70ºC. Antes de la utilización, se quitaron los porta objetos de -70ºC y se coloraron a 50ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se fijaron secciones en 4% de paraformaldehido durante 20 minutos a 4ºC, se deshidrataron con un gradiente creciente de etanol (70-95-100%) durante 1 minuto a 4ºC en cada concentración y se secó al aire durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se desnaturalizaron durante 2 minutos a 70ºC en 70% de formamida/2X SSC, se enjuagaron dos veces en 2X SSC, se deshidrataron con el gradiente de etanol descrito anteriormente y se secaron al aire durante 30 minutos. La hibridación se realizó durante la noche (12-16 horas) a 55ºC en una solución que contenía ribo-sondas marcadas ^{35}S a razón de 6 x 10^{5} cpm/sección y agua tratada con (DEPC) dietilpirocarbonato para obtener una concentración final de 50% de formamida, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% de sulfato de dextrano, solución Denhardt 1X, 100 mM de ditiotreitol (DTT) y 5 mM EDTA. Tras la hibridación, se lavaron durante 1 hora las secciones a temperatura ambiente en 4X SSC/10 mM DTT, 40 minutos a 60ºC en 50% de formamida/2X SSC/10 mM DTT, 30 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC, y 30 minutos a temperatura ambiente en 0,1 X SSC. Las secciones se deshidrataron, se secaron al aire durante 2 horas, se revistieron con emulsión fotográfica Kodak NTB2, se secaron al aire durante 2 horas, se revelaron, (después de almacenar a 4ºC en completa oscuridad) y se contra-colorearon con hematoxilina / eosina.

El tejido del bazo mostraba una señal fuerte principalmente en la pulpa roja. Este modelo se corresponde con el de la distribución de macrófago tisular en el bazo pero no excluye otros tipos de células.

Ejemplo 22 Generación de constructos de expresión de ratón

El objeto de construir un plásmido de expresión que incluyera secuencias de cADN de ratón que mostraban homología con \alpha_{d} humano, se ligaron insertos (¿) de clones A1160 y B3800. Antes de esta ligación sin embargo se añadió al clon A1160 una secuencia lider 5' que incluía una metionina de iniciación. Se diseñó un iniciador designado lider PCR 5' "(SEQ ID NO: 47) que contuviera: (1) bases no específicas idénticas en posiciones 1-6 que permitieran la digestión; (2) una zona BamHI (subrayada en SEQ ID NO: 47) de posiciones 7-12 para facilitar la subclonación en un vector de expresión; (3) una secuencia de consenso Kozak de posiciones 13-18, (4) una secuencia de señal que incluyera un codón para una metionina de iniciación (negrita en SEQ ID NO: 47) y (5) 31 bases adicionales de secuencia específicamente de solapamiento 5' (¿) del clon A1160 que permitiera la hibridación del inhibidor. Se utilizó un segundo iniciador designado 3' end frag" (SEQ ID NO: 48) con el iniciador "5' PCR leader" para amplificar el inserto del clon A1160.

5'-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTC-

-GGCACTGTRGATCCTCCTGTGTG-3'N	(SEQ ID NO: 47)

5'-GCTGGACGATGGCATCCAC-3'	(SEQ ID NO: 48)

El producto PCR resultante no se digirió con BamHI, sugiriendo que un número insuficiente de bases precedía la zona de restricción, impidiendo el reconocimiento por la enzima. La longitud de la secuencia "de cola" que precede la zona BamHI en el iniciador 5' (SEQ ID NO: 47) se incrementó y se repitió el PRC sobre el producto de amplificación del primer PCR. Se diseñó un iniciador 5', designado mAD.5'.2 (SEQ ID NO: 49) con bases adicionales no específicas en posiciones 1-4 y uno adicional de 20 bases que solapaba específicamente las secuencias de iniciador utilizadas previamente "5' PCR lider".

5'-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3'

(SEQ ID NO: 49)

Se utilizaron iniciadores "mAD.5'.2" y "3' end frag" juntos en PCR con el producto de la primera amplificación como molde. Se subclonó un producto secundario resultante PCR en plásmido pCRtmII (Invitrogen) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante y se transformó en células competentes One shot (Invitrogen). Se identificó por análisis enzimático de restricción utilizando BamHI EcoRI y se secuenció un clon que contenía el producto PCR. Una vez verificada la secuencia, se aisló el inserto (¿) por digestión con BamHI y EcoRI y se purificó con gel.

El inserto del clon B3800 se aisló por digestión con EcoRI y NotI, se purificó con gel y se añadió a una reacción de ligación que incluía el fragmento aumentado A1160 BamHI/EcoRI. Se dejó actuar la ligación durante 14 horas a 14ºC. Se añadió vector pcADN.3 (Invitrogen), digerido con BamHI y NotI, a la reacción de ligación con ligasa adicional y se siguió con la reacción durante otras 12 horas. Una parte de la mezcla de reacción se transformó en células competentes E.coli, se cultivaron las colonias resultantes y se identificó un clon positivo por análisis PCR con los iniciadores 11.b-1/2FOR1 y 11.b-1/2REV11 (SEQ ID NOS. 50 y 51, respectivamente). Estos iniciadores puentean los fragmentos A1160 y B3800, por lo que la detección de un producto de amplificación indica que los dos fragmentos han sido ligados. La secuencia del clon positivo se verificó con los iniciadores indicados en SEQ ID NOS: 50 y 51, que amplifican de base 100 a 1405 después de la metionina iniciadora.

Ejemplo 23 Construcción de un ratón Knock-out

Con el fin de evaluar de forma más precisa el papel inmunológico de la proteína codificada por el cADN de \alpha_{d} ratón putativo, se diseñó un ratón "Knock-out" en el que la secuencia genómica de ADN que codifica el homólogo de \alpha_{d} putativo se rompe por recombinación homóloga. Se evalúa aquí el significado de la proteína codificada por el gen destruido por la ausencia de la proteína codificada. En Deng, et al.,Mol.Cell.Biol. 13:2134-2140 (1993) se describe la generación de ratones "Knock-out".

El diseño de este tipo de ratón comienza con la construcción de un plásmido que contiene secuencias que se van a "knocked out" por eventos de recombinación homóloga. Se utilizó un fragmento de par de bases 750 del cADN de ratón (correspondiente a nucleotídos 1985 a 2733 en SEQ ID NO: 45) para identificar una secuencia genómica de ratón que codifica el homólogo de \alpha_{d} de ratón putativo a partir de una biblioteca genómica \lambdaFIXII. El cribado primario dio como resultado 14 placa positivas, siete de las cuales se confirmaron por cribado secundario. Se obtuvieron lisatos líquidos de dos de las placas que daban la señal más fuerte y se aisló el \lambda ADN utilizando métodos convencionales. La fotogrametría de restricción y el análisis Southern confirmaron la autenticidad de un clon (designado 14-1, y se aisló el inserto ADN por digestión con NotI. Este fragmento se clonó en Bluescript SKII^{+}.

Con el fin de identificar un fragmento de restricción de aproximadamente 9 a 14 kb, longitud que según los informes optimiza la probabilidad de eventos de recombinación homóloga, se realizó la hibridación Southern con la sonda cADN 750 bp. Antes de la hibridación, se construyó un mapa de restricción (¿) para el clon 14-1. Se identificó un fragmento 12 kb como posible candidato y este fragmento se subclonó en Bluescript SKII^{++} en una posición en la que el ADN de ratón está flanqueado por cassettes de codificación de timidina quinasa. El análisis ulterior de este clon con una sonda de dominio I (correspondientes a nucleotídos 454-1064 en SEQ ID NO: 45) indicó que el clon no contenía secuencias de codificación de dominio I.

Utilizando la misma sonda de dominio I, se volvió a cribar la biblioteca genómica \lambdaFIXII. Inicialmente, se detectaron seis clones positivos, uno de los cuales siguió siendo positivo en el cribado secundario. El ADN aislado de este clon reaccionó fuertemente en el análisis Southern con una sonda de dominio I. No se detectó reactividad utilizando la sonda original 750 bp, lo cual indica sin embargo que este clon incluía regiones 5' a nucleotídos 1985-2773 de SEQ ID NO: 45.

Alternativamente, la falta de hibridación a la sonda 750 bp puede haber sugerido que el clon era otro miembro de la familia de proteínas de la integrina. Para determinar si esta explicación era plausible, se subclonó el inserto 13 kb en pBluescript SKII^{+}. Se secuenció ADN purificado utilizando iniciadores correspondientes a secuencias de ácido nucleico de dominio I de \alpha_{d} 441-461, 591-612, 717-739 y 898-918 en SEQ ID NO: 52. La información de la secuencia se obtuvo utilizando solamente el primer iniciador 4441-4461, y se amplificó eficazmente solo el exon mas 5' del dominio I. El resto del dominio I no se amplificó. El clon resultante comprendía por lo tanto exon 6 del gen de \alpha_{d} de ratón, y se secuencias intrónicas al extremo 3' y 5' del exon. El exon 7 no estaba representado en el clon. Tras la secuenciación, se generó un constructo que contenía genes de resistencia a la neomicina y timidina quinasa.

El gen de resistencia a la neomicina (neo^{r}) se insertó en el plásmido resultante de forma que interrumpe la secuencia de codificación de proteína del ADN genómico de ratón. El plásmido resultante contiene por lo tanto un gen neo^{r} dentro de las secuencias de ADN genómico de ratón, todas las cuales están situadas dentro de un región de codificación de timidina quinasa. La construcción de plásmido de esta forma se requiere para favorecer la recombinación homóloga respecto de la recombinación aleatoria [Chisaka, et al., Nature 355:516-520 (1992)].

Ejemplo 24 Clonación de \alpha_{d} de conejo-Construcción y cribado de biblioteca de cADN de conejo

La identificación de homólogos \alpha_{d} humanos en ratas y ratones condujo a la investigación de la existencia de un homólogo de conejo que pudiera ser útil en modelos de conejo de estados patológicos humanos descritos más abajo.

Se preparó ARN poli A^{+} a partir de un bazo completo de conejo utilizando un kit Invitrogen FastTrack (San Diego, CA) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante y reactivos suministrados con el kit. De 1,65 g de tejido se aislaron 73 \mug de ARN poli A^{+}. El ARN de bazo de conejo se utilizó para construir una biblioteca de cADN ZAP Express utilizando un kit de Stratagene (La Jolla, CA). El cADN resultante se clonó direccionalmente en zonas EcoRI y XhoII en los lados lambda de un vector fagómido pBK-CMV. Se utilizó Gigapack II Gold (Stratagene) para envolver los lados lambda en partículas de fago. Se estimó que la concentración resultante de la biblioteca era de aproximadamente 8 x 10^{5} partículas, con un tamaño medio de inserto de 1,2 kb.

La biblioteca se amplificó una vez con placas de Petri para crecimiento concluente de placa y se recogió lisato celular. La biblioteca amplificada se preparó en placas de Petri a razón de aproximadamente 30.000 unidades formadoras de placa (pfu) por placa de 150 mm con E. coli y la mezcla resultante se incubó durante 12-16 horas a 37ºC para permitir la formación de la placa. El ADN de fago se transfirió sobre membranas de nylon Hybond N^{+} (Amersham, Arlington Heights, Illinois). Las membranas se hibridaron con una mezcla de 2 sondas de ADN PCR de \alpha_{d} de ratón radio marcadas, iniciadas aleatoriamente. La primera sonda se generó a partir de un producto PCR que abarcaba los nucleotídos 149-946 en SEQ ID NO. 52. La segunda sonda era de un producto PCR que abarcaba los nucleotídos 2752-3651 en SEQ ID NO: 52. Se marcaron las sondas por iniciación aleatoria (Kit de Marcado de ADN Iniciación Aleatoria de Boehringer Mannheim) y la mezcla de reacción se pasó por encima de una columna Sephadex G-50 para quitar los nucleotídos no incorporados. La solución de hibridación estaba compuesta por 5X SSPE, 5X Denharts, 1% SDS, 40% formamida y las sondas marcadas en 1 x 10^{6} dpm/ml. La hibridación se realizó a 42ºC durante 16-18 horas. Los filtros se lavaron a fondo en 2X SSPE/0,10/0 SDS a temperatura ambiente y se expusieron a película de rayos X para visualizar las posibles placas de hibridación.

Se identificaron dos clones con notable homología de secuencia con el \alpha_{d} humano. El clon nº. 2 tenía aproximadamente 800 bp de longitud y cubría hasta el extremo 5' del \alpha_{d} humano. El clon nº.2 incluye una metionina de iniciación y una secuencia leader completa. El clon nº. 7 tenía aproximadamente 1,5 kb que incluye una metionina de iniciación. El extremo 5' del clon nº.7 solapaba el del clon nº.8 mientras que las secuencias 3' terminaron en un punto más allá de las secuencias de dominio I. La secuenciación interna del clon nº.7 se realiza utilizando la técnica de secuenciación de supresiones encajadas.

La secuencia de amino ácido terminal N prevista para \alpha_{d} de conejo según lo determinado a partir de los clones número 2 y números 7 indicaba una proteína con 73% de identidad con \alpha_{d} humano, 65% de identidad con \alpha_{d} de ratón y 58% de identidad con CD11b de ratón, CD11b humano y CD11 c humano. La secuencia de ácido nucleico para el clon nº.7 aparece en SEQ ID NO: 92; la secuencia de amino ácido prevista se indica en SEQ ID NO: 93.

El aislamiento de cADN de \alpha_{d} de conejo de longitud total se realiza utilizando fragmento de conejo marcado, clon nº.7 y volviendo a cribar la biblioteca cADN de la que se deriva el fragmento.

El aislamiento del clon de \alpha_{d} de conejo permite la expresión de la proteína, ya sea sobre la superficie de transfectantes o en forma truncada soluble o de longitud completa. Esta proteína se utiliza entonces como inmunógeno para la creación de anticuerpos monoclonales que se utilizan en modelos de conejo de estados patológicos humanos.

Ejemplo 25 Modelos animales para determinar la utilidad terapéutica de \alpha_{d}

Los datos inmuno-histológicos en el perro y la hibridación in situ en ratas y ratones han determinado que en el bazo, \alpha_{d} se expresa principalmente por macrófagos presentes en la pulpa roja y en ganglios linfáticos; \alpha_{d} se encuentra en cordones y senos medulares. El modelo de expresión es notablemente similar al que se ha descrito para dos antígenos murinos definidos por los anticuerpos monoclonales F4/80 y SK39. Si bien la caracterización bioquímica de estos antígenos murinos ha demostrado que son distintos de \alpha_{d}, es altamente probable que \alpha_{d} defina el mismo conjunto macrófago que los antígenos murinos F4/80 y SK39.

En el ratón, se han identificado macrófagos SK39-positivos en pulpa roja esplénica donde pueden participar en la depuración de materiales extraños de la circulación y en médula de ganglios linfáticos [Jutila, et al., J.Leukocyte Biol.54:30-39 (1993)]. También se han descrito macrófagos SK39 positivos en zonas de inflamación aguda y crónica. Además, los monocitos reclutados a cavidades peritoneales inflamadas por tioglicolato expresan también el antígeno SK39. Colectivamente, estos resultados sugieren que si las células SK39^{+} son también \alpha_{d}^{+} entonces estas células son responsables de la depuración de materiales extraños en el bazo y participan en la inflamación, en la que los macrófagos desempeñan un papel importante.

Aunque la función de \alpha_{d} permanece poco clara, otras interinas \beta_{2} mejor caracterizadas participan, según se ha visto, en una amplia variedad de eventos de adhesión que facilitan la migración celular, potencian la fagocitosis y promueven interacciones entre células, circunstancias todas ellas que conducen al aumento de los procesos inflamatorios. Por consiguiente, es altamente plausible que la interferencia con la función normal de \alpha_{d} pueda también interferir en la inflamación en donde los macrófagos desempeñan un papel importante. Este efecto antiinflamatorio podría ser debido a: i) bloqueo de reclutación de macrófagos en zonas de inflamación, ii) evitar la activación de macrófagos en la zona de inflamación o iii) interferir en las funciones de efector macrofago que dañan el tejido anfitrión normal ya sea mediante respuesta autoinmunitarias específicas o como resultado de daño celular espectador.

Como estados patológicos en los que se conocen la existencia de macrófagos que desempeñan un papel importante en el proceso patológico se puede mencionar: esclerosis múltiple, artritis, ateroesclerosis de transplante, algunas formas de diabetes y patología intestinal inflamatoria. Se ha visto que los modelos animales descritos a continuación reproducen muchos de los aspectos de estos trastornos humanos. Se han probado en estos sistemas de modelos inhibidores de la función de \alpha_{d} para determinar si existe la posibilidad de tratar la patología humana correspondiente.

A. Arteriosclerosis de transplante

El transplante cardiaco es en la actualidad la forma aceptada de intervención terapéutica para algunos tipos de cardiopatías terminales. Como el uso de la ciclosporina A ha aumentado hasta el 80% las tasas de supervivencia de un año, el desarrollo de la arteriosclerosis progresiva por transplante ha ido emergiendo como la causa principal de muerte en transplantes cardiacos con supervivencia pasado el primer año. Recientes estudios han mostrado que la incidencia de una arteriosclerosis por transplante notable tres años después del transplante cardiaco es del orden de 36-44% [Adams, et al., Transplantation 53:1115-1119 (1992); Adams, et al., Transplantation 56:794-799 (1993)].

La arteriosclerosis por transplante suele consistir en lesiones difusas, oclusivas, intimales que afectan toda la pared del vaso coronario y suelen ir acompañadas de deposición de lípido. Si bien la patogénesis de la arteriosclerosis por transplante sigue sin conocerse, se supone que está relacionada con diferencia de histocompatibilidad entre el donante y el receptor y es de naturaleza inmunológica. Histológicamente, las zonas de espesamiento intimal están compuestas principalmente por macrófagos, aunque se ven ocasionalmente células T. Por lo tanto, es posible que macrófagos que expresan \alpha_{d} puedan desempeñar una función importante en la inducción y/o el desarrollo de la arteriosclerosis de transplante. En este caso, se podrían proporcionar profilácticamente a personas que recibieron un corazón transplantado y que corren el peligro de desarrollar una arteriosclerosis de transplante, anticuerpos monoclonales o inhibidores de molécula pequeña (por ejemplo ICAM-R soluble) de función \alpha_{d}.

Aunque la aterosclerosis en los transplantes de corazón presenta la mayor amenaza para la vida, se observa también arteriosclerosis de transplante en otros transplantes de órganos sólidos, inclusive de riñón y de hígado. El uso de terapéutico de agentes de bloqueo de \alpha_{d} podría prevenir la arteriosclerosis de transplante en el transplante de otros órganos y reducir las complicaciones resultantes de la insuficiencia del transplante.

Un modelo de arteriosclerosis de transplante en la rata supone el transplante de aloinjertos cardiacos heterotópicos por barreras de histocompatibilidad menor. Cuando se transplantan aloinjertos cardiacos Lewis en receptores F-344 compatibles clase I y II MHC, el 80% de los autoinjertos sobrevive por lo menos tres semanas, mientras que el 25% de los injertos sobrevive de forma indefinida. Durante este rechazo de injerto de baja intensidad, se forman lesiones por arteriosclerosis en el corazón del donante. Las lesiones arteriales en aloinjertos de 120 días suelen presentar espesamiento íntimo fibrótico difuso indistinguible en cuanto a su aspecto de las lesiones por arteriosclerosis de injerto encontradas en aloinjertos cardiacos humanos con rechazo.

Se transplantan en ratas corazones mal adaptados a antígenos de histocompatibilidad menores, por ejemplo Lewis en F-344. Se proporciona periódicamente a los destinatarios de transplantes anticuerpos monoclonales específicos de \alpha_{d} de rata o inhibidores moleculares pequeños de \alpha_{d}. Se espera que el tratamiento reduzca la incidencia de la arteriosclerosis de transplante en corazones de donantes sin rechazo. El tratamiento de ratas con anticuerpos monoclonales de \alpha_{d} o inhibidores de molécula pequeña puede no limitarse a tratamientos profilácticos. Se espera también que el bloqueo de la función de \alpha_{d} reduzca la inflamación debida a macrófagos y permita la inversión del daño arterial en el injerto.

B. Aterosclerosis en conejos alimentados con colesterol

Los conejos alimentados con una dieta aterogénica que contiene un suplemento de colesterol durante aproximadamente 12-16 semanas desarrollan lesiones intimales que abarcan la mayoría de la superficie lumenal de la aorta ascendente [Rosenfeld, et al., Arteriosclerosis 7:9-23 (1987); Rosenfeld, et al., Arteriosclerosis 7:24-34 (1987)]. Las lesiones ateroscleróticas observadas en estos conejos son similares a la de los humanos. Las lesiones contienen grandes números de células T, la mayoría de las cuales se expresan CD45RO, un marcador asociado con células T de memoria. Aproximadamente la mitad de las células T de infiltración expresan también antígeno clase II en MHC y algunas expresan el receptor IL-2 lo cual sugiere que muchas de las células se encuentran en estado activado.

Una característica de las lesiones ateroscleróticas encontradas en conejos alimentados con colesterol, si bien aparentemente ausente en modelo de roedores, es la acumulación de lesiones ricas en células espumosas. Se cree que los macrófagos de células espumosas son debidos a la absorción de lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL) por receptores específicos. Se ha visto que las partículas de LDL oxidada son tóxicas para algunos tipos de célula inclusive las células endoteliales y las células de los músculos lisos. La absorción de partículas de LDL oxidadas, potencialmente tóxicas por macrófagos hace las veces de irritante y produce la activación de los macrófagos, contribuyendo a la inflamación asociada con lesiones ateroscleróticas.

Una vez que se han generado anticuerpos monoclonales \alpha_{d} de conejo, se tratan conejos alimentados con colesterol. Los tratamientos incluyen la administración profiláctica de anticuerpos monoclonales de \alpha_{d} o inhibidores de molécula pequeña, para demostrar que los macrófagos \alpha_{d}^{+} participan en el proceso patológico. Realizando estudios adicionales se podría demostrar que los anticuerpos monoclonales al \alpha_{d} o los inhibidores de molécula pequeña pueden invertir el daño vascular detectado en conejos alimentados con una dieta aterogénica.

C. Diabetes dependiente de insulina

Las ratas BB desarrollan espontáneamente diabetes dependiente de insulina a los 70-150 días de edad. Recurriendo a la inmuno-histoquímica, se pueden detectar los macrófagos EDI^{+}, MHC clase II^{+} que infiltran tempranamente los islotes en la patología. Muchos de los macrófagos parecen participar en la fagocitosis de residuos celulares o células normales. Al ir progresando la enfermedad, se observa que números mayores de macrófagos infiltran los islotes, aunque también parece que se reclutan en la zona números significantes de células T y ulteriormente células B [Hanenberg, et al., Diabetología 32:126-134 (1989)].

El desarrollo de la diabetes en ratas BB parece depender en la infiltración temprana por macrofago y reclutamiento ulterior de células B. El tratamiento de ratas BB con partículas de sílice, que son tóxicas para los macrófagos, ha resultado ser eficaz en el bloqueo de la infiltración temprana por macrófagos de los islotes. Si no se produce una infiltración temprana por macrófagos, no se produce el daño tisular subsiguiente debido a una población de linfocitos autoagresiva. La administración de anticuerpo monoclonal OX-19 (específico de rata CD5) o anticuerpo monoclonal OX-8 (específico de rata CD8), que bloquean la fase de la enfermedad asociada con células T, también resulta eficaz para suprimir el desarrollo de la diabetes.

La función central de los macrófagos en la patología de este modelo le confiere atractivo para someter a prueba los inhibidores de la función de \alpha_{d}. Se tratan ratas genéticamente predispuestas al desarrollo de diabetes dependiente de insulina con anticuerpos monoclonales a \alpha_{d} o inhibidores de molécula pequeña y se evalúa la evolución de la enfermedad. El hecho de evitar o retrasar el inicio clínico demuestra que \alpha_{d} desempeña una función central en el daño por macrofago a las células del islote.

D. Patología inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa)

Los modelos animales utilizados en el estudio de la patología intestinal inflamatoria (IBD) se suelen obtener por administración intrarectal de irritantes nocivos (por ejemplo ácido acético o ácido trinitrobenceno sulfónico / etanol). La inflamación del colon inducida por estos agentes es el resultado de heridas químicas o metabólicas y carece de la inflamación crónica y espontáneamente recidiva asociada con la IBD humana. No obstante, un modelo descrito recientemente que utiliza inyecciones subserosas de polímeros peptidoglicano-polisacárida (PG-PS) purificados de estreptococos del grupo A o del grupo D parece ser un modelo fisiológicamente más relevante para el IBD humano [Yamada, et al., Gastroenterology 104:759-771 (1993)].

En este modelo se inyecta PG-PS en la capa subserosa del colon distal. La respuesta inflamatoria resultante es bifásica con un episodio inicial agudo tres días después de la inyección, seguido de una fase crónica espontánea 3 a 4 semanas más tarde. La respuesta de la fase última es de naturaleza granulomatosa y produce un espesamiento del colon, adhesiones, nódulos del colon y lesiones de la mucosa. Además de heridas en la mucosa, la colitis PG-PS conduce frecuentemente a anemia-artritis y hepatitis granulomatosa. Las manifestaciones extra intestinales de la enfermedad hace que el modelo resulte atractivo para estudiar la colitis de Crohn ya que un número considerable de pacientes con enfermedad de Crohn activa padecen una patología de la junta artrítica así como inflamación hepatobiliar.

Las lesiones granulomatosas son el resultado de inflamación crónica que conduce al reclutamiento y la activación subsiguiente de células de linaje monocito/macrófago. La presencia de lesiones granulomatosas en la enfermedad de Crohn y el modelo animal anterior hacen que se convierte éste en una diana clínica atractiva para anticuerpos monoclonales de \alpha_{d} u otros inhibidores de la función de \alpha_{d}. Se espera que los inhibidores de la función de \alpha_{d} bloqueen la formación de lesiones asociadas con IBD, o incluso inviertan el daño tisular observado en la enfermedad.

E. Artritis

La artritis parece ser un proceso patológico multifactorial en el que interviene una variedad de tipos celulares inflamatorios como neutrófilos, linfocitos T y macrófagos fagocíticos. Aunque existe una variedad de modelos de artritis, las preparaciones de proteoglicano de pared celular estreptocócica producen un trastorno más similar a la patología humana.

En las ratas, la pared celular estreptocócica induce la inflamación de articulaciones periféricas caracterizada por episodios repetidos de progresión patológica seguida de remisión y eventualmente con el resultado de la destrucción de la articulación durante un período de varios meses [Cromartie, et al., J.Exp.Med.146:1585-1602 (1977); Schwad et al., Infection and Immunity 59:4436-4442 (1991)]. Durante la fase crónica de la enfermedad, se cree que los fagocitos mononucleares o macrófagos desempeñan una función importante en la destrucción sinovial. Además, los agentes que suprimen el reclutamiento de macrófagos en el sinovio reducen efectivamente la inflamación y las características de patología de la artritis.

Un papel central del macrofago en la destrucción sinovial que conduce a la artritis indica que los anticuerpos monoclonales al \alpha_{d} o los inhibidores de la función de \alpha_{d} pueden tener un potencial terapéutico en el tratamiento de esta enfermedad. Al igual que en otros modelos descritos anteriormente, se espera que los anticuerpos monoclonales de \alpha_{d} o inhibidores de molécula pequeña administrados profilácticamente bloqueen o moderen la inflamación articular y eviten la destrucción sinovial. Los agentes que interfieren con la función de \alpha_{d} pueden también moderar la infamación en curso evitando el reclutamiento de macrófagos adicionales en la articulación o bloqueando la activación de macrófagos. El resultado neto sería la inversión de la destrucción en curso de la articulación así como facilitar la reparación tisular.

F. Esclerosis múltiple (MS)

Aunque la patogénesis de la esclerosis múltiple (MS) sigue sin estar clara, se acepta en general que la enfermedad es mediada por células T CD4^{+} que reconocen auto antígenos en el sistema nervioso central e inician una cascada inflamatoria. La respuesta inmunitaria resultante tiene como resultado el reclutamiento de células inflamatorias adicionales, inclusive macrófagos activados que contribuyen a la enfermedad. La encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) es un modelo animal que reproduce algunos aspectos de MS. Recientemente se ha comprobado que los anticuerpos monoclonales que reaccionan con CD11b/CD18 [Huitinga, et al., Eur.J. Immunol. 23:709-715 (1993)] presentes en macrófagos inflamatorios bloquean la enfermedad clínica e histológica. Los resultados sugieren que los anticuerpos monoclonales o los inhibidores de molécula pequeña de \alpha_{d} pueden ser eficaces en el bloqueo de la respuesta inflamatoria en EAE. Estos agentes tienen también aplicaciones terapéuticas importantes en el tratamiento de MS.

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/ CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3..3485

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1161 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION DE SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1153 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:4;

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1163 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(Xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:11:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGRAANACCA TNGGYTC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGAAGACC ATNGGYTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTAACCCTC ACTAAAG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATACGACTC ACTATAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Phe Gln Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gin}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gln Pro Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val Ile Pro Gln Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Gln Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Pro Thr Phe Ile Xaa Met Ser Gln Glu Asn Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gln Thr Gly}

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Arg

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi.): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Gly Glu Gln Phe Ser Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RAANCCYTCY TGRAAACTYT C

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1006 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTNTTYCARG ARGAYGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(Xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACTGTCAG GATGCCCGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:27

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GGCTCTACGG GTGCTTCTTC TG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:28

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTTCTTC TG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:29

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: FOR SEQ ID NO: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(Xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGCTGACTG CCTGCAGTTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:31

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:32

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:33

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: FOR SEQ ID NO: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA:SEQ ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3519 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACION: 52..3519

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA:SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION DE SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1151 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAACAGCT ATGACCATG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN POR SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE SECUENCIA:SEQ ID NO:34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGATTGG GGGTAAATAA CCAC

\hfill

24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD:24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3528 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..3456

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1155 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGGACGAT GGCATCCAC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGCCAGCT TCGGACAGAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGTCCAC AGAACAGAGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN FOR SEQ ID NO:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3803 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/ CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..3486

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

41

42

43

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1161 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

47

48

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3597 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 40..3525

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

52

53

54

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1161 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO:55:

57

58

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO; ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGTCATGG GTCTAACCTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:57

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTTAGACC CATGACAGG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:58

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCTTGCAG CTGGACAATG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:59

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAAGCTGG CTGCATCCTC TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: FOR SEQ ID NO: 60

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)TOPOLOGÍA:: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:61

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:62

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGGGATCA TTCGCTATGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:63

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAATTGGATGG ACCAGTTCTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO: 64

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGATCGGCT CCTACTTTGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:65

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGAGCCT CGAGACAGG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:66

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION DE SEQ ID NO:67

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO: 68

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:69

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTGATAG TAGGCAGGAA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:70

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.800000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCACAGAGG GAACCTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:71

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO: 72

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:73

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:74

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATCAGC ACTGAAATCT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:75

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO: 76

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGCGGAG GTGCAGGCAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:77

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCACTGCTT GCGCTGGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:78

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTAAGATA GCTCTGCTGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:79

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCCCACAG CCAGCACAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO: 80

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCCAACGC CAGATCATAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:81

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACGGCCAGG TCCACCAGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:82

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACGTCCCCT AGCACTGTCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:83

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGACGAAGT CCTCATCTG GG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:84

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:85

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:86

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTTGGAGC TGGACGATGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:87

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA; SEQ ID NO:87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGATCTG CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE: SEQ ID NO:88

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:89

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTGTGACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:90

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGACACTA TAGAATAGGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:91

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD; 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO:91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCAGGAGCTCCTGTGT

\hfill

18

\vskip0.800000\baselineskip

(2): INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 852 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 61..852

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 264 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:93:

63

64

Claims

1. Polinucleótido de \alpha_{d}, purificado y aislado, que tiene la secuencia de codificación de proteína de \alpha_{d} humana indicada en SEQ ID NO: 1.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es una molécula de ADN.

3. La molécula de ADN de la reivindicación 2, que es una molécula de cADN.

4. La molécula de ADN de la reivindicación 2, que es una molécula de ADN total o parcialmente sintetizada químicamente.

5. Polinucleótido codificador de \alpha_{d}, purificado y asilado, de longitud completa, elegido dentro del grupo formado por:

a) la secuencia de ADN humano indicada en SEQ ID NO: 1, y

b) una molécula de ADN humano, que se hibrida en condiciones rigurosas a la cadena no codificadora de la proteína que codifica la parte de ADN de a), siendo las condiciones rigurosas ejemplares el lavado con 2X SSC/ 0,1% SDS a 50ºC, 0,5X SSC / 0,1% SDS a 50ºC, y a 55ºC en 0,2X SSC / 0,1% SDS.

6. Una molécula de ADN que codifica la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO: 2.

7. La molécula de ADN de la reivindicación 6, que es un ADN genómico que tiene una secuencia codificadora de proteína, que codifica la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO: 2.

8. La molécula de ADN de la reivindicación 6, que es una molécula de cADN.

9. La molécula de ADN de la reivindicación 6, que es una molécula total o parcialmente sintetizada químicamente.

10. Un constructo de expresión de ADN, que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

11. Una célula anfitriona transformada con una molécula de ADN, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

12. Método para producir un polipéptido de \alpha_{d} que comprende el crecimiento de una célula anfitriona según la reivindicación 11 en un medio adecuado y el aislamiento de polipéptido de \alpha_{d} de dicha célula anfitriona o del medio en el que crece.

13. Polipéptido de \alpha_{d}, purificado y aislado, que tiene la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO:2.

14. Un anticuerpo capaz de interaccionar específicamente con un polipéptido de \alpha_{d} según lo indicado en SEQ ID NO:2.

15. Anticuerpo según la reivindicación 14, que es un anticuerpo monoclonal.

16. Anticuerpo anti-idiotipo específico del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 15.

17. Línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 15.

18. Fragmento de polipéptido de dominio extracelular de \alpha_{d}, purificado y aislado, que comprende aminos ácidos 17 a 1108 de la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO: 2.

19. Fragmento de polipéptido dominio I de \alpha_{d}, purificado y aislado, que comprende amino ácidos 145 a 355 de la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO: 2.

20. Proteína de fusión que contiene amino ácidos 17 a 1108 de polipéptido de dominio extracelular de \alpha_{d} de la SEQ ID NO: 2 y secuencias de dominio constante de inmuno globulina humana.

21. Polinucleótido de murino, purificado y aislado, que tiene la secuencia de codificación de la proteína de la subunidad a indicada en SEQ ID NO: 45.

22. Método para aislar un polinucleótido, que codifica una proteína que interacciona con un polipéptido de \alpha_{d} según lo indicado en SEQ ID NO: 2, 53 ó 55, que comprende las siguientes etapas:

a) transformación o transfección de células anfitrionas adecuadas con un constructo de ADN, que comprende un gen indicador bajo el control de un promotor, regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de fijación de ADN y un dominio de activación;

b) expresión en dichas células anfitrionas de una primera secuencia de ADN híbrido, que codifica una primera fusión de parte o de la totalidad de \alpha_{d} y el dominio de fijación de ADN o el dominio de activación de dicho factor de transcripción;

c) expresión en dichas células anfitrionas de una biblioteca de segundas secuencias de ADN híbridas que codifican segundas fusiones de parte o de la totalidad de las proteínas de fijación de \alpha_{d} putativo y el dominio de fijación de ADN o dominio de activación de dicho factor de trascripción, no incorporado en dicha primera fusión;

d) detección, interacción de una proteína de fijación de \alpha_{d} con \alpha_{d} en una célula anfitriona particular, detectando la producción del producto del gen indicador en dicha célula anfitriona; y

e) aislamiento de segundas secuencias de ADN híbridas, que codifican proteína de fijación de \alpha_{d} a partir de dicha célula anfitriona particular.

23. Método para identificar un compuesto capaz de modular la interacción de polipéptido de \alpha_{d} según lo indicado en SEQ ID NO:2, 53 ó 55 e ICAM-R, que comprende las siguientes etapas:

a) inmovilización de \alpha_{d} o un fragmento del mismo o ICAM-R o un fragmento del mismo, sobre un soporte sólido revestido o impregnado con un agente fluorescente;

b) marcado del partner de fijación no inmovilizado con un compuesto capaz de excitar dicho agente fluorescente;

c) poner en contacto dicho partner de fijación inmovilizado con el partner de fijación marcado en presencia y ausencia de un compuesto modulador putativo capaz de reaccionar específicamente con \alpha_{d};

d) detección de emisión luminosa por dicho agente fluorescente; y

e) identificación, modulación de compuestos, como aquellos que afectan la emisión de la luz, por dicho agente fluorescente, comparando con la emisión de luz por dicho agente fluorescente en ausencia de dicho compuesto de modulación.

24. Fragmento de polipéptido de dominio extracelular de ad, purificado y asilado, que comprende amino ácido 127 a amino ácido 353 de la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO: 2.

25. Proteína de fusión, que comprende el fragmento de polipéptido de la reivindicación 24 y secuencias de región constante de inmunoglobulina humana.

26. Fragmento de polipéptido de dominio extracelular de \alpha_{d}, purificado y aislado, que comprende amino ácido 17 a amino ácido 603 de la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO: 2.

27. Proteína de fusión, que comprende el fragmento de polipéptido de la reivindicación 26 y secuencias de la región constante de inmunoglobulina humana.

28. Fragmento de polipéptido de dominio extracelular de \alpha_{d}, purificado y aislado, que comprende amino ácido 17 a aproximadamente amino ácido 1029 de la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} humano indicada en SEQ ID NO: 2.

29. Proteína de fusión, que comprende el fragmento de polipéptido de la reivindicación 28 y secuencias de la región constante de inmunoglobulina.

30. Polinucleótido de murino, purificado y asilado, que comprende la secuencia de codificación de proteína de la subunidad a según aparece en SEQ ID NO: 52.

31. Polinucleótido de \alpha_{d}, purificado y asilado, que tiene la secuencia de amino ácidos \alpha_{d} de murino indicada en SEQ ID NO: 53.

32. Polinucleótido de rata, purificado y asilado, que comprende la secuencia de codificación de proteína de la subunidad \alpha, según aparece en SEQ ID NO: 54.

33. Polipéptido de \alpha_{d}, purificado y asilado, que tiene la secuencia de amino ácidos de \alpha_{d} de rata, según aparece en SEQ ID NO: 55.

34. Fragmento de polipéptido, purificado y asilado, que comprende secuencias de dominio extracelular del polipéptido de la reivindicación 33.

35. Anticuerpo capaz de interaccionar con el polipéptido de la reivindicación 33.

36. Anticuerpo según la reivindicación 35, que es un anticuerpo monoclonal.

37. Roedor que no expresa una proteína de \alpha_{d} funcional indicada en SEQ ID NO: 53 ó 55.

38. Composición farmacéutica, que comprende un polipéptido según la reivindicación 13, un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, un fragmento de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 18, 19, 24, 26 ó 28, un polipéptido según la reivindicación 31 ó 33, un fragmento de polipéptido de la reivindicación 34 o un anticuerpo de la reivindicación 35 ó 36.

39. Polipéptido según la reivindicación 13, anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, fragmento de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 18, 19, 24, 26 ó 28, un polipéptido según la reivindicación 31 ó 33, fragmento de polipéptido de la reivindicación 34 o un anticuerpo de la reivindicación 35 ó 36, que se utiliza como agente terapéutico o profiláctico.

40. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 13, un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, fragmento de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 18, 19, 24, 26 ó 28, un polipéptido según la reivindicación 31 ó 33, un fragmento de polipéptido de la reivindicación 34 o un anticuerpo de la reivindicación 35 ó 36, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes de tipo I, aterosclerosis, esclerosis múltiple, asma, psoriasis o artritis reumatoide.